ES2562821T3 - Método ultrasensible para la detección in situ de ácidos nucleicos - Google Patents

Método ultrasensible para la detección in situ de ácidos nucleicos Download PDF

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Abstract

Un método para detectar al menos un ácido nucleico diana, método que comprende: (a) proporcionar una muestra que comprende, o de la que se sospecha que comprende, dicho ácido nucleico diana; (b) proporcionar al menos un conjunto de dos o más sondas de captura capaces de hibridarse con dicho ácido nucleico diana; (c) proporcionar un multímero generador de señales capaz de hibridarse con dicho conjunto de dos o más sondas de captura, en donde dicho multímero generador de señales comprende una sonda de marcación; (d) proporcionar una sonda de amplificación de señales capaz de conjugarse con dicha sonda de marcación, en donde dicha sonda de amplificación de señales comprende: (i) una molécula de biotina que es capaz de conjugarse con dicha sonda de marcación, una molécula de avidina/estreptavidina que es capaz de unirse a dicha molécula de biotina, y moléculas de biotina adicionales que están conjugadas con peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina (AP) o fluoróforos y son capaces de unirse a dicha molécula de avidina/estreptavidina; (ii) una molécula de HRP, AP, dinitrofenilo (DNP) o fluoróforo que es capaz de conjugarse con dicha sonda de marcación, uno o más anticuerpos primeros que son capaces de unirse a la molécula de HRP, AP, DNP o fluoróforo, y uno o más anticuerpos segundos que están conjugados con HRP, polímero-HRP, AP, polímero-AP o fluoróforo y son capaces de unirse a dichos uno o más anticuerpos primeros; o (iii) una molécula de HRP que es capaz de conjugarse con dicha sonda de marcación, una pluralidad de moléculas de tiramida-fluoróforo o una pluralidad de moléculas de tiramida-biotina o tiramida-hapteno que son capaces de reaccionar con dicha molécula de HRP, y marcadores de detección que permiten detectar visualmente dichas moléculas de tiramida-biotina o tiramida-hapteno; (e) hibridar dicho ácido nucleico diana con dicho conjunto de dos o más sondas de captura; (f) capturar el multímero generador de señales con dicho conjunto de dos o más sondas de captura y, de este modo, capturar el multímero generador de señales con dicho ácido nucleico diana; (g) capturar dicha sonda de amplificación de señales con dicha sonda de marcación y, de este modo, capturar la sonda de amplificación de señales con dicho multímero generador de señales; y (h) detectar la presencia, ausencia o cantidad de la señal generada por dicha sonda de amplificación de señales.

Description

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DESCRIPCIÓN
Método ultrasensible para la detección in situ de ácidos nucleicos
Campo de la invención
La invención se refiere, en general, a ensayos químicos y bioquímicos para ácido nucleico. Más particularmente, la invención se refiere a métodos para la detección in situ de analitos de ácido nucleico en una muestra.
Antecedentes de la invención
La hibridación in situ (ISH; del inglés, in situ hybridization) es una técnica que permite la detección y localización de moléculas de ácido nucleico específicas en células individuales morfológicamente conservadas, cortes tisulares histológicos, o preparaciones de cromosomas. Se describió por vez primera en 1969 y se basa en la hibridación complementaria de una sonda de nucleótidos con una secuencia diana específica de DNA o RNA en la célula. Éste puede ser DNA endógeno, RNA mensajero (mRNA), microRNA (miRNA), secuencias víricas o secuencias bacterianas. La sonda añadida está marcada con una molécula informadora, y los sitios de unión se visualizan fluorescentemente [hibridación in situ fluorescente (FISH; del inglés, fluorescent in situ hybridization)] o cromogénicamente [hibridación in situ cromogénica (CISH; del inglés, chromogenic in situ hybridization)].
En los últimos años, una vez completada la secuenciación del genoma humano completo, se han anotado muchos miles de nuevas secuencias génicas humanas en bases de datos públicas y privadas. Esto abrió una nueva puerta para la ISH, ya que es relativamente sencillo, rápido y barato diseñar y sintetizar sondas antisentido para detectar una secuencia específica de cualquier nuevo gen en la célula. Con la ISH se pueden obtener patrones de expresión específicos del tejido y específicos del tipo celular junto con el nivel de expresión del gen, lo que proporcionará una información valiosa para analizar la función del gen.
Sin embargo, la aplicación de técnicas de ISH puede estar limitada por su incapacidad para detectar dianas de DNA
o RNA con bajos números de copias en las células a causa de una falta de sensibilidad y especificidad. Es especialmente exigente aplicar la ISH en el escenario clínico donde la fijación con formalina y la imbibición en parafina (FFPE; del inglés, formalin fixation and paraffin embedding) es el método más comúnmente empleado en el mundo para almacenar muestras tisulares clínicas. El método de FFPE conserva bien la morfología tisular, pero la fijación con entrecruzamiento por formaldehído puede causar una mala accesibilidad de la secuencia diana a la sonda de detección, una mala interacción química o física de las moléculas de la sonda con otras moléculas o estructuras, y daño a los ácidos nucleicos, especialmente a mRNAs.
