CN107447033B - 一种结直肠癌诊断生物标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种结直肠癌诊断生物标志物及其应用,核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明首次发现了hsa_circ_0006110基因表达与结直肠癌密切相关,通过检测受试者结直肠组织中hsa_circ_0006110的表达,可以断更加准确、快速的判断受试者是否已患有结直肠癌或是否存在患有结直肠癌的风险,从而给临床医师提供预防或治疗方案。并且作为制备治疗结直肠癌药物的靶基因为治疗结直肠癌提供了新的治疗靶点和治疗途径,与传统的检测手段相比,分子标志物的诊断更及时、更特异,从而提高结直肠癌患者的5年生存率,降低死亡率,应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域,具体涉及一种环状RNA hsa_circ_0006110以及作为标志物在结直肠癌诊断中的应用。
背景技术
结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是最常见的消化道恶性肿瘤之一,为男性第三位和女性第二位的常见肿瘤,居癌症死亡第二位。据世界卫生组织国际癌症研究署估计,2008年全世界约有120万结直肠癌新发病例,其死亡率约占全部恶性肿瘤的8%。随着我国近30年经济和生活的改善,结直肠癌在我国的发病和死亡情况均呈上升趋势,位居我国恶性肿瘤发病第三位和死亡第五位,严重威胁着人们的健康和生命。结直肠癌在全球范围内具有明显的地域分布差异,高发地区主要为澳大利亚、新西兰、欧洲及北美等地区,而在非洲、中南亚等地区发病率较低。2010年我国结直肠癌粗发病率为20.90/10万,中国人口标化率为16.14/10万;粗死亡率为10.05/10万,中国人口标化率为7.55/10万,发病率和死亡率均高于发展中国家的平均水平。大部分结直肠癌患者确诊时已处于肿瘤进展期,失去了最佳的治疗时机,导致五年生存率不到20%,预后较差。因此,探索结直肠癌快速诊断的评估方法,提高诊疗水平,提高存活率,是当前研究的热点和难点。
目前临床上用于结直肠癌诊断的方法包括:光学检查和形态学检查,常规的检查方法主要有排泄物便潜血检查、排泄物免疫学检查、钡剂双重造影检查、弹性乙状结肠镜检查、结肠镜检查和CT结肠成像。但是,上述检测方法仍存在一定局限性,如便潜血检查分离过程繁琐,易受细菌、食物及肠道粘液等干扰;结肠镜检查对设备和检测人员技术的要求较高,误诊率较大。
随着结直肠癌的发病机制的研究越来越广泛,分子生物标记物在其中的重要性越来越明显。这些标记物已成为结直肠癌诊断和治疗的重要靶点。环状RNA(circular RNA,circRNA)是近些年发现的一类特殊的非编码RNA,是区别于传统线性RNA的RNA家族新成员,不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。最新研究表明circRNA具有闭合环状结构,主要通过非典型可变剪切加工产生,广泛存在于各种生物细胞中,具有结构稳定,难以被RNA酶降解、表达丰度高、物种间保守性好,表达具有组织及时空特异性等特征。同时,circRNA在人类细胞中的分布丰度超过相关线性mRNA分子,且比其他非编码RNA(如microRNA)具有更稳定的性质和更长的半衰期。这些特点使得circRNA在新型疾病诊断与治疗方法的开发应用上具有广阔的前景。
hsa_circ_0006110其在基因组上的定位为:chr2:61456682-61459667,相应的线性基因为USP34(NM_014709),环化序列有167个碱基,包含2个外显子。
发明内容
解决的技术问题:本发明发明人根据对6对结直肠癌患者的肠道内癌和癌旁组织样本进行高通量芯片数据处理及分析,得到标准化的环状RNA表达谱数据,进而筛选出差异表达的环状RNA——hsa_circ_0006110。通过分析hsa_circ_0006110在人结直肠癌中的表达,提供一种特异性强、灵敏度高的结直肠癌诊断生物标志物及其应用。
技术方案:一种结直肠癌诊断生物标志物,命名为hsa_circ_0006110,核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
上述结直肠癌诊断生物标志物在制备结直肠癌诊断试剂盒中的应用。
上述结直肠癌诊断生物标志物的引物组合,由如Primer pair 1至Primer pair10所示的DNA序列的引物对组成。
上述结直肠癌诊断生物标志物的引物组合在制备结直肠癌诊断试剂盒中的应用。
上述结直肠癌诊断生物标志物的引物组合在制备或筛选结直肠癌的诊断药物中的用途。
一种结直肠癌诊断试剂盒,包括上述结直肠癌诊断生物标志物。
一种结直肠癌诊断试剂盒,包括上述结直肠癌诊断生物标志物的引物组合。
