CN104024433B

CN104024433B - 基因丰度的测定方法

Info

Publication number: CN104024433B
Application number: CN201280053730.7A
Authority: CN
Inventors: 细见敏也; 伊集院萌子
Original assignee: Arkray Inc
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 2011-10-31
Filing date: 2012-10-29
Publication date: 2016-11-16
Anticipated expiration: 2032-10-29
Also published as: EP2774995A1; CN104024433A; JP5570657B2; KR101483576B1; WO2013065646A1; JPWO2013065646A1; KR20140088105A; EP2774995A4

Abstract

一种基因的丰度的测定方法，包括：在一个反应液中，使用第二引物和包括至少两种第一引物的第一引物组对编码至少两个基因的核酸进行核酸扩增，其中，所述至少两个基因在对象样品中的核酸中的基因丰度有可能不同，所述至少两种第一引物能够将单一的额外碱基序列导入扩增产物中且分别对应于所述至少两个基因，所述第二引物用于扩增包括所述单一的额外碱基序列的核酸，并获得包含所述单一的额外碱基序列且分别对应于所述至少两个基因的至少两种扩增产物；以及检测基于所述至少两种扩增产物的丰度的各自的信号，基于该信号测定出所述至少两个基因的丰度。

Description

基因丰度的测定方法

技术领域

本发明涉及基因丰度的测定方法。

背景技术

有些基因可能在一个基因组中存在多个。这样的基因的基因组中的丰度有可能被利用到基因诊断或有可能影响到药剂的效果，有时要求了解或测定基因在对象样品中的核酸(例如基因组等)中的丰度。作为这样的检测的一例，可以举出基因拷贝数的测定或基因数量增减的测定，还有拷贝数变异(CNV，copy number ofvariation)的诊断等。

作为测定基因丰度的方法有，例如FISH法(请参照例如Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.89，pp.5321-5325，June1992)或利用了竞争性结合DNA的CGH法(请参照例如JP特表平7-505053号公报)等的利用了荧光标记法的方法。在这些方法中，使荧光标记化合物直接与染色体反应之后，通过图像处理或荧光显微镜的观察可以确认基因丰度。但是，具有不能正确识别同一个基因在染色体上比较接近位置存在两处以上等情况、以及使用大量试剂以及操作复杂等缺点。

从这样的观点出发，开发了使用利用PCR(聚合酶链式反应，polymerase chainreaction)技术而测定基因丰度的实时PCR(请参照例如Clinical Chemistry pp.1546-1554(2009)、国际公开第WO2011/043220号小册子等)以及数字PCR(请参照例如JP特开2010-538614号公报)等，有效且准确地测定基因丰度的技术。

特别是，JP特开2010-538614号公报中公开的技术，是一种确定对象基因组中的目标多核苷酸序列的相对拷贝数的方法，在包含对象基因组DNA的试样中，对目标基因序列以及参照基因序列进行核酸扩增，并对通过数字PCR而进行扩增的各基因序列进行分析，根据包括目标基因序列的扩增多核苷酸分子数和包括参照基因序列的扩增多核苷酸分子数的比，来确定拷贝数的变动。

一方面，在一个试样中存在多个不同的基因的情况下，作为扩增目标核酸(作为目标的部分)的方法，JP特表2011-516069号公报中公开了包括两阶段的核酸扩增工序、以及其间拯救被用作目标的核酸扩增子的工序的方法。这种方法中，在最初的核酸扩增工序中，使用目标特定性引物而进行核酸的扩增，由此产生至少一个包括至少一个共通引物结合部位的核酸扩增子，将已获的核酸扩增子从已使用的目标特定引物中分离(拯救)之后，使用共通引物而进行扩增。

并且一般在PCR技术中，使用相互方向不同的一对引物对而分别对双链核酸进行核酸扩增，产生对象基因序列的扩增产物(有时被称为扩增子)。因此，已知在使用引物对的核酸扩增的过程中，双链扩增子在一个反应体系中指数性累积之后，随着产生的互补扩增子链的累积量的增加，扩增反应速度会降低，会停止任一个(平台期)。一旦达到平台期之后不会产生核酸扩增，因此扩增子量不会增加。为了不达到这样的平台期而继续增加扩增子的累积量，利用了对使用量设定一定的差的一对引物的“指数后的线型PCR(LATE-PCR)”(请参照如JP特表2005-512577号公报)。

并且，在检测融合基因的情况下，使用对于各变异体设定特异的引物的多重PCR的情况较多(请参照如JP特开2012-100628号公报)。在多重PCR中，必须准备多个引物且根据每个引物制作二聚物的可能性来进行优化。经由这种优化的过程再制作引物，必须进行关于可否通过实验而进行测定的检讨。并且，随着引物数的增加，这种优化的过程的难易度会提高，找出这种最佳的引物组为止需要大量的时间、劳力、以及成本。

发明内容

发明要解决的问题

但是，即使在使用目标基因序列和参照基因序列而进行核酸扩增、基于扩增产物的量比确定拷贝数的情况下，也为了分别扩增目标基因序列和参照基因序列，会使用不同的引物。如此使用不同的引物时，大多情况下的扩增效率不同。并且，在通过PCR技术进行核酸扩增的情况下，因存在前述的平台期，当PCR循环数增多时，扩增产物量将会与原来的丰度无关地变成一定量。因此，即使要使用PCR技术来测定基因的丰度，也无法正确反映出原来的基因丰度。并且，在使用多重PCR的情况下，必须准备大量的引物，因此在优化的过程中，会产生费用方面、劳力方面、和/或时间方面等的问题。

因此，本发明的目的是提供一种相比现有技术更准确且简便地测定出基因在对象样品中的核酸中的丰度的基因丰度测定方法。

用于解决问题的手段

本发明为如下：

[1]一种基因丰度的测定方法，包括：在一个反应液中，使用第二引物和包括至少两种第一引物的第一引物组对编码至少两个基因的核酸进行核酸扩增，其中，所述至少两个基因在对象样品中的核酸中的基因丰度有可能不同，所述至少两种第一引物能够将单一的额外碱基序列导入扩增产物中且分别对应于所述至少两个基因，所述第二引物用于扩增包括所述单一的额外碱基序列的核酸，并获得包含所述单一的额外碱基序列且分别对应于所述至少两个基因的至少两种扩增产物；以及检测基于所述至少两种扩增产物的丰度的各自的信号，基于该信号测定出所述至少两个基因的丰度。

[2]根据[1]所述的测定方法，其中，所述第一引物具有所述单一的额外碱基序列、以及能够与编码各个所述基因的核酸的扩增对象区域的碱基序列进行杂交的碱基序列。

[3]根据[1]或[2]所述的测定方法，其中，所述第二引物具有能够与所述单一的额外碱基序列或其互补的碱基序列进行杂交的碱基序列。

[4]根据[1]至[3]中任一项所述的测定方法，其中，所述单一的额外碱基序列由与所述至少两个基因的各扩增对象区域中的碱基序列非同源的碱基序列组成。

[5]根据[1]至[4]中任一项所述的测定方法，其中，所述第一引物组包括所述第一引物以及第三引物，所述第三引物用于扩增该第一引物进行杂交的碱基序列的互补链侧的碱基序列、并且不包含所述单一的额外碱基序列。

[6]根据[5]所述的测定方法，其中，所述反应液中的所述第三引物的丰度与所述反应液中的所述第一引物的丰度相比，以物质量基准为0.25倍量～4倍量。

[7]根据[1]至[6]中任一项所述的测定方法，其中，所述第二引物在所述反应液中的丰度与所述第一引物组中包含的各引物各自在所述反应液中的丰度相比，以物质量基准为1倍量～400倍量。

[8]根据[1]至[7]中任一项所述的测定方法，其中，所述反应液还包括分别识别所述至少两种扩增产物的至少两种检测用探针。

[9]根据[1]至[8]中任一项所述的测定方法，其中，所述第一引物包含选自相对扩增对象区域的碱基序列错配的碱基以及简并的碱基组成的组的至少一者。

[10]根据[1]至[9]中任一项所述的测定方法，其中，所述第二引物的Tm值高于所述第一引物的各Tm值。

[11]根据[1]至[10]中任一项所述的测定方法，其中，所述第二引物还包括不同于所述单一的额外碱基序列、以及其互补碱基序列的额外序列。

[12]根据[1]至[11]中任一项所述的测定方法，其中，所述至少两个基因的至少一个是预先判明在对象样品中的核酸中的丰度的参照基因，至少一个是作为在对象样品中的核酸中的丰度的测定对象的目标基因。

[13]根据[12]所述的测定方法，包括：对来自所述参照基因的扩增产物的检测信号和来自所述目标基因的扩增产物的检测信号进行比较，来确定所述目标基因在对象样品中的核酸中的丰度。

[14]根据[1]至[11]中任一项所述的测定方法，其中，所述至少两个基因的至少一个是融合基因的融合点的上游的5’侧基因区域，至少一个是融合基因的融合点的下游的3’侧基因区域。

[15]根据[14]所述的测定方法，包括：对来自所述5’侧基因区域的扩增产物的检测信号和来自所述3’侧基因区域的扩增产物的检测信号进行比较，来检测样品中的所述融合基因的存在。

[16]根据[1]至[15]中任一项所述的测定方法，其中，所述至少两个基因的丰度通过该基因的各个对应的至少两个检测信号的Tm分析而测定。

[17]根据[1]至[16]中任一项所述的测定方法，其中，通过由同一波长取得的吸光度或荧光值，来获得用于测定所述至少两种基因的丰度的所述信号。

[18]根据[16]或[17]所述的测定方法，其中，对Tm分析的结果进行面积分析，并确定在对象样品中的核酸中的丰度。

[19]一种用于[1]至[4]以及[7]至[18]中任一项所述的测定方法的基因测定试剂盒，包括：第一引物组，所述第一引物组包括能够将单一的额外碱基序列导入到扩增产物中且对应于所述至少两个基因的至少两种的第一引物；以及第二引物，所述第二引物用于扩增包括所述单一的额外碱基序列的核酸。

[20]一种用于[5]至[18]中任一项所述的基因测定试剂盒，包括：第一引物组，所述第一引物组包括能够将单一的额外碱基序列导入到扩增产物且各自对应于所述至少两个基因的至少两种的第一引物；第二引物，所述第二引物用于扩增包括所述单一的额外碱基序列的核酸；以及第三引物，所述第三引物用于扩增所述第一引物进行杂交的碱基序列的互补链侧的碱基序列且不包括所述单一的额外碱基序列。