Con objeto de sortear la limitación de la ISH y prolongar su utilidad en la patología diagnóstica, se han desarrollado varias estrategias para mejorar la sensibilidad de la ISH. Recientemente, un nuevo método para amplificación de señales por ISH llamado RNAscope® ha sido desarrollado por Advanced Cell Diagnostics, Inc. (Patente de EE.UU. nº 7.709.198). Este ensayo incluye sondas oligonucleotídicas de captura exclusivamente diseñadas y un sistema de amplificación de señales compuesto de preamplificadores, amplificadores y sondas de marcación, que permiten una sustancial amplificación de señales sin amplificar la señal de fondo, lo que permite la detección de moléculas de RNA individuales para casi todos los genes. Una realización ejemplar de la tecnología RNAscope® se ilustra esquemáticamente en la Figura 1 y se describirá con detalle en las Sección 2 de esta solicitud.
En un ensayo RNAscope® típico para detectar un ácido nucleico diana, un mRNA diana cuya expresión se va a detectar es liberado de células y es capturado sobre una superficie sólida (por ejemplo, un pocillo de una placa de microtitulación). También se proporcionan un conjunto de dos o más sondas de captura y un multímero generador de señales. Las sondas de captura se hibridan tanto con el ácido nucleico diana como con el multímero generador de señales y, por lo tanto, capturan el multímero generador de señales para el ácido nucleico diana. El multímero generador de señales comprende sondas de marcación (LPs; del inglés, label probes). Pero más típicamente, el multímero generador de señales comprende preamplificadores y/o amplificadores además de sondas de marcación. La sonda de marcación es capaz de unirse a una partícula o molécula de marcación que proporciona una señal detectable. La sonda de marcación tiene una estructura molecular más grande que permite la fijación de una pluralidad de partículas o moléculas de marcación, las cuales proporcionan una señal más intensa que una sola partícula o molécula de marcación. De este modo, el ensayo RNAscope® mejora la sensibilidad y la especificidad de la detección de ácido nucleico.
Sin embargo, el ensayo RNAscope® solo aún no permite detectar fiablemente algunos genes de pocas copias en cortes tisulares retroactivos fijados con formalina y embebidos en parafina (FFPE), donde el RNA está significativamente degradado. Además, una sola molécula de RNA no puede ser visualizada con un aumento de 40X usando la tecnología RNAscope® actual. Es deseable potenciar más la señal de detección para permitir una detección más robusta de cualesquier moléculas de RNA, incluyendo las moléculas de RNA significativamente degradadas, y para permitir una fácil visualización de la señal de RNA detectada con un aumento de 10X.
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En esta memoria describimos un nuevo ensayo de amplificación de señales por ISH para prolongar la utilidad de la ISH en la patología diagnóstica, al combinar dos métodos de amplificación de señales en un sistema. Este sistema tiene tres formatos: (1) RNAscope® en combinación con biotina-(estrept)avidina, (2) RNAscope® en combinación con un anticuerpo, y (3) RNAscope® en combinación con amplificación de señales con tiramida (TSA; del inglés, tyramide signal amplification). Todos estos métodos pueden aprovechar la excepcional especificidad de la tecnología RNAscope® con el poder de amplificación de los tres métodos de amplificación. Hemos hallado sorprendentemente que los tres anteriores métodos de amplificación de señales combinados permiten amplificar enormemente las señales asociadas con la presencia de un ácido nucleico diana en una muestra mientras producen una excelente razón de señal a ruido.
La biotina-avidina (o biotina-estreptavidina) es un sistema de amplificación de señales bien conocido basado en el hecho de que las dos moléculas tienen una afinidad extraordinariamente elevada entre sí y de que una molécula de avidina/estreptavidina puede unirse a cuatro moléculas de biotina. Los anticuerpos son ampliamente empleados para la amplificación de señales en inmunohistoquímica e ISH. La TSA se basa en el depósito de un gran número de moléculas de tiramida "haptenizadas" por una actividad peroxidasa. La tiramida es un compuesto fenólico. En presencia de pequeñas cantidades de peróxido de hidrógeno, la peroxidasa de rábano picante (HRP; del inglés, horseradish peroxidase) inmovilizada convierte el sustrato marcado en un producto intermedio muy reactivo de vida corta. Las moléculas de sustrato activadas reaccionan entonces muy rápidamente con, y se unen covalentemente a, componentes de proteínas ricos en electrones, tales como tirosina, en, o cerca de, el sitio de unión de la peroxidasa. De este modo, se puede introducir un lote de moléculas extra de hapteno conjugadas con tiramida en el sitio de hibridación in situ. Posteriormente, las moléculas de tiramida-hapteno depositadas pueden ser directa o indirectamente visualizadas.