一种检测结直肠癌的环状RNA芯片,所述环状RNA芯片包括固相载体以及固定于固相载体上的针对上述生物标志物的探针。
作为优选方案,一种结直肠癌诊断试剂盒,所述试剂盒通过检测hsa_circ_0006110基因的表达水平进行诊断,所述试剂盒主要包括:扩增hsa_circ_0006110基因的特异性引物(RT-PCR诊断试剂盒或荧光定量PCR诊断试剂盒),或者与hsa_circ_0006110基因的核酸序列杂交的探针(原位杂交诊断试剂盒),以及检测用试剂(相应PCR反应或免疫检测、原位杂交以及表达水平检测所需要的试剂)。所述结直肠癌诊断包含判断受试者是否已患结直肠癌,也包含判断受试者是否存在患有结直肠癌的风险。
所述与hsa_circ_0006110基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其他衍生物。所述探针长度没有限制,能够完成特异性杂交且与目的核苷酸序列特异性结合均可。所述探针长度范围大于10个碱基。
有益效果:本发明首次发现了hsa_circ_0006110基因表达与结直肠癌密切相关,通过检测受试者结直肠组织中hsa_circ_0006110的表达,可以更加准确、快速的判断受试者是否已患有结直肠癌或是否存在患有结直肠癌的风险,从而给临床医师提供预防或治疗方案。并且作为制备治疗结直肠癌药物的靶基因为治疗结直肠癌提供了新的治疗靶点和治疗途径,与传统的检测手段相比,分子标志物的诊断更及时、更特异,从而提高结直肠癌患者的5年生存率,降低死亡率,应用前景广阔。
附图说明
图1为hsa_circ_0006110的结构示意图。
图2为火山图。每个圆点代表一种基因,以横坐标“0”为分界点,左侧为下调基因,右侧为上调基因。
图3为差异表达基因热图。红色表示上调基因,蓝色表示下调基因。
图4为Real-time PCR检测hsa_circ_0006110在正常肠上皮细胞系(NCM460)和结直肠癌细胞系(HCT116、SW620、RKO)的表达情况(以β-actin为内参,2-ΔΔCt值比较,*为P<0.05,***为P<0.001)。
图5为hsa_circ_0006110在临床结直肠癌及癌旁组织中的表达状况(以GAPDH为内参,2-ΔΔCt值比较,***为P<0.001)。
具体实施方式
本发明首先将从江苏省肿瘤医院获取的6对结直肠癌患者肠道内癌和癌旁组织样本进行高通量芯片数据处理及分析。按照高通量芯片处理及分析流程控制方法,导入环状RNA高通量原始芯片数据,经过信号值筛选和标准化得到理论上有效的环状RNA,在此基础上进行差异表达分析。
上述circRNA的筛选方法具体包括一下步骤:
1.分别收集6名结直肠癌患者肠道内癌组织与癌旁组织的样本,以及6名结直肠腺瘤患者的肠道腺瘤组织与肠道正常组织,提取总RNA。
2.对所获得的RNA进行质量检测和RNase R处理,之后合成cDNA和aRNA样品并标记。
3.采用Arraystar公司的环状RNA芯片技术,在标准条件下将标记好的探针与高密度基因芯片进行杂交。
4.使用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度,并将实验结果转换成数字型数据以便分析运算。
5.对所述的环状RNA高通量芯片原始信号文件进行质量分析并剔除低质量信号数据,获得经过筛选的信号数据,并将所述的经过筛选的数据进行前景值和背景值校正,得到消除噪音污染的环状RNA信号数据。
6.将校正过的信号数据进行标准化,并去除极值,得到理论上有效的环状RNA表达值。
最终筛选出来的差异表达的环状RNA——hsa_circ_0006110。通过分析该基因在人结直肠癌中的表达及其对结直肠癌细胞生物学功能的调节作用的研究,发现hsa_circ_0006110的表达在癌组织中表现为下调。
根据高通量芯片处理及分析的结果,设计能扩增hsa_circ_0006110的特异性引物,经PCR扩增出来的环状RNA,接着进行RNaseR降解实验,确定了hsa_circ_0006110基因是一种由167个核苷酸组成的,具有闭合环状结构的环状RNA分子,本发明所述环状RNA hsa_circ_0006110的结构示意图如图1所示。
接着,我们对hsa_circ_0006110基因进行了体外细胞功能学的研究,采用荧光定量PCR法检测hsa_circ_0006110基因在结直肠癌细胞系和正常肠上皮细胞系差异表达。结果表明与正常肠上皮细胞系NCM460相比,结直肠癌细胞系(HCT116、SW620和RKO)hsa_circ_0006110基因的表达量均显著下降。
进一步,本发明通过采用荧光定量PCR的方法检测hsa_circ_0006110在结直肠癌与癌旁组织样本中的表达差异,结果显示hsa_circ_0006110在结直肠癌组织中的表达水平明显低于癌旁组织中的表达水平。故可将该基因作为生物标志物以用于诊断结直肠癌。
