ES2511218T5 - Kits y productos para detección de ácidos nucleicos en células individuales y para identificación de células raras en grandes poblaciones de células heterogéneas - Google Patents

Kits y productos para detección de ácidos nucleicos en células individuales y para identificación de células raras en grandes poblaciones de células heterogéneas Download PDF

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Description

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DESCRIPCION
Kits y productos para deteccion de acidos nucleicos en celulas individuales y para identificacion de celulas raras en grandes poblaciones de celulas heterogeneas
Campo de la invencion
La invencion se refiere generalmente a la qmmica de acidos nucleicos y a analisis bioqmmicos. Mas concretamente, la invencion se refiere a kits para la deteccion in situ de analitos de acido nucleico en celulas individuales. La invencion tambien se refiere a la deteccion y la identificacion de celulas individuales, particularmente celulas raras.
Antecedentes de la invencion
Numerosas pruebas han demostrado que las celulas cancerosas pueden disociarse del tumor primario y circular en los ganglios linfaticos, la medula osea, la sangre periferica u otros fluidos corporales. Se ha demostrado que estas celulas tumorales circulantes (CTC) reflejan las caractensticas biologicas de los tumores primarios, incluyendo el potencial para el desarrollo de metastasis y recurrencia del tumor. Por lo tanto, la deteccion de CTC puede indicar recurrencia de la enfermedad, propagacion de celulas tumorales, y un alto potencial de metastasis a distancia. Todos estos son factores clmicos informativos importantes en la identificacion del estado de la enfermedad de los pacientes de cancer de alto riesgo (p. ej., Vogel et al., 2002; Gilbey et al., 2004; Molnar et al., 2003; Vlems et al, 2003; Ma et al., 2003).
La validacion de la utilidad clmica de la deteccion de CTC como indicador pronostico no ha progresado tan rapidamente como se esperaba, en gran parte debido a la falta de tecnologfas de deteccion adecuadas. Una dificultad clave en la deteccion de CTC en sangre periferica u otros fluidos corporales es que las CTC estan presentes en la circulacion a concentraciones extremadamente bajas, que se estima que se encuentran en el intervalo de una celula tumoral entre 106-107 globulos blancos normales. Como resultado, cualquier tecnologfa de deteccion para esta aplicacion tiene que exhibir excepcional sensibilidad y especificidad con el fin de limitar la tasa tanto de falsos negativos como de falsos positivos a un nivel aceptable.
Uno de los enfoques existentes incorpora la tecnologfa de separacion inmunomagnetica en la deteccion de CTC intactas (documentos US 6.365.362; US 6.645.731). Utilizando esta tecnologfa, una muestra de sangre de un paciente de cancer se incuba con cuentas magneticas recubiertas con anticuerpos dirigidos contra un antfgeno epitelial de superficie como por ejemplo EpCAM (Cristofanilli et al., 2004). Las celulas marcadas magneticamente se afslan a continuacion, utilizando un separador magnetico. La fraccion enriquecida inmunomagneticamente se procesa adicionalmente para el analisis aguas abajo para la identificacion de CTC. Utilizando esta tecnologfa, se demostro en un estudio prospectivo que el numero de CTC despues del tratamiento es un indicador independiente de la supervivencia sin progresion y la supervivencia global en pacientes con cancer de mama metastasico (Cristofanilli et al., 2004). Aunque esta tecnologfa ha manifestado alta sensibilidad, su aplicabilidad esta limitada por la disponibilidad de anticuerpos de deteccion que son altamente sensibles y espedficos para tipos concretos de CTC. Los anticuerpos pueden presentar union no espedfica a otros componentes celulares que puede conducir a baja proporcion de senal a ruido y perjudicar la deteccion posterior. Los anticuerpos que se unen a CTC tambien se pueden unir a antfgenos presentes en otros tipos de celulas a bajo nivel, dando como resultado un alto nivel de falsos positivos.
Otro enfoque para determinar la presencia de CTC ha sido someter a ensayo la expresion espedfica en celulas tumorales del ARN mensajero en la sangre. La reaccion en cadena de la polimerasa con transcripcion inversa en tiempo real de (QPCR) se ha utilizado para correlacionar la deteccion de CTC con el pronostico del paciente. La RT- PCR en tiempo real se ha utilizado para la deteccion de ARNm de CEA en la sangre periferica de pacientes con cancer colorrectal (Ito et al., 2002). La supervivencia sin enfermedad de los pacientes con ARNm positivo para CEA en sangre en el postoperatorio fue significativamente menor que en los casos que fueron negativos para ARNm de CEA. Estos resultados sugieren que las celulas tumorales se vertieron al torrente sangumeo y dieron lugar a pobres resultados en paciente para pacientes con cancer colorrectal. Otro informe demostro la utilidad clmica de la deteccion molecular de CTC en pacientes de melanoma en fase IIBC y IIIAB de AJCC de alto riesgo utilizando marcadores de ARNm multiples mediante QPCR (Mocellin et al., 2004). La ventaja de la deteccion de ARNm espedfico de tumor es que la expresion de cualquier gen espedfico de tumor se puede utilizar para que sirva como marcador de diagnostico/pronostico. Sin embargo, el enfoque QPCR requiere el procedimiento laborioso de aislamiento del ARNm de la muestra de sangre y la transcripcion inversa antes de la reaccion de PCR. Con frecuencia se observan falsos positivos utilizando esta tecnica debido a la contaminacion de la muestra por el ADN cromosomico o la expresion de bajo nivel del gen marcador elegido en las celulas de la sangre normales (Fava et al. 2001). Ademas, el lfmite de la sensibilidad de deteccion de esta tecnica es como maximo alrededor de una celula tumoral por 1 ml de sangre, y la tecnologfa no puede proporcionar un recuento preciso del numero de CTC.
El documento US 5,635,352 se refiere a un ensayo de hibridacion en disolucion in vitro (ADN ramificado, o ADNr) para identificar analitos tales como acidos nucleicoas, lo que requiere que los acidos nucleicos individuales diana se liberen del entorno celular y se unan a un soporte solido via un multfmero de amplificacion y que los acidos nucleicos no diana en exceso se separen mediante lavado antes del marcado y la identificacion.
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Es muy deseable detectar y cuantificar la expresion del ARNm espedfico de celulas tumorales a nivel de una sola celulas en la sangre u otros fluidos corporales. Una tecnologfa que puede detectar la expresion de multiples ARNm espedficos en las celulas individuales en suspension permitina tanto la deteccion sensible y espedfica como la enumeracion de las CTC en la sangre u otros fluidos corporales. Ademas, esta tecnologfa podna permitir la recogida de las celulas CTC para analisis citologico y molecular aguas abajo. Las tecnicas disponibles actualmente no satisfacen estas necesidades.
La tecnologfa de hibridacion in situ (HIS) es un metodo establecido para localizar y detectar secuencias de ARNm espedficas en secciones de tejido o preparaciones celulares morfologicamente conservadas (Hicks et al., 2004). Los espedmenes mas comunes que se utilizan son las secciones congeladas, las secciones embebidas en parafina o las celulas en suspension que fueron sometidas a citocentrifugacion en portaobjetos de vidrio y fijadas con metanol. La deteccion se llevo a cabo utilizando sondas de acido nucleico que son complementarias a e hibridan con secuencias de nucleotidos espedficas dentro de las celulas y tejidos. La sensibilidad de la tecnica es tal que los niveles umbral de deteccion estan en el intervalo de 10-20 copias de ARNm por celula.
Sin embargo, la tecnologfa HIS se enfrenta a una serie de desaffos tecnicos que limitan su uso generalizado. En primer lugar, las celulas inmovilizadas sobre una superficie solida exhiben pobres cineticas de hibridacion. En segundo lugar, generalmente se requiere la optimizacion del analisis para un ARNm diana en la seleccion de la sonda, el marcaje y la deteccion, para cada seccion de tejido en la fijacion y permeabilizacion, y en la hibridacion y el lavado. Ademas, se necesita realizar diversos experimentos para controlar la especificidad de la sonda, para determinar la calidad del ARNm del tejido, y para determinar la eficacia de hibridacion del procedimiento experimental. Ademas de los problemas tecnicos, la tecnologfa HIS actual tiene criterios de funcionamiento relativamente bajos en lo que respecta a su sensibilidad de deteccion y reproducibilidad. La tasa de falsos positivos es todavfa alta a menos que las celulas de interes se vuelvan a examinar manualmente utilizando su morfologfa, que consume tiempo y mano de obra intensiva. La tecnologfa HIS actual tampoco tiene la capacidad de determinar cuantitativamente el nivel de expresion del ARNm o medir simultaneamente la expresion de multiples ARNm diana dentro de las celulas, lo que puede proporcionar valiosa informacion clmica como el aumento de la sensibilidad y especificidad de deteccion, y la identificacion del tipo, fuente y escenario de tumor primario.
Existen cuatro tipos principales de sondas que se utilizan normalmente para realizar la hibridacion in situ dentro de las celulas: sondas de oligonucleotidos (normalmente 20-40 bases de longitud), sondas de ADN de hebra sencilla (200-500 bases de longitud), sondas de ADN de cadena doble, o sondas de ARN (200-5000 bases de longitud). Las sondas de ARN son actualmente las sondas mas ampliamente utilizadas para la hibridacion in situ, ya que tienen la ventaja de que los hfbridos ARN-ARN son muy termoestables y son resistentes a la digestion por ARNasas. La sonda de aRn es un metodo directo de marcaje que adolece de varias dificultades. En primer lugar, se tienen que preparar sondas marcadas por separado para la deteccion de cada ARNm de interes. En segundo lugar, es tecnicamente diffcil detectar la expresion de ARNm multiplo de interes in situ al mismo tiempo. Como resultado, solo se ha informado recientemente de la deteccion secuencial de ARNm multiples utilizando diferentes metodos de marcaje (Schrock et al, 1996; Kosman et al, 2004). Ademas, con los metodos de marcaje directo, no hay buena manera de controlar la hibridacion cruzada potencial con secuencias no espedficas en las celulas. La hibridacion in situ con ADN ramificado (ADNr) es un metodo de marcaje indirecto para detectar ARNm en las celulas individuales (Player et al, 2001). Este metodo utiliza una serie de sondas de oligonucleotidos que tienen una porcion que hibrida con el ARNm espedfico de interes y otra porcion que hibrida con el ADNr para la amplificacion de la senal y la deteccion. La HIS con ADNr tiene la ventaja de utilizar sondas de oligonucleotidos no marcadas para la deteccion de todos los ARNm de interes y la amplificacion de la senal y la deteccion son componentes genericos en el analisis. Sin embargo, las sondas espedficas de genes en la HIS con ADNr necesitan ser teoricamente escrutadas frente a posibles interacciones de hibridacion no espedfica con otras secuencias de ARNm en las celulas. La hibridacion no espedfica de las sondas de oligonucleotidos en la HIS con ADNr puede convertirse en un problema serio cuando se tiene que utilizar un multiplo de esas sondas para la deteccion de los ARNm de baja abundancia. Del mismo modo, aunque es deseable el uso de HIS con ADNr para detectar o cuantificar multiples ARNm, tal hibridacion no espedfica de las sondas de oligonucleotidos es un problema potencial.
La presente invencion supera las dificultades mencionadas anteriormente y proporciona kits para la deteccion de acidos nucleicos en y para la identificacion de celulas individuales. Se obtendra una comprension completa de la invencion tras la revision de lo siguiente.
Compendio de la invencion
La invencion proporciona un kit para detectar un acido nucleico en una celula individual que comprende, empaquetado en uno o mas contenedores:
al menos un reactivo para celulas permeabilizantes;
al menos un conjunto de sondas de captura que comprende dos o mas sondas de captura capaces de hibridarse a
una secuencia de acido nucleico diana; y
(i) una sonda marcada que comprende una marca, en donde la sonda marcada es capaz de hibridarse con
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dicho conjunto de dos o mas sondas de captura, o
(ii) una sonda marcada que comprende una marca, y un amplificador hibridado con la sonda marcada y capaz de hibridarse con dicho conjunto de dos o mas sondas de captura, o
(iii) una sonda marcada que comprende una marca, un amplificador hibridado con la sonda marcada, y un preamplificador hibridado con el amplificador y capaz de hibridarse con dicho conjunto de dos o mas sondas de captura,
donde cada una de dichas sondas de captura comprende una seccion T que es complementaria a una region de dicha secuencia de acido nucleico diana y una seccion L que es complementaria a una region de (i) dicha sonda marcada, (ii) dicho amplificador o (iii) dicho preamplificador; donde las secciones T de las dos o mas sondas de captura en el conjunto de sondas de captura son complementarias a las regiones no solapantes de la secuencia de acido nucleico diana, y las secciones L de dos o mas sondas de captura en el conjunto de sondas de captura son complementarias a las regiones que no se solapan de (i) dicha sonda marcada, (ii) dicho amplificador o (iii) dicho preamplificador.
En una realizacion del kit, la diana de acido nucleico comprende una pluralidad de diferentes dianas de acido nucleico; y cada diana de acido nucleico tiene asociada o asociado su sonda marcada, su sonda de captura, su preamplificador y/o su amplificador; y cada sonda marcada comprende una marca, en la que la senal de cada marca es distinguible entre sl
La invencion proporciona ademas una muestra de celulas fijadas y permeabilizadas, que comprende:
a. al menos una celula fijada y permeabilizada que contiene un acido nucleico diana;
b. al menos un conjunto de sondas de captura que comprende dos o mas sondas de captura hibridadas con dicho acido nucleico diana; y
c. (i) una sonda marcada hibridada con dicho conjunto de dos o mas sondas de captura, o
(ii) una sonda marcada, y un amplificador hibridado con la sonda marcada y capaz de hibridarse con dicho conjunto de dos o mas sondas de captura, o
(iii) una sonda marcada, un amplificador hibridado con el marcador, y un preamplificador hibridado con el amplificador y capaz de hibridarse con dicho conjunto de dos o mas sondas de captura,
donde cada una de dichas sondas de captura comprende una seccion T que es complementaria a una region de dicho acido nucleico diana y una seccion L que es complementaria a una region de dicha (i) sonda marcada, (ii) amplificador, o (iii) preamplificador; donde las secciones T de dos o mas sondas de captura en el conjunto de sondas de captura son complementarias a regiones no solapantes del acido nucleico diana y las secciones L de dos o mas sondas de captura en el conjunto son complementarias a regiones no solapantes de (i) dicha sonda marcada, (ii) dicho amplificador o (iii) dicho preamplificador.
En una realizacion de la muestra, dichas celulas se suspenden en solucion o se inmovilizan en un portaobjetos. En otra realizacion, dichas celulas provienen de un fluido corporal o de sangre. En una realizacion adicional, dichas celulas comprenden una mezcla de tipos de celulas, en donde dicha mezcla comprende al menos una celula de un tipo especificado. En una realizacion adicional, la relacion de celulas de un tipo especificado a celulas de todos los demas tipos de la mezcla es inferior a 1 : 1x104 o inferior a 1 : 1x105 En una realizacion adicional, dichas celulas de un tipo espedfico son celulas tumorales, o espedficamente, celulas tumorales circulantes.
Tambien se describen metodos de deteccion de dianas de acido nucleico en las celulas individuales, incluidos los metodos de deteccion de multiples dianas en una sola celula. Se describen metodos de deteccion de celulas individuales, particularmente celulas raras entre grandes poblaciones de celulas heterogeneas, a traves de la deteccion de acidos nucleicos. Tambien se describen composiciones y sistemas relacionados.
En la presente memoria se describen procedimientos de deteccion de dos o mas dianas de acido nucleico en una celula individual. En los metodos, se describe una muestra que comprende la celula. La celula comprende, o se sospecha que comprende, una primera diana de acido nucleico y una segunda diana de acido nucleico. Se describen una primera sonda marcada que comprende una primera marca y una segunda sonda marcada que comprende una segunda marca, en donde una primera senal de la primera marca es distinguible de una segunda senal de la segunda marca. Tambien se describen al menos una primera sonda de captura y al menos una segunda sonda de captura.
La primera sonda de captura hibrida, en la celula, con la primera diana de acido nucleico (cuando la primera diana de acido nucleico esta presente en la celula), y la segunda sonda de captura hibrida, en la celula, con la segunda diana de acido nucleico (cuando la segunda diana de acido nucleico esta presente en la celula). La primera sonda marcada es capturada con la primera sonda de captura y la segunda sonda marcada es capturada con la segunda sonda de captura, capturando de este modo la primera sonda marcada con la primera diana de acido nucleico y la
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segunda sonda marcada con la segunda diana de acido nucleico. A continuacion se detectan la primera senal de la primera marca y la segunda senal de la segunda marca. Puesto que las primera y segunda marcas estan asociadas con sus respectivas dianas de acido nucleico a traves de las sondas de captura, la presencia de la marca o las marcas en la celula indica la presencia de la diana o dianas de acido nucleico correspondientes en la celula. Los metodos son opcionalmente cuantitativos. Por lo tanto, se pueden medir la intensidad de la primera senal y la intensidad de la segunda senal, y la intensidad de la primera senal se puede correlacionar con una cantidad de la primera diana de acido nucleico en la celula mientras que la intensidad de la segunda senal se correlaciona con una cantidad de la segunda diana de acido nucleico en la celula.
En un aspecto, las sondas marcadoras se unen directamente a las sondas de captura. Por ejemplo, se describen una unica primera sonda de captura y una unica segunda sonda captura, la primera sonda marcada hibrida con la primera sonda de captura, y la segunda sonda marcada hibrida con la segunda sonda de captura. En relacion con esto, se describen dos o mas primeras sondas de captura y dos o mas segundas sondas de captura, puesto que son una pluralidad de las primeras sondas marcadoras (p. ej., dos o mas primeras sondas marcadoras identicas) y una pluralidad de las segundas sondas marcadoras (p. ej., dos o mas segundas sondas marcadoras identicas). Las dos o mas primeras sondas de captura hibridan con la primera diana de acido nucleico, y los dos o mas segundas sondas de captura hibridan con la segunda diana de acido nucleico. Una unica primera sonda marcada hibrida con cada una de las primeras sondas de captura, y una unica segunda sonda marcada hibrida con cada una de las segundas sondas de captura.
Como se describe allf las sondas marcadoras son capturadas con las sondas de captura indirectamente, por ejemplo, a traves de la union de los preamplificadores y/o amplificadores. Si se emplean amplificadores, se proporcionan una unica primera sonda de captura, una unica segunda sonda de captura, una pluralidad de las primeras sondas marcadoras, y una pluralidad de las segundas sondas marcadoras. Un primer amplificador hibrida con la primera sonda de captura y con la pluralidad de primeras sondas marcadoras, y un segundo amplificador hibrida con la segunda sonda de captura y con la pluralidad de segundas sondas marcadoras. Alternativamente, se proporcionan dos o mas primeras sondas de captura, dos o mas segundas sondas de captura, una pluralidad de las primeras sondas marcadoras, y una pluralidad de las segundas sondas marcadoras. Las dos o mas primeras sondas de captura hibridan con la primera diana de acido nucleico, y las dos o mas segundas sondas de captura hibridan con la segunda diana de acido nucleico. Un primer amplificador hibrida con cada una de las primera sondas de captura, y la pluralidad de primeras sondas marcadoras hibrida con los primeros amplificadores. Un segundo amplificador hibrida con cada una de las segundas sondas de captura, y la pluralidad de segundas sondas marcadoras hibrida con los segundos amplificadores.
Si se emplean preamplificadores, se describen una unica primera sonda de captura, una unica segunda sonda de captura, una pluralidad de las primeras sondas marcadoras, y una pluralidad de las segundas sondas marcadoras. Un primer preamplificador hibrida con la primera sonda de captura, una pluralidad de primeros amplificadores hibrida con el primer preamplificador, y la pluralidad de primeras sondas marcadoras hibrida con los primeros amplificadores. Un segundo preamplificador hibrida con la segunda sonda de captura, una pluralidad de segundos amplificadores hibrida con el segundo preamplificador, y la pluralidad de segundas sondas marcadoras hibrida con los segundos amplificadores. Alternativamente, se describen dos o mas primeras sondas de captura, dos o mas segundas sondas de captura, una pluralidad de las primeras sondas marcadoras, y una pluralidad de las segundas sondas marcadoras. Las dos o mas primeras sondas de captura hibridan con la primera diana de acido nucleico, y las dos o mas segundas sondas de captura hibridan con la segunda diana de acido nucleico. Un primer preamplificador hibrida con cada una de las primera sondas de captura, una pluralidad de primeros amplificadores hibrida con cada una de los primeros preamplificadores, y la pluralidad de primeras sondas marcadoras hibrida con los primeros amplificadores. Un segundo preamplificador hibrida con cada una de las segundas sondas de captura, una pluralidad de segundos amplificadores hibrida con cada uno de los segundos preamplificadores, y la pluralidad de segundas sondas marcadoras hibrida con los segundos amplificadores.
Si se emplean dos o mas primeras sondas de captura y/o dos o mas segundas sondas de captura, las sondas de captura hibridan preferiblemente con secuencias de polinucleotidos no solapantes en su respectiva diana de acido nucleico.
Segun se describe en la presente memoria, se describen una pluralidad de las primeras sondas marcadoras y una pluralidad de las segundas sondas marcadoras. Un primer polinucleotido amplificado se produce mediante amplificacion por cfrculo rodador de un primer polinucleotido circular hibridado con la primera sonda de captura. El primer polinucleotido circular comprende al menos una copia de una secuencia de polinucleotidos identica a una secuencia de polinucleotidos en la primera sonda marcada, y el primer polinucleotido amplificado comprende por tanto una pluralidad de copias de una secuencia de polinucleotidos complementaria a la secuencia de polinucleotidos de la primera sonda marcada. La pluralidad de primeras sondas marcadoras hibrida a continuacion con el primer polinucleotido amplificado. De un modo similar, se produce un segundo polinucleotido amplificado mediante amplificacion por cfrculo rodador de un segundo polinucleotido circular hibridado con la segunda sonda de captura. El segundo polinucleotido circular comprende al menos una copia de una secuencia de polinucleotidos identica a una secuencia de polinucleotidos de la segunda sonda marcada, y el segundo polinucleotido amplificado comprende por tanto una pluralidad de copias de una secuencia de polinucleotidos complementaria a la secuencia de polinucleotidos en la segunda sonda marcada. La pluralidad de segundas sondas marcadoras hibrida a
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continuacion con el segundo polinucleotido amplificado. Los polinucleotidos amplificados permanecen asociados con la sonda o las sondas de captura, y las sondas marcadoras son capturadas de este modo con las dianas de acido nucleico.
Los metodos son utiles para la deteccion multiplex de acidos nucleicos, incluyendo la deteccion simultanea de mas de dos dianas de acido nucleico. Por lo tanto, la celula comprende opcionalmente o se sospecha que comprende un tercer acido nucleico diana, y los metodos incluyen opcionalmente: proporcionar una tercera sonda marcada que comprende una tercera marca, en donde una tercera senal de la tercera marca es distinguible de las primeras y segundas senales, proporcionar al menos una tercera sonda de captura, hibridar en la celula la tercera sonda de captura con la tercera diana de acido nucleico (cuando esta presente en la celula), capturar la tercera sonda marcada con la tercera sonda de captura, y detectar la tercera senal de la tercera marca. Se detectan simultaneamente de manera similar en la celula si se desea cuartas, quintas, sextas, etc. dianas de acido nucleico. Cada etapa de hibridacion o de captura se lleva a cabo preferiblemente para todas las dianas de acido nucleico al mismo tiempo.
Una diana de acido nucleico puede ser esencialmente cualquier acido nucleico que se detecte deseablemente en la celula. Por ejemplo, una diana de acido nucleico puede ser un ADN, un ADN cromosomico, un ARN, un ARNm, un microARN, un ARN ribosomico, o similares. La diana de acido nucleico puede ser un acido nucleico endogeno a la celula. En cuanto a otro ejemplo, la diana puede ser un acido nucleico introducido o expresado en la celula mediante la infeccion de la celula con un patogeno, por ejemplo, un ARN o ADN genomico viral o bacteriano, un plasmido, un ARNm viral o bacteriano, o similares.
Las primera y segunda (y/o opcionales tercera, cuarta, etc.) dianas de acido nucleico pueden ser parte de una sola molecula de acido nucleico, o pueden ser moleculas separadas. Como se describe en la presente memoria, la primera diana de acido nucleico es un primer ARNm y la segunda diana de acido nucleico es un segundo ARNm. En otra clase de realizaciones, la primera diana de acido nucleico comprende una primera region de un ARNm y la segunda diana de acido nucleico comprende una segunda region del mismo ARNm. Alternativamente, la primera diana de acido nucleico comprende una primera secuencia de polinucleotidos de ADN cromosomico y la segunda diana de acido nucleico comprende una segunda secuencia de polinucleotidos de ADN cromosomico. Las primera y segunda secuencias de polinucleotidos de ADN cromosomico estan localizadas opcionalmente en el mismo cromosoma, por ejemplo, dentro del mismo gen, o en diferentes cromosomas.
En un aspecto, la senal o senales de la diana o dianas de acido nucleico se normalizan. Como se describe en la presente memoria, la segunda diana de acido nucleico comprende un acido nucleico de referencia, y el metodo incluye la normalizacion de la primera senal a la segunda senal. La marca (primera, segunda, tercera, etc.) puede ser esencialmente cualquier marca conveniente que proporcione directa o indirectamente una senal detectable. En un aspecto, la primera marca es una primera marca fluorescente y la segunda marca es una segunda marca fluorescente.
Los metodos se pueden utilizar para detectar la presencia de las dianas de acido nucleico en las celulas de esencialmente cualquier tipo de muestra. Por ejemplo, la muestra puede estar derivada de un fluido corporal tal como sangre. Los metodos para la deteccion de dianas de acido nucleico en las celulas se pueden utilizar para identificar las celulas. Por ejemplo, se puede identificar que una celula es de un tipo deseado basandose en que acidos nucleicos contiene, y a que niveles. Por lo tanto, los metodos incluyen la identificacion de la celula como una celula diana deseada basandose en la deteccion de las primeras y segundas senales (y opcionales tercera, cuarta senales, etc.) dentro de la celula. Por mencionar algunos pocos ejemplos, la celula puede ser una celula tumoral circulante, una celula infectada viralmente, una celula fetal en sangre materna, una celula bacteriana u otro microorganismo en una muestra biologica, o una celula endotelial, celula endotelial precursora o celula miocardica en la sangre.
La celula se fija y permeabiliza tfpicamente antes de la hibridacion de las sondas de captura, para retener las dianas de acido nucleico en la celula y permitir que las sondas de captura, las sondas marcadoras, etc., entren en la celula. La celula se lava opcionalmente para eliminar los materiales no capturados por una de las dianas de acido nucleico. La celula se puede lavar despues de cualquiera de las diversas etapas, por ejemplo, despues de la hibridacion de las sondas de captura con las dianas de acido nucleico para eliminar las sondas de captura no unidas, despues de la hibridacion de los preamplificadores, los amplificadores, y/o las sondas marcadoras con las sondas de captura, y/o similares. Resultara evidente que la diana o las dianas de acido nucleico de doble hebra son preferiblemente desnaturalizadas, p. ej., con calor, antes de la hibridacion de la sonda o las sondas de captura correspondientes con la diana o las dianas.
Preferiblemente, la celula esta en suspension para todas o la mayona de las etapas del metodo. Por lo tanto, la celula esta en suspension en la muestra que comprende la celula, y/o la celula esta en suspension durante las etapas de hibridacion, captura y/o deteccion. Alternativamente, la celula esta en suspension en la muestra que comprende la celula, y la celula se fija sobre un sustrato durante las etapas de hibridacion, captura y/o deteccion. Por ejemplo, la celula puede estar en suspension durante las etapas de hibridacion, captura y lavado opcionales e inmovilizada sobre un sustrato durante la etapa de deteccion. Si la celula esta en suspension, las primera y segunda (y opcional tercera, etc.) senales se pueden detectar convenientemente mediante citometna de flujo. Las senales
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procedentes de las marcas se detectan tfpicamente en una sola operacion.
