CN109312405A

CN109312405A - 一种用于诊断大肠癌的组合物以及诊断标记物的检测方法

Info

Publication number: CN109312405A
Application number: CN201780023863.2A
Authority: CN
Inventors: 金圣勋; 朴敃哲; 彼得·查尔斯·高夫努尔
Original assignee: Medicinal Bioconvergence Research Center
Current assignee: Medicinal Bioconvergence Research Center
Priority date: 2016-02-25
Filing date: 2017-02-24
Publication date: 2019-02-05
Also published as: US11360093B2; JP2019507594A; JP6847972B2; EP3409790A4; US20190018015A1; WO2017146529A1; EP3409790A1; KR101851003B1; KR20170100206A

Abstract

本发明涉及一种用于诊断大肠癌的组合物以及诊断标记物的检测方法。具体来说，本发明涉及一种包含测定KRS(赖氨酰tRNA合成酶,lysyl‑tRNA synthetase)和AIMP1(氨酰tRNA合成酶复合物相互作用多功能蛋白1，aminoacyl‑tRNA synthetase complex‑interacting multifunctional protein 1)所组成的群中至少一种以上的mRNA或其蛋白质的表达水平的制剂的用于诊断大肠癌的组合物；以及为了提供诊断大肠癌所需的信息，在采集自被检体的样本中检测所述标记物的方法；选自KRS和AIMP1所组成的本发明的大肠癌诊断标记物在大肠癌患者的血清中的表达水平与正常比对组相比有所增加。因此，通过测定选自KRS和AIMP1所组成的群中的至少一个以上的标记物的表达水平可以准确并迅速地判断有无大肠癌。

Description

一种用于诊断大肠癌的组合物以及诊断标记物的检测方法

技术领域

本发明主张基于2016年2月25日提交的大韩民国专利申请第10-2016-0022470号的优先权，所述说明书的所有内容作为本发明的参考文献。

本发明涉及一种用于诊断大肠癌的组合物以及诊断标记物的检测方法。具体来说，本发明涉及一种含有测定KRS(赖氨酰tRNA合成酶,lysyl-tRNA synthetase)或AIMP1(氨酰tRNA合成酶复合物相互作用多功能蛋白1，aminoacyl-tRNA synthetase complex-interacting multifunctional protein 1)的mRNA或其蛋白质表达水平制剂的用于诊断大肠癌的组合物；为了提供诊断大肠癌所需的信息，由被检体获取的样本中检测所述标记物的方法；以及测定选自KRS(赖氨tRNA合成酶,lysyl-tRNA synthetase)和AIMP1(氨酰tRNA合成酶复合物相互作用多功能蛋白1，aminoacyl-tRNA synthetase complex-interacting multifunctional protein 1)群组中一种以上的mRNA或其蛋白质表达水平的试剂的用途，以制备大肠癌诊断用制剂。

背景技术

2002年，大韩民国死于癌症(恶性肿瘤)的人数为62,887人，占韩国国民总死亡人数246,515人(每10万人中早年死亡的人数为512人)的25.5％(男性死亡人数占比29.6％，女性死亡人数占比20.5％)。癌症成为第一大死亡诱因(死亡率：每10万人死于癌症者130.7人)。癌症死亡率由高至低依次为肺癌、胃癌、肝癌、大肠癌和胰腺癌，这五大癌症的死亡率约占癌症死亡总数的70％。其中，男性主要死于肺癌、胃癌、肝癌和大肠癌这四大癌症，死亡人数为28,147人，占所有男性癌症死亡人数(40,177人)的70％。女性主要死于胃癌、肺癌、肝癌、大肠癌和胰腺癌这五大癌症，死于这五类癌症的人数为13,630人，占所有女性癌症死亡人数(22,710人)的60％。

大肠癌是指在结肠或直肠中发生恶性肿瘤，2000年全球发病率(新发病例达到945,000例，占全世界癌症总发病率的9.4％)，死亡率(492,000例,占癌症总死亡率的7.9％)在所有癌症中高居第三；按性别比较，男性和女性的发病率相似(男性:女性为1.1:1)。因为与其他癌症相比，大肠癌的预后相对较好，大肠癌患者的生存率(发病率)在世界上仅次于乳腺癌，而在过去5年，大约有240万人在被诊断为大肠癌后存活(Parkin DM，2000年全球癌症统计，柳叶刀肿瘤杂志2:533-543，2001年，Parkin DM,Global cancerstatistics in the year 2000,Lancet Oncol 2:533-543,2001)。大肠癌预后5年的生存率在早期(I期)患者中达到90％以上，而在癌细胞转移(IV期)患者中仅为5％(癌症事实和数字，2004年；美国癌症协会，Cancer Facts and Figures 2004.American CancerSociety,2004)。

在我国(韩国)，随着近年来饮食文化的日益西化，大肠癌的发病率和死亡率显著上升。根据韩国保健福祉部和韩国中央癌症登记处公布的韩国中央癌症登记事业年度报告(2002年1月-2002年12月)，2002年大肠癌发病率为11,097例，为第四大常见癌症，占所有癌症发病率的11.2％。按照性别，男性患者共6,423例，多于女性患者(4,647例)；而按照年龄来看，60岁以上(3,751例)最常见，其次是50岁以上(2,400例)。根据1999年到2002年的资料来看，大肠癌的发病率在四年里一直保持上升趋势，与1999年相比，2002年癌症的发病率(每10万人口中癌症新发病例的患者数)，男性从22.5人增加到30.7人，上升了36.4％,女性从18.8人增加到23.1人，上升了22.9％，整体来说从20.6人增加到26.9人，上升了30.6％之多(1993-2002年癌症患者的生存率和1999-2002年癌症发病率，保健福祉部，2007年7月)。2006年死于大肠癌的人数为6,277人，占癌症死亡人数的第四位(9.5％)，其中男性共有3,453人，位于第四(8.0％)，女性为2,824人，位于第三(11.5％)。此外，大肠癌在过去十年的死亡率上升最快，仅次于肺癌(2006年死亡及其原因统计结果，韩国统计厅，2007年9月)。

就大肠癌而言，由于癌细胞在可切除癌前病变或可治疗的早期阶段发展缓慢，因此通过大肠癌筛查是有可能降低其发病率和死亡率的。可确认的是，对50岁以上的成年男性和女性进行大肠癌筛查可以降低大肠癌的死亡率(Walsh JM&amp；terdiman JP，JAMA289:1288-96，2003年)。肠镜检查是目前最可靠的筛查方法，但其依从性和普及率很低。另外，粪隐血试验(fecal occult blood test，FOBT)是目前最为广泛使用的非侵入性筛查(non-invasive screening)法，但其存在着灵敏度低等几个重要的限制点。在美国，2002年的数据，50岁以上成人中仅有40％在过去5年内接受了肠镜检查，仅有22％的人在过去12个月内接受了粪隐血试验(行为危险因素调查，国家慢性病预防和健康促进中心，疾病控制和预防中心，2002年；Behavior risk factor survey,National center for chronicdisease prevention and helth promotion.Centers for disease control andprevention,2002)。大肠癌筛查试验的参与率低于乳腺癌和宫颈癌筛查，这是源于患者的不适感、费用、缺乏意识以及对现有筛查方法的接受度低等各种原因。