[21]根据[19]或[20]所述的基因测定试剂盒，还包括至少两个检测用探针，所述两个检测用探针具有能够分别与所述至少两个基因的核酸扩增区域进行杂交的碱基序列且具备标记。

[22]根据[21]所述的基因测定试剂盒，其中，所述标记为荧光标记。

[23]一种能够应用[1]至[18]中任一项所述的基因的丰度的测定方法的基因测定装置，包括：检测部，所述检测部检测基于包括通过所述第一引物而导入的所述单一的额外碱基序列且对应于通过所述第二引物而进行核酸扩增的所述至少两个基因的扩增产物的丰度的至少两个信号；以及运算部，所述运算部对通过所述检测部而检测的所述至少两个检测信号进行对比，运算出所述至少两个基因的丰度。

[24]一种实施[1]至[18]中任一项所述的基因丰度的测定方法的基因测定系统，包括：检测装置，所述检测装置基于包括通过所述第一引物而导入的所述单一的额外碱基序列且对应于通过所述第二引物而进行核酸扩增的所述至少两个基因的扩增产物的丰度的至少两个信号；以及运算装置，所述运算装置对通过所述检测部而检测的所述至少两个检测信号进行对比，运算出所述至少两个基因的丰度。

[25]一种使用[1]至[18]中任一项所述的测定方法进行的基因诊断方法。

发明效果

根据本发明，可以提供相比现有技术更正确且简便地测定出基因在对象样品中的核酸中的丰度的测定方法。

附图说明

图1的(A)是核酸混合物的解链曲线的一例，(B)是微分解链曲线的一例；

图2A是示出本发明的实施例1涉及的Tm分析的结果的曲线图；

图2B是示出本发明的比较例1涉及的Tm分析的结果的曲线图；

图2C是示出本发明的比较例2涉及的Tm分析的结果的曲线图；

图2D是示出本发明的比较例3涉及的Tm分析的结果的曲线图；

图3是示出本发明的实施例2涉及的Tm分析的结果的曲线图；

图4是示出本发明的实施例3涉及的Tm分析的结果的曲线图；

图5是示出本发明的实施例4涉及的Tm分析的结果的曲线图；

图6是示出本发明的实施例5涉及的Tm分析的结果的曲线图；

图7是示出本发明的实施例6～8涉及的Tm分析的结果的曲线图；

图8是示出本发明的实施例9涉及的Tm分析的结果的曲线图。

具体实施方式

本发明涉及基因的丰度的测定方法，包括：使用第二引物和包括至少两种第一引物的第一引物组对编码至少两个基因的核酸进行核酸扩增，其中，所述至少两个基因在对象样品中的核酸中的基因丰度有可能不同，所述至少两种第一引物能够将单一的额外碱基序列导入扩增产物中且分别对应于所述至少两个基因，所述第二引物用于扩增包括所述单一的额外碱基序列的核酸，并获得包含所述单一的额外碱基序列且分别对应于所述至少两个基因的至少两种扩增产物；以及检测基于所述至少两种扩增产物的丰度的各自的信号，基于该信号测定出所述至少两个基因的丰度。

另外，本说明书中的“基因”中还包含示出基因的部分区域的“基因区域”。并且，“基因”只要通过碱基序列编码即可，不仅包含表达特定功能的，还包含不表达特定功能的基因。

本测定方法中，在使第二引物和包括指定第一引物的第一引物组存在于一个反应液中，并对所述至少两个基因(以下称为“测定对象基因”)的各自的核酸进行核酸扩增，因此通过使用指定的第一引物而进行的核酸扩增，在各个测定对象基因对应的多种扩增产物中导入单一的额外碱基序列。因此，即使在反应液中存在多种测定对象基因，对应的扩增产物中也被导入单一的、即共通的额外碱基序列。被导入这种单一的额外碱基序列且对应于测定对象基因的多种核酸(或扩增产物)均包括一个共通的额外碱基序列，因此可以通过一种的第二引物而一律进行核酸扩增。由此，即使反应液中存在的多个基因的丰度不同，来自通过同一第二引物的核酸扩增而获得的各个基因的扩增产物的丰度也不同于使用不同引物的核酸扩增，反映出各基因的丰度。其结果为，相比现有技术更正确且简便地测定出对象样品中的核酸中至少两种基因的丰度。

本发明中，关于被用作测定对象的试样中的试样核酸、检测用探针、或引物的各个序列，只要不特别指出，基于这些相互互补关系而记载的事项还应用到各自的序列和相对于各序列互补的序列中。将本发明的事项应用到相对于各序列互补的该序列中时，关于该互补序列所识别的序列，在对本领域的技术人员而言属于技术常识的范围内，会将全部说明书替换为对应的本说明书中所述的序列的互补序列。

本发明中，“Tm值”是指双链核酸解离的温度(解离温度：Tm)，通常定义为260nm处的吸光度达到吸光度全上升量的50％时的温度。即，加热包括双链核酸例如双链DNA的溶液时，260nm处的吸光度上升。这是因为双链DNA中的双链间的氢键由于加热而解开，解离成单链DNA(DNA的解链)。而且，所有的双链DNA解离成单链DNA时，其吸光度是示出加热开始时的吸光度(仅为双链DNA的吸光度)的约1.5倍，通过这些可以判断出解链已完成。Tm值是基于这些现象而设定的。只要不特别指出，本发明的Tm值是指50％的碱基形成双链、剩下的50％解链成单链时的温度。

本发明中的“模板核酸”或“模板”是指进行核酸扩增时将引物作为模板而进行退火处理的碱基序列。

本发明中的“工序”的术语不仅包括独立的工序，而且包括即使在不能明确区分于其他工序的情况下，只要能达到本工序的所期目的就被包括在本术语中。

并且，本发明中使用“～”而示出的数值范围是表示包括“～”前后所述的数值各自作为最小值以及最大值的范围。

并且，本说明书中，在组成物中存在多个对应于各成分的物质的情况下，只要不特别指出，组成物的各成分的量就是指组成物中存在的该多个物质的合计量。

以下说明本发明的内容。

<基因丰度的测定方法>

本发明涉及的基因丰度的测定方法包括：在一个反应液中，使用第二引物和包括至少两种第一引物的第一引物组对编码至少两个基因的核酸进行核酸扩增，其中，所述至少两个基因在对象样品中的核酸中的基因丰度有可能不同，所述至少两种第一引物能够将单一的额外碱基序列导入扩增产物中且分别对应于所述至少两个基因，所述第二引物用于扩增包括所述单一的额外碱基序列的核酸，并获得包含所述单一的额外碱基序列且分别对应于所述至少两个基因的至少两种扩增产物(以下称为“核酸扩增工序”)；以及检测基于所述至少两种的扩增产物的丰度的信号，基于该信号测定出所述至少两个基因的丰度(以下称为“丰度测定工序”)。

核酸扩增工序包括：在一个反应液中，使用第二引物和包括至少两种第一引物的第一引物组对编码至少两个基因的核酸进行核酸扩增，其中，所述至少两个基因在对象样品中的核酸中的基因丰度有可能不同，所述至少两种第一引物能够将单一的额外碱基序列导入扩增产物中且分别对应于所述至少两个基因，所述第二引物用于扩增包括所述单一的额外碱基序列的核酸，并获得包含所述单一的额外碱基序列且分别对应于所述至少两个基因的至少两种扩增产物。

所述反应液中包括至少两种基因、即测定对象基因。

所述测定对象基因在对象样品中的核酸中的基因丰度可相互不同，通常包括对象样品中的核酸中的基因丰度不同的基因，但也可以包括同一个基因。对反应液中的所述测定对象基因进行编码的碱基序列相当于进行后述的核酸扩增时的被用作模板的核酸。

对于可被用作所述反应液中的核酸的供给源的试样，并没有特别的限制。例如可以举出血液、口腔粘膜悬浮液、指甲以及毛发等体细胞、生殖细胞、乳汁、腹水液、石蜡包埋组织、胃液、胃洗净液、腹膜液、羊水、以及细胞培养等任意来自或有可能来自生物源的试样。关于被用作模板的核酸，可以是从该来源获得的状态下直接使用，也可以是进行前处理而改变该样品特性之后使用。

例如，将全血用作试样的情况下，可以从全血中分离基因组DNA而调制测定对象基因的核酸。可以通过现有公知方法从全血中分离基因组DNA。可以使用例如市售的基因组DNA分离试剂盒(商品名为GFX Genomic Blood DNA Purification kit；通用电气医疗集团生命科学公司制)等。

反应液中的核酸可以是单链，也可以是双链。作为反应液中的核酸序列，例如可以是DNA，也可以是总RNA、mRNA等的RNA。并且，在本发明中，由于使后述的多种引物存在于反应液中而进行核酸扩增，因此在核酸扩增工序后的反应液中也存在通过核酸扩增而产生的扩增产物。因此，作为本发明的反应液中的核酸，还包括这些扩增产物。

反应液中的所述测定对象基因只要为至少两种基因，则有可能被用作本发明中的丰度的测定对象。优选地，所述测定对象基因的至少一个为预先判明对象样品中的核酸中的丰度的参照基因，至少一个为对象样品中的核酸的被用作测定对象的目标基因。如此，通过将测定对象基因的至少一个作为对象样品中的核酸中的丰度已被判明的参照基因，能将参照基因的丰度作为参照(指标)而使用，可以容易地测定出目标基因的对象样品中的核酸中的丰度。

在这里，“对象样品中的核酸中的丰度”是指指定大小的基因的拷贝数、1拷贝的整个基因所占的对象样品中核酸的大小、疾病相关的基因的增加或减少、相当于蛋白质翻译时的功能域的基因内特定区域、串联重复或微卫星等。在本发明涉及的测定方法中，例如从所述测定方法的灵敏度以及简便性等的关联方面考虑，优选将基因的拷贝数作为被用作测定对象的丰度。

作为能够用作所述参照基因的基因，只要是预先判明个体间具有同等丰度的基因或丰度随时间无变化而比较稳定的丰度的基因即可，不需要特别限制，可以举出RNaseP、sod2、COL8A1、gamma-actin等。并且，作为所述参照基因和所述目标基因的组合，没有特别限制，可以在基因组地图上在同一个染色体上，还可以是位于其他染色体上的在基因组地图上远离的位置，可以适当选择，对于所述目标基因和所述参照基因的选择并没有特别的限制。