以下例证的本发明可以合适地在不存在未在本文中具体揭示的任何一或多种元件、一或多种限制的条件下实施。本发明将根据特定的实施方案参照附图加以描述,但是本发明不受其限制,仅受权利要求书限制。所描述的附图仅是示意性的,被认为是非限制性的。
当术语“包含”被用于本发明说明书和权利要求书中时,其不排除其它元件或步骤。为本发明目的,术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中组被限定为包含至少一定数目的实施方案,这也被理解为揭示了优选地仅由这些实施方案组成的组。
当指代单数形式名词使用不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”,“所述”时,包括该名词的复数形式,除非特别指出。
另外,术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)等在说明书和权利要求书中用于区分类
似的元件,不是必须描述顺序或时间次序。应理解如此应用的术语在合适情况下可互换,并且本发明描述的实施方案能以不同于本文所述或例证的其它顺序操作。
术语的进一步定义在下文中使用术语时给出。
以下术语或定义仅为了理解本发明。这些定义不应被认为具有小于本领域技术人员理解的范围。
本发明的研究目的是提供用于结直肠癌手术切除及肠镜活检组织,可靠地诊断结直肠癌的环状RNA生物标记及检测方法。与健康对照细胞相比,核酸分子编码circRNA序列在其中所述的一种在所分析的靶细胞中差异表达,并且该差异表达的核酸分子代表这样的核酸表达生物标记,该核酸表达生物标记是鉴别结直肠癌的指征。
本文所用术语“癌症”(也称为“癌”)通常指任何类型的恶性赘生物,即与未受影响的(健康)野生型对照细胞相比显示或具有发生癌特征的倾向的靶细胞的任何形态学和/或生理学改变。这种改变的例子可涉及细胞大小和形状(变大或变小)、细胞增殖(细胞数增加)、细胞分化(生理学状态中的变化)、凋亡(程序性细胞死亡)或细胞存活。因此,术语“结直肠癌”是指在结肠、直肠和阑尾中的癌性生长。
本发明中采用的哺乳动物靶细胞可以是人或非人类来源的。本发明通常用人类细胞进行。本文所用术语“一或多种细胞”应被理解为不仅包括个体细胞,也包括组织、器官和生物体。本文所用术语“靶细胞”是指被至少认定是显示或具有发生结肠直肠癌倾向的细胞,其中术语“对照细胞”通常是指不具有这种癌性表型的特征的(健康)野生型细胞。但是在一些应用中,例如当比较显示不同癌或癌前状态的细胞时,具有不太严重疾病特征的细胞通常被认为是“对照细胞”。通常,所用的靶细胞和对照细胞衍生自从待被诊断是否存在结直肠癌或具有发生结肠直肠癌倾向的对象中收集的生物学样品。另外,为了确证数据,“比较样品”也可以从患有给定的已知疾病状态的对象中收集。生物学样品可包括身体组织和液体,如血液、痰和尿。另外,生物学样品可含有衍生自以下细胞的细胞提取物或含有以下细胞的细胞群:上皮细胞,优选癌性上皮细胞或衍生自疑为癌性的组织的上皮细胞。更优选的是,生物学样品包含衍生自腺组织的细胞群。另外,如果需要,细胞可以从获得的身体组织和液体中纯化,然后用作生物学样品。根据本发明,本发明的核酸标记的表达水平在对象衍生的生物学样品中确定。
用于在本发明的体外方法中检测的样品通常应以临床可接受的方式收集,优选以核酸(特别是RNA)或蛋白质被保护的方式收集。待分析的样品通常是结肠直肠活组织检查样品或切除物。来自肿瘤组织的完整细胞或细胞裂解物也可以不经介入而从结肠脱落,并最终在粪便中。因此,大便样品也被认为是分离RNA的合适来源。另外,结直肠腺癌细胞可迁移进其它组织。因此,血液及其它类型样品也可以使用。活组织检查样品或切除物可含有大部分腺瘤细胞和仅少部分腺癌细胞。为增加信号/背景比,切除物可以在分析之前分成不同的亚样品(例如,通过激光捕获显微切割)。即使活组织检查样品或切除物中的癌细胞总数有限,至少一个亚样品可含有增加的腺癌对腺瘤细胞比率。样品特别在最初加工之后可以合并。但是也可以使用未合并的样品。
本发明不限于RNA分子,也包括相应的编码环状RNA的DNA分子,例如通过逆转录circRNA序列产生的DNA分子。编码本发明的环状RNA序列的核酸分子通常编码单个circRNA序列(即个体circRNA)。但是,也可能这种核酸分子编码两个或多种miRNA序列(即两个或多种circRNA),例如转录单位包含在常用调节序列如启动子或转录终止子控制下的两个或多种circRNA序列。
本文所用术语“编码环状RNA序列的核酸分子”也被理解为包括“有义核酸分子”(即核酸序列(5'→3')匹配或相应于所编码的circRNA(5'→3')序列的分子)及“反义核酸分子”(即核酸序列互补于所编码的miRNA(5'→3')序列或者换句话说匹配所编码的circRNA序列的反向互补序列(3'→5')的分子)。本文所用术语“互补于”是指“反义”核酸分子序列与相应的“有义”核酸分子序列(具有互补于反义序列的序列)形成碱基对、优选Watson-Crick碱基对的能力。
