KR101350747B1 - 실시간 역전사효소 중합반응을 이용한 유방암의 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 유방암진단용 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 실시간 역전사효소 중합반응을 이용한 유방암의 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 유방암진단용 키트에 관한 것이다.

Description

실시간 역전사효소 중합반응을 이용한 유방암의 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 유방암진단용 키트{Method of providing information for diagnosis of breast cancer using quantitative realtime PCR and diagnostic kit comprising thereof}

본 발명은 실시간 역전사효소 중합반응을 이용한 유방암의 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 유방암진단용 키트에 관한 것이다.

Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) 수용체는 타이로신 키나아제 활동을 지닌 185kDa의 막 당단백질로 상피세포의 성장과 분화를 조절하는 세포하 신호전달체계의 활성화에 중요한 역할을 한다(Akiyama T, Sudo C, Ogawara H, Toyoshima K, Yamamoto T. Science 1986;232:1644-6.). 유방암 환자에서 HER2 유전자의 증폭이나 HER2 단백질의 과발현은 유방암 환자의 10~34%에서 관찰된다(Ross JS, Fletcher JA. Am J Clin Pathol 1999;112:S53-67.). HER2 상태에 대한 분석은 환자의 예후와 anti-HER2 단클론 항체인 Tratuzumab 치료에 중요하다(Cobleigh MA, Vogel CL, Tripathy D, Robert NJ, Scholl S, Fehrenbacher L, et al. J Clin Oncol 1999;17:2639-48.; Shak S. Herceptin Multinational Inverstigator Study Group Semin Oncol 1999;26:71-7).

최근 많은 임상 연구에서 HER2에 대한 표적치료제인 Tratuzumab (Herceptin) 이 전이성 유방암 뿐만 아니라 초기 유방암의 보조적 요법 후에도 재발률을 감소시키고 생존율을 연장시키는 결과가 나오면서 HER2 과발현 유무는 예후인자로서의 가치 뿐만 아니라 치료 계획에 있어서도 매우 중요한 요소가 되었다(Salmon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, Fuchs H, Paton V, Bajamonde A, et al. N Engl J Med 2001;344:783-92; Smith I, Procter M, Gelber RD, Guillaume S, Feyereislova A, Dowsett M, et al. Lancet 2007;369:29-36).

초창기에는 HER2 유전자 증폭이나 단백질 과발현 유무를 알아보는 방법으로 Southern 또는 Western blotting이 쓰였으나 임상 적용은 되지 못하였으며, 암조직에서 유전자의 증폭을 측정하는 형광도소교잡법 (fluorescence in situ hybridization, FISH)과 단백질 발현을 찾는 면역조직화학염색법(immunohistochemistry, IHC)이 있다. 면역조직화학 염색 방법이 일차 선별검사로 가장 널리 쓰이고 있으나 기관별 차이가 있고 기술적인 정확성이나 결과의 재연성면에서 논란이 많다(Press MF, Sauter G, Bernstein L, Villalobos IE, Mirlacher M, Zhou JY, et al. Clin Cancer Res 2005;11:6598-607)

형광도소교잡법은 현재 가장 믿을만하다고 알려져 있으며, DNA 자체가 매우 안정적이므로 파라핀포매 조직에서 행할 수 있고 면역조직화학염색보다 조직의 상태에 민감하지 않으며 병리의사 간의 판독 일치율이 높은 장점이 있다. 그러나 검사과정이 복잡하고 판독시 암실에서 형광현미경을 통해 진행하여야 하는 불편함이 있으며 형광을 사용하기 때문에 결과의 영구보존이 불가능하며 비용이 비싸다는 단점이 있다(Lewis F, Jackson P, Lane S, Coast G, Hanby AM. Histopathology 2004:45:207-17.)

