JP4790621B2

JP4790621B2 - 特定のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の分析のためのペプチド核酸プローブ

Info

Publication number: JP4790621B2
Application number: JP2006541471A
Authority: JP
Inventors: ヘンリックステンダー，; マークフィアンダカ，; ケネスオリベイラ，; エリザベスバージェロン，
Original assignee: アドバンディーエックス，インコーポレイテッド
Priority date: 2003-11-26
Filing date: 2004-11-24
Publication date: 2011-10-12
Anticipated expiration: 2024-11-24
Also published as: EP1709198B1; WO2005054516A3; JP2011097958A; US20080008994A1; DK1709198T3; EP1709198A2; WO2005054516A2; JP2007512021A; US8173785B2

Description

（関連出願）
本出願は、２００３年１１月２６日に出願した米国仮特許出願第６０／５２５，５９１号の利益を主張する。この仮出願の内容全体が、この言及によって本明細書中にて援用される。

（発明の分野）
本発明は、特定のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種（必要に応じて、サンプル中に存在する）の分析のための、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ、ＰＮＡプローブセット、および方法に関する。本発明は、そのようなＰＮＡプローブまたはＰＮＡプローブセットを含む、診断キットにさらに関する。本発明の方法およびキットは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ以外の１種以上のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種およびＳ．ａｕｒｅｕｓの同時分析のために特に有用である。

（背景）
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓは、外科部位感染、血流感染（ＢＳＩ）および他の深刻な感染に関連する、周知のヒト病原体である。対照的に、皮膚において一般的に見出される他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種（例えば、特に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｌｕｇｄｅｎｅｎｓｉｓ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）は、カテーテル関連感染以外は、臨床的には稀にしか重要ではない。さらに、ＢＳＩがＳ．ａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種によって引き起こされる場合において、しばしば、それらの生物とＳ．ａｕｒｅｕｓとの間に、抗生物質感受性または生存能の差が存在する。従って、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種と、Ｓ．ａｕｒｅｕｓとの間の区別が、適切な患者治療および患者管理を指示するためには非常に重要である。

臨床標本におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の存在は、グラム染色および顕微鏡分析によりグラム陽性球菌クラスター（ＧＰＣＣ）の存在によって慣用的に決定される。しかし、Ｓ．ａｕｒｅｕｓと他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種との間の区別は、継代培養、一晩インキュベーションと、その後の生化学的分析（例えば、コアグラーゼ試験およびラテックス凝集試験）またはより最近では分子試験を待たなければならない。他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の存在は、しばしば、試験管コアグラーゼ試験の陰性の結果に基づいて決定され、代表的には、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣＮＳ）として報告されている。これは、ＧＰＣＣ陽性の血液培養ビンの分析のために特に問題である。なぜなら、ＧＰＣＣ陽性血液ビンのうちのわずか２０％〜３０％しか、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに起因しないからである（非特許文献１）。従って、大多数の場合において、医師は、陰性の試験結果（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの不在）に基づいて判断を行わなければならない。

ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓおよびすべてのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の分析のためのＤＮＡプローブ（属特異的プローブ）が、記載されており（特許文献１、非特許文献２）、同様に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの分析のためのＰＮＡプローブも、記載されている（特許文献２、非特許文献３）。これらのプローブは、すべて、種特異的または属特異的のいずれかである配列を標的とする。

リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列またはそのｒＲＮＡに対応するゲノムＤＮＡ配列（ｒＤＮＡ）の比較分析は、細菌種間の系統発生的関係を確立するための広く受け入れられた方法となっている（非特許文献４）。結果的に、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｕａｌｏｆｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙが、ｒＲＮＡ配列比較またはｒＤＮＡ配列比較に基づいて修正された。近縁種間でのリボソームＲＮＡ配列またはｒＤＮＡ配列の差によって、微生物同定のための種特異的プローブの設計が可能になり、それによって、診断微生物学は、伝統的微生物学におけるような一連の表現型マーカーではなく単一の遺伝子マーカーに基づくことが可能になる（非特許文献５）。しかし、種コホートを標的とするプローブの設計は、特に問題があり、非常に特異的なプローブ構築物と独特な標的配列との組み合わせを必要とする。

ＰＮＡは、種サブセットを標的とするプローブを開発する場合の有用な研究候補である。なぜなら、ＰＮＡは、ＤＮＡプローブと比較して増加した配列特異性で核酸にハイブリダイズするからである。従って、先行技術はまた、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ以外のマイコバクテリアを標的とするＰＮＡプローブの例（特許文献３）およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ以外の腸球菌を標的とするＰＮＡプローブの例（非特許文献６）を包含する。

