CN110387422A - 结直肠癌的诊断性检测 - Google Patents

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朱丽娜
施佳君
郑纯威
杨钦钦
黄强
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Abstract

本发明公开了结直肠癌的诊断性检测，本发明首次发现了RP11‑350J20.12或RP11‑386G11.5在结直肠癌中表达上调，通过检测RP11‑350J20.12和/或RP11‑386G11.5的水平可以判断受试者是否患有结直肠癌。鉴于此，本发明公开了RP11‑350J20.12或RP11‑386G11.5在制备诊断结直肠癌的产品中的应用，以及包含检测RP11‑350J20.12或RP11‑386G11.5表达水平的试剂的产品。

Description

结直肠癌的诊断性检测
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及结直肠癌的诊断性检测。
背景技术
结直肠癌(colorectal cancer CRC)，也称为大肠癌，包括结肠癌和直肠癌，是全世界范围内常见的消化道恶性肿瘤之一。近二十年来，随着生活水平的不断提高，生活方式及饮食习惯结构的改变，我国结直肠癌的发病率和死亡率均呈现明显的上升趋势。根据中国疾病预防与控制中心发布的2014年中国肿瘤登记工作报告显示，结直肠癌位于男性发病顺位的第四位(前三位依次为肺癌、胃癌和肝癌)，女性中发病仅次于乳腺癌和肺癌位于第三位。死因顺位在男性和女性中分别为第五位和第四位。我国结直肠癌的疾病负担不断增加，城市高于农村，男性高于女性，已成为严重威胁到居民健康的重大公共卫生问题，预防和控制结直肠癌的工作刻不容缓。
为了有效地预防和控制结直肠癌，必须明确结直肠癌发生发展的机制。与大多数肿瘤一样，结直肠癌属于慢性复杂性疾病，其发病机制及预后影响因素尚不完全明确。当前普遍观点认为结直肠癌的发生是环境因素和遗传因素共同作用的复杂结果。流行病学研究表明，肿瘤家族史、肥胖、糖尿病、缺乏体力活动、饮酒和不良饮食习惯等会增加结直肠癌的发病风险。
从细胞分子进程来看，结直肠癌是一种复杂的基因组疾病(Xu C,Yang M,Tian J,et al.MALAT 1:a long non-coding RNA and its important 3'end functional motifin colorectal cancer metastasis.Int J Oncol.2011；39(1):169-175.)。随着人类全基因组测序的完成，人们发现，人类基因组中虽然有超过80％的基因组具有转录本活性，然而超过98％的序列不能编码蛋白质，能够编码蛋白的基因组序列不足总量的2％(Djebali S,Davis CA,Merkel A,et al.Landscape of transcription in humancells.Nature.2012；489(7414):101-108.)。非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)是一类由非编码基因转录生成的RNA序列。
长链非编码RNA(long non-coding RNA,1ncRNA)是长度大于200nt的非编码RNA(Ponting CP,Oliver PL,Reik W.Evolution and functions of long noncodingRNAs.Cell.2009；136(4):629-641.)。研究表明，1ncRNA广泛存在于哺乳动物基因组中，在细胞的发生、发育、增殖、分化、代谢等多个方面发挥重要作用，包括DNA甲基化、X染色体沉默、基因组印记、染色质修饰、核内运输、表观遗传调控、转录的激活调控和干扰等重要过程(Li CH,Chen Y Targeting long non-coding RNAs in cancers:progress andprospects.Int J Biochem Cell Biol.2013；45(8):1895-1910.)，鉴于lncRNA在细胞中的重要作用，lncRNA与疾病之间的相关性也越发受到关注。研究lncRNA在结直肠癌发生发展之间的作用，对于揭示结直肠癌的发病机理，实现结直肠癌的早期诊断和治疗具有重要的意义。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供可用于结直肠癌早期诊断的分子标志物，通过检测分子标志物的水平，可以判断受试者是否患有结直肠癌，从而为结直肠癌的诊断及靶向治疗寻找更好的途径和方法。
“分子标志物”指代具有特异性生物学特性、生物化学特征或者方面的分子指示物，其可用于确定存在或不存在特定疾病或状况和/或特定疾病或状况的严重程度。
在本发明中，“标志物”指与一个或多个生物分子相关的参数(即“分子标志物”)，例如天然或人工合成产生的核酸(即个体基因，以及编码和非编码DNA和RNA)。本发明中的“标志物”还包括指可通过考虑来自两个或多个不同标志物的表达数据计算或以其他方式获得的单个参数。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了用于检测分子标志物的试剂在制备诊断结直肠癌的产品中的应用，所述分子标志物为RP11-350J20.12或RP11-386G11.5。
“RP11-350J20.12”位于6号染色体上，基因号为ENSG00000273132，包括RP11-350J20.12基因及其的同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的RP11-350J20.12，以及源自细胞中加工的任何形式的RP11-350J20.12。该术语涵盖RP11-350J20.12的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。一种代表性的RP11-350J20.12的序列如ENST00000472053.2所示。
