KR101586847B1 - 조직 및 혈액을 이용한 유방암의 치료제 선별 검사 및 조기진단을 위한 역전사 정량적 중합효소연쇄반응 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 조직 및 혈액을 이용한 유방암의 치료제 선별 검사 및 조기진단을 위한 방법 및 그 역전사 정량적 중합효소연쇄반응 키트에 관한 발명이다.

Description

조직 및 혈액을 이용한 유방암의 치료제 선별 검사 및 조기진단을 위한 역전사 정량적 중합효소연쇄반응 키트{Method of providing information for early diagnosis of breast cancer with reverse transcription quantitative PCR and diagnostic kit using tissue and blood}

본 발명은 조직 및 혈액을 이용한 유방암의 치료제 선별 검사 및 조기진단을 위한 방법 및 그 역전사 정량적 중합효소연쇄반응 키트에 관한 발명이다.

Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)는 ErbB-like oncogene family로 HER2 검사는 유방암 치료에 있어서 매우 중요하다 (Di Fiore PP, et al. (1987) Cell 51(6):1063-1070.). 특히 HER2의 과 발현은 유방암 환자의 20~30% 발견되며 이러한 환자들은 예후가 좋지 못하고, 더 극심한 유방암 양상을 나타내게 되며 그렇지 못한 환자들에 비하여 5년 생존률이 감소한다(Revillion F, Lhotellier V, Hornez L, Bonneterre J, & Peyrat JP (2008) Ann Oncol 19(1):73-80.). 이러한 HER2 과발현 환자의 치료를 위해서 Herceptin (Roche)을 사용하고 있다. Herceptin은 humanized monoclonal antibody로써 HER2 receptor의 extracellular domain을 직접적으로 타깃하고 있으며, 현재 전이성 유방암환자의 치료와 neo-adjuvant 환자의 치료에 있어서 화학적 요법으로 사용되고 있다 (Piccart-Gebhart MJ (2006) Eur J Cancer 42(12):1715-1719.).

암환자의 진단에 있어서 암의 병기, 예후 또는 치료제 선별에 있어서 가장 Gold standard로 사용되는 것은 형광동소보합법 (FISH)와 면역조직화학염색법 (IHC)이 사용되고 있다. 특히 HER2의 과발현 진단에 있어서 IHC법은 암세포 표면에 HER2 단백질의 과발현 유무를 나타내는 방법으로 사용되고, FISH 법은 chromosome상의 HER2 유전자의 과 발현 유무를 알아보는 방법으로 사용되고 있다 (Sauerbrei W, et al. (2000) J Clin Oncol 18(1):94-101.). 특히 IHC법은 일차적인 선별 검사로 가장 널리 사용되고 있는 방법이나, 각 검사 기관별로 차이가 있고, 기술적인 정확성이나 결과의 재연성에서 논란이 대상이 되고 있다. 또한 FISH법은 IHC법에 비해 결과의 일치율이 좋고, 민감도 및 특이도에서 IHC 법보다 더 좋다고 알려져 있다. 그러나 검사과정이 매우 복잡하고 형광을 이용한 검사법이기 때문에 그 결과의 영구보존이 불가능하다고 알려져 있다. 또한 형광 probe의 값이 매우 비싸기 때문에 규모가 작은 병원등에서는 수행이 불가능하다고 알려져 있다(Lewis F, et al. (2004) Histopathology 45:207-17).

관련 선행특허로 대한민국특허공개번호 제1020090079845호는 '유방암 모니터링，진단 및 스크리닝용 단백질 마커 및 이를 이용한 유방암 모니터링，진단 및 스크리닝 방법'에 관한 것과, 대한민국특허공개번호 제1020090064378호는 '유방암 관련 유전자 및 폴리펩티드'에 관한것이 있다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 역전사 정량적 중합반응을 이용한 유방암의 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 유방암진단용 키트를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 a) 암 의심환자의 조직 또는 혈액에서 얻은 세포로부터 전장 RNA를 분리하는 단계;b) 상기 분리된 전장 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계;c) 상기 합성된 cDNA를 인간 표피 증식인자 수용체 (HER) 2를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브, 사이토케라틴 19를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브, 상피세포부착분자(EpCAM)를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브, 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT)를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브,Ki67를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브, 및 비멘틴(Vimentin)을 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머쌍 및 프로브,및 글리세르알데히드 -3-인산 탈수소효소(GAPDH)를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브를 이용하여 실시간-PCR을 수행하는 단계; 및 d) 상기 증폭된 양을 정상인에 대해 발현된 양과 비교하는 단계;를 포함하는 유방암의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

일반적으로 사용되는 전장 RNA(Total RNA)를 분리하는 방법 및 이로부터 cDNA를 합성하는 방법은 공지된 방법을 통해 수행될 수 있으며, 이 과정에 대한 자세한 설명은 Joseph Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); 및 Noonan, K.F. 등에 개시되어 있어 본 발명의 참조로서 삽입될 수 있다.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속,철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그널을 직접 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열(HER 2, 및 GAPDH 유전자 등)은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광, 화학발광단 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나,이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine) Cy-5 또는 Cy-3일 수 있다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단 및/또는 3' 말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 RT-PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다.

또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 RT-PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용할 수 있다.

