ES2645754T3 - Conjunto de sondas de oligonucleótidos así como métodos y usos relacionados con el mismo - Google Patents

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Abstract

Un kit que comprende - un conjunto de sondas de oligonucleótidos adecuadas para hibridación in situ, conjunto de sondas que comprende al menos 100 sondas de oligonucleótidos de una sola hebra diferentes dirigidas contra una secuencia diana genómica no repetitiva de interés, en la que cada uno de los oligonucleótidos individuales comprende al menos una marca, en los que dicha marca es adecuada para detección por medio de una reacción cromogénica, por medio de una reacción metalográfica, o por medio de análisis de fluorescencia directa o indirecta; y - una ficha de producto.

Description

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humano haploide está formado por un número total de más de 3 billones de pares de bases de ADN y contiene un cálculo estimado De aproximadamente 30.000 secuencias codificantes de proteínas. Es decir, solo aproximadamente un 1,5 % del genoma codifican proteínas, mientras que las partes restantes contienen miles de genes de ARN tales como genes que codifican ARNt, ARN ribosómico, microARN u otros ARN no codificantes, secuencias reguladoras, intrones y secuencias repetitivas. Las secuencias repetitivas del genoma humano incluyen, pero no se limitan a, centrómeros, telómeros, repeticiones en tándem tales como ADN satélite, ADN minisatélite, ADN microsatélite, y repeticiones intercaladas tales como los SINE (Elementos nucleares intercalados cortos) y los LINE (Elementos nucleares intercalados largos). Por consiguiente, la expresión "secuencia diana genómica" puede comprender, pero no se limita a, una secuencia de un gen en particular o una parte del mismo, y pueden incluir adicionalmente secuencias reguladoras, secuencias no codificantes, secuencias repetitivas o no repetitivas. En la presente invención, la secuencia diana genómica es una secuencia diana genómica no repetitiva. Preferentemente, la secuencia diana genómica de la presente invención se refiere a un locus genético definido que comprende un gen en particular.
En general, los genes se distribuyen de manera no uniforme a través del genoma del organismo, es decir, a través de los diferentes cromosomas. Es decir, la secuencia diana genómica de la presente invención puede hacer referencia a una región de longitud variable y/o a una región que se extiende con respecto a diferentes regiones de un cromosoma, y/o se extiende con respecto diferentes cromosomas. En particular, la secuencia diana genómica puede hacer referencia a una o más regiones individuales. Preferentemente, la secuencia diana genómica de la presente invención se refiere un locus genético, es decir, ha una región específica en un cromosoma en la que se localiza un cromosoma. La secuencia diana genómica de la presente invención puede comprender regiones de tamaños variables que incluyen, pero no se limitan, a regiones con un tamaño de hasta 1 MB.
Sin embargo, se debe entender que las sondas de oligonucleótidos se dirigen contra diferentes secuencias diana, es decir, contra una región diferente, dentro de la secuencia diana genómica de la presente invención. Es decir, aunque el conjunto de sondas de oligonucleótidos que comprende al menos 100 sondas de oligonucleótidos individuales diferentes se dirige, en total, contra una secuencia diana genómica, que comprende preferentemente un locus genético en particular, cada una de las sondas de oligonucleótidos individuales se dirige contra una de subsecuencia en particular que se encuentra dentro de esta región.
La expresión "marca" como se usa en el presente documento por lo general se refiere a cualquier tipo de sustancia o agente que se puede incorporar y/o unir a las sondas de oligonucleótidos de la presente invención, y que se puede usar para visualizar, detectar, analizar y/o cuantificar la sonda de oligonucleótidos cuando se une a su secuencia diana. De acuerdo con la invención, la marca es adecuada para detección por medio de una reacción cromogénica, por medio de una reacción metalográfica, o por medio de análisis de fluorescencia directa o indirecta. Una marca de acuerdo con la presente invención puede incluir, pero no se limita, radioisótopos tales como, por ejemplo, 35Azufre (35S), 32Fósforo (32P), 33Fósforo (33P), 3H o 14C, cualquier molécula fluorescente o fluoróforo que se pueda detectar y/o visualizar por medio de análisis de fluorescencia tal como colorantes de fluoresceína que incluyen, pero no se limitan a, carboxifluoresceína (FAM), 6-carboxi-4’,5’-dicloro-2’7’-dimetoxifluoresceína (JOE), isotiocianato de fluoresceína (FITC), tetraclorofluoresceína (TET), y hexaclorofluoresceína, colorantes de rodamina tales como, por ejemplo, carboxi-X-rodamina (ROX), Rojo Texas y tetrametilrodamina (TAMRA), colorantes de cianina tales como colorantes de pirilio cianina, DY548, Quasar 570, o Cy3, Cy5, Alexa 568, y similares. La elección de la marca fluorescente por lo general se determina mediante sus propiedades espectrales T y por la disponibilidad de equipo para formación de imágenes. Las marcas fluorescentes están disponibles en el mercado en diversos proveedores incluyendo, por ejemplo, a Invitrogen™ (USA). Una marca de la presente invención también puede ser un hapteno tal como digoxigenina (DIG), biotina, o 2,4-dinitrofenilo (DNP). Estas marcas así como sus estrategias de detección son bien conocidas por la persona con experiencia en la materia, y se describen, por ejemplo, en Jin et al., 2001 (Morphology Methods: Cell and Molecular Biology Techniques, 27-48), Krick, 2002 (Ann. Clin. Biochem. 39: 114-12),
o Grzybowski et al., 1993 (Nucleic Acids Research, Vol. 21, N.º 8: 1705-1712).
Además, la marca de la invención se puede unir a la sonda de oligonucleótidos mediante conjugación química a un nucleótido o a un reactivo de unión no nucleotídico (es decir, marcado directo), o mediante conjugación química del nucleótido o del reactivo de unión no nucleotídico a una molécula que se puede unir a una marca (es decir, marcado indirecto). En el marcado indirecto, la molécula unida directamente a la sonda de oligonucleótidos por lo general es cualquiera de un hapteno tal como 2,4-dinitrofenilo (DNP), digoxigenina (DIG), o biotina. En el marcado directo, la molécula unida a la sonda de oligonucleótidos por lo general es un colorante fluorescente. Las estrategias de detección de las diferentes marcas de acuerdo con la presente invención se describen con detalle a continuación.
