RU2807530C1 - Способ прогностической оценки гепатотоксичности у ВИЧ-инфицированных лиц при антиретровирусной терапии на основе определения делеционного полиморфизма генов биотрансформации ксенобиотиков GSTM1, GSTT1, CYP2D6 человека и набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых зондов - Google Patents
Способ прогностической оценки гепатотоксичности у ВИЧ-инфицированных лиц при антиретровирусной терапии на основе определения делеционного полиморфизма генов биотрансформации ксенобиотиков GSTM1, GSTT1, CYP2D6 человека и набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых зондов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2807530C1 RU2807530C1 RU2022130994A RU2022130994A RU2807530C1 RU 2807530 C1 RU2807530 C1 RU 2807530C1 RU 2022130994 A RU2022130994 A RU 2022130994A RU 2022130994 A RU2022130994 A RU 2022130994A RU 2807530 C1 RU2807530 C1 RU 2807530C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- insdqualifier
- insdseq
- cyp2d6
- insdfeature
- gstt1
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 35
- 108010001237 Cytochrome P-450 CYP2D6 Proteins 0.000 title claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 206010019851 Hepatotoxicity Diseases 0.000 title claims abstract description 19
- 238000012217 deletion Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 230000037430 deletion Effects 0.000 title claims abstract description 19
- 231100000304 hepatotoxicity Toxicity 0.000 title claims abstract description 15
- 230000007686 hepatotoxicity Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 15
- 238000011225 antiretroviral therapy Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 title claims abstract description 9
- 239000002676 xenobiotic agent Substances 0.000 title claims abstract description 6
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 title claims abstract description 4
- 230000002034 xenobiotic effect Effects 0.000 title claims abstract description 4
- 101001071694 Homo sapiens Glutathione S-transferase Mu 1 Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 101001032462 Homo sapiens Glutathione S-transferase theta-1 Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 102100038055 Glutathione S-transferase theta-1 Human genes 0.000 claims abstract description 43
- 102100021704 Cytochrome P450 2D6 Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000010606 normalization Methods 0.000 claims abstract description 12
- 101710205841 Ribonuclease P protein component 3 Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 7
- 102100033795 Ribonuclease P protein subunit p30 Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 13
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 12
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 9
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 6
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 claims 1
- 101710120319 Photosystem I reaction center subunit IV Proteins 0.000 claims 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 claims 1
- 102000004167 Ribonuclease P Human genes 0.000 claims 1
- 108090000621 Ribonuclease P Proteins 0.000 claims 1
- 102100036534 Glutathione S-transferase Mu 1 Human genes 0.000 abstract description 42
- 230000000798 anti-retroviral effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 abstract 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 11
- 231100000334 hepatotoxic Toxicity 0.000 description 11
- 230000003082 hepatotoxic effect Effects 0.000 description 11
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 10
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 9
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 6
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 101150010738 CYP2D6 gene Proteins 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 101150053089 GSTM1 gene Proteins 0.000 description 3
- 101150111575 GSTT1 gene Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 2
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 101150008380 gstp1 gene Proteins 0.000 description 2
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000002974 pharmacogenomic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 101150066516 GST gene Proteins 0.000 description 1
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 1
- 102100030943 Glutathione S-transferase P Human genes 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 101001010139 Homo sapiens Glutathione S-transferase P Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- ARCJQKUWGAZPFX-KBPBESRZSA-N S-trans-stilbene oxide Chemical compound C1([C@H]2[C@@H](O2)C=2C=CC=CC=2)=CC=CC=C1 ARCJQKUWGAZPFX-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000002247 constant time method Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 108010032440 glutathione S-transferase M1 Proteins 0.000 description 1
- 108010027853 glutathione S-transferase T1 Proteins 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000010197 meta-analysis Methods 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 208000008338 non-alcoholic fatty liver disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001050 pharmacotherapy Methods 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000009120 supportive therapy Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000721 toxic potential Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
Abstract
Группа изобретений относится к биотехнологии. Описан способ прогностической оценки гепатотоксичности у ВИЧ-инфицированных лиц при антиретровирусной терапии. Способ основан на определении делеционного полиморфизма генов биотрансформации ксенобиотиков человека. Он предусматривает экстракцию ДНК из биологического материала с последующим проведением полимеразной цепной реакции для целевых генов и эталонного нормировочного гена с использованием набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и соответствующих флуоресцентно меченых зондов, комплементарных участкам выявляемых фрагментов. Также описан набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых зондов для проведения амплификации целевых генов GSTM1, GSTT1, CYP2D6 и эталонного нормировочного гена RPP30. Технический результат заявленного изобретения заключается в создании способа определения наследственной предрасположенности человека к проявлению гепатотоксичности антиретровирусных препаратов. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 3 пр.