표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정,중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

본 발명의 한 측면에 따르면, 본 발명에서는 RT-PCR을 통해 mRNA 수준에서 발현수준을 측정하게 된다. 이를 위하여 상기 HER 2, 및 GAPDH 유전자 등에 특이적으로 결합하는 신규한 프라이머 쌍과 형광이 표지된 프로브가 요구되며, 본 발명에서 특정한 염기서열로 특정된 해당 프라이머 및 프로브를 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 이들 유전자에 특이적으로 결합하여 검출가능한 시그널을 제공하여 RT-PCR을 수행할 수 있는 것이면, 제한 없이 사용될 수 있다. 상기에서 FAM과 Quen(Quencher)는 형광염료를 의미한다.

본 발명에 적용되는 RT-PCR 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 공지의 과정을 통해 수행될 수 있다.

mRNA 발현수준을 측정하는 단계는 통상의 mRNA 발현수준을 측정할 수 있는 방법이면 제한 없이 사용될 수 있으며, 사용한 프로브 표지의 종류에 따라 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 real-time RT-PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 RT-PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 상기 RT-PCR을 통해 증폭된 PCR 산물에 형광이 표지된 프로브가 붙어 특정 파장의 형광을 내게 되고, 증폭과 동시에 PCR 장치의 형광 측정기에서 본 발명의 유전자들의 mRNA 발현수준을 실시간으로 측정하고, 측정된 값이 계산되어 PC를 통해 시각화 되게 되어 검사자는 쉽게 그 발현 정도를 확인할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면 상기 진단 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 유방암 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 상기 본 발명의 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이일 수 있다.

그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "암 진단을 위한 정보제공방법"은 진단을 위한 예비적 단계로서 암의 진단을 위하여 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다.

용어 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.

용어 "프로브"는 단일쇄 핵산 분자이며, 타깃 핵산 서열에 상보적인 서열을 포함한다.

용어 "실시간 역전사 중합효소 반응(realtime RT-PCR)"이라 함은 역전사효소를 이용하여 RNA를 상보적인 DNA(cDNA)로 역전사 시킨 후에 만들어진 cDNA를 주형(template) 으로하여 타겟 프라이머와 표지를 포함하는 타겟 프로브를 이용해 타겟을 증폭함과 동시에 증폭된 타겟에 타겟 프로프의 표지에서 발생하는 신호를 정량적으로 검출해 내는 분자생물학적 중합방법이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 증폭된 양을 정상인에 대해 증폭된 양과 비교하는 단계는 표준 또는 컷오프 값에 의하여 수행되는 것이 바람직하고, 상기 방법은 상기 GAPDH Ct 값을 30이하로 하고, 여기에서 Ct값이란 PCR과정 중 증폭이 뚜렷하게 증가되기 시작한 사이클의 수치를 의미하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 인간 표피 증식인자 수용체 (HER) 2를 증폭할 수 있는 프라이머쌍은 서열번호 1 내지 2, 3 내지 4, 또는 6 내지 7에 기재되고, 프로브는 서열번호 5, 8 또는 9에 기재되고, 사이토케라틴 19를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브는 각각 서열번호 13 내지 14, 및 15에 기재되고, 상피세포부착분자(EpCAM)를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브는 각각 서열번호 16 내지 17, 및 18에 기재되고, 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT)를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브는 각각 서열번호 19 내지 20, 및 21에 기재되고, ,Ki67를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브는 각각 서열번호 22 내지 23, 및 24에 기재되고, 비멘틴(Vimentin)을 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브는 각각 서열번호 25 내지 26, 및 27에 기재된 프라이머쌍 및 프로브인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니하며,

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 GAPDH를 증폭할 수 있는 프라이머쌍은 서열번호 10 및 11에 기재되고, 프로브는 서열번호 12에 기재된 염기서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 인간 표피 증식인자 수용체 (HER) 2를 증폭할 수 있는 서열번호 1 내지 2, 3 내지 4, 또는 6 내지 7에 기재된 프라이머쌍, 및 서열번호 5, 8 또는 9에 기재된 프로브, 사이토케라틴 19를 증폭할 수 있는 서열번호 13 내지 14의 프라이머쌍 및 서열번호 15에 기재된 프로브, 상피세포부착분자(EpCAM)를 증폭할 수 있는 서열번호 16 내지 17의 프라이머쌍 및 서열번호 18의 프로브, 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT)를 증폭할 수 있는 서열번호 19 내지 20의 프라이머쌍 및 서열번호 21의 프로브, ,Ki67를 증폭할 수 있는 서열번호 22 내지 23의 프라이머쌍 및 서열번호 24의 프로브, 비멘틴(Vimentin)을 증폭할 수 있는 서열번호 25 내지 26의 프라이머쌍 및 서열번호 27의 프로브로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머쌍 및 프로브;및 GAPDH를 증폭할 수 있는 서열번호 10 및 11에 기재된 프라이머쌍과 서열번호 12에 기재된 프로브를 포함하는 유방암의 진단을 위한 프라이머쌍 및 프로브를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 프로브의 5'말단은 형광물질로 표지된 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하는 유방암 진단용 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 조성물을 포함하는 유방암 진단용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 조성물을 포함하는 유방암 조기 또는 병기별 진단용 키트를 제공한다.

이하 본 발명을 설명한다.