관련 선행특허로 대한민국특허공개번호 제1020090079845호는 '유방암 모니터링，진단 및 스크리닝용 단백질 마커 및 이를 이용한 유방암 모니터링，진단 및 스크리닝 방법'에 관한 것으로, Vitronectin, sVCAM-1(Soluble Vascular cell adhesion molecule-1), sCD40L(Soluble CD40 ligand), EGF(Epidermal growth factor), tPAI-1(Total plasminogen activator inhibitor-1), ApoA-1(Apolipoprotein-A1), proApoA-1(Proapolipoprotein-A1), Kininogen, VDBP(Vitamin D-binding protein), ApoA1/proApoA1(ApoA-1과 Proapolipoprotein-A1의 비율), CRP/Kininogen(CRP와 Kininogen의 비율), Hemoglobin 및 MPO(myeloperoxidase)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 유방암 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트가 기재되어 있으며,

다른 관련 선행특허로 대한민국특허공개번호 제1020090064378호는 '유방암 관련 유전자 및 폴리펩티드'에 관한 것으로, 유방암에서 현저하게 발현이 증가하는 신규한 인간 유전자 A7322를 제공하고, 유방암에서 현저하게 발현이 증가하는 신규한 인간 유전자 F3374를 제공하며, 이런 유전자들 및 이들에 의해 암호화되는 폴리펩티드들은 유방암의 진단, 및 유방암에 대한 약제 개발을 위한 표적 분자로 이용될 수 있으며, PBK/TOPK의 키나아제 활성의 조절자를 스크리닝하는 방법이 기재되어 있다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 실시간 역전사효소 중합반응을 이용한 유방암의 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 유방암진단용 키트를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 a) 암 의심환자의 혈액에서 얻은 세포로부터 전장 RNA를 분리하는 단계;b) 상기 분리된 전장 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계;c) 상기 합성된 cDNA를 인간 표피 증식인자 수용체 (HER) 2를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브, 및 글리세르알데히드 -3-인산 탈수소효소(GAPDH)를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머쌍 및 프로브를 이용하여 실시간-PCR을 수행하는 단계; 및 d) 상기 증폭된 양을 정상인에 대해 발현된 양과 비교하는 단계;를 포함하는 유방암의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

일반적으로 사용되는 전장 RNA(Total RNA)를 분리하는 방법 및 이로부터 cDNA를 합성하는 방법은 공지된 방법을 통해 수행될 수 있으며, 이 과정에 대한 자세한 설명은 Joseph Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); 및 Noonan, K. F. 등에 개시되어 있어 본 발명의 참조로서 삽입될 수 있다.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속,철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그널을 직접 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열(HER 2, 및 GAPDH 유전자)은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광, 화학발광단 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 루오리신(fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine) Cy-5 또는 Cy-3일 수 있다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단 및/또는 3' 말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 real-time RT-PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다.

또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 real-time RT-PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용할 수 있다.

표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

본 발명의 한 측면에 따르면, 본 발명에서는 RT-PCR을 통해 mRNA 수준에서 발현수준을 측정하게 된다. 이를 위하여 상기 HER 2, 및 GAPDH 유전자에 특이적으로 결합하는 신규한 프라이머 쌍과 형광이 표지된 프로브가 요구되며, 본 발명에서 특정한 염기서열로 특정된 해당 프라이머 및 프로브를 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 이들 유전자에 특이적으로 결합하여 검출가능한 시그널을 제공하여 real-time RT-PCR을 수행할 수 있는 것이면, 제한 없이 사용될 수 있다. 상기에서 FAM과 Quen(Quencher)는 형광염료를 의미한다.

본 발명에 적용되는 real-time RT-PCR 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 공지의 과정을 통해 수행될 수 있다.

mRNA 발현수준을 측정하는 단계는 통상의 mRNA 발현수준을 측정할 수 있는 방법이면 제한 없이 사용될 수 있으며, 사용한 프로브 표지의 종류에 따라 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 real-time RT-PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 real-time RT-PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 상기 realtime RT-PCR을 통해 증폭된 PCR 산물에 형광이 표지된 프로브가 붙어 특정 파장의 형광을 내게 되고, 증폭과 동시에 realtime PCR 장치의 형광 측정기에서 본 발명의 유전자들의 mRNA 발현수준을 실시간으로 측정하고, 측정된 값이 계산되어 PC를 통해 시각화 되게 되어 검사자는 쉽게 그 발현 정도를 확인할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면 상기 진단 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 유방암 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 상기 본 발명의 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이일 수 있다.

그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "암 진단을 위한 정보제공방법"은 진단을 위한 예비적 단계로서 암의 진단을 위하여 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다.

용어 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.

용어 "프로브"는 단일쇄 핵산 분자이며, 타깃 핵산 서열에 상보적인 서열을 포함한다.