Description
Группа изобретений относится к биотехнологии и медицине, а именно к инфекционным болезням и медицинской генетике, в частности к проблеме прогностической оценки развития гепатотоксических побочных эффектов у ВИЧ-инфицированных лиц при терапии антиретровирусными препаратами. Диагностику проводят с использованием ДНК, выделенной из цельной крови или сухих пятен крови (сухой капли крови).
Низкая приверженность лечению при антиретровирусной терапии (APT) ВИЧ - наиболее частая причина прекращения APT - зависит от многих факторов, в том числе медицинских: токсичность используемых лекарств, приводящая к побочным реакциям при приеме препаратов и, соответственно, плохой переносимости лечения из-за проявлений гепатотоксичности [Мусатов В.Б., Яковлев А.А., Чайка Н.А., Келли Д., Амирханян Ю.А. Основные причины и современные методы коррекции низкой приверженности к антиретровирусной терапии у трудных пациентов. ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии. 2018. т. 10 (4). стр. 37-56. DOI: 10.22328/2077-9828-2018-10-4-37-56]. Гепатотоксичность представляет собой повреждение печени, вызванное чужеродными веществами (ксенобиотиками), в том числе лекарственными препаратами. Гепатотоксичность и ее выраженность зависят от токсического потенциала лекарственных препаратов, модифицируемых факторов риска и генетических особенностей пациента. В среднем, только у 25-30% ВИЧ-инфицированных лиц гепатотоксичность сопровождается клинически выраженными симптомами, однако значимое поражение печени может привести к тяжелым последствиям и летальному исходу [Журавлева М.В., Прокофьев А.Б., Подымова А.С., Бердникова Н.Г., Сереброва С.Ю., Демченкова Е.Ю. Контроль за нежелательными реакциями при проведении антиретровирусной терапии ВИЧ/СПИД при применении взаимозаменяемых лекарственных препаратов. Безопасность и риск фармакотерапии. 2017; 5(3): 126-132.]. Следует отметить, что понимание значимости гепатотоксичности при APT увеличивается с каждым годом в связи с распространенностью среди ВИЧ-инфицированных лиц хронических вирусных гепатитов В (ХГВ) и С (ХГС) [Останкова Ю. В., Щемелев А.Н., Зуева Е.Б., Чурина М.А., Валутите Д.Э., Семенов А.В. Молекулярная эпидемиология и фармакорезистентность ВИЧ у пациентов с вирусологической неэффективностью антиретровирусной терапии в Архангельской области. ВИЧ инфекция и иммуносупрессии. 2019. Том 11. №4. с. 65-72. http://dx.doi.org/10.22328/2077-9828-2019-11-4-79-90. Семенов А.В., Останкова Ю. В., Серикова Е.Н., Зуева Е.Б., Тотолян Арег А. Оптимизация алгоритма диагностики маркеров хронического гепатита В у пациентов с впервые выявленной ВИЧ-инфекцией. Клиническая лабораторная диагностика. 2020. 65(9). 574-579. doi: 10.18821/0869-2084-2020-65-9-574-579.], так как у таких больных на фоне терапии чаще развиваются гепатотоксические эффекты.