Generalmente, en la presente memoria se describen metodos para someter a ensayo un nivel relativo de uno o mas acidos nucleicos diana en una celula individual. En los metodos, se describe una muestra que comprende la celula. La celula comprende o se sospecha que comprende un primer acido nucleico diana, y comprende un segundo acido nucleico de referencia. Tambien se describen una primera sonda marcada que comprende una primera marca y una segunda sonda marcada que comprende una segunda marca, en donde una primera senal de la primera marca es distinguible de una segunda senal de la segunda marca. En la celula, la primera sonda marcada se captura con el primer acido nucleico diana (cuando esta presente en la celula) y la segunda sonda marcada se captura con el segundo acido nucleico de referencia. La primera senal de la primera marca y la segunda senal de la segunda marca se detectan a continuacion en la celula individual, y se mide la intensidad de cada senal. La intensidad de la primera senal es normalizada a la intensidad de la segunda senal (referencia). De este modo se someten a ensayo el nivel del primer acido nucleico diana con respecto al nivel del segundo acido nucleico de referencia en la celula, ya que las primera y segunda marcas estan asociadas con sus respectivos acidos nucleicos. Los metodos son opcionalmente cuantitativos, permitiendo la medicion de la cantidad del primer acido nucleico diana con respecto a la cantidad del segundo acido nucleico de referencia en la celula. Por lo tanto, la intensidad de la primera senal normalizada con respecto a la de la segunda senal se puede correlacionar con una cantidad del primer acido nucleico diana presente en la celula.
Las sondas marcadoras se pueden unir directamente a los acidos nucleicos. Por ejemplo, la primera sonda marcada puede hibridar con el primer acido nucleico diana y/o la segunda sonda marcada puede hibridar con el segundo acido nucleico de referencia. Alternativamente, las sondas marcadoras se pueden unir indirectamente a los acidos nucleicos, por ejemplo, a traves de sondas de captura. Segun se describe en la presente memoria, se describen al menos una primera sonda de captura y al menos una segunda sonda de captura. En la celula, la primera sonda de captura hibrida con el primer acido nucleico diana y la segunda sonda de captura hibrida con el segundo acido nucleico de referencia. La primera sonda marcada es capturada con la primera sonda de captura y la segunda sonda marcada es capturada con la segunda sonda de captura, capturando de este modo la primera sonda marcada con el primer acido nucleico diana y la segunda sonda marcada con el segundo acido nucleico de referencia. Las caractensticas descritas para los metodos anteriores se aplican tambien, con respecto a la configuracion y al numero de sondas marcadoras y de captura, el uso opcional de preamplificadores y/o amplificadores, la amplificacion por cfrculo rodador de polinucleotidos circulares, y similares.
Los metodos se pueden utilizar para la deteccion multiplex de acidos nucleicos, incluyendo la deteccion simultanea de dos o mas acidos nucleicos diana. Por lo tanto, la celula comprende opcionalmente o se sospecha que comprende un tercer acido nucleico diana, y los metodos incluyen opcionalmente: proporcionar una tercera sonda marcada que comprende una tercera marca, en donde una tercera senal de la tercera marca es distinguible de las primeras y segundas senales; capturar, en la celula, la tercera sonda marcada con el tercer acido nucleico diana (cuando esta presente en la celula); detectar la tercera senal de la tercera marca, cuya deteccion comprende medir una intensidad de la tercera senal; y normalizar la intensidad de la tercera senal a la intensidad de la segunda senal. Si se desea, se detectan simultaneamente cuartos, quintos, sextos, etc. acidos nucleicos de una manera similar en la celula.
Los metodos para someter a ensayo niveles relativos de acidos nucleicos diana en las celulas se pueden utilizar para identificar las celulas. Por ejemplo, se puede identificar que una celula es de un tipo deseado basandose en que acidos nucleicos contiene, y en que niveles. Por lo tanto, los metodos incluyen la identificacion de la celula como una celula diana deseada basandose en la primera senal normalizada (y las tercera, cuarta, etc. senales normalizadas opcionales).
Esencialmente se aplican tambien todas las caractensticas senaladas para los metodos anteriores, segun corresponda; por ejemplo, con respecto al tipo de acidos nucleicos diana y de referencia, al tipo de celula, la fuente de la muestra, la fijacion y permeabilizacion de la celula, el lavado de la celula, la desnaturalizacion de los acidos nucleicos diana y de referencia de doble hebra, el tipo de marcas, el uso de sondas de bloqueo opcionales, la deteccion de senales, la deteccion (y medicion de la intensidad) mediante citometna de flujo o microscopfa, la presencia de la celula en suspension o inmovilizada sobre un sustrato, y/o similares.
Tambien se describen en la presente memoria metodos para realizar el analisis comparativo de la expresion genica en celulas individuales. En los metodos, se proporciona una primera poblacion celular mixta que comprende una o mas celulas de un tipo especificado. Se mide un nivel de expresion de uno o mas acidos nucleicos diana con respecto a un acido nucleico de referencia en las celulas del tipo especificado de la primera poblacion, para proporcionar un primer perfil de expresion. Tambien se proporciona una segunda poblacion celular mixta que comprende una o mas celulas del tipo especificado, y se mide un nivel de expresion de los uno o mas acidos nucleicos diana con respecto al acido nucleico de referencia en las celulas del tipo especificado de la segunda poblacion, para proporcionar un segundo perfil de expresion. A continuacion se comparan los primeros y segundos perfiles de expresion.
Esencialmente se aplican tambien todas las caractensticas senaladas para los metodos anteriores, segun corresponda; por ejemplo, con respecto al tipo de acidos nucleicos diana y de referencia, al tipo de celula, la fuente
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de la muestra, la fijacion y permeabilizacion de la celula, el lavado de la celula, la desnaturalizacion de los acidos nucleicos diana y de referencia de doble hebra, el tipo de marcas, el uso y la configuracion de las sondas marcadoras, las sondas de captura, los preamplificadores y/o amplificadores, el uso de sondas de bloqueo opcionales, la deteccion de senales, la deteccion (y medicion de la intensidad) mediante citometna de flujo o microso^a, la presencia de la celula en suspension o inmovilizada sobre un sustrato, y/o similares.
En un aspecto, en la presente memoria se describen metodos que facilitan la asociacion de una alta densidad de marcas de acidos nucleicos diana en las celulas. Se describen metodos de deteccion de dos o mas dianas de acido nucleico en una celula individual. En los metodos, se proporciona una muestra que comprende la celula. La celula comprende o se sospecha de que comprende una primera diana de acido nucleico y una segunda diana de acido nucleico. En la celula, una primera marca se captura con la primera diana de acido nucleico (cuando esta presente en la celula) y una segunda marca se captura con la segunda diana de acido nucleico (cuando esta presente en la celula). Una primera senal de la primera marca es distinguible de una segunda senal de la segunda marca. Como se ha senalado, las marcas son capturadas a alta densidad. Por lo tanto, se captura un promedio de al menos una copia de la primera marca por nucleotido de la primera diana de acido nucleico con la primera diana de acido nucleico sobre una region que abarca al menos 20 nucleotidos contiguos de la primera diana de acido nucleico, y se captura un promedio de al menos una copia de la segunda marca por nucleotido de la segunda diana de acido nucleico con la segunda diana de acido nucleico sobre una region que abarca al menos 20 nucleotidos contiguos de la segunda diana de acido nucleico. Se detectan la primera senal de la primera marca y la segunda senal de la segunda marca.
Espedficamente, se captura un promedio de al menos cuatro, ocho, o doce copias de la primera marca por nucleotido de la primera diana de acido nucleico con la primera diana de acido nucleico sobre una region que abarca al menos 20 nucleotidos contiguos de la primera diana de acido nucleico, y se captura un promedio de al menos cuatro, ocho, o doce copias de la segunda marca por nucleotido de la segunda diana de acido nucleico con la segunda diana de acido nucleico sobre una region que abarca al menos 20 nucleotidos contiguos de la segunda diana de acido nucleico. Espedficamente, se captura un promedio de al menos dieciseis copias de la primera marca por nucleotido de la primera diana de acido nucleico con la primera diana de acido nucleico sobre una region que abarca al menos 20 nucleotidos contiguos de la primera diana de acido nucleico, y se captura un promedio de al menos dieciseis copias de la segunda marca por nucleotido de la segunda diana de acido nucleico con la segunda diana de acido nucleico sobre una region que abarca al menos 20 nucleotidos contiguos de la segunda diana de acido nucleico.
Esencialmente se aplican tambien todas las caractensticas senaladas para los metodos anteriores, segun corresponda, por ejemplo, con respecto al tipo de marcas, la deteccion de senales, el tipo, el tratamiento, y la suspension de la celula, y/o similares. Una densidad similar de las tercera, cuarta, quinta, sexta, etc. marcas se captura opcionalmente con las tercera, cuarta, quinta, sexta, etc. dianas de acido nucleico.
Tambien se describen en la presente memoria metodos de deteccion de una celula individual de un tipo especificado. En los metodos, se proporciona una muestra que comprende una mezcla de tipos de celulas incluyendo al menos una celula del tipo especificado. Se proporcionan una primera sonda marcada que comprende una primera marca y una segunda sonda marcada que comprende una segunda marca, en donde una primera senal de la primera marca es distinguible de una segunda senal de la segunda marca. En la celula, la primera sonda marcada se captura con un primer acido nucleico diana (cuando la primera diana de acido nucleico esta presente en la celula) y la segunda sonda marcada se captura con una segunda diana de acido nucleico (cuando la segunda diana de acido nucleico esta presente en la celula). La primera senal de la primera marca y la segunda senal de la segunda marca se detectan y se correlacionan con la presencia, ausencia o cantidad de las correspondientes primera y segunda dianas de acido nucleico en la celula. Se identifica que la celula es del tipo especificado basandose en la deteccion de la presencia, ausencia o cantidad de la primera y la segunda dianas de acido nucleico dentro de la celula, donde el tipo especificado de celula es distinguible del otro tipo o los otros tipos de celulas en la mezcla basandose en la presencia, ausencia o cantidad de la primera diana de acido nucleico o la presencia, ausencia o cantidad de la segunda diana de acido nucleico en la celula (es decir, las dianas de acido nucleico son redundantes para los marcadores del tipo de celula especificado). Opcionalmente se miden y correlacionan la intensidad de la primera senal y la intensidad de la segunda senal con una cantidad del correspondiente acido nucleico presente en la celula. En una clase de realizaciones, la celula comprende un primer acido nucleico diana y un segundo acido nucleico diana, y se identifica que la celula es del tipo especificado basandose en la deteccion de la presencia o cantidad de la primera y la segunda dianas de acido nucleico dentro de la celula, donde el tipo especificado de celula es distinguible del otro tipo o de los otros tipos de celula en la mezcla basandose en la presencia o cantidad de la primera diana de acido nucleico o la presencia o cantidad de la segunda diana de acido nucleico en la celula.
Las sondas marcadoras pueden unirse directamente a las dianas de acido nucleico. Por ejemplo, la primera sonda marcada puede hibridar con la primera diana de acido nucleico y/o la segunda sonda marcada puede hibridar con la segunda diana de acido nucleico. Las sondas marcadoras son capturadas opcionalmente con las dianas de acido nucleico a traves de sondas de captura. Segun se describe en la presente memoria, se proporcionan al menos una primera sonda de captura y al menos una segunda sonda de captura. En la celula, la primera sonda de captura hibrida con la primera diana de acido nucleico y la segunda sonda de captura hibrida con la segunda diana de acido
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Opcionalmente se detectan en la celula las tercera, cuarta, quinta, etc. dianas de acido nucleico. Por ejemplo, el metodo incluye opcionalmente: proporcionar una tercera sonda marcada que comprende una tercera marca, en donde una tercera senal de la tercera marca es distinguible de las primeras y segundas senales, capturar en la celula la tercera sonda marcada con una tercera diana de acido nucleico (cuando la tercera diana esta presente en la celula), y detectar la tercera senal de la tercera marca. Las tercera, cuarta, quinta, etc. sondas marcadoras opcionalmente hibridan directamente con su acido nucleico correspondiente, o pueden ser capturadas indirectamente a traves de sondas de captura como se describe para las primera y segunda sondas marcadoras.
La primera y/o segunda senal se puede normalizar a la tercera senal. Por lo tanto, la celula comprende la tercera diana de acido nucleico, y los metodos incluyen la identificacion de que la celula es del tipo especificado basandose en la primera y/o segunda senal normalizada, por ejemplo, si el tipo de celula diana es distinguible del otro tipo u otros tipos de celulas en la mezcla basandose en el numero de copias de las primera y/o segunda dianas de acido nucleico, en lugar de puramente en su presencia en el tipo de celula diana y no en el otro u otros tipos celulares.
Como ejemplo adicional, la tercera diana de acido nucleico puede servir como un tercer marcador redundante para el tipo de celula diana, por ejemplo, para mejorar la especificidad del analisis para el tipo de celula deseado. Por lo tanto, los metodos incluyen la correlacion de la tercera senal detectada a partir de la celula con la presencia, ausencia o cantidad de la tercera diana de acido nucleico en la celula, y la identificacion de la celula como del tipo especificado basandose en la deteccion de la presencia, ausencia, o la cantidad de las primera, segunda y tercera dianas de acido nucleico, dentro de la celula, en donde el tipo especificado de celula es distinguible del otro u otros tipos de celulas en la mezcla basandose en la presencia, ausencia o cantidad de la primera diana de acido nucleico, la presencia, ausencia o cantidad de la segunda diana de acido nucleico, o la presencia, ausencia o cantidad de la tercera diana de acido nucleico en la celula.
Los metodos pueden aplicarse a la deteccion y la identificacion incluso de tipos raros de celulas. Por ejemplo, la proporcion de celulas del tipo especificado con respecto a las celulas de todos los otros tipos en la mezcla es opcionalmente menos de 1:1x104, menos de 1:1x105, menos de 1:1x106, menos de 1:1x107, menos de 1:1x108, o incluso menos de 1:1x109.
Esencialmente todas las caractensticas senaladas por los metodos anteriores se aplican a estas realizaciones y, en su caso; por ejemplo, con respecto al tipo de dianas de acido nucleico, el tipo de celula, la fuente de la muestra, la fijacion y la permeabilizacion de la celula, el lavado de la celula, la desnaturalizacion de acidos nucleicos de doble hebra, el tipo de marcas, el uso de sondas de bloqueo opcionales, la deteccion de senales, la deteccion (y medicion de la intensidad) de las senales de la celula individual mediante citometna de flujo o microscopfa, la presencia de la celula en suspension o inmovilizada sobre un sustrato, y/o similares.
Adicionalmente se describen composiciones utiles en la practica o producidas mediante los metodos.
Espedficamente se describe una composicion que incluye una celula fijada y permeabilizada, cuya celula
comprende o se sospecha de que comprende una primera diana de acido nucleico y una segunda diana de acido nucleico, al menos una primera sonda de captura susceptible de hibridar con la primera diana de acido nucleico, al menos una segunda sonda de captura susceptible de hibridar con la segunda diana de acido nucleico, una primera sonda marcada que comprende una primera marca, y una segunda sonda marcada que comprende una segunda marca. Una primera senal de la primera marca es distinguible de una segunda senal de la segunda marca. La celula comprende opcionalmente las primera y segunda sondas de captura y sondas marcadoras. Las primera y segunda sondas de captura estan opcionalmente hibridadas con sus respectivas dianas de acido nucleico en la celula.
Las caractensticas descritas para los metodos anteriores para la captura indirecta de las sondas marcadoras con las dianas de acido nucleico tambien se aplican a estas realizaciones, por ejemplo, con respecto a la configuracion y al numero de sondas marcadoras y de captura, al uso opcional de preamplificadores y/o amplificadores, y similares.
Espedficamente, la composicion comprende una pluralidad de las primeras sondas marcadoras, una pluralidad de
las segundas sondas marcadoras, un primer polinucleotido amplificado producido mediante amplificacion por drculo rodador de un primer polinucleotido circular hibridado con la primera sonda de captura, y un segundo polinucleotido amplificado producido mediante amplificacion por drculo rodador de un segundo polinucleotido circular hibridado con la segunda sonda de captura. El primer polinucleotido circular comprende al menos una copia de una secuencia de polinucleotidos identica a una secuencia de polinucleotidos en la primera sonda marcada, y el primer polinucleotido amplificado comprende una pluralidad de copias de una secuencia de polinucleotidos complementaria a la secuencia de polinucleotidos en la primera sonda marcada. El segundo polinucleotido circular comprende al menos una copia de una secuencia de polinucleotidos identica a una secuencia de polinucleotidos en la segunda sonda marcada, y el segundo polinucleotido amplificado comprende una pluralidad de copias de una secuencia de polinucleotidos
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complementaria a la secuencia de polinucleotidos en la segunda sonda marcada. La composicion tambien puede incluir reactivos necesarios para la produccion de los polinucleotidos amplificados, por ejemplo, una polimerasa de acido nucleico suministrada exogenamente, una ligasa de acido nucleico suministrada exogenamente, y/o nucleosidos trifosfato suministrados exogenamente (p. ej., dNTP).
La celula incluye opcionalmente dianas de acido nucleico adicionales, y la composicion (y celula) puede incluir reactivos para la deteccion de estas dianas. Por ejemplo, la celula puede comprender o se puede sospechar que comprende una tercera diana de acido nucleico, y la composicion puede incluir al menos una tercera sonda de captura susceptible de hibridar con la tercera diana de acido nucleico y la tercera sonda marcada que comprende una tercera marca. Una tercera senal de la tercera marca es distinguible de las primeras y segundas senales. La celula incluye opcionalmente una cuarta, quinta, sexta, etc. dianas de acido nucleico, y la composicion incluye opcionalmente una cuarta, quinta, sexta, etc. sondas marcadoras y sondas de captura.
La celula puede estar presente en una mezcla de celulas, por ejemplo, una mezcla heterogenea compleja. Espedficamente, la celula es de un tipo especificado, y la composicion comprende uno o mas de otros tipos de celulas. Estas otras celulas pueden estar presentes en exceso, incluso gran exceso, de la celula. Por ejemplo, la proporcion de celulas del tipo especificado con respecto a las celulas de todos los otros tipos en la composicion es opcionalmente menos de 1:1x104, menos de 1:1x105, menos de 1:1x106, menos de 1:1x1o7, menos de 1:1x108, o incluso menos de 1:1x109.
Esencialmente se aplican tambien todas las caractensticas senaladas para los metodos anteriores, segun corresponda; por ejemplo, con respecto al tipo de diana de acido nucleico, el tipo y fuente de la celula, la ubicacion de diversas dianas en una sola molecula o en moleculas diferentes, el tipo de marcas, la inclusion de sondas de bloqueo opcionales, y/o similares. La celula esta opcionalmente en suspension en la composicion.
Se describe una composicion que comprende una celula, cuya celula incluye una primera diana de acido nucleico, una segunda diana de acido nucleico, una primera marca cuya presencia en la celula es indicativa de la presencia de la primera diana de acido nucleico en la celula, y una segunda marca cuya presencia en la celula es indicativa de la presencia de la segunda diana de acido nucleico en la celula, en donde una primera senal de la primera marca es distinguible de una segunda senal de la segunda marca. Esta presente un promedio de al menos una copia de la primera marca en la celula por nucleotido de la primera diana de acido nucleico sobre una region que abarca al menos 20 nucleotidos contiguos de la primera diana de acido nucleico, y esta presente un promedio de al menos una copia de la segunda marca en la celula por nucleotido de la segunda diana de acido nucleico sobre una region que abarca al menos 20 nucleotidos contiguos de la segunda diana de acido nucleico.
Las copias de la primera marca se asocian ffsicamente con el primer acido nucleico diana, y las copias de la segunda marca se asocian ffsicamente con la segunda diana de acido nucleico. Por ejemplo, la primera marca puede ser parte de una primera sonda marcada y la segunda marca parte de una segunda sonda marcada, donde se capturan las sondas marcadoras con los acidos nucleicos diana.
Esencialmente todas las caractensticas mencionadas anteriormente se aplican tambien, segun corresponda, por ejemplo, con respecto al tipo y la cantidad de marcas, la suspension de la celula, y/o similares. Una densidad parecida de marcas esta presente opcionalmente para las tercera, cuarta, quinta, sexta, etc. dianas de acido nucleico.
En la presente memoria se describen equipos utiles para la practica de los metodos. Una clase general de realizaciones proporciona un kit para la deteccion de una primera diana de acido nucleico y una segunda diana de acido nucleico en una celula individual. El kit incluye al menos un reactivo para la fijacion y/o permeabilizacion de la celula, al menos una primera sonda de captura susceptible de hibridar con el primer acido nucleico diana, al menos una segunda sonda de captura susceptible de hibridar con la segunda diana de acido nucleico, una primera sonda marcada que comprende una primera marca, y una segunda sonda marcada que comprende una segunda marca, en donde una primera senal de la primera marca es distinguible de una segunda senal de la segunda marca, empaquetados en uno o mas recipientes.
Esencialmente todas las caractensticas senaladas anteriormente se aplican tambien, segun corresponda; por ejemplo, con respecto al numero de dianas de acido nucleico, la configuracion y el numero de las sondas marcadoras y de captura, la inclusion de preamplificadores y/o amplificadores, la inclusion de sondas de bloqueo, la inclusion de reactivos de amplificacion, el tipo de diana de acido nucleico, la ubicacion de las diversas dianas en una sola molecula o en diferentes moleculas, el tipo de marcas, la inclusion de sondas de bloqueo opcionales, y/o similares.
Tambien se describe en la presente memoria un kit para detectar una celula individual de un tipo especificado a partir de una mezcla de tipos de celulas mediante la deteccion de una primera diana de acido nucleico y una segunda diana de acido nucleico. El kit incluye al menos un reactivo para la fijacion y/o permeabilizacion de la celula, una primera sonda marcada que comprende una primera marca, y una segunda sonda marcada que comprende una segunda marca, en donde una primera senal de la primera marca es distinguible de una segunda senal de la segunda marca, empaquetados en uno o mas recipientes. El tipo especificado de celula es distinguible de los otros
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Esencialmente se aplican tambien todas las caractensticas senaladas anteriormente, segun corresponda; por ejemplo, con respecto al numero de dianas de acido nucleico, la inclusion de sondas de captura, la configuracion y numero de las sondas marcadoras y/o de captura, la inclusion de preamplificadores y/o amplificadores, la inclusion de sondas de bloqueo, la inclusion de reactivos de amplificacion, el tipo de diana de acido nucleico, la ubicacion de diversas dianas en una sola molecula o en moleculas diferentes, el tipo de marcas, la inclusion de sondas de bloqueo opcionales, y/o similares.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 ilustra esquematicamente el flujo de trabajo de la tecnologfa QMAGEX para un metodo descrito en la presente memoria.
La Figura 2 ilustra esquematicamente un enfoque de marcaje directo en el que las sondas marcadoras hibridan con el acido nucleico diana.
La Figura 3 ilustra esquematicamente un enfoque de marcaje indirecto en el que las sondas marcadoras hibridan con sondas de captura hibridadas con el acido nucleico diana.
La Figura 4 ilustra esquematicamente un enfoque de diseno de sonda de captura de marcaje indirecto que utiliza un par de sondas de captura independientes para mejorar la especificidad de captura de la sonda marcada por el acido nucleico diana.
La Figura 5 ilustra esquematicamente un enfoque de diseno de sonda de captura de marcaje indirecto que utiliza tres o mas sondas de captura independientes para mejorar la especificidad de captura de la sonda marcada por el acido nucleico diana.
La Figura 6 ilustra esquematicamente enfoques de diseno de sondas para detectar multiples moleculas diana en paralelo utilizando marcaje directo (Panel A) o marcaje indirecto con dos sondas de captura independientes (Panel B).
La Figura 7 ilustra esquematicamente enfoques de diseno de sondas para reducir tasas de falsos positivos en la identificacion de celulas raras anclando varios tipos de partfculas generadoras de senal (marcas) a la misma molecula diana. El Panel A muestra multiples tipos de partfculas generadoras de senal (marcas) en una unica diana. El Panel B muestra multiples tipos de partfculas generadoras de senal (marcas) en mas de una diana, donde se mantienen las intensidades de senal relativas de la serie de partfculas a traves de todas las dianas. El Panel C muestra un conjunto de partfculas generadoras de senal (marcas) en una molecula diana, donde diferentes dianas tienen conjuntos caractensticamente diferentes.
La Figura 8 Paneles A-D ilustra esquematicamente diferentes estructuras de los amplificadores ilustrativos.
La Figura 9 ilustra esquematicamente la utilizacion de la amplificacion por drculo rodador para amplificar la senal. Como se muestra en el Panel A, una molecula de nucleotidos circular se ancla a la sonda o las sondas de captura. Como se muestra en el Panel B, aparece una molecula de cadena larga con muchas secuencias repetidas como resultado de la amplificacion por drculo rodador. Como se muestra en el Panel C, se pueden hibridan muchas sondas senal con las secuencias repetidas para lograr la amplificacion de la senal.
La Figura 10 ilustra esquematicamente una realizacion de la configuracion del aparato de analisis.
Las Figuras esquematicas no estan necesariamente a escala.
Definiciones
A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado entendido comunmente por un experto normal en la tecnica a la que pertenece la invencion. Las siguientes definiciones complementan las de la tecnica y se dirigen a la aplicacion actual y no deben ser imputadas a ningun caso relacionado o no relacionado, p. ej., a cualquier patente o solicitud del mismo propietario. Aunque se pueden utilizar metodos y materiales cualesquiera similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la practica para el ensayo de la presente invencion, los materiales y metodos preferidos se describen en la presente memoria. Por lo tanto, la terminologfa utilizada en la presente memoria tiene el proposito de describir unicamente realizaciones concretas, y no se pretende que sea limitante.
Segun se utiliza en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno", "una", "el" y "la" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Asf, por ejemplo, la referencia a "una molecula" incluye una pluralidad de tales moleculas, y similares.
El termino "aproximadamente" segun se utiliza en la presente memoria indica el valor de una cantidad dada que
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vana en +/- 10% del valor, u opcionalmente +/- 5% del valor, o en algunas realizaciones, en +/- 1% del valor asf descrito.
El termino "polinucleotido" (y el termino equivalente "acido nucleico") abarca cualquier cadena ffsica de unidades monomericas que se puede corresponder a una cadena de nucleotidos, incluyendo un polfmero de nucleotidos (p. ej., un poKmero de ADN o ARN tipico), acidos peptidonucleicos (PNA), oligonucleotidos modificados (p. ej., oligonucleotidos que comprenden nucleotidos que no son tfpicos de ARN o ADN biologico, tales como oligonucleotidos 2'-O-metilados), y similares. Los nucleotidos del polinucleotido pueden ser desoxirribonucleotidos, ribonucleotidos o analogos de nucleotidos, pueden ser naturales o no naturales, y pueden ser no sustituidos, no modificados, sustituidos o modificados. Los nucleotidos pueden estar conectados por enlaces fosfodiester, o por enlaces fosforotioato, enlaces metilfosfonato, enlaces boranofosfato, o similares. El polinucleotido puede comprender adicionalmente elementos no nucleotfdicos tales como marcas, grupos extintores, grupos de bloqueo, o similares. El polinucleotido puede ser, por ejemplo, de doble hebra o de hebra sencilla.
Una "diana de acido nucleico" o "acido nucleico diana" se refiere a un acido nucleico, u opcionalmente una region del mismo, que se va a detectar.
Una "secuencia de polinucleotidos" o "secuencia de nucleotidos" es un polfmero de nucleotidos (un oligonucleotido, un ADN, un acido nucleico, etc.) o una cadena de caracteres que representa un polfmero de nucleotidos, dependiendo del contexto. A partir de cualquier secuencia de polinucleotidos especificada, se puede determinar el acido nucleico proporcionado o la secuencia de polinucleotidos complementaria (p. ej., el acido nucleico complementario).