La marca de la presente invención se puede unir adicionalmente a cualquiera del extremo en la posición 5’ y/o el extremo en la posición the 3’ de la sonda de oligonucleótidos, o se puede incorporar internamente en la sonda de oligonucleótidos a través de unión a uno o más nucleótidos o fosfatos modificados. Como alternativa, la marca de la presente invención también se puede incorporar en la sonda de oligonucleótidos a través de unión a uno o más reactivos de unión no nucleotídicos. Opcionalmente, la marca se puede incorporar en la sonda de oligonucleótidos en un proceso de 2 etapas, por ejemplo mediante la introducción de grupos reactivos tales como grupos amino, azido o alquino en las sondas de oligonucleótidos y mediante acoplamiento de la marca en una segunda etapa a través de formación de enlaces amida o química click. La expresión "química click" como se usa en el presente
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documento por lo general se refiere a cualquier reacción bioortogonal que permita la formación eficaz de un producto específico dentro de un entorno químico altamente complejo. En particular, se refiere a una reacción química que permite la incorporación de una o más marcas reactivas en una diana biomolecular y la posterior selectividad elevada en la derivatización de la marca dentro de una muestra biológica compleja. La persona con experiencia en la materia conoce los principios de la química y se describen, por ejemplo, en Best, M.D. (Biochemistry 2009, 48 (28): 6571-6584). Otra forma de introducir una marca de la presente invención es, por ejemplo, acoplar la marca a través de la etapa de oxidación durante la síntesis de oligonucleótidos basada en fosforamidita como se describe, por ejemplo, en el documento WO 2007/059816.
El conjunto de sondas de oligonucleótidos de la presente invención se puede diseñar un modo tal que cada uno de los oligonucleótidos individuales esté presente en una o más copia/copias, preferentemente en múltiples copias. Preferentemente, el conjunto de sondas de oligonucleótidos se diseña de un modo tal que cada una de las sondas de oligonucleótidos individuales esté presente en cantidades equimolares y/o concentraciones similares. Los métodos sobre cómo calcular la concentración y/o la molaridad de las moléculas de ácido nucleico son de conocimiento convencional para la persona con experiencia en la materia. Además, el conjunto de sondas de oligonucleótidos se diseña preferentemente de un modo tal que cada copia de una sonda de oligonucleótidos individual tenga la misma secuencia idéntica y contenga un algo más marcas en posiciones idénticas. Cada una de las sondas de oligonucleótidos individuales presente en una o múltiples copia/copias constituye un subconjunto de sondas de oligonucleótidos.
Por consiguiente, en otra realización preferente, el conjunto de sondas de oligonucleótidos de la invención comprende uno o más subconjuntos de sondas de oligonucleótidos, en el que cada subconjunto consiste en sondas de oligonucleótidos con secuencias idénticas que tienen marcas en posiciones idénticas.
Como se encuentra en el contexto de la presente invención, los subconjuntos de sondas de oligonucleótidos con secuencias idénticas y con marcas en posiciones idénticas son particularmente ventajosos, ya que sus propiedades bioquímicas son conocidas por el investigador, con la consecuencia de que las posiciones más favorables para la incorporación de marcas se pueden elegir y, además, se pueden evitar las posiciones no favorables, por ejemplo las posiciones que podrían dar como resultado una interrupción desventajosa de una señal de fluorescencia.
Las sondas de oligonucleótidos de la presente invención se caracterizan adicionalmente por que la marca se inserta en una posición definida durante la síntesis química del oligonucleótido. Es decir, un número definido de marcas se pueden incorporar en la molécula mediante la incorporación de nucleótidos modificados en una posición definida a la que se une, relaciona y/o conjuga una marca, o mediante la incorporación de reactivos de unión no nucleotídicos que pueden servir como una plataforma para unión de marcas. La inserción de marcas en posiciones definidas también incluye el procedimiento de incorporación de la marca durante la etapa de oxidación en la síntesis de oligonucleótidos basada en fosforamidita (véase, por ejemplo, el documento WO 2007/059816). Preferentemente, la incorporación de una marca se produce de un modo tal que las marcas se distribuyen de manera uniforme a través de la sonda de oligonucleótidos. Más preferentemente, las sondas de oligonucleótidos se diseñan de modo tal que las marcas se insertan en la molécula en posiciones con distancias iguales entre sí, especialmente en las posiciones con una distancia de separación de al menos 5, 10, 15, o 20 o más nucleótidos entre sí. Esta distancia espaciadora puede variar de un subconjunto de sondas de oligonucleótidos al otro, y también puede depender de la longitud total de la sonda de oligonucleótidos individual, es decir, la distancia espaciadora entre marcas individuales puede aumentar con la longitud total de la sonda de oligonucleótidos.
Por consiguiente, en una realización preferente, las sondas de oligonucleótidos de la invención comprenden marcas en posiciones casi a la misma distancia, en particular a una distancia de separación de al menos 5, 10, 15, o 20 nucleótidos.
En otra realización preferente, las sondas de oligonucleótidos pueden comprender marcas en posiciones predeterminadas, opcionalmente en posiciones situadas a una distancia predeterminada entre sí.
La ventaja de la colocación de marcas en distancias separadas en particular se puede evitar cualquier efecto negativo que pudiera surgir si las marcas se colocaran demasiado cerca entre sí (por ejemplo, interferencia y/o interrupción si se usa una marca fluorescente). Además, mediante el control de la incorporación de marcas se puede evitar adicionalmente que se introduzcan demasiadas marcas en ciertas posiciones que podrían influir en la eficacia de la hibridación.
La expresión "predeterminada" como se usa en el presente documento por lo general se refiere a que las posiciones en las que se incorpora, une, conjuga o relaciona la marca se pueden definir diseñando las sondas de oligonucleótidos individuales. Es decir, el término "predeterminada" se refiere a que la marcas no se distribuyen y/o incorporan de forma aleatoria tal como, por ejemplo, en el caso de enfoque esté marcado enzimático. Una posibilidad del reconocí ciento y/o determinación de las posiciones de la marca predeterminadas se produce si la distribución de marcas dentro de una molécula sigue un cierto patrón. Además, las posiciones predeterminadas también pueden ser evidentes cuando se analiza la distribución de las marcas dentro de un subconjunto, por
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ejemplo, si cada una de las sondas de oligonucleótidos de uno o más subconjuntos desvela el mismo patrón de marcas incorporadas.