이러한 부분을 대체하기 위하여 간편하고 정량적인 결과를 도출할 수 있는 RT-qPCR법을 기초로 하여 reference gene인 GAPDH를 이용한 HER2 유전자를 증폭한 후 나타난 발현양을 비교 정량하여 발현율을 기존의 방법인 IHC와 FISH 결과와 비교하여 보았다. 뿐만 아니라 효과적인 치료를 위하여 조직 검체 뿐만 아니라 혈액 내에서 발현하는 HER2와 혈액 내 암 관련 마커의 발현 양상을 통하여 더 효과적인 유방암 치료 및 진단에 도움을 주고자 본 발명을 완성하였다.

본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 조직 검체 뿐만 아니라 혈액 내에서 발현하는 HER2와 혈액 내 암 관련 마커의 발현 양상을 통하여 더 효과적인 유방암 치료 및 진단에 도움을 줄 수 있다.

도 1은 SK-BR-3 세포주를 이용한 RT-qPCR의 HER2 민감도 확인
도 2는 유방암 세포주를 이용한 HER2 mRNA의 발현양상 비교
도 3은 HER2 RT-qPCR과 HER2 IHC간의 상관 분석 결과
도 4는 임상적 Cut-off 결정을 위한 ROC curve 분석법
도 5는 ROC curve 분석법을 이용한 임상적 Cut-off의 설정
도 6은 RT-qPCR을 이용한 임상 검체의 결과
도 7은 정상인 혈액에 SK-BR-3를 섞어준 후 HER2 RT-qPCR의 민감도 확인
도 8은 정상인 그룹과 유방암 환자 그룹의 혈액 내 HER2 발현 비교
도 9는 혈액 내에서 암관련 마커의 발현 양상 비교
도 10은 정상인과 유방암 환자의 혈액 내 암관련 마커의 발현 여부 비교
도 11은 RT-qPCR을 이용한 혈액 내 암관련 마커와 혈액 내 HER2 발현양상의 비교
도 12는 혈액 내 HER2 발현 및 Ki67과 hTER의 발현양상의 상관 관계 분석
도 13은 Histological grade와 hTERT와 Ki67의 상관 관계 분석
도 14는 조직학적 HER2의 발현과 혈액 내 HER2의 발현 양상의 비교
도 15는 유방암 환자의 병기별 상피성 항원의 발현 양상 확인
도 16은 유방암 병기별 세포 내 암 관련 마커의 발현양상 확인

이하, 본 발명의 실시예에 대하여 첨부된 도면을 참조하면서 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 치료제 선별 검사를 위한 조직 검사법

1) 재료

2010년부터 2011년까지 신촌 세브란스병원에서 199명의 환자의 FFPE (Formalin Fixed Paraffin Embbeded) 조직을 이용하였다. 환자의 조직학적 HER2의 발현여부는 면역조직화학 염색법 (IHC)과 형광동소보합법 (FISH)을 수행하여 확인하였다. 또한 HER2의 발현 여부를 확인하기 위하여 유방암 Cell line인 SK-BR3, MCF7, MDA-MB 231을 사용하여 HER2의 발현 여부를 확인하였다.

2) 면역조직화학염색법 (Immunohistochemistry ; IHC)

파라핀 블록을 4 ㎛ 두께로 박절하여 슬라이드에 부착시키고 충분히 건조시킨 후 BenchMark ST (Ventana medical system, USA) 자동면역염색기기를 이용하여 면역조직화학염색을 시행하였다. 일차항체는 polyclonal rabbit anti-human c-erbB-2 oncoprotein (A0485, DakoCytomation, Glostrup, Denmark)을 1:1,000으로 희석하여 이용하였다. 이러한 방법으로 슬라이드를 염색한 후 암세포의 세포막에 HER2 단백질이 염색되는 정도에 따라 4가지 등급, 즉 0, 1+, 2+, 3+으로 나누어 판정하였다. 그 중에서 0, 1+ 일 경우 HER2 음성으로 진단하고, 3+ 일 경우 양성으로 진단하였으며, 2+일 경우 환자의 임상정보에 따라 양성 혹은 FISH를 수행하여 진단을 하였다.

3) 형광동소보합법 (Fluorescence in situ Hybridization ; FISH)

HER2 IHC법에서 2+가 나온 환자를 대상으로 하여, 파라핀으로 고정되어 있는 조직 블록을 microtome을 이용하여 4 ㎛ 두께로 박절하여 슬라이드에 부착시킨 후, 탈파라핀화 및 함수 과정을 거쳐 상용화된 HER2 DNA probe kit (Vysis Inc, Downers Grove, IL, USA)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 실험을 진행하였다. HER2 발현 여부는 유전자 발현 정도에 따라서 Amplification Index가 2.2 이상일 경우 양성으로 판독하였다.

4) 분리된 조직에서 Total RNA 분리

FFPE 조직을 10 ㎛의 두께로 박절한 2장의 조각을 이용하여, 탈파라핀화 과정을 거친 후 자동핵산 추출 장비인 MagNApure LC RNA Isolation Kit III (Roche) 를 이용하여 RNA를 추출하였다.

Cell line의 경우 각각의 Cell line의 세포 수를 1 x 10⁶으로 맞춘 후 Trizol을 이용하여 제조 업체의 프로토콜에 따라 Total RNA를 분리 하였다. 분리한 Total RNA는 NanoQuant system (TECAN)을 이용하여 정량 하였다.