El termino "gen" se utiliza ampliamente para referirse a cualquier acido nucleico asociado con una funcion biologica. Los genes incluyen tfpicamente secuencias codificantes y/o las secuencias reguladoras requeridas para la expresion de dichas secuencias codificantes. El termino gen se puede aplicar a una secuencia genomica espedfica, asf como a un ADNc o un ARNm codificados por esa secuencia genomica. Los genes tambien incluyen segmentos de acido nucleico no expresado que, por ejemplo, forman secuencias de reconocimiento para otras protemas. Las secuencias reguladoras no expresadas incluyen promotores y potenciadores, a los que se unen protemas reguladoras tales como factores de transcripcion, dando como resultado la transcripcion de las secuencias adyacentes o cercanas.
Dos polinucleotidos "hibridan" cuando se asocian para formar un duplex estable, p. ej., en condiciones de analisis relevantes. Los acidos nucleicos hibridan debido a una variedad de fuerzas fisicoqmmicas bien caracterizadas, tales como los enlaces de hidrogeno, la exclusion de disolvente, el apilamiento de bases y similares. Una extensa grna para la hibridacion de acidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte I capttulo 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" (Elsevier, Nueva York), asf como en Ausubel, infra.
Un primer polinucleotido "susceptible de hibridar" con un segundo polinucleotido contiene una primera secuencia de polinucleotidos que es complementaria a una segunda secuencia de polinucleotidos en el segundo polinucleotido. Los primeros y segundos polinucleotidos son capaces de formar un duplex estable, p. ej., bajo condiciones de analisis relevantes.
La "Tm" (Temperatura de fusion) de un duplex de acido nucleico bajo condiciones especificadas (p. ej., condiciones de analisis relevantes) es la temperatura a la cual la mitad de los pares de bases en una poblacion del duplex se disocia y la mitad se asocia. La Tm para un duplex concreto, se puede calcular y/o medir, p. ej., mediante la obtencion de una curva de desnaturalizacion termica del duplex (donde la Tm es la temperatura correspondiente al punto medio en la transicion observada de la forma de doble hebra a hebra sencilla).
El termino "complementario" se refiere a un polinucleotido que forma un duplex estable con su "complemento", p. ej., bajo condiciones de analisis relevantes. Tfpicamente, dos secuencias de polinucleotidos que son complementarias entre sf tienen emparejamientos erroneos al menos en aproximadamente 20% de las bases, al menos en aproximadamente 10% de las bases, preferiblemente al menos en aproximadamente 5% de las bases, y mas preferiblemente no tienen emparejamientos erroneos.
Una "marca" es un radical que facilita la deteccion de una molecula. Las marcas comunes en el contexto de la presente invencion incluyen marcas fluorescentes, luminiscentes, de dispersion de luz, y/o colorimetricas. Las marcas adecuadas incluyen enzimas y radicales fluorescentes, asf como radionuclidos, sustratos, cofactores, inhibidores, radicales quimioluminiscentes, partmulas magneticas, y similares. Las patentes que ilustran el uso de tales marcadores incluyen las Patentes de los Estados Unidos Nums. 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; y 4.366.241. Muchas marcas son asequibles comercialmente y se pueden utilizar en el contexto de la invencion.
El termino "sonda marcada" se refiere a una entidad que se une a una molecula diana, directamente o indirectamente, y permite que la diana sea detectada, p. ej., por medio de un instrumento de lectura. Una sonda marcada (o "LP" en sus siglas inglesas) es tfpicamente un polinucleotido de hebra sencilla que comprende al menos una marca que proporciona directa o indirectamente una senal detectable. La marca puede unirse covalentemente al polinucleotido, o el polinucleotido puede ser configurado para unirse a la marca (p. ej., un polinucleotido biotinilado
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se puede unir a una marca con estreptavidina asociada). La sonda marcada puede, por ejemplo, hibridar directamente con un acido nucleico diana, o puede hibridar con un acido nucleico que a su vez hibrida con el acido nucleico diana o con uno o mas acidos nucleicos diferentes que hibridan con el acido nucleico. Por lo tanto, la sonda marcada puede comprender una secuencia de polinucleotidos que es complementaria a una secuencia de polinucleotidos del acido nucleico diana, o puede comprender al menos una secuencia de polinucleotidos que es complementaria a una secuencia de polinucleotidos en una sonda de captura, amplificador, o similares.
Una "sonda de captura" es un polinucleotido que es susceptible de hibridar con un acido nucleico diana y capturar una sonda marcada para ese acido nucleico diana. La sonda de captura puede hibridar directamente con la sonda marcada, o puede hibridar con uno o mas acidos nucleicos que a su vez hibridan con la sonda marcada; por ejemplo, la sonda de captura puede hibridar con un amplificador o un preamplificador. Asf pues, la sonda de captura incluye una primera secuencia de polinucleotidos que es complementaria a una secuencia de polinucleotidos del acido nucleico diana y una segunda secuencia de polinucleotidos que es complementaria a una secuencia de polinucleotidos de la sonda marcada, el amplificador, el preamplificador, o similares. La sonda de captura es preferiblemente de hebra sencilla.
Un "amplificador" es una molecula, tipicamente un polinucleotido, que es susceptible de hibridar con multiples sondas marcadoras. Tfpicamente, el amplificador hibrida con multiples sondas marcadoras identicas. El amplificador tambien hibrida con al menos una sonda de captura o acido nucleico unido a una sonda de captura. Por ejemplo, el amplificador puede hibridar con al menos una sonda de captura y con una pluralidad de sondas marcadoras, o con un preamplificador y una pluralidad de sondas marcadoras. El amplificador puede ser, p. ej., un acido nucleico lineal, bifurcado, en forma de peine, o ramificado. Como se ha indicado para todos los polinucleotidos, el amplificador puede incluir nucleotidos modificados y/o conexiones internucleotido no convencionales, asf como desoxirribonucleotidos, ribonucleotidos, y/o enlaces fosfodiester convencionales. Los amplificadores adecuados se describen, p. ej., en los documentos USPN 5.635.352, USPN 5.124.246, USPN 5.710.264, y USPN 5.849.481.
Un "preamplificador" es una molecula, tipicamente un polinucleotido, que sirve como un intermedio entre una o mas sondas de captura y amplificadores. Tfpicamente, el preamplificador hibrida simultaneamente con una o mas sondas de captura y con una pluralidad de amplificadores. Los preamplificadores ilustrativos se describen, p. ej., en los documentos USPN 5.635.352 y USPN 5.681.697.
Un "patogeno" es un agente biologico, tfpicamente un microorganismo, que causa la enfermedad o la dolencia a su anfitrion.
Un "microorganismo" es un organismo de tamano microscopico o submicroscopico. Los ejemplos incluyen bacterias, hongos, levaduras, protozoos, algas microscopicas (p. ej., algas unicelulares), virus (que tfpicamente se incluyen en esta categona, aunque no son susceptibles de crecimiento y reproduccion fuera de las celulas anfitrionas), agentes subvirales, viroides y micoplasmas.
En la presente memoria se define o caracteriza de otra manera una variedad de terminos adicionales.
Descripcion detallada
La invencion proporciona un kit para detectar un acido nucleico en una celula individual que comprende, empaquetado en uno o mas contenedores:
al menos un reactivo para celulas permeabilizantes;
al menos un conjunto de sondas de captura que comprende dos o mas sondas de captura capaces de hibridarse a una secuencia de acido nucleico diana; y
(i) una sonda marcada que comprende una marca, en donde la sonda marcada es capaz de hibridarse con dicho conjunto de dos o mas sondas de captura, o
(ii) una sonda marcada que comprende una marca, y un amplificador hibridado con la sonda marcada y capaz de hibridarse con dicho conjunto de dos o mas sondas de captura, o
(iii) una sonda marcada que comprende una marca, un amplificador hibridado con la sonda marcada, y un preamplificador hibridado con el amplificador y capaz de hibridarse con dicho conjunto de dos o mas sondas de captura,
donde cada una de dichas sondas de captura comprende una seccion T que es complementaria a una region de dicha secuencia de acido nucleico diana y una seccion L que es complementaria a una region de (i) dicha sonda marcada, (ii) dicho amplificador o (iii) dicho preamplificador; donde las secciones T de las dos o mas sondas de captura en el conjunto de sondas de captura son complementarias a las regiones no solapantes de la secuencia de acido nucleico diana, y las secciones L de dos o mas sondas de captura en el conjunto de sondas de captura son complementarias a las regiones que no se solapan de (i) dicha sonda marcada, (ii) dicho amplificador o (iii) dicho preamplificador.
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En una realizacion del kit, la diana de acido nucleico comprende una pluralidad de diferentes dianas de acido nucleico; y cada diana de acido nucleico tiene asociada o asociado su sonda marcada, su sonda de captura, su preamplificador y/o su amplificador; y cada sonda marcada comprende una marca, en la que la senal de cada marca es distinguible entre sl
La invencion proporciona ademas una muestra de celulas fijadas y permeabilizadas, que comprende:
a. al menos una celula fijada y permeabilizada que contiene un acido nucleico diana;
b. al menos un conjunto de sondas de captura que comprende dos o mas sondas de captura hibridadas con dicho acido nucleico diana; y
c. (i) una sonda marcada hibridada con dicho conjunto de dos o mas sondas de captura, o
(ii) una sonda marcada, y un amplificador hibridado con la sonda marcada y capaz de hibridarse con dicho conjunto de dos o mas sondas de captura, o
(iii) una sonda marcada, un amplificador hibridado con el marcador, y un preamplificador hibridado con el amplificador y capaz de hibridarse con dicho conjunto de dos o mas sondas de captura,
donde cada una de dichas sondas de captura comprende una seccion T que es complementaria a una region de dicho acido nucleico diana y una seccion L que es complementaria a una region de dicha (i) sonda marcada, (ii) amplificador, o (iii) preamplificador; donde las secciones T de dos o mas sondas de captura en el conjunto de sondas de captura son complementarias a regiones no solapantes del acido nucleico diana y las secciones L de dos o mas sondas de captura en el conjunto son complementarias a regiones no solapantes de (i) dicha sonda marcada, (ii) dicho amplificador o (iii) dicho preamplificador.
En una realizacion de la muestra, dichas celulas se suspenden en solucion o se inmovilizan en un portaobjetos. En otra realizacion, dichas celulas provienen de un fluido corporal o de sangre. En una realizacion adicional, dichas celulas comprenden una mezcla de tipos de celulas, en donde dicha mezcla comprende al menos una celula de un tipo especificado. En una realizacion adicional, la relacion de celulas de un tipo especificado a celulas de todos los demas tipos de la mezcla es inferior a 1 : 1x10.4 o inferior a 1 : 1x105 En una realizacion adicional, dichas celulas de un tipo espedfico son celulas tumorales, o espedficamente, celulas tumorales circulantes.
Entre otros aspectos, se describen analisis multiplex que se pueden utilizar para la deteccion simultanea, y opcionalmente la cuantificacion, de dos o mas dianas de acido nucleico en una sola celula. En la presente memoria se describen metodos para detectar el nivel de uno o mas acidos nucleicos diana respecto al de un acido nucleico de referencia en una celula individual.
En general, en los analisis descritos en la presente memoria, una sonda marcada es capturada con cada acido nucleico diana. La sonda marcada puede ser capturada con la diana a traves de la union directa de la sonda marcada a la diana. Preferiblemente, sin embargo, la sonda marcada es capturada indirectamente a traves de la union a las sondas de captura, amplificadores, y/o preamplificadores que se unen a la diana. El uso de los amplificadores y preamplificadores opcionales facilita la captura de multiples copias de la sonda marcada con la diana, amplificando asf la senal de la diana sin necesidad de amplificacion enzimatica de la propia diana. La union de las sondas de captura es opcionalmente cooperativa, reduciendo el fondo causado por la hibridacion cruzada no deseada de las sondas captura con los acidos nucleicos no diana (un problema mayor en los analisis multiplex que en los analisis "singleplex" puesto que se deben utilizar mas sondas en los analisis multiplex, aumentando la probabilidad de hibridacion cruzada).
Un aspecto de la invencion se refiere a la deteccion de celulas individuales, incluyendo la deteccion de celulas raras partir de una mezcla heterogenea de celulas. Las celulas individuales se detectan mediante la deteccion de acidos nucleicos cuya presencia, ausencia, numero de copias, o similares son caractensticos de la celula.
Tambien se describen composiciones, kits y sistemas relacionados con los metodos.
Metodos de deteccion de acidos nucleicos y celulas
Deteccion multiplex de acidos nucleicos
Como se ha indicado, en la presente memoria se describen analisis multiplex de acidos nucleicos en celulas individuales. Por lo tanto, se describen metodos de deteccion de dos o mas dianas de acido nucleico en una celula individual. En los metodos, se describe una muestra que comprende la celula. La celula comprende, o se sospecha de que comprende, un primer acido nucleico diana y un segundo acido nucleico diana. Se describen una primera sonda marcada que comprende una primera marca y una segunda sonda marcada que comprende una segunda marca, en donde una primera senal de la primera marca es distinguible de una segunda senal de la segunda marca. Tambien se describen al menos una primera sonda de captura y al menos una segunda sonda de captura.
La primera sonda de captura hibrida, en la celula, con la primera diana de acido nucleico (cuando la primera diana
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de acido nucleico esta presente en la celula), y la segunda sonda de captura hibrida, en la celula, con la segunda diana de acido nucleico (cuando el segundo acido nucleico diana esta presente en la celula). La primera sonda marcada es capturada con la primera sonda de captura y la segunda sonda marcada es capturada con la segunda sonda de captura, capturando de este modo la primera sonda marcada con la primera diana de acido nucleico y la segunda sonda marcada con la segunda diana de acido nucleico. A continuacion se detectan la primera senal de la primera marca y la segunda senal de la segunda marca. Puesto que las primera y segunda marcas estan asociadas con sus respectivas dianas de acido nucleico a traves de las sondas de captura, la presencia de la marca o las marcas en la celula indica la presencia de la diana o las dianas de acido nucleico correspondientes en la celula. Los metodos son opcionalmente cuantitativos. Por lo tanto, se pueden medir la intensidad de la primera senal y la intensidad de la segunda senal, y la intensidad de la primera senal se puede correlacionar con una cantidad de la primera diana de acido nucleico en la celula mientras que la intensidad de la segunda senal se correlaciona con una cantidad de la segunda diana de acido nucleico en la celula.
En un aspecto, las sondas marcadoras se unen directamente a las sondas de captura. Por ejemplo, se proporcionan una unica primera sonda de captura y una unica segunda sonda de captura, la primera sonda marcada hibrida con la primera sonda de captura, y la segunda sonda marcada hibrida con la segunda sonda de captura. Espedficamente, se proporcionan dos o mas primeras sondas de captura y dos o mas segundas sondas de captura, ya que son una pluralidad de las primeras sondas marcadoras (p. ej., dos o mas primeras sondas marcadoras identicas) y una pluralidad de las segundas sondas marcadoras (p. ej., dos o mas segundas sondas marcadoras identicas). Las dos o mas primeras sondas de captura hibridan con la primera diana de acido nucleico, y las dos o mas segundas sondas de captura hibridan con la segunda diana de acido nucleico. Una unica primera sonda marcada hibrida con cada una de las primera sondas de captura, y una unica segunda sonda marcada hibrida con cada una de las segundas sondas de captura.
Alternativamente, las sondas marcadoras son capturadas con las sondas de captura indirectamente, por ejemplo, a traves de la union de los preamplificadores y/o amplificadores. El uso de amplificadores y preamplificadores puede ser ventajoso en el aumento de intensidad de la senal, ya que puede facilitar la union de un gran numero de sondas marcadoras a cada diana de acido nucleico.
Si se emplean amplificadores, se describen una unica primera sonda de captura, una unica segunda sonda de captura, una pluralidad de las primeras sondas marcadoras, y una pluralidad de las segundas sondas marcadoras. Un primer amplificador hibrida con la primera sonda de captura y con la pluralidad de primeras sondas marcadoras, y un segundo amplificador hibrida con la segunda sonda de captura y con la pluralidad de segundas sondas marcadoras. Alternativamente, se proporcionan dos o mas primeras sondas de captura, dos o mas segundas sondas de captura, una pluralidad de las primeras sondas marcadoras, y una pluralidad de las segundas sondas marcadoras. Las dos o mas primeras sondas de captura hibridan con la primera diana de acido nucleico, y las dos o mas segundas sondas de captura hibridan con la segunda diana de acido nucleico. Un primer amplificador hibrida con cada una de las primeras sondas de captura, y la pluralidad de primeras sondas marcadoras hibrida con los primeros amplificadores. Un segundo amplificador hibrida con cada una de las segundas sondas de captura, y la pluralidad de segundas sondas marcadoras hibrida con los segundos amplificadores.
Si se emplean preamplificadores, se describen una unica primera sonda de captura, una unica segunda sonda de captura, una pluralidad de las primeras sondas marcadoras, y una pluralidad de las segundas sondas marcadoras. Un primer preamplificador hibrida con la primera sonda de captura, una pluralidad de primeros amplificadores hibrida con el primer preamplificador, y la pluralidad de primeras sondas marcadoras hibrida con los primeros amplificadores. Un segundo preamplificador hibrida con la segunda sonda de captura, una pluralidad de segundos amplificadores hibrida con el segundo preamplificador, y la pluralidad de segundas sondas marcadoras hibrida con los segundos amplificadores. Alternativamente, se proporcionan dos o mas primeras sondas de captura, dos o mas segundas sondas de captura, una pluralidad de las primeras sondas marcadoras, y una pluralidad de las segundas sondas marcadoras. Las dos o mas primeras sondas de captura hibridan con la primera diana de acido nucleico, y las dos o mas segundas sondas de captura hibridan con la segunda diana de acido nucleico. Un primer preamplificador hibrida con cada una de las primeras sondas de captura, una pluralidad de primeros amplificadores hibrida con cada uno de los primeros preamplificadores, y la pluralidad de primeras sondas marcadoras hibrida con los primeros amplificadores. Un segundo preamplificador hibrida con cada una de las segundas sondas de captura, una pluralidad de segundos amplificadores hibrida con cada uno de los segundos preamplificadores, y la pluralidad de segundas sondas marcadoras hibrida con los segundos amplificadores. Opcionalmente, se pueden utilizar preamplificadores adicionales como intermedios entre un preamplificador hibridado a la sonda o sondas de captura y los amplificadores.
Como se ha descrito anteriormente, una sonda de captura hibrida con cada sonda marcada, amplificador, o preamplificador. Alternativamente, dos o mas sondas de captura hibridan con la sonda marcada, amplificador, o preamplificador. Vease, p. ej., la seccion de mas abajo titulada "Implementacion, aplicaciones y ventajas".
Si se emplean dos o mas primeras sondas de captura y/o dos o mas segundas sondas de capturas, las sondas de captura hibridan preferiblemente con secuencias de polinucleotidos no solapantes en sus respectivas dianas de acido nucleico. Las sondas de captura pueden, aunque no es necesario, cubrir una region contigua de la diana de acido nucleico. Se proporcionan opcionalmente sondas de bloqueo, polinucleotidos que hibridan con regiones de la
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diana de acido nucleico no ocupadas por sondas de captura, e hibridan con la diana. Para una diana de acido nucleico dada, las correspondientes sondas de captura y sondas de bloqueo son preferiblemente complementarias a secuencias no solapantes ffsicamente distintas en el acido nucleico diana, cuyas secuencias no solapantes son preferiblemente, pero no necesariamente, contiguas. Tener las sondas de captura y sondas de bloqueo opcionales contiguas entre sf puede en algunas realizaciones aumentar la fuerza de la hibridacion, eliminar la estructura secundaria, y asegurar la senal mas consistente y reproducible.
A menudo, no se requiere manipulacion enzimatica para capturar las sondas marcadoras con las sondas de captura. Alternativamente, sin embargo, la manipulacion enzimatica, en particular la amplificacion de acidos nucleicos intermedios entre las sondas de captura y las sondas marcadoras, facilita la deteccion de las dianas de acido nucleico. Por ejemplo, se proporciona una pluralidad de las primeras sondas marcadoras y una pluralidad de las segundas sondas marcadoras. Un primer polinucleotido amplificado se produce mediante amplificacion por cfrculo rodador de un primer polinucleotido circular hibridado con la primera sonda de captura. El primer polinucleotido circular comprende al menos una copia de una secuencia de polinucleotidos identica a una secuencia de polinucleotidos en la primera sonda marcada, y el primer polinucleotido amplificado comprende por tanto una pluralidad de copias de una secuencia de polinucleotidos complementaria a la secuencia de polinucleotidos en la primera sonda marcada. La pluralidad de primeras sondas marcadoras hibrida a continuacion con el primer polinucleotido amplificado. Del mismo modo, un segundo polinucleotido amplificado se produce mediante amplificacion por cfrculo rodador de un segundo polinucleotido circular hibridado con la segunda sonda de captura (preferiblemente, al mismo tiempo, se produce el primer polinucleotido amplificado). El segundo polinucleotido circular comprende al menos una copia de una secuencia de polinucleotidos identica a una secuencia de polinucleotidos en la segunda sonda marcada, y el segundo polinucleotido amplificado comprende por tanto una pluralidad de copias de una secuencia de polinucleotidos complementaria a la secuencia de polinucleotidos en la segunda sonda marcada. La pluralidad de segundas sondas marcadoras hibrida a continuacion con el segundo polinucleotido amplificado. Los polinucleotidos amplificados permanecen asociados (p. ej., de forma covalente) con la sonda o sondas de captura, y las sondas marcadoras son capturadas de este modo por las dianas de acido nucleico. Se puede proporcionar un polinucleotido circular e hibridar con la sonda de captura, o se puede emplear un polinucleotido lineal que se circulariza mediante ligacion despues de que se una a la sonda de captura (p. ej., una sonda candado). Los mecanismos para la amplificacion por cfrculo rodador, incluyendo la utilizacion de sondas candado, son bien conocidos en la tecnica. Veanse, p. ej., Larsson et al. (2004) "In situ genotyping individual DNA molecules by target-primed rolling-circle amplification of padlock probes" Nat Methods. 1(3):227-32, Nilsson et al. (1994) Science 265:2085-2088, y Antson et al. (2000) "PCR-generated padlock probes detect single nucleotide variation in genomic DNA" Nucl Acids Res 28(12):E58.
Las secuencias de la sonda de captura potenciales se examinan opcionalmente para determinar posibles interacciones con dianas de acidos nucleicos no correspondientes, preamplificadores, amplificadores, marcas, sondas y/o secuencias genomicas cualesquiera relevantes, por ejemplo. Las secuencias que se espera que experimenten hibridacion cruzada con acidos nucleicos no deseados no se seleccionan tfpicamente para su uso en las sondas de captura. El examen puede ser, p. ej., visual (p. ej., examen visual de la complementariedad), computacional (p. ej., una busqueda BLAST de la base de datos genomica relevante, o calculo y comparacion de las energfas libres de union), y/o experimental (p. ej., experimentos de hibridacion cruzada). Las secuencias de la sonda marcada se examinan preferentemente de manera similar, para ayudar a minimizar la hibridacion cruzada no deseable potencial.
Una sonda de captura, preamplificador, amplificador, y/o sonda marcada comprenden opcionalmente al menos un nucleotido no natural. Por ejemplo, una sonda de captura y un preamplificador (o amplificador o sonda marcada) que hibrida con la misma opcionalmente comprenden, en posiciones complementarias, al menos un par de nucleotidos no naturales que experimentan emparejamiento de bases entre sf, pero que no experimentan emparejamiento de bases de Watson-Crick con las bases tfpicas de los ADN o ARN biologicos (es decir, A, C, G, T o U). Los ejemplos de los nucleotidos no naturales incluyen, nucleotidos Locked NucleicAcid™ (asequibles de Exiqon A/S, (www) exiqon.com;. vease, p. ej., SantaLucia Jr. (1998) Proc Natl Acad Sci 95: 1460-1465) e isoG, isoC, y otros nucleotidos utilizados en el sistema AEGIS (Artificially Expanded Genetic Information System, asequible de EraGen Biosciences, (www.) eragen.com; veanse, p. ej., los documentos USPN 6.001.983, USPN 6.037.120, y USPN 6.140.496). El uso de tales pares de bases no naturales (p. ej., pares de bases isoG-isoC) en las sondas pueden, por ejemplo., reducir el fondo y/o simplificar el diseno de la sonda mediante la disminucion de la hibridacion cruzada, o puede permitir el uso de sondas mas cortas cuando los pares de bases no naturales tienen afinidades de union mas altas que las de los pares de bases naturales.
Como se ha senalado, los metodos son utiles para la deteccion multiplex de acidos nucleicos, incluyendo la deteccion simultanea de mas de dos dianas de acido nucleico. Por lo tanto, la celula comprende opcionalmente o se sospecha que comprende una tercera diana de acido nucleico, y los metodos incluyen opcionalmente: proporcionar una tercera sonda marcada que comprende una tercera marca, en donde una tercera senal de la tercera marca es distinguible de las primeras y segundas senales, proporcionar al menos una tercera sonda de captura, hibridar en la celula la tercera sonda de captura con la tercera diana de acido nucleico (cuando la tercera diana esta presente en la celula), capturar la tercera sonda marcada con la tercera sonda de captura, y detectar la tercera senal de la tercera marca. Se detectan simultaneamente de manera similar en la celula si se desea cuartas, quintas, sextas, etc. dianas de acido nucleico.
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Una diana de acido nucleico puede ser esencialmente cualquier acido nucleico que se detecta deseablemente en la celula. Por ejemplo, una diana de acido nucleico puede ser un ADN, un ADN cromosomico, un ARN, un ARNm, un microARN, un ARN ribosomico, o similares. El acido nucleico diana puede ser un acido nucleico endogeno para la celula. Como ejemplo adicional, la diana puede ser un acido nucleico introducido o expresado en la celula por medio de infeccion de la celula con un patogeno, por ejemplo, un ARN o ADN genomico viral o bacteriano, un plasmido, un ARNm viral o bacteriano, o similares.
Las primera y segunda (y/u opcionales tercera, cuarta, etc.) dianas de acido nucleico pueden ser parte de una unica molecula de acido nucleico, o pueden ser moleculas separadas. Varias ventajas y aplicaciones de ambos enfoques se comentan con mayor detalle a continuacion y en la seccion titulada "Implementacion, aplicaciones y ventajas". Como se ha descrito en la presente memoria, la primera diana de acido nucleico es un primer ARNm y la segunda diana de acido nucleico es un segundo ARNm. Alternativamente, la primera diana de acido nucleico comprende una primera region de un ARNm y la segunda diana de acido nucleico comprende una segunda region del mismo ARNm; este enfoque puede aumentar la especificidad de la deteccion del ARNm. Alternativamente, la primera diana de acido nucleico comprende una primera secuencia de polinucleotidos de ADN cromosomico y la segunda diana de acido nucleico comprende una segunda secuencia de polinucleotidos de ADN cromosomico. Las primera y segunda secuencias de polinucleotidos de ADN cromosomico se encuentran opcionalmente localizadas en el mismo cromosoma, p. ej., dentro del mismo gen, o en diferentes cromosomas.
Segun se describe en la presente memoria, la senal o senales de la diana o dianas de acido nucleico se normalizan. Espedficamente, la segunda diana de acido nucleico comprende un acido nucleico de referencia, y el metodo incluye la normalizacion de la primera senal a la segunda senal. El acido nucleico de referencia es un acido nucleico seleccionado como patron de comparacion. Resultara evidente que la eleccion del acido nucleico de referencia puede depender de la aplicacion deseada. Por ejemplo, para el analisis de la expresion genica, en donde la primera y opcionales tercera, cuarta, etc. dianas de acido nucleico son ARNm cuyos niveles de expresion se van a determinar, el acido nucleico de referencia puede ser un ARNm transcrito de un gen constitutivo. Como ejemplo adicional, la primera diana de acido nucleico puede ser un ARNm cuya expresion esta alterada en un estado patologico, p. ej., un ARNm expresado en una celula tumoral y no en una celula normal o expresado a un nivel mas alto en una celula tumoral que en una celula normal, mientras que la segunda diana de acido nucleico es un ARNm expresado a partir de un gen constitutivo o gen similar cuya expresion no se altera en el estado patologico. Como ejemplo adicional, la primera diana de acido nucleico puede ser una secuencia de ADN cromosomico que se amplifica o se elimina en una celula tumoral, mientras que la segunda diana de acido nucleico es otra secuencia de ADN cromosomico que se mantiene en su numero normal de copias en la celula tumoral. En la presente memoria se describen acidos nucleicos de referencia ilustrativos, y muchos mas son bien conocidos en la tecnica.