Como ya se ha detallado anteriormente, la marca se puede incorporar, unir, conjugar o relacionar directa o indirectamente a la sonda de oligonucleótidos individual.
Por lo tanto, en una realización preferente, el conjunto de sondas de oligonucleótidos de la invención se caracteriza por que la marca está unida a una base, un azúcar, o un resto de fosfato de un nucleótido, ya sea directa o indirectamente a través de un conector.
Mediante la unión de la marca a una a base, un azúcar, o un resto de fosfato, (i) la interrupción y/o alteración potencial del emparejamiento de bases complementarias a la secuencia diana se reduce a un mínimo, e (ii) se pueden usar sondas de oligonucleótidos cortas para conseguir afinidades de unión eficaz.
Por ejemplo, una marca de 2,4-dinitrofenilo (DNP) se puede unir directamente a la posición N4 de una citidina. Como alternativa, el nucleótido se puede modificar para permitir y/o facilitar la unión de una marca. Es decir, por ejemplo, un colorante de pirilio cianina sé prevenir de forma covalente a un nucleótido de pirimidina modificado con 5aminoalquilo. La unión directa de una marca a la sonda preferentemente no modifica directamente un sitio en la base purina o una pirimidina que normalmente está implicada en las interacciones de formación de enlaces de hidrógeno de emparejamiento de bases complementarias.
La expresión "conector" como se usa en el presente documento por lo general se refiere a cualquier estructura química que puede servir para acoplar, conjugar, unir covalentemente o añadir una marca a una nucleobase, un azúcar o un resto de fosfato de un nucleótido. Preferentemente, el conector de acuerdo con la presente invención puede incluir, pero no se limita a, estructuras flexibles o rígidas tales como, por ejemplo, conector de etilenglicol, conector de hexaetilenglicol, conector de propargilamino, conector de animoalquilo, conector de ciclohexilo, conector de arilo, conector de etilenglicol etinilo y conector de etiloxietilamino, o conector de alquilamina. Por lo general, la marca se y a través de un éster activado al conector.
Además en otra realización preferente, el conjunto de sondas de oligonucleótidos de la invención se caracteriza por que la marca está unida a una unidad no nucleotídica.
Una ventaja de unir la marca a una unidad no nucleotídica es que el diseño y la síntesis de las sondas de oligonucleótidos individuales dependen de la secuencia. Es decir, todas las sondas de oligonucleótidos se pueden diseñar de un modo tal que contengan la marca en las prismas posiciones. Además, a diferencia de la aceptación general en la técnica, en el contexto de la presente invención se ha encontrado de forma sorprendente que las suspicacias de unión a la secuencia diana son aún óptimas cuando las marcas se unen a unidades no nucleotídicas.
La expresión "unidad no nucleotídica" como se usa en el presente documento por lo general se refiere a cualquier reactivo o molécula que puede permitir de forma conveniente que un solo resto o múltiples restos, tales como marcas o agentes de intercalado, se una a una sonda de nucleótidos en una posición(s) seleccionada previamente específica en la misma. Una unidad no nucleotídica de acuerdo con la presente invención es preferentemente una unidad monomérica que se puede acoplar de forma sintética con unidades monoméricas nucleotídica específicas de reactivos nucleotídicos para producir un polímero con una secuencia definida con una estructura principal formada por unidades monoméricas nucleotídicas y no nucleotídicas. Es decir, una unidad no nucleotídica de la invención se puede colocar en cualquier posición deseada dentro de una secuencia de la estructura principal del nucleótido. Una unidad no nucleotídica de la invención puede comprender obligando que es cualquiera de un resto de grupo conector que porta una marca o que puede participar en reacciones de conjugación una vez que se ha desprotegido el grupo conector. Una unidad no nucleotídica de la invención puede contener adicionalmente un resto de azida o alquino adecuado para química click (Best, M.D., Biochemistry 2009, 48 (28): 6571-6584). En la técnica se conoce en grupos protectores adecuados que se pueden usar para proteger el grupo funcional del grupo conector durante la formación de un polímero.
Una unidad no nucleotídica de acuerdo con la presente invención puede comprender adicionalmente dos grupos de acoplamiento para permitir su inclusión en etapas en un polímero de unidades monoméricas nucleotídicas y no nucleotídicas, en la que uno de estos grupos de acoplamiento se define de un modo tal que se pueda acoplar de forma eficaz al extremo de una cadena creciente de unidades monoméricas, y el segundo grupo sea capaz de prolongar adicionalmente, de un modo en etapas, la cadena creciente de monómeros nucleotídicos y no nucleotídicos mixtos. Las unidades no nucleotídicas de acuerdo con la presente invención se conocen bien la técnica y se describen, por ejemplo, en el documento EP 0313219.
De acuerdo con la invención, las sondas de oligonucleótidos de la presente invención comprenden una marca adecuada para su detección por medio de una reacción cromogénica, por medio de una reacción metalográfica, o por medio de análisis de fluorescencia directa o indirecta.
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Hasta ahora, las sondas de oligonucleótidos se han usado de forma satisfactoria para la detección de secuencias diana altamente abundantes tales como ARNm expresados abundantemente o secuencias genómicas repetitivas que incluyen, por ejemplo, secuencias centroméricas, mientras que se ha descrito que el uso de sondas de oligonucleótidos para la detección de secuencias de baja abundancia s presenta desventajas (véase, por ejemplo, Jin et al., 2001; Morphology Methods: Cell and Molecular Biology Techniques: 27-46).
En el contexto de la presente invención, sin embargo, las sondas de oligonucleótidos se han usado de forma satisfactoria para detectar secuencias genómicas no repetitivas. De acuerdo con la invención, las sondas de oligonucleótidos se dirigen contra una secuencia diana genómica no repetitiva de interés.
Por consiguiente, el conjunto de sondas de oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención son complementarias a regiones no repetitivas de la secuencia diana genómica.
Una de las ventajas del uso de un conjunto de sondas de oligonucleótidos complementarias a regiones no repetitivas de una secuencia diana genómica es que los genes de baja abundancia se pueden detectar y/o visualizar con alta sensibilidad.