용어 "실시간 역전사 중합효소 반응(realtime RT-PCR)"이라 함은 역전사효소를 이용하여 RNA를 상보적인 DNA(cDNA)로 역전사 시킨 후에 만들어진 cDNA를 주형(template) 으로하여 타겟 프라이머와 표지를 포함하는 타겟 프로브를 이용해 타겟을 증폭함과 동시에 증폭된 타겟에 타겟 프로프의 표지에서 발생하는 신호를 정량적으로 검출해 내는 분자생물학적 중합방법이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 증폭된 양을 정상인에 대해 증폭된 양과 비교하는 단계는 표준 또는 컷오프 값에 의하여 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 방법은 발현 양 기준으로 50 이상은 양성, 20 아래는 음성이며 20~50은 컷오프값인 것이 바람직하고,
여기서, 상기 발현 양은 ΔCt 값을 의미하고,
상기 ΔCt 값 = 상기 환자 조직에서 상기 HER2의 Ct 값 - 환자 조직에서 상기 GAPDH 유전자의 Ct 값을 의미하고, 상기 Ct값은 PCR과정 중 증폭이 뚜렷하게 증가되기 시작한 주기(Cycle)의 수치를 나타내는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 인간 표피 증식인자 수용체 (HER) 2를 증폭할 수 있는 프라이머쌍은 서열번호 5 및 6에 기재되고, 프로브는 서열번호 11 및 12에 기재된 염기서열을 가지는 프로브 중 하나 이상인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니하고, 상기 GAPDH를 증폭할 수 있는 프라이머쌍은 서열번호 1 및 2에 기재되고, 프로브는 서열번호 9에 기재된 염기서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 인간 표피 증식인자 수용체 (HER) 2를 증폭할 수 있는 서열번호 5 및 6에 기재된 프라이머쌍과 서열번호 11 및 12에 기재된 염기서열을 가지는 프로브 중 하나 이상의 프로브;및 GAPDH를 증폭할 수 있는 서열번호 1 및 2에 기재된 프라이머쌍과 서열번호 9에 기재된 프로브로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머쌍 및 프로브를 포함하는 유방암의 진단을 위한 프라이머쌍 및 프로브를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 프로브의 5'말단은 형광물질로 표지된 것이 바람직하고, 상기 형광물질은 FAM 또는 Cy-5인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하는 유방암 진단용 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 조성물을 포함하는 유방암 진단용 키트를 제공한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명은 간편하고 정량적인 결과를 도출할 수 있는 Real-time RT-PCR법을 기초로 하여 reference gene인 GAPDH와 TBP를 이용한 GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), TBP (TATA-binding protein) 대비 HER2 유전자를 증폭한 후 나타난 발현양을 비교 정량하여 발현율을 기존의 방법인 IHC와 FISH 결과와 비교하여 보았다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

유방암 cell line 으로부터 HER2 의 발현의 민감도 비교확인

기존 논문상에 나와있는 exon 5 부위의 HER2 유전자(도 1 Savino M, Parrella P, Copetti M, Barbano R, Murgo R, Fazio VM, Valori VM, Carella M, Garrubba M, Santini SA. Cell Oncol. 2009;31(3):203-11.)와 IHC와 FISH대비 62~65%의 민감도를 보여주고 있는 논문상에서 많이 이용된 exon 20부분(그림2의 1부분 Egervari K, Toth J, Nemes Z, Szollosi Z. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2009 May;17(3):247-54.와 도 2의 2부분 Cuadros M, Talavera P, Lopez FJ, Garcia-Perez I, Blanco A, Concha A. Pathobiology. 2010;77(1):38-45. Epub 2010 Feb 25.)에서 새로 제작된 HER2 유전자부위의 민감도를 비교하기 위하여(그림 2) 유방암 cell line인 SK-BR3를 10⁵ 부터 1 세포 까지 희석하여 민감도를 확인하였다. 그 결과 새로 제작된 HER2 유전자의 10⁵에서 1세포까지의 Ct값은 각각 19.96에서 36.94로(도 3) 기존 논문상의 HER2 유전자의 10⁵에서 10세포까지의 Ct값인 20.25에서 33.86보다 낮게 나와 새로 제작된 HER2유전자의 민감도가 높아졌음을 확인할 수 있었다(도 4).