Opcionalmente, los resultados de la celula se comparan con los resultados de una celula de referencia. Es decir, las primera y segunda dianas tambien se detectan en una celula de referencia, por ejemplo, una celula no tumoral, no infectada, u otra celula normal sana, elegida como patron de comparacion dependiendo de la aplicacion deseada. Las senales pueden ser normalizadas a un acido nucleico de referencia como se senalo anteriormente. A modo de ejemplo, la primera diana de acido nucleico puede ser el gen Her-2, con el objetivo de medir la amplificacion del gen Her-2. La senal de Her-2 se puede normalizar a la de un gen de referencia, cuyo numero de copias se mantiene de manera estable en el ADN genomico. La senal normalizada para el gen HER-2 de una celula diana (p. ej., una celula tumoral o una celula que se sospecha que es tumoral) se puede comparar con la senal normalizada de una celula de referencia (p. ej., una celula normal), para determinar el numero de copias en la celula cancerosa en comparacion con las celulas normales.
La marca (primera, segunda, tercera, etc.) puede ser esencialmente cualquier marca conveniente que proporcione directa o indirectamente una senal detectable. Espedficamente, la primera marca es una primera marca fluorescente y la segunda marca es una segunda marca fluorescente. La deteccion de la senal de las marcas comprende de este modo detectar las senales fluorescentes de las marcas. Se conoce una variedad de marcas fluorescentes cuyas senales se pueden distinguir entre sf, incluyendo, p. ej., fluoroforos y puntos cuanticos. En cuanto a otros ejemplos, la marca puede ser una marca luminiscente, una marca de dispersion de luz (p. ej., partfculas de oro coloidal), o una enzima (p. ej., fosfatasa alcalina o peroxidasa de rabano picante).
Los metodos se pueden utilizar para detectar la presencia de las dianas de acido nucleico en las celulas de esencialmente cualquier tipo de muestra. Por ejemplo, la muestra puede estar derivada de un fluido corporal, un residuo corporal, sangre, medula osea, esputo, orina, ganglio linfatico, heces, secreciones vaginales, citologfa cervical, hisopo oral u otro hisopo o frotis, lfquido cefalorraqrndeo, saliva, esputo, lfquido eyaculatorio, semen, fluido linfatico, un fluido intercelular, un tejido (p. ej., un producto homogeneizado de tejido), una biopsia, y/o un tumor. La muestra y/o la celula pueden derivar de uno o mas entre un ser humano, un animal, una planta, y una celula cultivada. Se pueden escrutar muestras derivadas de volumenes incluso relativamente grandes de materiales tales como fluido corporal o residuo corporal en los metodos de la invencion, y la eliminacion de tales materiales es relativamente no invasiva. Las muestras se toman opcionalmente de un paciente, siguiendo los metodos de laboratorio convencionales despues de consentimiento informado.
Los metodos para la deteccion de dianas de acido nucleico en las celulas se pueden utilizar para identificar las celulas. Por ejemplo, se puede identificar que una celula es de un tipo deseado basandose en los acidos nucleicos, y
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en que niveles los contiene. Por lo tanto, los metodos incluyen la identificacion de la celula como una celula diana deseada basandose en la deteccion de las primeras y segundas senales (y opcionales tercera, cuarta, etc. senales) dentro de la celula. La celula se puede identificar basandose en la presencia o ausencia de una o mas de las dianas de acido nucleico. Del mismo modo, la celula se puede identificar basandose en la fuerza relativa de la senal o el nivel de expresion de una o mas de las dianas de acido nucleico. Las senales se normalizan opcionalmente como se indico anteriormente y/o se comparan con las de una celula de referencia.
Los metodos pueden aplicarse a la deteccion y la identificacion incluso de tipos de celulas raras. De este modo, la muestra que incluye la celula puede ser una mezcla de celulas diana deseadas y otras celulas, que no son diana, que pueden estar presentes en exceso de las celulas diana. Por ejemplo, la razon de las celulas diana con respecto a las celulas de todos los otros tipos en la muestra es opcionalmente menor de 1:1x104, menor de 1:1x105, menor de 1:1x106, menor de 1:1x107, menor de 1:1x108, o incluso menor de 1:1x109.
Esencialmente, se puede detectar e identificar cualquier tipo de celula que pueda diferenciarse dependiendo de su contenido de acido nucleico (presencia, ausencia, nivel de expresion o numero de copias de uno o mas acidos nucleicos) utilizando los metodos y una eleccion adecuada de las dianas de acido nucleico. A modo de unos pocos ejemplos, la celula puede ser una celula tumoral circulante, una celula infectada viralmente, una celula fetal en sangre materna, una celula bacteriana u otro microorganismo en una muestra biologica (p. ej., sangre u otro fluido corporal), una celula endotelial, celulas endoteliales precursoras, o celulas del miocardio en la sangre, una celula madre, o una celula T. Los tipos de celulas raras pueden ser enriquecidos antes de realizar los metodos, si fuera necesario, por medio de metodos conocidos en la tecnica (p. ej., la lisis de globulos rojos de la sangre, aislamiento de celulas mononucleares de sangre periferica, enriquecimiento adicional de las celulas diana raras mediante separacion magnetica de celulas activadas (MACS), etc.). Los metodos se combinan opcionalmente con otras tecnicas, tales como la tincion DAPI para el ADN nuclear. Resultara evidente que se detecta opcionalmente simultaneamente una variedad de diferentes tipos de marcadores de acido nucleico por medio de los metodos y se utiliza para identificar la celula. Por ejemplo, se puede identificar una celula basandose en la presencia o nivel relativo de expresion de una diana de acido nucleico en la celula y la ausencia de otra diana de acido nucleico de la celula; por ejemplo, se puede identificar una celula tumoral circulante por la presencia o el nivel de uno o mas marcadores que se encuentran en la celula tumoral y no se encuentran (o se encuentran a diferentes niveles) en las celulas de la sangre, y su identidad se puede confirmar por la ausencia de uno o mas marcadores presentes en las celulas de la sangre y no en celulas tumorales circulantes. El principio puede ser extendido al uso de cualquier otro tipo de marcadores tales como marcadores basados en protemas en celulas individuales.
La celula se fija y permeabiliza tfpicamente antes de la hibridacion de las sondas de captura, para retener las dianas de acido nucleico en la celula y permitir que las sondas de captura, sondas marcadoras, etc., entren en la celula. La celula se lava opcionalmente para eliminar los materiales no capturados por una de las dianas de acido nucleico. La celula se puede lavar despues de cualquiera de las diversas etapas, por ejemplo, despues de la hibridacion de las sondas de captura con las dianas de acido nucleico para eliminar las sondas de captura no unidas, despues de la hibridacion de los preamplificadores, los amplificadores, y/o las sondas marcadoras con las sondas de captura, y/o similares.
Las diversas etapas de captura y de hibridacion se pueden realizar de forma simultanea o sucesivamente, esencialmente en cualquier orden conveniente. Preferiblemente, se lleva a cabo una etapa de hibridacion dada para todas las dianas de acido nucleico al mismo tiempo. Por ejemplo, todas las sondas de captura (primera, segunda, etc.) se pueden anadir a la celula a la vez y permitir que hibriden con sus correspondientes dianas, la celula se puede lavar, los amplificadores (primero, segundo, etc.) se pueden hibridar con las sondas de captura correspondientes, la celula se puede lavar, las sondas marcadoras (primera, segunda, etc.) se pueden hibridar con los amplificadores correspondientes, y la celula se puede lavar a continuacion de nuevo antes de la deteccion de las marcas. Como ejemplo adicional, las sondas de captura pueden hibridar con las dianas, la celula se puede lavar, los amplificadores y las sondas marcadoras se pueden anadir juntos e hibridar, y la celula se puede lavar a continuacion antes de la deteccion. Resultara evidente que la diana o las dianas de acido nucleico de doble hebra se desnaturalizan preferiblemente, p. ej., con calor, antes de la hibridacion de la sonda o las sondas de captura correspondientes a la diana o las dianas.
Preferiblemente, la celula esta en suspension durante todas o la mayona de las etapas del metodo, para facilitar su manejo. Sin embargo, los metodos son tambien aplicables a las celulas en muestras solidas de tejidos (p. ej., secciones de tejido) y/o celulas inmovilizadas sobre un sustrato (p. ej., un porta u otra superficie). Por lo tanto, la celula esta en suspension en la muestra que comprende la celula, y/o la celula esta en suspension durante las etapas de hibridacion, de captura y/o de deteccion. Por ejemplo, la celula puede estar en suspension en la muestra y durante las etapas de hibridacion, de captura, de lavado opcional, y de deteccion. Alternativamente, la celula esta en suspension en la muestra que comprende la celula, y la celula se fija sobre un sustrato durante las etapas de hibridacion, de captura y/o de deteccion. Por ejemplo, la celula puede estar en suspension durante las etapas de hibridacion, de captura, y de lavado opcionales e inmovilizada sobre un sustrato durante la etapa de deteccion.
Las senales procedentes de las marcas pueden ser detectadas, y sus intensidades medidas opcionalmente, por medio de cualquiera de una variedad de mecanismos bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, si la celula esta en suspension, las primera y segunda (y tercera opcional, etc.) senales se pueden detectar convenientemente mediante
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citometna de flujo. Si las celulas se inmovilizan sobre un sustrato, las primera y segunda (y tercera opcional etc.) senales se pueden detectar, p. ej., mediante un escaner laser o un microscopio, p. ej., un microscopio de barrido fluorescente o automatico. Como se ha senalado, la deteccion es a nivel de una sola celula individual. Las senales procedentes de las marcas se detectan tipicamente en una sola operacion (p. ej., una sola ronda de citometna de flujo o una unica sesion de microscop^a o barrido), en lugar de sucesivamente en operaciones separadas para cada marca. Tal operacion de deteccion unica puede, por ejemplo, implicar el cambio de filtros opticos entre la deteccion de las diferentes marcas, pero no implica la deteccion de la primera marca seguida de la captura de la segunda marca y a continuacion deteccion de la segunda marca. Como se describe en la presente memoria, las primera y segunda (y tercera opcional etc.) marcas son capturadas por sus respectivas dianas simultaneamente, pero se detectan en etapas u operaciones de deteccion separadas.
Las caractensticas adicionales descritas en la presente memoria, p. ej., en la seccion de mas abajo titulada "Implementacion, aplicaciones y ventajas", se puede aplicar a los metodos, segun corresponda. Por ejemplo, como se describe en mayor detalle a continuacion, una sonda marcada puede incluir mas de una marca, identica o distinta. La intensidad de la senal se ajusta opcionalmente entre las dianas dependiendo de su numero de copias esperado, si se desea; por ejemplo, la senal para un ARNm expresado a bajos niveles puede ser amplificada en un grado mayor (p. ej., mediante el uso de mas marcas por sonda marcada y/o el uso de preamplificadores y amplificadores para capturar mas sondas marcadoras por copia de la diana) que la senal para un ARNm altamente expresado.
Segun se describe en la presente memoria, dos o mas acidos nucleicos se detectan mediante amplificacion por PCR de los acidos nucleicos in situ en las celulas individuales. Para evitar la fuga de los amplicones resultantes de las celulas, se puede elaborar una emulsion de agua-aceite como mencionan Li et al. (2006) "BEAMing up for detection and quantification of rare sequence variants" Nature Methods 3(2):95-7 que separa celulas individuales en diferentes compartimentos.
Deteccion de niveles relativos mediante normalizacion a acidos nucleicos de referencia
Como se ha expuesto brevemente mas arriba, la senal detectada para un acido nucleico de interes se puede normalizar a la de un acido nucleico de referencia, convencional. Por lo tanto, en la presente memoria se describen metodos para someter a ensayo un nivel relativo de uno o mas acidos nucleicos diana en una celula individual. En los metodos, se describe una muestra que comprende la celula. La celula comprende o se sospecha que comprende un primer acido nucleico diana, y comprende un segundo acido nucleico de referencia. Tambien se describen una primera sonda marcada que comprende una primera marca y una segunda sonda marcada que comprende una segunda marca, en donde una primera senal de la primera marca es distinguible de una segunda senal de la segunda marca. En la celula, la primera sonda marcada se captura con el primer acido nucleico diana (cuando el primer acido nucleico diana esta presente en la celula) y la segunda sonda marcada se captura con el segundo acido nucleico de referencia. La primera senal de la primera marca y la segunda senal de la segunda marca se detectan a continuacion en la celula individual, y se mide la intensidad de cada senal. La intensidad de la primera senal es normalizada a la intensidad de la segunda senal (referencia). De este modo se somete a ensayo el nivel del primer acido nucleico diana con respecto al nivel del segundo acido nucleico de referencia en la celula, ya que las primera y segunda marcas estan asociadas con sus respectivos acidos nucleicos. Los metodos son opcionalmente cuantitativos, permitiendo la medicion de la cantidad del primer acido nucleico diana con respecto a la cantidad del segundo acido nucleico de referencia en la celula. Por lo tanto, la intensidad de la primera senal normalizada a la de la segunda senal se puede correlacionar con una cantidad del primer acido nucleico diana presente en la celula.
Las sondas marcadoras se pueden unir directamente a los acidos nucleicos. Por ejemplo, la primera sonda marcada puede hibridar con el primer acido nucleico diana y/o la segunda sonda marcada puede hibridar con el segundo acido nucleico de referencia. Alternativamente, algunas o todas las sondas marcadoras se pueden unir indirectamente a sus acidos nucleicos correspondientes, p. ej., a traves de sondas de captura. Por ejemplo, las primera y segunda sondas marcadoras se pueden unir directamente a los acidos nucleicos, o se puede unir una directamente mientras que la otra se une indirectamente, o ambas se pueden unir indirectamente.
Las sondas marcadoras son capturadas opcionalmente con los acidos nucleicos a traves de sondas de captura. Como se describe en la presente memoria, se proporcionan al menos una primera sonda de captura y al menos una segunda sonda de captura. En la celula, la primera sonda de captura hibrida con el primer acido nucleico diana y la segunda sonda de captura hibrida con el segundo acido nucleico de referencia. La primera sonda marcada es capturada con la primera sonda de captura y la segunda sonda marcada es capturada con la segunda sonda de captura, capturando de este modo la primera sonda marcada con el primer acido nucleico diana y la segunda sonda marcada con el segundo acido nucleico de referencia. Las caractensticas descritas para los metodos anteriores se aplican tambien, con respecto a la configuracion y al numero de sondas de marcadoras y de captura, al uso opcional de preamplificadores y/o amplificadores, a la amplificacion por cfrculo rodador de polinucleotidos circulares, y similares.
Los metodos se pueden utilizar para la deteccion multiplex de acidos nucleicos, incluyendo la deteccion simultanea de dos o mas acidos nucleicos diana. Por lo tanto, la celula comprende opcionalmente o se sospecha que comprende un tercer acido nucleico diana, y los metodos incluyen opcionalmente: proporcionar una tercera sonda marcada que comprende una tercera marca, en donde una tercera senal de la tercera marca es distinguible de las
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primeras y segundas senales; capturar, en la celula, la tercera sonda marcada con el tercer acido nucleico diana (cuando esta presente en la celula); detectar la tercera senal de la tercera marca, cuya deteccion comprende medir una intensidad de la tercera senal; y normalizar la intensidad de la tercera senal a la intensidad de la segunda senal. Alternativamente, la tercera senal se puede normalizar a la de un acido nucleico de referencia diferente. Los cuarto, quinto, sexto, etc. acidos nucleicos se detectan simultaneamente de manera similar en la celula si se desea. Las tercera, cuarta, quinta, etc. sondas marcadoras hibridan opcionalmente directamente con su acido nucleico correspondiente, o pueden ser capturadas indirectamente mediante sondas de captura como se describe para la primera y segunda sondas marcadoras.
Los metodos se pueden utilizar para el analisis de la expresion genica, la deteccion de la amplificacion o supresion genica, o la deteccion o el diagnostico de enfermedades, solo como algunos ejemplos. Un acido nucleico diana puede ser esencialmente cualquier acido nucleico que se detecta deseablemente en la celula. Por ejemplo, un acido nucleico diana puede ser un ADN, un ADN cromosomico, un ARN, un ARNm, un microARN, un aRn ribosomico, o similares. El acido nucleico diana puede ser un acido nucleico endogeno a la celula, o como otro ejemplo, la diana puede ser un acido nucleico introducido o expresado en la celula mediante infeccion de la celula con un patogeno, p. ej., un ARN o ADN genomico viral o bacteriano, un plasmido, un ARNm viral o bacteriano, o similares. El acido nucleico de referencia puede ser de una manera similar un ADN, un ARNm, un ADN cromosomico, un ARNm, un ARN endogeno a la celula, o similares.
Como se describio anteriormente, la eleccion del acido nucleico de referencia puede depender de la aplicacion deseada. Por ejemplo, para el analisis de la expresion genica, en donde el primer y opcionales tercero, cuarto, etc. acidos nucleicos diana son ARNm cuyos niveles de expresion se van a determinar, el acido nucleico de referencia puede ser un ARNm transcrito de un gen constitutivo. Como ejemplo adicional, el primer acido nucleico diana puede ser un ARNm cuya expresion esta alterada en un estado patologico, p. ej., un ARNm expresado en una celula tumoral y no una celula normal o expresado a un nivel mas alto en una celula tumoral que en una celula normal, mientras que el acido nucleico de referencia es un ARNm expresado a partir de un gen constitutivo o gen similar cuya expresion no se altera en el estado patologico. En un ejemplo similar, el acido nucleico diana puede ser un acido nucleico viral o bacteriano, mientras que el acido nucleico de referencia es endogeno a la celula. Como ejemplo adicional, el primer acido nucleico diana puede ser una secuencia de ADN cromosomico que se amplifica o se elimina en una celula tumoral, mientras que el acido nucleico de referencia es otra secuencia de ADN cromosomico que se mantiene en su numero normal de copias en la celula tumoral. Los acidos nucleicos de referencia ilustrativos se describen en la presente memoria, y muchos mas son bien conocidos en la tecnica.
Como se describe en la presente memoria, el primer acido nucleico diana es un primer ARNm y el segundo acido nucleico de referencia es un segundo ARNm. Alternativamente, el primer acido nucleico diana comprende una primera secuencia de polinucleotidos de ADN cromosomico y el segundo acido nucleico de referencia comprende una segunda secuencia de polinucleotidos de ADN cromosomico. Las primera y segunda secuencias de polinucleotidos de ADN cromosomico estan situadas opcionalmente en el mismo cromosoma o en cromosomas diferentes.
Opcionalmente, los resultados normalizados de la celula se comparan con los resultados normalizados de una celula de referencia. Es decir, los acidos nucleicos diana y de referencia tambien se detectan en una celula de referencia, por ejemplo, una celula no tumoral, no infectada, u otra celula normal sana, elegida como patron de comparacion dependiendo de la aplicacion deseada. A modo de ejemplo, el primer acido nucleico diana puede ser el gen Her-2, con el objetivo de medir la amplificacion de genes Her-2. La senal de Her-2 se puede normalizar a la de un gen de referencia cuyo numero de copias se mantiene de manera estable en el ADN genomico. La senal normalizada para el gen Her-2 de una celula diana (p. ej., una celula tumoral o que se sospecha que es una celula tumoral) se puede comparar con la senal normalizada de una celula de referencia (p. ej., una celula normal), para determinar el numero de copias en la celula cancerosa en comparacion con las celulas normales.
La intensidad de la senal se ajusta opcionalmente entre la diana y los acidos nucleicos de referencia dependiendo de su numero de copias esperado, si se desea. Por ejemplo, la senal para un ARNm diana expresado a bajos niveles se puede amplificar en un grado mayor (p. ej., mediante el uso de mas marcas por sonda marcada y/o el uso de sondas de captura, preamplificadores y amplificadores para capturar mas sondas marcadoras por copia de la diana) que la senal para un ARNm altamente expresado (que se puede detectar, p. ej., mediante union directa de la sonda marcada al acido nucleico de referencia, mediante el uso de sondas de captura y amplificador sin un preamplificador, o similares).
Los metodos para someter a ensayo los niveles relativos de acidos nucleicos diana en las celulas se pueden utilizar para identificar las celulas. Por ejemplo, se puede identificar que una celula es de un tipo deseado basandose en que acidos nucleicos contiene, y a que niveles. De este modo, en una clase de realizaciones, los metodos incluyen la identificacion de la celula como una celula diana deseada basandose en la primera senal normalizada (y opcionales tercera, cuarta, etc. senales normalizadas). Como se describe en la presente memoria, la celula se puede identificar basandose en la presencia o ausencia de uno o mas de los acidos nucleicos diana. Del mismo modo, la celula se puede identificar basandose en la fuerza relativa de la senal o el nivel de expresion de uno o mas acidos nucleicos diana. Las senales se comparan opcionalmente con las de una celula de referencia.
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Los metodos pueden aplicarse a la deteccion y la identificacion incluso de tipos de celulas raras. De este modo, la muestra que incluye la celula puede ser una mezcla de celulas diana deseadas y otras celulas, que no son diana, que pueden estar presentes en exceso de las celulas diana. Por ejemplo, la razon de las celulas diana con respecto a las celulas de todos los otros tipos en la muestra es opcionalmente menor de 1:1x104, menor de 1:1x105, menor de 1:1x106, menor de 1:1x107, menor de 1:1x108, o incluso menor de 1:1x109.
Esencialmente, se puede detectar e identificar cualquier tipo de celula que puede diferenciarse dependiendo de su contenido de acido nucleico (presencia, ausencia, o numero de copias de uno o mas acidos nucleicos) utilizando los metodos y una eleccion adecuada de acidos nucleicos diana y de referencia. A modo de unos pocos ejemplos, la celula puede ser una celula tumoral circulante, una celula infectada viralmente, una celula fetal en sangre materna, una celula bacteriana u otro microorganismo en una muestra biologica (por ejemplo, sangre u otro fluido corporal), o una celula endotelial, celula endotelial precursora o celulas del miocardio en la sangre. Los tipos de celulas raras pueden ser enriquecidos antes de realizar los metodos, si fuera necesario, por medio de metodos conocidos en la tecnica (p. ej., lisis de globulos rojos, aislamiento de celulas mononucleares de sangre periferica, etc.). Los metodos se combinan opcionalmente con otras tecnicas, tales como la tincion DAPI para el ADN nuclear. Resultara evidente que se detecta opcionalmente simultaneamente una variedad de diferentes tipos de marcadores de acido nucleico mediante los metodos y se utiliza para identificar la celula. Por ejemplo, una celula se puede identificar basandose en la presencia o el nivel de expresion relativa de un acido nucleico diana en la celula y la ausencia de otra diana de acido nucleico de la celula; p. ej., una celula tumoral circulante se puede identificar por la presencia o el nivel de uno o mas marcadores que se encuentran en la celula tumoral y que no se encuentran (o que se encuentran a diferentes niveles) en celulas de la sangre, y por la ausencia de uno o mas marcadores presentes en las celulas de la sangre y no en celulas tumorales circulantes. El principio puede ser extendido al uso de cualquier otro tipo de marcadores tales como marcadores basados en protemas en las celulas individuales.
Esencialmente todas las caractensticas senaladas por los metodos anteriores se aplican tambien a estas realizaciones, segun sea relevante; por ejemplo, con respecto a la fuente de la muestra, la fijacion y permeabilizacion de la celula, el lavado de la celula, la desnaturalizacion de los acidos nucleicos diana y de referencia de doble hebra, el tipo de marcas, el uso de sondas de bloqueo opcionales, la deteccion de senales, la deteccion (e intensidad medicion) mediante citometna de flujo o microscopfa, la presencia de la celula en suspension o inmovilizada sobre un sustrato, y/o similares. Ademas, las caractensticas adicionales descritas en la presente memoria, p. ej., en la seccion titulada "Implementacion, aplicaciones y ventajas", se pueden aplicar a los metodos, segun corresponda.
Los metodos de la invencion se pueden utilizar para el analisis de la expresion genica en celulas individuales. Actualmente, el analisis de la expresion genica se ocupa de poblaciones celulares heterogeneas tales como sangre o espedmenes tumorales. La sangre contiene diversos subtipos de leucocitos, y cuando se miden los cambios en la expresion genica de sangre completa o de ARN aislado de la sangre, no se sabe que subtipo de celulas de la sangre cambia realmente su expresion genica. Es posible que la expresion del gen de solo un cierto subtipo de celulas de la sangre se vea afectada en un estado de enfermedad o por tratamiento con farmacos, por ejemplo. La tecnologfa que puede medir la expresion genica en celulas individuales, de modo que se puedan examinar los cambios de expresion genica en celulas individuales, es por lo tanto deseable. Del mismo modo, un especimen tumoral contiene una poblacion heterogenea de celulas incluyendo celulas tumorales, celulas normales, celulas estromales, celulas inmunitarias, etc. La tecnologfa actual examina la suma de la expresion de todas esas celulas a traves del ARN total o el producto lisado celular. Sin embargo, el cambio de expresion en general puede no ser representativo del de las celulas tumorales diana. Asf que de nuevo, sena util analizar los cambios de expresion en celulas individuales de manera que las celulas tumorales diana se pudieran examinar espedficamente, para ver como cambia la expresion genica en las celulas diana y como responden al tratamiento farmacologico, por ejemplo.
Se describen en la presente memoria metodos para el analisis de la expresion genica en celulas individuales. El analisis de la expresion genica de las celulas individuales se puede llevar a cabo midiendo la expresion de un gen diana y normalizandola frente a la expresion de un gen constitutivo, como se describio anteriormente. A modo solo de un par de ejemplos, la expresion normalizada en un estado de enfermedad se puede comparar con el del estado normal, o la expresion en un estado tratado con farmaco se puede comparar con el del estado normal. El cambio de nivel de expresion en celulas individuales puede tener importancia biologica que indica progresion de la enfermedad, eficacia terapeutica y/o toxicidad del farmaco, estadificacion y clasificacion del tumor, etc.
Por consiguiente, se describen metodos para realizar el analisis de la expresion genica comparativa en celulas individuales. En los metodos, se proporciona una primera poblacion celular mixta que comprende una o mas celulas de un tipo especificado. Tambien se proporciona una segunda poblacion celular mixta que comprende una o mas celulas del tipo especificado. Se mide un nivel de expresion de uno o mas acidos nucleicos diana con respecto a un acido nucleico de referencia en las celulas del tipo especificado de la primera poblacion, para proporcionar un primer perfil de expresion. Se mide un nivel de expresion de los uno o mas acidos nucleicos diana con respecto al acido nucleico de referencia en las celulas del tipo especificado de la segunda poblacion, para proporcionar un segundo perfil de expresion. Se comparan los primeros y segundos perfiles de expresion.
Espedficamente, los uno o mas acidos nucleicos diana son uno o mas ARNm, p. ej., dos o mas, tres o mas, cuatro o mas, etc. ARNm. El nivel de expresion de cada ARNm se puede determinar con respecto al de un gen constitutivo
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cuyo ARNm sirve como acido nucleico de referencia.
Las primera y/o segunda poblaciones celulares mixtas contienen al menos otro tipo de celula ademas del tipo especificado, mas tipicamente al menos otros dos o mas tipos de celulas, y opcionalmente de varios a muchos otros tipos de celulas (p. ej., como se encuentra en sangre completa, tumor, u otra muestra biologica compleja). La proporcion de celulas del tipo especificado con respecto a las celulas de todos los otros tipos en la primera o segunda poblacion celular mixta es opcionalmente menor de 1:1x104, menor de 1:1x105, menor de 1:1x106, menor de 1:1x107, menor de 1:1x108, o incluso menor de 1:1x109.
