CN108504777A - 一种基于信号放大检测hcv病毒载量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于病毒诊断技术领域，特别涉及一种基于信号放大检测HCV病毒载量的方法，分别设计HCV病毒型别中HCV1b、HCV2a、HCV3a、HCV3b、HCV6b5种型别的特异性引物，检测样品、通用捕获引物和裂解液混合裂解，再加入检测探针缓冲液进行杂交，经放大分子溶液放大后依次加探针标记物和底物，完成捕获杂交后的信号放大，最后用化学发光检测信号获得样品中HCV病毒载量。本发明的敏感性在200‑300个HCV病毒拷贝才能检测到，对于临床患者的病毒载量的监测其敏感性是足够的，可有效避免测定结果假阳性的基础上，简便、快速地实现对样品中HCV‑RNA准确定量。
Description
技术领域
本发明属于病毒诊断技术领域，特别涉及一种基于信号放大检测HCV病毒载量的方法。
背景技术
丙型病毒性肝炎，简称为丙型肝炎、丙肝，是一种由丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的病毒性肝炎，主要经输血、针刺、吸毒等传播，据世界卫生组织统计，全球HCV的感染率约为3％，估计约1.8亿人感染了HCV，每年新发丙型肝炎病例约3.5万例。丙型肝炎呈全球性流行，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌(HCC)。未来20年内与HCV感染相关的死亡率(肝衰竭及肝细胞癌导致的死亡)将继续增加，对患者的健康和生命危害极大，已成为严重的社会和公共卫生问题。在我国健康人群抗HCV阳性率为0.7％～3.1％，约3800万人。由于病毒生物学特点和宿主免疫功能等多方面因素，机体免疫往往难以有效清除病毒，致使约50％～80％HCV感染者发展为慢性肝炎，其中20％～30％将发展成肝硬化。肝硬化患者中每年有1％～4％发展成为肝细胞癌症，丙肝已成为我国危害国民健康的重大疾病之一。
索磷布韦可与其他药物联合，治疗所有基因型的丙型肝炎病毒感染效果良好。该药2013年美国上市，2017.9中国上市。目前，慢性丙肝抗病毒治疗方法普遍采用聚乙二醇干扰素α联合利巴韦林，但治疗的患者中大概有十分之一是不能耐受干扰素治疗，还有一些干扰素治疗无应答、复发的患者，都因为无法实时检测出病人HCV病毒载量的水平变化而难以实时评估患者的治疗效果，所以会导致药物的无效治疗浪费，产生不必要的费用，甚至耽误患者病情。另外，现有HCV病毒核酸检测RT-PCR中易出现的RNA降解和污染问题，无法进一步提高病毒的筛出率，高敏HCV-RNA检测技术成本太高，限制了部分患者的临床应用。为此，本发明设计了一种基于信号放大检测HCV病毒载量的方法，可对病人血液中一段时间内的HCV病毒载量水平做线性评估。
发明内容
本发明的敏感性在200-300个HCV病毒拷贝才能检测到，对于临床患者的病毒载量的监测其敏感性是足够的，可有效避免测定结果假阳性的基础上，简便、快速地实现对样品中HCV-RNA准确定量。
本发明提供了一种基于信号放大检测HCV病毒载量的方法，包括如下步骤：
S1，准备待检测样品，所述待检测样品为血清、血浆、全血中的其中一种；
S2，针对HCV病毒型别设计特异性引物，每个HCV病毒型别的特异性引物数量≥8条；
S3，将浓度为1pmol/ul的通用捕获引物溶液包被在孔微板中，在避光密闭条件下冷藏24h，然后再恢复到室温，待用，所述通用捕获引物的序列如SEQ ID NO.54所示；
S4，向S3的孔微板中加入S1中检测样品和裂解液，其中S1中检测样品、S3中通用捕获引物溶液、裂解液体积比为1:2:2，65℃裂解1h，得裂解样品；
其中，裂解液由以下质量浓度的组分组成：10％的EDTA、2.53％的Hepes、1.79％的Tris、15％的十二烷基硫酸锂，余量为去离子水；
S5，向裂解样品加入相当于S1中检测样品2倍体积量的检测探针缓冲液，55℃杂交3～5h，得杂交样品；
其中，所述检测探针缓冲液由S2中特异性引物混合物、所述裂解液、蛋白酶K溶液以1:50:49的体积比组成；
S6，用洗液洗含有S5的微孔板，然后加入相当于S1中检测样品2倍体积量的放大分子溶液，55℃温育35min，得初步放大溶液；
S7，用洗液洗含有S6的微孔板，然后加入相当于S1中检测样品2倍体积量的放大分子溶液，55℃温育35min，得放大溶液；
S8，用洗液洗含有S7的微孔板，加入相当于S1中检测样品2倍体积量的探针标记溶液，50℃温育35min，得标记溶液；
其中，探针标记溶液由以下质量浓度的组分组成：0.05％标记探针、3.75％Hepes、5.3％Tris、7.5％MgCl2、0.5％ZnCl2、余量为去离子水，所述标记探针的序列如SEQ IDNO.56所示；
S9，用洗液洗含有S8的微孔板，然后加入S1中检测样品2倍体积量的底物溶液，30℃温育15min，得到待检测溶液；
其中，底物溶液由以下质量浓度的组分组成：1.5％的CDP-Star、余量为增强剂组成；
S10，将S9中待检测溶液置于化学发光分析仪上读数，再对照标准曲线计算得检测样品中HCV病毒载量。