在本发明范围内,两个核酸分子(即“有义”和“反义”分子)可以完全互补,即它们不含有任何碱基错配和/或额外的或缺失的核苷酸。或者,两个分子包含一或多种碱基错配或者它们的核苷酸总数不同(由于添加或缺失导致)。优选地,“互补”核酸分子包含显示与包含在相应的“有义”核酸分子中的序列完全互补的至少10个连续核苷酸。
因此,包含在本发明的诊断试剂盒中的编码circRNA序列的多种核酸分子可包括一或多种“有义核酸分子”和/或一或多种“反义核酸分子”。有时,诊断试剂盒包括一或多种“有义核酸分子”(即circRNA序列本身),所述分子被认为组成了差异表达的circRNA(即分子标记)的全体或至少一个亚集合,是存在特定疾病或发生特定疾病的倾向的指征,所述特定疾病在本文中是结肠直肠癌,优选表现为腺癌的结肠直肠癌。另一方面,诊断试剂盒包括一或多种“反义核酸分子”(即与circRNA序列互补的序列)时,所述分子可包含适合用于检测和/或定量给定样品中的一或多种特定(互补)circRNA序列的探针分子(用于进行杂交测定)和/或寡核苷酸引物(例如用于逆转录或PCR应用)等。
在本发明中所涉及关于环状RNA生物标记诊断试剂盒鉴别结直肠癌的一或多种哺乳动物靶细胞。与健康对照细胞相比,一种核酸分子编码环状RNA(circRNA)序列在所分析的靶细胞中差异表达,此差异表达的核酸分子代表这样的核酸表达生物标记,该核酸表达生物标记是鉴别早期结直肠癌和高级腺瘤的指征。在进一步优选的实施方案中,编码circRNA序列的核酸分子所代表的生物标记,其表达在一或多种靶细胞中与一或多种对照细胞相比被下调(即其浓度降低)。
本发明所涉及的技术均为分子生物学常规技术手段,其中涉及的酶、引物、试剂以及反应条件在未作说明的情况下均可根据本领域技术人员的经验进行合理选择,其中涉及试剂耗材属于市售的普通产品,其中涉及的检测手段以及仪器也均为本领域技术人员所熟知并熟练掌握。
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
实施例1:环状RNA的高通量芯片处理及分析
首先对原始数据进行过滤处理,然后去除低质量信号和噪音污染的数据,经过标准化后得到有效的环状RNA表达值。在上述分析的基础上,可进行一系列的统计学和可视化分析。
本研究以变化倍数(Fold Change,FC)≥1.5且P<0.05为标准,筛选表达有统计学差异的mRNAs,应用火山图表示(图2)。再将筛选出的差异表达mRNAs用热图表示(图3)。
实施例2:荧光定量PCR法检测hsa_circ_0006110基因在结直肠癌细胞系和正常肠上皮细胞系差异表达
1.培养人结直肠癌细胞系(SW620、HCT116和RKO)和人正常肠上皮细胞系NCM460,具体培养方法如下:人正常肠道细胞系NCM460用含10%胎生牛血清和青霉素、链霉素各100U/mL的DMEM培养基在37℃及5%CO2的孵育箱中培养,每2~3天更换培养液并传代。人肠癌HCT116、SW620和RKO细胞系采用DMEM(含10%胎牛血清)在37℃及5%CO2的孵育箱中培养。
2.待细胞在60mm培养皿中的融合度达到80%时,弃去培养液,加入1mL无菌PBS清洗,弃去PBS后重复1次,加入1mL Trizol RNA提取液,左右轻轻晃动培养皿,使Trizol RNA提取液全部没过培养皿底部,采用1mL移液枪轻轻吹打贴壁的细胞,使得细胞完全悬浮于Trizol RNA提取液中,将含有细胞的Trizol RNA提取液收集至1.5mL无菌的EP管中。
(1)抽提:加入500μL的氯仿,剧烈颠倒混匀15~30s,放入4℃低温离心机中离心,12000g离心10min。样品将分为三层:上层为无机水相含有RNA,中间层和下层为含有蛋白或其他杂质的有机相。
(2)沉淀:取上层水相于新的EP管,按水相与异丙醇(4℃预冷)1:1的体积比例加入异丙醇,上下颠倒混匀(轻柔),室温放置10min,12000g离心10min。此时注意:一般取2/3水相体积,一般中层白色沉淀出现扰动即不再抽取,否则会影响提取RNA的纯度。中下层-80℃保存,可用来提取蛋白。
(3)洗涤:弃上清液,加入1mL 75%乙醇,放入4℃低温离心机中离心,12000rpm离1min,弃上清后重复该步骤。
(5)干燥:吸干管中的乙醇,室温下干燥RNA沉淀2~3min。
(6)溶解:加入30μL ddH2O溶解RNA沉淀。
(7)测定浓度:用Nanodrop 2000紫外分光光度计检测RNA样品的浓度。
3、RNA反转录得到cDNA
采用TOROBO公司反转录试剂盒进行cDNA反转录,实验操作按产品说明书进行,具体操作如下:
(1)在200μL PCR管中配制去除DNA的反应液,总体系10μL,包含gDNA Eraser 1μL,5×gDNA Eraser Buffer 2μL,RNA xμL,RNase Free dH2O 7-xμL,RNA的体积由浓度决定,x=1μg/RNA浓度。
(2)将装有配制好的去DNA反应液的PCR管放入PCR仪中,42℃孵育2min。