Согласно литературным данным, определение нулевых/делеционных мутаций генов GSTM1, GSTT1, CYP2D6 у ВИЧ-инфицированных лиц дает ценную прогностическую информацию в отношении возможного развития гепатотоксического эффекта при APT [Абдрашитов Р.Х., Гильдеева Г.Н., Раменская Г.В., Смирнов В.В. Обзор существующих методик оценки активности CYP2D6 с применением экзогенных и эндогенных маркеров. Фармакокинетика и Фармакодинамика. 2015; (1):4-11; Seidegard J, Vorachek WR, Pero RW, Pearson WR. Hereditary differences in the expression of the human glutathione transferase active on trans-stilbene oxide are due to a gene deletion. Proc Natl Acad Sci. 1988. 85:7293-7. doi: 10.1073/pnas.85.19.7293; Nefic H. The Genetic Variation of CYP2D6 Gene in the Bosnian Population. Med Arch. 2018 Dec;72(6):396-400. doi: 10.5455/medarh.2018.72.396-400; Sophonnithiprasert T, Saelee P, Pongtheerat T. GSTM1 and GSTT1 copy number variants and the risk to Thai females of hepatocellular carcinoma. J Gastrointest Oncol. 2019 Apr;10(2):324-329. doi: 10.21037/jgo.2018.09.14; Ivanov A.V., Valuev-Elliston V.T., Ivanova O.N., Kochetkov S.N., Starodubova E.S., Bartosch В., Isaguliants M.G. Oxidative Stress during HIV Infection: Mechanisms and Consequences. Oxid. Med. Cell. Longev. 2016; 2016:8910396. doi: 10.1155/2016/8910396; Singh H.O., Lata S., Angadi M., Bapat S., Pawar J., Nema V., Ghate M.V., Sahay S., Gangakhedkar R.R. Impact of GSTM1, GSTT1 and GSTP1 gene polymorphism and risk of ARV-associated hepatotoxicity in HIV-infected individuals and its modulation. Pharmacogenomics J. 2017. 17(l):53-60. doi: 10.1038/tpj.2015.88; Zhu Y, Yang JH, Hu JP, Qiao M. Association of glutathione S-transferases (GSTT1, GSTM1 and GSTP1) genes polymorphisms with nonalcoholic fatty liver disease susceptibility: A PRISMA-compliant systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 2022. 101(38):e30803. doi:10.1097/MD.0000000000030803]. Это позволяет выявлять пациентов для углубленного обследования, своевременного назначения адекватной поддерживающей терапии, а также проведения комплекса профилактических мероприятий.
Известен способ определения делеционных мутаций генов GSTM1 и GSTT1 у ВИЧ-инфицированных лиц для определения риска развития гепатотоксичности при APT [Singh Н.О., Lata S., Angadi M., Bapat S., Pawar J., Nema V., Ghate M.V., Sahay S., Gangakhedkar R.R. Impact of GSTM1, GSTT1 and GSTP1 gene polymorphism and risk of ARV-associated hepatotoxicity in HIV-infected individuals and its modulation. Pharmacogenomics J. 2017. 17(1):53-60. doi: 10.1038/tpj.2015.88.]. Известен «Набор реагентов для выявления генетических полиморфизмов в генах GSTT1 и GSTM1 человека методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле "АмплиСенс® GSTT1 / GSTMl-EPh"». Однако, методы, выявляющие только гомозиготные нулевые генотипы очевидно ограничены так как не позволяют определить гетерозиготы GSTM1+/0 и GSTT1+/0, ферментативная активность которых наличествует, но имеет сравнительно более низкий уровень, чем при гомозиготах GSTM1+/+и GSTT1+/+. Кроме того, ограничением является необходимость использования агарозного гель-электрофореза для детекции результатов. Известен способ определения мутаций гена CYP2D6, включая делеционную мутацию методом ПЦР с последующим секвенированием [Kim EY, Lee SS, Jung HJ, Jung HE, Yeo CW, Shon JH, Shin JG. Robust CYP2D6 genotype assay including copy number variation using multiplex single-base extension for Asian populations. Clin Chim Acta. 2010 Dec 14; 411(23-24):2043-8. doi: 10.1016/j.cca.2010.08.042.]. Очевидным ограничением метода является необходимость прямого секвенирования фрагмента генома, что редко возможно в рамках рутинной лабораторной диагностики.
