JP6013912B2 - オリゴヌクレオチドプローブのセットならびにそれに関連する方法および使用 - Google Patents
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Description
(a)本発明のオリゴヌクレオチドプローブのセットをサンプルと共に、該対象のゲノム標的配列へのオリゴヌクレオチドプローブのセットの結合をもたらす条件下でインキュベートするステップ;および
(b)該ゲノム標的配列への該オリゴヌクレオチドプローブの結合を検出するステップ。
(a)対象のゲノム標的配列の少なくとも100箇所の異なる領域に相補的なオリゴヌクレオチドプローブのセットを設計するステップであって、特に、該領域は、非反復配列を含むステップ;および
(b)本発明のオリゴヌクレオチドプローブのセットを合成するステップ。
(i)ホスホルアミダイト修飾ビルディングブロックを介して、または
(ii)ホスホルアミダイト法に基づくオリゴヌクレオチド合成中の酸化ステップを介して、
少なくとも1種の標識の取り込みを含む点をさらに特徴とする。
6個のDNPで標識された87merオリゴヌクレオチドの15×96ウェルプレートDNAプローブ合成は、Biolytic Dr. Oligo 192 MWP DNA合成機で、50nmolスケールで、標準的なホスホルアミダイト化学およびBiolytic社の合成サイクルを用いて行なった。合成は、DMTオンモードで行なった。2000 A CPG dT支持材(Glen ResearchTM、カタログ番号20-2032)を、マイクロウェル合成プレート(OrochemTMフィルタープレート96ウェル、カタログ番号OF1100)のすべてのウェルにロードした。ホスホルアミダイト法に基づくオリゴヌクレオチド合成に必要なすべての他の標準的な試薬は、ProligoTMまたはGlen ResearchTMから購入し、アセトニトリルはBakerTMから購入した。オリゴヌクレオチド合成の品質は、放出されるDMTカチオンの色検出により定期的にチェックした。合成が完了した後、アンモニアを用いてオリゴヌクレオチドを切断および脱保護し(20時間、40℃)、続いてspeed vac濃縮器で蒸発させ、600μlの10mM Tris pH8.0に再懸濁した。続いて、OD260nm測定により濃度を測定した。収量:7〜16 OD260nm。この粗製品質を、異なるプローブプールを構成するために用いた。
in situハイブリダイゼーションアッセイは、脱パラフィン、前処理、洗浄およびストリンジェント洗浄のためにVentanaTM試薬を用いて、Ventana Discovery XTシステム(カタログ番号750-701)で行なった。サンプルは、本発明のプローブ組成物と、またはVentana INFORM HER2 DNAプローブTM(Ventana社、カタログ番号780-4332)とハイブリダイズさせた。特に記載しない限り、本発明のオリゴヌクレオチドプローブのセットは、それぞれが81個のヌクレオチドを含み、互いに16ヌクレオチドの距離の同一の位置に6個の非ヌクレオチドDNP標識を有する1440個のオリゴヌクレオチドプローブからなっていた。このプローブの標識の合計数は、8640個であった。
プローブの酵素金属組織学的検出は、ultra View SISH検出キット(Ventana社、カタログ番号780-001)を用いて行ない、ultra View SISH-HRP(Ventana ultra View SISH検出キットTM、カタログ番号780-001)との37℃で16分間のインキュベーションで開始した。続いて、スライドをultra View SISH銀発色剤A、ultra View SISH銀発色剤Bおよびultra View SISH銀発色剤C(Ventana ultra View SISH検出キットTM、カタログ番号780-001)と共に37℃で12分間インキュベートした。スライドを、ヘマトキシリンII(Ventana社、カタログ番号790-2208)で37℃にて4分間、続いて青味試薬(Ventana社、カタログ番号760-2037)で37℃にて4分間、対比染色した。次に、スライドを、弱界面活性剤溶液中で2回洗浄し、アルコール希釈系列(70%、96%、100%)で脱水し、続いてキシレンで2回洗浄し、パーマウント(Fisher ScientificTM、カタログ番号SP15-100)で封入した。
プローブの発色検出は、Ventana BlueMapTM試薬(Ventana社、カタログ番号760-120)を用いて行なった。スライドを、アルカリホスファターゼコンジュゲート化UltraMap抗ウサギIgG(Ventana社、カタログ番号760-4314)と共に37℃で12分間インキュベートし、続いて、アクチベーター、BlueMap1およびBlueMap2(Ventana社、カタログ番号760-120)と共に50℃で20分間インキュベートした。次に、スライドを、弱界面活性剤溶液中で2回洗浄し、アルコール希釈系列(70%、96%、100%)で脱水し、続いてキシレンで2回洗浄し、パーマウント(Fisher ScientificTM、カタログ番号SP15-100)で封入した。