その名前にも関わらず、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ペプチドでも核酸でもなく、酸でさえない。ＰＮＡは、天然に存在しないポリアミドであり、これは、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成規則に従って配列特異性を備えて核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）にハイブリダイズし得る（特許文献４および非特許文献７を参照のこと）。しかし、核酸は、生存種の一生において遺伝子伝達および遺伝子発現の作用因子として中心的役割を果たす生物学的物質であるが、ＰＮＡは、最近開発された全体的に人工の分子であり、化学者の頭脳において着想され合成有機化学を使用して作製された。ＰＮＡはまた、核酸とは構造的に異なる。両方とも、一般的な核酸塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵ）を使用し得るが、これらの分子の骨格は、構造的に多岐にわたる。ＲＮＡの骨格およびＤＮＡの骨格は、反復するホスホジエステルリボース単位および２−デオキシリボース単位から構成される。対照的に、最も一般的なＰＮＡの骨格は、（アミノエチル）−グリシンサブユニットから構成される。さらに、ＰＮＡにおいて、その核酸塩基は、さらなるメチレンカルボニル部分によってその骨格に接続される。従って、ＰＮＡは、酸ではなく、従って、荷電酸性基（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ中に存在する荷電酸性基）を含まない。その非荷電骨格によって、ＰＮＡプローブは、ＤＮＡおよびＲＮＡに対しては不安定な条件下でハイブリダイズ可能である。そのような属性によって、ＰＮＡプローブは、ＤＮＡプローブに接近不能であることが公知である標的（例えば、高度に構造化されたｒＲＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ）に接近可能である（非特許文献８を参照のこと）。ＰＮＡプローブは、構造においても機能においても、核酸プローブの等価物ではない。
国際公開第００６６７８８号パンフレット米国特許第６６６４０４５号明細書米国特許第６７５３４２１号明細書米国特許第５，５３９，０８２号明細書Ｋａｒｌｏｗｓｋｙら、ＡｎｎＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂ（２００４）３：７Ｋｅｍｐｆら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２０００）３８：８３０〜８３８Ｏｌｉｖｅｉｒａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００２）４０：２４７〜２５１Ｗｏｅｓｅ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（１９８７）５１：２２１〜２７１Ｄｅｌｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）３４２：１３６０〜１３６３Ｏｌｉｖｅｉｒａら、Ａｂｓｔｒａｃｔ＃Ｄ−２００３，ＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｎＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＡｇｅｎｔｓａｎｄＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２００２，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ２７〜３０，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡＥｇｈｏｌｍら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６５：５６６〜５６８ＳｔｅｐｈａｎｏおよびＨｙｌｄｉｇ−Ｎｉｅｌｓｅｎ，ＩＢＣＬｉｂｒａｒｙＳｅｒｉｅｓＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ＃９４８，ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＢｕｓｉｎｅｓｓＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，１９９７，ＭＡ，ｐｐ．１９〜３７

Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の積極的同定は、多くの場合において有利である。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓおよび他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の同時分析が、理想的である。なぜなら、Ｓ．ａｕｒｅｕｓまたは他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種のいずれかの存在についての処置判断は、常に、陽性の試験結果に基づくからである。この特徴はまた、Ｓ．ａｕｒｅｕｓと他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種との混合物が存在する場合に、有意な利点を提供する。

（発明の要旨）
本発明は、（必要に応じて、対象サンプル中に存在する）特定のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種（好ましくは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種）の分析のために有用な、ＰＮＡプローブもしくはＰＮＡプローブセット、およびそれらの使用ならびにキットに関する。特許請求の範囲に従って、上記ＰＮＡプローブは、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、またはそのｒＲＮＡもしくはその相補体に対応するゲノム配列（ｒＤＮＡ）に関する。

一実施形態において、本発明は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）以外のあるブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種（例えば、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカスヘモリティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカスホミニス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｈｏｍｉｎｉｓ）、スタフィロコッカスルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、およびスタフィロコッカスサプロフィティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）であるが、これらに限定されない）の分析のためのＰＮＡプローブに関する。

別の実施形態において、本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外の２種以上のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の分析のためのＰＮＡプローブに関する。

ＰＮＡプローブ（元々、米国特許第５，５３９，０８２号およびＥｇｈｏｌｍら、Ｎａｔｕｒｅ３６５：５６６〜５６８（１９９３）（本明細書に参考として添付される）に記載される）は、天然に存在する核酸プローブと比較した場合の固有の物理化学的特徴／化学的特徴を有し、その特徴によって、迅速かつ正確なアッセイの設計が可能である。ＰＮＡプローブは、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイにおいて適用された場合に、核酸プローブを超える別の利点を提供する。この利点は、ＰＮＡプローブによる、グラム陽性細菌（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種）の強固な細胞壁の改良された細胞浸透に起因する。核酸プローブが、架橋剤および／または酵素による固定および透過化処理を必要とする（例えば、Ｋｅｍｐｆら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ３８：８３０〜８３８（２０００）を参照のこと）場合、ＰＮＡプローブは、実施例１において例証されるような塗抹標本調製の後に直接適用され得る。

好ましい実施形態において、ＰＮＡプローブは、比較的短い核酸塩基配列（例えば、実施例１に記載されるような１５核酸塩基）を有する。天然に存在する核酸プローブは、ＰＮＡプローブよりも弱いその安定性および低いその融解温度（Ｔｍ）が原因で、代表的には、少なくとも１８ヌクレオチド長である（例えば、Ｋｅｍｐｆら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ３８：８３０〜８３８（２０００）を参照のこと）。核酸プローブよりも高いＰＮＡプローブの特異性は、密接に関連するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡの分析のために必要とされるような、一核酸塩基の差もしくはほんの少数の核酸塩基の差しかない密接に関連する非標的配列を、核酸プローブよりも良好に識別する。

本発明に従う例示的なＰＮＡプローブ核酸塩基配列としては、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）を標的とするＴＣＴ−ＡＡＣ−ＡＴＧ−ＴＴＣ−ＴＴＴ（配列番号１）；スタフィロコッカスサプロフィティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）を標的とするＴＣＴ−ＡＧＴ−ＣＴＧ−ＴＴＣ−ＴＴＴ（配列番号２）；スタフィロコッカスヘモリティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）を標的とするＴＣＴ−ＡＡＴ−ＡＴＡ−ＴＴＣ−ＣＴＴ（配列番号３）；スタフィロコッカスワーネリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｗａｒｎｅｒｉ）を標的とするＴＣＴ−ＡＡＴ−ＡＴＡ−ＴＡＣ−ＴＴＴ（配列番号４）；黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）以外の数種のブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種を標的とするＧＣＴ−ＣＣＡ−ＡＡＴ−ＧＧＴ−ＴＡＣ（配列番号５）；表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）を標的とするＴＣＣ−ＴＣＧ−ＴＣＴ−ＧＴＴ−ＣＧＣ（配列番号６）；スタフィロコッカスサプロフィティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）を標的とするＣＴＣ−ＣＴＴ−ＡＴＣ−ＴＧＴ−ＴＣＧ−Ｃ（配列番号７）；スタフィロコッカスヘモリティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）を標的とするＣＴＣ−ＣＴＴ−ＧＴＣ−ＴＧＴ−ＴＣＧ−Ｃ（配列番号８）；スタフィロコッカスシウリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓｃｉｕｒｉ）を標的とするＣＴＴ−ＣＴＣ−ＡＴＣ−ＴＧＴ−ＴＣＧ−Ｃ（配列番号９）；スタフィロコッカスシュライフェリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ）を標的とするＴＣＣ−ＴＣＧ−ＴＣＣ−ＧＴＴ−ＣＧＣ（配列番号１０）；およびスタフィロコッカスシュライフェリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ）の改変体を標的とするＴＣＣ−ＴＴＧ−ＴＣＣ−ＧＴＴ−ＣＧＣ（配列番号１１）が挙げられる。これらのＰＮＡプローブは、これらのＰＮＡプローブが標的とするブドウ球菌の種によって記載されているが、これらのＰＮＡプローブは、必ずしもその特定の生物に対して特異的ではなく、実際には、それらのプローブのうちのいくつかは、他のブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種における標的と完全に相補的であるか、またはほぼ完全に相補的である。