作为能够用作所述目标基因的基因，根据被测定的丰度的利用目的而不同。例如可以举出示出多态性的基因以及疾病引起的丰度增加或减少的基因，疾病引起的、碱基序列中的碱基缺失的基因，以及通过样品而表达水平改变的基因等。

并且，所述参照基因和目标基因的组合可以根据目标基因的性质而适当选择。例如，在检测个体间的拷贝数多态性的情况下，可举出将预先判明个体间为同等丰度的基因作为参照基因、将显示多态性的基因作为目标基因；在检测作为疾病治疗药的目标的基因的丰度的情况下，将丰度随时间无变化且具有比较稳定丰度的基因用作参照基因，将疾病引起的、丰度增加或减少或碱基缺失的基因作为目标基因；在检测RNA表达水平的情况下，例如可以举出将管家基因作为参照基因、将由于样品而表达水平变化的基因作为目标基因。

并且，作为其他的实施例，优选所述测定对象基因的至少一个是融合基因的融合点上游的5’侧基因区域(以下也称为“5’侧基因区域”)，至少一个是融合基因的融合点下游的3’侧基因区域(以下也称为“3’侧基因区域”)。如此，通过对5’侧基因区域的丰度和3’侧基因区域的丰度进行比较，可以容易地检测融合基因变异的有无等。

所述融合基因是只要以某基因的一部分和其他基因的一部分融合并作为一个基因而存在即可，不需要特别限制。具体可以举出ALK融合基因，BCR-ABL融合基因，AML1-MTG8融合基因，RET融合基因，以及ROS1融合基因等。

以下，以ALK融合基因为例，进行具体的说明。

ALK基因(NCBI登记号NM004304.4)进行对ALK(anaplastic lymphoma kinase)受体酪氨酸激酶的编码。

作为ALK融合基因例如已知J.Clon.Oncol.2009Sep10；27(26)：4232-5中所记载的EML4-ALK融合基因以及KIF5B、KLC1、TFG等各种基因的融合基因。

在这里，对于本发明的测定方法，仅关注了组成融合基因的任何一方的基因，只要测定并比较该基因的融合点上游的5’侧基因区域的丰度以及下游的3’侧基因区域的丰度即可。

融合点意味着不同的两个基因融合时的边界部分。例如ALK基因中第4125位碱基(相当于序列号23中的第1760个碱基)成为融合点。

另外，测定基因丰度的5’侧基因区域以及3’侧基因区域只要是融合点的上游以及下游的区域即可，并没有特别的限制。测定基因丰度的5’侧基因区域以及3’侧基因区域离融合点有一个碱基以上时，可以测定出基因的丰度，但优选充分远离的区域，例如优选10个碱基以上远离，更优选约50个碱基以上。

并且，核酸上有可能存在多个随着融合基因变异而产生的融合点。因此，通过对应于被用作测定对象的融合基因变异的种类而适当设定从融合点到5’侧基因区域以及3’侧基因区域的距离，就能自由地变更可以检测到的融合基因变异的种类，能检测出更多的变异体(Variant)。

另外，从融合点到基因区域的距离(碱基数)以在与成为测定对象基因的5’侧基因区域以及3’侧基因区域进行杂交的引物中、与接近融合点的距离杂交的引物的5’末端作为基础而计算出。

另外，在本说明书中，融合基因并不限于ALK融合基因。例如只要在GenBank等的数据库中登录的碱基序列即可，可以是任何基因，与ALK融合基因同样，可以应用到本发明涉及的方法中。

所述第一引物组包括第一引物，其是一种对测定对象基因中的扩增对象区域的双链核酸分别进行扩增的引物组。所述第一引物可以将单一的额外碱基序列导入到扩增产物中且各自对应于所述至少两个基因的引物。

在这里，所述扩增对象区域相当于对测定对象基因进行编码的碱基序列一部分的区域，优选40个碱基长～5000个碱基长，更优选50个碱基长～1000个碱基长，进一步优选60个碱基长～200个碱基长。通过将所述扩增对象区域设为这种范围内的长度，有利于例如缩短所述核酸扩增工序中的反应时间的、缓和扩增阻碍影响、使多个核酸扩增可靠进行，以及测定精度的提高等。

在这里，“对应于所述至少两个基因的各个”是指以能够将在测定对象基因中有特征的碱基序列作为扩增对象区域而可以进行扩增。因此，在所述核酸扩增工序中，使用了与测定对象基因种类对应的数量的第一引物。

所述第一引物需要能够将单一的额外碱基序列导入扩增产物中。在这里，“能够将单一的额外碱基序列导入扩增产物中”意味着不仅要产生包括由指定碱基序列组成的所述单一的额外碱基序列本身的扩增产物，还要产生包括与该指定碱基序列互补的碱基序列的扩增产物这两方面的意思。

为了能够在扩增产物中导入单一的额外碱基序列，所述第一引物可以包括单一的额外碱基序列，以及能够以编码所述测定对象基因的核酸的碱基序列的一部分为模板进行核酸扩增的碱基序列，它们之间可以包括连接序列。作为能够以编码所述测定对象基因的核酸的碱基序列的一部分为模板进行核酸扩增的碱基序列，例如可以是能够与所述扩增对象区域的碱基序列杂交的碱基序列。例如，从操作的简便性、测定方法的测定敏感度等观点出发，第一引物优选所述单一的额外碱基序列、以及可以与所述测定对象基因的扩增对象区域的碱基序列杂交的碱基序列的组合。

在这里，“单一的额外碱基序列”意味着对于一个用于测定的、有可能存在于一个反应液中的所有扩增产物，有可能是共通并被导入的一种类型(单一的)额外碱基序列，还包含其互补序列。第一引物具有的“单一的额外碱基序列”可以是任何一个所述单一的额外碱基序列以及其互补的碱基序列。以下，没有特别指出的情况下，将所述扩增产物中导入的“单一的额外碱基序列”以及第一引物具有的“单一的额外碱基序列”统称为“单一的额外碱基序列”。

作为这样的单一的额外碱基序列的构造(碱基序列以及长度)，没有特别限制，可以选择任意的序列。由于碱基序列是在所有扩增产物内共通并被导入，因此优选由不同于至少两个基因的各扩增对象区域中碱基序列的碱基序列组成的序列，更优选由不同于包括所述扩增对象区域以及该扩增对象区域相邻的区域(如，1000个碱基长以内的范围)的区域的碱基序列组成的序列，进一步优选由反应液中存在的基因的碱基序列中不存在的碱基序列组成的序列。如此，有利于后述的第二引物引起的核酸扩增的精度的提高。在这里，“不同于”意味着具有例如扩增对象区域50％以下，优选具有25％以下的同源性。

在这里，“能够与所述扩增对象区域的碱基序列进行杂交的碱基序列”意味着在通常的核酸扩增条件下，将对含有被用作扩增对象的碱基序列的单链核酸(模板核酸)进行退火处理，具有可与模板核酸之间形成双链核酸的序列。

关于可以与所述第一引物中的所述扩增对象区域的核酸序列进行杂交的碱基序列，并没有特别的限制，只要能够对扩增对象区域中的模板核酸的碱基序列进行扩增即可，对本领域的技术人员来说，可以基于被用作对象的基因的碱基序列而进行适当的设计。

关于所述第一引物的“能够进行杂交的碱基序列”中包括对于模板核酸的碱基序列完全互补的的碱基序列，并且，在后述的核酸扩增条件下，对于完全互补的碱基序列，在不明显损伤单链核酸亲和性的程度下，还可以包括缺失、取代、或附加一个或多个碱基的碱基序列。在插入、缺失、或取代碱基的情况下，对于其插入、缺失、或取代的位置并没有特别的限制。作为插入、缺失、或取代的碱基数，可以举出一个碱基或两个碱基以上，虽然根据第一引物全体的长度而不同，但是例如可以举出1个碱基～10个碱基，优选1个碱基～5个碱基。

并且，在所述第一引物中优先通过后述的第二引物进行的核酸扩增，因此可以包括不同于前述的单一的额外碱基序列的种种额外碱基或指定长度的额外碱基序列(以下统称为“调整用额外碱基序列”)。这些调整用额外碱基序列可以是单独使用后述的碱基序列，或可以是从后述中适当选择的两个以上的组合。

作为这样的调整用额外碱基序列，优选包括相对所述扩增对象区域的碱基序列错配碱基以及简并碱基组成的组中选择的至少一者。关于所述错配碱基以及简并碱基的种类以及碱基数，并没有特别的限制，但可以通过预测的Tm值的调整、对扩增效率的影响、同一个引物分子数的调整而设定。

并且，作为其他调整用额外碱基，可以导入由尿嘧啶碱基、AP位点、以及RNA碱基组成的组中选择的分解诱导碱基。在导入这些分解诱导碱基的情况下，获得第一引物引起的扩增产物之后，通过分解这些分解诱导碱基，可获得能降低第一引物相对于扩增产物的Tm值、并且能够优先进行第二引物引起的核酸扩增的优点。

所述第一引物的长度以及Tm值通常为12mer～60mer以及40℃～85℃，优选16mer～50mer以及50℃～80℃，但并不限于此。

并且，所述第一引物中的所述单一的额外碱基序列以及能够与所述基因的扩增对象区域的基因序列进行杂交的碱基序列可以具有相同长度，也可以具有不同长度。

并且，所述第一引物中的所述单一的额外碱基序列的位置可以是任何位置。优选为，所述单一的额外碱基序列被配置在所述第一引物的5’末端。通过将所述单一的额外碱基序列配置在与所述基因的扩增对象区域杂交的碱基序列的5’末端侧，例如不妨碍第一引物最初扩增测定对象基因时的反应。

第二引物是用于扩增包括通过所述第一引物组而扩增的所述单一的额外碱基序列的核酸。如此，可以对包括所述单一的额外碱基序列的扩增产物进一步进行核酸扩增，并在反应液中累积，所述扩增产物是使用包括所述第一引物的第一引物组而获得的。

所述第二引物可以具有能够与所述单一的额外碱基序列或其互补的碱基序列进行杂交的碱基序列。为了防止第一引物的所述单一的额外碱基序列以及第二引物的杂交等，优选具有可以与所述第一引物的一部分中包括的所述单一的额外碱基序列的互补碱基序列进行杂交的碱基序列，即与所述第一引物的一部分中包括的所述单一的额外碱基序列同源的碱基序列。如此，能够将包括所述单一的额外碱基序列的扩增产物有效率且有效果地累积在反应液中。