因此，开发一种能够准确、快速地早期诊断大肠癌的新的标记物就显得尤为重要。

发明内容

【技术课题】

为此，本发明的发明者们不懈努力开发一种能够有效诊断大肠癌的生物标记物，结果发现了能够在大肠癌患者的血清中简单快速地检测并且具有高灵敏度和特异性的生物标记物，从而完成了本发明。

因此，本发明的目的之一是提供一种用于诊断大肠癌的组合物，其包含用于测定赖氨酰tRNA合成酶(KRS)和氨酰tRNA合成酶复合物相互作用多功能蛋白1(AIMP1)所组成的群中一种以上的mRNA或蛋白质表达水平的试剂。

本发明的另一目的是提供一种用于诊断大肠癌的试剂盒，其包含用于测定选自KRS和AIMP1所组成的群中一种以上的mRNA或蛋白质表达水平的试剂。

本发明的另一目的是提供一种大肠癌标记物的检测方法，以提供大肠癌诊断所需的信息，该方法包括以下步骤:

(a)从被检体采集样本；

(b)从所述样本中测定选自KRS和AIMP1所组成的群中一个以上的mRNA或蛋白质表达水平；和

(c)将所述基因mRNA的表达水平或蛋白质的表达水平与正常比对样本所对应基因mRNA的表达水平或蛋白质表达水平进行比较，确认表达水平上升的被检体患有大肠癌。

本发明的另一目的是提供一种筛选大肠癌药剂的方法，该方法包括以下步骤:

(a)将大肠癌药剂的候补物质投药至采集自大肠癌患者的样本；

(b)大肠癌药剂候补物质存在或不存在的情况下，在所述样本中测定选自KRS和AIMP1所组成的群中至少一种以上mRNA或蛋白质表达水平；

(c)将候选物质存在情况下的mRNA或蛋白质水平与候选物质不存在的情况下的mRNA或蛋白质水平进行比较；

(d)在候补物质存在的情况下识别使mRNA或蛋白质水平降低的物质；以及

(e)在细胞或动物中测定所识别的候补物质的抗癌活性。

本发明的另一目的是提供测定选自赖氨酰tRNA合成酶(KRS)和氨酰tRNA合成酶复合物相互作用多功能蛋白1(AIMP1)所组成的群中至少一种以上的mRNA或其蛋白质表达水平的试剂的用途，以制备大肠癌诊断试剂。

【技术解决方法】

为了达到本发明的上述目的，本发明提供一种用于诊断大肠癌的组合物，其包含用于测定选自赖氨酰tRNA合成酶(KRS)和氨酰tRNA合成酶复合物相互作用多功能蛋白1(AIMP1)所组成的群中至少一种以上的mRNA或蛋白质表达水平的试剂。

为了达到本发明的另一个目的，本发明提供了一种用于诊断大肠癌的试剂盒，其包含用于测定选自KRS和AIMP1所组成的群中至少一种以上的mRNA或蛋白质表达水平的试剂。

为了达到本发明的另一个目的，本发明提供一种大肠癌标记物的检测方法，以提供诊断大肠癌的必要信息。该方法包括以下步骤：

(a)从被检体采集样本；

(b)在所述样本中测定选自赖氨酰tRNA合成酶(KRS)和氨酰tRNA合成酶复合物相互作用多功能蛋白1(AIMP1)所组成的群中一个以上的mRNA或蛋白质表达水平；和

(c)将所述基因mRNA的表达水平或蛋白质的表达水平与正常比对样本所对应的基因mRNA的表达水平或蛋白质表达水平进行比较，确认表达水平上升的被检体患有大肠癌。

为了达到本发明的另一个目的，本发明提供一种筛选大肠癌药剂的方法，该方法包括以下步骤:

(b)候补物质存在或不存在的情况下，在所述样本中测定选自KRS和AIMP1所组成的群中一种以上的mRNA或蛋白质表达水平；

(d)在候补物质存在的情况下识别使mRNA或蛋白质水平降低的物质；和

(e)在细胞或动物中确认所识别的候补物质的抗癌活性。

为了达到本发明的另一目的，本发明提供了测定选自赖氨酰tRNA合成酶(KRS)和氨酰tRNA合成酶复合物相互作用多功能蛋白1(AIMP1)所组成的群中一种以上的mRNA或其蛋白质表达水平的试剂的用途，以制备用于诊断大肠癌的试剂。

以下将对本发明进行详细说明。

本发明提供了一种用于诊断大肠癌的组合物，其包含用于测定选自赖氨酰tRNA合成酶(KRS)和氨酰tRNA合成酶复合物相互作用多功能蛋白1(AIMP1)所组成的群中至少一种以上的mRNA或蛋白质表达水平的试剂。

本发明的发明者们首次证实KRS和AIMP1在大肠癌患者中较正常人明显增加，确认其作为一种新的大肠癌诊断标记物具有很高的价值。

在本发明的另一个实施例中，通过KRS(赖氨酰tRNA合成酶)和AIMP1(氨酰tRNA合成酶复合物相互作用多功能蛋白1)的ROC曲线分析，发现所述各标记物在诊断大肠癌时均具有优异的敏感性(sensitivity)和特异性(specificity)。本发明的诊断标记物的敏感性和特异性明显优于传统大肠癌诊断标记物之一的CA19-9。

基于本发明者们的上述发现，本发明提供了一种用于诊断大肠癌的组合物，其包含用于测定KRS(赖氨酰tRNA合成酶)和/或AIMP1(氨酰tRNA合成酶复合物相互作用多功能蛋白1)的表达水平，即KRS(赖氨酰tRNA合成酶)和/或AIMP1(氨酰tRNA合成酶复合物相互作用多功能蛋白1)的蛋白质或mRNA水平的试剂。

氨酰tRNA合成酶(ARS)是一种将特定氨基酸连接到其相应tRNA上的酶。在高等生物的情况下，除了不同氨基酸类型的不同的20种酶之外，它还可由23种酶组成，包括参与AIMP1(p⁴3)、(AIMP2)p38和(AIMP3)p18等多合成酶复合物形成的三种酶，除了参与多合成酶复合物形成的酶之外，一些酶也以游离形式存在着。但近年来，有报告称这些酶除了基本功能之外，在特定环境中还具有各种其他活性功能，KRS和AIMP1也是其中之一。