なお別の実施形態において、上記ＰＮＡプローブは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外の２種以上のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の分析のための２種以上のＰＮＡプローブを含むか、またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の分析のための少なくとも１種のＰＮＡプローブとＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓの分析のためのＰＮＡプローブとを含む、ＰＮＡプローブセットの一部であり得る。すなわち、本発明のいくつかのＰＮＡプローブは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外の２種以上のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種に対して特異的である。好ましくは、ＰＮＡプローブセット内のＰＮＡプローブは、２種以上のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の独立した分析のために別々に標識される。この実施形態の改変形において、そして実施例５において例証されるように、複数のプローブが、特定のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種コホートを検出するために同じように標識され得、一方、必要に応じた他のプローブが、第二の種または種コホートの分析のために別々に標識される。

本発明に従う方法は、サンプルを、上記のＰＮＡプローブのうちの１つ以上と接触させる工程を包含する。この方法によると、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の存在、不在、および／または数が、適切なハイブリダイゼーション条件下での標的配列に対する上記プローブのプロービング核酸塩基配列のハイブリダイゼーションを相関付けることによって、検出、同定、および／または定量される。結果的に、この分析は、決定的な結果を伴う単一のアッセイに基づく。対照的に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の決定的分析のための現行の慣用的方法は、複数の試験を含む複数の表現型特徴に基づく。

別の実施形態において、上記ＰＮＡプローブは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓと、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種との同時分析のために、並列反応または同一反応（多重反応）のいずれかにおいて、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓの分析のための以前に公開されたＰＮＡプローブ（Ｏｌｉｖｅｉｒａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４０：２４７〜２５１（２００２）を参照のこと）と同時に適用される。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の存在がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ特異的シグナルの不在によってさらに支持され、逆もまた同様であるこの様式においては、そのような最終的試験結果は、ポジティブな反応およびネガティブな反応の両方に基づいて解釈される。従って、上記ＰＮＡプローブセットは、別個のコントロール実験を実施する必要性を排除する内部コントロールを提供する。好ましくは、上記２種のＰＮＡプローブは、その分析が１つの反応（多重反応）において実施されるように、独立して標識される。同時分析はまた、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓと、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種との両方の混合物を含む標本にとって、有利である。そのような場合、ＦＩＳＨのための上記ＰＮＡプローブの使用は、単一細胞検出という利点を提供し、その結果、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種と、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓとの両方の細胞が、下記に例証されるような特異的標識によって同時に観察され得かつ区別され得る。対称的に、他の技術は、さらなるコントロール実験を実施することなく、混合培養物を擬陽性反応から区別することはできない。

なお別の実施形態において、本発明は、（必要に応じてサンプル中に存在する）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ種を検出、同定、および／または定量するアッセイを実施するため、ならびに／あるいは抗生物質耐性の決定のために適切な、キットに関する。本発明のキットは、１種以上のＰＮＡプローブと、アッセイを実施するように選択されるかまたはそうでなければアッセイの実施を簡単にするように選択される他の試薬もしくは組成物とを、含む。特に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ種と、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓとの組み合わせ分析は、ＧＰＣＣ陽性血液培養ビンの慣用的試験（複数のＰＮＡプローブの使用が二次的に内部コントロールとして役立つ）のために充分に適している。

複数のＰＮＡプローブの使用に由来する別の利点は、ブロッキングプローブの使用である。この好ましい実施形態において、ブロッキングプローブストラテジーが、密接に関連する生物における保存された標的分子の類似領域にプローブが指向されている多重アッセイにおける使用のためのプローブの設計において、使用される。例えば、核酸塩基配列およびＴｍが実質的に類似している独立して検出可能な一対のプローブが、標的核酸塩基配列が１塩基だけ異なる２つの標的の非常に保存された領域に対してハイブリダイズするように設計され得る。この場合、第一プローブが第二プローブの相補的標的に対して非特異的にハイブリダイズする傾向は、第二プローブ／標的ハイブリッドの存在および相対的安定性によって妨害される。同様に、独立して検出可能であるかまたは非独立的に検出可能であるか、または独立して検出可能であるものと非独立的に検出可能であるものとの組み合わせであるかのいずれかである、複数のプローブが、設計され得、これらの複数のプローブは、すべて、わずか一塩基だけ互いに異なり、これらの複数のプローブは、系統的に関連する生物の部分的に保存された標的領域に対して相補的であるかまたは少なくとも実質的に相補的である。標的部位に対する競合は、より高いプローブ特異性を生じ得ると同時に交差ハイブリダイゼーションの可能性を低下させ得る。

当業者は、適切なＰＮＡプローブが、本明細書において有効であると記載されるこれらのプロービング核酸塩基配列を正確に有する必要はないが、特定のアッセイ条件に従って改変され得ることを、認識する。例えば、ハイブリッドの安定性が改変されてそのＴｍを低下させかつ／またはストリンジェンシーについて調節する必要がある場合に、その核酸塩基配列の短縮によって、より短いＰＮＡプローブが調製され得る。同様に、その核酸塩基配列は、区別する核酸塩基がそのＰＮＡプローブの配列中に残る限り、一端において短縮され得、もう一端において伸長され得る。本明細書中に記載されるパラメーター内における上記プロービング核酸塩基配列のそのような変化は、本発明の実施形態であると考えられる。