La expresión "regiones no repetitivas" usada en el presente documento por lo general se refiere a cualquier secuencia distinta de un elemento de ADN repetitivo en un genoma de interés. En particular, las regiones no repetitivas de acuerdo con la presente invención se refieren a cualquier región distinta de la secuencias repetitivas del genoma (por ejemplo, genoma humano) que incluyen, pero no se limitan a, centrómeros, telómeros, repeticiones en tándem (por ejemplo, ADN satélite, ADN minisatélite, y ADN microsatélite), y elementos de repetición intercalados tales como los SINE (elementos nucleares intercalados cortos) y los LINE (elementos nucleares intercalados largos). Los elementos repetitivos que se han encontrado en la mayoría de los genomas eucariotas analizados, están principalmente presentes en múltiples copias, y no codifican proteínas o ARN. Los elementos repetidos intercalados normalmente están presentes como copias individuales y se distribuyen ampliamente en todo el genoma.
En una realización preferente adicional, el conjunto de sondas de oligonucleótidos puede ser complementario a cualquiera de la hebra sentido o antisentido de la secuencia diana genómica. Mediante el uso de sondas de oligonucleótidos que son complementarias a la hebra sentido o antisentido de la secuencia diana genómica, la hibridación óptima se asegura ya que no es posible que las sondas se vuelvan a hibridar.
El término "sentido" como se usa en el presente documento se refiere a que la secuencia de la sonda de oligonucleótidos es la misma y la secuencia diana, por ejemplo como la hebra codificante de la secuencia genómica.
El término "antisentido", por el contrario, se refiere a la secuencia de la hebra opuesta. En el contexto de la presente invención, se ha encontrado que las sondas de oligonucleótidos que son complementarias a cualquiera de la hebra sentido o antisentido de la secuencia diana genómica se puede usar para detectar una secuencia diana genómica de interés.
El oncogén del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (HER-2) es un miembro de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico o genes erb y codifica un receptor de tirosina quinasa transmembrana que ha evolucionado como un clasificador principal de cáncer de mama invasivo y como una diana para terapia para el cáncer. El gen de HER-2 (C-erbB-2) está localizado en el cromosoma 17q. El HER-2 se ha relacionado con el pronóstico de la respuesta a la terapia con el anticuerpo monoclonal humanizado anti-HER-2 (trastuzumab) en pacientes con cáncer de mama metastásico avanzado. El estado de HER-2 también se ha sometido ensayo para su capacidad para predecir la respuesta del cáncer de mama a otras terapias incluyendo terapias hormonales, inhibidores de topoisomerasa, y antraciclinas. Las técnicas tanto basadas en morfología como basadas en contexto molecular se han usado para medir el estado de HER-2 en muestras clínicas de cáncer de mama. Hasta ahora, la tinción inmunohistoquímica (IHC) ha sido el método predominante utilizado. A diferencia de la mayoría de los ensayos de IHC, sin embargo, la evaluación del estado de HER-2 es cuantitativa en lugar de cualitativa, porque HER-2 se expresa en todas las células epiteliales de mama. Los estudios han mostrado que cuando un ensayo de IHC estandarizado se realiza en muestras de ensayo que se fijan de forma cuidadosa, se procesan, y se embeben, existe una correlación excelente entre el estado de copias genéticas y niveles de expresión de proteínas.
En el contexto de la presente invención, se ha encontrado de forma sorprendente que el conjunto de sondas de oligonucleótidos de la presente invención es particularmente adecuado para detectar el locus del gen del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER-2 humano). El receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2) está altamente expresado en aproximadamente un 30 % de pacientes con cáncer de mama, y las evidencias sustanciales apoyan la relación entre la sobreexpresión de HER2 y una escasa supervivencia global. Por consiguiente, siempre existe una necesidad de un método mejorado para detectar una expresión genética de HER-2 humano normal o anómala. La detección del locus del gen del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano de acuerdo con la presente invención se ejemplifica, por ejemplo, en los Ejemplos 1 a 3.
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Además, en el contexto de la presente invención se ha encontrado que la detección metalográfica de una secuencia diana genómica es particularmente favorable cuando el conjunto de sondas de oligonucleótidos se dirige contra regiones agrupadas de la secuencia diana de interés. El término "agrupado" como se usa en el presente documento se refiere a que las sondas de oligonucleótidos diferentes se dirigen contra secuencias diana individuales que pueden permanecer en estrecha cercanía entre sí. Esta estrecha cercanía puede incluir, pero no se limita a, una distancia de aproximadamente 50 a 500 nucleótidos. El agrupamiento de las sondas de oligonucleótidos se refiere además a que estas regiones no se distribuyen de manera uniforme con respecto a la secuencia diana genómica de interés, sino que las sondas de oligonucleótidos pueden estar distribuidas de forma no uniforme, cubriendo de ese modo las regiones en estrecha cercanía dentro del locus del gen (es decir, grupos) así como regiones que están situadas a más distancia. El agrupamiento de sondas de oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención se ejemplifica en la Figura 3 (véase, por ejemplo, combinaciones 2 y 4).
Por consiguiente, en otra realización preferente, el conjunto de sondas de oligonucleótidos de la presente invención se caracteriza por que las sondas de oligonucleótidos están agrupadas dentro de la secuencia diana genómica.
En el contexto de la presente invención, se ha encontrado de forma sorprendente que el análisis y/o visualización de una secuencia diana genómica es particularmente sensible cuando se usan sondas de oligonucleótidos agrupadas y procedimientos de detección metalográfica.
En otra realización preferente, el conjunto de sondas de oligonucleótidos de la invención se caracteriza por que las sondas de oligonucleótidos se dirigen contra una secuencia diana genómica, en el que la secuencia diana genómica comprende el locus del gen del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER-2 humano).
La expresión "locus del gen del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER-2 humano)" como se usa en el presente documento por lo general incluye todas las secuencias genómicas y/o regiones genómicas que constituyen el gen que codifica receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2). Estas secuencias puede ser o no esenciales para la expresión genética. Las secuencias que constituyen el locus del gen del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER-2 humano) son conocidas por la persona con experiencia en la materia y se pueden identificar, por ejemplo, mediante búsqueda en bases de datos que incluyen, pero no se limitan a, la base de datos GenBank del NCBI (National Center for Biotechnology Information).