KRS通过巨噬细胞活化诱导免疫反应这一点已被公开，且已有报告称由TNF-a促进向细胞外分泌的KRS通过p38丝裂原活化激酶等信号传输，通过TNF-a增加巨噬细胞的活性，或者促进细胞迁移。KRS最近也被证实与多种疾病有关。有报告称，炎症性肌肉疾病患者体内存在KRS自身抗体，另外发现SOD1基因突变所导致的卢伽雷病患者也有KRS与SOD1酶结合并参与。然而，KRS在大肠癌患者血清中的蛋白质的数值明显高于正常比对组，因此可以用作大肠癌的诊断标记物，这一发现未曾公布，在本发明中属首次公开。

AIMP1(ARS相互作用多功能蛋白1)作为已知传统的p43蛋白质，最近更名为AIMP1(Sang Gyu Park等，《生化科学趋势》，30:569-574，2005年)。所述AIMP1是由312个氨基酸组成的蛋白质，其结合多重tRNA合成酶复合物((Deutscher,M.P.,Method Enzymol,29,577-583,1974年；Dang C.V.等。国际J.生化，14,539-543，1982年；米兰德,M等、EMBO J.1,733-736，1982年；Yang D.C.等，Curr.Top Cell.Regul.26,325-335,1985年)并促进多重tRNA合成酶的催化活性(Park S.G.等J.Biol.Chem.274,16673-16676,1999年)。已知经分泌的AIMP1作用于多种靶细胞，如单核细胞/巨噬细胞、内皮细胞和纤维芽细胞。然而，由于AIMP1在大肠癌患者血清中的蛋白水平数值明显高于正常比对组，因此可以用作大肠癌的诊断标志物，这一发现尚未公开，在本发明中属首次公开。

本发明中的“诊断用标记物”、“用于诊断的标记物”或“诊断标记物(diagnosismarker)”是指能够将大肠癌患者与正常人区分开来并进行诊断的物质，与正常比对组相比，在患有大肠癌的患者中可看出多肽或核酸(例如mRNA等)、脂质、糖脂、糖蛋白或糖(单糖、二糖、寡糖等)等有机生物分子增加或减少。就本发明的目的而言，本发明的大肠癌诊断标记物是KRS(赖氨酰tRNA合成酶)和AIMP1(氨酰tRNA合成酶复合物相互作用多功能蛋白1)基因及其编码的蛋白质，与正常组织的细胞相比，在癌细胞中显示出特别高的表达水平。

本发明中的“表达(expression)”是指在细胞中产生蛋白质或核酸。蛋白质可与多肽(polypeptide)或肽(peptide)互换使用，例如，天然蛋白质中常见的氨基酸残基聚合物。多核苷酸(polynucleotide)或核酸是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)。另外还包括以类似于天然生成的核苷酸的方式与核酸杂交的已知的天然核苷酸类似物，除非另有限制。mRNA是在蛋白质合成过程中将遗传信息(基因特异核苷酸序列)传送至特定基因中的氨基酸序列特异的RNA。

“诊断”是指确认病理状态的存在或特征。本发明中的“诊断”一词是确定KRS和/或AIMP1的表达水平，即测定所述标记物中一种或多种蛋白质或mRNA的水平，以确定大肠癌病理的存在或发病与否。

同时，当本发明的诊断用组合物用于测定mRNA的表达水平时，用于测定mRNA表达水平的试剂可以是一组与KRS和/或AIMP1的mRNA特异性结合的探针或引物。

所述KRS和AIMP1的mRNA可以来自包括人类在内的哺乳动物，所述KRS的mRNA最好是包括序列号为1的碱基序列和AIMP1的mRNA最好是包括序列号为2的碱基序列。本发明的诊断用组合物包含对选自所述KRS和AIMP1所组成的群中一种以上的mRNA特异的一组探针或引物，作为测定选自KRS和AIMP1所组成的群中一种以上的表达水平的试剂，还可以包含检测RNA的已知方法所必需的试剂。利用本发明的组合物检测RNA的已知方法可无限制地用于测定被检体中所述标记物的mRNA水平。

引物(primer)是指作为DNA合成的起点(starting point)的短单链寡核苷酸(short single strand oligonucleotide)。引物在合适的缓冲液(buffer)和温度条件下与模板(template)多核苷酸特异结合，并且通过DNA聚合酶在引物中添加并结合具有模板DNA互补碱基的三磷酸核苷以合成DNA。引物通常由15-30个碱基序列组成，与模板链结合的熔化温度(melting temperature，Tm)随碱基的构成和长度而不同。

引物序列不需具备与模板的部分碱基序列完全互补的序列，只要具有能与模板杂交并发挥引物固有作用范围内的充分的互补性。因此，本发明中用于测定所述各标记物的mRNA的表达水平的引物不需具备与各基因序列完全互补的序列，只要具有能通过DNA合成达到扩增mRNA或cDNA的特定区域来测定mRNA的量这一目的的长度和互补性即可。用于所述扩增反应的引物由分别与待扩增mRNA的特定区域两个末端的模板(或正义，sense)链和相反(反义，antisense)链互补结合的一组(对)链组成，本领域技术人员可参考KRS或AIMP1的mRNA或cDNA序列很容易地设计引物。

本发明的引物优选为特异结合序列号为1的KRS mRNA的碱基序列、序列号为2的AIMP1mRNA的碱基序列的一组、一对或其组合，最好是至少一种选自序列号5和序列号6群组的正向引物以及至少一种选自序列号7和序列号8的反向引物，但并不限于此。在本发明中，序列号5和序列号7是对KRS mRNA的碱基序列特异的引物，而序列号6和序列号8是对AIMP1mRNA的碱基序列特异的引物。

“探针(probe)”是指能与特定基因的mRNA或cDNA(互补DNA，complementary DNA)特异接合的长度为短至几个长至数百个的碱基(base pair)长度的RNA或DNA等多核苷酸的片段，并且被标记(labeling)以确认结合的对象mRNA或cDNA的存在与否或表达水平等。为了达到本发明的目的，与KRS或AIMP1的mRNA互补的探针可通过与被检体样本进行杂交反应(hybridization)来测量KRS或AIMP1的表达水平，用于大肠癌的诊断。探针的选择和杂交条件可以根据本领域已知的技术适当地进行选择。

本发明的引物或探针可以使用亚磷酰胺(phosphoramidite)固相合成法或其他公知的方法化学性合成。此外，引物或探针只要在不干扰与KRS或AIMP1的mRNA的杂交的范围内，可以用本领域已知的方法对其进行各种转换。这类转换如甲基化、封端、用一种或多种天然核苷酸类似物取代以及核苷酸之间的转换，又如使用不带电荷的接头(例如：甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯和氨基甲酸酯等)或带电荷的接头(例如：硫代磷酸酯、硫代磷酸酯等)，以及利用荧光或酶的标记物质(labeling material)的接合等。