5) 분리된 Total RNA로부터 cDNA 제작 및 Real-time PCR 수행

ㄱ. cDNA 합성

분리된 total RNA 0.5~3ug, random primer (Invitrogen) 0.25 ug, dNTP(Intron) 250 uM, Tris-HCl(pH 8.3) 50 mM, KCl 75 mM, MgCl₂ 3 mM, DTT 8 mM 와 MMLV 역전사 중합효소 200 units (Invitrogen)을 첨가하고 최종부피를 30 ul가 되도록 DEPC treated DW를 넣고 잘 섞은 후 합성 반응액을 thermocycler (ABI)에서 25℃에서 10 분, 37℃에서 50 분, 70℃에서 15 분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다.ㄴ. RT-qPCR 수행

Real-time PCR의 반응물의 조성은 25 mM TAPS (pH 9.3 at 25°C), 50 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM 2-mercaptoethanol, 200 μM each dNTP, 1 unit Taq polymerase (TAKARA)와 Forward primer와 Reverse primer를 각각 10pmole을 넣어주고, probe 또한 10pmole을 넣어 주고, 합성된 cDNA를 2ul를 넣고 최종 부피를 20ul가 되게 수행한다. 각각의 프라이머와 프로브의 염기서열은 다음과 같다.

HER2 primer와 Probe

Forward (1) : 5'AACCTGGAACTCACCTACCTGCCCAC-3(서열번호 1)

Reverse (1) : 5'CGATGAGCACGTAGCCCTGCAC-3(서열번호 2)

Forward (2) : 5'AACTCACCTACCTGCCCACCAAT-3(서열번호 3)

Reverse (2) : 5'CACGTAGCCCTGCACCTCCT-3(서열번호 4)

Probe (1) : 5'FAM-CAGCCTGTCCTTCCTGCAGGATATC-BHQ1-3(서열번호 5)

Forward (3) : 5'AAGCATACGTGATGGCTGGTGT-3(서열번호 6)

Reverse (3) : 5'TCTAAGAGGCAGCCATAGGGCATA-3(서열번호 7)

Probe (2) : 5'FAM-ATATGTCTCCCGCCTTCTGGGCATCT-BHQ1-3(서열번호 8)

Probe (3) : 5'FAM-CATCCACGGTGCAGCTGGTGACACA-BHQ1-3(서열번호 9)

GAPDH Primer와 프로브

Forward : 5'CCATCTTCCAGGAGCGAGATCC-3(서열번호 10)

Reverse : 5'ATGGTGGTGAAGACGCCAGTG-3(서열번호 11)

Probe : 5'FAM-TCCACGACGTACTCAGCGCCAGCA-BHQ1-3(서열번호 12)

PCR 반응은 ABI 7500Fast (Applied Biosystem) 이용하여 변성 온도 94℃에서 5분 동안 1회 수행하고, 변성 온도 95℃에서 30초, 어닐링 온도 60℃에서 10사이클을 먼저 수행한 후 다시 95℃에서 30초 , 55℃에서 40초인 사이클을 40회 반복하여 수행하였다. 또한 각각의 어닐링 과정 후 형광을 측정하는 과정을 추가하여, 각 사이클 별로 증가되는 형광 값을 측정하였다.

6. 결과의 분석

각 실험의 결과는 7500 software v2.0.4 (Applied Biosystem)을 이용하여 분석 하였다. 유방암 세포인 SK-BR3을 10⁵ 부터 1세포 까지 단계적으로 희석하여 상대적 정량 곡선을 그려서 Ct value를 이용하여 발현양을 비교 정량하여 발현율을 살펴 보았다. 이때 GAPDH의 발현양을 기준으로 하여 각각의 HER2의 발현양을 비교 하였고, HER2 음성 유방암 세포 주인 MDA-MB-231의 HER2 발현양을 1로 기준을 정한 후 각 검체 및 세포주의 HER2의 발현양을 제시하였다.

7. Software 분석을 통한 증폭여부 확인 및 증폭된 산물의 정량

qRT-PCR의 특정유전자 발현량을 정량하는 방법 중 하나인 Comparative Ct Method를 이용하여 하기 관계식에 의거하여 측정하였고 이 공식은 ABI 7500 software-Bio-Rad CFX Manager Software에 내재되어 있어 자동으로 계산되어 나온다.

[관계식 1]

ΔΔCt= ΔCt(sample) - ΔCt(reference gene)

여기에서 Ct값이란 PCR과정 중 증폭이 뚜렷하게 증가되기 시작한 Cycle의 수치를 나타낸다.

ΔΔCt는 하기 도 3에서 세로축의 수치(mRAN expression ratio)를 의미한다.

[관계식 2]

양성대조군에서 HER2의 발현량 분석 관계식

SKBR3의 Δ Ct 값 = SKBR3에서 HER2의 Ct 값 - SKBR3에서 reference gene (GAPDH)의 Ct 값

THP-1의 Δ Ct 값 = THP-1에서 HER2의 Ct 값 - THP-1에서 reference (GAPDH) gene의 Ct 값

R (발현량) = SKBR3의 ΔCt값 - THP-1의 ΔCt값

[관계식 3]

유방암 환자 조직 샘플에 대한 HER2의 발현량 분석 관계식

유방암 환자 조직에서의 ΔCt 값 = 유방암 환자 조직에서 HER2의 Ct 값 - 조직에서 reference(GAPDH) gene 의 Ct 값

THP-1의 ΔCt 값 = THP-1에서 HER2의 Ct 값 - THP-1에서 reference (GAPDH) gene의 Ct 값

R (발현량) = 유방암 환자 조직에서 ΔCt값 - THP-1에서의 ΔCt값

본 실험에서 사용된 reference gene의 Ct 값은 GAPDH에 대한 Ct값을 나타내며, reference gene이란 본 실험에 사용된 GAPDH이외에도 다른 house keeping gene이 포함될 수 있다.