Todos estos métodos para amplificación de señales han sido empleados en la ISH con diferentes grados de éxito pero, normalmente, la intensidad de las señales y/o la razón de señal a ruido no son lo suficientemente buenas para una patología diagnóstica rutinaria. En el caso de la TSA, en particular cuando se emplea sola en ISH, produce un alto grado de ruido de fondo. Las consistencias día a día y laboratorio a laboratorio son también menos que deseables.
A la vista de lo anterior, existe la necesidad de métodos para amplificar ácidos nucleicos tanto con elevada intensidad como con elevada especificidad. También existe la necesidad de dicho método con una sólida consistencia. La presente invención proporciona estas y otras características que resultarán evidentes tras la revisión de lo siguiente.
Sumario de la invención
La presente invención combina el método para amplificación de señales de RNAscope® con los métodos generales para amplificación de señales por ISH en un método ultrasensible para detectar, cuantificar e identificar uno o más ácidos nucleicos diana en una muestra. El ensayo RNAscope® ofrece una especificidad excepcional a causa de su diseño único de sondas de captura apareadas. Al añadirse métodos generales para amplificación de señales por ISH, tales como la amplificación de señales basada en TSA, al ensayo RNAscope®, los métodos combinados alcanzan una elevada intensidad de señales y un bajo fondo. Los métodos y el sistema para amplificación de señales descritos en esta invención son relativamente simples de utilizar y producen un resultado consistente. El método reivindicado puede ser fácilmente adaptado para uso en procedimientos de diagnóstico clínico rutinarios.
En una realización preferida de la presente invención, la especificidad y la sensibilidad del método descrito para amplificación de señales están equilibradas. El equilibrio se alcanza mediante una reducción moderada del factor de amplificación de señales en RNAscope®. En una realización de la presente invención, se diseña un preamplificador para que se una a entre 1 y 16 amplificadores. En una realización preferida, se diseña un preamplificador para que se una a entre 2 y 10 amplificadores. En otra realización más preferida, se diseña un preamplificador para que se una a entre 2 y 5 amplificadores.
En una realización preferida de la detección de un ácido nucleico diana en una muestra, se proporciona primero la muestra que comprende, o de la que se sospecha que comprende, el ácido nucleico diana, junto con al menos un conjunto de dos o más sondas de captura capaces de hibridarse con el ácido nucleico diana, un multímero generador de señales capaz de hibridarse con el conjunto de dos o más sondas de captura, en donde dicho multímero generador de señales comprende una sonda de marcación, y una sonda de amplificación de señales capaz de unirse a la sonda de marcación, en donde la sonda de amplificación de señales comprende un marcador. En el método, se hibrida primero el ácido nucleico diana con el conjunto de dos o más sondas de captura, y el multímero generador de señales es luego capturado por el conjunto de dos o más sondas de captura, capturándose de este modo el multímero generador de señales para el ácido nucleico diana. La sonda de amplificación de señales es luego capturada por la sonda de marcación, capturándose de este modo el multímero generador de señales. En la última operación se detecta la presencia, ausencia o cantidad del marcador en la sonda de amplificación de señales.
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dianas de ácido nucleico con elevadas sensibilidad y especificidad. Dicha potenciación aumenta la consistencia entre los resultados de la detección de ácido nucleico hasta el nivel que puede ser implementado en ensayos diagnósticos.
1. Detección de ácido nucleico diana mediante una combinación de RNAscope® y métodos generales para la amplificación de señales por ISH
En esta invención se describe un método de hibridación in situ nuevo, sencillo y ultrasensible para detectar ácido nucleico diana en una muestra. Este método puede ser empleado en ensayos tanto de ISH fluorescente (FISH) como de ISH cromogénica (CISH). El método permite detectar ácidos nucleicos (DNA y RNA) inmovilizados en células intactas, cortes tisulares, micromatrices tisulares y micromatrices de cDNA.
1.1. Métodos generales para la amplificación de señales por ISH
Hay muchos métodos para la amplificación de señales por ISH que se han desarrollado para detectar una diana de DNA o RNA. A continuación se describirán tres métodos ejemplares para la amplificación de señales por ISH: (1) amplificación de señales por ISH basada en biotina-(estrept)avidina; (2) amplificación de señales por ISH basada en anticuerpo; y (3) amplificación de señales por ISH basada en la amplificación de señales con tiramida (TSA). Es evidente para un técnico experto que se puede utilizar cualquier método para la amplificación de señales por ISH en la presente invención en combinación con el método RNAscope®. De este modo, estos ejemplos no deberían ser considerados una limitación a la presente invención.