当本发明的诊断用组合物是用于测量蛋白质的表达水平之物时，用于测定蛋白质表达水平的试剂可以是分别与KRS或AIMP1蛋白质特异接合的抗体。

所述KRS和AIMP1蛋白质可以是来自包括人类在内的哺乳动物，优选包括用序列号3表示的KRS蛋白质以及用序列号4表示AIMP1蛋白质的碱基序列。

“抗体(antibody)”是指特异结合于抗原位点的免疫球蛋白(immunoglobulin)。本发明的抗体不与KRS或AIPM1以外的其他种类的包括氨酰tRNA合成酶的其他蛋白质发生反应，是只与KRS或AIMP1蛋白质特异结合的抗体。KRS或AIMP1抗体可以通过将每个基因克隆到表达载体中以获得由所述基因编码的蛋白质，然后可使用本领域的常规方法从所获得的蛋白质进行制备。使用包含KRS或AIMP1抗原位点的KRS或AIMP1蛋白质片段可以制备各所述蛋白质特异抗体。对本发明的抗体的形式并没有特别的限制，包括多克隆抗体(polyclonalantibody)和单克隆抗体(monoclonal antibody)。此外，只要具有抗原-抗体结合性，即使是完整抗体的一部分也包括在本发明的抗体中，同时包括与KRS或AIMP1特异结合的所有种类的免疫球蛋白抗体。例如，不仅包括具有两条全长轻链和两条全长重链的完整形式的抗体，而且包括具有抗原结合功能的Fab、F(ab’)、F(ab’)2和Fv等。并且，本发明的抗体是能与KRS或AIMP1蛋白质特异结合的抗体，包括人源化抗体、嵌合抗体等的特殊抗体的重组抗体。

本发明的诊断用组合物包括所述各标记物蛋白质特异性抗体作为用于测定KRS或AIMP1的表达水平的试剂，还可包含用于检测蛋白质的已知方法所必需的试剂，利用本组合物使用检测蛋白质的已知方法测定被检体中选自KRS和AIMP1所组成的群中至少一种以上的蛋白质水平，并无限制。

此外，本发明提供了一种用于诊断大肠癌的试剂盒，其包含用于测量选自赖氨酰tRNA合成酶(KRS)和氨酰tRNA合成酶复合物相互作用多功能蛋白1(AIMP1)所组成的群中至少一种以上的mRNA或蛋白质表达水平的试剂。

本发明的诊断用试剂盒可包括用标记物识别选自KRS和AIMP1所组成的群中一种以上的蛋白质的抗体、或者用标记物识别选自KRS和AIMP1群组中一种以上的mRNA的引物和探针，并且还可包括适用于分析法的一种或一种以上的其它结构成分的组合物、溶液或装置。

根据具体情况，所述诊断用试剂盒可以是包含逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)必需要件的诊断用试剂盒。逆转录聚合酶链反应试剂盒包含特异于标记物基因的各引物对。引物作为各标记物基因的核酸序列中具特异序列的核苷酸，长度约为7bp至50bp，优选长度约为10bp至30bp。另外还可含有与对比组基因的核酸序列特异的引物。另外逆转录聚合酶链反应试剂盒还可包括试管或其他合适的容器、反应缓冲液(各种不同的pH和镁浓度)、脱氧核苷酸(dNTPs)、Taq聚合酶和逆转录酶等酶、DNAse、RNAse抑制剂DEPC处理水(DEPC-water)和无菌水等。

另一种具体情况是，一种诊断用试剂盒，其特征在于包括操作DNA芯片所必需的要件。DNA芯片试剂盒可以包括其上附着有对应于基因或其片段的cDNA或寡核苷酸(oligonucleotide)的底物，以及用于制备荧光标记探针的试剂、制剂和酶等。此外，底物还可包括对应于比对组基因或其片段的cDNA或寡核苷酸。

最优选的是，一种诊断用试剂盒，其特征在于包括进行ELISA所必需的要件。ELISA试剂盒含有特异于标记蛋白质的抗体。所用的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体或重组抗体，这些抗体对每个标记蛋白都具有高特异性和亲和性，对其他蛋白质基本不具交叉反应性。此外，ELISA试剂盒还可以包含特异于对比组蛋白质的抗体。ELISA试剂盒还可包括能够检测到结合抗体的试剂，如经标记的次级抗体、发色团(chromophores)、酶(与抗体结合的形式)及其底物或能结合抗体的其他物质。另外，本发明的试剂盒还可包括去除了酶、要显色反应的底物以及未结合的蛋白质等，只保留结合了的蛋白质标记物的洗涤液或洗脱液。

用于分析的样本包括血液、血清、尿液、泪液和唾液等能区分于正常状态并识别感染性炎症疾病特异性蛋白质的生物样本。最好是生物液体样本，如用血液、血清和血浆进行测量。可以准备样本以增强蛋白质标记物的检测灵敏度，例如可使用阴离子交换色谱法、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法(size exclusion chromatography)、液相色谱法、分级提取法(sequential extraction)或凝胶电泳法等方法预处理从患者处提取的血清样本。

本发明还提供了一种检测大肠癌标志物的方法，用于提供大肠癌诊断所需的信息，该方法包括以下步骤:

(a)从被检体采集样本；

(b)测定所述样本中选自赖氨酰tRNA合成酶(KRS)和氨酰tRNA合成酶复合物相互作用多功能蛋白1(AIMP1)所组成的群中一种以上mRNA的表达水平或蛋白质的表达水平；和

(c)将所述各基因mRNA的表达水平或蛋白质的表达水平与正常比对组样本所对应的基因mRNA的表达水平或蛋白质表达水平进行比较，确认表达水平上升的被检体患有大肠癌。

本发明的发明人们最早发现KRS和AIMP1可以作为大肠癌的新型标记物，提供一种测定所述各标记物的表达水平，以提供诊断大肠癌所需信息的方法。以下将按照各步骤依次说明本发明的方法。

本发明涉及方法的步骤(a)是从被检体采集样本的步骤。

所述样本采集于待诊断是否患有大肠癌的被检体，其使用不受限制。样本可以是经活体组织检查所提取的组织和细胞，如血液、全血、血清、血浆、唾液、脑脊液、各种分泌物、尿液、粪便等。较为理想的样本可以是血液、血浆、血清、唾液、鼻粘液、痰、囊液、羊水、腹水、宫颈或阴道分泌物、尿液或脑脊液。最理想的样本可以是血液、血浆或血清。