En el contexto de la presente invención, se ha encontrado de forma sorprendente que el agrupamiento de las sondas de oligonucleótidos es particularmente favorable cuando se aplican métodos de detección metalográfica. Es decir, el agrupamiento de sondas de oligonucleótidos permite una detección altamente sensible de la secuencia genética ya que se supone que la deposición de metal mediada por enzimas se acelera por la estrecha proximidad de las marcas entre sí.
En el contexto de la presente invención, se ha demostrado que un conjunto de sondas de oligonucleótidos que comprende al menos 100 sondas de oligonucleótidos diferentes se puede usar de forma satisfactoria para detectar una secuencia diana genómica, en particular una secuencia diana genómica que comprende el locus del gen de HER-2. La detección de una secuencia diana genómica, en particular una secuencia diana que comprende el locus del gen de HER-2 de acuerdo con la presente invención se ejemplifica, por ejemplo, en las Figuras 1 a 4.
Por consiguiente, en otro aspecto, la presente invención proporciona un uso del kit de la presente invención para la detección mediante hibridación in situ de una secuencia diana genómica.
En el contexto de la presente invención, los términos "detección" o "detectar" por lo general hacen referencia a la visualización, análisis y/o cuantificación de la unión de una sonda de oligonucleótidos a su secuencia diana. La detección de acuerdo con la presente invención incluye, pero no se limita a, inspección visual de las muestras sondeadas incluyendo el uso de técnicas microscópicas convencionales así como cualquier tipo de análisis de fluorescencia. En particular, la inspección visual de la muestra se realiza después de haber hibridado la sonda de oligonucleótidos a su secuencia diana. En el caso de marcas radiactivas, la detección o medio para detectar se refiere a la exposición de las muestras sondeadas a una película de rayos X incluyendo la generación de un autorradiograma. Preferentemente, la detección o medio para detectar de acuerdo con la presente invención se realiza por medio de reacción cromogénica, reacción metalográfica, o por medio de análisis de fluorescencia directa
o indirecta.
En el contexto de la presente invención, se ha encontrado de forma sorprendente que un conjunto de sondas de oligonucleótidos que comprende al menos 100 sondas de oligonucleótidos diferentes permite un método de detección que proporciona diversas ventajas con respecto a la técnica. Es decir, con el conjunto de sondas de oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención, la secuencia diana genómica de interés se puede detectar (i) con una cantidad de sonda reducida, (ii) después de un tiempo de hibridación reducido, y/o (iii) con un fondo reducido en comparación con los métodos conocidos y disponibles en la técnica. Los métodos convencionales conocidos para detectar secuencias diana genómicas emplean, por ejemplo, técnicas de hibridación in situ cromogénica (CISH) e inmunohistoquímica (IHC) (Inform™ de Ventana, Ventana Medical Systems Inc., USA; SpotLight™, Zymed Laboratories Inc., CA, USA).
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Por consiguiente en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para detectar una secuencia diana genómica de interés mediante hibridación in situ, comprendiendo dicho método las etapas de
a) incubar un conjunto de sondas de oligonucleótidos como se define en el contexto del kit de acuerdo con la presente invención con una muestra en condiciones que conducen a la unión del conjunto de sondas de oligonucleótidos a la secuencia diana genómica de interés en el que no se realiza una etapa de calentamiento adecuada para disolver estructuras secundarias antes de la unión; y
b) detectar la unión de las sondas de oligonucleótidos to la secuencia diana genómica.
Todos los aspectos y realización como se ha definido anteriormente también pertenecen al método para detectar una secuencia diana genómica de interés.
La expresión "en condiciones que conducen a la unión" por lo general se refiera condiciones en las que las sondas de oligonucleótidos marcadas de la invención se puede hibridar a su secuencia diana, es decir, condiciones en las que las sondas de oligonucleótidos se pueden unir a su secuencia diana. En particular, en el contexto de la presente invención, las condiciones que conducen a la unión se refiere a la formación de pares de bases complementarias entre las sondas de oligonucleótidos y la secuencia diana. La hibridación entre las sondas de oligonucleótidos y la secuencia diana y por lo tanto la formación de pares de bases complementarias se define mediante formación de enlaces de hidrógeno e interacciones hidrófobas en equilibrio. Es decir, la hibridación y la separación de las dos hebras complementarias depende de una diversidad de factores, incluyendo temperatura, concentraciones de sal, pH, la naturaleza de las sondas y moléculas diana, y la composición de la solución de hibridación y de lavado. La temperatura óptima para hibridación está preferentemente en el intervalo de 15-25 ºC por debajo del valor de Tf que define la temperatura de fusión (Tf) de los híbridos, es decir, la temperatura a la que un 50 % de las cadenas de ácidos nucleicos de doble hebra se separan. La persona experta en la materia conoce diversas fórmulas para calcular los valores de Tf. Por lo general los híbridos de ARN-ARN son 10-15 ºC más estables que los híbridos de ADN-ADN o ADN-ARN y por lo tanto requieren condiciones más rigurosas para la hibridación y el lavado. Las condiciones que conducen a la unión de acuerdo con la presente invención también incluyen el uso de reactivos que contienen tampón de hibridación para maximizar la formación de dúplex y para inhibir la unión no específica de la sonda al tejido o las células. La concentración de la sonda se debe optimizar para cada sonda y para cada tejido. Las condiciones que conducen a la unión también se refieren a la incubación de las sondas con la secuencia diana durante un periodo de tiempo suficiente como para permitir una hibridación óptima incluyendo la retirada de sondas no unidas mediante la aplicación de una o más etapas de lavado.
En particular, en el contexto de la presente invención, las condiciones que conducen a la unión de acuerdo con la presente invención se refieren a las condiciones de hibridación en las que las sondas de oligonucleótidos se incuban con la nuestra diana en solución. Es decir, las condiciones que conducen a la unión no se refieren a ninguna condición en la las sondas de oligonucleótidos se incuban con la muestra diana a la vez que se inmovilizan, por ejemplo tal como en el contexto de una matriz de ADN. Las condiciones que conducen a la unión de acuerdo con la presente invención se describen por ejemplo en el Ejemplo 3.