“RP11-386G11.5”位于12号染色体上，基因号为ENSG00000257913，包括RP11-386G11.5基因及其的同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的RP11-386G11.5，以及源自细胞中加工的任何形式的RP11-386G11.5。该术语涵盖RP11-386G11.5的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。目前RP11-386G11.5存在四个转录本，转录本ID分别为ENST00000547866.1、ENST00000552933.1、ENST00000552284.1、ENST00000547395.1。一种代表性的RP11-386G11.5的序列如ENST00000547866.1所示。
进一步，所述试剂为特异性结合RP11-350J20.12或RP11-386G11.5的试剂。
进一步，所述特异性结合RP11-350J20.12或RP11-386G11.5的试剂为特异性结合RP11-350J20.12或RP11-386G11.5的核酸。
进一步，所述特异性结合RP11-350J20.12或RP11-386G11.5的核酸选自：
特异性扩增RP11-350J20.12或RP11-386G11.5的引物；
特异性识别RP11-350J20.12或RP11-386G11.5的探针；或
特异性分析RP11-350J20.12或RP11-386G11.5的芯片。
本文所用的“引物”表示寡核苷酸，不管是在纯化的限制性消化物中天然存在还是合成产生，当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下，即在存在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶并在合适温度和pH下时它能作为合成起点。引物可以是单链或双链，并且必须足够长以在诱导剂存在下引发合成预期的延伸产物。引物的确切长度依赖于很多因素，其中包括温度、引物来源和使用方法。例如，对于诊断应用，依赖于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有15-25个或更多核苷酸，尽管它可以含有更少核苷酸。参与确定引物适当长度的因素对于本领域技术人员容易知道。
“探针”指能与特别预期的靶生物分子，例如由内在基因编码的或相应于内在基因的核苷酸转录物或蛋白选择性结合的分子。探针可以由本领域技术人员合成，或者可以来自于合适的生物制备物。可以特异性地设计探针以对其进行标记。可以用作探针的分子的实例包括，但不限于RNA、DNA、蛋白、抗体、和有机分子。作为一种优选的实施方式，用作探针的分子包括RNA、DNA。
作为探针，可以使用荧光标记、放射标记、生物素标记等对癌检测用多核苷酸进行了标记的标记探针。多核苷酸的标记方法本身是公知的。可通过如下方法检查试样中是否存在受试核酸：固定受试核酸或者其扩增物，与标记探针进行杂交，洗涤，以及然后测定与固相结合的标记。备选地，还可固定癌检测用多核苷酸，使受试核酸与其杂交，然后应用标记探针等检测结合于固相上的受试核酸。在这种情况下，结合于固相上的癌检测用多核苷酸也称为探针。使用多核苷酸探针测定受试核酸的方法在本领域也是公知的。可以如下进行该方法：在缓冲液中使多核苷酸探针与受试核酸在Tm或者其附近(优选在±4℃以内)接触用于杂交，洗涤，然后测定杂交的标记探针或者与固相探针结合的模板核酸。
在作为探针使用的多核苷酸的大小优选为18个或更多个核苷酸、更优选为20个或更多个核苷酸，以及编码区域的全长或更少。作为引物使用时，该多核苷酸大小优选为18个或更多个核苷酸，以及50个或更少核苷酸。这些探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。
本发明的引物或探针可以使用磷酰亚胺固相支持法或其他熟知方法化学合成。也可以使用本领域已知的许多手段修饰所述核酸序列。这些修饰的非限制性实例是甲基化、加帽、用天然核苷酸的一种或多种类似物进行的置换和在核苷酸之间的修饰，例如，修饰不带电荷的连接体(例如，磷酸甲酯、磷酸三酯、磷酰亚胺、氨基甲酸酯等)，或修饰带电荷的连接体(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)。
许多表达检测方法使用分离的RNA。起始材料典型地是从生物样品，例如分别从肿瘤或肿瘤细胞系，以及相应的正常组织或细胞系分离的总RNA。如果RNA的来源是原发性肿瘤，则可以从冷冻的或保存的石蜡包埋并固定的(例如福尔马林固定的)组织样品中提取RNA。
本文所用的“芯片”也称为“阵列”，指包含连接的核酸或肽探针的固体支持物。阵列通常包含按照不同的已知位置连接至基底表面的多种不同的核酸或肽探针。这些阵列，也称为“微阵列”，通常可以利用机械合成方法或光引导合成方法来产生这些阵列，所述光引导合成方法合并了光刻方法和固相合成方法的组合。阵列可以包含平坦的表面，或者可以是珠子、凝胶、聚合物表面、诸如光纤的纤维、玻璃或任何其它合适的基底上的核酸或肽。可以以一定的方式来包装阵列，从而允许进行全功能装置的诊断或其它方式的操纵。
“微阵列”是杂交阵列原件有序排列在基质上，所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针(例如寡核苷酸)或结合剂(例如抗体)。所述基质可以是固体基质，例如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质，例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其中的任何排列。
上述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA、LNA、ENA、GNA、TNA等人工核酸置换得到的多核苷酸。