本发明涉及方法的步骤(b)是在步骤(a)所提供的样本中测定选自赖氨酰tRNA合成酶(KRS)和氨酰tRNA合成酶复合物相互作用多功能蛋白1(AIMP1)所组成的群中至少一种的表达水平。所述表达水平可以是选自KRS和AIMP1所组成的群中至少一种的mRNA或蛋白质的表达水平。

可以利用特异性结合于各蛋白质的抗体来检测或测定各蛋白质的表达水平。蛋白质特异性抗体如本发明的诊断用组合物中所述相同。测定各蛋白质的表达水平的方法可以不受限制地使用本领域已知的方法，例如蛋白质印迹法(Western blotting)、斑点印迹法(dot blotting)、酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、放射免疫测定(RIA)、放射免疫扩散法、免疫扩散法、火箭免疫电泳、免疫组织化学染色、免疫沉淀法、补体结合试验、流式细胞分析法(FACS)或蛋白质芯片(chip)等，但并不限于此。使用ELISA方法较为理想。

各标记物的mRNA水平可以利用与mRNA特异性结合的引物组或探针使来自被检体样本的各标记物的mRNA或cDNA扩增，或者利用探针与其杂交，来确定被检体样本中各标记物的mRNA的存在和表达量。引物和探针与本发明的诊断用组合物中所述相同。mRNA表达水平的测定可使用本领域常规的确认表达水平的方法，没有任何限制，例如逆转录聚合酶链反应法(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)、竞争性逆转录聚合酶链反应法(competitive RT-PCR)、实时逆转录聚合酶链反应法(real-time RT-PCR)、核糖核酸酶保护测定法(RPA：RNase protection assay)、RNA印迹法(northernblotting)、DNA微阵列芯片(microarray chip)、RNA测序法(RNA sequencing)、使用纳米串(nanostring)的杂交法、组织切片的原位杂交法(in situ hybridization)等，但并不限于此。

本发明涉及方法的步骤(c)是将步骤(b)中测量的被检体样本的选自KRS和AIMP1所组成的群中一种以上的mRNA或蛋白质的表达水平与正常被检体进行比较，确认该表达水平与正常人相比有所上升的被检体患有大肠癌。

将使用上述步骤(b)的方法测定的被检体的各标记物的表达水平与以相同方式测定的正常被检体的标记物水平进行比较。各标记物的表达水平如果与健康的正常被检体相比有所增加，那么该被检体即可确定患有大肠癌。

本发明还提供了一种大肠癌药剂的筛选方法，包括以下步骤:

(a)将大肠癌治疗候补物质投药至采集自大肠癌患者的样本；

(b)在候补物质存在或不存在的情况下，在所述样本中测定选自赖氨酰tRNA合成酶(KRS)和氨酰tRNA合成酶复合物相互作用多功能蛋白1(AIMP1)所组成的群中至少一种mRNA或蛋白质表达水平；

(c)将候补物质存在时的mRNA或蛋白质的表达水平与候补物质不存在时的mRNA或蛋白质的表达水平进行比较；

(d)候补物质存在时识别使mRNA的表达水平或蛋白质的表达水平减少的候补物质；以及

(e)在细胞或动物中确认所识别的候补物质的抗癌活性。

具体而言，作为在治疗大肠癌的候补物质存在和不存在时，比较选自KRS和AIMP1所组成的群中至少一种的mRNA或蛋白质表达水平的增加或减少的一种方法，可更容易地筛选大肠癌药剂。任何间接或直接减少选自KRS和AIMP1所组成的群中的一种以上mRNA或蛋白质表达水平的物质都可选作大肠癌的药剂。即，在大肠癌治疗候选物质不存在时测定本发明标记物在大肠癌细胞中的表达水平，又在大肠癌治疗候选物质存在时测定本发明标记物在大肠癌细胞中的表达水平，随后将两者进行比较，使大肠癌治疗候补物质存在下本发明标记物的表达水平低于大肠癌治疗候补物质不存在时的标记物表达水平的物质可选为大肠癌药剂。

本发明的所述“抗癌活性”是指抑制异常细胞分裂增加、从正常细胞转化成癌细胞、癌细胞的细胞分裂和增殖、肿瘤的产生和生长等。

本发明的所述“细胞或动物”可以是癌症或肿瘤样本的细胞或动物，如本领域中常用的来自于人类等哺乳动物和动物的细胞、组织、器官等。

本发明提供了用于测定选自KRS(赖氨酰tRNA合成酶，lysyl-tRNA synthetase)和AIMP1(氨酰tRNA合成酶复合物相互作用多功能蛋白1，aminoacyl-tRNA synthetasecomplex-interacting multifunctional protein 1)所组成的群中至少一种的mRNA或蛋白质表达水平的试剂的用途，以制备用于诊断大肠癌的试剂。

测定本发明的所述基因的mRNA表达水平的试剂可以是特异性结合于KRS或AIMP1的mRNA的一组探针或引物，如上所述。

测定本发明的所述蛋白质表达水平的试剂可以是对KRS或AIMP1的蛋白质特异的抗体，如上所述。

本发明中所述KRS的mRNA可以包含序列号1的碱基序列，而AIMP1的mRNA可以包含序列号2的碱基序列。本发明的所述KRS蛋白质可以包含序列号3的氨基酸序列，而AIMP1蛋白可以包含序列号4的氨基酸序列，如上所述。

本发明可提供用于测定选自KRS和AIMP1所组成的群中至少一种以上的mRNA或蛋白质表达水平的试剂的用途，以制备用于诊断大肠癌的试剂盒。本发明的所述试剂盒可以是RT-PCR试剂盒、DNA芯片试剂盒或蛋白质芯片试剂盒，但并不限于此。

【有利效果】

与正常人相比，发现本发明涉及的KRS和AIMP1的大肠癌诊断标记物在大肠癌患者血清中的表达水平有所增加。因此，通过测量选自KRS和AIMP1所组成的群中至少一种标记物的表达水平，可以准确并快速地验证大肠癌的存在或不存在。

附图说明

图1显示的是用斑点杂交法显示的大肠癌患者组和正常人的血清蛋白质数值(A:GRS，B:KRS，C:AIMP1，D:HRS，E:WRS，F:CA-19-9，G:TNF-α，H:IL-10)；

图2是显示血清蛋白质表达水平的ROC曲线的附图。

具体实施方式

以下将对本发明进行具体说明。

只是，以下实施例只是为了对本发明进行说明，本发明的内容并不限于以下实施例。

【实施方法】

1.获取实验样本

大肠癌患者的血清是根据临床实验审查委员会的规定从三星医疗院(大韩民国，首尔)获取。采集并分析了32名正常人和164名大肠癌患者的样本。

用于实验的患者的临床信息如表1所示。

<表1>

正常人和大肠癌患者的临床和病理信息

2.酶联免疫吸附测试(ELISA测试)