SKBR3 : positive control 로써 실제로 HER2의 발현이 과발현 되었는지를 확인할 수 있다.

실시예 2. 혈액 내에서 암발현 마커의 분석

1) 검체

2011년부터 2012년 까지 연세대학교 세브란스 병원에서 제공받은 유방암 환자 188명의 혈액 및 유방암이 없는 정상인 기증자 50명의 혈액을 사용함.

2) 환자의 혈액에서 세포의 분리

암 환자 및 정상인의 정맥에서 혈액을 EDTA 항응고제가 들어있는 튜브를 사용하여 2 tube를 채취한다. 상피세포로부터의 오염을 방지 하기 위하여 처음 채취한 5 ml은 버리고 나중에 채취한 10 ml을 본 검사에 이용한다. 환자 혈액으로부터 mRNA 손상을 방지하기 위하여 혈액 채취 후 4 시간 이내에 첫 실험 과정인 적혈구 용해 과정을 시작하며, 혈액으로부터 적혈구를 용해하기 위해 NH₄Cl 154 mM, KHCO₃ 9 mM, EDTA 0.1 mM이 포함된 적혈구 용해 용액으로 5배 부피를 넣어 주고 vortex 후 상온에서 10분간 정치 후 10분간 4℃ 600g 에서 원심분리를 수행하고 상등액은 조심스럽게 버린다. 여분의 적혈구를 제거하기 위해 10 ml의 RBC lysis buffer를 넣고 5분간 ice에서 정치시킨 후 2분간 4℃ 3000rpm 에서 원심분리를 재차 수행 하고 상등액을 조심스럽게 버리고 1 ml PBS넣고 pellet을 재 부유 시킨 후 혈중에 있는 자유 핵산을 제거 해주기 위하여 RNase A (100 ug/ml)를 5분 간 처리 해 준다.

3) 분리된 세포로부터 Total RNA 분리

재 부유시킨 pellet 다시 2분간 4℃ 3000 rpm 에서 원심분리를 하고 상등액은 pipetting 으로 버린 후 Trizol reagent (Invitorogen) 1ml을 넣고 제조 업체의 프로토콜에 따라 Total RNA를 분리 하였다.

4) 분리된 Total RNA로부터 cDNA 제작 및 Real-time PCR 수행

ㄱ. cDNA 합성

분리된 total RNA 2 ug, Random Hexamer (Invitrogen) 0.25 ug, dNTP(Cosmo gene tech) 250 uM, Tris-HCl(pH 8.3) 50 mM, KCl 75 mM, MgCl₂ 3 mM, DTT 8 mM 와 MMLV 역전사 중합효소 200 units (Invitrogen)을 첨가하고 최종부피를 20 ul가 되도록 DEPC treated DW를 넣고 잘 섞은 후 합성 반응액을 thermocycler (ABI)에서 25℃에서 10 분, 37℃에서 50 분, 70℃에서 15 분간 반응시켜 cDNA를 합성한다.

ㄴ. Real-time PCR 수행

Real-time PCR의 반응물의 조성은 25 mM TAPS (pH 9.3 at 25°C), 50 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM 2-mercaptoethanol, 200 μM each dNTP, 1 unit Taq polymerase (TAKARA)와 Forward primer와 Reverse primer를 각각 10pmole을 넣어주고, probe 또한 각 10pmole을 넣어 주고, 합성된 cDNA를 2ul를 넣고 최종 부피를 20ul가 되게 수행한다. 각각의 프라이머와 프로브의 염기서열은 다음과 같다.

CK19 primer와 프로브

Forward : 5'GATGAGCAGGTCCGAGGTTA-3(서열번호 13)

Reverse : 5'TCTTCCAAGGCAGCTTTCAT-3(서열번호 14)

Probe : 5'FAM-CTGCGGCGCACCCTTCAGGGTCT-BHQ1-3(서열번호 15)

EpCAM Primer와 프로브

Forward : 5'GCCAGTGTACTTCAGTTGGTGCAC -3(서열번호 16)

Reverse : 5'CATTTCTGCCTTCATCACCAAACA -3(서열번호 17)

Probe : 5'FAM-TACTGTCATTTGCTCAAAGCTGGCTGCCA -BHQ1-3(서열번호 18)

hTERT Primer와 프로브

Forward : 5'TGACGTCCAGACTCCGCTTCAT -3(서열번호 19)

Reverse : 5'ACGTTCTGGCTCCCACGACGTA -3(서열번호 20)

Probe : 5'FAM-GCTGCGGCCGATTGTGAACATGGA -BHQ1-3(서열번호 21)

Ki67 Primer와 프로브

Forward : 5'TAATGAGAGTGAGGGAATACCTTTG-3(서열번호 22)

Reverse : 5'AGGCAAGTTTTCATCAAATAGTTCA-3(서열번호 23)

Probe : 5'FAM-GGCGTGTGTCCTTTGGTGGGCA-BHQ1-3(서열번호 24)