(1)
Sistema RNAscope + biotina-(estrept)avidina (Figura 2)
En una realización se utilizó el método para amplificación de señales por ISH basada en biotina-(estrept)avidina en combinación con RNAscope®. En un aspecto, el sistema RNAscope® comprende un conjunto de dos o más sondas de captura, una pluralidad de sondas de marcación, una pluralidad de amplificadores y una pluralidad de preamplificadores. El ácido nucleico diana se hibrida con el conjunto de sondas de captura. El conjunto de sondas de captura se hibrida luego con un preamplificador. El preamplificador se hibrida además con una pluralidad de amplificadores. Cada amplificador se hibrida luego con una pluralidad de sondas de marcación. La sonda de marcación (LP) de la estructura del complejo de RNAscope se conjuga luego con una molécula de biotina de la estructura para amplificación de señales por ISH y forma un complejo de LP-biotina. El complejo de LP-biotina se une además a una molécula de avidina/estreptavidina. La molécula de avidina/estreptavidina tiene capacidad para unirse a un máximo de 4 moléculas de biotina, donde cada molécula de biotina está además conjugada con HRP o AP. La HRP o AP puede ser visualmente detectada mediante colorantes cromogénicos tales como diaminobencidina (DAB) o Fast Red. De este modo, la combinación del método para amplificación de señales por ISH basada en biotina-(estrept)avidina con el método RNAscope® conduce a un factor de aumento de la señal de 4 por cada sonda de marcación.
(2)
Sistema RNAscope + anticuerpo (Figura 3)
En otra realización se utilizó el método para amplificación de señales por ISH basada en anticuerpo en combinación con RNAscope®. En un aspecto, el sistema RNAscope® comprende un conjunto de dos o más sondas de captura, una pluralidad de sondas de marcación, una pluralidad de amplificadores y una pluralidad de preamplificadores. El ácido nucleico diana se hibrida con el conjunto de sondas de captura. Las dos o más sondas de captura se hibridan con la diana de ácido nucleico. Se hibrida cada preamplificador con cada una de las dos o más sondas de captura, se hibrida una pluralidad de amplificadores con cada uno de los preamplificadores, y se hibrida la pluralidad de sondas de marcación con los amplificadores. Cada sonda de marcación de la estructura del complejo de RNAscope® se conjuga con una molécula de HRP, una molécula de AP, una molécula de DNP o una molécula de fluoróforo, formándose así un complejo de HRP-LP, un complejo de AP-LP, un complejo de DNP-LP o un complejo de fluoróforo-LP, respectivamente. El complejo de HRP-LP, AP-LP, DNP-LP o fluoróforo-LP es reconocido por un anticuerpo anti-HRP, un anticuerpo anti-AP-LP, un anticuerpo anti-DNP-LP o un anticuerpo anti-fluoróforo-LP, respectivamente. Los anticuerpos anteriores son producidos por una especie animal A, tal como una cabra. Este primer anticuerpo es luego reconocido por un segundo anticuerpo contra la especie A. El segundo anticuerpo está conjugado con HRP, polímero-HRP, AP, polímero-AP o fluoróforo y es capaz de unirse a uno o más de los anticuerpos primeros. La HRP o AP puede ser visualmente detectada mediante colorantes cromogénicos tales como diaminobencidina (DAB) o Fast Red. El resultado aquí es más amplificación de señales además de la amplificación de señales por RNAscope.
(3)
Sistema RNAscope + TSA (Figura 4)
En aún otra realización se utilizó el método para amplificación de señales por ISH basada en TSA en combinación con RNAscope®. En un aspecto, el sistema RNAscope® comprende un conjunto de dos o más sondas de captura, una pluralidad de sondas de marcación, una pluralidad de amplificadores y una pluralidad de preamplificadores. El ácido nucleico diana se hibrida con el conjunto de sondas de captura. El conjunto de sondas de captura se hibrida
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En otras realizaciones del método para amplificación de señales por ISH basada en TSA, se puede también conjugar tiramida con otros haptenos tales como digoxigenina (DIG), trinitrofenilo (TNP; del inglés, trinitrophenyl), dinitrofenilo (DNP) y colorantes fluorescentes. Cuando se emplean moléculas de colorante fluorescente en la conjugación de tiramida, los productos de conjugación de tiramida-colorante pueden ser directamente empleados en un sistema RNAscope-TSA para una detección de fluorescencia (FISH) sencilla y eficaz.
1.2. Mejora de la razón amplificador/preamplificador en RNAscope®
La combinación del método RNAscope® con métodos generales para la amplificación de señales por ISH descritos en esta invención puede ser más afinada para aumentar la sensibilidad y la especificidad de la amplificación de señales. En este planteamiento de RNAscope® + amplificación general de señales por ISH, la mayor contribución del ensayo RNAscope® es su especificidad. El sistema RNAscope® también proporciona una modesta amplificación de señales de la diana de ácido nucleico con alta especificidad. Una de las contribuciones de los métodos generales para la amplificación de señales por ISH es su capacidad potenciadora de señales. De esta manera, además de la modesta capacidad para amplificación de señales proporcionada por RNAscope®, los métodos generales para la amplificación de señales por ISH permiten amplificar más la señal del ácido nucleico diana a un nivel mucho mayor.