El análisis de la expresión genética puede ser indicativo de la presencia de enfermedades, para evaluar diferentes estadios de enfermedades, o para el éxito o fracaso de tratamientos terapéuticos. Por ejemplo, se ha descrito que la sobreexpresión genética de HER-2 está asociada con un grado más elevado y formas extensas de carcinoma ductal, mientras que la amplificación genética de HER-2 se ha relacionado con un resultado adverso en el carcinoma lobular invasivo. Además, la amplificación genética de HER-2 y la sobreexpresión de proteínas se han asociado de forma coherente con un grado de tumor elevado, aneuploidía de ADN, tasa de proliferación celular elevada, ensayos negativos para receptores de proteínas nucleares para estrógenos y progesterona, dotación de p53, amplificación de la topoisomerasa IIa y alteraciones en una diversidad de otros biomarcadores moleculares de invasión y metástasis de cáncer de mama (véase, por ejemplo, Ross et al., 2004). El estado de la expresión genética de HER-2 se ha relacionado adicionalmente con el pronóstico de respuesta a la terapia con el anticuerpo monoclonal humanizado anti-HER-2, trastuzumab (Herceptin®, Genentech, CA, USA).
Por consiguiente, en una realización preferente, el método para detectar una secuencia diana genómica de acuerdo con la presente invención se caracteriza adicionalmente por que la detección es para un fin de diagnóstico, en particular para una enfermedad humana y/o para la eficacia de un tratamiento terapéutico en un paciente.
La fiabilidad de los métodos de detección sensibles para su uso con fines de diagnóstico y para la evaluación de trata mitos médicos es de importancia en particular.
El uso de la invención o el método de la presente invención se caracteriza por que la detección por la realización de detección se realiza por medio de hibridación in situ.
La hibridación in situ es un método convencional y por lo tanto es de importancia en particular.
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La expresión "hibridación in situ", como se usa en el contexto de la presente invención, por lo general se refiere a cualquier tipo de ensayo de hibridación de ácido nucleico en el que se usa una sonda de oligonucleótido marcada para localizar una secuencia de ADN o de ARN específica en una parte o sección de un tejido (in situ), una célula o, si el tejido es lo suficientemente pequeño (por ejemplo, semillas de plantas o embriones de Drosophila), en todo el organismo. Por consiguiente, la hibridación in situ de acuerdo con la presente invención se requiera cualquier método para localizar y detectar secuencias de nucleótidos específicas en secciones de tejidos morfológicamente conservados o preparaciones celulares para hibridar la hebra complementaria de una sonda de nucleótidos a la secuencia de interés.
Por lo general existen dos tipos de sondas marcadas que se pueden usar en un método de hibridación in situ, en particular oligonucleótidos marcados ya sea de forma directa o indirecta. Un oligonucleótido se puede marcar de forma indirecta mediante su conjugación a una molécula que se puede detectar m con una molécula secundaria o anticuerpo tal como, por ejemplo, biotina. Los oligonucleótidos marcados con biotina se usan frecuentemente para técnicas de hibridación in situ y se pueden detectar, por ejemplo, mediante unión de avidina conjugada con fluorocromo a la sonda marcada con biotina e hibridada. Otro tipo de oligonucleótidos marcados de forma indirecta puede incluir los conjugados a digoxigenina o dinitrofenilo. Estas marcas se pueden detectar, por ejemplo, mediante anticuerpos anti-digoxigenina o anti-dinitrofenilo conjugados con fluorocromo. Otros oligonucleótidos se pueden marcar directamente mediante unión covalente de fluorocromos a nucleótidos individuales o reactivos de unión no nucleotídicos en una posición definida que elimina la necesidad de moléculas de detección contrarias. El marcado de sondas de oligonucleótidos después de la síntesis de ADN a menudo es más fácil que la incorporación de nucleótidos marcados durante la síntesis. La detección de sondas marcadas directamente, por el contrario, requiere menos tiempo ya que se puede omitir el uso de moléculas de detección secundarias. Por lo tanto, existen ventajas y desventajas evidentes para las sondas marcadas tanto de forma directa como indirecta.
Preferentemente, las sondas de oligonucleótidos de la presente invención se marcan con dinitrofenilo y se detectan mediante el uso de anticuerpos anti-dinitrofenilo.
La sonda de oligonucleótidos usada para hibridación in situ puede ser ADN o ARN o una combinación de ambos y puede estar marcada o no con fluorescencia. Por consiguiente, la hibridación in situ de la presente invención incluye técnicas tanto de hibridación in situ fluorescente (FISH) así como todos los métodos conocidos de hibridación in situ cromogénica (CISH) que se pueden usar, por ejemplo, en diagnósticos médicos para evaluar la integridad cromosómica. La hibridación in situ también se puede realizar usando sondas de oligonucleótidos marcadas con hapteno o radio, en las que la detección se realiza, por ejemplo, mediante el uso de anticuerpos marcados con fluoróforo, avidina, o exposición a rayos X. los métodos de hibridación in situ son bien conocidos por la persona con experiencia en materia y se describen, por ejemplo, en Silverman y Kool, 2007, Advances in Clinical Chemistry, Vol.
43: 79-115.
La hibridación in situ de acuerdo con la presente invención incluye adicionalmente todos los procedimientos conocidos de hibridación in situ múltiplex o multicolor, es decir, todos los procedimientos en los que se usan las sondas de oligonucleótidos con marcas fluorescentes coloreadas de formas diferentes o en los que se usan sondas de oligonucleótidos con diferentes haptenos y diferentes sistemas de enzimas/sustrato. Estas marcas múltiples se pueden detectar de forma simultánea o en una serie de etapas de detección. Los métodos de este tipo son conocidos por la persona con experiencia en la materia y se describen, por ejemplo, en Wiegant et al., 1993 (Cytogenet Cell Genet 63: 73-76).
Como se ejemplifica, por ejemplo, en el Ejemplo 1 de la presente invención, la detección de una secuencia diana genómica se consiguió de zona satisfactoria en un breve periodo de tiempo, es decir, después de un tiempo de hibridación significativamente inferior a 4 horas. Además, en comparación con los métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, el método de detección Inform™ de Ventana), se obtuvieron mejores resultados incluso después de un tiempo de hibridación de 1 hora o 30 minutos.