优选的，S1中血浆是经乙二胺四乙酸二钾或枸橼酸盐抗凝处理后的。
优选的，S1中全血在18℃-30℃中储存≤4h，或者18℃-30℃中储存≥4h则离心10-15min，或者2℃-8℃中储存≤48h，或者-20℃储存≤72h。
优选的，S2中所述HCV病毒型别包括HCV1b、HCV2a、HCV3a、HCV3b、HCV6b；其中HCV1b对应的特异性引物的核酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.13所示，HCV2a对应的特异性引物的核酸序列如SEQ ID NO.14～SEQ ID NO.23所示，HCV3a对应的特异性引物的核酸序列如SEQ ID NO.24～SEQ ID NO.35所示，HCV3b对应的特异性引物的核酸序列如SEQ IDNO.36～SEQ ID NO.45所示，HCV6b对应的特异性引物的核酸序列如SEQ ID NO.46～SEQ IDNO.53所示。
优选的，S6中洗液是由以下质量浓度的组分组成：1.5％的SSC、0.5％的十二烷基硫酸锂、余量为去离子水；放大分子溶液由以下质量浓度的组分组成：0.05％放大分子探针、3.75％Hepes、5.3％Tris、7.5％MgCl2、0.5％ZnCl2、余量为去离子水，所述放大分子探针的序列如SEQ ID NO.55所示。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明的敏感性在200-300个HCV病毒拷贝才能检测到，对于临床患者的病毒载量的监测其敏感性是足够的，可有效避免测定结果假阳性的基础上，简便、快速地实现对样品中HCV-RNA准确定量；特异性针对中国人基因易感染的HCV1b、HCV2a、HCV3a、HCV3b、HCV6b型别，每个型别至少设计8条引物，杂交的特异性更高，特异性达到86.3％，敏感性达到75.6％；本发明方法无需进行RNA提纯，直接血样标本即可，简单易操作，也无需进行PCR扩增，避免了模板污染、试剂等因素的干扰。
附图说明
图1为本发明HCV病毒裂解释放靶标RNA示意图；
图2为本发明通用捕获引物捕获靶标RNA示意图；
图3为本发明特异性引物与被捕获的靶标RNA杂交后的信号放大图；
图4为本发明加入底物后的化学发光检测信号图；
图5为本发明HCV浓度标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图1-5对本发明的一个具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制，实施例中涉及的试剂均能通过公共渠道获得。
一种基于信号放大检测HCV病毒载量的方法，包括如下步骤：
S1，准备待检测样品，待检测样品为血清、血浆、全血中的其中一种；
血浆是经乙二胺四乙酸二钾或枸橼酸盐抗凝处理后的；
全血在18℃-30℃中储存≤4h，或者18℃-30℃中储存≥4h则离心10-15min，或者2℃-8℃中储存≤48h，或者-20℃储存≤72h
S2，针对HCV病毒型别设计特异性引物，每个HCV病毒型别的特异性引物数量≥8条；
HCV病毒型别包括HCV1b、HCV2a、HCV3a、HCV3b、HCV6b；其中HCV1b对应的特异性引物的核酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.13所示，HCV2a对应的特异性引物的核酸序列如SEQ ID NO.14～SEQ ID NO.23所示，HCV3a对应的特异性引物的核酸序列如SEQ ID NO.24～SEQ ID NO.35所示，HCV3b对应的特异性引物的核酸序列如SEQ ID NO.36～SEQ IDNO.45所示，HCV6b对应的特异性引物的核酸序列如SEQ ID NO.46～SEQ ID NO.53所示；
S3，将浓度为1pmol/ul的通用捕获引物溶液包被在孔微板中，在避光密闭条件下冷藏24h，然后再恢复到室温，待用，通用捕获引物的序列为：5’-ctcttggaaagaaagt-3’，如SEQ ID NO.54所示；
S4，向S3的孔微板中加入S1中检测样品和裂解液，其中S1中检测样品、S3中通用捕获引物溶液、裂解液体积比为1:2:2，65℃裂解1h，得裂解样品；
其中，裂解液由以下质量浓度的组分组成：10％的EDTA、2.53％的Hepes、1.79％的Tris、15％的十二烷基硫酸锂，余量为去离子水；
S5，向裂解样品加入相当于S1中检测样品2倍体积量的检测探针缓冲液，55℃杂交3～5h，得杂交样品；
其中，所述检测探针缓冲液由S2中特异性引物混合物、所述裂解液、蛋白酶K溶液以1:50:49的体积比组成，
SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.53的特异性引物混合物中物质的量比为CE:LE:BL＝1:4:2，具体可参照表1；
S6，用洗液洗含有S5的微孔板，然后加入相当于S1中检测样品2倍体积量的放大分子溶液，55℃温育35min，得初步放大溶液，