Наиболее близким по сущности к заявляемому изобретению и выбранным за прототип является метод, предложенный в работе I. Girault с соавторами [Girault I, Lidereau R, Biche I. Trimodal GSTT1 and GSTM1 genotyping assay by real-time PCR. Int J Biol Markers. 2005 Apr-Jun; 20(2):81-86. doi: 10.5301/JBM.2008.2569.]. Согласно методу, выделяют ДНК, выделенную из лейкоцитов крови. Затем производят одновременную амплификацию участков генов GSTM1, GSTT1 и нормировочного гена, кодирующего альбумин (ALB) с использованием набора праймеров и зондов TaqMan, а также с использованием в качестве калибратора образцов гомозиготных по аллелям GSTM1 и GSTT1 дикого типа. Регистрируют полученные результаты посредством гибридизационно-флуоресцентной детекции и определяют в режиме реального времени относительное количество копий генов GSTM1, GSTT1 с использованием сравнительного метода СТ (ΔΔСТ), позволяющего измерять разницу СТ (ΔCT) между целевым и эталонным геном, а затем сравнивать значения ΔCT анализируемых образцов с образцом-калибратором, имеющим две копии целевой последовательности. Число копий мишени рассчитывается как удвоенное относительное количество. По результатам оценки относительного количества копий целевых генов делают вывод о наличии делеционного полиморфизма для каждого гена в гомо- или гетерозиготном состоянии. Недостатком способа является выявление делеционных мутаций только генов II фазы биотрансформации ксенобиотиков, но отсутствие выявления делеционной мутации генов I фазы. Недостатком способа является выбор нуклеотидной последовательности зонда GSTM1, имеющего сайты, за счет которых зонд может отжигаться на себя, тем самым снижая эффективность ПЦР. Недостатком способа является выбор комплекта олигодезоксирибонуклеотидных праймеров с различными температурами отжига, в результате чего эффективность ПЦР целевых и нормировочного гена отличаются.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является расширение арсенала способов, предназначенных для оценки на доклиническом этапе генетической предрасположенности человека к развитию гепатотоксических побочных эффектов при терапии с использованием антиретровирусных препаратов.
Технический результат - создание способа определения наследственной предрасположенности человека к проявлению гепатотоксичности антиретровирусных препаратов и расширение арсенала средств, используемых для прогноза гепатотоксичности при антиретровирусной терапии.
Авторами предложен способ, согласно которому ДНК выделяют из биологического материала, например, цельной крови или из сухой капли крови, а затем проводят мультиплексную постановку ПЦР участков генов GSTM1, GSTT1, CYP2D6 и эталонного нормировочного гена RPP30 с использованием следующих олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых зондов:
Состав амплификационной смеси представляет собой буферный раствор, содержащий Трис-HCl рН 8,8 (при 25°С), КО, 6-7 мМ MgCl2, дезоксинуклеозидтрифосфаты, глицерол, Tween 20, SynTaq ДНК-полимеразу с ингибирующими активность фермента антителами (или 1 ед. рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы, или Hot-start Taq ДНК-полимеразы).
ПЦР и детекцию результатов проводят при следующих условиях:
Параллельно с амплификацией анализируемых образцов проводят амплификацию контрольного образца, представляющего собой ранее охарактеризованный образец ДНК, в котором все три целевых гена дикого типа находятся в гомозиготном состоянии.
Первичный анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».
Анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по четырем каналам:
по каналу для флуорофора FAM регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента гена GSTM1;
по каналу для флуорофора HEX регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента гена GSTT1;
по каналу для флуорофора Су5 регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента гена CYP2D6;
по каналу для флуорофора ROX регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК RPP30.
Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (устанавливается в середине линейного участка прироста флуоресценции положительного контроля в логарифмической шкале), что определяет наличие (или отсутствие) для данной пробы значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов. Результат амплификации по каналу считается положительным, если кривая однократно пересекается с пороговой линией в области достоверного прироста флуоресценции, отрицательным в случае отсутствия пересечения кривой с пороговой линией (нет значения Ct), сомнительным во всех других случаях.