Por consiguiente, en una realización preferente, el método de la presente invención se caracteriza adicionalmente por que la detección de la etapa b) se realiza por medio de una reacción cromogénica, por medio de una reacción metalográfica, o por medio de análisis de fluorescencia directa o indirecta; y/o la incubación de la etapa a) se completa después de como máximo 4 horas, 3 horas, o 2 horas, en particular después de como máximo 1 hora o 30 min.
Como se ha encontrado de forma sorprendente en el contexto de la presente invención, la detección de la secuencia diana genómica se podría conseguir en un periodo más corto de tiempo de hibridación en comparación con los métodos de detección convencionales conocidos en la técnica (véase por ejemplo la Figura 2). La detección de una secuencia diana genómica por medio de análisis de fluorescencia indirecta se ejemplifica, por ejemplo, en la Figura
4.
La expresión "completada" como se denomina en el presente documento no se debe entender como que la incubación de la etapa a) está esencialmente acabada. Se refiere aquí un aumento del tiempo de incubación podría no dar como resultado una mejora o aumento significativo de la señal. Por el contrario, el término "completada" en su
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lugar se refiere a que la hibridación de las sondas de oligonucleótidos a la secuencia diana de interés se completa de modo que se puede obtener un resultado detectable.
Como se ejemplifica, por ejemplo, en el Ejemplo 3, en el contexto de la presente invención se ha observado adicionalmente que la elección de diferentes subconjuntos de sondas de oligonucleótidos, que dan como resultado diversas composiciones de "cóctel" de sonda de oligonucleótidos, permite una mejora de la detección en comparación con los métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, Inform™ de Ventana).
También se desvela un método para generar un conjunto de sondas de oligonucleótidos dirigidas contra una secuencia diana genómica de interés, comprendiendo dicho método las etapas de diseñar un conjunto de sondas de oligonucleótidos complementarias al menos a 100 regiones diferentes de una secuencia diana genómica de interés, en particular en las que las regiones comprenden secuencias no repetitivas; y sintetizar el conjunto de sondas de oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención.
Todos los aspectos y realización como se ha definido anteriormente también se refieren al método para generar un conjunto de sondas de oligonucleótidos dirigidas contra una secuencia diana genómica de interés.
Una de las ventajas del presente método es que las sondas de oligonucleótidos se pueden generar de una manera altamente reproducible. Además, el diseño de las sondas de oligonucleótidos se puede adaptar a diversas secuencias genéticas diferentes.
La expresión "diseñar" como se usa en el presente documento por lo general se refiera la identificación de secuencias diana diferentes con las que son complementarias las sondas de oligonucleótidos. Como se ha detallado anteriormente, las sondas de oligonucleótidos de la presente invención se pueden diseñar de un modo tal que puedan ser complementarias a cualquiera de la hebra sentido o antisentido de la secuencia diana. Preferentemente, las sondas de oligonucleótidos se diseñan de un modo tal que no sean complementarias a ninguna región repetitiva del genoma humano. Diseñar se refiere adicionalmente a que las sondas de oligonucleótidos pueden formar cualquier tipo de pares de bases complementarias con la secuencia diana de interés incluyendo, pero no limitándose a, pares de bases canónicas y no canónicas y faltas de coincidencias de bases. Es decir, las sondas de oligonucleótidos de la presente invención se puede diseñar preferentemente, pero no necesariamente, para que desvele una complementariedad con respecto a la secuencia diana de un 100 %. Las sondas de oligonucleótidos también se pueden diseñar para que desvele en menos de un 100 % de complementariedad con respecto a la secuencia diana, si se considera apropiado. La complementariedad entre la sonda de oligonucleótidos y la secuencia diana de interés, sin embargo, tiene que ser lo suficiente como para proporcionar unión a y, en consecuencia, detección de la secuencia diana de interés. Con los índices crecientes de genes clonados, las sondas de oligonucleótidos se pueden diseñar fácilmente basándose en cualquier secuencia de ADNc publicada y/o entrada en banco genético. Las bases de datos con secuencias genómicas de diversos organismos c son conocidas por la persona con experiencia en la materia e incluyen, por ejemplo, todas las bases de datos públicas del NCBI (National Center of Biological Information, USA).
La expresión "sintetizar" como se usa en el presente documento se refiere preferentemente a la generación de sondas de oligonucleótidos por medio de síntesis química que incluye, pero no se limita a, el uso de sintetizadores de ADN y/o ARN automatizados y química de fosforamidita. La persona con experiencia en la materia usa de forma rutinaria sintetizadores de ADN o ARN automatizados y están disponibles en el mercado en diversos proveedores tales como, por ejemplo, Applied Biosystems (Darmstadt, Alemania), Biolytic (Newark, CA, USA), o BioAutomation (Plano, TX, USA). Preferentemente, las sondas de oligonucleótidos de la presente invención se sintetizan en una o más placas de 96 pocillos, proporcionando de este modo una síntesis de alto rendimiento rápida y resistente. La síntesis química de las sondas de oligonucleótidos en formato de placas de 96 pocillos no solamente permite una síntesis rápida de diversos oligonucleótidos diferentes, sino también la selección altamente eficaz y combinatoria de diferentes subconjuntos de oligonucleótidos. Como ya se ha detallado anteriormente, el método para detectar una secuencia diana genómica de interés de acuerdo con la presente invención se puede optimizar adicionalmente mediante elección individual y combinatoria de al menos 100 subconjuntos de oligonucleótidos diferentes a partir de una combinación grande de oligonucleótidos generados mediante síntesis múltiple en formato de 96 pocillos que a continuación se puede usar para formar el conjunto de sondas de oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención. La selección combinatoria de diferentes subconjuntos de sondas de oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención se ejemplifica, por ejemplo, en el Ejemplo 3. Este proceso de optimización se puede evaluar adicionalmente mediante lectura experimental.
Opcionalmente, las sondas de oligonucleótidos se pueden purificar adicionalmente mediante cualquier tipo de método convencional aplicable y conocido en la técnica. Los métodos de este tipo incluyen, pero no se limitan a, métodos cromatográficos tales como, por ejemplo, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).