当業者はまた、相補的プロービング配列が、標的配列としてのｒＤＮＡに対して指向されているアッセイ（例えば、リアルタイムＰＣＲであるが、これに限定はされない）のために等しく適切であることを、認識する。

（発明の詳細な説明）
（１．定義）
本明細書中に記載される場合、用語「核酸塩基」とは、核酸技術を利用するかまたはペプチド核酸技術を利用することによって、核酸に配列特異的に結合し得るポリマーを作製する者にとって一般的に公知である、天然に存在する複素環式部分および天然に存在しない複素環式部分を意味する。

本明細書において使用される場合、用語「核酸塩基配列」とは、核酸塩基含有サブユニットを含むポリマーの任意のセグメントを意味する。適切なポリマーまたはポリマーセグメントの非限定的例としては、オリゴデオキシヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、ペプチド核酸、核酸アナログ、核酸模倣物、および／またはキメラが挙げられる。

本明細書中で使用される場合、用語「標的配列」とは、アッセイにおいて検出されるべき核酸塩基配列を意味する。

本明細書中で使用される場合、用語「プローブ」とは、対象生物の標的分子の標的配列に対して配列特異的にハイブリダイズするように設計されたプロービング核酸塩基配列を有する、ポリマー（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、キメラ、または連結ポリマー）を意味する。

本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」とは、２つ以上のＰＮＡサブユニット（残基）を含む、任意のオリゴマー、連結ポリマー、またはキメラオリゴマーを意味し、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，５２７，６７５号、同第５，６２３，０４９号、同第５，７１４，３３１号、同第５，７３６，３３６号、同第５，７７３，５７１号、同第５，７８６，４６１号、同第５，８３７，４５９号、同第５，８９１，６２５号、同第５，９７２，６１０号、同第５，９８６，０５３号、同第６，１０７，４７０号、および同第６，３５７，１６３号においてペプチド核酸として言及または特許請求されているポリマーのいずれをも包含する。最も好ましい実施形態において、ＰＮＡサブユニットは、メチレンカルボニル結合を介してＮ−［２−（アミノエチル）］グリシン骨格のアザ窒素に結合した、天然に存在する核酸塩基または天然に存在しない核酸塩基からなる。

本明細書において使用される場合、用語「標識」および「検出可能な部分」は、互換可能であり、そしてこれらの用語は、プローブに結合されることによってそのプローブを器具または方法によって検出可能にし得る、部分を指す。

本明細書における「Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種」に対する言及または関連する語句は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の本質的に１種以上のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種を意味する。少数の例外として、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種は、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（これは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種についての医学的表現である）と等価である。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種のコホートとは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外の２種以上のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種を本質的には意味し、これは、すべてのコアグラーゼ陰性ブドウ球菌、臨床的に重要なコアグラーゼ陰性ブドウ球菌、またはこれらの部分集合を包含し得る。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種としては、例えば、Ｓ．ｃａｐｉｔｉｓ、Ｓ．ｃｏｈｎｉｉ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓ．ｈｙｉｃｕｓ、Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ、Ｓ．ｓｃｉｕｒｉ、Ｓ．ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｓ．ｗａｒｎｅｒｉ、および／またはＳ．ｘｙｌｏｓｕｓが挙げられ得る。

用語「サンプル」とは、本明細書中で使用される場合、検出用分析物を含み得る、任意の生物学的サンプルまたは臨床サンプルを指す。好ましくは、この生物学的サンプルは、液体形態であるかまたは組織サンプルとして存在する。最も好ましくは、そのサンプルは、血液培養物由来である。液体サンプルとしては、臨床サンプル（例えば、尿、血液、創傷、痰、咽頭スワブ、胃洗浄物、気管支洗浄物、吸引物、血清、鼻分泌物、汗、血漿、精液、脳脊髄液、涙、膿、羊水、唾液、肺吸引物、胃腸内容物、膣分泌物、尿道分泌物、吐出物、およびそれらの培養物が挙げられる。好ましい組織サンプルまたはその培養物としては、絨毛膜絨毛標本、皮膚上皮、生殖器上皮、歯肉上皮、咽頭上皮、毛、および生検が挙げられる。組織サンプルは、新たに調製されてもよいし、または特定の期間の間、固定剤（例えば、エタノール、メタノール、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ホルマリン、パラフィン、ホルムアルデヒド、ホルムアミド、またはそれらの混合物であるが、これらに限定されない）中に保存されてもよい。非臨床サンプルとして、食物、飲料、水、薬学的製品、パーソナルケア製品、日用品、または環境サンプル、およびそれらの培養物が挙げられる。

本明細書中で使用される場合、「多重アッセイ」とは、複数の標的が検出および同定される可能性があり得るアッセイを包含する。同定は、具体的（例えば、特定の微生物種）または包括的（例えば、特定の微生物属）であり得る。包括的同定はまた、微生物種のコホートの同定を包含し、このコホートは、規定された種群の１種以上のメンバーを含む。規定された種群の一例は、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌である。

本明細書中で使用される場合、独立的かつ同時の検出は、１つよりも多い標的について一度に同定結果を生じ得るアッセイを含む。例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外の１種以上のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓと、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓとの検出は、各プローブについて独特の標識を用いて同時に行われ得、それによって、独立的かつ同時の検出がもたらされる。

このアッセイを実施するために必要な他の試薬または組成物（例えば、洗浄溶液、スライドガラス、カバーガラス、本発明に従う１種以上のＰＮＡプローブ、培養容器、スライドガラス加温器、インキュベーター、封入液、ならびにＰＣＲ成分（酵素および緩衝液を含む））が、含められ得る。