Un posible problema es que los métodos generales para la amplificación de señales por ISH no sólo amplifican señales positivas ciertas sino también señales positivas falsas. De esta manera, una simple combinación de RNAscope® con métodos generales para la amplificación de señales por ISH afronta el problema del elevado ruido de fondo en la detección de señales. La presente invención describe un modo inteligente para reducir el nivel de las señales positivas falsas.
Un factor equilibrador para la combinación del método RNAscope® con métodos generales para la amplificación de señales por ISH descritos en esta invención es el tamaño del preamplificador empleado en RNAscope®. El preamplificador del sistema RNAscope® podría ser una molécula muy grande si se diseñara para que se uniera a un gran número de amplificadores. Por ejemplo, el preamplificador puede tener la capacidad para hibridarse con más de 20 amplificadores. Dicha molécula grande es propensa a unirse inespecíficamente en la matriz celular durante la hibridación in situ. Cuando uno de los preamplificadores se una inespecíficamente a la muestra, atraerá hacia sí al mismo gran número de amplificadores y sondas de marcación que cuando se une a un ácido nucleico diana. En el caso en que se utiliza el sistema RNAscope® solo, puede que el número de sondas de marcación que se unen a los pocos preamplificadores de unión inespecífica no genere ninguna señal observable. Sin embargo, si la señal de estas sondas de marcación es más potenciada mediante la adicional amplificación de señales por una subsiguiente amplificación general de señales por ISH, la señal positiva falsa será lo suficientemente elevada para ser detectada.
Un planteamiento para reducir dicha señal positiva falsa es reducir el tamaño del preamplificador para que, en primer lugar, sea menos probable que quede atrapado en la matriz celular y, en segundo lugar, incluso cuando quede unido inespecíficamente en la muestra, sólo se hibride con él un número más pequeño de moléculas de amplificador. Como resultado, es probable que la señal producida por la unión inespecífica sea demasiado pequeña para ser detectada incluso cuando la señal es potenciada mediante la amplificación general de señales por ISH. En una realización de este planteamiento, se diseña un preamplificador para que se una a entre 1 y 16 amplificadores. En una realización más preferida, se diseña un preamplificador para que se una a entre 2 y 10 amplificadores. En otra realización preferida, se diseña un preamplificador para que se una a entre 2 y 5 amplificadores.
Al equilibrar las potencias de amplificación y la especificidad de los sistemas RNAscope® y TSA en el ensayo, se ha alcanzado una razón óptima de señal a ruido para la detección de RNA in situ en una muestra tisular clínica rutinaria (véanse el Ejemplo 1 y la Figura 5).
2. Detección de ácido nucleico diana mediante el sistema RNAscope®
Un potente método de hibridación in situ llamado RNAscope® ha sido recientemente desarrollado por Advanced Cell 9
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nucleico diana. L1 y L2, que pueden ser iguales o diferentes, son complementarias de dos secciones adyacentes en la sonda de marcación. Sus secciones ligantes, T, L o ambas, se diseñan para que el enlace entre la sonda de marcación y la diana sea inestable y tienda a caerse a la temperatura de hibridación cuando sólo está en su sitio una de las sondas de captura. Dicho diseño permitiría una especificidad excepcional porque la sonda de marcación que genera señales sólo se puede fijar al gen diana de interés cuando dos sondas de captura independientes reconocen la diana y se unen a las secuencias adyacentes de, o muy próximas a, el gen diana. En una realización se ajusta la temperatura de fusión, Tm, de las secciones T de las dos sondas de captura para que sea significativamente superior a la temperatura de hibridación, mientras que la Tm de las secciones L es inferior a la temperatura de hibridación. Como resultado, las secciones T se unen fuerte y establemente a la molécula diana durante la hibridación, mientras que las secciones L se unen débil e inestablemente a la sonda de marcación si sólo está presente una de las sondas de captura. Sin embargo, si están presentes ambas sondas de captura, la combinación de L1 y L2 mantiene fuerte y establemente la sonda de marcación durante la hibridación. Por ejemplo, las secciones T pueden tener una longitud de 20-30 nucleótidos, mientras que las secciones L tienen una longitud de 13-15 nucleótidos; C puede tener una longitud de 0 a 10 nucleótidos, por ejemplo, 5 nucleótidos. En otra realización, la Tm de las secciones T es inferior a la temperatura de hibridación mientras que la Tm de las secciones L es sustancialmente superior. Del mismo modo, el enlace entre la sonda de marcación y la diana sólo puede sobrevivir a la hibridación cuando ambas sondas de captura se hibridan con la diana de una manera cooperativa. Véase la Patente de EE.UU. nº 7.709.198 para detalles adicionales sobre el diseño de sondas de captura.