プローブの間接的蛍光検出は、DyLightTM649コンジュゲート化抗ウサギIgGを37℃で20分間用いて行なった。スライドを、DAPI(Ventana社、カタログ番号760-4196)を用いて室温で8分間、対比染色した。次に、スライドを、弱界面活性剤溶液中で2回洗浄し、アルコール希釈系列(70%、96%、100%)で脱水し、続いてキシレンで2回洗浄し、パーマウント(Fisher ScientificTM、カタログ番号SP15-100)で封入した。蛍光顕微鏡観察は、ハロゲン蛍光ランプ(Leica EL6000)、ならびにHER-2遺伝子配列シグナルの可視化のためにCy5蛍光フィルターキューブ(励起620nm、二色ミラー660nm、抑制(suppression)700nm)および対比染色の可視化のためにDAPI蛍光フィルターキューブ(励起360nm、二色ミラー400nm、抑制(suppression)470nm)を用いて、蛍光顕微鏡(Leica DM5500)で行なった。60倍対物レンズを用いて、CCDカメラ(Leica DFC 350FX)で画像を取得した。
図1に示した実験は、2時間のハイブリダイゼーション時間で、本発明のオリゴヌクレオチドプローブのセットが、Ventana INFORM HER2 DNAプローブTM(Ventana Medical Systems Inc., USA)と比較した場合に、より低いプローブ濃度(10μg/mlに対して4μg/ml)でさえ、同様のシグナル強度をもたらしたことを示している。
本発明のオリゴヌクレオチドプローブのセットを用いて、Ventana INFORM HER2 DNAプローブTMと比較して、より低い濃度(10μg/mlに対して4μg/ml)で、32分後または1時間後に、より強い強度の染色シグナルが観察された。本発明のオリゴヌクレオチドプローブのセットは、たった32分のハイブリダイゼーション時間後に最適な染色をもたらしたが、INFORMTM HER2 DNAプローブを用いた最適染色は2時間後でのみ達成され、1時間後では最適未満の染色が達成された(図2を参照されたい)。
図3に概要を示した実験は、金属組織学的検出を用いた場合、標的遺伝子座の両端でのオリゴヌクレオチドプローブサブセットのクラスター化(標的遺伝子座の中央部は染色されない)により、標的遺伝子座全体にわたるオリゴヌクレオチドプローブサブセットの均一分布よりも強度の強い染色がもたらされることを示している(図3、プール2とプール4を参照されたい)。しかしながら、標識の合計数は両方のプールで等しいことに留意されたい。この結果は、本発明のオリゴヌクレオチドプローブのセットが、必要なオリゴヌクレオチドプローブのサブセットの数を最小化しながら、最適なシグナル強度を得るために、オリゴヌクレオチドサブセットの最適な組成物を設計するための可能性をもたらすという、本発明のオリゴヌクレオチドプローブのセットの利点を明らかに説明している。
図4に示した実験は、間接的蛍光検出を用いて、本発明のオリゴヌクレオチドプローブのセットを可視化することができることを明らかにしている。
Claims (17)
- 対象のゲノム標的配列に対する少なくとも100種類の異なる一本鎖オリゴヌクレオチドプローブを含むオリゴヌクレオチドプローブのセットであって、個々のオリゴヌクレオチドのそれぞれが少なくとも1個の内部標識を含み、該内部標識は該オリゴヌクレオチドプローブの5’末端及び3’末端に位置しない、上記オリゴヌクレオチドプローブのセット。
- 少なくとも200種類、300種類または400種類の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項1に記載のオリゴヌクレオチドプローブのセット。
- (i)前記オリゴヌクレオチドプローブのそれぞれが、20〜200ヌクレオチドの長さを有し、かつ/または、
(ii)前記オリゴヌクレオチドプローブのそれぞれが、40〜175ヌクレオチドの長さを有し、かつ/または、
(iii)前記オリゴヌクレオチドプローブのそれぞれが、60〜150ヌクレオチドの長さを有し、かつ/または、
(iv)前記オリゴヌクレオチドプローブのそれぞれが、80〜120ヌクレオチドの長さを有し、かつ/または
(v)該オリゴヌクレオチドプローブのそれぞれが、少なくとも10個の標識を含み、かつ/または
(vi)該オリゴヌクレオチドプローブのそれぞれが、少なくとも15個の標識を含み、かつ/または
(vii)前記セットが少なくとも500種類の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含み、かつ/または
(viii)前記セットが少なくとも1000種類の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含む、
請求項1または2に記載のオリゴヌクレオチドプローブのセット。 - (i)前記オリゴヌクレオチドプローブのセットが、オリゴヌクレオチドプローブの1以上のサブセットを含み、各サブセットが、同一の位置に標識を有する同一の配列を有するオリゴヌクレオチドプローブからなるか、または
(ii)前記オリゴヌクレオチドプローブが、ほぼ等間隔の位置に標識を含むか、または (iii)前記オリゴヌクレオチドプローブが、少なくとも5、10、15、もしくは20ヌクレオチドのスペーサー距離でほぼ等間隔の位置に標識を含むか、または