(3)在新的200μL PCR管中配制反转录反应液,体系为10μL,包含5×PrimeSriptBuffer 4μL,PrimeSript RT Enzyme Mix I 1μL,RT Primer Mix 1μL,RNase Free dH2O 4μL。
(4)将前两步得到的10μL溶液混合得到20μL体系,PCR仪37℃孵育5min,85℃孵育5s,得到反转录的cDNA,RNase Free dH2O稀释成100μL。
4、荧光定量PCR检测:
(1)在96孔板中,每管配制荧光定量PCR反应液,总体积20μL,SYBR Premix Ex TaqII 10μL,hsa_circ_0006110上游引物0.8μL,hsa_circ_0006110下游引物0.8μL,ROX DyeII 0.4μL,cDNA模板2μL,RNase Free dH2O 6μL。
(2)封盖后放入PCR检测仪中,程序设定为:50℃2min,95℃10min,接着45个循环:95℃15s,61℃60s。
5、数据分析:实验均按照重复3次完成,采用相对定量2-ΔΔCt的方法进行统计分析,GAPDH作为内参基因,数据利用GraphPad 5.0软件进行分析,所有统计结果均以P<0.01认为存在显著差异。
6、结果:与正常肠上皮细胞系NCM460相比,结直肠癌细胞系(SW620、HCT116和RKO)hsa_circ_0006110基因的表达量均显著下降(P<0.001)(图4)。
实施例3:RT-PCR反应检测hsa_circ_0006110基因在结直肠癌与癌旁组织中的差异表达。
1、收集25对结直肠癌组织和对应的远处正常肠组织样本,每例患者标本均有明确的诊断记录,并通过伦理委员会的同意,收集标本后冻存于液氮。
2、RNA样品的制备
(1)样品的前处理:从液氮罐中取出样本,将样本放入2mL的无菌EP管中,加入1mLTrizol RNA提取液,用0.1%DEPC水浸泡过夜并用消毒的剪刀剪碎后放入组织匀浆器中充分研磨。
3、RNA提取、反转录、荧光定量PCR和数据分析方法同实施例2。
4、结果:在25对结直肠癌临床组织样本中检测hsa_circ_0006110表达量,经配对T检验,结果显示hsa_circ_0006110在癌组织中显著下调。(图5)
SEQ ID NO:1
Primer pair 1
Primer pair 2
Primer pair 3
Primer pair 4
Primer pair 5
Primer pair 6
Primer pair 7
Primer pair 8
Primer pair 9
Primer pair 10
以上所述,仅为本发明的较佳实施例,并非对本发明任何形式上和实质上的限制,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还将可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明的精神和范围的情况下,当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化,均为本发明的等效实施例;同时,凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变,均仍属于本发明的技术方案的范围内。
序列表
<110> 东南大学
<120> 一种结直肠癌诊断生物标志物及其应用
<130> F1703434
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 167
<212> DNA
<213> 人工序列(colorectal cancer hsa_circ_0006110)
<400> 1
gatgtttcag cgtttgtgta tccatgtgat tcagaggctg agacctgtgc atgctcatct 60
ctatttgcag ccaggaatgg aagatggtgg tttttagatc gtatggctga tgacgactgg 120
tggccaatgc agatactaat taagtgccct aatcaaattg tgagaca 167
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Primer pair 1-F1)
<400> 2
ggaatggaag atggtggttt tt 22
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Primer pair 1-R1)
<400> 3
tgtctcacaa tttgattagg gcac 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Primer pair 2-F2)
<400> 4