（２．説明）
（１．一般）
（ＰＮＡ合成）
ＰＮＡの化学的構築のための方法は、周知である（米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，５２７，６７５号、同第５，６２３，０４９号、同第５，７１４，３３１号、同第５，７３６，３３６号、同第５，７７３，５７１号、同第５，７８６，４６１号、同第５，８３７，４５９号、同第５，８９１，６２５号、同第５，９７２，６１０号、同第５，９８６，０５３号、および同第６，１０７，４７０号を参照のこと）。

（ＰＮＡ標識）
ＰＮＡを標識するための好ましい非限定的方法は、米国特許第６，１１０，６７６号、同第６，３６１，９４２号、および同第６，３５５，４２１号、これらの明細書の実施例部分において記載されているか、またはそうではなければ、ＰＮＡ合成およびペプチド合成の分野において周知である。

（標識）
本発明の実施において使用されるＰＮＡプローブを標識するために適切な検出可能な部分（標識）の非限定的例としては、デキストラン結合体、分枝型核酸検出系、発色団、フルオロフォア、スピン標識、放射性同位体、酵素、ハプテン、アクリジニウムエステル、および発光化合物が挙げられる。

他の適切な標識試薬および好ましい付着方法は、ＰＮＡ合成、ペプチド合成、または核酸合成の当業者によって認識される。

好ましいハプテンとしては、５（６）−カルボキシフルオレセイン、２，４−ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、およびビオチンが挙げられる。

好ましい蛍光色素（フルオロフォア）としては、５（６）−カルボキシフルオレセイン（Ｆｌｕ）、テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ｔａｍｒａ）、６−（（７−アミノ−４−メチルクマリン−３−アセチル）アミノ）ヘキサン酸（Ｃｏｕ）、５（および６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（Ｒｏｘ）、Ｃｙａｎｉｎｅ２（Ｃｙ２）Ｄｙｅ、Ｃｙａｎｉｎｅ３（Ｃｙ３）Ｄｙｅ、Ｃｙａｎｉｎｅ３．５（Ｃｙ３．５）Ｄｙｅ、Ｃｙａｎｉｎｅ５（Ｃｙ５）Ｄｙｅ、Ｃｙａｎｉｎｅ５．５（Ｃｙ５．５）Ｄｙｅ、Ｃｙａｎｉｎｅ７（Ｃｙ７）Ｄｙｅ、Ｃｙａｎｉｎｅ９（Ｃｙ９）Ｄｙｅ（Ｃｙａｎｉｎｅ色素２、Ｃｙａｎｉｎｅ色素３、Ｃｙａｎｉｎｅ色素３．５、Ｃｙａｎｉｎｅ色素５およびＣｙａｎｉｎｅ色素５．５は、Ａｍｅｒｓｈａｍ（ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）からＮＨＳエステルとして入手可能である）、ＪＯＥ、Ｔａｍａｒａ、またはＡｌｅｘａ色素シリーズ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）が挙げられる。

好ましい酵素としては、ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、ＫｌｅｎｏｗＰＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ＤＮＡポリメラーゼ１、およびΦ２９ポリメラーゼ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が挙げられ、最も好ましくは、ダイズペルオキシダーゼ（ＳＢＰ）が挙げられる。

（非標識プローブ）
本発明の実施のために使用されるプローブは、本発明の方法において有効であるためには検出可能な部分で標識される必要はない。例えば、本発明のプローブは、固体支持体に付着され得、これによって、本発明のプローブは、公知のアレイ技術によって検出可能になる。

（自己指示（ｓｅｌｆ−ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ）プローブ）
Ｂｅａｃｏｎプローブは、ドナー部分とアクセプター部分とを備える自己指示プローブの例である。そのドナー部分およびアクセプター部分は、そのアクセプター部分がドナー部分から移動したエネルギーを受容するかまたはそうでなければドナー部分からのシグナルをクエンチングするように、作動する。上記に列挙されたフルオロフォア（適切なスペクトル特性を有する）はまた、エネルギー移動アクセプターとして作動し得るが、好ましくは、そのアクセプター部分は、クエンチャー部分である。好ましくは、そのクエンチャー部分は、非蛍光芳香族部分または非蛍光複素芳香族部分である。好ましくは、クエンチャー部分は、４−（（４−ジメチルアミノ）フェニル）アゾ）安息香酸（ダブシル）である。好ましい実施形態において、その自己指示Ｂｅａｃｏｎプローブは、米国特許第６，４８５，９０１号においてより充分に記載されるＰＮＡＬｉｎｅａｒＢｅａｃｏｎである。

別の実施形態において、本発明の自己指示プローブは、ＷＩＰＯ特許出願ＷＯ９７／４５５３９に記載される型である。これらの自己指示プローブは、シグナルを生成するためにはレポーターが核酸と相互作用しなければならないという点が主に、Ｂｅａｃｏｎプローブと比較して異なる。

（スペーサー／リンカー部分）
一般的には、スペーサーは、嵩高い標識試薬がプローブのハイブリダイゼーション特性に対して有し得る有害作用を最小にするために使用される。本発明の核酸塩基ポリマーのための好ましいスペーサー／リンカーは、１つ以上のアミノアルキルカルボン酸（例えば、アミノカプロン酸）、アミノ酸の側鎖（例えば、リジンの側鎖またはオルニチンの側鎖）、天然アミノ酸（例えば、グリシン）、アミノオキシアルキル酸（例えば、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸）、アルキル二酸（例えば、コハク酸）、アルキルオキシ二酸（例えば、ジグリコール酸）、またはアルキルジアミン（例えば、１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン）からなる。

（ハイブリダイゼーション条件／ハイブリダイゼーションストリンジェンシー）
核酸ハイブリダイゼーションの当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを付与または制御するために一般的に使用される要因としては、ホルムアミド濃度（もしくは他の化学的変性試薬）、塩濃度（例えば、イオン強度）、ハイブリダイゼーション温度、界面活性剤濃度、ｐＨ、およびカオトロープの存在または不在が挙げられることを認識する。プローブ／標的配列の組み合わせについてのストリンジェンシーが、上記のストリンジェンシー要因のうちのいくつかを固定し、その後、単一のストリンジェンシー要因を変化させる影響を決定するという周知技術によって、しばしば見出される。同じストリンジェンシー要因が、調節され、それによって核酸に対するＰＮＡのハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを制御するようにされ得るが、但し、ＰＮＡのハイブリダイゼーションは、イオン強度とは全く独立している。アッセイについてのストリンジェンシーは、望ましい区別の程度が達成されるまで、各ストリンジェンシー要因の検討によって経験的に決定され得る。