또한 새로 제작된 HER2 유전자 부위의 probe를 2개를 넣었는데 이 부분이 기존의 방법과 민감도에서 어떠한 차이를 보이는지 유방암 cell line인 SK-BR3를 10⁵ 부터 1 세포까지 희석하여 민감도를 확인하였다. 그 결과 새로 제작된 HER2 유전자의 probe를 2개를 넣은 10⁵에서 1세포까지의 Ct값은 각각 19.65에서 31.57(도 5-A)로 기존 논문상의 HER2 유전자의 probe를 하나 넣어 진행한 10⁵에서 10세포까지의 Ct값인 각각 20.87에서 37.48(도 5-B)와 20.03에서 34.46(도 5-C)보다 낮게 나와 새로 제작된 HER2유전자의 probe를 2개를 넣은 경우가 probe를 하나만 넣어 진행된 결과 값보다 민감도가 높아졌음을 확인할 수 있었다.

A는 HER2 gene에서 본 실험에서 제작한 두 부위의 probe를 혼합하여 실시한 민감도 테스트 결과이며, B는 기존 논문상에 나타난 probe를 이용하여 실시한 민감도 테스트 결과이며, C는 본 실험에서 제작한 부위 중 한 부위의 probe만 이용하여 실시한 민감도 테스트 결과이다.

reference gene 의 선택을 위한 GAPDH 와 TBP 의 비교

기존에 많이 사용되고 있는 reference gene인 GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), TBP (TATA-binding protein) 중에서 본 실험의 HER2에 사용된 reference gene을 선택하기 위하여 임상샘플을 이용하여 두 gene의 발현양상을 비교하여 본 결과 GAPDH gene의 Ct값이 TBP gene의 Ct값보다 낮게 나왔으며 이에 따른 발현값을 비교해 본 결과에서도 GAPDH gene을 이용한 발현값이 TBP gene을 이용한 발현값보다 양성-음성의 구별이 차이가 있음을 확인할 수 있었고(표 1) 이 결과를 Graphpad Prism (Graphpad software, Inc)를 이용하여 두 방법의 분포도를 확인 하여 봤을 때 그 구별이 더 확실해 짐을 알 수 있었다. 즉 TBP gene의 발현값이 낮아 cut-off를 설정하는데에 애매모호한 데 비해 GAPDH gene이 TBP gene보다 발현양상의 값이 높아 25-50사이의 부분으로 cut-off를 설정하기 쉬워 본 실험에서는 reference gene으로 GAPDH를 사용하기로 하였다(도 6)

No.	GAP	TBP	HER2	Expression (GAP-HER)	Expression (TBP-HER)
1	21.44	28.31	22.24	65.34	54.57
2	24.81	28.44	22.36	621.67	54.95
3	27.59	30.19	29.57	28.84	1.25
4	25.48	30.03	29.71	6.06	1.01
5	22.03	27.15	21.83	130.69	32.45
6	24.98	30.24	29.34	5.54	1.52
7	22.18	28.91	25.17	14.32	10.85
8	30.06	33.09	32.28	24.42	1.42
9	31.06	34.72	33.23	25.28	2.28
10	20.29	27.81	20.89	75.06	98.36
11	19.46	28.46	19.42	116.97	427.57
12	23.12	28.62	25.06	29.65	9.58
13	23.89	27.91	23.88	114.56	13.27
14	28.47	32.87	32.65	6.28	0.95
15	25.67	30.34	26.29	74.03	13.45
16	26.84	32.06	30.46	9.25	2.46
17	25.62	30.74	27.90	23.43	5.82
18	23.20	28.46	26.91	8.69	2.38
19	21.20	27.70	24.23	13.93	9.00
20	21.97	28.69	24.81	15.89	11.96
21	22.87	28.25	27.36	5.06	1.51
22	21.23	27.55	26.00	4.17	2.38
23	16.97	24.10	23.80	1	1
24	24.98	30.24	29.34	5.54	1.52
25	26.84	32.06	30.46	9.25	2.46
26	25.62	30.74	27.90	23.43	5.82
27	23.20	28.46	26.91	8.69	2.38
28	21.20	27.70	24.23	13.93	9.00
29	21.97	28.69	24.81	15.89	11.96
30	22.18	28.91	25.17	14.32	10.85
31	30.06	33.09	32.28	24.42	1.42
32	31.06	34.72	33.23	25.28	2.28
33	20.29	27.81	20.89	75.06	98.36
34	19.46	28.46	19.42	116.97	427.57
35	23.12	28.62	25.06	29.65	9.58
36	22.87	28.25	27.36	5.06	1.51
37	21.23	27.55	26.00	4.17	2.38
38	23.89	27.91	23.88	114.56	13.27
39	21.44	28.31	22.24	65.34	54.57
40	24.81	28.44	22.36	621.67	54.95
41	27.59	30.19	29.57	28.84	1.25
42	25.48	30.03	29.71	6.06	1.01
43	28.47	32.87	32.65	6.28	0.95
44	25.67	30.34	26.29	74.03	13.45
45	22.03	27.15	21.83	130.69	32.45