所述第二引物在核酸扩增条件下，只要可以与所述单一的额外碱基序列或其互补的碱基序列之间形成双链核酸，还可以是缺失、取代、或添加一个或多个碱基的引物。在碱基被插入、缺失、或取代的情况下，对于其插入、缺失、或取代的位置并没有特别的限制。作为插入、缺失、或取代的碱基数，可以举出一个碱基或两个碱基以上，根据第二引物全体长度而不同，但是例如可以举出1个碱基～10个碱基，优选1个碱基～5个碱基。

优选所述第二引物包括相对所述第一引物的一部分中所包含的所述单一的额外碱基序列同源的序列。如此，例如可以提高测定精度。在这里，所述第二引物中，相对所述单一的额外碱基序列“同源”意味着相对所述单一的额外碱基序列具有80％以上的同源性。相对所述第二引物中的所述单一的额外碱基序列同源的序列，优选相对所述单一的额外碱基序列具有90％以上，最优选100％的同源性。

在所述第二引物中，为了能使所述第二引物引起的核酸扩增相比所述第一引物引起的核酸扩增优先进行，优选第二引物的Tm值(是指相对所述扩增产物的Tm值)高于第一引物的Tm值(是指相对于编码所述至少两个基因的各扩增对象区域或所述扩增产物的Tm值)。

因此，第二引物是不同于所述单一的额外碱基序列以及其互补碱基序列的额外碱基序列，能包括可以调整到高于第一引物的Tm值的额外序列(以下称为调整用额外碱基序列)。其结果为，对于所述扩增产物可以提高第二引物的Tm值。作为用于这种目的的额外序列，虽然没有特别限制，但可以举出GC含量高的碱基序列等。

并且，可以在所述第二引物中导入人工核酸。作为这样的人工核酸，可以举出LNA、BNA、PNA等。

并且，为了能使所述第二引物的Tm值高于所述第一引物的Tm值，可以导入RNA引物。还可以添加作为提高解链温度的Tm增强剂的MGB(小沟组合剂)。

所述第二引物的长度以及Tm值通常为12mer～60mer以及40℃～85℃，优选16mer～50mer以及50℃～80℃，但并不限于此。

另外，在将所述第二引物的Tm值设定得高于所述第一引物的Tm值的情况下，优选所述第二引物的Tm值相比所述第一引物的Tm值高至少0.1℃、1℃、3℃、5℃。并且，优选所述第二引物的Tm值和所述第一引物的Tm值之差低于30℃、25℃、20℃。在此基础上，优选所述第二引物的Tm值和所述第一引物的Tm值之差高于0.1℃～30℃，更优选高于1℃～30℃、3℃～30℃、5℃～25℃。

并且，在将所述第二引物的Tm值设定得高于所述第一引物的Tm值的情况下，优选所述第二引物的Tm值为50℃～85℃，以及所述第一引物的Tm值为40℃～75℃。并且，更优选所述第二引物的Tm值为55℃～80℃，以及所述第一引物的Tm值为50℃～75℃。

所述第一引物组是除了所述第一引物之外还包括其他引物，所述其他引物是为了扩增用作测定对象的基因的双链核酸的另一方单链核酸。作为该另一方引物，可以是设计成同等于使能包括所述单一的额外碱基序列的同等第一引物(由一对第一引物组成的组)，并且，可以是第三引物，所述第三引物是用于对所述第一引物进行杂交的单链互补链侧的核酸扩增中且不包括所述单一的额外碱基序列。第三引物是只要不包括所述单一的额外碱基序列，具有对于所述第一引物识别的所述测定对象基因的单链互补链的核酸序列能够进行杂交的核酸序列即可。

在所述第三引物涉及的“能够进行杂交的碱基序列”中，可以直接应用第一引物涉及的所记述内容。

并且，所述第二引物可以形成另一方引物和第二引物组，所述另一方引物是用于扩增具有所述第一的额外碱基序列的双链核酸的另一方核酸。作为所述第二引物组中包括的另一方引物，可以是由一对所述第二引物组成的组，并且也可以与所述第一引物组中包括的所述第三引物一起组成所述第二引物组。即在所述第一引物组包括所述第三引物的情况下，所述第一引物以及所述第二引物的各自形成一对(所述第一引物或所述第二引物和所述第三引物的组)，可以对所述测定对象基因的双链核酸的双方碱基序列进行核酸扩增。

作为核酸扩增工序中使用的引物组，可以是例如一对第一引物组以及一对第二引物组的组合，第一引物以及第二引物和第三引物的组合。并且，在这种情况下，第一引物以及第二引物中可以包括所述调整用额外碱基序列。

作为组合的示例，例如虽然不限于此，但可以举出以下：

具有相对所述单一的额外碱基序列以及所述测定对象基因的扩增对象区域的碱基序列互补的碱基序列的第一引物、不包括调整用额外碱基序列的第二引物、以及第三引物的组合；

低于第二引物Tm值的第一引物、高于第一引物Tm值的第二引物、以及第三引物的组合；

高于第二引物Tm值的第一引物，低于第一引物Tm值的第二引物、以及第三引物的组合；

包括低于第二引物Tm值的调整用额外序列的第一引物、不包括错配或简并碱基的第二引物、以及第三引物的组合；

包括低于第二引物Tm值的错配或简并碱基等的调整用额外碱基序列的第一引物、不包括错配或简并碱基等的调整用额外碱基序列的第二引物、以及第三引物的组合；

包括低于第二引物Tm值的调整用额外序列以及错配或简并碱基的第一引物、不包括错配或简并碱基等的调整用额外碱基序列的第二引物、以及第三引物的组合；

相对于所述单一的额外碱基序列以及测定对象基因的扩增对象区域的碱基序列双方不包括取代等的第一引物，包括高于第一引物Tm值的调整用额外碱基序列的第二引物、以及第三引物的组合；

包括错配或简并碱基等的调整用额外碱基序列的第一引物、包括高于第一引物Tm值的错配或简并基因等的调整用额外碱基序列的第二引物、以及第三引物的组合；以及

包括错配或简并碱基的第一引物、包括高于第一引物Tm值的错配或简并碱基以及调整用额外碱基序列的第二引物、以及第三引物的组合。

另外，这时与反应液中的测定对象基因对应的第一引物的组成可以是同种类(例如，由同时不包括错配或简并碱基的第一引物组成)，也可以是不同种类(例如，一方应用不包括错配或简并碱基的第一引物，另一方应用包括错配或简并碱基的第一引物)，但从对多个测定对象基因以同一扩增效率进行核酸扩增的观点等出发，优选同种类。

在使用第三引物的情况下，所述反应液中可以包括相对与该第三引物成对的所述第一引物量以物质量基准0.25倍量～4倍量的所述第三引物。如果为0.25倍量以上时，则例如有能够不大大损伤第一引物和第三引物的扩增平衡的扩增的倾向，如果是4倍量以下，则例如可以获得第二引物容易与第三引物的扩增产物发生反应等优点。

可以使第三引物的量等量于第一引物的量。并且，为了调节实际中使用的引物序列、试剂配方、以及获得的检测结果的数值，能够增加或减少第三引物量来微调整并进行优化。因此，例如可以得到能调节参照基因或目标基因、或5’侧基因区域或3’侧基因区域的检测信号强度的优点，除了这个优点，还可以得到能调节参照基因或目标基因的扩增效率的优点。

例如，从容易转移到第二引物引起的反应中等方面来看，优选将第三引物量设为相对第一引物的丰度为以物质量基准约1倍～4倍，更优选1倍～2倍。

而且，在所述第三引物量少于所述第一引物量的情况下，例如因反应液中的第三引物的量少，以所述第一引物以及第二引物相互争夺第三引物的方式发生反应。从这一点看，可获得能够准备很容易达到参照基因和目标基因的反应平台的试剂的优点。这时，可以将第三引物量设为相比第一引物丰度以物质量基准约为0.25倍～1倍，更优选0.5倍～1倍。

并且，所述反应液可以包括以物质量基准与包括在所述第一引物组中的各引物相比等量或多量的所述第二引物。因此，例如有能够可靠地扩增通过第一引物组而进行核酸扩增的扩增产物等优点。并且，可以得到如下优点中的一个以上，所述优点包括：相比第一引物组引起的核酸扩增更容易转移到第二引物组的核酸扩增中，可以获得多量的第二引物引起的核酸扩增产物，以及防止第二引物的枯竭为原因引起的核酸扩增产物达到平台期等。

优选地，所述第二引物在所述反应液中的量是组成第一引物组的各引物中量多的一方的1倍量～400倍量(摩尔比)，优选为1倍量～40倍量(摩尔比)的多量，更优选为1倍～20倍(摩尔比)。通过将第二引物的反应液中的浓度设为组成所述第一引物组的各引物种量多的一方的浓度的1倍量以上，倾向于不损失扩增效率地在反应液中确切地累积扩增产物等，通过设为400倍量以下，倾向于防止非特异扩增、以及第一引物组引起的核酸扩增反应的不妨碍等。

为了同时满足与所述第一引物的量比以及与所述第二引物的量比，所述反应液中可以包括所述第三引物。因此，可以同时具有上述优点。

另外，在所述核酸扩增工序中，各引物组中包括的各引物的长度可以是相同也可以是不相同。

作为核酸扩增的方法，优选的是使用聚合酶的方法，作为其例可以举出PCR法、ICAN法、LAMP法以及NASBA法等。在通过使用聚合酶的方法而进行扩增的情况下，优选的是在后述的探针的存在下进行扩增。对于本领域技术人员来说，对应于使用的探针以及聚合酶而调整扩增的反应条件等是很容易的事情。

并且，作为用于PCR法的DNA聚合酶，使用通常被使用的DNA聚合酶，并没有特别的限制。例如，可以举出GeneTaq(日本基因公司制)，PrimeSTAR Max DNA Polymerase(宝生物工程株式会社制)，以及Taq聚合酶等。

作为聚合酶的使用量，只要为通常使用的浓度即可，并没有特别的限制。例如在使用Taq聚合酶的情况下，优选的是相对反应液量50μl浓度设为0.01U～100U。

所述PCR扩增产物的解离(解离工序)中的加热温度为只要能解离所述扩增产物即可，并没有特别的限制。例如为85℃～95℃。加热时间也没有特别的限制。通常为1秒～10分钟，优选1秒～5分钟。