Анализ GSTM1, GSTT1, CYP2D6 проводят с нормализацией на эталонный ген RPP30, относительное число копий целевых генов определяют с использованием метода AΔCT [Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001 Dec;25(4):402-8. doi: 10.1006/meth.2001.1262.] в сравнении с охарактеризованным образцом-калибратором, имеющим две копии каждой из целевых последовательностей, на основании чего делают выводы о наличии аллеля дикого типа или делеционного полиморфизма в гетеро- или гомозиготном состоянии для каждого анализируемого гена и функциональной состоятельности соответствующих ферментов. При выявлении сочетания генотипов GSTM1 0/0 GSTT1 0/0, GSTM1 0/+ GSTT1 0/0, GSTM1 0/+ GSTT1 0/+, GSTM1 0/+ GSTT1 0/0 в присутствии CYP2D6 0/0 или CYP2D6 0/+делают вывод о наличии у обследуемого генетической предрасположенности к развитию гепатотоксического эффекта при антиретровирусной терапии.
Предложенный способ отличается от прототипа выявлением делеционных мутаций трех целевых генов, использованием нормировочного гена RPP30, набором олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и зондов.
Сущность изобретения поясняется чертежом, где на фиг. 1 представлены кривые флуоресценции, отражающие динамику образования продукта реакции в ходе амплификации всех анализируемых генов, включая три целевых гена и один нормировочный, при «диком» генотипе, то есть, каждый целевой ген гомозиготен по «дикой» аллели. А также чертежами, где на фиг. 2 представлен двухкопийный нормировочный ген RPP30 (ROX - ромбы), двухкопийный целевой ген GSTT1 (HEX - треугольники), однокопийный (0/+) целевой ген GSTM1 (FAM - кружок), целевой ген CYP2D6 с гомозиготной делеционной мутацией (Су5 - крест); где на фиг. З представлен двухкопийный нормировочный ген RPP30 (ROX - ромбы), двухкопийный целевой ген GSTT1 (HEX - треугольники), целевые гены GSTM1 (FAM -кружок) и CYP2D6 (Су5 - крест) с гомозиготной делеционной мутацией.
Ниже приведены примеры конкретного использования предложенного метода, являющиеся одним из возможных способов его реализации. Пример 1.
Были обследованы образцы крови 176 ВИЧ-инфицированных пациентов, проживающих в Северо-Западном федеральном округе, получавших две и более схем антиретровирусной терапии (APT), направленных в 2014-2016 гг.на определение лекарственной устойчивости вируса в связи с вирусологической неэффективностью APT; 112 образцов крови от лиц с впервые выявленной ВИЧ-инфекцией; 123 пациента без ВИЧ, вирусных гепатитов и клинических проявлений хронических и/или острых заболеваний, включая гепатотоксические проявления. Частоты гомозиготных делеций GSTM1 и GSTT1 у пациентов с неэффективной APT составили 41,47% и 44,88%, соответственно, сочетанный генотип GSTM1 0/0+ GSTT1 0/0 - 22,15% от группы. В контрольной группе сочетанный генотип GSTM1 0/0+ GSTT1 0/0 - 12,19% от группы. При анализе распределения генотипов: GSTM1 0/0+ GSTT1+/-, GSTM1+/-+ GSTT1 0/0, GSTM1 0/0+ GSTT1 0/0, GSTM1+/-+ GSTT1+/- выявлены достоверные отличия между контрольной группой и ВИЧ-инфицированными лицами с неэффективной APT -%2=18,103, df3, р=0,0004. Распределение генотипов генов GST в группе пациентов с впервые выявленной инфекцией ВИЧ не отличалось от такового в контрольной группе. Показан риск неэффективности APT при сочетанном генотипе GSTM1 0/0+ GSTT1 0/0 - OR=2,05, р<0,05. Риск вирусологической неэффективности APT при GSTM1 0/- GSTT1 0/- CYP2D6 0/- более чем в пять раз выше, чем у лиц с генотипом GSTM1+/+ GSTT1+/+CYP2D6+/+-OR=5,7, р<0,05.