표 1은 real-time RT PCR에 의한 reference gene인 GAPDH와 TBP의 Ct값과 발현양상 비교 표이다.

또한 GAPDH를 기존의 방법인 dye를 FAM으로 GAPDH와 HER2를 각각 테스트를 진행하여 Ct값을 비교하는 것과 GAPDH의 dye Cy5로 변경하여 multiplex PCR을 하여 각각의 결과를 유방암 cell line인 SK-BR3를 10⁵ 부터 1 세포 까지 희석하여 민감도를 비교하여 HER2는 FAM으로 GAPDH는 Cy5로 multiplex PCR을 한 결과에서는 10⁵에서 1세포까지의 Ct값인 17.14에서 34.20(그림 7-B)로 나왔으며 dye가 FAM인 GAPDH와 HER2를 PCR한 결과에서는 그 민감도가 18.06에서 34.33으로 나와 각각 PCR하였을때의 결과보다 multiplex PCR을 한 경우에서 민감도가 높아졌음을 확인 할 수 있었다(도7-A)) .

Cell line 별 HER2 발현양상

각각의 유방암세포에 해당되는 Cell line 세 종류 (MCF7, SKBR3, MDA-MB 231)와 사람의 단구세포 cell line (THP-1)을 음성 대조군으로 이용하여 HER2의 발현여부를 확인한 결과 MCF7과 SK-BR3에서 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다(도 8)

유방암 환자에서의 IHC 와 FISH 그리고 HER2 의 발현 양상비교

신촌 세브란스 병원에서 제공받은 ICH 결과가 있는 조직 샘플 55를 이용하여 두 가지의 방법으로 HER2의 발현 여부를 확인해 보았다. 기존 논문에서 사용된 HER2 유전자의 발현의 cut off는 10으로 설정하였으며 새로 제작된 HER2 유전자의 발현의 cut off를 25아래는 음성으로 50이상은 양성으로 설정하였으며(도 9) 그 결과를 비교 한 결과 새로 제작된 HER2 유전자의 발현이 43/55 (78%)로 기존 논문의 HER2 유전자의 발현 30/55 (54.5%)보다 높게 나타남을 확인할 수 있었다(표 2).

표 2는 IHC 결과별에 따른 HER2 발현양상 표이다.

또한 FISH 결과가 있는 조직샘플 31을 이용하여 위와 동일한 방법으로 HER2의 발현 여부를 확인해 보았다. 그 결과 새로 제작된 HER2 유전자의 발현이 22/31 (71%)로 기존 논문의 HER2 유전자의 발현 21/31 (67.7%)보다 높게 나타남을 확인 할 수 있었다(표 3).

표 3은 FISH 결과별에 따른 HER2 발현양상 표이다.

FISH와 IHC 결과가 모두 있는 조직샘플 31을 이용하여 위와 동일한 방법으로 HER2의 발현 여부를 확인해 보았다. 그 결과 FISH-IHC 양성인 15 샘플에서 새로 제작된 HER2 유전자의 발현이 모두 양성으로 나타났으나 기존 논문의 HER2 유전자 발현양상은 12/15 (80%)로 나타났으며 FISH 결과가 음성인 경우 기존논문의 HER2 유전자 발현에서 9샘플이 음성으로 새로 제작된 HER2 유전자 발현에서 7샘플이 음성으로 확인 되었으나 IHC의 결과는 2+로 이들 샘플에 대한 재확인이 필요할 것으로 보이며 전체 결과를 비교해 볼 때 새로 제작된 HER2 유전자의 발현이 22/31 (71%)로 기존 논문의 HER2 유전자의 발현 21/31 (67.7%)보다 높게 나타남을 확인할 수 있었다(표 4).