并且，解离的单链核酸和所述引物各自之间的杂交是例如可以通过所述解离工序之后，降低所述解离工序中的加热温度而进行。作为温度条件，例如为50℃～80℃。

关于温度条件，在核酸扩增和反应过程中，可以设定成多个条件。例如在实行50个循环的PCR反应的核酸扩增反应中，可以将反应条件调整为55℃时实施前面的10个循环，65℃时实施后面的40个循环。

关于杂交工序的反应液中的各组成体积或浓度，并没有特别的限制。作为具体例，所述反应液中的引物浓度例如为第一引物和第三引物是0.001μM～1μM，优选0.01μM～0.5μM，第二引物的浓度例如为0.01μM～10μM，优选0.05μM～5μM。

为了在后述的信号检测工序中有效地检测信号，所述反应液中可以包括对所述至少两种扩增产物分别进行识别的至少两种的检测用探针。

作为所述检测用探针，只要能检测被用作目标的扩增产物即可，并没有特别的限制。并且，作为检测用探针的长度，并没有特别的限制，优选5mer～50mer，更优选10mer～30mer。探针的长度在这个范围时，例如可以提高检测敏感度。

关于所述检测用探针，优选的是相对所述测定对象基因各自的核酸序列70％～100％相同的序列，特别优选80％以上相同。

并且，在将所述检测用探针在核酸扩增工序中与引物同时存在而使用的情况下，为了被用作DNA聚合酶的反应对象而防止探针自身的延长，优选要么在3’末端侧中添加后述的荧光标记，要么在探针的3’末端中再添加磷酸基。

从检测效率性的观点出发，优选检测用探针是附加标记的标记化探针。

作为标记化探针中的标记物质的具体例，例如可以举出荧光染料以及荧光团。作为所述标记化探针的具体例，例如优选以荧光染料作标记的、单独显示荧光且由于杂交体形成而荧光减少(例如为淬灭)的探针。

利用这样的荧光淬灭现象(Quenching phenomenon)的探针通常被称为荧光淬灭探针。其中，作为所述探针，优选的是寡核苷酸的3’区域(例如3’末端)或5’区域(例如5’末端)的碱基被荧光染料标记化，被标记化的所述碱基优选的是胞嘧啶(C)。这时，在所述标记化探针进行杂交的检测目标序列中，优选设计所述标记化探针的碱基序列，使能与所述标记化探针的末端碱基C成对的碱基或从形成所述对的碱基中远离1～3个碱基的碱基为鸟嘌呤(G)。这样的探针通常被称为鸟嘌呤淬灭探针，已知为所谓的Q Probe。

这样的鸟嘌呤淬灭探针在检测目标序列中进行杂交时，显示通过被荧光染料标记化的末端的C接近所述检测目标序列中的G，而所述荧光染料的发光变弱(减少荧光强度)的现象。使用这样的探针时，通过信号的变动，可以容易地确认杂交和解离。并且，所述标记物质可以结合在例如通常为核苷酸的磷酸基上。

另外，除了使用Q Probe的检测方法之外，可以使用公知的检测方式。作为这样的检测方式，可以举出Taq-man Probe法或RFLP法等。

作为所述荧光染料，并没有特别的限制，例如可以举出荧光素、若丹明、磷光体、以及聚甲炔染料衍生物等，作为市场上可买到的荧光染料，例如可以举出BODIPY FL、FluorePrime、Fluoredite、FAM、Cy3以及Cy5、以及TAMRA等。由于试样液中存在多个被用作测定对象的基因，因此可以在本发明中应用多个检测用探针。这时优选使用的多个探针中可以使用的荧光染料的组合为，例如只要在不同条件下能检测即可，并没有特别的限制，例如可以举出Pacific Blue(检测波长为445nm～480nm)，TAMRA(检测波长为585nm～700nm)、以及BODIPY FL(检测波长为520nm～555nm)的组合等。在使用同一个荧光染料的情况下，优选选择相对所述检测对象具有不同Tm值的检测用探针。

并且，在所述检测用探针为被荧光染料等标记化物质标记化的标记化探针的情况下，例如为了调节检测的荧光强度等的信号强度，可以并用与所述标记化探针相同序列的未标记探针。关于未标记探针，例如可以在其3’末端中添加磷酸。

关于检测用探针相对于所述反应液中核酸的添加比例(摩尔比)，并没有特别的限制。相对试样中的核酸，优选1倍以下，更优选0.1倍以下。因此，例如可以充分确保检测信号。

所述检测用探针相对于所述核酸的添加比例例如可以是相对双链核酸的摩尔比，也可以是相对单链核酸的摩尔比。

所述丰度测定工序中包括检测基于所述至少两种扩增产物丰度的信号，以及基于该信号测定出所述至少两个基因的丰度。

至少两种扩增产物的丰度反映出至少两种基因的丰度，因此通过测定基于核酸扩增工序中获得的扩增产物的丰度的信号，可以测定出对象样品中的核酸中基因的丰度。

可以通过获得扩增产物的检测信号(以下称为信号检测工序)、以及对比已获检测信号而测定丰度(以下称为信号对比工序)，可以进行基因丰度的测定。

信号的检测只要是能测定出反应液中累积的扩增产物的丰度的方法即可，对于信号种类也没有特别的限制。

作为所述信号检测工序，优选使用利用了可以检测被用作目标的扩增产物的检测用探针的检测方法。

所述信号对比工序中包括通过对对应于所述信号检测工序中获得的各基因的各检测信号进行对比而测定各基因丰度。关于所述检测信号的对比以及从对比结果获得的各基因丰度的测定方法，并没有特别的限制。

例如从PCR循环数和扩增产物的累积量之间的关系，可以对比与所述基因对应的检测信号而计算出各基因的丰度。

这时，可以经过PCR循环数的同时逐次测定出反应液中的多个测定对象基因的扩增产物量，从获得的测定结果测定测定对象基因的丰度。伴随PCR循环数的扩增产物的量一般指数性扩增，但在一般的检测方法中分为不能进行检测的初期循环期、指数性增长并可以进行检测的扩增期、以及反应速度下降的平台期。在所述核酸扩增工序中，与所述检测对象基因种类对应的多个扩增产物中均是通过第二引物而获得的扩增产物，因此即使达到平台期，也以与所述测定对象基因的丰度对应的量比累积在反应液中。因此，通过应用对所述扩增产物的种类进行识别的种类识别手段，能对来自于反应液中累积的所述测定对象基因的扩增产物进行识别，通过各自量比的测定，可以测定出各自测定对象基因的丰度。

作为所述种类识别手段，可以举出固定了所述检测用探针的Tm值、标记种类、以及探针的DNA微序列等。

并且，在所述测定对象基因包括参照基因和目标基因的情况下，从相对于参照基因的丰度的比率中，可以测定出目标基因的丰度。在所述测定对象基因为融合基因中的5’侧基因区域和3’侧基因区域的情况下，可以是从相对于5’侧基因区域的丰度中测定出3’侧基因区域的丰度，也可以是从相对于3’侧基因区域的丰度中测定出5’侧基因区域的丰度。

并且，所述丰度测定工序中，所述至少两个基因的丰度可以是通过与该基因各自对应的至少两个检测信号的Tm分析而测定出。这时，作为所述信号检测工序以及所述信号对比工序，更优选的是包括下述工序(I)～(IV)。另外，下述工序(I)可以与上述核酸扩增工序同时进行。

(I)使所述检测用探针和试样中的单链核酸(扩增产物)接触，获得杂交体形成体(杂交工序)。

(II)通过改变包括所述杂交体形成体的试样的温度，使所述杂交体形成体解离，测定出基于所述杂交体形成体解离的检测信号的变动(测定工序)。

(III)基于所述检测信号的变动，检测杂交体形成体的解离温度Tm值(Tm值检测工序)。

(IV)基于所述Tm值，检测所述试样的单链核酸中被用作目标的扩增产物的存在或丰度比(丰度比检测工序)。

在杂交工序中，通过所述检测用探针和试样中的单链核酸的接触，能使两者进行杂交。试样中的单链核酸是例如通过解离上述中获得的扩增产物而可以调制。

对于所述扩增产物的解离(解离工序)中的加热温度，只要能解离所述扩增产物即可，并没有特别的限制。例如为85℃～95℃。对于加热时间也没有特别的限制。通常为1秒～10分钟，优选1秒～5分钟。

对于解离的单链核酸和所述检测用探针之间的杂交，例如可以通过所述解离工序之后，降低所述解离工序中的加热温度而进行。作为温度条件，例如为25℃～50℃。对于杂交工序的反应液中的各组成的体积以及浓度，并没有特别的限制，可以应用通常的应用条件。

在测定工序中，渐渐加热已获的所述单链核酸和所述检测用探针之间的杂交体形成体，并测定伴随温度上升的荧光信号的变动。例如，在使用Q Probe的情况下，与单链核酸进行杂交的状态下，相比解离状态荧光强度减少(或淬灭)。因此，例如只要渐渐加热荧光正减少(或淬灭)的杂交体形成体，并测定伴随温度上升的荧光强度的增加即可。

对于测定荧光强度变动时的温度范围，并没有特别的限制，例如开始温度为室温～85℃，优选25℃～70℃，结束温度例如为40℃～105℃。并且，对于温度的上升速度并没有特别的限制，例如为0.1℃/秒～20℃/秒，优选0.3℃/秒～5℃/秒。

在测定工序中，对用于所述至少两种基因丰度的测定中的所述信号，优选通过同一个波长时取得的吸光度或荧光值而获得。如此，通过简单化的测定以及检测，可以测定出所述测定对象基因的丰度。为了通过同一波长取得吸光度或荧光值，例如可以使用相同的检测用探针的标记。这时，从检测灵敏度的观点出发，对于使用的各引物，优选不同的Tm值。

在Tm值检测工序中，对所述信号的变动进行分析，并确定为Tm值。具体地，基于获得的荧光强度计算出各温度下的微分值(-d荧光强度/dt)，将显示最低值的温度确定为Tm值。并且，还可以将每单位时间的荧光强度增加量(荧光强度增加量/t)最高的点确定为Tm值。另外，作为标记化探针，在不使用淬灭探针，而使用了通过杂交体形成而增加信号强度的探针的情况下，相反只要测定荧光强的减少量即可。