Como resultara evidente, un cambio en el perfil de expresion genica entre las dos poblaciones puede indicar un estado o progreso de la enfermedad, una respuesta a farmacos, una eficacia terapeutica, etc. De este modo, p. ej., la primera poblacion celular mixta puede ser de un paciente que ha sido diagnosticado o que va a ser diagnosticado de una enfermedad o trastorno concretos, mientras que la segunda poblacion mixta es de un individuo sano. Del mismo modo, las primera y segunda poblaciones mixtas pueden ser de un solo individuo, pero tomadas en diferentes momentos, por ejemplo, para seguir el progreso de la enfermedad o para evaluar la respuesta al tratamiento farmacologico. Por consiguiente, la primera poblacion celular mixta puede ser tomada de un individuo (p. ej., un ser humano) antes de que se inicie el tratamiento con un farmaco u otro compuesto, mientras que la segunda poblacion se toma en un momento especificado despues de que se inicie el tratamiento. Como ejemplo adicional, la primera poblacion mixta puede ser de un individuo tratado, mientras que la segunda poblacion mixta es de un individuo no tratado.
Esencialmente se aplican tambien todas las caractensticas senaladas para los metodos anteriores, segun corresponda; por ejemplo, con respecto al tipo de acidos nucleicos diana y de referencia, el tipo de celula, la fuente de la muestra, la fijacion y permeabilizacion de la celula, el lavado de la celula, la desnaturalizacion de los acidos nucleicos diana y de referencia de doble hebra, el tipo de marcas, el uso y la configuracion de las sondas marcadoras, las sondas de captura, los preamplificadores y/o los amplificadores, el uso de sondas de bloqueo opcionales, la deteccion de senales, la deteccion (y la medicion de la intensidad) mediante citometna de flujo o microscopfa, la presencia de la celula en suspension o inmovilizada sobre un sustrato, y/o similares. Los acidos nucleicos diana y de referencia ilustrativos se describen en la presente memoria.
Alternativamente, los metodos se pueden utilizar para comparar el numero de copias en las celulas individuales de una primera poblacion (p. ej., celulas tumorales) con el numero de copias en las celulas individuales de una segunda poblacion (p. ej., celulas normales utilizadas como referencia). La diana o las dianas de acido nucleico pueden ser transcritos o aDn genomico, donde, por ejemplo, el grado de amplificacion o delecion de genes tales como Her-2 se puede correlacionar con el progreso del tumor. Alternativamente, los metodos se pueden aplicar al analisis de la expresion genica en celulas individuales, incluso en una unica poblacion, incluyendo, p. ej., las celulas del mismo tipo pero en diferentes etapas del ciclo celular.
Densidad de la marca
Los metodos descritos en la presente memoria permiten la captura de muchas mas marcas con pequenas regiones de acidos nucleicos diana de lo que lo hacen las tecnicas actualmente existentes. Por ejemplo, las tecnicas FISH convencionales utilizan tipicamente sondas que cubren 20 kb o mas, y una sonda tiene tipicamente fluoroforos conjugados qmmicamente a una densidad de aproximadamente una molecula fluorescente por siete nucleotidos de la sonda. Cuando se emplea la deteccion de dianas con baliza moleculares, un par de marcas se captura con la diana en la region cubierta por la baliza, tipicamente aproximadamente 40 nucleotidos. Para una discusion adicional de las tecnicas actuales ilustrativas, veanse, p. ej., las publicaciones de solicitud de patente de los Estados Unidos Nums. 2004/0091880 y 2005/0181463, el documento USPN 6.645.731, y las publicaciones de solicitud de patente internacional Nums. WO 95/09245 y 03/019141.
Los metodos descritos en la presente memoria, en comparacion, permiten facilmente la captura de cientos de marcas (por ejemplo, 400 o mas) por la region de la diana cubierta por una unica sonda de captura, p. ej., 20-25 nucleotidos o mas. El grado teorico de amplificacion obtenido a partir de una unica sonda de captura se calcula facilmente para cualquier configuracion dada de sondas de captura, amplificadores, etc.; por ejemplo, el grado teorico de amplificacion logrado a partir de una unica sonda de captura, y por lo tanto el numero de marcas por longitud en nucleotidos de la sonda de captura, puede ser igual al numero de preamplificadores unidos a la sonda de captura x numero de amplificadores que se unen a cada preamplificador x numero de sondas marcadoras que se unen a cada preamplificador x numero de marcas por sonda marcada.
Por lo tanto, se describen metodos que facilitan la asociacion de una alta densidad de marcas a acidos nucleicos diana en las celulas. Se describen espedficamente metodos de deteccion de dos o mas dianas de acido nucleico en una celula individual. En los metodos, se proporciona una muestra que comprende la celula. La celula comprende o se sospecha que comprende una primera diana de acido nucleico y una segunda diana de acido nucleico. En la celula, una primera marca se captura con la primera diana de acido nucleico (cuando esta presente en la celula) y una segunda marca se captura con la segunda diana de acido nucleico (cuando esta presente en la celula). Una primera senal de la primera marca es distinguible de una segunda senal de la segunda marca. Como se ha senalado, las marcas son capturadas a alta densidad. Por lo tanto, se captura con la primera diana de acido nucleico
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un promedio de al menos una copia de la primera marca por nucleotido de la primera diana de acido nucleico sobre una region que abarca al menos 20 nucleotidos contiguos de la primera diana de acido nucleico, y se captura con la segunda diana de acido nucleico un promedio de al menos una copia de la segunda marca por nucleotido del segundo acido nucleico diana sobre una region que abarca al menos 20 nucleotidos contiguos de la segunda diana de acido nucleico. Se detectan la primera senal de la primera marca y la segunda senal de la segunda marca.
Como se describe en la presente memoria, se capturan un promedio de al menos cuatro, ocho, o doce copias de la primera marca por nucleotido de la primera diana de acido nucleico con la primera diana de acido nucleico sobre una region que abarca al menos 20 nucleotidos contiguos de la primera diana de acido nucleico, y se capturan un promedio de al menos cuatro, ocho, o doce copias de la segunda marca por nucleotido de la segunda diana de acido nucleico con la segunda diana de acido nucleico sobre una region que abarca al menos 20 nucleotidos contiguos de la segunda diana de acido nucleico. Espedficamente, se capturan un promedio de al menos dieciseis copias de la primera marca por nucleotido de la primera diana de acido nucleico con la primera diana de acido nucleico sobre una region que abarca al menos 20 nucleotidos contiguos de la primera diana de acido nucleico, y se capturan un promedio de al menos dieciseis copias de la segunda marca por nucleotido de la segunda diana de acido nucleico con la segunda diana de acido nucleico sobre una region que abarca al menos 20 nucleotidos contiguos de la segunda diana de acido nucleico.
Esencialmente todas las caractensticas observadas para los metodos anteriores tambien se aplican a estas realizaciones, segun corresponda, por ejemplo, con respecto al tipo de marcas, la deteccion de senales, el tipo, el tratamiento, y la suspension de la celula, y/o similares. Las regiones de las primera y segunda dianas de acido nucleico opcionalmente abarcan al menos 25, 50, 100, 200, o mas nucleotidos contiguos y/o a lo sumo 2000, 1000, 500, 200, 100, 50, o menos nucleotidos. Una densidad parecida de terceras, cuartas, quintas, sextas, etc. marcas esta presente opcionalmente para (por ejemplo, capturadas por), las terceras, cuartas, quintas, sextas, etc. dianas de acido nucleico.
Deteccion de celulas diana
Como se describio anteriormente, las celulas se pueden detectar e identificar mediante la deteccion de sus acidos nucleicos constituyentes. Para ciertas aplicaciones, por ejemplo, es ventajosa la deteccion de celulas raras de grandes mezclas heterogeneas de celulas, la deteccion de multiples marcadores de acido nucleico redundantes, con el fin de detectar la celula rara. El siguiente ejemplo hipotetico ilustra una ventaja de detectar marcadores redundantes.
Se dice que las celulas tumorales circulantes (CTC) se van a detectar a partir de una muestra de sangre en la que la concentracion de CTC es una en 106 globulos blancos normales. Si un solo marcador de acido nucleico para la CTC (p. ej., un acido nucleico cuya presencia o numero de copias pueden distinguir umvocamente y suficientemente la celula del resto de la poblacion celular) tiene una especificidad de deteccion de 1 en 103, 1000 celulas seran identificados por error como "CTC" cuando se cuentan 106 celulas. (Tales falsos positivos pueden resultar de la senal de fondo aleatoria generado por la union no espedfica de la sonda o sondas relevantes o de factores similares). Si esta incluido un marcador independiente adicional que, por sf mismo, tambien tiene una especificidad de deteccion de 1 en 103, y si una celula se identifica como CTC solo si ambos marcadores son positivos, la especificidad de deteccion combinada se incrementa ahora drasticamente, a 1 en 103x103 = 106. Esta especificidad es suficiente para la deteccion directa de CTC en los globulos blancos normales bajo estos supuestos. Del mismo modo, si se utilizan tres marcadores redundantes independientes para la identificacion de CTC, la especificidad de deteccion se puede reforzar a 1 en 109. El uso de dos o mas marcadores redundantes reduce de este modo el numero de falsos positivos y facilita la deteccion incluso de celulas raras a partir de muestras complejas.
Por consiguiente, en la presente memoria se describen metodos de deteccion de una celula individual de un tipo especificado. En los metodos, se proporciona una muestra que comprende una mezcla de tipos de celulas incluyendo al menos una celula del tipo especificado. Se proporcionan Una primera sonda marcada que comprende una primera marca y una segunda sonda marcada que comprende una segunda marca, en donde una primera senal de la primera marca es distinguible de una segunda senal de la segunda marca. En la celula, la primera sonda marcada se captura con una primera diana de acido nucleico (cuando la primera diana de acido nucleico esta presente en la celula) y la segunda sonda marcada se captura con una segunda diana de acido nucleico (cuando la segunda diana de acido nucleico esta presente en la celula). La primera senal de la primera marca y la segunda senal de la segunda marca se detectan y se correlacionan con la presencia, ausencia o cantidad de las correspondientes, primera y segunda dianas de acido nucleico en la celula. Se identifica que la celula es del tipo especificado basandose en la deteccion de la presencia, ausencia o cantidad (p. ej., una cantidad distinta de cero) de la primera y la segunda dianas de acido nucleico dentro de la celula, donde el tipo especificado de celula es distinguible de los otros tipos de celulas en la mezcla basandose en la presencia, ausencia o cantidad de la primera diana de acido nucleico o la presencia, ausencia o cantidad de la segunda diana de acido nucleico en la celula (es decir, las dianas de acido nucleico son marcadores redundantes para el tipo de celula especificado). Opcionalmente se miden la intensidad de la primera senal y la intensidad de la segunda senal y se correlacionan con la cantidad de acido nucleico correspondiente presente en la celula.
Cada diana de acido nucleico que sirve como marcador para el tipo de celula especificado puede distinguir el tipo de
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celula por su presencia en la celula, por su cantidad (numero de copias, p. ej., su numero de copias genomicas o su nivel de expresion de transcritos), o por su ausencia de la celula (un marcador negativo). Un conjunto de dianas de acido nucleico puede incluir diferentes tipos de tales marcadores; es decir, una diana de acido nucleico puede servir como marcador positivo, distinguiendo la celula por su presencia o cantidad distinta de cero en la celula, mientras que otro sirve como marcador negativo, distinguiendo la celula por su ausencia en la celula. Por ejemplo, la celula comprende una primera diana de acido nucleico y una segunda diana de acido nucleico, y se identifica que la celula es del tipo especificado basandose en la deteccion de la presencia o la cantidad tanto de la primera como de la segunda dianas de acido nucleico dentro de la celula, donde el tipo especificado de celula es distinguible de los otros tipos de celulas en la mezcla basandose en la presencia o cantidad de la primera diana de acido nucleico o la presencia o cantidad de la segunda diana de acido nucleico en la celula.
Las sondas marcadoras pueden unirse directamente a las dianas de acido nucleico. Por ejemplo, la primera sonda marcada puede hibridar con la primera diana de acido nucleico y/o la segunda sonda marcada puede hibridar con la segunda diana de acido nucleico. Alternativamente, algunas o todas las sondas marcadoras se pueden unir indirectamente a sus dianas de acido nucleico correspondientes, p. ej., a traves de sondas de captura. Por ejemplo, las primera y segunda sondas marcadoras se pueden unir directamente a las dianas de acido nucleico, o una se puede unir directamente mientras que la otra se une indirectamente, o ambas se pueden unir indirectamente.
Las sondas marcadoras son capturadas opcionalmente con las dianas de acido nucleico a traves de sondas de captura. Espedficamente, se proporcionan al menos una primera sonda de captura y al menos una segunda sonda de captura. En la celula, la primera sonda de captura hibrida con la primera diana de acido nucleico y la segunda sonda de captura hibrida con la segunda diana de acido nucleico. La primera sonda marcada es capturada con la primera sonda de captura y la segunda sonda marcada es capturada con la segunda sonda de captura, capturando de este modo la primera sonda marcada con la primera diana de acido nucleico y la segunda sonda marcada con la segunda diana de acido nucleico. Las caractensticas descritas para los metodos anteriores tambien se aplican a estas realizaciones, con respecto a la configuracion y al numero de sondas marcadoras y de captura, el uso opcional de preamplificadores y/o amplificadores, la amplificacion por drculo rodador de polinucleotidos circulares, y similares.
Las tercera, cuarta, quinta, etc. dianas de acido nucleico se detectan opcionalmente en la celula. Por ejemplo, el metodo incluye opcionalmente: proporcionar una tercera sonda marcada que comprende una tercera marca, en donde una tercera senal de la tercera marca es distinguible de las primeras y segundas senales, capturar en la celula la tercera sonda marcada con un tercer acido nucleico diana (cuando esta presente en la celula), y detectar la tercera senal de la tercera marca. Las tercera, cuarta, quinta, etc. sondas marcadoras hibridan opcionalmente directamente con su acido nucleico correspondiente, o puede ser capturadas indirectamente a traves de sondas de captura como se describe para la primera y segunda sondas marcadoras.
Se pueden utilizar marcadores adicionales en cualquiera de una variedad de maneras. Por ejemplo, la celula puede comprender la tercera diana de acido nucleico, y las primera y/o segunda senales pueden ser normalizadas a la tercera senal. Los metodos pueden incluir la identificacion de que la celula es del tipo especificado basandose en las primera y/o segunda senales normalizadas, p. ej., si el tipo de celula diana es distinguible de los otros tipos de celulas en la mezcla basandose en el numero de copias las primera y/o segunda dianas de acido nucleico, en lugar de solamente en su presencia en el tipo de celula diana y no en los otros tipos de celulas. Los ejemplos incluyen las celulas detectables basandose en un patron de expresion genica diferencial, CTC u otras celulas tumorales detectables por la expresion en exceso de uno o mas ARNm espedficos, y CTC u otras celulas tumorales detectables mediante amplificacion o delecion de una o mas regiones cromosomicas espedficas.
Como ejemplo adicional, la tercera diana de acido nucleico puede servir como un tercer marcador redundante para el tipo de celula diana, p. ej., para mejorar la especificidad del analisis para determinar el tipo de celula deseado. Por lo tanto, los metodos incluyen la correlacion de la tercera senal detectada a partir de la celula con la presencia, ausencia o cantidad de la tercera diana de acido nucleico en la celula, y la identificacion de que la celula es del tipo especificado basandose en la deteccion de la presencia, ausencia, o cantidad de las primera, segunda y tercera dianas de acido nucleico, dentro de la celula, en donde el tipo especificado de celula es distinguible de los otros tipos de celulas en la mezcla basandose en la presencia, ausencia o cantidad de la primera diana de acido nucleico, la presencia, ausencia o cantidad de la segunda diana de acido nucleico, o la presencia, ausencia o cantidad de la tercera diana de acido nucleico en la celula.
Como otro ejemplo adicional, los marcadores adicionales pueden ayudar a identificar el tipo de celula. Por ejemplo, la presencia, ausencia o cantidad de los primeros y terceros marcadores puede ser suficiente para identificar el tipo de celulas, al igual que la presencia, ausencia o cantidad de los segundos y cuartos marcadores; los cuatro marcadores podnan ser detectados para proporcionar dos conjuntos redundantes de marcadores y por lo tanto una mayor especificidad de deteccion. Como ejemplo adicional, se pueden utilizar uno o mas marcadores adicionales en la seleccion negativa contra los tipos celulares no deseados; por ejemplo, la identidad de una celula como una CTC puede ser verificada adicionalmente por la ausencia de la celula de uno o mas marcadores presentes en las celulas de la sangre y no en celulas tumorales circulantes.
La deteccion de dianas de acido nucleico adicionales tambien puede proporcionar una informacion adicional util en el
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diagnostico, la prediccion de resultados o similares, independientemente de si las dianas sirven como marcadores para el tipo de celula concreto. Por ejemplo, las dianas de acido nucleico adicionales pueden incluir marcadores del potencial de proliferacion, la apoptosis, u otros cambios metastasicos, geneticos, o epigeneticos.
Las senales de las dianas adicionales se normalizan opcionalmente a un acido nucleico de referencia como se ha descrito anteriormente. La intensidad de la senal se ajusta opcionalmente entre las dianas dependiendo de su numero de copias esperado, si se desea. Las senales de los acidos nucleicos diana en la celula se comparan opcionalmente con las de una celula de referencia, como se senalo anteriormente.
Una diana de acido nucleico puede ser esencialmente cualquier acido nucleico que se detecta deseablemente en la celula. Por ejemplo, una diana de acido nucleico puede ser un ADN, un ADN cromosomico, un ARN, un ARNm, un microARN, un ARN ribosomico, o similares. La diana de acido nucleico puede ser un acido nucleico endogeno a la celula. Como ejemplo adicional, la diana puede ser un acido nucleico introducido o expresado en la celula mediante infeccion de la celula con un patogeno, p. ej., un ARN o ADN genomico viral o bacteriano, un plasmido, un ARNm viral o bacteriano, o similares.
Las primera y segunda (y/u opcionales tercera, cuarta, etc.) dianas de acido nucleico pueden ser parte de una molecula de acido nucleico, o pueden ser moleculas separadas. Varias ventajas y aplicaciones de ambos enfoques se comentan con mayor detalle mas adelante, p. ej., en la seccion titulada "Implementacion, aplicaciones y ventajas". Espedficamente, la primera diana de acido nucleico es un primer ARNm y la segunda diana de acido nucleico es un segundo ARNm. Alternativamente, la primera diana de acido nucleico comprende una primera region de un ARNm y de la segunda diana de acido nucleico comprende una segunda region del mismo ARNm. Alternativamente, la primera diana de acido nucleico comprende una primera secuencia de polinucleotidos de ADN cromosomico y la segunda diana de acido nucleico comprende una segunda secuencia de polinucleotidos de ADN cromosomico. Las primera y segunda secuencias de polinucleotidos de ADN cromosomico estan localizadas opcionalmente en el mismo cromosoma, p. ej., dentro del mismo gen, o en diferentes cromosomas.
Los metodos se pueden aplicar a la deteccion y la identificacion incluso de tipos de celulas raras. Por ejemplo, la proporcion de celulas del tipo especificado con respecto a las todos los otros tipos en la mezcla es opcionalmente menos de 1:1x104, menos de 1:1x105, menos de 1:1x106, menos de 1:1x107, menos de 1:1x108, o incluso menos de 1:1x109.
Esencialmente, se puede detectar e identificar cualquier tipo de celula que pueda diferenciarse basandose en marcadores adecuados (o regiones redundantes de un unico marcador, p. ej., un unico ARNm o una region cromosomica amplificada/suprimido) utilizando los metodos. Solo como unos pocos ejemplos, la celula puede ser una celula tumoral circulante, una celula infectada viralmente, una celula fetal en sangre materna, una celula bacteriana u otro microorganismo en una muestra biologica (p. ej., sangre u otro fluido corporal), una celula endotelial, una celula endotelial precursora o una celulas de miocardio en la sangre, una celula madre o una celula T. Los tipos de celulas raras se pueden enriquecer antes de realizar los metodos, si fuera necesario, por medio de metodos conocidos en la tecnica (p. ej., lisis de globulos rojos, aislamiento de celulas mononucleares de sangre periferica, etc.).
Esencialmente se aplican tambien todas las caractensticas senaladas para los metodos anteriores, segun corresponda; por ejemplo, con respecto a la fuente de la muestra, la fijacion y permeabilizacion de la celula, el lavado de la celula, la desnaturalizacion de acidos nucleicos de doble hebra, el tipo de marcas, el uso de sondas de bloqueo opcionales, la deteccion de senales, la deteccion (y medicion de la intensidad) de las senales de la celula individual mediante citometna de flujo o microscopfa, la presencia de la celula en suspension o inmovilizada sobre un sustrato, y/o similares. Ademas, las caractensticas adicionales descritas en la presente memoria, p. ej., en la seccion titulada "Implementacion, aplicaciones y ventajas", se puede aplicar a los metodos, segun corresponda.
Alternativamente, se realiza la deteccion de las celulas individuales de un tipo especificado como se ha descrito anteriormente, pero no es necesario que las primera y segunda dianas de acido nucleico sean marcadores redundantes para ese tipo de celula. Las dianas de acido nucleico pueden ser esencialmente cualquier acido nucleico deseado, incluyendo, p. ej., marcadores redundantes y/o no redundantes para el tipo de celula.
Composiciones y kits
Tambien se describen en la presente memoria composiciones utiles en la practica o producidas mediante los metodos. Espedficamente se describe una composicion que incluye una celula fijada y permeabilizada, cuya celula comprende o se sospecha que comprende una primera diana de acido nucleico y una segunda diana de acido nucleico, al menos una primera sonda de captura susceptible de hibridar con la primera diana de acido nucleico, al menos una segunda sonda de captura susceptible de hibridar con la segunda diana de acido nucleico, una primera sonda marcada que comprende una primera marca, y una segunda sonda marcada que comprende una segunda marca. Una primera senal de la primera marca es distinguible de una segunda senal de la segunda marca. La celula comprende opcionalmente las primera y segunda sondas de captura y sondas marcadoras. Las primera y segunda sondas de captura hibridan opcionalmente con sus respectivas dianas de acido nucleico en la celula.
Tambien se aplican las caractensticas descritas para los metodos anteriores para la captura indirecta de las sondas
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marcadoras con las dianas de acido nucleico. Por ejemplo, las sondas marcadoras pueden hibridar con las sondas de captura. Espedficamente, la composicion incluye una unica primera sonda de captura y una unica segunda sonda de captura, donde la primera sonda marcada es susceptible de hibridar con la primera sonda de captura y la segunda sonda marcada es susceptible de hibridar con la segunda sonda de captura. Alternativamente, la composicion incluye dos o mas primeras sondas de captura, dos o mas segundas sondas de captura, una pluralidad de las primeras sondas marcadoras, y una pluralidad de las segundas sondas marcadoras. Una unica primera sonda marcada es susceptible de hibridar con cada una de las primeras sondas de captura, y una unica segunda sonda marcada es susceptible de hibridar con cada una de las segundas sondas de captura.
Alternativamente, los amplificadores se pueden emplear para aumentar el numero de sondas marcadoras capturadas con cada diana. Por ejemplo, en una clase de realizaciones, la composicion incluye una unica primera sonda de captura, una unica segunda sonda de captura, una pluralidad de las primeras sondas marcadoras, una pluralidad de las segundas sondas marcadoras, un primer amplificador, y un segundo amplificador. El primer amplificador es susceptible de hibridar con la primera sonda de captura y con la pluralidad de primeras sondas marcadoras, y el segundo amplificador es susceptible de hibridar con la segunda sonda de captura y con la pluralidad de segundas sondas marcadoras. Alternativamente, la composicion incluye dos o mas primeras sondas de captura, dos o mas segundas sondas de captura, una multiplicidad de las primeras sondas marcadoras, una multiplicidad de las segundas sondas marcadoras, un primer amplificador, y un segundo amplificador. El primer amplificador es susceptible de hibridar con una de las primeras sondas de captura y con una pluralidad de primeras sondas marcadoras, y el segundo amplificador es susceptible de hibridar con una de las segundas sondas de captura y con una pluralidad de segundas sondas marcadoras.
Alternativamente, se emplean preamplificadores y amplificadores para capturar las sondas marcadoras con las dianas. Espedficamente, la composicion incluye una unica primera sonda de captura, una unica segunda sonda de captura, una multiplicidad de las primeras sondas marcadoras, una multiplicidad de las segundas sondas marcadoras, una pluralidad de primeros amplificadores, una pluralidad de segundos amplificadores, un primer preamplificador, y un segundo preamplificador. El primer preamplificador es susceptible de hibridar con la primera sonda de captura y a la pluralidad de primeros amplificadores, y el segundo preamplificador es susceptible de hibridar con la segunda sonda de captura y con la pluralidad de segundos amplificadores. El primer amplificador es susceptible de hibridar con el primer preamplificador y con una pluralidad de primeras sondas marcadoras, y el segundo amplificador es susceptible de hibridar con el segundo preamplificador y con una pluralidad de segundas sondas marcadoras. Espedficamente, la composicion incluye dos o mas primeras sondas de captura, dos o mas segundas sondas de captura, una multiplicidad de las primeras sondas marcadoras, una multiplicidad de las segundas sondas marcadoras, una multiplicidad de primeros amplificadores, una multiplicidad de segundos amplificadores, una pluralidad de primeros preamplificadores, y una pluralidad de segundos preamplificadores. El primer preamplificador es susceptible de hibridar con una de las primera sondas de captura y con una pluralidad de primeros amplificadores, el segundo preamplificador es susceptible de hibridar con una de las segundas sondas de captura y con una pluralidad de segundos amplificadores, el primer amplificador es susceptible de hibridar con el primer preamplificador y con una pluralidad de primeras sondas marcadoras, y el segundo amplificador es susceptible de hibridar con el segundo preamplificador y con una pluralidad de segundas sondas marcadoras. Opcionalmente, se pueden utilizar preamplificadores adicionales como intermedios entre un preamplificador hibridado con la sonda o las sondas de captura y los amplificadores.
Como se ha descrito anteriormente, una sonda de captura hibrida con cada sonda marcada, amplificador, o preamplificador. Alternativamente, dos o mas sondas de captura hibridan con la sonda marcada, amplificador, o preamplificador.
Espedficamente, la composicion comprende una pluralidad de las primeras sondas marcadoras, una pluralidad de las segundas sondas marcadoras, un primer polinucleotido amplificado producido mediante amplificacion por drculo rodador de un primer polinucleotido circular hibridado con la primera sonda de captura, y un segundo polinucleotido amplificado producido mediante amplificacion por drculo rodador de un segundo polinucleotido circular hibridado con la segunda sonda de captura. El primer polinucleotido circular comprende al menos una copia de una secuencia de polinucleotidos identica a una secuencia de polinucleotidos en la primera sonda marcada, y el primer polinucleotido amplificado comprende una pluralidad de copias de una secuencia de polinucleotidos complementaria a la secuencia de polinucleotidos en la primera sonda marcada (y por lo tanto puede hibridar con una pluralidad de las sondas marcadoras). El segundo polinucleotido circular comprende al menos una copia de una secuencia de polinucleotidos identica a una secuencia de polinucleotidos en la segunda sonda marcada, y el segundo polinucleotido amplificado comprende una pluralidad de copias de una secuencia de polinucleotidos complementaria a la secuencia de polinucleotidos en la segunda sonda marcada. La composicion tambien puede incluir reactivos necesarios para la produccion de los polinucleotidos amplificados, por ejemplo, una polimerasa de acido nucleico suministrada exogenamente, una ligasa de acido nucleico suministrada exogenamente, y/o nucleosido trifosfatos suministrados exogenamente (p. ej., dNTP).