进一步，特异性扩增RP11-350J20.12引物序列如SEQ ID NO.1～2所示，特异性扩增RP11-386G11.5的引物序列如SEQ ID NO.3～4所示。
本发明提供了一种诊断结直肠癌的产品，所述产品包括检测RP11-350J20.12或RP11-386G11.5的试剂。
进一步，所述产品包括芯片或试剂盒。
进一步，所述芯片包括：固相载体，以及附着于其上的特异性识别RP11-350J20.12或RP11-386G11.5的探针。具体地，可根据本发明所述的lncRNA，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。
在本发明中，所述固相载体包括塑料制品、微颗粒、膜载体等。所述塑料制品可通过非共价或物理吸附机制与抗体或蛋白抗原相结合，最常用的塑料制品为聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板；所述微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为微米，由于带有能与蛋白质结合的功能团，易与抗体(抗原)形成化学偶联，结合容量大；所述膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。
进一步，所述试剂盒包括：
特异性扩增RP11-350J20.12或RP11-386G11.5的引物；
特异性识别RP11-350J20.12或RP11-386G11.5的探针；或
特异性分析RP11-350J20.12或RP11-386G11.5的芯片
进一步，所述试剂盒还包括核酸抽提试剂、聚合酶链反应试剂、显色剂或指示剂、核酸分析软件或使用说明书。
这样一种试剂盒可以采用例如试纸条、膜、芯片、盘、测试条、滤器、微球、载片、多孔板或光纤。所述试剂盒的固相支持物可以是例如塑料、硅片、金属、树脂、玻璃、膜、颗粒、沉淀物、凝胶、聚合物、薄片、球、多糖、毛细管、胶片、板或载片。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了RP11-350J20.12或RP11-386G11.5基因的表达水平与结直肠癌相关，通过检测受试者样本中RP11-350J20.12或RP11-386G11.5的表达水平，可以判断受试者是否患有结直肠癌，以及患结直肠癌的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案，同时采用分子标志物进行诊断，相比传统诊断手段，更及时、更灵敏、更特异。
附图说明
图1是利用QPCR检测分子标志物在结直肠癌组织中的表达情况图；其中图A是RP11-350J20.12，图B是RP11-386G11.5。
图2是分子标志物在结直肠癌组织中的ROC曲线图，其中图A是RP11-350J20.12，图B是RP11-386G11.5，图C是RP11-350J20.12和RP11-386G11.5。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 QPCR检测RP11-350J20.12或RP11-386G11.5在结直肠癌中的表达
1、收集32例结直肠癌患者的癌组织以及相对应的癌旁组织，所有患者术前未进行化疗、放疗以及内分泌治疗。
2、RNA样品的制备及质量分析
使用TRIZOL法提取组织总RNA，具体步骤如下：
1)用剪刀组织剪碎，加入1ml Trizol,振荡器上震荡1min；常温放置10min，使核蛋白体完全分解；
2)加入200μl三氯甲烷(氯仿)，盖紧管盖，剧烈震荡15s，常温静置10min；
3)4℃，11000rpm离心15min；
4)将水样层转移到一个新的离心管中，加入500μl异丙醇；颠倒混匀后，常温静置10min；
5)4℃，11000rpm离心15min；
6)用枪小心吸走液体，留沉淀在管底，加入1ml 75％的乙醇，在振荡器上震荡5s，洗涤沉淀一次；
7)4℃，8000rpm离心5min；
8)将上清小心去掉，干燥沉淀10min，加入适量的水溶解沉淀10min；
9)检测RNA浓度，鉴定RNA的产量和纯度。
3、逆转录
使用TAKARA公司的反转录试剂盒(Takara code：DRR047A)进行进行RNA的逆转录，实验操作按照说明书进行，步骤如下：
1)去除基因组DNA
在试管中加入5×gDNA Eraser Bμffer 2.0μl，gDNA Eraser 1.0μl，总RNA 1μg，加Rnase Free ddH2O使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热2min。
2)反转录反应
将2 4.0μl，Enzyme Mix I 1.0μl，RTPrimer Mix 1.0μl，RNase Free ddH2O 4.0μl加入上述试管中一起混合共20μl，水浴锅中37℃15min，85℃5s。
4、QPCR扩增
1)引物设计
根据RP11-350J20.12、RP11-386G11.5和GADPH的基因序列设计引物，序列如下：
RP11-350J20.12：
正向引物：5′-TGCCAGCAGTGACAACAT-3′(SEQ ID NO.1)
反向引物：5′-CCATCGTCCAGTATGAGTG-3′(SEQ ID NO.2)
RP11-386G11.5：
正向引物：5′-GAGACCAACTGCGAATCATT-3′(SEQ ID NO.3)
反向引物：5′-TCTTTGCCACACCGTTTC-3′(SEQ ID NO.4)
GAPDH：
正向引物：5′-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3′(SEQ ID NO.5)
反向引物：5′-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3′(SEQ ID NO.6)
2)QPCR扩增检验
用Ex TaqTM II(Takara Code:DRR081)试剂盒配置PCR反应体系，在Thermal CyclerTime System扩增仪上进行PCR扩增，反应结束后确认Real TimePCR的扩增曲线和溶解曲线，ΔΔCT法进行相对定量。