표 4는 FISH와 IHC 결과별에 따른 HER2 발현양상 표이다.

본 발명은 간편하고 정량적인 결과를 도출할 수 있는 실시간 RT-PCR법에 기초하여 HER 2 mRNA를 이용한 유전자 증폭 방법을 이용하기 때문에 단백질을 검출하는 방법보다 눈에 보이지 않은 정도의 양도 검출할 수 있고, 항원 항체 반응을 사용하지 않기 때문에 값싼 검사 방법을 제공할 수 있다. 또 기존에 알려진 서열에 비하여 더 민감도가 높다는 것을 확인할 수 있었고, 또한 전기 영동을 이용하여 밴드를 확인하는 단계가 없기 때문에 더 손쉽게 결과를 확인할 수 있다.

도 1은 기존 논문상에 나와 있는 primer와 probe 위치와 새로 제작된 primer와 probe 위치,
도 2는 새로 제작된 primer와 probe위치와 기존 논문상에 사용된 primer와 probe위치이며, A는 GAPDH와 HER2 gene을 이용하여 나타난 발현양상의 분포도이며, B는 TBP와 HER2 gene을 이용하여 나타난 발현양상의 분포도이고,
도 3은 SK-BR3 세포주를 이용한 HER2 새로 제작된 부위의 민감도를 확인한 그림이고,
도 4는 SK-BR3 세포주를 이용한 HER2 reference gene 부위의 민감도를 확인한 그림이고,
도 5는 SK-BR3 세포주를 이용한 HER2 새로 제작된 부위의 민감도를 확인한 그림이고,
도 6은 GAPDH와 TBP gene을 이용한 HER2 유전자의 발현양상의 비교를 나타낸 그림이고,
도 7은 SK-BR3 세포주를 이용한 GAPDH의 Dye 변경에 의한 민감도를 확인한 그림이고,
도 8은 세포주를 이용한 HER2 발현양상을 확인한 그림이고,
도 9는 IHC와 FISH, 그리고 real-time RT-PCR에 의한 HER2 유전자의 발현양상을 비교한 그림으로, 각각의 그림에서 I→IHC 0/1+, 2+, 3+ 의 구분을 표시한 것이며, F→FISH 0(음성)/ 1(양성)을 표시한 것이며, Reference는 HER2관련 reference primer&probe를 이용하여 각각 테스트를 진행 후 발현양을 나타낸 값이며, Cy5는 GAPDH의 dye를 Cy5로 변경하여 multiplex PCR을 진행 후 발현양을 나타낸 값이며, Mix는 새로 제작된 HER2관련 primer&probe(probe를 2부위 사용)와 GAPDH의 dye를 Cy5로 multiplex PCR을 진행 후 발현양을 나타낸 값의 분포에 대해 비교하여 확인하기 위하여 prism graph를 이용하여 나타낸 그림이다. 그림에서 보면 1(Reference)번과 2(Cy5)번의 경우보다는 3번(mix)의 경우가 cut-off 50선에서 뚜렷하게 음성과 양성으로 나눠지는 것을 확인할 수 있다

이하, 본 발명의 실시예에 대하여 첨부된 도면을 참조하면서 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 재료

2010년 9월부터 2011년 5월까지 신촌 세브란스병원에서 유방암 수술을 받은 55명의 환자의 수술 시 적출한 생검 조직을 이용하였다. 환자에서 HER2의 발현여부는 면역조직화학 염색법과 형광동소교잡법을 수행하여 확인하였다. 또한 HER2의 발현 여부를 확인하기 위하여 유방암 Cell line인 SK-BR3, MCF7, MDA-MB 231을 사용하여 HER2의 발현 여부를 확인하였고, 대조 군으로 사람의 단구세포 Cell line인 THP-1을 사용하였다.