Пример 2.
Большая часть ВИЧ-инфицированных больных с низкой приверженностью APT сообщали о гепатотоксических проявлениях лечения антиретровирусными препаратами. Среди 400 ВИЧ-инфицированных лиц с низкой приверженностью терапии у 332 человек, что составило 83% обследованных, был представлен по крайней мере один из целевых генов GSTM1, GSTT1, CYP2D6 с делеционной мутацией в гомозиготном состоянии. У 278 человек (69,5%) одновременно выявляли делеционную мутацию другого целевого гена в гомо- или гетерозиготном состоянии. У 161 (40,25%) ВИЧ-инфицированных больных с низкой приверженностью APT были выявлены сочетания генотипов GSTM1 0/0 GSTT1 0/0, GSTM1 0/+ GSTT1 0/0, GSTM1 0/+ GSTT1 0/+, GSTM1 0/+ GSTT1 0/0 в присутствии CYP2D6 0/0 или CYP2D6 0/+.
Пример 3.
Обследованы 297 ВИЧ-инфицированных лиц на антиретровирусной терапии с гепатотоксическими проявлениями различной степени тяжести. Показано, что в 87,88% случаев у пациентов с гепатотоксическими проявлениями был представлен по крайней мере один из целевых генов GSTM1, GSTT1, CYP2D6 с делеционной мутацией в гомозиготном состоянии. У 92,22% лиц с тяжелыми гепатотоксическими проявлениями выявляли следующие сочетания целевых генов: GSTM1 0/0 GSTT1 0/0 CYP2D6 0/0, GSTM1 0/0 GSTT1 0/0 CYP2D6 0/+, GSTM1 0/+ GSTT1 0/0 CYP2D6 0/0, GSTM1 0/0 GSTT1 0/+CYP2D6 0/0, GSTM1 0/+ GSTT1 0/0 CYP2D6 0/+, GSTM1 0/0 GSTT1 0/+CYP2D6 0/+. При оценке риска развития тяжелых гепатотоксических эффектов показано, что OR=16,21, р<0,05 при сочетанном генотипе GSTM1 0/0 GSTT1 0/0 CYP2D6 0/0.
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="1.xml"
softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.2.0"
productionDate="2023-02-20">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>2022130994/20(067648)</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2022-11-28</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное бюджетное учреждение
науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт
эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по
надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия
человека»</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Saint-Petersburg Pasteur
Institute</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">СПОСОБ ПРОГНОСТИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ
ГЕПАТОТОКСИЧНОСТИ У ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ ЛИЦ ПРИ АНТИРЕТРОВИРУСНОЙ
ТЕРАПИИ НА ОСНОВЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕЛЕЦИОННОГО ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ
БИОТРАНСФОРМАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ GSTM1, GSTT1, CYP2D6 ЧЕЛОВЕКА И НАБОР
ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ И ФЛУОРЕСЦЕНТНО МЕЧЕНЫХ
ЗОНДОВ</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>12</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q30">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Forward PCR primer</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q3">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cacctgcattcgttcatgtgac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q31">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Forward PCR primer</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q5">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gtcccagagcacctcacc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q32">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Forward PCR primer</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q7">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgagcccatctgggaaaca</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>16</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..16</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q33">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Forward PCR primer</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q9">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tttggacctgcgagcg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q34">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Reverse primer PCR</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q11">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aagcaagagcagagaggagac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q35">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Reverse primer PCR</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q13">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gtgtgcatcattctcattgtgg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q36">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Reverse