La celula incluye opcionalmente dianas de acido nucleico adicionales, y la composicion (y la celula) puede incluir reactivos para la deteccion de estas dianas. Por ejemplo, la celula puede comprender o se puede sospechar que comprende una tercera diana de acido nucleico, y la composicion puede incluir al menos una tercera sonda de captura susceptible de hibridar con la tercera diana de acido nucleico y una tercera sonda marcada que comprende
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una tercera marca. Una tercera senal de la tercera marca es distinguible de las primera y segunda senales. La celula incluye opcionalmente cuartas, quintas, sextas, etc. dianas de acido nucleico, y la composicion incluye opcionalmente cuartas, quintas, sextas, etc. sondas marcadoras y sondas de captura.
Esencialmente se aplican tambien todas las caractensticas senaladas para los metodos anteriores, segun corresponda; por ejemplo, con respecto al tipo de diana de acido nucleico, la ubicacion de diversas dianas en una sola molecula o en moleculas diferentes, el tipo de marcas, la inclusion de sondas de bloqueo opcionales, y/o similares. Por ejemplo, vale la pena senalar que la segunda diana de acido nucleico comprende opcionalmente un acido nucleico de referencia. En otras realizaciones, las primera y segunda dianas de acido nucleico sirven como marcadores para un tipo de celula especificado, p. ej., marcadores redundantes.
La celula puede ser esencialmente cualquier tipo de celula de cualquier fuente, particularmente una celula que puede diferenciarse dependiendo de su contenido de acido nucleico (presencia, ausencia, o numero de copias de uno o mas acidos nucleicos). Solo a modo de unos pocos ejemplos, la celula puede ser una celula tumoral circulante, una celula infectada viralmente, una celula fetal en sangre materna, una celula bacteriana u otro microorganismo en una muestra biologica (p. ej., sangre u otro fluido corporal), o una celula endotelial, una celula endotelial precursora o la celula de miocardio en la sangre. Por ejemplo, la celula puede derivar de un fluido corporal, sangre, medula osea, esputo, orina, ganglio linfatico, heces, frotis de Papanicolaou cervical, hisopo oral u otro hisopo o frotis, ffquido cefalorraqmdeo, saliva, esputo, semen, fluido linfatico, un fluido intercelular, un tejido (p. ej., un producto homogeneizado de tejido), una biopsia, y/o un tumor. La celula puede derivar de uno o mas de un ser humano, un animal, una planta, y una celula cultivada.
La celula puede estar presente en una mezcla de celulas, por ejemplo, una mezcla heterogenea compleja. En una clase de realizaciones, la celula es de un tipo especificado, y la composicion comprende uno o mas de otros tipos de celulas. Estas otras celulas pueden estar presentes en exceso, incluso gran exceso, de la celula. Por ejemplo, la razon de celulas del tipo especificado con respecto a las celulas de todos los otros tipos en la composicion es opcionalmente menor de 1:1x104, menor de 1:1x105, menor de 1:1x106, menor de 1:1x107, menor de 1:1x108, o incluso menor de 1:1x109.
La celula esta opcionalmente inmovilizada sobre un sustrato, presente en una seccion de tejido, o similar. Preferiblemente, sin embargo, la celula esta en suspension en la composicion. La composicion puede estar contenida en un citometro de flujo o un aparato similar. Las caractensticas adicionales descritas en la presente memoria, p. ej., en la seccion titulada "Implementacion, aplicaciones y ventajas," se pueden aplicar a las composiciones, segun corresponda.
Tambien se describen composiciones en las que un gran numero de marcas se correlacionan con cada acido nucleico diana. Una clase general de realizaciones proporciona asf una composicion que comprende una celula, cuya celula incluye una primera diana de acido nucleico, una segunda diana de acido nucleico, una primera marca, cuya presencia en la celula es indicativa de la presencia de la primera diana de acido nucleico en la celula, y una segunda marca cuya presencia en la celula es indicativa de la presencia de la segunda diana de acido nucleico en la celula, en donde una primera senal de la primera marca es distinguible de una segunda senal de la segunda marca. Esta presente un promedio de al menos una copia de la primera marca en la celula por nucleotido de la primera diana de acido nucleico sobre una region que abarca al menos 20 nucleotidos contiguos de la primera diana de acido nucleico, y esta presente un promedio de al menos una copia de la segunda marca en la celula por nucleotido de la segunda diana de acido nucleico en una region que abarca al menos 20 nucleotidos contiguos de la segunda diana de acido nucleico.
Espedficamente, las copias de la primera marca se asocian ffsicamente con la primera diana de acido nucleico, y las copias de la segunda marca se asocian ffsicamente con la segunda diana de acido nucleico. Por ejemplo, la primera marca puede ser parte de una primera sonda marcada y la segunda marca parte de una segunda sonda marcada, donde se capturan las sondas marcadoras con los acidos nucleicos diana.
Espedficamente, esta presente un promedio de al menos cuatro, ocho, o doce copias de la primera marca en la celula por nucleotido de la primera diana de acido nucleico sobre una region que abarca al menos 20 nucleotidos contiguos de la primera diana de acido nucleico, y esta presente un promedio de al menos cuatro, ocho o doce copias de la segunda marca en la celula por nucleotido de la segunda diana de acido nucleico sobre una region que abarca al menos 20 nucleotidos contiguos de la segunda diana de acido nucleico. Espedficamente, estan presentes en la celula un promedio de al menos dieciseis copias de la primera marca por nucleotido de la primera diana de acido nucleico sobre una region que abarca al menos 20 nucleotidos contiguos de la primera diana de acido nucleico, y esta presente un promedio de al menos dieciseis copias de la segunda marca en la celula por nucleotido de la segunda diana de acido nucleico en una region que abarca al menos 20 nucleotidos contiguos de la segunda diana de acido nucleico.
Esencialmente todas las caractensticas observadas para las realizaciones anteriores se aplican tambien, segun corresponda, p. ej., con respecto al tipo de marcas, la suspension de la celula, y/o similares. Las regiones de las primera y segunda dianas de acido nucleico son ffpicamente regiones cubiertas por una sonda, cebador, o polinucleotido similar empleados para detectar la diana respectiva. Las regiones de las primera y segunda dianas de
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acido nucleico opcionalmente abarcan al menos 25, 50, 100, 200, o mas nucleotidos contiguos y/o a lo sumo 2000, 1000, 500, 200, 100, 50, o menos nucleotidos. Una densidad similar de marcas se captura opcionalmente con las tercera, cuarta, quinta, sexta, etc. dianas de acido nucleico. La composicion incluye opcionalmente cebadores de PCR, una polimerasa termoestable, y/o similares, en realizaciones en las que las dianas son detectadas por PCR multiplex in situ.
Los kits de la invencion son utiles para la practica de los metodos descritos en la presente memoria. Una clase general de kits detecta una primera diana de acido nucleico y una segunda diana de acido nucleico en una celula individual. Dicho kit incluye al menos un reactivo para la fijacion y/o permeabilizacion de la celula, al menos una primera sonda de captura susceptible de hibridar con la primera diana de acido nucleico, al menos una segunda sonda de captura susceptible de hibridar con la segunda diana de acido nucleico, una primera sonda marcada que comprende una primera marca, y una segunda sonda marcada que comprende una segunda marca, en donde una primera senal de la primera marca es distinguible de una segunda senal de la segunda marca, empaquetados en uno o mas recipientes.
Esencialmente todas las caractensticas senaladas para las composiciones descritas anteriormente se aplican tambien a los kits, segun corresponda; por ejemplo, con respecto al numero de dianas de acido nucleico, la configuracion y el numero de las sondas marcadoras y de captura, la inclusion de preamplificadores y/o amplificadores, la inclusion de sondas de bloqueo, la inclusion de reactivos de amplificacion, el tipo de acido nucleico diana, la ubicacion de diversas dianas en una sola molecula o en diferentes moleculas, el tipo de marcas, la inclusion de sondas de bloqueo opcionales, y/o similares. El kit opcionalmente tambien incluye instrucciones para la deteccion de las dianas de acido nucleico en la celula y/o la identificacion de que la celula es de un tipo especificado, una o mas soluciones tamponadas (p. ej., diluyente, tampon de hibridacion, y/o tampon de lavado), una o varias celulas de referencia que comprenden una o mas de las dianas de acido nucleico, y/o similares.
Otra clase general de kits detecta una celula individual de un tipo especificado a partir de una mezcla de tipos de celulas mediante la deteccion de una primera diana de acido nucleico y una segunda diana de acido nucleico. Dicho kit incluye al menos un reactivo para la fijacion y/o permeabilizacion de la celula, una primera sonda marcada que comprende una primera marca (para la deteccion de la primera diana de acido nucleico), y una segunda sonda marcada que comprende una segunda marca (para la deteccion de la segunda diana de acido nucleico), en donde una primera senal de la primera marca es distinguible de una segunda senal de la segunda marca, empaquetados en uno o mas recipientes. El tipo especificado de celula es distinguible de los otros tipos de celulas en la mezcla por la presencia, ausencia o cantidad de la primera diana de acido nucleico en la celula o por la presencia, ausencia o cantidad de la segunda diana de acido nucleico en la celula (es decir, las dos dianas son marcadores redundantes para el tipo de celula especificado).
Esencialmente todas las caractensticas senaladas para las composiciones descritas anteriormente se aplican tambien a los kits, segun corresponda; por ejemplo, con respecto al numero de dianas de acido nucleico, la inclusion de sondas de captura, la configuracion y numero de las sondas marcadoras y/o de captura, la inclusion de preamplificadores y/o amplificadores, la inclusion de sondas de bloqueo, la inclusion de reactivos de amplificacion, el tipo de diana de nucleico acido, la ubicacion de diversas dianas en una sola molecula o en moleculas diferentes, el tipo de marcas, la inclusion de sondas de bloqueo opcionales, y/o similares. El kit tambien incluye opcionalmente instrucciones para identificar que la celula es del tipo especificado, una o mas soluciones tamponadas (p. ej., diluyente, tampon de hibridacion, y/o tampon de lavado), una o varias celulas de referencia que comprenden una o mas dianas de acido nucleico, y/o similares.
Implementacion, aplicaciones y ventajas
Varios aspectos de la invencion se describen con detalle adicionalmente a continuacion. Tambien se describen realizaciones y aplicaciones ilustrativas.
La nueva tecnologfa (metodos, composiciones, sistemas y kits), QMAGEX (Quantitative Multiplex Analysis of Gene Expression in Single Cell), descrita en la presente memoria es susceptible de deteccion y cuantificacion de multiples acidos nucleicos dentro de las celulas individuales. La tecnologfa es significativamente diferente de la tecnologfa HIS existente en varios aspectos, aunque ambas pueden medir la expresion del ARNm en las celulas individuales. En primer lugar, las celulas permanecen preferiblemente en estado de suspension durante todas o al menos la mayona de las etapas de ensayo en los ensayos de la presente invencion, lo que mejora en gran medida la cinetica de hibridacion de ensayo, dando como resultado una mejor reproducibilidad y menor tiempo de ensayo. En segundo lugar, la tecnologfa actual tiene la capacidad para analizar la expresion de multiples transcritos de ARNm en las celulas simultaneamente y cuantitativamente. Esto es muy deseable, ya que, por ejemplo, la deteccion de multiples genes marcadores de tumores podna mejorar en gran medida la precision de la identificacion de CTC (Mocellin et al., 2004) y reducir considerablemente la tasa de falsos positivos. El analisis cuantitativo del nivel de expresion genica no solo podna ayudar adicionalmente a la discriminacion de las CTC de otros tipos de celulas, sino tambien podna ayudar a distinguir el tipo y el origen de los tumores primarios, asf como las fases del progreso del tumor. En tercer lugar, la tecnologfa actual permite el uso de un citometro de flujo como base para la deteccion, lo que, en comparacion con los instrumentos de deteccion basados en el microscopio, ofrece un mayor rendimiento. Ademas, el citometro de flujo es capaz de clasificar celulas, p. ej., celulas tumorales, para el estudio adicional. Con
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posterioridad a la deteccion y cuantificacion de la expresion del ARNm, el aislamiento de las CTC u otras celulas puede ser ventajoso para la posterior confirmacion de la identidad o para analisis citologicos y moleculares adicionales. En cuarto lugar, la tecnologfa actual ha mejorado enormemente la sensibilidad de deteccion y la reproducibilidad, y es susceptible de deteccion y cuantificacion de una sola copia de genes. Ademas, la presente tecnologfa utiliza un patron, un conjunto generico de tecnologfa marcaje y deteccion de sondas (p. ej., el mismo conjunto de preamplificadores, amplificadores, y sondas marcadoras se puede utilizar para detectar multiples conjuntos diferentes de dianas de acido nucleico, requiriendo solo la smtesis de un nuevo conjunto de sondas de captura para cada nuevo conjunto de dianas de acido nucleico), y opcionalmente utiliza procedimientos normalizados para la fijacion y la permeabilizacion y para la hibridacion y el lavado de las celulas. Ademas, la tecnologfa puede incluir controles internos incorporados para la especificidad y la eficacia del ensayo.
La tecnologfa actual se puede utilizar no solo para la deteccion y enumeracion de CTC raras en muestras de sangre u otros fluidos corporales, sino tambien para cualquier tipo de eventos de identificacion y enumeracion de celulas raras. Las aplicaciones incluyen: deteccion de enfermedad minima residual en leucemia y linfoma; verificacion de la recurrencia despues del tratamiento de quimioterapia (Hess et al.); deteccion de otras celulas pre-cancerosas, tales como la deteccion de celulas del cuello uterino que contiene el VPH en los fluidos corporales; deteccion de acido nucleico viral o bacteriano en una celula infectada; deteccion de celulas fetales en la sangre materna; deteccion de lesiones micro-tumorales durante la etapa temprana del crecimiento del tumor; o deteccion de celulas tumorales residuales despues de la cirugfa para la gestion de margenes. En todos estos casos, es probable que la expresion genica espedfica de la celula diana este sepultada en el fondo de un gran numero de poblaciones de celulas heterogeneas. Como resultado, los analisis de expresion basados en micromatrices o RT-PCR, que requieren el aislamiento del ARNm a partir de una gran poblacion de celulas, tendran dificultades para detectar la presencia de aquellos eventos de celulas raras con precision o fiabilidad, mientras que la tecnologfa inventada se puede aplicar facilmente.
Tambien hay que senalar que aunque la deteccion y cuantificacion en una sola celula de multiples transcritos de ARNm se ilustra aqrn como la aplicacion principal, tal tecnologfa es igualmente aplicable a la deteccion de otros eventos de celulas raras que incluyen cambios en el ADN cromosomico o el contenido de acido nucleico celular. Los ejemplos incluyen la deteccion de la amplificacion del gen Her-2/neu, la deteccion de la delecion del gen Rb, la deteccion de mutaciones somaticas, la deteccion de translocacion cromosomica como en la leucemia mielogena cronica (BCR-ABL), o la deteccion de la insercion del VPH en el ADN cromosomico de celulas de cancer de cuello uterino.
Finalmente, se puede aplicar los aspectos del diseno, multiplexacion y amplificacion de sondas de la presente tecnologfa en el analisis de la expresion genica, multiplex cuantitativa y en la medicion de cambios en el ADN cromosomico a nivel de una sola celula en secciones solidas de tejido, tales como muestras de tejido fijadas con formalina, incluidas en parafina (FFPE).
La tecnologfa QMAGEX comprende un ensayo y un aparato asociado opcional para implementar el ensayo de forma automatizada. La Figura 1 ilustra los elementos principales del flujo de trabajo del ensayo QMAGEX, que, si se emplean amplificadores, incluyen:
Fijacion y permeabilizacion: Las celulas de la muestra se fijan y se vuelven permeables (permeabilizan) en suspension. La etapa de fijacion inmoviliza los acidos nucleicos (p. ej., ARNm o ADN cromosomico) y los entrecruza con la estructura celular. A continuacion, la membrana celular se permeabiliza de manera que las sondas de acido nucleico espedficas de la diana y las partfculas generadoras de senales, tales sondas de acido nucleico marcadas fluorescentemente, puedan entrar en la celula y unirse a la diana.
Desnaturalizacion: Si la diana de deteccion es ADN cromosomico de doble hebra, se anade una etapa de desnaturalizacion para convertir la diana de doble hebra en el ADN de hebra sencilla, listo para ser unido con las sondas espedficas de la diana.
Hibridacion con sondas de captura: Las sondas de captura espedficas de la diana seleccionadas cuidadosamente o los conjuntos de sondas hibridan con los acidos nucleicos diana. Las sondas de captura sirven para conectar las moleculas diana espedficamente a partfculas generadoras de senal. La tecnologfa permite que multiples genes diana de la celula sean reconocidos por diferentes conjuntos de sondas de forma simultanea y con un alto grado de especificidad.
Amplificacion de la senal: Las senales de las moleculas diana se amplifican mediante union de una molecula de armazon grande, un amplificador, a las sondas de captura o conjuntos sondas. Cada armazon tiene multiples ubicaciones para aceptar sondas marcadoras y partfculas generadores de senal. En un analisis multiplex, se utilizan multiples amplificadores distintos.
Marcaje: Las sondas marcadoras, a las cuales se anclan partfculas generadoras de senales (marcas), hibridan con el amplificador en esta etapa. En un analisis multiplex, se utilizan multiples sondas marcadoras distintas.
Lavado: El exceso de sondas o partfculas generadoras de senales que no estan unidas o que se unen de manera no espedfica a las celulas se eliminan a traves de una etapa de lavado, lo que reduce el ruido de fondo y mejora la
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razon de la senal de deteccion con respecto al ruido. Se pueden anadir etapas de lavado adicionales durante las etapas de hibridacion de la sonda de captura o de amplificacion de la senal potenciar adicionalmente el rendimiento del ensayo.
Deteccion: Las celulas en suspension marcadas se detectan utilizando clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS) o un citometro de flujo, o se inmovilizan sobre una superficie solida y se detectan utilizando un microscopio o un aparato basado en un escaner.
En la siguiente seccion, se describiran en detalle los elementos principales de la tecnologfa QMAGEX. En lo siguiente, el termino sonda marcada se refiere a una entidad que se une a la molecula diana, directamente o indirectamente, y permite que la diana sea detectada por un aparato de lectura. La sonda marcada, en general, comprende un acido nucleico o una molecula de acido nucleico modificado que se une a la diana, directamente o indirectamente, y una o mas "pardculas generadoras de senales" (es decir, una marca) que produce la senal reconocible por el aparato de lectura. En el modo indirecto, la sonda marcada, se puede unir a la molecula diana a traves de la union a una sonda de captura directamente o a traves de la union a un amplificador que a su vez esta unido a una sonda de captura. Las pardculas generadoras de senales ilustrativas (marcas) incluyen moleculas fluorescentes, nanopardculas, isotopos radioactivos, moleculas quimioluminiscentes (p. ej., digoxigenina, dinitrofenilo). Las moleculas fluorescentes incluyen, fluorescema (FITC), Cy3, Cy5, colorantes Alexa, ficoeritrina, etc. Las nanopardculas incluyen puntos cuanticos fluorescentes, pardculas difusoras, etc. El termino sonda de captura se refiere a un acido nucleico o un acido nucleico modificado que conecta la diana de un tipo espedfico de sonda marcada, directa o indirectamente. El termino "conjunto de sondas de captura" se refiere a multiples acidos nucleicos o acidos nucleicos modificados que conectan una diana con un tipo especificado de sonda marcada, directa o indirectamente, para aumentar la sensibilidad del ensayo. El termino amplificador se refiere a una o varias moleculas de armazon grande que se unen a una o mas sondas de captura o a un preamplificador en un lado y a multiples sondas marcadoras en otro lado.
Fijacion
En esta etapa, los acidos nucleicos se inmovilizan dentro de las celulas mediante entrecruzamiento dentro de la estructura celular. Existe una variedad de metodos bien conocidos para fijar celulas en suspension con un reactivo fijador y para bloquear las actividades ARNasa endogenas, que se pueden adaptar para su uso en la presente invencion. Los reactivos fijadores incluyen formalina (formaldelddo), paraformaldelddo, glutaraldelddo, etanol, metanol, etc. Una disolucion fijadora comun para las secciones de tejido incluye glutaraldelddo al 0,25% y paraformaldelddo al 4% en tampon de fosfato. Otra disolucion fijadora comun para secciones de tejido incluye etanol al 50%, formalina al 10% (que contiene formaldelddo al 37%), y acido acetico al 5%. Se someten a ensayo opcionalmente diferentes combinaciones de los reactivos fijadores a diversas concentraciones para encontrar la composicion optima para fijar las celulas en suspension, utilizando mecanismos bien conocidos en la tecnica. La duracion del tratamiento de fijacion tambien se puede optimizar. Se pueden incluir numerosos inliibidores de ARNasa diferentes en la disolucion fijadora, tales como RNAlater (Ambion), acido dtrico o LiCl, etc.
Permeabilizacion
La fijacion da como resultado el entrecruzamiento de los acidos nucleicos diana con protemas u otros componentes celulares dentro de las celulas, lo que puede dificultar o impedir la infiltracion de las sondas de captura en las celulas y enmascarar las moleculas diana para la ldbridacion. Los analisis de la invencion por lo tanto incluyen dpicamente una etapa de seguimiento de la permeabilizacion para permitir la ldbridacion dentro de la celula. Una tecnica consiste en la aplicacion de calor durante distintos periodos de tiempo para romper el entrecruzamiento. Esto se la demostrado para aumentar la accesibilidad del ARNm de las celulas para la ldbridacion. Tambien se pueden utilizar detergentes (p. ej., Triton X-100 o SDS) y proteinasa K para aumentar la permeabilidad de las celulas fijadas. El tratamiento con detergente, generalmente con Triton X-l0o o SDS, se utiliza con frecuencia para permeabilizar las membranas mediante la extraccion de los lfpidos. La proteinasa K es una proteasa no espedfica que es activa a lo largo de un intervalo de pH amplio y no se inactiva facilmente. Se utiliza para digerir las protemas que rodean el ARNm diana. Una vez mas, se pueden determinar experimentalmente las concentraciones y la duracion del tratamiento optimas como es bien conocido en la tecnica. Puede seguir una etapa de lavado de celulas, para eliminar los materiales disueltos producidos en la etapa de permeabilizacion.
Opcionalmente, antes de la fijacion y la permeabilizacion, las celulas en suspension se recogen y se tratan para inactivar la ARNasa y/o para reducir la autofluorescencia. Se la demostrado que el tratamiento con DEPC (p. ej., Braissant y Wadi (1988) "A simplified in situ liybridization protocol using non-radioactively labeled probes to detect abundant and rare mRNAs on tissue sections" Biodiemica 1:10-16) y RNAlater (Ambion, Inc.) es eficaz en la estabilizacion y proteccion de ARN celular. Tambien se la demostrado que el boroliidruro de sodio y un calor elevado conservan la integridad de ARN y reducen la autofluorescencia, facilitando la deteccion de los genes expresados en un bajo nivel (Capodieci et al. (2005) "Gene expression profiling in single cells witldn tissue" Nat Metliods 2(9):663-5). Se emplean opcionalmente otros metodos para reducir la autofluorescencia celular tales como el azul de tnpano (Mosiman et al. (1997) "Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in situ metliod" Cytometry 30(3):151-6) o una sonda oligonucleoddica extintora marcado individualmente (Nolan et al. (2003) "A simple quencldng metliod for fluorescence background reduction and its application to tlie direct, quantitative
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detection of specific mRNA" Anal Chem. 2003 75(22):6236-43).
Hibridacion con la sonda de captura
En esta etapa del ensayo, la sonda de captura o el conjunto de sondas de captura se unen a la molecula diana pretendida mediante hibridacion. Un indicador de la hibridacion satisfactoria con la diana es la especificidad, es decir, las sondas o conjuntos de sondas de captura deben conectar solo sustancialmente las sondas marcadoras con la molecula diana espedfica de interes, no con ninguna otra molecula. La seleccion y el diseno de la sonda son importantes para lograr una hibridacion espedfica.
Seleccion y diseno de la sonda
Los ensayos de la invencion emplean dos tipos de enfoques en el diseno de la sonda para conectar los acidos nucleicos diana de las celulas a las partfculas generadoras de senal: "marcaje directo" y "marcaje indirecto". En el enfoque de marcaje directo, la molecula diana hibrida con o captura una o mas sondas marcadoras (LP) directamente. Las LP contienen las partfculas de generadores de senal (SGP), como se muestra en la Figura 2. Es necesario utilizar una LP diferente para anclar SGP adicionales en diferentes posiciones sobre la molecula diana. Con el fin de garantizar la especificidad de la hibridacion, la sonda marcada se selecciona preferiblemente de manera rigurosa para asegurar que no presenta hibridacion cruzada con secuencias de acido nucleico no espedficas.
En el enfoque de marcaje indirecto, se emplea una sonda de captura (CP) adicional. En la Figura 3. se muestra un ejemplo. La molecula diana captura la sonda marcada a traves de la sonda de captura. En cada sonda de captura, hay al menos una seccion, T, complementaria a una seccion sobre la molecula diana, y otra seccion, L, complementaria a una seccion en la sonda marcada. Las secciones T y L estan conectadas por una seccion C. Para anclar mas SGP a diferentes posiciones en la misma molecula diana, se necesitan diferentes sondas de captura, pero la sonda marcada puede seguir siendo la misma. La secuencia de L se selecciona cuidadosamente para asegurar que no presenta hibridacion cruzada sustancialmente con ninguna de las secuencia de los acidos nucleicos de las celulas. En una realizacion adicional, la porcion L de la sonda de captura y la sonda marcada contiene nucleotidos modificados qmmicamente o no naturales que no hibridan con los nucleotidos naturales de las celulas. En otra realizacion, L y la sonda marcada (o una porcion de la misma) ni siquiera son secuencias de acido nucleico. Por ejemplo, L puede ser un anticuerpo de union de afinidad debil que reconoce la sonda generadora de senal, que en este caso es o incluye un antfgeno; L se puede conjugar covalentemente con un oligonucleotido que comprende la seccion T de la sonda de captura. Opcionalmente, para dos sondas de captura adyacentes, las secciones T hibridan con la diana y dos de los anticuerpo de union de baja afinidad se unen al antfgeno sobre la sonda marcada, al mismo tiempo, lo que da como resultado una union de fuerte afinidad del antfgeno. Las sondas de captura y marcadora son espedficas para un gen diana de interes. Se pueden unir multiples sondas de captura (conjunto de sondas) al mismo gen diana de interes con el fin de anclar mas partfculas generadoras de senal para una mayor sensibilidad de deteccion. En esta situacion, el conjunto de sondas para el mismo gen diana puede compartir la misma sonda marcada.
Aunque ambos enfoques se pueden utilizar en la tecnologfa actual, se prefiere el enfoque de captura indirecta, ya que permite que la sonda marcada sea localizada independientemente y una descripcion adicional demostrara que puede ofrecer mejor especificidad y sensibilidad.
En un ejemplo de captura indirecta adicional mostrado en la Figura 4, dos sondas de captura adyacentes se incorporan a un conjunto de sondas dirigidas a un gen de interes. Ti y T2 se disenan para que sean complementarios a dos secciones unicas y adyacentes sobre el acido nucleico diana. Li y L2, que puede ser diferentes o iguales, son complementarios a dos secciones adyacentes sobre la sonda marcada. Sus secciones de union, T, L o ambas, se disenan de manera que la conexion entre la sonda marcada y el diana sea inestable y tienda a caer a la temperatura de hibridacion cuando solo una de las sondas de captura esta en su lugar. Tal diseno debena permitir una especificidad excepcional debido a que la sonda marcada generadora de senal solo se puede anclar al gen diana de interes cuando dos sondas de captura independientes reconocen ambas la diana y se unen a las secuencias adyacentes o muy cerca del gen diana. En una realizacion adicional, la temperatura de fusion, Tm, de las secciones T de las dos sondas de captura se disena para que se encuentre significativamente por encima de la temperatura de hibridacion mientras que la Tm de las secciones L es inferior a la temperatura de hibridacion. Como resultado, las secciones T se unen a la molecula diana fuertemente y de forma estable durante la hibridacion, mientras que las secciones L se unen a la sonda marcada debilmente y de forma inestable si solo una de las sondas de captura esta presente. Sin embargo, si las dos sondas de captura estan presentes, la combinacion de Li y L2 retiene la sonda marcada fuertemente y de forma estable durante la hibridacion. En otra realizacion, la Tm de las secciones T esta por debajo de la temperatura de hibridacion mientras que Tm de las secciones L esta sustancialmente por encima. De la misma manera, la conexion entre la sonda marcada y la diana solo puede sobrevivir a la hibridacion cuando ambas sondas de captura hibridan con la diana de manera cooperativa.