실시예 2: 면역조직화학염색법

파라핀 블록을 4 ㎛ 두께로 박절하여 슬라이드에 부착시키고 충분히 건조시킨 후 BenchMark ST (Ventana medical system, USA) 자동면역염색기기를 이용하여 면역조직화학염색을 시행하였다. 일차항체는 polyclonal rabbit anti-human c-erbB-2 oncoprotein (A0485, DakoCytomation, Glostrup, Denmark)을 1:1,000으로 희석하여 이용하였다. 이러한 방법으로 슬라이드를 염색한 후 암세포의 세포막에 염색되는 정도에 따라 4가지 등급, 즉 0, 1+, 2+, 3+으로 나누어 판정하였다.

실시예3 : 형광동소교잡법

파라핀으로 고정되어 있는 조직 블록을 microtome을 이용하여 4 ㎛ 두께로 박절하여 슬라이드에 부착시킨 후, 탈파라핀화 및 함수 과정을 거쳐 상용화된 HER2 DNA probe kit (Vysis Inc, Downers Grove, IL, USA)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 실험을 진행하였다. HER2 발현 여부는 유전자 발현 정도에 따라서 Amplification Index가 2.0 이상일 경우 양성으로 하여 진행하였다.

실시예 4: 분리된 조직에서 Total RNA 분리

환자에서 분리한 조직은 Trizol(Invitrogen)을 첨가한 후 BioMasher-II (Optima)를 이용하여 3,000rpm에서 조직을 균질화 시킨 후 제조업체의 프로토콜에 따라 Total RNA를 분리 하였다.

Cell line의 경우 각각의 Cell line의 세포 수를 1 x 10⁶으로 맞춘 후 Trizol을 이용하여 Total RNA를 분리 하였다. 분리한 Total RNA는 NanoQuant system (TECAN)을 이용하여 정량 하였다.

실시예 5: 분리된 Total RNA 로부터 cDNA 제작 및 Real - time PCR 수행

1) cDNA 합성

분리된 total RNA 2 ug, random primer (Invitrogen) 0.2 5 ug, dNTP(Cosmo genetech) 250 uM, Tris-HCl(pH 8.3) 50 mM, KCl 75 mM, MgCl₂ 3 mM, DTT 8 mM 와 MMLV 역전사 중합효소 200 units (Invitrogen)을 첨가하고 최종부피를 20 ul가 되도록 DEPC treated DW를 넣고 잘 섞은 후 합성 반응액을 thermocycler (ABI)에서 25℃에서 10 분, 37℃에서 50 분, 70℃에서 15 분간 반응시켜 cDNA를 합성한다.

2) Real-time PCR 수행

Real-time PCR의 반응물의 조성은 25 mM TAPS (pH 9.3 at 25°C), 50 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM 2-mercaptoethanol, 200 μM each dNTP, 1 unit Taq polymerase (TAKARA)와 Forward primer와 Reverse primer를 각각 10 pmole을 넣어주고, probe 또한 10 pmole을 넣어 주고, 합성된 cDNA를 2ul를 넣고 최종 부피를 20ul가 되게 수행한다. 각각의 프라이머와 프로브의 염기서열은 다음 표 5와 같다.

		5' modificaion	5'-sequence-3'	3' modificaion
Primer	GAPDH -F		CAT CAC CAT CTT CCA GGA GCG AGA TCC(서열번호 1)
	GAPDH -R		CTC CAT GGT GGT GAA GAC GCC AGT G(서열번호 2)
	HER2-F	reference	GGC TCT CAC ACT GAT AGA CAC C(서열번호 3)
	HER2-R	reference	TCC CCA GCA GCG GGA GCC CTT AC(서열번호 4)
	HER2-F1	new	AAG CAT ACG TGA TGG CTG GTG T (서열번호 5)
	HER2-R1	new	TCT AAG AGG CAG CCA TAG GGC ATA(서열번호 6)
	TBP-F		CACAGTGAATCTTGGTTGTAAACTTGA(서열번호 7)
	TBP-R		AAACCGCTTGGGATTATATTC G(서열번호 8)
Probe	GAPDH -cy5	Cy5	TCC ACG ACG TAC TCA GCG CCA GCA(서열번호 9)	BHQ-2
	HER2-P	FAM (reference)	TCT CGG GCC TGC CAC CCC TG(서열번호 10)	BHQ-1
	HER2-P1	FAM (new)	ATA TGT CTC CCG CCT TCT GGG CAT CT(서열번호 11)	BHQ-1
	HER2-P2	FAM(new)	CAT CCA CGG TGC AGC TGG TGA CAC A(서열번호 12)	BHQ-1
	TBP-P	FAM	AAGACCAATGCACTTCGTGCCCGA(서열번호 13)	BHQ-1

한편, 도 2의 F,P-1,P-2, R은 본 발명의 서열이고, 황색과 녹색으로 표시된 부분은 기존에 논문에서 사용한 염기서열 부위이다.