Vimentin primer와 프로브

Forward : 5'ATGTTGACAATGCGTCTCTGGCA-3(서열번호 25)

Reverse : 5'ATT TCCTCTTCGTGGAGTTTCTTCAAA-3(서열번호 26)

Probe : 5'FAM- TGACCTTGAACGCAAAGTGGAATCTTTGC-BHQ1-3(서열번호 27)

PCR 반응은 ABI 7500Fast (Applied Biosystem) 이용하여 변성 온도 94℃에서 5분 동안 1회 수행하고, 변성 온도 95℃에서 30초, 어닐링 온도 55℃에서 20초인 사이클을 40회 반복하여 수행하였다. 또한 각각의 어닐링 과정 후 형광을 측정하는 과정을 추가하여, 각 사이클 별로 증가되는 형광 값을 측정하였다.

5) 결과의 분석

각 실험의 결과는 7500 software v2.0.4 (Applied Biosystem)을 이용하여 분석 하였다. 세포표면항원인 EpCAM과 CK19의 경우 RT-qPCR의 Ct 값을 기준으로 양성과 음성을 구분하였다. 두 마커 모두 Ct 값이 38 이하인 경우 양성으로 판독하였고, Ct값이 38 이상인 경우는 음성으로 판독 하였다. 각 마커의 경우 정상인의 혈액에서 발현되는 HER2, hTERT와 Ki67의 발현 양을 기준으로 하여 환자군의 발현양을 비교 정량하여 발현율을 살펴 보았다. 이때 GAPDH의 발현양을 기준으로 하여 각각의 마커의 발현양을 비교하였다.

1. 치료제 선별을 위한 조직 검사의 RT-qPCR의 이용

1) RT-qPCR을 이용한 각 Cell line 별 HER2 발현양 비교

HER2 양성 유방암 세포주인 SK-BR-3를 이용하여 HER2의 발현 민감도를 확인 하였다. 그 결과 도 1에서 볼 수 있듯이 HER2의 RT-qPCR을 이용한 민감도는 SK-BR-3 세포를 한 개까지 검출할 수 있는 민감도를 확인할 수 있었다.

또한 유방암 세포 cell line인 SK-BR3, MCF7, MDA-MB-231 세포주를 이용하여 각 세포주의 HER2의 발현 양을 비교 하였다. HER2 음성 세포 주인 MDA-MB-231 세포주의 HER2 발현을 1로 정했을 때, MCF7의 HER2 발현 양은 약 5.4로 나타났고, SK-BR-3의 HER2 발현 양은 약 56.9를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

2) 임상적 Cut-off의 설정

신촌 세브란스 병원에서 제공받은 유방암 환자의 199명의 FFPE 검체를 이용하여 HER2 RT-qPCR을 수행한 후 그 결과를 유방암 환자의 IHC Score와 FISH 결과와 비교해 보았다. IHC 0 인 경우 0으로 IHC 1+인 경우 25로 IHC 2+이면서 FISH음성일 경우 50으로 IHC 2+면서 FISH 양성일 경우는 75로 IHC 3+ 인 경우는 100으로 각각 Score를 지정한 후 그 결과를 HER2 RT-qPCR의 결과와 상관 분석을 시행하였다.

도 3에서 Pearson r 값이 0.5418 R squre 는 0.2936 p value는 < 0.0001 로 나타나서 RT-qPCR과 IHC 결과 사이에는 상관 관계가 있다는 것을 알 수 있었다.

또한 FFPE 검체를 이용한 실험에서는 검체의 RNA quality가 매우 중요하다. RNA의 quality가 높은 검체는 정확한 결과를 나타낼 수 있는 반면에 RNA quality가 낮다면 위양성 혹은 위음성의 결과를 나타낼 수 있다. 따라서 본 발명에서는 RNA quality의 정도를 GAPDH의 발현 양을 기준으로 제시하였다. 도 4에서 볼 수 있듯이 GAPDH의 발현 정도를 RT-qPCR의 Ct 값을 기준으로 하여 분류해 보았을 때 GAPDH의 Ct 값이 낮은 값을 가질수록 더 정확한 결과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

이때 ROC curve(receiver operating characteristic)는 어떤 검사의 판단결과(binary classifier)의 performance를 보여주는 그래프로,

TPR(true positive rate) or sensitivity, 을 y 축으로

FPR(false positive rate) or 1-specificity 을 x 축으로 가진다.

즉, TRP = y축 = sensitivity = (TP / (TP + FN)

FPR = x 축 = 1-specificity = 1 - [ TN / (TN + FP)] 로 계산된다.

도 5에 의하면 GAPDH Ct 값을 30이하로 하였을 때 그 민감도와 특이도가 가장 높은 것을 알 수 있었고 (민감도 93.02, 특이도 91.84) 그 때의 Cut-off는 105.5인 것을 알 수 있었다. 이렇게 지정한 Cut-off를 이용한 임상 검체를 분석한 결과는 도 6에서 볼 수 있다.