并且，可以代替加热杂交体形成体而进行的伴随温度上升的荧光信号变动(优选荧光强度的增加)的测定，例如可以进行形成杂交体时的信号变动的测定。即，可以测定降低添加了所述探针的试样的温度并形成杂交体形成体时的伴随所述温度降低的荧光信号变动。

作为具体例，与未与互补序列中进行杂交的荧光强度相比，使用与互补序列杂交时的荧光强度减少(淬灭)的荧光标记探针(例如为Q Probe)的情况下，当将所述探针添加到试样中时，所述探针处于解离状态，因此荧光强度很大，但是当通过温度的降低而形成杂交体形成体时，所述荧光减少(或淬灭)。因此，例如通过渐渐降低所述加热的试样的温度而可以测定出温度下降伴随的荧光强度的减少。

另一方面，在使用通过杂交体形成而信号增加的标记化探针的情况下，当将所述探针添加到试样中时，所述探针处于解离状态，因此荧光强度很小(或淬灭)，但是当通过温度的降低而形成杂交体体时，荧光强度增加。因此，例如只要渐渐降低所述试样的温度而测定出温度的降低伴随的荧光强度的增加即可。

在丰度比检测工序中，基于所述Tm值而检测所述试样中的单链核酸中被用作目标的扩增产物，并基于该丰度检测被用作测定对象的基因的丰度。

在所述信号检测工序中获得的所述扩增产物的检测信号中，混杂了来自被用作测定对象的多个基因的多个扩增产物的信号。这些信号反映出各自的扩增产物的信号，因此通过对各自的检测信号的比较对比，可以测定出测定对象基因的丰度，即对象样品中的核酸中的丰度。特别是，在被用作测定对象的基因中包括预先判明了基因丰度的所述参照基因和所述目标基因的情况下，通过将参照基因的检测信号用作基准，可以简便地测定出所述目标基因的丰度。

并且，在被用作测定对象的基因为融合基因中5’侧基因区域和3’侧基因区域的情况下，通过对5’侧基因区域的检测信号和3’侧基因区域的检测信号的比较，可以简便地检测样品中的融合基因的丰度。

作为基于检测信号而测定基因丰度的方法，并没有特别的限制，只要是可以为这种目的使用的分析方法，任何一种都能应用。

例如优选通过对上述信号的Tm分析中获得的解链曲线进行对比而测定基因的丰度，所述基因丰度的测定具有可以高精度且简便地测定被用作目标的基因的丰度等优点。

作为这样的Tm分析方法，可以优选举出WO2009/081965以及WO2010/001969等中记载的内容。

作为Tm分析方法的优选的一例，以下陈述关于将测定对象基因作为参照基因和目标基因，对Tm分析结果进行面积分析，并确定各自基因的对象样品的核酸中的丰度的方法。

图1的(A)中示出通过某任意的目标基因和参照基因的核酸混合物的温度和吸光度或荧光强度等的检测信号之间的关系而表示的解链曲线，以及图1的(B)中示出通过温度和检测信号的微分值之间的关系而表示的解链曲线(也称为微分解链曲线)。通过从这种微分解链曲线中的峰值的检测，检测参照基因的核酸R的解链温度Tm_R以及目标基因的核酸T的解链温度Tm_T，并设定包括Tm_R以及Tm_T的各自的温度范围。

作为包括Tm_R的温度范围ΔT_R，可以设定例如Tm_R和Tm_T之间的检测信号的微分值为最小的温度为下限，检测信号的峰值部分对应的温度为上限的温度范围。并且，作为包括Tm_T的温度范围ΔT_T，可以设定例如Tm_R和Tm_T之间的检测信号的微分值为最小的温度为下限，检测信号的峰值部分对应的温度为上限的温度范围。

另外，温度范围ΔT_R以及温度范围ΔT_T可以设定成同一宽度(例如为10℃)或不同宽度(例如温度范围ΔT_R为10℃，温度范围ΔT_T为7℃)。并且，温度范围ΔT_R以及温度范围ΔT_T可以设定成各自的解链温度Tm中加X℃、减X℃的宽度(X℃例如在15℃以内，最好是10℃以内)。

接着，对于各自的温度范围ΔT_R以及温度范围ΔT_T，求出经过对应于微分解链曲线的温度范围的下限的点和对应于上限的点的直线、以及微分解链曲线包围的面积。作为面积的求出方法的一例，具体如以下方式可以求出。将温度T中的检测信号的微分值作为f(T)，将温度T中的基值作为B(T)，通过下述(1)式能求出。

其中，T_s为各温度范围中的下限值，T_e为上限值。并且，各温度T中的基值B(T)是通过下述(2)式而求出的值，表示了检测信号中包括的背景值。从检测信号的微分值中减去这个基值，就能除去检测信号中包括的背景值的影响。

B(T)＝a×(T-T_s)+f(T_s) (2)

其中，a＝{f(T_e)-f(T_s)}/(T_e-T_s)。

根据上述(1)式以及(2)式，可以求出各核酸的温度范围ΔT_R中的面积S_R以及温度范围ΔT_T中的面积S_T，计算出面积比和各核酸丰度比之间的关系。例如横轴上标注丰度比(对应核酸总量的目标基因T的比率)，纵轴上标注面积比(S_T/S_R)。另外，面积比可以是由S_T/S_R确定。

在这里，预先已判明了参照基因的丰度，因此通过参照基因的面积和目标基因的面积之间的对比，可以确定目标基因的丰度。

另外，对于如上述预先已知具体丰度的测定对象基因，可以制作校准曲线而进行目标基因的定量。

使用如上述的方法制作的校准曲线，测定出被用作测定对象的多个基因的丰度。对于丰度的测定，可以是通过作为测定对象的基因中、与一个基因的丰度进行对比而获得其他基因的相对丰度，还可以是基于一个基因的具体丰度而获得其他基因的具体丰度。将一个基因用作参照基因的情况下，可以将目标基因丰度作为基于参照基因丰度的相对量而获得，并且还可以作为具体的量而获得。在作为丰度而求出拷贝数的情况下，对来自所述参照基因的扩增产物检测信号和来自目标基因的扩增产物检测信号之间进行比较，并确定所述目标基因的拷贝数。

另外，即使对于测定对象基因为5’侧基因区域以及3’侧基因区域的情况，通过与上述方法同样的方法，对来自5’侧基因区域的扩增产物检测信号以及来自3’侧基因区域的扩增产物检测信号进行对比，并检测样品中的融合基因的丰度。

<基因的测定试剂盒>

本发明涉及的基因测定试剂盒是用于前述基因测定方法的试剂盒，包含所述的第一引物组和所述第二引物，所述第一引物组包括前述的第一引物。

根据本测定试剂盒，可以简便地测定出丰度不同的测定对象基因的丰度。

并且，除所述第一引物以及第二引物之外，所述测定试剂盒中还可以含有前述的第三引物。

对于本基因测定试剂盒中的所述第一引物、所述第二引物、以及所述第三引物，可以直接应用前述的事项。

并且，所述测定试剂盒中可以包括至少两个检测用探针，所述检测用探针具有能够分别于所述至少两个基因的核酸扩增区域进行杂交的核酸序列且具备标记。由此，通过使用检测探针，可以进一步简便地测定出丰度不同的测定对象基因。作为所述测定试剂盒中包括的所述检测用探针，优选的是所述标记为荧光标记。对于所述标记以及荧光标记，可以直接应用前述的事项。

并且，所述测定试剂盒除了探针之外还可以包括本发明涉及的测定方法中的进行核酸扩增所需的试剂类。并且，对于所述各探针、所述各引物、以及其他的试剂类，可以分别收纳，也可以将它们的一部分制成混合物。

另外，对于“分别收纳”，只要各试剂区分开以能维持非接触状态即可，不需要一定收纳在可以独立操作的个别容器中。

本发明的测定试剂盒优选包括操作说明书或使用说明书。所述操作说明书中记载了使用包括所述第一引物的所述第一引物组和第二引物，针对包括测定对象基因的试剂制作微分解链曲线，并进行其Tm值分析而测定出测定对象基因的丰度。所述使用说明书中记载了测定试剂盒中包括的或可以附加性包括的各种试剂。

并且，本发明的测定试剂盒可以用于融合基因变异的检测中。例如作为ALK融合基因测定试剂盒，可以举出包括所述第一引物组(例如序列号为19以及21)和第二引物(例如序列号为22)的测定试剂盒，所述第一引物组中包括了可以扩增ALK基因中的特定基因区域的第一引物。并且，ALK融合基因测定试剂盒可以是包括所述第一引物组(例如序列号为19以及21)、第二引物(例如序列号为22)、以及第三引物(例如序列号为18以及20)的测定试剂盒，所述第一引物组中包括了可以扩增ALK基因中的特定基因区域的第一引物。

<基因测定装置>

本发明涉及的基因测定装置是可以应用前述基因丰度测定方法的装置，包括检测部以及运算部。所述检测部检测基于包含通过所述第一引物而导入的所述单一的额外碱基序列且对应于通过第二引物而进行核酸扩增的所述至少两个基因的扩增产物丰度的至少两个信号。所述运算部是对所述检测部检测的所述至少两个检测信号进行对比，并运算出所述至少两个基因的丰度。

只要是本基因测定装置，就能更简便地实施前述的本发明涉及的基因丰度的测定方法。

关于所述检测部，只要可以检测检测信号即可，并没有特别的限制，例如对应于被使用的检测用探针的种类，可以适当地选择。例如当检测用探针为荧光标记探针时，可以包括荧光检测器。

所述运算部是基于通过检测部获得的各检测信号而运算出反应液中的测定对象基因的丰度。

运算中包括：例如对解链曲线的检测信号进行关于温度的微分，并运算出表示温度和检测信号的微分值之间关系的微分解链曲线；对于微分解链曲线，设定预先制作校正曲线时设定的温度范围；各自求出对应于测定对象基因的面积，所述面积为经过微分解链曲线的温度范围的下限对应的点和上限对应的点的直线、以及微分解链曲线包围的面积；运算出已获的面积的比；以及基于预先制作的校正曲线而运算出测定对象基因对应的丰度比。

作为具备所述检测部以及运算部的装置，可以使用任何一种公知的装置。例如可以直接应用WO2009/081965以及WO2010/001969等中记载的装置。

<基因测定系统>

本发明涉及的基因测定系统是可以应用前述基因丰度测定方法的装置，包括检测装置以及运算装置。所述检测装置检测基于包含通过所述第一引物而导入的所述单一的额外碱基序列且对应于通过第二引物而进行核酸扩增的所述至少两个基因的扩增产物丰度的至少两个信号。所述运算装置是对所述检测部检测的所述至少两个检测信号进行对比，运算出所述至少两个基因的丰度。