Alternativamente, se utilizan tres o mas de las sondas de captura proximas, espedficas del acido nucleico diana para la captura estable de una sonda marcada dentro de las celulas (Figura 5). El diseno basico de las sondas es el mismo que se ha comentado anteriormente, pero la captura de una sonda generadora de senal debe tener incluso
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mayor especificidad que cuando se utilizan dos sondas proximas puesto que ahora tres sondas independientes tienen que unirse a la misma molecula diana de interes en posiciones proximas vecinas con el fin de generar la senal.
Multiplexacion
Para llevar a cabo la deteccion multiplexada para mas de un gen diana, p. ej., como se muestra en la Figura 6, cada gen diana tiene que ser unido espedficamente por diferentes sondas de captura y marcadoras. Ademas, la partroula generadora de senal (la marca) anclada a la sonda marcada debe proporcionar senales claramente diferentes para cada diana que pueden ser lefdas por el aparato de deteccion. En el mecanismo de marcaje directo (p. ej., Figura 6 panel A), las sondas marcadoras adecuadas con minima hibridacion cruzada pueden ser mas diffciles de encontrar puesto que cada sonda marcada tiene que ser susceptible de unirse a la diana fuertemente pero no de presentar hibridacion cruzada con cualquier otra molecula de acido nucleico en el sistema. Para que este enfoque proporcione resultados optimos, la porcion de union a la diana de la sonda marcada se debe disenar oportunamente de modo que no presente hibridacion cruzada con secuencias no espedficas. En el enfoque de marcaje indirecto (p. ej., Figura 6 Panel B), debido al enfoque de diseno de la sonda de captura multiple unico, incluso cuando una sonda de captura se une a una diana no espedfica, esto no dara como resultado la union de la sonda marcada a la diana no espedfica. La especificidad del ensayo se puede mejorar en gran medida. De este modo, el diseno de la sonda de captura ilustrado en la Figura 4 y la Figura 5 se prefiere tfpicamente en algunas aplicaciones de ensayo multiplex. En una clase de realizaciones, las partfculas generadoras de senal ancladas a los diferentes genes diana son diferentes moleculas fluorescentes con espectros distintivos de emision.
La capacidad de la presente tecnologfa para medir mas de un parametro simultaneamente puede permitir la deteccion de celulas raras en una gran poblacion heterogenea de celulas. Como se ha indicado anteriormente, se estima que la concentracion de CTC esta en el intervalo de una celula tumoral entre cada 106-107 celulas sangurneas normales. En los inmunoensayos basados en FACS existentes, por otra parte, la agregacion de colorante al azar en las celulas puede producir un recuento de celulas falso positivo en cada diez mil celulas. Por lo tanto no se puede utilizar tal ensayo para la deteccion de CTC debido a las inaceptablemente altas tasas de falsos positivos. Este problema se puede resolver elegantemente utilizando la tecnologfa actual. Espedficamente, se utiliza la expresion de mas de un gen tumoral como diana para la deteccion multiplex. Solamente las celulas que expresan todos los genes diana se recuentan como celulas tumorales. De esta manera, la tasa de falsos positivos de la deteccion de la CTC se puede reducir drasticamente. Por ejemplo, ya que la agregacion de colorante en las celulas es un evento aleatorio, si la tasa de falsos positivos de deteccion de un solo color es 10"4, la tasa de falsos positivos para la deteccion de dos colores o de tres colores puede ser tan baja como 10"8 o 10"12, respectivamente. En situaciones en la que se conocen los niveles relativos de expresion de los genes diana, estos niveles relativos pueden medirse utilizando los metodos de deteccion multiplex descritos en la presente memoria y se puede utilizar la informacion para reducir la tasa de falsos positivos de la deteccion.
En otro ejemplo, como se ilustra esquematicamente en la Figura 7 Panel A, mas de una partroula generadora de senal esta conectada al mismo acido nucleico diana. Estas partroulas generan senales diferentes en el aparato de deteccion. Las intensidades relativas de estas senales se pueden determinar previamente planificando el numero de cada tipo de partroulas anclado a la diana. El numero de partroulas generadoras de senal sobre una diana se puede controlar en el diseno de la sonda cambiando el numero de conjuntos de sondas o empleando diferentes metodos de amplificacion de la senal, p. ej., como se describe en la siguiente seccion. Las celulas raras se identifican solo cuando las intensidades de senal relativas de estas partroulas medida por el aparato de deteccion son iguales a los valores predeterminados. Este ejemplo es util cuando no hay suficientes marcadores adecuados o cuando sus niveles de expresion son desconocidos en un tipo concreto de celulas raras. Alternativamente, como se muestra en la Figura 7 Panel B, el mismo conjunto de partroulas generadoras de senal se ancla a mas de una diana. Las intensidades de la senal relativas del conjunto de partroulas se controlan para que sean iguales en todas las dianas seleccionadas. Este ejemplo es util en situaciones en las que la celula rara es identificada cuando cualquiera de las moleculas diana se encuentra presente. En otro ejemplo mas, representado en la Figura 7 Panel C, cada molecula diana tiene un conjunto de partroulas generadoras de senal anclado a la misma, pero los conjuntos de partroulas son claramente diferentes de diana a diana.
La deteccion de multiples especies de acidos nucleicos diana de interes se puede aplicar a la medicion cuantitativa de una diana. Debido a las diferentes muestras y condiciones experimentales, la abundancia de una molecula diana concreta en una celula normalmente no se puede determinar con precision mediante la deteccion del nivel de senal asociado con la diana. Sin embargo, la medicion mas precisa se puede lograr mediante la normalizacion de la senal de un gen de interes a la de un gen de referencia/constitutivo. Un gen de referencia/constitutivo se define como un gen que generalmente siempre esta presente o se expresa en las celulas. La expresion del gen de referencia/constitutivo es en general constitutiva y tiende a no cambiar bajo diferentes condiciones biologicas. 18S, 28S, GAPD, ACTB, PPIB etc. han sido considerados generalmente como genes de referencia o constitutivos, y se han utilizado en la normalizacion de los datos de expresion genica generados a partir de diferentes muestras y/o bajo diferentes condiciones de ensayo.
Alternativamente, se puede disenar un conjunto de sondas marcadoras especiales que no se une a ninguna sonda de captura o diana espedficamente. La senal asociada con esta sonda marcada se puede utilizar para establecer el
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fondo de la senal de hibridacion en las celulas individuales. De este modo, se puede determinar cuantitativamente la abundancia de una molecula diana concreta restando primero la senal de hibridacion de fondo, normalizando despues frente a la senal de hibridacion del gen de referencia/constitutivo restado del fondo.
Alternativamente, se pueden detectar simultaneamente en las celulas dos o mas secuencias de ADN cromosomico de interes. En la deteccion de multiples secuencias de ADN en las celulas, las sondas marcadoras para las secuencias de ADN son diferentes entre sf y no presentan hibridacion cruzada entre sn En realizaciones en las que se emplea la captura indirecta cooperativa, a causa del esquema de diseno, incluso cuando una sonda se une a una secuencia de ADN no espedfica, no dara lugar a la captura de la sonda generadora de senal por las secuencias de ADN no espedficas.
Alternativamente, la deteccion de multiples secuencias de ADN cromosomicas diana de interes permite el analisis cuantitativo de la amplificacion del gen, la delecion del gen, o la translocacion de genes en celulas individuales. Esto se logra mediante la normalizacion de la senal de un gen de interes a la de un gen de referencia. La razon de la senal del gen de interes con respecto al gen de referencia para una celula concreta de interes se compara con la razon en las celulas de referencia. Un gen de referencia se define como un gen que mantiene de forma estable su numero de copias en el ADN genomico. Un celula de referencia se define como una celula que contiene el numero de copias normal del gen de interes y el gen de referencia. Si la razon de la senal es mayor en las celulas de interes en comparacion con las celulas de referencia, se detecta la amplificacion del gen. Si la relacion es menor en las celulas de interes en comparacion con las celulas de referencia, en ese caso se detecta la delecion del gen.
Amplificacion de la senal y marcaje
El enfoque de marcaje directo representado en Figura 2 y la Figura 6 Panel A ofrece solamente una sensibilidad limitada debido a que solo un numero relativamente pequeno de partfculas generadoras de senal (marcas) se puede unir a cada sonda marcada. Una forma de aumentar la sensibilidad es utilizar ARN transcrito in vitro que incorpora partfculas generadoras de senal, pero como resultado la especificidad se resentira.
El enfoque de "marcaje indirecto" no solo puede mejorar la especificidad como se ha descrito anteriormente, sino que tambien se puede utilizar para mejorar la sensibilidad de deteccion. En este enfoque, la sonda marcada se hibrida o se conectado con una molecula amplificadora, lo que proporciona muchas mas localizaciones de union para las sondas marcadoras. La estructura y el metodo de anclaje del amplificador pueden adoptar muchas formas. La Figura 8 Paneles A-D muestra varios esquemas de amplificacion como ejemplos ilustrativos. En el Panel A, multiples sondas marcadoras marcadas individualmente se unen al amplificador. En el Panel B, multiples sondas marcadoras marcadas multiplemente se unen al amplificador. En el Panel C, multiples sondas marcadoras marcadas individualmente se unen al amplificador, y multiples copias del amplificador se unen a un preamplificador. Concretamente, el amplificador es una o multiples moleculas de ADN ramificadas (Panel D). La secuencia de la sonda marcada se selecciona preferiblemente con cuidado para que no hibriden de forma cruzada sustancialmente con ningun acidos nucleicos endogenos en la celula. De hecho, la sonda marcada no tiene que ser una molecula de polinucleotido natural. La modificacion qrnmica de la molecula, por ejemplo, y la inclusion de nucleotidos no naturales, puede garantizar que la sonda marcada hibride solo con el amplificador y no con las moleculas de acido nucleico de origen natural de las celulas. En los ensayos multiplex, se disenaran distintos amplificadores y sondas marcadoras y se utilizaran para las diferentes dianas.
Espedficamente, como se ilustra esquematicamente en la Figura 9, una molecula de polinucleotido circular es capturada por el conjunto de sondas de captura. A lo largo del drculo, puede haber una secuencia o mas de una repeticion de la misma secuencia que se une a la sonda marcada (Figura 9 Panel A). En la etapa de amplificacion de la senal del ensayo, se lleva a cabo un procedimiento de amplificacion por drculo rodador (Larsson et al, 2004). Como resultado de este procedimiento, se produce una molecula de polinucleotido de cadena larga anclada a las sondas de captura (Figura 9 Panel B). Existen muchas secuencias repetitivas a lo largo de la cadena, sobre la cual se pueden anclar las sondas marcadoras mediante hibridacion (Figura 9 Panel C). En los ensayos multiplex, se disenaran y se utilizaran distintas sondas de captura, drculos rodadores, y sondas marcadoras.
Como se describe en la presente memoria, una porcion de la sonda generadora de senal puede ser amplificada por PCR. Alternativamente, cada porcion de las multiples sondas generadoras de senal se puede amplificar mediante PCR simultaneamente.
Aunque se ha utilizado un enfoque de captura espedfico (marcaje indirecto con pares de sondas de captura) para ilustrar los esquemas de marcaje y amplificacion en las Figuras 8 y 9, es importante tener en cuenta que se puede utilizar cualquier otro enfoque de captura de la sonda, directo o indirecto, descrito en las secciones anteriores combinado con los esquemas de marcaje y amplificacion descritos en estas secciones. La sonda de captura, los metodos de marcaje, y las configuraciones del amplificador descritos anteriormente son independientes entre sf y se pueden utilizados en cualquier combinacion en un diseno de ensayo concreto.
Condiciones de hibridacion
La composicion de la solucion de hibridacion puede afectar a la eficiencia del procedimiento de hibridacion. La hibridacion depende tfpicamente de la capacidad del oligonucleotido para recocerse con una hebra de ARNm
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complementaria por debajo de su punto de fusion (Tm). El valor de Tm es la temperatura a la cual la mitad del duplex de oligonucleotido esta presente en forma de hebra sencilla. Los factores que influyen en la hibridacion de las sondas de oligonucleotidos con los acidos nucleicos diana pueden incluir la temperatura, el pH, la concentracion de cation monovalente, la presencia de disolventes organicos, etc. Una solucion de hibridacion tfpica puede contener algunos o todos los siguientes reactivos, p. ej., sulfato de dextrano, formamida, DTT (ditiotreitol), SSC (NaCl mas citrato de sodio), EDTA, etc. Tambien pueden anadirse otros componentes para disminuir la posibilidad de union no espedfica de las sondas de oligonucleotidos, incluyendo, p. ej., ADN de hebra sencilla, ARNt que actua como un aRn transportador, poliA, solucion de Denhardt, etc. Las condiciones de hibridacion ilustrativas se pueden encontrar en la tecnica y/o determinar empmcamente como es bien conocido en la tecnica. Veanse, p. ej., la Publicacion de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Num. 2002/0172950, Player et al. (2001) J. Histochem. Cytochem. 49:603-611, and Kenny et al. (2002) J. Histochem. Cytochem. 50:1219-1227, que tambien describen la fijacion, permeabilizacion, y lavado.
Opcionalmente se lleva a cabo una prehibridacion opcional para reducir la tincion del fondo. La prehibridacion implica incubar el tejido fijado o las celulas con una solucion que se compone de todos los elementos de la solucion de hibridacion, menos la sonda.
Lavado
Despues de la etapa de marcaje, las celulas se lavan preferiblemente para eliminar las sondas no unidas o las sondas que se han unido ligeramente a secuencias emparejadas imperfectamente. El lavado se inicia generalmente con un tampon de lavado de bajo rigor tal como 2 X SSC + EDTA 1 mM (1 X SSC es NaCl 0,15 M, citrato de Na 0,015 M), seguido a continuacion de lavado con tampon de lavado de mas alto rigor tal como 0,2 X SSC + EDTA 1 mM o 0,1 X SSC + EDTA 1 mM.
El lavado es importante para reducir el ruido de fondo, mejorar la razon de senal a ruido y la cuantificacion con el ensayo. Los procedimientos de lavado establecidos se pueden encontrar, p. ej., en Bauman y Bentvelzen (1988) "Flow cytometric detection of ribosomal RNA in suspended cells by fluorescent in situ hybridization" Cytometry 9(6):517-24 y Yu et al. (1992) "Sensitive detection of RNAs in single cells by flow cytometry" Nucleic Acids Res. 20(1):83-8.
El lavado se puede llevar a cabo mediante la ejecucion de un numero adecuado de ciclos de lavado, es decir, uno o mas. Cada ciclo en general incluye las siguientes etapas: mezclar las celulas con una solucion tampon adecuada, desprender los materiales unidos no espedficamente de las celulas, y eliminar el tampon junto con los residuos. Cada etapa se describe con mas detalle a continuacion.
Mezclar las celulas con tampon de lavado: En algunos ensayos, las celulas se inmovilizan sobre la superficie de un sustrato antes de ser lavadas. En tales casos, el tampon de lavado se mezcla junto con la superficie del sustrato. Como se describe en la presente memoria, las celulas que se van a lavar flotan libremente. El tampon de lavado se anade a los sedimentos celulares o a la solucion en la cual estan flotando las celulas.
Desprender los materiales unidos no espedficamente de las celulas: Se pueden emplear cualquiera de varias tecnicas empleadas aqu para reducir la union no espedfica despues del tratamiento de permeabilidad celular y la hibridacion de la sonda para fomentar que las sondas unidas no espedficamente se desprendan de las celulas y se disuelvan en el tampon de lavado. Estas incluyen el aumento de la temperatura justo por debajo de la temperatura de fusion de las sondas unidas espedficamente y emplear agitacion utilizando un agitador magnetico o mecanico o la perturbacion con ondas sonicas o ultrasonicas. La agitacion de la mezcla tambien se puede lograr, sacudiendo el recipiente con un movimiento de balanceo o vortice.
Retirar el tampon junto con los residuos: Se puede emplear cualquier metodo conveniente para separar y eliminar el tampon de lavado y el residuo de las celulas diana de la muestra. Por ejemplo, las celulas o los sustratos flotantes a los que estan unidas las celulas se separan del tampon y el residuo a traves de centrifugacion. Despues de la centrifugacion, las celulas o sustratos forman un sedimento en el fondo del recipiente. El tampon y el residuo se decantan desde la parte superior.
Como ejemplo adicional, la mezcla se transfiere opcionalmente a (o se forma en) un recipiente cuyo fondo esta formado por una membrana porosa. El tamano de poro de la membrana se selecciona para que sea mas pequeno que las celulas diana o los sustratos a los que estan unidas las celulas pero lo suficientemente grande para permitir que la suciedad y otros materiales residuales pasen a traves. Para eliminar los residuos, el aire o la presion del lfquido se ajustan opcionalmente de tal manera que la presion sea mayor en el interior del recipiente que en el exterior, dirigiendo de este modo el tampon y el residuo fuera del recipiente mientras que la membrana retiene las celulas diana en el interior. El residuo tambien se puede eliminar, p. ej., filtrando el tampon y el residuo a traves de la membrana impulsado por la fuerza de gravedad o por la fuerza centnfuga.
Como otro ejemplo adicional, las celulas se pueden inmovilizar en la superficie de un sustrato grande, p. ej., un porta o el fondo de un recipiente, a traves de la fijacion de celulas o la union de afinidad utilizando protemas de superficie. El tampon y el residuos se pueden eliminar directamente, o bien utilizando un vado para la decantacion desde la parte superior o bien volteando el recipiente boca abajo. Como otro ejemplo adicional, las celulas se inmovilizan
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opcionalmente sobre cuentas magneticas, p. ej., o mediante fijacion qmmica o mediante union de afinidad a protemas de la superficie. Las cuentas se pueden inmovilizar a continuacion en el recipiente anclando un campo magnetico al recipiente. Despues se pueden eliminar el tampon y el residuo directamente sin la perdida de las celulas de la misma manera que se ha descrito en el ejemplo anterior. Como otro ejemplo adicional, se induce la migracion de las sondas unidas no espedficamente en el interior de las celulas fuera de las celulas por medio de metodos electroforeticos, mientras que las sondas unidas espedficamente permanecen.
Como se ha establecido anteriormente, un ciclo de lavado se completa llevando a cabo una de las tres etapas anteriores, y el procedimiento de lavado se completa ejecutando uno o mas (p. ej., varios) de tales ciclos de lavado. Se pueden utilizar diferentes tampones de lavado, tecnicas de desprendimiento o eliminacion de residuos en los diferentes ciclos de lavado.
Deteccion
En el presente tecnologfa, las celulas diana que tienen partfculas generadoras de senal (marcas) que hibridan espedficamente con dianas de acido nucleico en ellas se pueden identificar entre una gran poblacion heterogenea despues de que se eliminen mediante lavado las sondas unidas no espedficamente y otros residuos. Esencialmente, se puede emplear cualquier metodo conveniente para la deteccion y la identificacion.
Espedficamente, las celulas en suspension se inmovilizan sobre un sustrato solido despues de la etapa de marcaje o de lavado descrita anteriormente. La deteccion se puede lograr utilizando aparatos basados en microscopio. Espedficamente, en los casos en los que la senal generada por las sondas es luz quimioluminiscente, se puede utilizar un microscopio de formacion de imagenes con una camara CCD o un microscopio de barrido para convertir la senal luminosa en informacion digital. En los casos en que la sonda lleva una marca que emite una senal fluorescente, se puede utilizar para la deteccion un aparato basado en un microscopio de formacion de imagenes fluorescentes o de barrido. Ademas, puesto que las celulas diana son, en general, raras entre una gran poblacion de celulas, se pueden utilizar algoritmos de busqueda automatica de eventos para identificar y contar automaticamente el numero de celulas diana en la poblacion. Las celulas en suspension se pueden inmovilizar sobre superficies solidas mediante cualquiera de varias tecnicas. Espedficamente, se utiliza un recipiente con una gran superficie inferior plana para mantener la disolucion con las celulas en suspension. El recipiente se centrifuga a continuacion para obligar a las celulas flotantes a depositarse en el fondo. Si la superficie es suficientemente grande en comparacion con la concentracion de celulas en la disolucion, no es probable que las celulas se superpongan en la superficie del fondo. En la mayona de los casos, incluso si las celulas se superponen, las celulas diana no lo haran ya que son relativamente raras en una poblacion grande. Alternativamente, las celulas suspendidas se someten a citocentrifugacion sobre una superficie plana. Despues de la eliminacion de los fluidos, las celulas se inmovilizan sobre la superficie por la tension superficial.
Preferiblemente, las celulas estan flotando (en suspension) o se inmovilizan sobre sustratos flotantes, tales como cuentas, de manera que los procedimientos de predeteccion, tales como la hibridacion y el lavado, se pueden llevar a cabo eficazmente en disolucion. Existen varios metodos para detectar celulas diana raras entre una gran poblacion de celulas flotante. El metodo preferido consiste en utilizar un sistema de deteccion basado en el concepto de citometna de flujo, donde las celulas o los sustratos flotantes son hidrodinamicos y pasan por delante de la optica de excitacion y deteccion de uno por uno. Las celulas diana se identifican a traves de la senal optica emitida por las sondas unidas espedficamente a las dianas de acido nucleico en las celulas. La senal optica puede ser, p. ej., luz luminiscente o fluorescente de una longitud de onda espedfica.
Ventajas
En resumen, la presente tecnologfa QMAGEX tiene varios elementos unicos que permiten la deteccion de acido nucleico multiplex en las celulas individuales y la deteccion de celulas diana. Estos elementos incluyen los siguientes.
Las moleculas de acido nucleico inmovilizadas en el interior de las celulas se utilizan como marcadores para la identificacion de CTC (u otros tipos de celulas). En comparacion con los marcadores basados en protemas, los acidos nucleicos son mas estables, estan ampliamente disponibles, y proporcionan una mejor razon de senal a ruido en la deteccion. Ademas, la tecnica de deteccion se puede aplicar facilmente a una amplia gama de tumores o incluso otras aplicaciones relacionadas con la identificacion o clasificacion de celulas. Como otra ventaja, las moleculas de acido nucleico se miden de manera cuantificable a nivel de celulas individuales, en lugar de en una poblacion de celulas mixtas. Esta caractenstica asegura que la celula, como unidad funcional clave en el sistema biologico, es conservada para el estudio. En muchas aplicaciones que implican una poblacion mixta de celulas, esta caractenstica puede ser muy util en la extraccion de informacion util, real del ensayo. (Por ejemplo, se puede identificar una CTC basandose en la deteccion de la presencia o el nivel o niveles de expresion de un conjunto de marcadores de acido nucleico en la celula; la presencia o numero de copias de acidos nucleicos adicionales en la celula puede proporcionar a continuacion informacion adicional util en el diagnostico, la prediccion de resultados, o similares).
Las celulas permanecen opcionalmente en suspension o en sedimentos que se pueden volver a suspender en todas
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las etapas del ensayo antes de la deteccion final. Esta caractenstica mejora significativamente la cinetica de ensayo, simplifica el procedimiento, mejora la reproducibilidad, y mantiene la celula en su correspondiente estado mas funcional. Por otro lado, los aspectos significativos de la invencion, incluyendo la seleccion y el diseno de la sonda, la multiplexacion, la amplificacion y el marcaje, se pueden aplicar directamente a la tecnica de hibridacion in situ para la deteccion y enumeracion de celulas raras en muestras de tejido.
Se emplea opcionalmente un enfoque de diseno unico de sonda de captura indirecta para lograr una especificidad de hibridacion con la diana excepcional, que da como resultado una mejor razon de senal a ruido en la deteccion.
Los ensayos permiten la deteccion de multiples genes diana o multiples parametros en el mismo gen simultaneamente. Esta caractenstica beneficia a la deteccion de celulas raras, tales como CTC de varias maneras. En primer lugar, puede reducir la tasa de falsos positivos, que es esencial en el diagnostico del cancer. En segundo lugar, puede proporcionar informacion adicional, clmicamente importante relacionada con la celula tumoral detectada, que puede incluir la fase de progreso y/o el tipo original y la fuente del tumor primario.
La tecnologfa de la invencion incorpora un esquema de amplificacion de la senal, lo que aumenta la sensibilidad de deteccion y permite la deteccion de celulas raras entre un gran numero de celulas normales con alta confianza.
La deteccion se puede implementar en aparatos basados en FACS o citometro de flujo o en plataformas basadas en microscopio. Los primeros pueden ser totalmente automaticos y proporcionan una deteccion rapida y la ventaja adicional de la clasificacion de las celulas identificadas para su posterior estudio, si se desea. Esta ultima plataforma se encuentra mas ampliamente disponible y tiene la ventaja de permitir la identificacion manual final a traves de la morfologfa.
Sistemas
En la presente memoria se describen sistemas y aparatos configurados para llevar a cabo los procedimientos de los nuevos ensayos. El aparato o sistema comprende uno o mas (y preferiblemente todos) de al menos los siguientes elementos.
Manipulacion de fluidos: El aparato incluye opcionalmente un subsistema que puede anadir reactivos, y si el ensayo lo requiere, decantar los fluidos desde el recipiente de muestra (p. ej., un recipiente extrafble o fijo, desechable o reutilizable, por ejemplo un tubo de muestra, una placa de multiples pocillos, o similares). El subsistema se puede basar en un sistema de transferencia de fluido de tipo pipeta donde los diferentes fluidos son manipulados por un cabezal de la bomba con puntas desechables. Como ejemplo alternativo, cada reactivo puede tener su propio canal de fluido dedicado.
Mezcla y agitacion: El aparato incluye opcionalmente un dispositivo para mezclar los diferentes reactivos en la disolucion de muestra y promover que cualquier material unido no espedficamente se separe de las celulas. El dispositivo puede tener un mecanismo para introducir un movimiento de vortice o balanceo en el contendedor del recipiente de la muestra o acoplar sonido o ultrasonido al recipiente. Alternativamente, se puede colocar un agitador magnetico en el recipiente de la muestra y se puede impulsar por una campo magnetico giratorio producido por un elemento instalado en el contenedor del recipiente.
Control de la temperatura: La temperatura de la muestra se puede controlar a un nivel por encima de la temperatura ambiente mediante la instalacion de un calentador y una sonda de temperatura en la camara que contiene el recipiente de la muestra. Se puede utilizar un dispositivo Peltier para controlar la temperatura a un nivel por encima o por debajo de la ambiente. El control de temperatura es importante, p. ej., para el rendimiento de los procedimientos de hibridacion y lavado en los ensayos.
Separacion de las celulas y del fluido residual: El aparato incluye opcionalmente un dispositivo que puede eliminar el fluido residual de la mezcla de la muestra al tiempo que conserva las celulas para su analisis adicional. El dispositivo puede comprender un recipiente de la muestra que tiene una membrana porosa como parte inferior. El tamano de poro de la membrana es mas pequeno que las celulas pero mas grande que el material residual de la solucion mixta. El espacio entre la membrana se puede sellar y conectado a una bomba de vado. Como ejemplo alternativo, el espacio por encima de la membrana se puede sellar y conectar a una fuente de presion positiva. Alternativamente, el dispositivo puede comprender una centrifugadora. El recipiente con la parte inferior de membrana se carga en la centrifugadora, que centrifuga para forzar la filtracion de la disolucion de residuos a traves de la membrana. En otra configuracion de este dispositivo, el recipiente de la muestra tiene un fondo solido. Las celulas se depositan en el fondo despues de la centrifugacion, y la disolucion residual se decanta desde la parte superior mediante el subsistema de manipulacion de fluidos descrito anteriormente.