En las clases anteriores de realizaciones, las sondas de captura se hibridan preferiblemente con secuencias polinucleotídicas no solapantes en sus respectivas dianas de ácido nucleico. Las sondas de captura pueden cubrir, aunque no es necesario, una región contigua de la diana de ácido nucleico. Se proporcionan opcionalmente, y se hibridan con la diana, sondas bloqueadoras, polinucleótidos que se hibridan con regiones de la diana de ácido nucleico no ocupadas por sondas de la diana. Para una diana de ácido nucleico dada, las correspondientes sondas de captura y sondas bloqueadoras son preferiblemente complementarias de secuencias no solapantes y físicamente distintas en la diana de ácido nucleico, secuencias no solapantes que son preferiblemente, aunque no necesariamente, contiguas. El que las sondas de captura y las sondas bloqueadoras opcionales sean contiguas entre sí puede, en algunas realizaciones, potenciar la fuerza de hibridación, eliminar la estructura secundaria y asegurar una señal más consistente y reproducible.
En la detección de dianas de ácido nucleico en una célula, la célula es típicamente fijada y permeabilizada antes de la hibridación de las sondas de captura para retener las dianas de ácido nucleico en la célula y permitir que las sondas de captura, las sondas de marcación, etc., entren en la célula. La célula es opcionalmente lavada para eliminar materiales no capturados para una de las dianas de ácido nucleico. La célula puede ser lavada después de cualquiera de diversas operaciones; por ejemplo, después de la hibridación de las sondas de captura con las dianas de ácido nucleico para eliminar sondas de captura no unidas, después de la hibridación de los preamplificadores, amplificadores y/o sondas de marcación con las sondas de captura, y/o similares.
En algunas realizaciones, la célula está en suspensión durante todas, o la mayoría de, las operaciones del método por facilidad de manipulación. Sin embargo, los métodos son también aplicables a células en muestras de tejido sólido (por ejemplo, cortes tisulares) y/o células inmovilizadas sobre un sustrato (por ejemplo, un portaobjetos u otra superficie). De esta manera, en una clase de realizaciones, la célula está en suspensión en la muestra que comprende la célula, y/o la célula está en suspensión durante las operaciones de hibridación, captura y/o detección. Por ejemplo, la célula puede estar en suspensión en la muestra y durante las operaciones de hibridación, captura, lavado opcional y detección. En otras realizaciones, la célula está en suspensión en la muestra que comprende la célula, y la célula está fija sobre un sustrato durante las operaciones de hibridación, captura y/o detección. Por ejemplo, la célula puede estar en suspensión durante las operaciones de hibridación, captura y lavado opcional y estar inmovilizada sobre un sustrato durante la operación de detección. En otras realizaciones, la muestra comprende un corte tisular.
3. Detección multiplex de ácidos nucleicos
Un aspecto de la invención proporciona ensayos multiplex de ácidos nucleicos. De este modo, una clase general de realizaciones incluye métodos para detectar dos o más ácidos nucleicos diana. En la sección anterior se ha descrito un método para detectar un solo ácido nucleico diana usando el sistema RNAscope®. En esta sección se describirá primero un método para detectar un solo ácido nucleico diana usando una combinación de RNAscope® y un método general para amplificación de señales por ISH. A continuación se describirá un método para detectar dos o más ácidos nucleicos diana usando una combinación de RNAscope® y un método general para la amplificación de señales por ISH. La detección de dos o más ácidos nucleicos diana puede llevarse a cabo de la misma manera que la detección de un solo ácido nucleico diana excepto por el uso de diferentes marcadores y sondas específicos de la diana.
En una realización de la invención se proporciona un método para detectar un solo ácido nucleico diana. En este método se proporciona una muestra que comprende, o de la que se sospecha que comprende, el ácido nucleico
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primer multímero generador de señales es marcado con la primera sonda de amplificación de señales. En una realización ejemplar, la primera sonda de amplificación de señales es una sonda de amplificación de señales por ISH basada en TSA que se unió con la sonda de marcación de la amplificación RNAscope® a través de un complejo de LP-HRP conjugados. Una vez que se ha llevado a cabo el método RNAscope®, la sonda de marcación de RNAscope® se conjuga primero con HRP. El complejo de LP-HRP conjugados es luego detectado con una incubación secuencial de tiramida-biotina, estreptavidina-HRP y sustrato cromático DAB, lo que da lugar a una señal marrón para el primer ácido nucleico diana. En la segunda operación, los agentes de marcación residuales para el primer multímero generador de señales son bloqueados con objeto de evitar que los marcadores reaccionen con el segundo multímero generador de señales que se va a añadir en la tercera operación. En la tercera operación, el segundo multímero generador de señales es marcado con la segunda sonda de amplificación de señales. En una realización ejemplar, una vez que se ha llevado a cabo el método RNAscope®, la sonda de marcación de RNAscope® se conjuga primero con dinitrofenilo (DNP). El complejo de LP-DNP conjugados es luego detectado con una incubación secuencial de anti-DNP-AP y sustrato cromático Fast Red, lo que da lugar a una señal roja para el segundo ácido nucleico diana.