도 6에서 볼 수 있듯이 IHC 0/1+는 음성으로 IHC 2+/FISH 양성 검체와 IHC 3+ 검체는 양성으로 분석하여 결과를 산출하였다. IHC 2+/FISH 음성 검체는 아직까지 임상적으로 논란이 많은 부분이라 제외 결과 산출에선 제외하였다. N Engl J Med.　2008 Mar 27;358(13):1409-11.에 의하면 IHC 2+/FISH 음성 환자에 HER2 표적 치료제인 Herceptin을 투여했을 때 그 효과가 있다는 것이 증명되었기 때문에 해당 환자들을 HER2 양성 혹은 음성으로 규정할 수 없었다. 따라서 해당 부분을 제외한 본 발명의 민감도 및 특이도는 각각 93.0%와 91.8%로 확인할 수 있었다.

2. 혈액 내에서 HER2 발현 및 암발현 마커의 분석

1) 민감도 및 특이도 비교

혈액 내에서 HER2의 발현을 검출 할 수 있는지 여부를 파악하기 위하여 본 발명에서는 유방암이 없는 정상인의 혈액에 HER2를 과발현하는 유방암세포주인 SK-BR-3를 섞어 준 후 RNA 추출을 통하여 혈액 내 암세포의 진단 여부를 확인해 보았다.

도 7에서 볼 수 있듯이 혈액과 섞어 준 SK-BR-3의 세포가 1개 일 때까지 HER2의 민감도가 높다는 것을 알 수 있었다.

또한 혈액 내에서 HER2의 발현 여부를 확인하기 위하여 정상인 50명과 신촌 세브란스 병원으로부터 제공받은 유방암 환자 188명의 혈액을 이용하여 HER2의 발현 여부를 확인해 보았다. 그 결과 정상인에서는 그 발현이 모두 0~1.5 정도로 낮게 나타났고, 유방암 환자에서는 0 ~ 355까지 다양한 발현이 나타나는 것을 확인 할 수 있었다. 그 중에서 혈액 내 HER2의 발현이 10이상인 환자들을 양성으로 하여 그 이상의 HER2 발현을 양성 10 이하의 발현을 음성으로 구분하였다. 그 결과는 도 8에서 볼 수 있다.

도 8에서 볼 수 있듯이 정상인에서는 HER2의 과발현이 나타나지 않은 반면에 188명의 유방암 환자 중 39명 (20.7%)에서는 HER2의 과발현이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

2) 기타 혈액 내 암 마커의 발현양 비교

HER2의 발현이 실제 혈액 내에서 암세포에 의해서 발현되는지 여부를 확인하기 위하여 다른 암세포 관련 마커의 발현 여부를 확인해 보았다. 사용된 마커는 상피성 항원 마커인 EpCAM과 Cytokeratin 19, 세포 내 암관련 마커인 hTERT와 Ki67을 이용하여 혈액 내 암세포의 유무를 확인하였다. EpCAM과 CK19는 SK-BR-3를 이용하여 민감도를 확인하였고, hTERT는 MDA-MB-231을 이용하여 확인하였다. 마지막으로 Ki67은 MCF7을 이용하여 민감도를 확인하였다.

Vimentin은 정상적으로는 섬유모세포나 hematopoietic cells와 같은 간엽기원의 세포들과 관련되어 있는 intermediate filament protein으로서 대부분의 정상적인 상피세포들에는 존재하고 있지 않고 세포질 내 vimentin 발현은 광범하게 분포되어 자주 분명한 perinuclear & subplasmalemmal accentuation을 보인다고 하였다. vimentin의 존재는 독립적으로 생존할 수 있는 상피세포들의 성질을 나타낸다. 따라서 vimentin발현과 cytokeratins의 발현여부를 판단하는 것이 유방암의 공격성과 전이능을 판단할 수 있는 중요한 마커로서 활용될 수 있다고 보고 있어 마커의 발현여부를 확인하고자 MDA-MB-231을 이용하여 민감도를 확인하였다.

도 9에서 볼 수 있듯이 EpCAM은 혈액 내 1개의 세포까지 민감도를 확인할 수 있었고, CK19와 hTERT, Ki67은 혈액 내 10개의 세포까지 확인할 수 있는 민감도를 갖는 것을 확인할 수 있었다.

또한 도 10에서 볼 수 있듯이 EpCAM과 CK19는 그 발현을 Ct 값을 이용하여 정상인과 유방암환자를 비교하였고, hTERT와 Ki67은 혈액 내 상대적인 발현 비율을 정상인과 환자 군을 비교해 보았다.

도 10에서 볼 수 있듯이 EpCAM과 CK19에서는 정상인은 EpCAM에서 한 명을 제외하고 모두 Ct값 39 이상의 낮은 값을 나타낸 반면 유방암 환자 군에서는 Ct 값 38 이하의 높은 값을 갖는 환자들이 존재하는 것을 확인할 수 있었다. EpCAM에서는 45.2%의 양성률을 나타내는 것을 확인할 수 있었고, CK19에서는 50.5%의 양성률을 확인할 수 있었다. 또한 hTERT와 Ki67의 발현양을 확인한 결과 정상인에서는 hTERT와 Ki67 모두 상대적 발현양이 10이상을 나타낸 사람이 없는 반면에 유방암 환자 군에서는 10이상의 높은 발현율을 나타내는 환자가 hTERT 20.7% Ki67은 13.8%의 환자가 10이상의 높은 발현을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

3) 혈액 내 HER2 발현과 유방암 관련 마커의 발현 양상 비교

혈액 내에서 HER2를 발현한 환자의 검체와 본 발명에서 이용한 암 관련 마커 들의 발현양상이 어떠한 관계가 있는지 확인해 보았다.