(iv)前記オリゴヌクレオチドプローブが、既定の位置に標識を含むか、または
(v)前記オリゴヌクレオチドプローブが、互いに既定の距離で局在する既定の位置に標識を含む、
請求項1〜3のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドプローブのセット。 - 前記標識が、
(i)直接的もしくはリンカーを介して間接的に、ヌクレオチドの塩基、糖、もしくはリン酸部分に結合しているか、または
(ii)非ヌクレオチド単位に結合しており、ならびに/あるいは
該標識が、発色反応による、金属組織反応による、または直接的もしくは間接的蛍光分析による検出に好適である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドプローブのセット。 - 前記標識が、蛍光標識、ハプテン、フルオレセイン色素、ローダミン色素、シアニン色素、ビオチン、ジゴキシゲニン、または2,4-ジニトロフェニル部分である、請求項1〜5のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドプローブのセット。
- (i)オリゴヌクレオチドプローブのセットが少なくとも1000個の合計数の標識を含む、または
(ii)オリゴヌクレオチドプローブのセットが少なくとも2000個の合計数の標識を含む、または
(iii)オリゴヌクレオチドプローブのセットが少なくとも4000個の合計数の標識を含む、または
(iv)オリゴヌクレオチドプローブのセットが少なくとも8000個の合計数の標識を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドプローブのセット。 - (i)前記オリゴヌクレオチドプローブが、前記ゲノム標的配列の非反復領域に相補的であるか、または
(ii)前記セットのオリゴヌクレオチドプローブが、該ゲノム標的配列のセンス鎖もしくはアンチセンス鎖のいずれかに相補的である、
請求項1〜7のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドプローブのセット。 - (i)前記オリゴヌクレオチドプローブが、前記ゲノム標的配列内にクラスター化しているか、または
(ii)該ゲノム標的配列が、ヒト上皮増殖因子受容体2(ヒトHER-2)遺伝子座を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドプローブのセット。 - ゲノム標的配列の検出のための、請求項1〜9のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドプローブのセットのin vitroにおける使用。
- 対象のゲノム標的配列を検出する方法であって、以下のステップ:
(a)請求項1〜9のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドプローブのセットをサンプルと共に、in vitroで、該対象のゲノム標的配列へのオリゴヌクレオチドプローブのセットの結合をもたらす条件下でインキュベートするステップ;および
(b)該ゲノム標的配列への該オリゴヌクレオチドプローブの結合を検出するステップを含む、上記方法。 - 疾患についてかつ/または患者での治療的処置の有効性について分析するステップをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 前記検出または検出ステップが、in vitroにおいてin situハイブリダイゼーションにより行われる、請求項10に記載の使用、または請求項11もしくは12に記載の方法。
- (i)ステップ(b)の検出が、発色反応による、金属組織反応による、または直接的もしくは間接的蛍光分析によるものであり、かつ/あるいは
(ii)ステップ(a)のインキュベーションが、最大で4時間、3時間、2時間後、1時間後または30分後に完了する、
請求項11〜13のいずれか1項に記載の方法。 - 対象のゲノム標的配列に対するオリゴヌクレオチドプローブのセットを作製する方法であって、以下のステップ:
(a)対象のゲノム標的配列の少なくとも100箇所の異なる領域に相補的なオリゴヌクレオチドプローブのセットを設計するステップ;および
(b)請求項1〜9のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドプローブのセットを合成するステップ
を含む、上記方法。 - ステップ(b)の合成が、
(i)ホスホルアミダイト修飾ビルディングブロックを介するか、または
(ii)ホスホルアミダイト法に基づくオリゴヌクレオチド合成中の酸化ステップを介して、
少なくとも1個の標識の取り込みを含む、ならびに/あるいは
対象のゲノム標的配列の異なる領域が非反復配列を含む、
請求項15に記載の方法。 - 請求項1〜9のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドプローブのセットと、それに加えて、脱パラフィン剤、前処理剤、洗浄剤、検出剤および製品シートからなる群より選択される少なくとも1つのさらなる構成要素とを含むキット。
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