primer PCR</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q15">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggtgtcccagcaaagttcatg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="8">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q37">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Reverse primer PCR</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q17">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gagcggctgtctccacaagt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="9">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q29">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Oligonucleotide fluorescent probe
carrying a FAM fluorophore at the 5' end and a dark quencher
RTQ1 or BHQ1 at the 3' end</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q19">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gccatgagcaggcacagtgagtgc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="10">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q26">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Oligonucleotide fluorescent probe
carrying a HEX fluorophore at the 5' end and a dark quencher
RTQ1 or BHQ1 at the 3' end</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q21">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>caccatccccaccctgtcttcca</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="11">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q27">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Oligonucleotide fluorescent probe
carrying a Cy5 fluorophore at the 5' end and a dark quencher
RTQ2 or BHQ2 at the 3' end</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q23">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cagtgcaggggccgagggag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="12">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q28">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Oligonucleotide fluorescent probe
carrying a ROX fluorophore at the 5' end and a dark quencher
RTQ2 or BHQ2 at the 3' end</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q25">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ttctgacctgaaggctctgcgcg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (4)
1. Способ прогностической оценки гепатотоксичности у ВИЧ-инфицированных лиц при антиретровирусной терапии на основе определения делеционного полиморфизма генов биотрансформации ксенобиотиков человека, предусматривающий экстракцию ДНК из биологического материала с последующим проведением полимеразной цепной реакции для целевых генов и эталонного нормировочного гена с использованием набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и соответствующих флуоресцентно меченых зондов, комплементарных участкам выявляемых фрагментов, отличающийся тем, что используют: GSTM1F-cacctgcattcgttcatgtgac, GSTM1R-aagcaagagcagagaggagac, GSTM1zondFAM-FAM-gccatgagcaggcacagtgagtgc-RTQ1/BHQ1, GSTT1F-gtcccagagcacctcacc, GSTT1R-gtgtgcatcattctcattgtgg, GSTT1zondHEX-HEX-caccatccccaccctgtcttcca-BHQ1, CYP2D6*5F-tgagcccatctgggaaaca, CYP2D6*5R-ggtgtcccagcaaagttcatg, CYP2D6*5zondCy5-Cy5-cagtgcaggggccgagggag-RTQ2/BHQ2, RPP30F-tttggacctgcgagcg, RPP30R-gagcggctgtctccacaagt, RPP30-zondROX-ROX-ttctgacctgaaggctctgcgcg-RTQ2/BHQ2, при этом анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени», анализ целевых генов проводят с нормализацией на эталонный ген, относительное число копий целевых генов определяют с использованием метода ΔΔСТ в сравнении с охарактеризованным образцом-калибратором, имеющим две копии каждой из целевых последовательностей, на основании чего делают выводы о наличии аллеля дикого типа или делеционного полиморфизма в гетеро- или гомозиготном состоянии для каждого анализируемого гена и функциональной состоятельности соответствующих ферментов.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что проводят одновременную амплификацию в одной емкости участков трех целевых генов GSTM1, GSTT1, CYP2D6 и эталонного нормировочного гена, тем самым выявляя среди анализируемых образцов образцы с гетеро- и гомозиготными делеционными мутациями целевых генов.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве нормировочного гена используют ген белковой субъединицы р30 рибонуклеазы Р (RPP30), имеющий постоянный уровень в цельной крови и в сухой капле крови, зависящий только от количества клеток во всех образцах вне зависимости от индивидуальных особенностей пациентов.
4. Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых зондов для проведения амплификации целевых генов GSTM1, GSTT1, CYP2D6 и эталонного нормировочного гена RPP30: GSTM1F-cacctgcattcgttcatgtgac, GSTM1R-aagcaagagcagagaggagac, GSTM1zondFAM-FAM-gccatgagcaggcacagtgagtgc-RTQ1/BHQ1, GSTT1F-gtcccagagcacctcacc, GSTT1R-gtgtgcatcattctcattgtgg, GSTT1zondHEX-HEX-caccatccccaccctgtcttcca-BHQ1, CYP2D6*5F-tgagcccatctgggaaaca, CYP2D6*5R-ggtgtcccagcaaagttcatg, CYP2D6*5zondCy5-Cy5-cagtgcaggggccgagggag-RTQ2/BHQ2, RPP30F-tttggacctgcgagcg, RPP30R-gagcggctgtctccacaagt, RPP30-zondROX-ROX-ttctgacctgaaggctctgcgcg-RTQ2/BHQ2.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2807530C1 true RU2807530C1 (ru) | 2023-11-16 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2519148C2 (ru) * | 2007-03-26 | 2014-06-10 | Новартис Аг | Биомаркеры и биомаркерные признаки почечной сохранности, обладающие предсказательной силой, для использования в мониторинге состояния почек |
| CN104024433B (zh) * | 2011-10-31 | 2016-11-16 | 爱科来株式会社 | 基因丰度的测定方法 |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2519148C2 (ru) * | 2007-03-26 | 2014-06-10 | Новартис Аг | Биомаркеры и биомаркерные признаки почечной сохранности, обладающие предсказательной силой, для использования в мониторинге состояния почек |
| CN104024433B (zh) * | 2011-10-31 | 2016-11-16 | 爱科来株式会社 | 基因丰度的测定方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Bediaga, Naiara & Alfonso-Sanchez, Miguel & de Renobales, Mertxe & Pablo, AM & Arroyo, Marta & M. de Pancorbo, Marian. (2008). GSTT1 and GSTM1 gene copy number analysis in paraffin-embedded tissue using quantitative real-time PCR. Analytical biochemistry. 378. 221-3. 10.1016/j.ab.2008.04.010. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Snow et al. | Analysis of a CGG sequence at the FMR-1 locus in fragile X families and in the general population. | |
| JP5262230B2 (ja) | 新規多型検出法 | |
| Lessard et al. | The genomics of autoimmune disease in the era of genome-wide association studies and beyond | |
| Kariyazono et al. | Rapid detection of the 22q11. 2 deletion with quantitative real-time PCR | |
| US20100092959A1 (en) | Single nucleotide polymorphisms as genetic markers for childhood leukemia | |
| CN112760414A (zh) | 引物组及其用途 | |
| WO2014063433A1 (zh) | Hla-b*1301等位基因的用途 | |
| Fiorentino | Molecular genetic analysis of single cells | |
| RU2807530C1 (ru) | Способ прогностической оценки гепатотоксичности у ВИЧ-инфицированных лиц при антиретровирусной терапии на основе определения делеционного полиморфизма генов биотрансформации ксенобиотиков GSTM1, GSTT1, CYP2D6 человека и набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых зондов | |
| JPWO2011148715A1 (ja) | 正常眼圧緑内障疾患感受性遺伝子及びその利用 | |
| JP5427352B2 (ja) | ヒト体脂肪量と関連する遺伝子多型に基づく肥満発症リスクの判定方法 | |
| CN110863040A (zh) | 用于荧光定量pcr检测cyp3a5基因多态性的方法 | |
| TWI351436B (en) | Method for detecting a risk of the development of | |
| RU2402771C2 (ru) | Способ скрининга сердечно-сосудистых заболеваний и биочип для осуществления этого способа | |
| Ohori et al. | Complex chromosomal 6q rearrangements revealed by combined long-molecule genomics technologies | |
| RU2805861C1 (ru) | Способ генотипирования гена TLR2 по полиморфизму rs5743708 и набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для его реализации | |
| Kucińska et al. | The Use of CGH Arrays for Identifying Copy Number Variations in Children with Autism Spectrum Disorder | |
| RU2777663C1 (ru) | Количественный метод определения экспрессии аллелей GNAO1 здоровой формы и с мутацией c.607 G>A | |
| Shi et al. | Genetic analysis of chromosome 22q11. 2 markers in congenital heart disease | |
| CN105765077B (zh) | 测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症风险的检测方法以及测定用试剂盒 | |
| JP2010522560A (ja) | Ｈｉｖ疾患制限に関連する遺伝的変異体 | |
| Abelleyro et al. | Reliable and cost-effective approach for diagnosis of heterozygous F8/F9 large deletions by quantitative real-time PCR | |
| Rahman et al. | Angiotensinogen Gene M235T and T174M Polymorphisms in Diabetic Nephropathy in a Bangladeshi Population | |
| EP2823054B1 (en) | Genetic factors in blood pressure | |
| Diop et al. | Genomic approach of AIDS pathogenesis: exhaustive genotyping of the TNFR1 gene in a French AIDS cohort |