Este dispositivo tambien puede realizar una funcion que prepara la muestra para la lectura final. Si la lectura es por medio de microscopfa, las celulas se depositan tfpicamente y se unen a una superficie plana. Una centnfuga en el dispositivo puede lograr esto si la parte inferior del recipiente es plano. En otro enfoque, una placa plana puede girar dentro de su plano, y el sistema puede emplear el dispositivo de manipulacion de fluido para hacer caer la disolucion que contiene las celulas en el centro del giro. Las celulas se haran girar de manera uniforme sobre la superficie de la placa.
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Deteccion: El elemento de deteccion del aparato de la invencion se puede integrar con el resto del sistema, o alternativamente se puede separada del resto de los subsistemas descritos anteriormente. En una realizacion, el dispositivo de lectura se basa en un microscopio, que puede ser un microscopio de formacion de imagenes o de barrido. Alternativamente, el dispositivo se basa en un microscopio de formacion de imagenes fluorescentes o de barrido con multiples longitudes de onda de excitacion y de lectura para diferentes sondas. Preferiblemente, el dispositivo de lectura se basa en la citometna de flujo. Se prefiere el enfoque de la citometna porque puede leer directamente las celulas flotantes del fluido a multiples longitudes de onda, mejorando asf en gran medida la eficacia del ensayo.
Todos los elementos anteriores se pueden integrar en un aparato. Alternativamente, estos elementos se pueden incluir una serie de aparatos, que funcionan juntos como un sistema para realizar el ensayo. La Figura 10 ilustra una realizacion ilustrativa concreta de la configuracion del aparato. En esta configuracion concreta, la muestra se mantiene en un recipiente (tubo de ensayo de la muestra) con un fondo de membrana. Los reactivos se anaden desde la parte superior del tubo utilizando una bomba a traves de una valvula multipuerto. Los residuos se retiran de la parte inferior mediante vado. El contenedor para el recipiente de la muestra se fija sobre una mesa de agitacion y se controla la temperatura del espacio alrededor de la muestra (zona temperatura controlada) por medio de un controlador de temperatura. El elemento de manipulacion de fluidos puede introducir reactivos (reactivos de fijacion y permeabilizacion, tampon de hibridacion, conjuntos de sondas, y tampon de lavado) en el tubo de la muestra, eliminar los residuos del recipiente de residuos, e introducir celulas en un citometro de flujo para su deteccion.
En la presente memoria se describe un sistema que comprende un contenedor configurado para aceptar un recipiente de muestra; un controlador de temperatura configurado para mantener el recipiente de la muestra a una temperatura seleccionada (p. ej., una temperatura seleccionada por un usuario del sistema o una temperatura prefijada, opcionalmente se seleccionan temperaturas diferentes para diferentes etapas en un procedimiento de ensayo); un elemento de manipulacion de fluidos conectado de forma fluida con el recipiente de la muestra y configurado para anadir fluido y/o extraer fluido del recipiente de la muestra; un elemento mezclador configurado para mezclar (p. ej., remover o agitar) el contenido del recipiente de la muestra; y un detector para detectar una o mas senales del interior de las celulas individuales, en donde el detector esta conectado opcionalmente de manera fluida con el recipiente de la muestra. Uno o mas reservorios de fluido (p. ej., para los reactivos de fijacion o permeabilizacion, el tampon de lavado, los conjuntos de sondas, y/o los residuos) estan conectados opcionalmente de manera fluida al recipiente de la muestra.
Un sistema puede incluir un ordenador. El ordenador puede incluir un soporte logico apropiado para recibir las instrucciones para el usuario, ya sea en forma de entrada del usuario en un conjunto de campos de parametros, p. ej., en una IGU, o ya sea en forma de instrucciones preprogramadas, p. ej., preprogramadas para una variedad de diferentes operaciones espedficas. El soporte logico convierte opcionalmente estas instrucciones a un lenguaje apropiado para controlar el funcionamiento de los componentes del sistema (p. ej., para controlar un elemento de manipulacion de fluidos y/o laser). El ordenador puede recibir tambien datos de otros componentes del sistema, p. ej., desde un detector, y puede interpretar los datos, proporcionarlos a un usuario en un formato legible por seres humanos, o utilizar esos datos para iniciar operaciones adicionales, de acuerdo con cualquier programacion por el usuario.
Dianas de acido nucleico
Como se ha indicado, una diana de acido nucleico puede ser esencialmente cualquier acido nucleico que se detecta deseablemente en una celula. La eleccion de las dianas dependera obviamente de la aplicacion deseada, p. ej., el analisis de la expresion, el diagnostico de la enfermedad, la estadificacion, o el pronostico, la identificacion o validacion de la diana, el analisis de la ruta, el escrutinio de un farmaco, los estudios de eficacia de farmacos, o cualquiera de muchas otras aplicaciones. En la tecnica se ha descrito un gran numero de dianas adecuadas, y muchas mas se pueden identificar utilizando mecanismos convencionales.
Para la deteccion de CTC, a modo solo de un ejemplo, se conoce una variedad de dianas de acido nucleico adecuadas. Por ejemplo, un panel multiplex de marcadores para la deteccion de CTC podna incluir uno o mas de los siguientes marcadores: espedfico de celulas epiteliales (p. ej., CK19, Muc1, EpCAM), espedfico de celulas de la sangre como seleccion negativa (p. ej.,CD45), espedfico del origen tumoral (p. ej., PSA, PSMA, HPN para el cancer de prostata y mam, mamb, her-2 para el cancer de mama), espedfico del potencial de proliferacion (p. ej., Ki-67, CEA, CA15-3), marcadores de apoptosis (p. ej., BCL-2, BCL-XL), y otros marcadores para cambios metastasicos geneticos y epigeneticos. Como ejemplo adicional, las dianas pueden incluir ARNm de HOXB13 y IL17BR, cuya proporcion en el tumor primario se ha demostrado que pronostica el resultado clmico de pacientes con cancer de mama tratadas con tamoxifeno (Ma et al. (2004) "A two-gene expression ratio predicts clinical outcome in breast cancer patients treated with tamoxifen" Cancer Cell 5(6):607-16 y Goetz et al. (2006) "A Two-Gene Expression Ratio of Homeobox 13 and Interleukin-17B Receptor for Prediction of Recurrence and Survival in Women Receiving Adjuvant Tamoxifen" Clin Cancer Res 12:2080-2087). Veanse tambien, p. ej., Gewanter, R. M., A. E. Katz, et al. (2003) "RT-PCR for PSA as a prognostic factor for patients with clinically localized prostate cancer treated with radiotherapy" Urology 61(5):967-71; Giatromanolaki et al. (2004) "Assessment of highly angiogenic and disseminated in the peripheral blood disease in breast cancer patients predicts for resistance to adjuvant chemotherapy and early relapse" Int J Cancer 108(4):620-7; Halabi et al. (2003) "Prognostic significance of reverse transcriptase polymerase
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chain reaction for prostate-specific antigen in metastatic prostate cancer: a nested study within CALGB 9583" J Clin Oncol 21(3):490-5; Hardingham et al. (2000) "Molecular detection of blood-borne epithelial cells in colorectal cancer patients and in patients with benign bowel disease" Int J Cancer 89(1):8-13; Hayes et al. (2002) "Monitoring expression of HER-2 on circulating epithelial cells in patients with advanced breast cancer" Int J Oncol 21(5):1111-7; Jotsuka, et al. (2004) "Persistent evidence of circulating tumor cells detected by means of RT-PCR for CEA mRNA predicts early relapse: a prospective study in node-negative breast cancer" Surgery 135(4):419-26; Allen-Mersh T et al. (2003) "Colorectal cancer recurrence is predicted by RT-PCR detection of circulating cancer cells at 24 hours after primary excision" congreso ASCO, Chicago, Mayo de 2003; Shariat et al. (2003) "Early postoperative peripheral blood reverse transcription PCR assay for prostate-specific antigen is associated with prostate cancer progression in patients undergoing radical prostatectomy" Cancer Res 63(18):5874-8; Smith et al. (2000) "Response of circulating tumor cells to systemic therapy in patients with metastatic breast cancer: comparison of quantitative polymerase chain reaction and immunocytochemical techniques" J Clin Oncol 18(7):1432-9; Stathopoulou et al. (2002) "Molecular detection of cytokeratin-19-positive cells in the peripheral blood of patients with operable breast cancer: evaluation of their prognostic significance" J Clin Oncol 20(16):3404-12; y Xenidis et al. (2003) "Peripheral blood circulating cytokeratin-19 mRNA-positive cells after the completion of adjuvant chemotherapy in patients with operable breast cancer" Ann Oncol 14(6):849-55.
Una clase preferida de dianas de acido nucleico a detectar en los metodos de la presente invencion son aquellas implicadas en el cancer. Cualquier acido nucleico que esta asociado con el cancer se puede detectar en los metodos descritos en la presente memoria, p. ej., aquellos que codifican factores de crecimiento polipeptfdicos expresados en exceso o mutados (p. ej., SIS), receptores de factores de crecimiento expresados en exceso o mutados (por ejemplo, erb-B1), protemas de transduccion de senales expresadas en exceso o mutadas, tales como protemas G (p. ej., Ras), o tirosina quinasas no receptoras (p. ej., abl), o protemas reguladoras expresadas en exceso o mutadas (p. ej., myc, myb, jun, fos, etc.) y/o similares. En general, el cancer a menudo puede estar relacionado con moleculas de transduccion de senales y los correspondientes productos de oncogenicos, p. ej., acidos nucleicos que codifican Mos, Ras, Raf y Met; y activadores y supresores de la transcripcion, p. ej., p53, Tat, Fos, Myc, Jun, Myb, Rel, y/o receptores nucleares. p53, conocida coloquialmente como "polida molecular" de la celula, tiene una especial relevancia, ya que se pueden localizar una o varias lesiones geneticas en p53 en aproximadamente 50% de todos los canceres conocidos.
Tomando una clase de genes que son relevantes para el cancer como un ejemplo para la discusion, muchos receptores de hormonas nucleares se han descrito con detalle y se han elaborado los mecanismos por los que estos receptores pueden ser modificados para conferir actividad oncogenica. Por ejemplo, la base fisiologica y molecular de accion de la hormona tiroidea es revisada por Yen (2001) en "Physiological and Molecular Basis of Thyroid Hormone Action" Physiological Reviews 81(3):l097-1142, y referencias allt Los receptores nucleares conocidos y bien caracterizados incluyen aquellos para glucocorticoides (GR), androgenos (AR), mineralocorticoides (MR), progestagenos (PR), estrogenos (ER), hormonas tiroideas (TR), vitamina D (VDR), retinoides (RAR y RXR), y receptores activados por el proliferador de peroxisomas (PPAR) que se unen a eicosanoides. Los denominados "receptores nucleares huerfanos" son tambien parte de la superfamilia de receptores nucleares, y son estructuralmente homologos a los receptores nucleares clasicos, tales como los receptores esteroideos y tiroideos. Los acidos nucleicos que codifican cualquiera de estos receptores, o las formas oncogenicas de los mismos, pueden ser detectados en los metodos descritos en la presente memoria. Aproximadamente 40% de todos los tratamientos farmaceuticos disponibles actualmente son agonistas o antagonistas de los receptores nucleares y/o formas oncogenicas de los mismos, lo que subraya la importancia relativa de estos receptores (y sus acidos nucleicos codificantes) como dianas para el analisis mediante los metodos descritos en la presente memoria.
Una clase ilustrativa de acidos nucleicos diana es aquella que es diagnostica del cancer de colon, p. ej., en muestras derivadas de heces. El cancer de colon es una enfermedad comun que puede ser esporadica o hereditaria. La base molecular de los diversos patrones de cancer de colon se conoce con algun detalle. En general, las mutaciones de la lmea germinal son la base de los smdromes de cancer de colon hereditario, mientras que una acumulacion de mutaciones somaticas es la base de cancer de colon esporadico. En Judios Ashkenazi, una mutacion que se habfa pensado previamente que era un polimorfismo puede causar cancer de colon familiar. Las mutaciones de al menos tres clases diferentes de genes se han descrito en la etiologfa del cancer de colon: oncogenes, genes supresores y genes con reparacion de emparejamientos erroneos. Un ejemplo de acido nucleico codifica DCC (suprimido en el cancer de colon), una molecula de adherencia celular con homologfa con la fibronectina. Una forma adicional de cancer de colon es un gen autosomico dominante, hMSH2, que comprende una lesion. La poliposis adenomatosa familiar es otra forma de cancer de colon con una lesion en el locus MCC en el cromosoma numero 5. Para obtener detalles adicionales sobre el cancer de colon, vease, Calvert et al. (2002) "The Genetics of Colorectal Cancer" Annals of Internal Medicine 137(7): 603-612 y las referencias allf citadas. Para una variedad de canceres de colon y marcadores de cancer de colon que se pueden detectar en las heces, vease p. ej., Boland (2002) "Advances in Colorectal Cancer Screening: Molecular Basis for Stool-Based DNA Tests for Colorectal Cancer: A Primer for Clinicans" Reviews In Gastroenterological Disorders Volumen 2, Sup. 1 y las rerefencias allf citadas. Como con otros canceres, las mutaciones en una variedad de genes diferentes que se correlacionan con el cancer, tales como Ras and p53, son indicadores de diagnostico utiles para el cancer.
El cancer de cuello uterino es otra diana ilustrativa para la deteccion, p. ej., mediante la deteccion de acidos nucleicos que son diagnosticos de tal cancer en muestras obtenidas a partir de secreciones vaginales. El cancer
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cervical puede estar causado por el papopavirus (p. ej., virus del papiloma humano) y tiene dos oncogenes, E6 y E7. E6 se une a p53 y lo elimina y E7 se une a PRB y lo elimina. La perdida de p53 y la accion incontrolada de los factores de crecimiento E2F/DP sin la regulacion de pRB es un mecanismo que conduce al cancer de cuello uterino.
Otra diana ilustrativa para la deteccion mediante los metodos descritos en la presente memoria es el retinoblastoma, p. ej., en muestras derivadas de lagrimas. Retinoblastoma es un tumor de los ojos que resulta de la inactivacion del gen pRB. Se ha encontrado que se transmite de manera hereditaria cuando un progenitor tiene un gen pRB mutado (y, por supuesto, la mutacion somatica puede causar formas no hereditarias de cancer).
La Neurofibromatosis de Tipo 1 se puede detectar mediante los metodos descritos en la presente memoria. El gen NF1 es inactivado, lo que activa la actividad GTPasa del oncogen ras. Si falta NF1, ras es hiperactivo y causa tumores neurales. Los metodos descritos en la presente memoria se pueden utilizar para detectar la Neurofibromatosis de Tipo 1 en el LCR o por medio de muestreo de tejidos.
Se conocen muchas otras formas de cancer y se pueden encontrar mediante la deteccion de las lesiones geneticas asociadas utilizando los metodos descritos en la presente memoria. Los canceres que se pueden detectar por medio de la deteccion de la lesiones apropiadas incluyen canceres de linfa, sangre, estomago, intestino, colon, testmulos, pancreas, vejiga, cuello uterino, utero, piel, y esencialmente todos los otros para los que existe una lesion genetica conocida. Para una revision del tema, vease, p. ej., The Molecular Basis of Human Cancer Coleman and Tsongalis (Eds) Humana Press; ISBN: 0896036340; Primera edicion (Agosto 2001).
Del mismo modo, se pueden detectar los acidos nucleicos de organismos patogenos o infecciosos mediante los metodos de la invencion, p. ej., para hongos infecciosos, p. ej., Aspergillus, o especies de Candida; bacterias, particularmente E. coli, que sirve de modelo para bacterias patogenas (y, por supuesto ciertas cepas de las cuales son patogenas), asf como bacterias importantes desde el punto de vista medico tales como Staphylococci (p. ej., aureus), o Streptococci (p. ej., pneumoniae); protozoos tales como esporozoos (p. ej., Plasmodia), rizopodos (p. ej., Entamoeba) y flagelados (Trypanosoma, Leishmania, Trichomonas, Giardia, etc.); virus tales como virus de aRn(+) (los ejemplos incluyen Poxvirus, p. ej., vaccinia; Picornavirus, p. ej., polio; Togavirus, p. ej., rubella; Flavivirus, p. ej., VHC, y Coronavirus), virus de ARN(-) (p. ej., Rhabdovirus, p. ej., VSV; Paramyxovirus, p. ej., RSV; Orthomyxoviruses, p. ej., influenza; Bunyavirus y Arenavirus), virus de ADNdh (Reovirus, p. ej.), virus de ARN a ADN, es decir, Retrovirus, p. ej., VIH y HTLV, y determinados virus de ADN a ARN tales como hepatitis B.
Como se senalo anteriormente, los eventos de amplificacion o de delecion genica se pueden detectar a nivel cromosomico utilizando los metodos descritos en la presente memoria, como se pueden detectar niveles de expresion alterados o anormales. Una clase preferida de dianas de acido nucleico a detectar en los metodos de la presente memoria incluyen oncogenes o genes supresores de tumores sujetos a dicha amplificacion o delecion. Las dianas de acido nucleico ilustrativas incluyen integrina (p. ej., delecion), tirosina quinasas receptoras (RTK; p. ej., amplificacion, mutacion puntual, translocacion, o aumento de la expresion), NF1 (p. ej., delecion o mutacion puntual), Akt (p. ej., amplificacion, mutacion puntual, o aumento de la expresion), PTEN (p. ej., delecion o mutacion puntual), MDM2 (p. ej., amplificacion), SOX (p. ej., amplificacion), RAR (p. ej., amplificacion), CDK2 (p. ej., amplificacion o aumento de la expresion), Ciclina D (p. ej., amplificacion o translocacion), Ciclina E (p. ej., amplificacion), Aurora A (p. ej., amplificacion o aumento de la expresion), P53 (p. ej., delecion o mutacion puntual), NBS1 (p. ej., delecion o mutacion puntual), Gli (p. ej., amplificacion o translocacion), Myc (p. ej., amplificacion o mutacion puntual), HPV-E7 (p. ej., infeccion viral), y VPH-E6 (p. ej., infeccion viral).
Si se utiliza un acido nucleico diana como una referencia, los acidos nucleicos de referencia adecuados se han descrito en la tecnica o se pueden determinar de manera similar. Por ejemplo, se conoce en la tecnica una variedad de genes cuyo numero de copias se mantiene de manera estable en diversas celulas tumorales. Los genes constitutivos cuyos transcritos pueden servir como referencias en los analisis de expresion genica incluyen, por ejemplo, 18S rRNA, 28S rRNA, GAPD, ACTB, y PPIB.
Marcas
Se conoce en la tecnica una amplia variedad de marcas y se puede adaptar a la practica de la presente invencion. Por ejemplo, se han descrito marcas luminiscentes y marcas de dispersion de luz (p. ej., partmulas de oro coloidal). Vease, p. ej., Csaki et al. (2002) "Gold nanoparticles as novel label for DNA diagnostics" Expert Rev Mol Diagn 2:187-93.
Como otro ejemplo, son bien conocidas en la tecnica diversas marcas fluorescentes, incluyendo fluoroforos hidrofobos (p. ej., ficoeritrina, rodamina, Alexa Fluor 488 y fluorescema), protema fluorescente verde (GFP) y variantes de la misma (p. ej., protema fluorescente cian y protema fluorescente amarilla), y puntos cuanticos. Vease, p. ej., The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Decima Edicion o Edicion Web (2006) de Invitrogen (disponible en la Red en probes.invitrogen.com/handbook), para obtener descripciones de fluoroforos que emiten a diferentes diferente longitudes de onda (incluyendo productos conjugados en tandem de fluoroforos que pueden facilitar la excitacion y la deteccion simultaneas de multiples especies marcadas). Para el uso de puntos cuanticos como marcas para las biomoleculas, veanse, p. ej., Dubertret et al. (2002) Science 298:1759; Nature Biotechnology (2003) 21:41-46; y Nature Biotechnology (2003) 21:47-51 .
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Las marcas se pueden introducir en moleculas p. ej. polinucleotidos, durante la smtesis o mediante reacciones postsinteticas mediante mecanismos establecidos en la tecnica. Por ejemplo, los kits para el marcaje fluorescente de polinucleotidos con diferentes fluoroforos estan disponibles de Molecular Probes, Inc. ((www). Molecularprobes.com), y las fosforamiditas que contiene fluoroforo para su uso en la smtesis de acido nucleico estan disponibles en el mercado. Del mismo modo, las senales de las marcas (p. ej., la absorcion y/o emision de fluorescencia a partir de una marca fluorescente) se pueden detectar esencialmente mediante cualquier metodo conocido en la tecnica. Por ejemplo, la deteccion multicolor y similares son bien conocidos en la tecnica. Los aparatos para la deteccion de marcas son igualmente bien conocidos y ampliamente asequibles, p. ej., escaneres, microscopios, citometros de flujo, etc. Por ejemplo, los citometros de flujo son ampliamente asequibles, p. ej., de Becton-Dickinson ((www.) Bd.com) y Beckman Coulter ((www.) beckman.com).
Tecnicas de biologma molecular
Al poner en practica la presente invencion, se utilizan opcionalmente muchas tecnicas convencionales en la biologfa molecular, la microbiologfa y la tecnologfa de ADN recombinante. Estas tecnicas son bien conocidas y se explican, por ejemplo, en Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA; Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3a Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2000 y Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (complementado en 2006). Otras referencias utiles, p. ej. para el aislamiento y el cultivo celular (p. ej., para el posterior aislamiento del acido nucleico) incluyen Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, tercera edicion, Wiley-Liss, Nueva York y las referencias allf citadas; Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. Nueva York, NY; Gamborg y Phillips (Eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg Nueva York) y Atlas y Parks (Eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CrC Press, Boca Raton, FL.
Elaboracion de polinucleotidos
Los metodos de elaboracion de acidos nucleicos (p. ej., mediante amplificacion in vitro, purificacion a partir de celulas, o smtesis qmmica), los metodos para la manipulacion de acidos nucleicos (p. ej., mediante digestion con enzimas de restriccion, ligacion, etc.) y los diversos vectores, lmeas celulares y similares utiles en la manipulacion y elaboracion de acidos nucleicos se describen en las referencias anteriores. Ademas, los metodos de elaboracion de polinucleotidos ramificados (p. ej., multfmetros de amplificacion) se describen en los documentos USPN 5.635.352, USPN 5.124.246, USPN 5.710.264, y USPN 5.849.481, asf como en otras referencias mencionadas anteriormente.
Ademas, se puede encargar esencialmente cualquier polinucleotido (incluyendo, p. ej., polinucleotidos marcados o biotinilados) a la medida o estandar de cualquiera de una variedad de fuentes comerciales, tales como The Midland Certified Reagent Company ((www.) Mcrc.com), The Great American Gene Company ((www.) genco.com), ExpressGen Inc. ((www.) expressgen.com), Qiagen (oligos.qiagen.com) y muchos otros.
Se pueden introducir opcionalmente en un polinucleotido una marca, biotina, u otro radical, ya sea durante o despues de la smtesis. Por ejemplo, se puede incorporar una biotina-fosforamidita durante la smtesis qmmica de un polinucleotido. Alternativamente, se puede biotinilar cualquier acido nucleico utilizando mecanismos conocidos en la tecnica; los reactivos adecuados estan disponibles en el mercado, p. ej., de Pierce Biotechnology ((www). piercenet.com). Del mismo modo, se puede marcar con fluorescencia cualquier acido nucleico, por ejemplo, mediante el uso de kits disponibles en el mercado, tales como los de Molecular Probes, Inc. ((www). Molecularprobes.com) o Pierce Biotechnology ((www). Piercenet.com) o mediante la incorporacion de una fosforamidita marcada con fluorescencia durante la smtesis qmmica de un polinucleotido.
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Claims (8)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un kit para detectar un acido nucleico en una celula individual que comprende, empaquetado en uno o mas contenedores:
    al menos un reactivo para celulas permeabilizantes;
    al menos un conjunto de sondas de captura que comprende dos o mas sondas de captura capaces de hibridarse a una secuencia de acido nucleico diana; y
    (i) una sonda marcada que comprende una marca, en donde la sonda marcada es capaz de hibridarse con dicho conjunto de dos o mas sondas de captura, o
    (ii) una sonda marcada que comprende una marca, y un amplificador hibridado con la sonda marcada y capaz de hibridarse con dicho conjunto de dos o mas sondas de captura, o
    (iii) una sonda marcada que comprende una marca, un amplificador hibridado con la sonda marcada, y un preamplificador hibridado con el amplificador y capaz de hibridarse con dicho conjunto de dos o mas sondas de captura,
    donde cada una de dichas sondas de captura comprende una seccion T que es complementaria a una region de dicha secuencia de acido nucleico diana y una seccion L que es complementaria a una region de (i) dicha sonda marcada, (ii) dicho amplificador o (iii) dicho preamplificador; donde las secciones T de las dos o mas sondas de captura en el conjunto de sondas de captura son complementarias a las regiones no solapantes de la secuencia de acido nucleico diana, y las secciones L de dos o mas sondas de captura en el conjunto de sondas de captura son complementarias a las regiones que no se solapan de (i) dicha sonda marcada, (ii) dicho amplificador o (iii) dicho preamplificador.
  2. 2. El kit de la reivindicacion 1, en donde la diana de acido nucleico comprende una pluralidad de diferentes dianas de acido nucleico; y cada diana de acido nucleico tiene su sonda marcada asociada, su sonda de captura, su preamplificador y/o su amplificador; y cada sonda marcada comprende un marcador, en la que la senal de cada marca es distinguible entre sl
  3. 3. Una muestra de celulas fijadas y permeabilizadas, que comprende:
    a. al menos una celula fijada y permeabilizada que contiene un acido nucleico diana;
    b. al menos un conjunto de sondas de captura que comprende dos o mas sondas de captura hibridadas con dicho acido nucleico diana; y
    c. (i) una sonda marcada hibridada con dicho conjunto de dos o mas sondas de captura, o
    (ii) una sonda marcada, y un amplificador hibridado con la sonda marcada y capaz de hibridarse con dicho conjunto de dos o mas sondas de captura, o
    (iii) una sonda marcada, un amplificador hibridado con el marcador, y un preamplificador hibridado con el amplificador y capaz de hibridarse con dicho conjunto de dos o mas sondas de captura,
    donde cada una de dichas sondas de captura comprende una seccion T que es complementaria a una region de dicho acido nucleico diana y una seccion L que es complementaria a una region de dicha (i) sonda marcada, (ii) amplificador, o (iii) preamplificador; donde las secciones T de dos o mas sondas de captura en el conjunto de sondas de captura son complementarias a regiones no solapantes del acido nucleico diana y las secciones L de dos o mas sondas de captura en el conjunto son complementarias a regiones no solapantes de (i) dicha sonda marcada, (ii) dicho amplificador o (iii) dicho preamplificador.
  4. 4. La muestra de la reivindicacion 3, en donde dichas celulas se suspenden en solucion o se inmovilizan en un portaobjetos.
  5. 5. La muestra de la reivindicacion 3 o 4, en dondedichas celulas provienen de un fluido corporal o de sangre.
  6. 6. La muestra de una cualquiera de las reivindicaciones 3-5, en donde dichas celulas comprenden una mezcla de tipos de celulas, en donde dicha mezcla comprende al menos una celula de un tipo especificado.
  7. 7. La muestra de la reivindicacion 6, en dondela relacion de celulas de un tipo especificado a celulas de todos los demas tipos de la mezcla es inferior a 1 : 1x104 o inferior a 1 : 1x105.
  8. 8. La muestra segun las realizaciones 3-7, en donde dichas celulas de un tipo espedfico son celulas tumorales, o espedficamente, celulas tumorales circulantes.
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