其中，洗液(洗液购于thermofisher，QS0008型)是由以下质量浓度的组分组成：1.5％的SSC、0.5％的十二烷基硫酸锂、余量为去离子水；放大分子溶液由以下质量浓度的组分组成：0.05％放大分子探针、3.75％Hepes、5.3％Tris、7.5％MgCl2、0.5％ZnCl2、余量为去离子水，所述放大分子探针的序列：
5’-aggatcgtaagtaactaaggactaccaggatcgtaagtaactaaggactaccaggatcgtaagtaactaaggactaccaggatcgtaagtaactaaggactaccaggatcgtaagtaactaaggactaccaggatcgtaagtaactaaggactaccaggatcgtaagtaactaaggactaccaggatcgtaagtaactaaggactaccaggatcgtaagtaactaaggactaccaggatcgtaagtaactaaggactaccaggatcgtaagtaactaaggactaccaggatcgtaagtaactaaggactaccaggatcgtaagtaactaaggactaccaggatcgtaagtaactaaggactaccaggatcgtaagtaactaaggactaccaggatcgtaagtaactaaggactaccaggatcgtaagtaactaaggactaccaggatcgtaagtaactaaggactaccaggatcgtaagtaactaaggactaccaggatcgtaagtaactaaggactacc-3’，如SEQ ID NO.55所示；
S7，用洗液洗含有S6的微孔板，然后加入相当于S1中检测样品2倍体积量的放大分子溶液，55℃温育35min，得放大溶液；
S8，用洗液洗含有S7的微孔板，加入相当于S1中检测样品2倍体积量的探针标记溶液，50℃温育35min，得标记溶液，
其中，探针标记溶液由以下质量浓度的组分组成：0.05％标记探针、3.75％Hepes、5.3％Tris、7.5％MgCl2、0.5％ZnCl2、余量为去离子水，所述标记探针的序列：
5’-aatcacaggattcaatggattc-3’，如SEQ ID NO.56所示
S9，用洗液洗含有S8的微孔板，然后加入S1中检测样品2倍体积量的底物溶液，30℃温育15min，得到待检测溶液，
其中，底物溶液由以下质量浓度的组分组成：1.5％的CDP-Star、余量为增强剂组成(底物溶液购于lumigen，p7000)；
S10，将S9中待检测溶液置于化学发光分析仪上读数，再对照标准曲线计算得检测样品中HCV病毒载量。
表1SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.53
以下是一具体标本检测过程：
(1)将100μL、浓度为1pmol/μL的通用捕获引物溶液包被在96孔微板中，用锡箔纸密闭冷藏24h再恢复到室温，备用。
(2)每个测试孔中加入50μL待检测的血清样品，再加入100μL/微孔的裂解液，65℃裂解1h，得裂解样品。
(3)向(2)裂解样品中以100μL/微孔的量加入检测探针缓冲液，55℃杂交3～5h，得杂交样品。
(4)用洗液洗含(3)微孔板，然后以100μL/微孔的量加入放大分子溶液，55℃温育35min。
(5)用洗液洗含(4)微孔板，以100μL/微孔的量加入放大分子溶液，55℃温育35min。
(6)用洗液洗含(5)微孔板，以100μL/微孔的量加入探针标记溶液，50℃温育35min。
(7)用洗液洗含(6)微孔板，以100μL/微孔的量加入底物溶液，30℃温育15min。
(8)在化学发光分析仪上读数后，根据做出的标准曲线计算并分析结果，得检测样品中HCV病毒载量。
其中，图1是步骤(2)HCV病毒裂解释放靶标RNA的过程示意图，图2是HCV病毒裂解后捕获靶标RNA示意图；图3是特异性引物与被捕获的靶标RNA杂交后的信号放大图；图4是步骤加入底物后的化学发光检测信号图；图5是以HCV标准品的浓度值为X轴，测得的相应光子数为Y轴制做出的标准曲线，曲线公式为X＝(Y-2880)/0.122，相关系数R2＝0.9997，该曲线检测有效线性范围：600IU/mL～8×106IU/mL。将HCV检测样本测得的光子数带入，即可获得相应HCV-RNA浓度(IU/mL)。
需要说明的是，本发明权利要求书中采用的步骤方法与上述实施例相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<120> 一种基于信号放大检测HCV病毒载量的方法
<141> 2018-03-21
<160> 56
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cattgagcgg gttgatccaa tttttctctt ggaaagaaag t 41
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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<211> 37