tggaagatgg tggtttttag atcg 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Primer pair 2-R2)
<400> 5
tgtctcacaa tttgattagg gcac 24
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Primer pair 3-F3)
<400> 6
ggaatggaag atggtggttt tt 22
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Primer pair 3-R3)
<400> 7
tgtctcacaa tttgattagg gca 23
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Primer pair 4-F4)
<400> 8
tggaagatgg tggtttttag atcg 24
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Primer pair 4-R4)
<400> 9
tgtctcacaa tttgattagg gca 23
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Primer pair 5-F5)
<400> 10
ggaatggaag atggtggttt tt 22
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Primer pair 5-R5)
<400> 11
gtctcacaat ttgattaggg cac 23
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Primer pair 6-F6)
<400> 12
tggaagatgg tggtttttag atcg 24
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Primer pair 6-R6)
<400> 13
gtctcacaat ttgattaggg cac 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Primer pair 7-F7)
<400> 14
ggaagatggt ggtttttaga tcg 23
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Primer pair 7-R7)
<400> 15
tgtctcacaa tttgattagg gcac 24
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Primer pair 8-F8)
<400> 16
atggaagatg gtggttttta gatcg 25
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Primer pair 8-R8)
<400> 17
tgtctcacaa tttgattagg gcac 24
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Primer pair 9-F9)
<400> 18
ggaatggaag atggtggttt tt 22
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Primer pair 9-R9)
<400> 19
gtctcacaat ttgattaggg cactt 25
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Primer pair 10-F10)
<400> 20
tggaagatgg tggtttttag atcg 24
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Primer pair 10-R10)
<400> 21
gtctcacaat ttgattaggg cactt 25
Claims (3)
1.核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的结直肠癌诊断生物标志物在制备结直肠癌诊断试剂盒中的应用。
2.如SEQ ID NO:2- SEQ ID NO:21所示结直肠癌诊断生物标志物的引物组合物在制备结直肠癌诊断试剂盒中的应用。
3.如SEQ ID NO:2- SEQ ID NO:21所示结直肠癌诊断生物标志物的引物组合物在制备或筛选结直肠癌的诊断药物中的用途。
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