（適切なハイブリダイゼーション条件）
一般的には、核酸混入物の原因となるバックグラウンドが標的配列に対して密接に関連しているほど、ストリンジェンシーはより注意深く制御されなければならない。ブロッキングプローブもまた、ストリンジェンシー要因の最適化によって可能な限界を上回って区別を改善するための手段として使用され得る。従って、適切なハイブリダイゼーション条件は、望ましい区別の程度が達成されて、アッセイが正確（そのアッセイのための望まれる許容範囲内にある）かつ再現可能な結果を生じるようになる条件を包含する。

慣用的に過ぎない実験および本明細書中にて提供される開示により補助されて、当業者は、本明細書中に記載される方法および組成物を利用するアッセイを実施するための適切なハイブリダイゼーション条件を容易に決定可能である。適切なインサイチュハイブリダイゼーション条件またはＰＣＲ条件は、インサイチュハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ手順を実施するために適切な条件を包含する。従って、適切なインサイチュハイブリダイゼーション条件またはＰＣＲ条件は、さらなる慣用的実験を伴ってかまたは伴うこともなく、本明細書中にて提供される開示を使用して、当業者にとって明らかになる。

（ブロッキングプローブ）
ブロッキングプローブは、非標的配列に対するプロービングポリマーのプロービング核酸塩基配列の結合を抑制するために使用され得る、核酸プローブまたは非核酸プローブである。好ましいブロッキングプローブは、ＰＮＡプローブ（米国特許第６，１１０，６７６号を参照のこと）である。ブロッキングプローブは、非標的配列に対するハイブリダイゼーションによって作動し、それによって、そのプロービング核酸塩基配列と非標的配列との間のハイブリダイゼーションにより形成されるよりも熱力学的に安定な複合体を形成すると考えられる。そのより安定かつ好ましい複合体の形成を介して、プロービング核酸塩基配列と非標的配列との間の、より安定ではなく好ましくはない複合体が、形成するのを防止される。従って、ブロッキングプローブは、存在し得かつそのアッセイの実施を妨害し得る非標的配列に対するそのプローブの結合を抑制するために、本発明の方法、キット、および組成物とともに使用され得る。

（プロービング核酸塩基配列）
本発明のプローブのプロービング核酸塩基配列は、その構築物の特定配列認識部分である。従って、そのプロービング核酸塩基配列は、特定の標的配列にハイブリダイズするように設計された核酸塩基配列であり、その標的配列の存在、不在、または量が、サンプル中の対象生物の存在、不在、または数を直接的もしくは間接的に検出するために使用され得る。結果的に、選択されたアッセイ形式のためのプローブの要件を考慮して、そのプローブのプロービング核酸塩基配列の長さおよび配列組成は、一般的には、安定な複合体が適切なハイブリダイゼーション条件下で標的配列とともに形成されるように選択される。

Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の分析のための本発明のプローブの好ましい核酸塩基配列は、ＴＣＴ−ＡＡＣ−ＡＴＧ−ＴＴＣ−ＴＴＴ（配列番号１）、ＴＣＴ−ＡＧＴ−ＣＴＧ−ＴＴＣ−ＴＴＴ（配列番号２）、ＴＣＴ−ＡＡＴ−ＡＴＡ−ＴＴＣ−ＣＴＴ（配列番号３）、ＴＣＴ−ＡＡＴ−ＡＴＡ−ＴＡＣ−ＴＴＴ（配列番号４）、ＧＣＴ−ＣＣＡ−ＡＡＴ−ＧＧＴ−ＴＡＣ（配列番号５）、ＴＣＣ−ＴＣＧ−ＴＣＴ−ＧＴＴ−ＣＧＣ（配列番号６）、ＣＴＣ−ＣＴＴ−ＡＴＣ−ＴＧＴ−ＴＣＧ−Ｃ（配列番号７）、ＣＴＣ−ＣＴＴ−ＧＴＣ−ＴＧＴ−ＴＣＧ−Ｃ（配列番号８）、ＣＴＴ−ＣＴＣ−ＡＴＣ−ＴＧＴ−ＴＣＧ−Ｃ（配列番号９）、ＴＣＣ−ＴＣＧ−ＴＣＣ−ＧＴＴ−ＣＧＣ（配列番号１０）、ＴＣＣ−ＴＴＧ−ＴＣＣ−ＧＴＴ−ＣＧＣ（配列番号１１）、およびそれらの相補体である。

本発明は、同定されたこれらのプロービング核酸塩基配列における変化もまた、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の分析のために適切なプローブを提供することを企図する。本明細書中に記載されるパラメーター内でのプロービング核酸塩基配列のこのような変化は、本発明の一実施形態であると考えられる。一般的な変化としては、欠失、挿入、およびフレームシフトが挙げられる。さらに、より短いプロービング核酸塩基配列が、上記で同定された配列の短縮によって作製され得る。

本発明のプローブは、一般的には、標的配列と正確に相補的であるプロービング核酸塩基配列を有する。あるいは、実質的に相補的なプロービング核酸塩基配列が、使用され得る。なぜならば、プローブと標的配列との間に１つ以上の点変異（塩基ミスマッチ）が存在するプローブを利用する場合に、より優れた配列区別が得られることが、実証されているからである（Ｇｕｏら、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１５：３３１〜３３５（１９９７）を参照のこと）。結果的には、そのプロービング核酸塩基配列は、上記で同定されたプロービング核酸塩基配列に対してほんの８６％程度しか相同でないものであり得る。上記のパラメーター内にある実質的に相補的なプロービング核酸塩基配列は、本発明の一実施形態であると考えられる。