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
acgacactcg tactaacgcc attttttctg agtcaaagca t 41
<210> 39
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
ccggttccgc agaccactat tttttgaagt taccgtttt 39
<210> 40
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
cggcgattcc ggtgtactca tttttctgag tcaaagcat 39
<210> 41
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
ggggcctgga ggctgc 16
<210> 42
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
ggctctcccg ggaggg 16
<210> 43
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
cgcccaaatt tccggg 16
<210> 44
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
tgatctcgcg ggggca 16
<210> 45
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
cgacccaaca ctactcggct atttttctct tggaaagaaa gt 42
<210> 46
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
cattgagcgg gtttgatcca tttttctctt ggaaagaaag t 41
<210> 47
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
ccggttccgc agaccactat tttttgaagt taccgtttt 39
<210> 48
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
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tggcaattcc ggtgtactca tttttctgag tcaaagcat 39
<210> 49
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
gcacgcccaa atctccaggt ttttgaagtt accgtttt 38
<210> 50
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
ggctagcagt cttgcggggt ttttctgagt caaagcat 38
<210> 51
<211> 40
<212> DNA
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<400> 51
ggcctggagg ctgtacgact ttttctcttg gaaagaaagt 40
<210> 52
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
ggctctcccg ggaggg 16
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
ttttgcaacc caacgctact c 21
<210> 54
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
ctcttggaaa gaaagt 16
<210> 55
<211> 520
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
aggatcgtaa gtaactaagg actaccagga tcgtaagtaa ctaaggacta ccaggatcgt 60
aagtaactaa ggactaccag gatcgtaagt aactaaggac taccaggatc gtaagtaact 120
aaggactacc aggatcgtaa gtaactaagg actaccagga tcgtaagtaa ctaaggacta 180
ccaggatcgt aagtaactaa ggactaccag gatcgtaagt aactaaggac taccaggatc 240
gtaagtaact aaggactacc aggatcgtaa gtaactaagg actaccagga tcgtaagtaa 300