使用酶免疫分析试剂盒并根据制造商的说明对正常人和大肠癌患者的血清中分泌的GRS(甘氨酰tRNA合成酶)、KRS(赖氨酰tRNA合成酶)、HRS(组氨酸tRNA合成酶)、WRS(色氨酸tRNA合成酶)、AIMP1(氨酰tRNA合成酶复合物相互作用多功能蛋白1)、TNF-α、IL-10和CA-19-9的数值进行分析。蛋白质的分泌量用微孔板读数器(TECAN)测量。各血清蛋白质分析试剂盒的制造商如下:

GRS,HRS,WRS酶联免疫试剂盒(库萨比奥,中国)

AIMP1酶联免疫试剂盒(Elab science,中国)

KRS酶联免疫试剂盒(Mybiosource,美国)

TNF-a,IL-10(BD science,美国)

CA 19-9(Abnova,台湾)

3.统计分析

使用XLASTAT软件对正常人和大肠癌患者血清中分泌的蛋白质之间的P值进行曼惠特尼检验/双尾检验分析。使用Graphpad Prism 6医学绘图软件分析点印迹图、ROC曲线、AUC和标准偏差。

<实验结果>

<实施例1>

正常人和大肠癌患者的血清分析

为了检索大肠癌特异性标志物，用酶联免疫吸附分析法(ELISA)对32名正常人和164名大肠癌患者的血清蛋白进行了分析。

结果如表2和图1所示。

<表2>

正常人和大肠癌患者的血清蛋白分析

(pg/ml)	正常人	大肠癌患者
			GRS	561.2±137.3	535.5±39.08
KRS	775.6±53.4	507±561.1
			WRS	2345±276.2	2628±115.6
HRS	1574±290.1	1302±55.33
			AIMP1	1711±143.5	2600±68.32
TNF-α	142.5±20.01	113.6±5.092
			IL-10	87.40±13.17	167.9±4.54
CA 19-9	76.63±11.80	284.3±48.03

如表2和图1所示，可以确认大肠癌患者的血清中KRS(赖氨酰tRNA合成酶)和AIMP1(氨酰tRNA合成酶复合物相互作用多功能蛋白1)的蛋白质水平与正常人相比显著增加。尤其是，证实了KRS明显优于传统的大肠癌诊断标记物之一的CA 19-9。

<实施例2>

ROC曲线分析

如图2所示,KRS和AIMP1的ROC的AUC大于0.6、p值小于0.01，从统计学来说，证实KRS和AIMP1的量在大肠癌患者血清中的数值明显高于正常人，因此是优秀的大肠癌标志物。此外，还确认了KRS和AIMP1比大肠癌的常规生物标记物CA-19-9更好。

【工业可用性】

与正常人相比，发现本发明中由KRS和AIMP1组成的大肠癌诊断标记物在大肠癌患者的血清中的表达水平有所增加。因此，通过测定选自KRS和AIMP1所组成的群中至少一种标记物的表达水平，可以准确并快速地验证有无大肠癌，因此具有优异的产业适用性。

<110> 医药生命融合硏究团

<120> 一种用于诊断大肠癌的组合物以及诊断标记物的检测方法

<130> DAG37733

<150> PCT/KR 10-2016-0022470

<151> 2016-02-25

<150> PCT/KR2017/002081

<151> 2017-02-24

<160> 8

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 1794

<212> RNA

<213> Human lysyl-tRNA synthetase(KRS) mRNA

<400> 1

atggcggccg tgcaggcggc cgaggtgaaa gtggatggca gcgagccgaa actgagcaag 60

aatgagctga agagacgcct gaaagctgag aagaaagtag cagagaagga ggccaaacag 120

aaagagctca gtgagaaaca gctaagccaa gccactgctg ctgccaccaa ccacaccact 180

gataatggtg tgggtcctga ggaagagagc gtggacccaa atcaatacta caaaatccgc 240

agtcaagcaa ttcatcagct gaaggtcaat ggggaagacc catacccaca caagttccat 300

gtagacatct cactcactga cttcatccaa aaatatagtc acctgcagcc tggggatcac 360

ctgactgaca tcaccttaaa ggtggcaggt aggatccatg ccaaaagagc ttctggggga 420

aagctcatct tctatgatct tcgaggagag ggggtgaagt tgcaagtcat ggccaattcc 480

agaaattata aatcagaaga agaatttatt catattaata acaaactgcg tcggggagac 540

ataattggag ttcaggggaa tcctggtaaa accaagaagg gtgagctgag catcattccg 600

tatgagatca cactgctgtc tccctgtttg catatgttac ctcatcttca ctttgggctc 660

aaagacaagg aaacaaggta tcgccagaga tacttggact tgatcctgaa tgactttgtg 720

aggcagaaat ttatcatccg ctctaagatc atcacatata taagaagttt cttagatgag 780

ctgggattcc tagagattga aactcccatg atgaacatca tcccaggggg agccgtggcc 840

aagcctttca tcacttatca caacgagctg gacatgaact tatatatgag aattgctcca 900

gaactctatc ataagatgct tgtggttggt ggcatcgacc gggtttatga aattggacgc 960

cagttccgga atgaggggat tgatttgacg cacaatcctg agttcaccac ctgtgagttc 1020

tacatggcct atgcagacta tcacgatctc atggaaatca cggagaagat ggtttcaggg 1080

atggtgaagc atattacagg cagttacaag gtcacctacc acccagatgg cccagagggc 1140

caagcctacg atgttgactt caccccaccc ttccggcgaa tcaacatggt agaagagctt 1200

gagaaagccc tggggatgaa gctgccagaa acgaacctct ttgaaactga agaaactcgc 1260

aaaattcttg atgatatctg tgtggcaaaa gctgttgaat gccctccacc tcggaccaca 1320

gccaggctcc ttgacaagct tgttggggag ttcctggaag tgacttgcat caatcctaca 1380

ttcatctgtg atcacccaca gataatgagc cctttggcta aatggcaccg ctctaaagag 1440

ggtctgactg agcgctttga gctgtttgtc atgaagaaag agatatgcaa tgcgtatact 1500

gagctgaatg atcccatgcg gcagcggcag ctttttgaag aacaggccaa ggccaaggct 1560

gcaggtgatg atgaggccat gttcatagat gaaaacttct gtactgccct ggaatatggg 1620

ctgcccccca cagctggctg gggcatgggc attgatcgag tcgccatgtt tctcacggac 1680

tccaacaaca tcaaggaagt acttctgttt cctgccatga aacccgaaga caagaaggag 1740

aatgtagcaa ccactgatac actggaaagc acaacagttg gcacttctgt ctag 1794

<210> 2

<211> 939

<212> RNA

<213> Human aminoacyl-tRNA synthetase complex-interacting multifunctionalProtein 1 mRNA