Opcionalmente, la purificación de las sondas de oligonucleótidos se realiza a través de uno o más grupos protectores unidos tales como, por ejemplo, DMT (dimetoxitritilo). El grupo DMT se usa ampliamente para la protección de los nucleósidos en síntesis de oligonucleótidos. En principio, cada una de las sondas de
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conjuntos de composiciones de sondas de oligonucleótidos usadas para detección genética de HER-2. Se generaron diferentes subconjuntos de sondas de oligonucleótidos por combinación de diversas sondas de oligonucleótidos de diferentes placas de 96 pocillos. Cada caja indica una placa de 96 pocillos que comprende 96 sondas de oligonucleótidos diferentes. (B) Hibridación in situ usando el sistema de detección Inform™ de Ventana que comprende aproximadamente 15000 marcas (panel izquierdo superior) en comparación con los resultados obtenidos con diferentes conjuntos de sondas de oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención. Las sondas de oligonucleótidos de la presente invención se generaron en un formato de placas de 96 pocillos (15 placas en total), y diferentes conjuntos de sondas de oligonucleótidos (por ejemplo, diferentes combinaciones) generadas por combinación de diferentes placas. Combinación 1: combinación de placas 1 a 15; número total de marcas: 8640; Combinación 2: combinación de placas 1 a 4 y 12 to 15; número total de marcas: 4608; Combinación 4: combinación de placas 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, y 15; número total de marcas: 4608.
La Fig. 4 muestra la visualización de la amplificación genética de HER2 en Xenoinjertos obtenidos a partir de células MCF7 y Calu tal como se investiga mediante hibridación in situ con sondas de oligonucleótidos marcadas con DNP usando detección fluorescente indirecta. La sonda hibridada al locus del gen de HER2 se visualizó usando un filtro de Cy5 (filtro Cy5), y la contratinción se visualizó a través de un filtro DAPI (DAPI). Superposición: filtro de Cy5 y de DAPI. (A) sin amplificación genética. Detección de la secuencia genómica de HER2 usando IgG anti-conejo conjugada con DyLight™649 en Xenoinjertos obtenidos a partir de células MCF7.
(B) Amplificación genética elevada. Detección de la secuencia genómica de HER2 usando IgG anti-conejo conjugada con DyLight™649 en Xenoinjertos obtenidos a partir de células Calu.
La Fig. 5 muestra la figura esquemática de sondas de oligonucleótidos marcadas a modo de ejemplo usadas para hibridación in situ. (A) Secuencias primarias y diseño de cinco sondas de oligonucleótidos de ADN de 87 mer diferentes dirigidas contra el locus del gen de HER-2 humano, comprendiendo cada una 81 nucleótidos y 6 marcas de DNP fosforamidita (1 en el extremo en la posición 5’ y 5 incorporadas internamente). La posición de cada marca se indica con "X", en la que X indica 2,4-dinitrofenilo (DNP). El DNP se coloca en un espaciamiento de 16 nts en las posiciones 2, 19, 36, 53, 70 y 87, tal como se hace el recuento desde el extremo en la posición 3’-terminal. (B). Estructura química de un componente básico modificado con fosforamidita unido a 2,4dinitrofenilo (X). DMP indica dimetoxitritilo.
Ejemplos
Síntesis de sonda
La síntesis de sondas de ADN en placa de 15 x 96 pocillos de oligonucleótidos con 87 mer marcados con 6 DNP se realizó en un Sintetizador de ADN Biolytic Dr. Oligo 192 MWP en una escala de 50 nmoles usando química de fosforamidita convencional y ciclos de síntesis de Biolytic. La síntesis se realizó en modo encendido de DMT. Un soporte de 2000 A CPG dT (Glen Research™, n.º de cat. 20-2032) se cargó en todos los pocillos de una placa de síntesis de micropocillos (placa de filtro Orochem™ de 96 pocillos, n.º de cat. OF1100). Los demás reactivos estándar necesarios para síntesis de oligonucleótidos basada en fosforamidita se adquirieron en Proligo™ o Glen Research™, acetonitrilo en Baker™. La calidad de la síntesis de oligonucleótidos se comprobó regularmente mediante detección de color de catión de DMT liberado. Después de completar la síntesis, los oligonucleótidos se escindieron y se desprotegieron con amoniaco (20 h, 40 ºC), a continuación se evaporó en un concentrador de vac de velocidad y se volvió a suspender en 600 µl de Tris 10 mM a pH 8,0. A partir de ese momento, la concentración se determinó mediante medición a DO 260 nm. Rendimiento: 7-16 DO 260 nm. Esta cualidad en bruto se usó para constituir diferentes combinaciones de sondas.
Hibridación in situ
El ensayo de hibridación in situ se realizó en un Sistema Ventana Discovery XT (n.º de Cat. 750-701) usando reactivos Ventana™ para desparafinación, tratamiento previo, lavado y lavados rigurosos. Las muestras se hibridaron con composiciones de sonda de acuerdo con la presente invención o con la Sonda de ADN INFORM HER2 de Ventana™ (Ventana, n.º de cat. 780-4332). A menos que se indique de otro modo, el conjunto de sondas de oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención constaba de 1440 sondas de oligonucleótidos comprendiendo cada una 81 nucleótidos y portando 6 marcas de DNP no nucleotídicas en posiciones idénticas con una distancia de 16 nucleótidos entre sí. El número total de marcas en esta sonda fue 8640.
Las sondas se detectaron mediante detección metalográfica enzimática, mediante detección cromogénica o mediante detección fluorescente indirecta. Las composiciones de sonda de acuerdo con la presente invención se diluyeron en tampón de hibridación (que contenía formamida, sulfato de dextrano, cloruro sódico, citrato sódico en tampón Tris) a una concentración final de 4 µg/ml. El fabricante proporciona la Sonda de ADN INFORM HER2 de Ventana™ (Ventana, n.º de cat. 780-4332) como una solución lista para usar en tampón de hibridación a una concentración final de 10 µg/ml. Las muestras eran portaobjetos de Control de Xenoinjerto 3 en 1 con HER2 embebido en parafina fijado en formalina (Ventana, n.º de cat. 783-4332). Cada portaobjetos lleva 3 secciones de tejido de Xenoinjertos obtenidos a partir de células Calu3 (amplificación genética de HER2 elevada), ZR-75-1 (amplificación genética de HER2 intermedia) y MCF7 (sin amplificación genética de HER2), respectivamente.
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