PCR 반응은 CFX96 (BIO-RAD) 이용하여 변성 온도 94℃에서 5분 동안 1회 수행하고, 변성 온도 95℃에서 30초, 어닐링 온도 55℃에서 20초인 사이클을 40회 반복하여 수행하였다. 또한 각각의 어닐링 과정 후 형광을 측정하는 과정을 추가 하여, 각 사이클 별로 증가되는 형광 값을 측정하였다.

실시예 6: 결과의 분석

각 실험의 결과는 CFX Manager software v1.6(BIO-RAD)을 이용하여 분석 하였다. 유방암 세포인 SK-BR3을 10⁵ 부터 1세포 까지 단계적으로 희석하여 상대적 정량 곡선을 그려서 Ct value를 이용하여 발현양을 비교 정량하여 발현율을 살펴 보았다. 이때 GAPDH와 TBP의 발현양을 기준으로 하여 각각의 HER2의 발현양을 비교 하였다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (9)

1. a) 암 의심환자의 혈액에서 얻은 세포로부터 전장 RNA를 분리하는 단계;
   b) 상기 분리된 전장 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계;
   c) 상기 합성된 cDNA를 인간 표피 증식인자 수용체 (HER) 2를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브, 및 글리세르알데히드 -3-인산 탈수소효소(GAPDH)를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머쌍 및 프로브를 이용하여 실시간-PCR을 수행하는 단계; 및
   d) 상기 증폭된 양을 정상인에 대해 발현된 양과 비교하는 단계;를 포함하며,
   상기 인간 표피 증식인자 수용체 (HER) 2를 증폭할 수 있는 프라이머쌍은 서열번호 5 및 6에 기재되고, 프로브는 서열번호 11 및 12에 기재된 염기서열을 가지는 프로브 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 유방암의 진단을 위한 정보제공방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 증폭된 양을 정상인에 대해 증폭된 양과 비교하는 단계는 표준 또는 컷오프 값에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 유방암의 진단을 위한 정보제공방법.
3. 제 1항 또는 2항에 있어서, 상기 방법은 발현 양 기준으로 50 이상은 양성, 20 아래는 음성이며 20~50은 컷오프값이고,
   여기서, 상기 발현 양은 ΔCt 값을 의미하고,
   상기 ΔCt 값 = 상기 환자 조직에서 상기 HER2의 Ct 값 - 환자 조직에서 상기 GAPDH 유전자의 Ct 값을 의미하고, 상기 Ct값은 PCR과정 중 증폭이 뚜렷하게 증가되기 시작한 주기(Cycle)의 수치를 나타내는 것을 특징으로 하는 유방암의 진단을 위한 정보제공방법.
4. 삭제
5. 제 1항에 있어서, 상기 GAPDH를 증폭할 수 있는 프라이머쌍은 서열번호 1 및 2에 기재되고, 프로브는 서열번호 9에 기재된 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 유방암의 진단을 위한 정보제공방법.
6. 인간 표피 증식인자 수용체 (HER) 2를 증폭할 수 있는 서열번호 5 및 6에 기재된 프라이머쌍과 서열번호 11 및 12에 기재된 염기서열을 가지는 프로브 중 하나 이상의 프로브;및
   GAPDH를 증폭할 수 있는 서열번호 1 및 2에 기재된 프라이머쌍과 서열번호 9에 기재된 프로브로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머쌍 및 프로브를 유효성분으로 포함하는 유방암 진단용 조성물.
7. 제 6항에 있어서, 상기 프로브의 5'말단은 형광물질로 표지된 것을 특징으로 하는 유방암 진단용 조성물.
8. 삭제
9. 제6항의 조성물을 포함하는 유방암 진단용 키트.

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