そのプロービング核酸塩基配列の相補体は、本発明の一実施形態であると考えられる。なぜなら、検出されるべき標的配列が増幅またはコピーされ、それによって同定された標的配列に対する相補体を作製した場合には、適切なプローブを作製することが可能であるからである。

（検出、同定、および／または計数）
「検出」によって、（必要に応じて、サンプル中に存在する）生物の存在または不在についての分析が意味される。「同定」によって、属名、属および種名、または対象生物を分類するために役立つ他の適切なカテゴリーによる、生物の正体の確立が意味される。「定量」によって、サンプル中の生物の計数が意味される。いくつかのアッセイ形式は、同時の検出、同定、および計数を提供し（例えば、Ｓｔｅｎｄｅｒ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ４５：３１〜３９（２００１）を参照のこと）、他のアッセイ形式は、検出および同定を提供し（例えば、Ｓｔｅｎｄｅｒ，Ｈ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｔｕｂｅｒｃ．ＬｕｎｇＤｉｓ．３：８３０〜８３７（１９９９）を参照のこと）、なお他のアッセイ形式は、同定だけを提供する（例えば、Ｏｌｉｖｅｉｒａ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４０：２４７〜２５１（２００２）を参照のこと）。

（独立的かつ同時の検出）
本発明の好ましい実施形態において、多重アッセイが、標識されたプローブを用いて１つの標的を検出すると同時に、別々に標識されたプローブを用いて別の標的を検出するように、設計される。本発明のより好ましい実施形態において、それらの標的は、２つ以上のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種由来のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡの構成要素である。最も好ましい実施形態において、上記アッセイは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外の１種以上のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓと、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓとを検出するように設計された、ＰＮＡＦＩＳＨアッセイである。

（抗生物質耐性）
抗生物質に対する耐性の決定によって、特定の遺伝子もしくは遺伝子産物、または抗菌剤に対する耐性もしくは感受性に関連する変異に基づく、抗生物質に対する生物の感受性の分析が意味される。

（ＩＩ．本発明の好ましい実施形態）
（ａ．ＰＮＡプローブ）
一実施形態において、本発明は、ＰＮＡプローブに関する。本発明のＰＮＡプローブは、（必要に応じてサンプル中に存在する）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種を検出、同定、および／または定量するために適切である。その分析のために適切なＰＮＡプローブの一般的特徴（例えば、長さ、標識、核酸塩基配列、リンカーなど）は、本明細書中にて上記されている。本発明のＰＮＡプローブの好ましいプロービング核酸塩基配列が、表１において列挙される。

（表１）

本発明のＰＮＡプローブは、プロービング核酸塩基配列（本明細書中に上記される）のみを含んでもよいし、またはさらなる部分を含んでもよい。さらなる部分の非限定的例としては、検出可能な部分（標識）、リンカー、スペーサー、天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、または他のＰＮＡサブユニット、ＤＮＡサブユニット、もしくはＲＮＡサブユニットが挙げられる。さらなる部分は、アッセイにおいて機能的であっても機能的でなくてもよい。しかし、一般的には、さらなる部分は、そのＰＮＡプローブが使用されるべきアッセイの設計において機能的であるように選択される。本発明の好ましいＰＮＡプローブは、フルオロフォア、酵素、およびハプテンからなる群より選択される、１つ以上の検出可能な部分で標識される。

好ましい実施形態において、本発明のプローブは、インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）アッセイおよび蛍光インサイチュハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用される。ＩＳＨアッセイまたはＦＩＳＨアッセイにおいて使用される過剰なプローブは、代表的には、特異的に結合したプローブの検出可能な部分が、依然として存在するがハイブリダイズはしていないプローブから生じるバックグラウンドシグナルを超えて検出され得るように除去されなければならない。一般的には、過剰なプローブは、サンプルが一定期間プローブとともにインキュベートされた後に洗い流される。しかし、自己指示プローブの使用は、本発明の好ましい実施形態である。なぜなら、検出可能なバックグラウンドを自己指示プローブがほとんどまたは全く生じないので、過剰な自己指示プローブがサンプルから完全に除去される（洗い流される）必要がないからである。ＩＳＨアッセイまたはＦＩＳＨアッセイに加えて、本明細書中に記載される選択されたプロービング核酸塩基配列を含む自己指示プローブは、すべての種類の均質アッセイ（例えば、リアルタイムＰＣＲ）において特に有用であるか、または自己指示デバイス（例えば、側流（ｌａｔｅｒａｌｆｌｏｗ）アッセイ）または自己指示アレイとともに有用である。

（ｂ．ＰＮＡプローブセット）
本発明のプローブセットは、２つ以上のＰＮＡを含む。一実施形態において、そのセットのＰＮＡプローブのうちのいくつかは、ブロッキングプローブであり得る。他の実施形態において、そのプローブセットは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外の２種以上のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種を分析するために、または、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外の１種以上のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種と、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓとの分析のために、使用され得る。

（ｃ．方法）
別の実施形態において、本発明は、（必要に応じてサンプル中に存在する）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の分析のために適切な方法に関する。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の分析のために適切なＰＮＡプローブの一般的特徴および特殊な特徴が、本明細書中に上記されている。好ましいプロービング核酸塩基配列は、表１に列挙されている。

サンプル中のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の分析のための方法は、そのサンプルを、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種に対して特異的な標的配列に対するハイブリダイゼーションのために適切な１種以上のＰＮＡプローブと、接触させる工程を包含する。この方法によると、その後、そのサンプル中のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種が、検出、同定、および／もしくは定量されるか、またはその抗生物質耐性が、決定される。これは、適切なハイブリダイゼーション条件下または適切なインサイチュハイブリダイゼーション条件下での、検出されるよう努力されるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の標的配列に対するＰＮＡプローブのプロービング核酸塩基配列のハイブリダイゼーションを、そのサンプル中のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ生物以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の存在、不在、もしくは数と相関付けることによって可能になる。代表的には、この相関性は、上記プローブ／標的配列ハイブリッドの直接的検出または間接的検出によって可能になる。好ましい実施形態において、ＰＮＡプローブセットが、別々に標識されたＰＮＡプローブを使用する、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種とＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓとの同時分析のために使用される。