对于本系统中使用的检测装置以及运算装置，可以直接应用上述基因测定装置中记述的检测部以及运算部。

并且，与所述测定装置同样，对于所述测定装置以及运算装置，例如可以直接应用WO2009/081965以及WO2010/001969等中记载的装置。

<基因诊断方法>

本发明中的基因诊断方法是使用上述的基因测定方法而进行的诊断方法。

根据本发明，基于对象样品中的核酸中的丰度不同的至少两个基因的丰度，就可以进行这些丰度相关的疾病、药物代谢能力、以及药物耐受性等的诊断。

优选地，测定对象基因的丰度为拷贝数量，并将本发明应用到拷贝数多态性的诊断中，所述诊断的指标之一是对象样品中的核酸中拷贝数的增减。作为将拷贝数变异用作指标之一的疾病，可以举出染色体1q21.1的拷贝数变异引起的神经胚细胞瘤等。根据本发明，可以高精度地诊断出这些疾病、药物代谢能力、以及药物耐受性有关的基因丰度的检测。

实施例

以下，对本发明的实施例进行详细的说明。但是，本发明不限于这些实施例。另外，除非特别指出，“％”为质量基准。

[实施例1]

将CYP2D6基因用作目标基因，测定了人CYP2D6基因的特定区域序列(序列号1)的丰度。作为参照基因，使用了人sod2基因的特定区域序列(序列号2)。另外，CYP2D6基因的基因组碱基序列能够作为GenBank NG008376获得，sod2基因的基因组碱基序列能够作为GenBank NG008729获得。

调制将序列号1或序列号2的核酸序列插入到pUC57的人工核酸(质粒)，为了改变CYP2D6的拷贝数，根据表1而准备了各种质粒溶液的试样a～d。使用这些质粒溶液，调制了以指定拷贝数含有目标基因以及参照基因的各种试样(各种模板)。

[表1]

使用全自动SNPs检查装置(商品名i-densy(商标)，爱科来公司制)和下述表2中示出的探针以及各种引物，并使用表3中记载的配方的检查用试剂而进行了PCR以及Tm分析。另外，使用的聚合酶是Taq聚合酶。

对于PCR，以在95℃下处理60秒之后、在95℃下1秒以及63℃下15秒作为一个循环而反复进行60个循环。

并且，对于Tm分析，PCR之后将进行95℃下1秒、40℃下60秒的处理，接着以1℃/3秒的温度的上升速度、将温度从40℃提高到80℃，并测定了其间的随时间的荧光强度的变化。将激发波长定为520nm～555nm、测定波长定为585nm～700nm，分别测定了来自荧光标记探针的荧光强度的变化。可知在目标基因(CYP2D6)时在58℃附近确认到峰，在参照基因(sod2)时在70℃附近确认到峰。

基于Tm值的分析是基于面积分析而进行的。具体地，对于试样a～d，基于Tm分析的结果而制作出微分解链曲线，获得目标基因以及参照基因的各自的Tm值和各自的面积，并求出目标基因面积相对于参照基因面积的比。其结果示出在表8以及图2A中。

使用的引物以及探针的序列为如表2中记载。

使用第一引物(序列号3，Tm值70.4℃)和第三引物(序列号4，Tm值55.7℃)而进行了对于CYP2D6的核酸的扩增，所述第一引物是由单一的额外碱基序列和CYP2D6特征性碱基序列的互补碱基序列组成，所述第三引物是由CYP2D6特征性碱基序列的互补碱基序列组成。使用第一引物(序列号6，Tm值69.7℃)和第三引物(序列号5，Tm值57.3℃)而进行了对于sod2的核酸的扩增，所述第一引物是由单一的额外碱基序列和sod2特征性碱基序列的互补碱基序列组组成，所述第三引物是由sod2特征性碱基序列的互补碱基序列组成。使用仅由所述单一的额外碱基序列组成的第二引物(序列号7，Tm值59.6℃)和各自的第三引物，对各自的扩增产物进行了扩增。CYP2D6的检测用探针(序列号8)以及sod2的检测用探针(序列号9)如表2中所记载。各引物的Tm值是使用Meltcalc而计算出的值。

另外，表2中的小写字母标记的碱基序列示出所述单一的额外碱基序列。

[表2]

[表3]

[比较例1～3]

在比较例1中，使用了包括下述的表4中示出的CYP2D6以及sod2双方都不包括所述单一的额外碱基序列的引物(2D6-Int6r-F1：序列号10，sod2-R1：序列号11)的引物组，且不使用第二引物的表5的配方，除此之外与实施例1同样地进行了PCR以及Tm分析。

在比较例2中，使用包括下述的表4中示出的CYP2D6以及sod2双方都不包括所述单一的额外碱基序列的引物(2D6-Int6r-F1：序列号10，sod2-R1：序列号11)的引物组的表6的配方，除此之外与实施例1同样地进行了PCR以及Tm分析。

在比较例3中，除了不使用第二引物(PEN3F4：序列号7，请参照表2)的表7的配方，除此之外与实施例1同样地进行了PCR以及Tm分析。

在表8以及图2B～图2D中示出比较例1～3中使用的各引物序列以及Tm分析结果。

[表4]

名称	序列(5′→3′)	mer	SEQID	备注
					2D6-Int6r-F1	TGAGCCCATCTGGGAAACA	19	10	Primer for CYP2D6
2D6-Int6f-R1	GGTGTCCCAGCAAAGTTCATG	21	4	Primer for CYP2D6
					sod2-F1	GGAGAAGCTGACGGCTGC	18	5	Primer for sod2
sod2-R1	CCTTATTGAAACCAAGCCAACC	22	11	Primer for sod2

[表5]

[表6]

[表7]

[表8]

样品	实施例1	比较例1	比较例2	比较例3
					a	1.18	2.14	1.44	1.03
b	1.77	2.96	1.72	0.63
					c	2.08	2.54	1.79	0.71
d	2.37	3.05	1.25	0.74

如表8以及图2A～D所示，在实施例1中，得到了随着试样a～b中的目标基因的拷贝数(增大)而变大，反映出拷贝数增加的结果。相比之下，比较例1～比较例3中的任何一个不发生与试样中的拷贝数增加对应的面积比的增加，没有得到能反映出拷贝数增加的结果。

即使各自反复进行三次实施例1以及比较例1，也能确认同样的倾向(未示出数据)。

[实施例2～实施例3]

在实施例2中，将第二引物变更为具有所述调整用额外碱基序列的PEN3F4+CTACG(CTACGCTACGCTACGcgctgtagtcgaagacgatgtttacg：序列号12，41mer，Tm值69.4℃)，使用按照表9中示出的配方的各试剂，将在95℃下处理60秒之后，以95℃下1秒以及60℃下15秒作为为一个循环重复性地进行50个循环地进行PCR，除此之外与实施例1同样地进行了Tm分析。其结果示出在表11以及图3中。

在实施例3中，将CYP2D6用的第一引物变更为2D6-P3F4-Int6r-F2(gtagtcgaagacgatgtttacgTGAGCCCATCTGGG(B)AACA，B＝c，g或t：序列号13，41mer，Tm值＝67.6～69.2℃)，所述D6-P3F4-Int6r-F2中消除了5’末端侧的所述单一的额外碱基序列的4个碱基，与此同时相当于CYP2D6扩增对象区域的碱基序列中包括简并；将sod2用的第一引物变更为P3F4-sod2-R4(gtagtcgaagacgatgtttacgCCTTATTGAAACCAAGC(D)AACC，D＝a，g或t：序列号14，44mer，Tm值66～67.3℃)，所述P3F4-sod2-R4消除了5’末端侧的所述单一的额外碱基序列的4个碱基，与此同时相当于sod2扩增对象区域的碱基序列中包括简并。并且，使用按照表10中示出的配方的各试剂，以在95℃下处理60秒之后，以95℃下1秒以及57℃下15秒为一个循环反复进行5个循环之后，将以95℃下1秒以及63℃下45秒为一个循环反复进行45个循环地进行PCR，除此之外与实施例1同样地进行了Tm分析。各引物的Tm值为使用Meltcalc而计算出的值。其结果在表11以及图4中示出。

[表9]

[表10]

[表11]

样品	实施例2	实施例3
			a	0.25	1.45
b	0.44	2.11
			c	0.73	3.59
d	0.91	4.81

如表11、图3以及图4中示出，在实施例2以及实施例3中，面积比随着a～b中的目标基因的拷贝数而变大，得到能反映出拷贝数增加的结果。并且，通过变更引物条件以及反应温度条件，改变检测曲线的波形，能得到各自不同面积比的结果，因此通过适当变更这些条件，就可以进行试剂配方的优化。

[实施例4～实施例5]

在实施例4中，将第一引物各自变更为包括调整用额外序列以及简并碱基的2D6-P3F4-Int6-F2(gtagtcgaagacgatgtttacgTGAGCCCATCTGGG(B)AACA：序列号13，41mer，Tm值67.6℃～69.2℃)和P3F4-sod2-R4(gtagtcgaagacgatgtttacgCCTTATTGAAACCAAGC(D)AACC：序列号14，44mer，Tm值66℃～67.3℃)，将第二引物变更为包括调整用额外碱基序列的PEN3F4+CTACG(CTACGCTACGCTACGcgctgtagtcgaagacgatgtttacg：序列号12，41mer，Tm值69.4℃)，使用按照表12中示出的配方的各试剂，在95℃下处理60秒的PCR之后，将以95℃下1秒以及57℃下15秒为一个循环重复性地进行5个循环之后，将以95℃下1秒以及63℃下45秒为一个循环重复性地进行45个循环，除外是同样于实施例1而进行了Tm分析。

在实施例5中，如表13中示出变更了各引物的量，除外是同样于实施例4而进行了PCR以及Tm分析。

其结果各自示出在表14、图5以及图6中。

[表12]

[表13]

[表14]

样品	实施例4	实施例5
			a	1.81	1.32
b	2.56	1.99
			c	3.30	2.54
d	3.38	2.98

如表14、图5以及图6中示出，在实施例4以及实施例5中，面积比随着a～b中的目标基因的拷贝数而变大，得到能反映出拷贝数增加的结果。

在实施例4中，使用了具有高于第一引物Tm值的第二引物，与此同时，使用了少于第三引物的量的第一引物。在实施例5中，使用了与实施例4同一组合的引物，使用了多于第三引物的量的第一引物。无论哪一种情况，如表14、图5以及图6中示出，可以获得能反映出目标基因的拷贝数增加的结果。