<400> 2

atggcaaata atgatgctgt tctgaagaga ctggagcaga agggtgcaga ggcagatcaa 60

atcattgaat atcttaagca gcaagtttct ctacttaagg agaaagcaat tttgcaggca 120

actttgaggg aagagaagaa acttcgagtt gaaaatgcta aactgaagaa agaaattgaa 180

gaactgaaac aagagctaat tcaggcagaa attcaaaatg gagtgaagca aataccattt 240

ccatctggta ctccactgca cgctaattct atggtttctg aaaatgtgat acagtctaca 300

gcagtaacaa ccgtatcttc tggtaccaaa gaacagataa aaggaggaac aggagacgaa 360

aagaaagcga aagagaaaat tgaaaagaaa ggagagaaga aggagaaaaa acagcaatca 420

atagctggaa gtgccgactc taagccaata gatgtttccc gtctggatct tcgaattggt 480

tgcatcataa ctgctagaaa acaccctgat gcagattctt tgtatgtgga agaagtagat 540

gtcggagaaa tagccccaag gacagttgtc agtggcctgg tgaatcatgt tcctcttgaa 600

cagatgcaaa atcggatggt gattttactt tgtaacctga aacctgcaaa gatgagggga 660

gtattatctc aagcaatggt catgtgtgct agttcaccag agaaaattga aatcttggct 720

cctccaaatg ggtctgttcc tggagacaga attacttttg atgctttccc aggagagcct 780

gacaaggagc tgaatcctaa gaagaagatt tgggagcaga tccagcctga tcttcacact 840

aatgatgagt gtgtggctac atacaaagga gttccctttg aggtgaaagg gaagggagta 900

tgtagggctc aaaccatgag caacagtgga atcaaataa 939

<210> 3

<211> 597

<212> PRT

<213> Human KRS protein

<400> 3

Met Ala Ala Val Gln Ala Ala Glu Val Lys Val Asp Gly Ser Glu Pro

1 5 10 15

Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys

20 25 30

Val Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu Leu Ser Glu Lys Gln Leu