ctaaggacta ccaggatcgt aagtaactaa ggactaccag gatcgtaagt aactaaggac 360
taccaggatc gtaagtaact aaggactacc aggatcgtaa gtaactaagg actaccagga 420
tcgtaagtaa ctaaggacta ccaggatcgt aagtaactaa ggactaccag gatcgtaagt 480
aactaaggac taccaggatc gtaagtaact aaggactacc 520
<210> 56
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
aatcacagga ttcaatggat tc 22
Claims (5)
1.一种基于信号放大检测HCV病毒载量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，准备待检测样品，所述待检测样品为血清、血浆、全血中的其中一种；
S2，针对HCV病毒型别设计特异性引物，每个HCV病毒型别的特异性引物数量≥8条；
S3，将浓度为1pmol/ul的通用捕获引物溶液包被在孔微板中，在避光密闭条件下冷藏24h，然后再恢复到室温，待用，所述通用捕获引物的序列如SEQ ID NO.54所示；
S4，向S3的孔微板中加入S1中检测样品和裂解液，其中S1中检测样品、S3中通用捕获引物溶液、裂解液体积比为1:2:2，65℃裂解1h，得裂解样品；
其中，裂解液由以下质量浓度的组分组成：10％的EDTA、2.53％的Hepes、1.79％的Tris、15％的十二烷基硫酸锂，余量为去离子水；
S5，向裂解样品加入相当于S1中检测样品2倍体积量的检测探针缓冲液，55℃杂交3～5h，得杂交样品；
其中，所述检测探针缓冲液由S2中特异性引物混合物、所述裂解液、蛋白酶K溶液以1:50:49的体积比组成；
S6，用洗液洗含有S5的微孔板，然后加入相当于S1中检测样品2倍体积量的放大分子溶液，55℃温育35min，得初步放大溶液；
S7，用洗液洗含有S6的微孔板，然后加入相当于S1中检测样品2倍体积量的放大分子溶液，55℃温育35min，得放大溶液；
S8，用洗液洗含有S7的微孔板，加入相当于S1中检测样品2倍体积量的探针标记溶液，50℃温育35min，得标记溶液；
其中，探针标记溶液由以下质量浓度的组分组成：0.05％标记探针、3.75％Hepes、5.3％Tris、7.5％MgCl2、0.5％ZnCl2、余量为去离子水，所述标记探针的序列如SEQ IDNO.56所示；
S9，用洗液洗含有S8的微孔板，然后加入S1中检测样品2倍体积量的底物溶液，30℃温育15min，得到待检测溶液；
其中，底物溶液由以下质量浓度的组分组成：1.5％的CDP-Star、余量为增强剂组成；
S10，将S9中待检测溶液置于化学发光分析仪上读数，再对照标准曲线计算得检测样品中HCV病毒载量。
2.如权利要求1所述的基于信号放大检测HCV病毒载量的方法，其特征在于，S1中血浆是经乙二胺四乙酸二钾或枸橼酸盐抗凝处理后的。
3.如权利要求1所述的基于信号放大检测HCV病毒载量的方法，其特征在于，S1中全血在18℃-30℃中储存≤4h，或者18℃-30℃中储存≥4h则离心10-15min，或者2℃-8℃中储存≤48h，或者-20℃储存≤72h。
4.如权利要求1所述的基于信号放大检测HCV病毒载量的方法，其特征在于，S2中所述HCV病毒型别包括HCV1b、HCV2a、HCV3a、HCV3b、HCV6b；其中HCV1b对应的特异性引物的核酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.13所示，HCV2a对应的特异性引物的核酸序列如SEQ IDNO.14～SEQ ID NO.23所示，HCV3a对应的特异性引物的核酸序列如SEQ ID NO.24～SEQ IDNO.35所示，HCV3b对应的特异性引物的核酸序列如SEQ ID NO.36～SEQ ID NO.45所示，HCV6b对应的特异性引物的核酸序列如SEQ ID NO.46～SEQ ID NO.53所示。
5.如权利要求1所述的基于信号放大检测HCV病毒载量的方法，其特征在于，S6中洗液是由以下质量浓度的组分组成：1.5％的SSC、0.5％的十二烷基硫酸锂、余量为去离子水；放大分子溶液由以下质量浓度的组分组成：0.05％放大分子探针、3.75％Hepes、5.3％Tris、7.5％MgCl2、0.5％ZnCl2、余量为去离子水，所述放大分子探针的序列如SEQ ID NO.55所示。
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- 2018-04-03 CN CN201810303707.8A patent/CN108504777A/zh active Pending
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