[实施例6～8]

在实施例6～8中，将CYP2D6变更为3T-2D6-Int6-R2(gtacccttcctccc-(TAMRA)：序列号15)，使用按照如表15中示出将第二引物(PEN3F4)的量各自变更为100nM(实施例6)、400nM(实施例7)、或1200nM(实施例8)的配方的各试剂，除外是同样于实施例1而进行了Tm分析。

其结果各自示出在表16以及图7。另外，在图7中，通过目标基因(CYP2D6)量为250拷贝数/μL时的面积比当作100％时的比率而示出实施例6～8的各试样中的各自的面积比。

[表15]

[表16]

样品	实施例6	实施例7	实施例8
				a	0.40	0.33	0.45
b	0.51	0.48	0.71
				c	0.57	0.60	0.97
d	0.71	0.77	1.17

如表16以及图7中示出，在实施例6～实施例8中，即使变更了第二引物的反应液中的丰度，面积比随着试样a～d中的目标基因的拷贝数而变大，得到能反映出拷贝数增加的结果。

并且，熟知当第二引物的量多于其他引物的量时，面积比的增加率变大，少时的面积比的增加率减少。

无论哪一种情况，如表16以及图7中示出，可以获得适当地反映出目标基因的拷贝数增加的结果。

因此，根据本发明，相比现有技术更正确且简便地测定出对象样品中的核酸中基因的丰度。

[实施例9]

通过将NCBI登录号NM_004304.4的第2460～2801位的碱基序列(序列号24)用作ALK基因的5’侧基因区域、第4690～5031位的碱基序列(序列号25)用作3’侧基因区域而插入到pcDNA3.1(+)的人工核酸(质粒)，合成RNA，并调制包括表17中记载的拷贝数的模板。

[表17]

使用全自动SNPs检查装置(商品名i-densy(商标)，爱科来制)和下述的表18中示出的探针以及各种引物，并使用表19中记载的配方的检查用试剂而进行了RT-PCR以及Tm分析。另外，使用的聚合酶是Taq聚合酶。并且，添加了0.2μM或4μM的PEN3R2(共通引物)。

在55℃下处理15分钟之后，进行了逆转录反应。

对于PCR，对在95℃下处理逆转录反应后的试样60秒之后、将95℃下1秒以及58℃下15秒作为一个循环而反复进行50个循环。

并且，对于Tm分析，PCR之后进行95℃下1秒、40℃下60秒的处理，相继将温度的上升速度定为1℃/3秒、从40℃提高到75℃，并测定出其间的随时间的荧光强度的变化。

将激发波长定为520nm～555nm、测定波长定为585nm～700nm，各自测定了来自荧光标记探针的荧光强度的变化。

熟知已经确认了来自5’侧基因区域的扩增产物时51℃附近，来自3’侧基因区域的扩增产物时58℃附近的各自的峰值。

基于Tm值的分析是基于面积分析而进行。具体地，对于模板a～c，从Tm分析的结果中制作出微分解链曲线，获得5’侧基因区域以及3’侧基因区域的各自的Tm值和各自的面积，并求出相对于5’侧基因区域的面积的3’侧基因区域的面积的比。其结果在表20以及图8中示出。

使用的引物以及探针的序列为如表18中记载。

对于5’侧基因区域，使用相对于5’侧基因区域的第一引物：P3R2-ALK5′-R5(序列号19，Tm值70.5℃)和第三引物：ALK5′-F2(序列号18，Tm值59.9℃)而进行了扩增。对于3’侧基因区域，使用相对于3’侧基因区域的第一引物：P3R2-ALK3′-R3(序列号21，Tm值70.1℃)和第三引物：ALK3′-F3(序列号20，Tm值60.8℃)而进行了扩增。对于各自的扩增产物，仅由所述单一的额外碱基序列组成的共通引物的第二引物：PEN3R2(序列号22，Tm值58.6℃)和各自的第三引物而进行了扩增。

相对于5’侧基因区域的检测用探针(序列号16)以及相对于3’侧基因区域的检测用探针(序列号17)为如表18中记载。

各引物的Tm值为使用Meltcalc而计算出的值。

另外，在表18中，小文字标记的碱基序列是示出单一的额外碱基序列。

[表18]

探针

名称	序列(5′→3′)	mer	SEQ ID
				5T-ALK5′-F2	(TAMRA)-CTCATTCGTGGAGTCT	16	16
3T-ALK3′-F2	GGAAGGAATATTCAC-(TAMRA)	15	17

引物

名称	序列(5′→3′)	mer	SEQ ID
				ALK5′-F2	TCTCCATGTGAGCTCCGAATGTCC	24	18
P3R2-ALK5′-R5	cgatcctgtttcttagcttagtcaagatccCCTTGCTCCTTCCCGGTTTTGTTC	54	19
				ALK3′-F3	GGATGCCCCCAGAGGCCTTC	20	20
P3R2-ALK3′-R3	cgatcctgtttcttagcttagtcaagatccTAGCAGCACTCCAAAGGACCATGTG	55	21
				PEN3R2	cgatcctgtttcttagcttagtcaagatcc	30	22

[表19]

[表20]

通过以上结果，根据本发明可以廉价且正确地测定出融合基因变异的存在的有无。

2011年10月31日申请的日本申请号第2011-238953号的全部公开内容通过参照并入本说明书中。

对于本说明书中记载的所有的文献、专利文献、以及技术规格而言，与各个文献、专利文献、以及技术规格被通过参照而并入所具体且分别记载的情况同等程度地，作为参照而并入。

Claims

1.一种基因的丰度的测定方法，包括：

在一个反应液中，使用第二引物和包括第三引物以及至少两种第一引物的第一引物组对编码至少两个基因的核酸进行核酸扩增，其中，所述至少两个基因在对象样品中的核酸中的基因丰度有可能不同，所述第一引物具有单一的额外碱基序列、以及能够与编码各个基因的核酸的扩增对象区域的碱基序列进行杂交的碱基序列，所述第三引物用于扩增该第一引物进行杂交的碱基序列的互补链侧的碱基序列、并且不包含所述单一的额外碱基序列，所述第二引物具有所述单一的额外碱基序列，并获得包含所述单一的额外碱基序列且分别对应于所述至少两个基因的至少两种扩增产物；以及

检测基于所述至少两种扩增产物的丰度的各自的信号，基于该信号测定出所述至少两个基因的丰度，

所述第二引物在所述反应液中的丰度与组成所述第一引物组的所述至少两种第一引物之中丰度最多的第一引物的丰度相比，以物质量基准为1倍量～20倍量，

所述第三引物在所述反应液中的丰度与所述第一引物在所述反应液中的丰度相比，以物质量基准为0.5倍量～2倍量，

所述第二引物在所述反应液中的丰度与所述第三引物之中丰度最多的第三引物在所述反应液中的丰度相比，以物质量基准为1倍量～20倍量。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其中，

所述单一的额外碱基序列由与编码所述至少两个基因的核酸的各扩增对象区域中的碱基序列非同源的碱基序列组成。

3.根据权利要求1所述的测定方法，其中，

所述反应液还包括分别识别所述至少两种扩增产物的至少两种的检测用探针。

4.根据权利要求1所述的测定方法，其中，

所述第一引物包含选自相对扩增对象区域的碱基序列错配的碱基以及简并的碱基组成的组的至少一者。

5.根据权利要求1所述的测定方法，其中，

所述第二引物的Tm值高于所述第一引物的各Tm值。

6.根据权利要求1所述的测定方法，其中，

所述第二引物还包含不同于所述单一的额外碱基序列的额外序列。

7.根据权利要求1所述的测定方法，其中，

所述至少两个基因的至少一个是预先判明在对象样品中的核酸中的丰度的参照基因，至少一个是作为在对象样品中的核酸中的丰度的测定对象的目标基因。

8.根据权利要求7所述的测定方法，包括：

对来自所述参照基因的扩增产物的检测信号和来自所述目标基因的扩增产物的检测信号进行比较，来确定所述目标基因在对象样品中的核酸中的丰度。

9.根据权利要求1所述的测定方法，其中，

所述至少两个基因的至少一个是融合基因的融合点上游的5’侧基因区域，至少一个是融合基因的融合点下游的3’侧基因区域。

10.根据权利要求9所述的测定方法，包括：

对来自所述5’侧基因区域的扩增产物的检测信号和来自所述3’侧基因区域的扩增产物的检测信号进行比较，来检测样品中的所述融合基因的存在。

11.根据权利要求1所述的测定方法，其中，

所述至少两个基因的丰度通过与该基因的各个对应的至少两个检测信号的Tm分析而测定。

12.根据权利要求1所述的测定方法，其中，

通过由同一波长取得的吸光度或荧光值，来获得用于测定所述至少两种基因的丰度的所述信号。

13.根据权利要求11所述的测定方法，其中，

对Tm分析的结果进行面积分析，并确定在对象样品中的核酸中的丰度。

14.一种用于权利要求1所述的测定方法的基因测定试剂盒，包括：

第一引物组，所述第一引物组包括第三引物以及至少两种第一引物，所述第一引物具有单一的额外碱基序列、以及能够与编码各个所述基因的核酸的扩增对象区域的碱基序列进行杂交的碱基序列，所述第三引物用于扩增该第一引物进行杂交的碱基序列的互补链侧的碱基序列、并且不包含所述单一的额外碱基序列；以及

第二引物，所述第二引物具有所述单一的额外碱基序列，

所述第二引物的丰度与组成所述第一引物组的所述至少两种第一引物之中丰度最多的第一引物的丰度相比，以物质量基准为1倍量～20倍量，

所述第三引物的丰度与所述第一引物的丰度相比，以物质量基准为0.5倍量～2倍量，

所述第二引物的丰度与所述第三引物之中丰度最多的第三引物的丰度相比，以物质量基准为1倍量～20倍量。

15.根据权利要求14所述的基因测定试剂盒，还包括：

至少两个检测用探针，所述两个检测用探针具有能够分别与所述至少两个基因的核酸扩增区域进行杂交的碱基序列且具备标记。

16.根据权利要求15所述的基因测定试剂盒，其中，

所述标记为荧光标记。