35 40 45

Ser Gln Ala Thr Ala Ala Ala Thr Asn His Thr Thr Asp Asn Gly Val

50 55 60

Gly Pro Glu Glu Glu Ser Val Asp Pro Asn Gln Tyr Tyr Lys Ile Arg

65 70 75 80

Ser Gln Ala Ile His Gln Leu Lys Val Asn Gly Glu Asp Pro Tyr Pro

85 90 95

His Lys Phe His Val Asp Ile Ser Leu Thr Asp Phe Ile Gln Lys Tyr

100 105 110

Ser His Leu Gln Pro Gly Asp His Leu Thr Asp Ile Thr Leu Lys Val

115 120 125

Ala Gly Arg Ile His Ala Lys Arg Ala Ser Gly Gly Lys Leu Ile Phe

130 135 140

Tyr Asp Leu Arg Gly Glu Gly Val Lys Leu Gln Val Met Ala Asn Ser

145 150 155 160

Arg Asn Tyr Lys Ser Glu Glu Glu Phe Ile His Ile Asn Asn Lys Leu

165 170 175

Arg Arg Gly Asp Ile Ile Gly Val Gln Gly Asn Pro Gly Lys Thr Lys

180 185 190

Lys Gly Glu Leu Ser Ile Ile Pro Tyr Glu Ile Thr Leu Leu Ser Pro

195 200 205

Cys Leu His Met Leu Pro His Leu His Phe Gly Leu Lys Asp Lys Glu

210 215 220

Thr Arg Tyr Arg Gln Arg Tyr Leu Asp Leu Ile Leu Asn Asp Phe Val

225 230 235 240

Arg Gln Lys Phe Ile Ile Arg Ser Lys Ile Ile Thr Tyr Ile Arg Ser

245 250 255

Phe Leu Asp Glu Leu Gly Phe Leu Glu Ile Glu Thr Pro Met Met Asn

260 265 270

Ile Ile Pro Gly Gly Ala Val Ala Lys Pro Phe Ile Thr Tyr His Asn

275 280 285

Glu Leu Asp Met Asn Leu Tyr Met Arg Ile Ala Pro Glu Leu Tyr His

290 295 300

Lys Met Leu Val Val Gly Gly Ile Asp Arg Val Tyr Glu Ile Gly Arg

305 310 315 320

Gln Phe Arg Asn Glu Gly Ile Asp Leu Thr His Asn Pro Glu Phe Thr

325 330 335

Thr Cys Glu Phe Tyr Met Ala Tyr Ala Asp Tyr His Asp Leu Met Glu

340 345 350

Ile Thr Glu Lys Met Val Ser Gly Met Val Lys His Ile Thr Gly Ser

355 360 365

Tyr Lys Val Thr Tyr His Pro Asp Gly Pro Glu Gly Gln Ala Tyr Asp

370 375 380

Val Asp Phe Thr Pro Pro Phe Arg Arg Ile Asn Met Val Glu Glu Leu

385 390 395 400

Glu Lys Ala Leu Gly Met Lys Leu Pro Glu Thr Asn Leu Phe Glu Thr

405 410 415

Glu Glu Thr Arg Lys Ile Leu Asp Asp Ile Cys Val Ala Lys Ala Val

420 425 430

Glu Cys Pro Pro Pro Arg Thr Thr Ala Arg Leu Leu Asp Lys Leu Val

435 440 445

Gly Glu Phe Leu Glu Val Thr Cys Ile Asn Pro Thr Phe Ile Cys Asp

450 455 460

His Pro Gln Ile Met Ser Pro Leu Ala Lys Trp His Arg Ser Lys Glu

465 470 475 480

Gly Leu Thr Glu Arg Phe Glu Leu Phe Val Met Lys Lys Glu Ile Cys

485 490 495

Asn Ala Tyr Thr Glu Leu Asn Asp Pro Met Arg Gln Arg Gln Leu Phe

500 505 510

Glu Glu Gln Ala Lys Ala Lys Ala Ala Gly Asp Asp Glu Ala Met Phe

515 520 525

Ile Asp Glu Asn Phe Cys Thr Ala Leu Glu Tyr Gly Leu Pro Pro Thr

530 535 540

Ala Gly Trp Gly Met Gly Ile Asp Arg Val Ala Met Phe Leu Thr Asp

545 550 555 560

Ser Asn Asn Ile Lys Glu Val Leu Leu Phe Pro Ala Met Lys Pro Glu

565 570 575

Asp Lys Lys Glu Asn Val Ala Thr Thr Asp Thr Leu Glu Ser Thr Thr

580 585 590

Val Gly Thr Ser Val

595

<210> 4

<211> 312

<212> PRT

<213> Human AIMP1 protein

<400> 4

Met Ala Asn Asn Asp Ala Val Leu Lys Arg Leu Glu Gln Lys Gly Ala

1 5 10 15

Glu Ala Asp Gln Ile Ile Glu Tyr Leu Lys Gln Gln Val Ser Leu Leu

20 25 30

Lys Glu Lys Ala Ile Leu Gln Ala Thr Leu Arg Glu Glu Lys Lys Leu

35 40 45

Arg Val Glu Asn Ala Lys Leu Lys Lys Glu Ile Glu Glu Leu Lys Gln

50 55 60

Glu Leu Ile Gln Ala Glu Ile Gln Asn Gly Val Lys Gln Ile Pro Phe

65 70 75 80

Pro Ser Gly Thr Pro Leu His Ala Asn Ser Met Val Ser Glu Asn Val

85 90 95

Ile Gln Ser Thr Ala Val Thr Thr Val Ser Ser Gly Thr Lys Glu Gln

100 105 110

Ile Lys Gly Gly Thr Gly Asp Glu Lys Lys Ala Lys Glu Lys Ile Glu

115 120 125

Lys Lys Gly Glu Lys Lys Glu Lys Lys Gln Gln Ser Ile Ala Gly Ser

130 135 140

Ala Asp Ser Lys Pro Ile Asp Val Ser Arg Leu Asp Leu Arg Ile Gly

145 150 155 160

Cys Ile Ile Thr Ala Arg Lys His Pro Asp Ala Asp Ser Leu Tyr Val

165 170 175

Glu Glu Val Asp Val Gly Glu Ile Ala Pro Arg Thr Val Val Ser Gly

180 185 190

Leu Val Asn His Val Pro Leu Glu Gln Met Gln Asn Arg Met Val Ile

195 200 205

Leu Leu Cys Asn Leu Lys Pro Ala Lys Met Arg Gly Val Leu Ser Gln

210 215 220

Ala Met Val Met Cys Ala Ser Ser Pro Glu Lys Ile Glu Ile Leu Ala

225 230 235 240

Pro Pro Asn Gly Ser Val Pro Gly Asp Arg Ile Thr Phe Asp Ala Phe

245 250 255

Pro Gly Glu Pro Asp Lys Glu Leu Asn Pro Lys Lys Lys Ile Trp Glu

260 265 270

Gln Ile Gln Pro Asp Leu His Thr Asn Asp Glu Cys Val Ala Thr Tyr

275 280 285

Lys Gly Val Pro Phe Glu Val Lys Gly Lys Gly Val Cys Arg Ala Gln

290 295 300

Thr Met Ser Asn Ser Gly Ile Lys

305 310

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Human KRS forward primer

<400> 5

aggaaacaag gtatcgccag a 21

<210> 6

<211> 22

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Human AIMP1 forward primer

<400> 6

ctggtgaatc atgttcctct tg 22

<210> 7

<211> 23

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Human KRS reverse primer

<400> 7

cagctcgttg tgataagtga tga 23

<210> 8

<211> 25

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Human AIMP1 reverse primer

<400> 8

ggaaagcatc aaaagtaatt ctgtc 25

Claims

1.一种用于诊断大肠癌的组合物，包含用于测量选自赖氨酰tRNA合成酶KRS和氨酰tRNA合成酶复合物相互作用多功能蛋白1 AIMP1所组成的群中至少一种mRNA或蛋白质表达水平的制剂。

2.根据权利请求项1所述的组合物，其特征在于，测定所述mRNA的表达水平的制剂是特异性结合KRS或AIMP1的mRNA的一组探针或引物。

3.根据权利请求项1所述的组合物，其特征在于，用于测量所述蛋白质的表达水平的制剂是对KRS或AIMP1的蛋白质特异的抗体。

4.根据权利请求项1所述的组合物，其特征在于，包括KRS的mRNA标记为序列号1、AIMP1的mRNA标记为序列号2的碱基序列。

5.根据权利请求项1所述的组合物，其特征在于，包括所述KRS蛋白质标记为序列号3、AIMP1蛋白质标记为序列号4的氨基酸序列。

6.一种用于诊断大肠癌的试剂盒，包括用于测量选自赖氨酰tRNA合成酶KRS和氨酰tRNA合成酶复合物相互作用多功能蛋白1 AIMP1所组成的群中至少一种mRNA或蛋白质表达水平的制剂。

7.根据权利请求项6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是RT-PCR试剂盒、DNA芯片试剂盒或蛋白质芯片试剂盒。

8.一种大肠癌标志物的检测方法，以提供大肠癌诊断所需的信息，该方法包括以下步骤:

(a)从被检体获取样本；

(b)测定样本中选自赖氨酰tRNA合成酶KRS和氨酰tRNA合成酶复合物相互作用多功能蛋白1 AIMP1所组成的群中至少一种mRNA或蛋白质的表达水平；和

(c)将所述mRNA的表达水平或蛋白质的表达水平与正常比对样本所对应的mRNA或蛋白质表达水平进行比较，确定表达水平增加的被检体患有大肠癌。

9.根据权利请求项8所述的检测方法，其特征在于，所述样本选自血液、血浆、血清、唾液、鼻液、痰、囊液、羊水、腹水、宫颈或阴道分泌物、尿和脑脊液所组成的群。

10.根据权利请求项8所述的检测方法，其特征在于，测定所述mRNA的表达水平的方法选用逆转录聚合酶链反应法、竞争性逆转录聚合酶链反应法、实时逆转录聚合酶链反应法、RNase保护测定法、RNA印迹法及DNA微阵列芯片等组成的群中任意一个。

11.根据权利请求项8所述的检测方法，其特征在于，测定所述蛋白质表达水平的方法选用蛋白质印迹法、ELISA、放射免疫测定、放射免疫扩散法、免疫扩散法、火箭免疫电泳、免疫组织化学染色、免疫沉淀法、补体结合试验、FACS及蛋白质芯片等所组成的群中任意一个。

12.一种筛选大肠癌药剂的方法，包括以下步骤:

(c)将候补物质存在情况下的mRNA或蛋白质水平与候补物质不存在的情况下的mRNA或蛋白质水平进行比较；

(e)在细胞或动物中确认所识别的候补物质的抗癌活性。

13.一种用于测定选自赖氨酰tRNA合成酶KRS和氨酰tRNA合成酶复合物相互作用多功能蛋白1 AIMP1所组成的群中至少一种以上的mRNA或其蛋白质的表达水平的制剂的用途，以制备用于诊断大肠癌的试剂。

14.根据权利请求项13所述的用途，其特征在于，用于测定所述mRNA水平的试剂是特异性结合KRS或AIMP1的mRNA的一组探针或引物。

15.根据权利请求项13所述的用途，其特征在于，测定所述蛋白质的表达水平的试剂是对KRS或AIMP1的蛋白质特异的抗体。