Los métodos anteriores son también útiles para la detección multiplex de ácidos nucleicos, incluyendo la detección secuencial de más de tres dianas de ácido nucleico. De esta manera, la célula que opcionalmente comprende, o de la que se sospecha que comprende, una diana de ácido nucleico tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima o incluso más puede ser analizada de un modo similar al anteriormente descrito.
4. Kits
Aún otra clase general de realizaciones proporciona un kit para detectar uno o más ácidos nucleicos diana. En un aspecto, el kit incluye un ácido nucleico diana, un componente para RNAscope® y un componente para la amplificación general de señales por ISH. En una realización, el kit incluye un ácido nucleico diana, conjuntos de sondas de captura capaces de hibridarse con el ácido nucleico diana, un multímero generador de señales capaz de hibridarse con un conjunto de sondas de captura, y una sonda de amplificación de señales capaz de unirse a la sonda de marcación. El multímero generador de señales comprende una sonda de marcación, y la sonda de amplificación de señales comprende un marcador. En cierta realización, el multímero generador de señales del kit puede incluir amplificadores y preamplificadores apropiados. El kit puede incluir también un soporte sólido. El componente del kit para la amplificación de señales por ISH puede ser cualquier sistema para amplificación de señales por ISH. Por ejemplo puede ser los tres sistemas para amplificación de señales por ISH descritos en la Sección 1.1 de la presente invención. El kit se puede utilizar para la detección de cualesquier ácidos nucleicos descritos anteriormente en esta solicitud, incluyendo, pero sin limitarse a, DNA, cDNA, RNA y mRNA.
En realizaciones multiplex de kits, muchos componentes pueden ser representados por dos o más subconjuntos diferentes. Por ejemplo, las sondas de marcación pueden incluir dos subconjuntos que se hibridan, respectivamente, con los ácidos nucleicos diana primero y segundo. El multímero generador de señales puede incluir dos sondas de marcación diferentes, cada una de las cuales se hibrida directa o indirectamente con las sondas de captura primera y segunda. El kit puede incluir también dos sondas de amplificación de señales diferentes, cada una de las cuales se conjuga con las sondas de marcación primera y segunda. Las distintas sondas de amplificación de señales son distinguibles entre sí al unirse a diferentes sustratos cromáticos. En otro aspecto, el kit incluye un agente bloqueador que es capaz de bloquear los agentes de marcación residuales para el primer multímero generador de señales, asegurando de este modo la unión específica del segundo multímero generador de señales con el segundo ácido nucleico diana.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar, pero no limitar, la invención reivindicada.
El ejemplo siguiente muestra cómo una combinación del método RNAscope® y métodos generales para la amplificación de señales por ISH adicionalmente potenciados por una razón preamplificador/amplificador optimizada alcanza una especificidad y una sensibilidad significativamente mejoradas para la detección de RNA in situ.
Ejemplo 1. Ensayo RNAscope® + amplificación general de señales por ISH
El procedimiento de ensayo básico se puede realizar en un día e incluye generalmente las operaciones siguientes. Se proporciona una muestra que contiene una pluralidad de células de las que se sospecha que comprenden un ácido nucleico diana HPRT1. Una vez fijadas y permeabilizadas, las células, fijas sobre un soporte sólido o en suspensión, se hibridan con la serie siguiente de sondas oligonucleotídicas. En primer lugar, se hibrida un conjunto de sondas de captura con el RNA diana dentro de las células. A continuación, se hibridan moléculas de preamplificador con las sondas de captura, lo que proporciona un puente para la hibridación de moléculas de amplificador. Múltiples moléculas de amplificador se hibridan además con un preamplificador, por ejemplo, hasta 20 amplificadores por cada preamplificador. Luego se hibridan múltiples sondas de marcación con un amplificador, por ejemplo, hasta 20 sondas de marcación por cada amplificador.
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La intensidad de las señales es adicionalmente potenciada mediante una amplificación de señales por ISH basada en TSA. Se conjuga una HRP con cada sonda de marcación. Luego se añade un reactivo que contiene moléculas de tiramida-biotina a la disolución de ensayo. La sonda de marcación conjugada con HRP cataliza que múltiples copias de tiramida-biotina se unan covalentemente a los componentes de proteínas ricos en electrones en las inmediaciones del sitio de unión de HRP-sonda de marcación. Luego se detecta la molécula de tiramida-biotina mediante avidina/estreptavidina-HRP, pudiéndose visualizar la avidina/estreptavidina-HRP mediante el sustrato de marcación DAB, que presenta un color marrón. Las señales se detectan, por ejemplo, bien con un microscopio regular de florescencia con filtros apropiados o bien con un citómetro de flujo multicolor. Se realizó una comparación de las detecciones de mRNA del gen HPRT1 de pocas copias en cortes FFPE de cáncer de mama humano, realizadas con RNAscope® solo o con RNAscope® + amplificación de señales por ISH basada en TSA. Como se muestra en la Figura 5, las señales obtenidas con el método RNAscope® + amplificación de señales por ISH basada en TSA eran significativamente más intensas que las obtenidas con el método RNAscope® solo.