25μl反应体系：Ex TaqTM II(2×)12.5μl，正(反)向引物各1μl，DNA模板2μl，灭菌蒸馏水8.5μl。
反应条件：95℃30s，(95℃5s，60℃30s)×40
5、结果
QPCR结果如图1所示，与癌旁组织相比，RP11-350J20.12和RP11-386G11.5在结直肠癌组织中均表达上调，RP11-350J20.12上调约20.09倍，RP11-386G11.5上调约7.67倍，差异具有统计学意义(P<0.05)，其中RP11-350J20.12在27例癌组织中显著上调，RP11-386G11.5在30例癌组织中显著上调。提示可通过检测RP11-350J20.12或RP11-386G11.5的水平判断受试者是否患有结直肠癌。
根据RP11-350J20.12或RP11-386G11.5与结直肠癌之间的关系，可以设计靶向RP11-350J20.12或RP11-386G11.5的干扰RNA、shRNA治疗结直肠癌。
实施例2分析RP11-350J20.12和RP11-386G11.5在TCGA数据库中的表达情况
从TCGA数据库中下载结直肠癌的数据，其中包括癌组织454例，癌旁组织41例，使用R3.6.1软件中的pROC包计算基因的AUC值，并绘制ROC曲线。ROC曲线的横坐标代表1-特异性，也称假阳性率(误报率)，X轴越接近零准确率越高；纵坐标Y轴称为敏感度，也称为真阳性率(敏感度)，Y轴越大代表准确率越好。
结果如图2所示，RP11-350J20.12的AUC值为0.924(图2A)，RP11-386G11.5的AUC值为0.911(图2B)，RP11-350J20.12与RP11-386G11.5联合的AUC值为0.972(图2C)，说明RP11-350J20.12和RP11-386G11.5单独或者联合应用于结直肠癌的诊断都具有较高的准确性。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 浙江省中医药研究院
<120> 结直肠癌的诊断性检测
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgccagcagt gacaacat 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccatcgtcca gtatgagtg 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gagaccaact gcgaatcatt 20
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tctttgccac accgtttc 18
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aatcccatca ccatcttcca g 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gagccccagc cttctccat 19

Claims (10)

1.用于检测分子标志物的试剂在制备诊断结直肠癌的产品中的应用，其特征在于，所述分子标志物为RP11-350J20.12或RP11-386G11.5的一种或两种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂为特异性结合RP11-350J20.12或RP11-386G11.5的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述特异性结合RP11-350J20.12或RP11-386G11.5的试剂为特异性结合RP11-350J20.12或RP11-386G11.5的核酸。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述特异性结合RP11-350J20.12或RP11-386G11.5的核酸选自：
特异性扩增RP11-350J20.12或RP11-386G11.5的引物；
特异性识别RP11-350J20.12或RP11-386G11.5的探针；或
特异性分析RP11-350J20.12或RP11-386G11.5的芯片。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，特异性扩增RP11-350J20.12引物序列如SEQ ID NO.1～2所示，特异性扩增RP11-386G11.5的引物序列如SEQ ID NO.3～4所示。
6.一种诊断结直肠癌的产品，其特征在于，所述产品包括检测RP11-350J20.12或RP11-386G11.5的试剂。
7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述产品包括芯片或试剂盒。
8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述芯片包括：固相载体，以及附着于其上的特异性识别RP11-350J20.12或RP11-386G11.5的探针。
9.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述试剂盒包括：
特异性扩增RP11-350J20.12或RP11-386G11.5的引物；
特异性识别RP11-350J20.12或RP11-386G11.5的探针；或
特异性分析RP11-350J20.12或RP11-386G11.5的芯片
10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸抽提试剂、聚合酶链反应试剂、显色剂或指示剂、核酸分析软件或使用说明书。
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