도 11에서 볼 수 있듯이 혈액 내 HER2를 발현한 환자는 2명의 환자를 제외하고는 모두 상피성 항원 또는 세포내 암관련 마커와 동시에 발현하는 것을 확인 할 수 있었다. 이는 혈액 내 HER2의 발현이 실제로 HER2를 과 발현하는 암세포의 존재에 의해서 높은 발현을 나타내는 것임을 확인 할 수 있었다.

특히 혈액 내 HER2의 발현은 혈액 내 Ki67과 hTERT의 발현과 작은 연관성이 있는 것을 확인 할 수 있었다 (도 12). 이로 인하여 HER2의 과 발현이 암세포의 악성도와 연관이 있음을 알 수 있었고, 이는 또한 암세포의 Histological grade가 점점 악화 될수록 Ki67과 hTERT발현이 어느 정도 연관성이 있음을 도 13에서 확인할 수 있었다.

4) 혈액 내 HER2의 발현과 조직학적 검사 HER2 결과의 비교

혈액 내에서 발현하는 HER2와 조직학적 검사 방법을 이용한 HER2의 발현양상이 어떠한 관계에 있는지 RT-qPCR을 이용하여 비교해 보았다.

도 12에서 볼 수 있듯이 혈액 내 HER2의 발현은 조직학적 HER2 검사 법과 많은 차이를 보이는 것을 알 수 있었다. 도 14의 아래 표에서 붉은 사각형으로 표시한 부분은 조직학적 검사 결과에서 HER2 음성을 나타낸 환자지만 혈액 내 HER2발현이 높게 나타난 환자임을 알 수 있다. 그 비율은 HER2 음성환자의 19.6%의 비율로 전체의 1/5을 차지할 정도로 그 비율이 높음을 알 수 있다. 이러한 환자들은 암세포의 악성도와 관련이 있다는 것을 알 수 있었고(도 13), 따라서 혈액 내 HER2의 발현이 높게 나타난 환자들에게 HER2의 Target 치료제인 Herceptin을 투여하여 치료를 가능하게 할 수 있을 것이라고 볼 수 있다.

5) 혈액 내 암 마커의 유방암 병기별 분석

혈액 내 암 마커를 이용한 유방암 병기별 분석을 수행하였다. 도 15에서 상피성 항원의 경우 유방암의 병기 별로 큰 구별이 되지 않는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 Stage 0에서 높은 발현 양상을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이는 유방암 환자의 조기 발견과 연관할 수 있을 것이라고 생각된다.

도 16에서 세포내 암 관련 마커의 경우는 유방암 환자의 병기별로 발현 양상이 차이가 나는 것을 확인할 수 있었다. HER2를 포함하여 hTERT와 Ki67 모두 병기가 진행될수록 혈액 내 암마커의 발현이 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 특히 90 ~ 100 배 이상의 과 발현 환자의 비율이 환자의 병기가 나빠질수록 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 이로써 세포 내 암 관련 마커는 환자의 병기와 연관이 있다는 것을 알 수 있어서 혈액을 이용한 신속한 진단으로 환자의 유방암의 악성도를 확인할 수 있을 것이라고 생각된다.

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Claims (10)

1. a) 암 의심환자의 조직 또는 혈액에서 얻은 세포로부터 전장 RNA를 분리하는 단계;
   b) 상기 분리된 전장 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계;
   c) 상기 합성된 cDNA를 인간 표피 증식인자 수용체 (HER) 2를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브, 사이토케라틴 19를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브, 상피세포부착분자(EpCAM)를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브, 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT)를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브,Ki67를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브, 및 비멘틴(Vimentin)을 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브로 구성된 프라이머쌍 및 프로브,및 글리세르알데히드 -3-인산 탈수소효소(GAPDH)를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브를 이용하여 실시간-PCR을 수행하는 단계; 및
   d) 상기 증폭된 양을 정상인에 대해 발현된 양과 비교하는 단계;를 포함하고,
   여기서 상기 GAPDH Ct 값을 30이하로 하고, 여기에서 Ct값이란 PCR과정 중 증폭이 뚜렷하게 증가되기 시작한 사이클의 수치를 의미하며,
   상기 인간 표피 증식인자 수용체 (HER) 2를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브는 각각 서열번호 1 내지 2의 프라이머쌍 및 서열번호 5의 프로브, 서열번호 3 내지 4의 프라이머쌍 및 서열번호 8의 프로브, 및 서열번호 6 내지 7의 프라이머쌍 및 서열번호 9의 프로브이며, 사이토케라틴 19를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브는 각각 서열번호 13 내지 14, 및 15에 기재되고, 상피세포부착분자(EpCAM)를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브는 각각 서열번호 16 내지 17, 및 18에 기재되고, 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT)를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브는 각각 서열번호 19 내지 20, 및 21에 기재되고, ,Ki67를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브는 각각 서열번호 22 내지 23, 및 24에 기재되고,
   비멘틴(Vimentin)을 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브는 각각 서열번호 25 내지 26, 및 27에 기재된 프라이머쌍 및 프로브이고, 상기 GAPDH를 증폭할 수 있는 프라이머쌍은 서열번호 10 및 11에 기재되고, 프로브는 서열번호 12에 기재된 염기서열을 가지는 것인 특징으로 하는 유방암의 진단을 위한 정보제공방법.
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