Se evitó o minimizó la unión inespecífica diseñando conjuntos de sondas que se dirigían a una secuencia de mRNA específica usando un diseño de sonda en doble "Z". Las sondas de captura en doble "Z" se diseñaron basándose en la secuencia del gen HPRT1 y fueron previamente exploradas frente a la base de datos GenBank para asegurar la mínima hibridación cruzada con secuencias de ácido nucleico no pretendidas. En el diseño en doble "Z", cada una de dos sondas vecinas contiene una secuencia que se hibrida con la diana, por ejemplo, con una longitud de 20 a 30 bases y una Tm significativamente por encima de la temperatura de ensayo, y una secuencia que se hibrida con el preamplificador, por ejemplo, con una longitud de sólo 14 bases y una Tm bien por debajo de la temperatura de ensayo. Como resultado, una sola sonda de captura es capaz de unirse fuerte y establemente al RNA diana durante la hibridación, pero se unirá débil e inestablemente al preamplificador a causa de la región de homología de 14 pares de bases que tiene una Tm bien por debajo de la temperatura de ensayo. Sin embargo, cuando están presentes dos sondas de captura en posiciones vecinas, la fuerza de hibridación combinada, por ejemplo, de 28 pares de bases complementarias, mantiene fuerte y establemente el preamplificador a la temperatura de ensayo permitiendo que tenga lugar la amplificación de señales. Dicho diseño en doble "Z" asegura una elevada especificidad de detección y simplifica el diseño de sondas para la detección simultánea de múltiples dianas.
A causa de la capacidad potenciadora de señales del método de amplificación de señales por ISH basada en TSA, la unión inespecífica del preamplificador en la matriz celular durante la hibridación in situ podría ser amplificada y, en consecuencia, producir una señal positiva falsa. Este problema llega a ser grave cuando se diseña el preamplificador para que se una a un gran número de amplificadores y, de esta manera, tenga un gran tamaño. La potencia de amplificación se alcanza a costa de la especificidad ligante perdida. Resolvimos este problema reduciendo moderadamente el número de amplificadores a los que se va a unir un preamplificador a diseñar. El resultado final es una razón de señal a ruido aumentada. La capacidad de amplificación perdida se ve compensada por la capacidad potenciadora de señales de los métodos de amplificación de señales por ISH, particularmente el método de amplificación de señales por ISH basada en TSA.
En este ensayo se han diseñado y examinado varios amplificadores. Se diseña el preamplificador PREAMP1 para que se una a 20 amplificadores. Se diseña el preamplificador PREAMP2 para que se una a 16 amplificadores. Se diseña el preamplificador PREAMP3 para que se una a 10 amplificadores. Se diseña el preamplificador PREAMP4 para que se una a 5 amplificadores.
Los resultados experimentales muestran que PREAMP2 tiene una razón de señal a ruido mejorada con respecto a PREAMP1. PREAMP3 y PREAMP4 tienen la mejor razón de señal a ruido entre todos los PREAMPs examinados (datos no mostrados).
Ejemplo 2. Ensayo RNAscope® + amplificación general de señales por ISH multiplex
El siguiente ejemplo pronosticador de una amplificación multiplex muestra cómo el método descrito en la presente invención permite detectar dos ácidos nucleicos diana con elevada sensibilidad. Para explorar el potencial de la invención descrita para la detección in situ de transcritos de RNA de pocas copias y su capacidad para detección multiplex, se emplean los genes 18S y Her-2 como genes modelo.
En la primera amplificación, el gen 18S es capturado por sondas de captura diseñadas para 18S. La sonda de captura para 18S se diseña del modo descrito en el Ejemplo 1. El gen 18S hibridado con sonda de captura es luego secuencialmente hibridado con preamplificadores, amplificadores y sondas de marcación. Luego se conjuga la sonda de marcación con HRP. Luego se detectan los complejos de LP-HRP conjugados con incubaciones sucesivas de tiramida-biotina, estreptavidina-HRP y DAB. El producto de la hibridación produce un color marrón en las posiciones donde se detectan genes diana 18S.
Antes de comenzar la segunda amplificación, se bloquean las HRPs residuales de la primera amplificación. En la segunda amplificación, el gen Her-2 es capturado por sondas de captura diseñadas para Her-2. La sonda de captura para Her-2 se diseña del modo descrito en el Ejemplo 1. El gen Her-2 hibridado con sonda de captura es luego
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