（蛍光インサイチュハイブリダイゼーションおよびリアルタイムＰＣＲ）
本発明のＰＮＡプローブ、方法、キット、および組成物は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の迅速なプローブベースの分析のために、特に好ましい。この分析は、好ましくは、２種以上のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の同時分析のためのＰＮＡプローブセットを使用する。好ましい実施形態において、インサイチュハイブリダイゼーションまたはＰＣＲが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の分析のためのアッセイ形式として使用される。最も好ましくは、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＰＮＡＦＩＳＨ）またはリアルタイムＰＣＲが、そのアッセイ形式である（Ｓｔｅｎｄｅｒら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ４８：１〜１７（２００２）により概説されている）。好ましくは、ＰＮＡＦＩＳＨ分析のための塗抹標本は、ハイブリダイゼーション前には架橋剤でも酵素でも処理されない。

一実施形態において、上記方法は、サンプルから、例えば核酸増幅によって、核酸を合成する工程を包含する。好ましい核酸増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳｔｒａｎｄＤｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）、転写媒介性増幅（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＭｅｄｉａｔｅｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＭＡ）、ローリングサークル増幅（ＲｏｌｌｉｎｇＣｉｒｃｌｅＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＲＣＡ）、およびＱβレプリカーゼ（Ｑｂｅｔａｒｅｐｌｉｃａｓｅ）からなる群より選択される。

本発明の実施は、そうではないと示されない限りは、当業者の範囲内にある、有機化学、ポリマー技術、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技術および説明を使用し得る。そのような従来技術としては、ポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、および標識を使用するハイブリダイゼーションの検出が挙げられる。適切な技術の具体的な例示は、本明細書中下記の実施例を参照することによって得られ得る。しかし、他の等価な従来の手順もまた、当然、使用され得る。そのような従来技術および説明は、標準的な実験室マニュアルにおいて見出され得る。そのようなマニュアルは、例えば、ＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｓｉｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌＳｅｒｉｅｓ（Ｖｏｌ．Ｉ〜ＩＶ）、ＵｓｉｎｇＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｏｔｙＭａｎｕａｌ、Ｃｅｌｌｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＰＣＲＰｒｉｍｅｒ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（すべて、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓより）、Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第４版）である。ポリマー（タンパク質を含む）アレイ合成に適用可能な方法および技術は、米国特許出願第０９／５３６，８４１号、ＷＯ００／５８５１６、米国特許第５，１４３，８５４号、同第５，２４２，９７４号、同第５，２５２，７４３号、同第５，３２４，６３３号、同第５，３８４，２６１号、同第５，４０５，７８３号、同第５，４２４，１８６号、同第５，４５１，６８３号、同第５，４８２，８６７号、同第５，４９１，０７４号、同第５，５２７，６８１号、同第５，５５０，２１５号、同第５，５７１，６３９号、同第５，５７８，８３２号、同第５，５９３，８３９号、同第５，５９９，６９５号、同第５，６２４，７１１号、同第５，６３１，７３４号、同第５，７９５，７１６号、同第５，８３１，０７０号、同第５，８３７，８３２号、同第５，８５６，１０１号、同第５，８５８，６５９号、同第５，９３６，３２４号、同第５，９６８，７４０号、同第５，９７４，１６４号、同第５，９８１，１８５号、同第５，９８１，９５６号、同第６，０２５，６０１号、同第６，０３３，８６０号、同第６，０４０，１９３号、同第６，０９０，５５５号、同第６，１３６，２６９号、同第６，２６９，８４６号、および同第６，４２８，７５２号、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／００７３０（国際公開番号ＷＯ９９／３６７６０）およびＰＣＴ／ＵＳ０１／０４２８５において記載されている。これらは、すべての目的のためにその全体が参考として援用される。具体的な実施形態において合成技術を記載する特許としては、米国特許第５，４１２，０８７号、同第６，１４７，２０５号、同第６，２６２，２１６号、同第６，３１０，１８９号、同第５，８８９，１６５号、および同第５，９５９，０９８号が挙げられる。ＰＣＲ方法について、例えば、ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編、ＦｒｅｅｍａｎＰｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，１９９２）；ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｐｌｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９９０）；Ｍａｔｔｉｌａら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９：４９６７（１９９１）；Ｅｃｋｅｒｔら、ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ１，１７（１９９１）；ＰＣＲ（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら編、ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）；ならびに米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号、同第４，９６５，１８８号、および同第５，３３３，６７５号を参照のこと。これらは各々、すべての目的のためにその全体が参考として本明細書中に援用される。上記サンプルは、アレイ上で増幅され得る。例えば、米国特許第６，３００，０７０号および米国特許出願第０９／５１３，３００号を参照のこと。これらは、参考として本明細書中に援用される。本発明において有用な核酸アレイとしては、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（ＳａｎｔａＣｌａｒａ，Ｃａｌｉｆ．）から市販されている核酸アレイが挙げられる。他の適切な増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４，５６０（１９８９）、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１，１０７７（１９８８）、ならびにＢａｒｒｉｎｇｅｒら、Ｇｅｎｅ８９：１１７（１９９０））、転写増幅（Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６，１１７３（１９８９）およびＷＯ８８／１０３１５）、自己保持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７，１８７４（１９９０）およびＷＯ９０／０６９９５）、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅（米国特許第６，４１０，２７６号）、コンセンサス配列プライムドポリメラーゼ連鎖反応（ＣＰ−ＰＣＲ）（米国特許第４，４３７，９７５号）、アービトラリリープライムド（ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙｐｒｉｍｅｄ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ−ＰＣＲ）（米国特許第５，４１３，９０９号、同第５，８６１，２４５号）、ならびに核酸ベースの配列増幅（ＮＡＢＳＡ）（米国特許第５，４０９，８１８号、同第５，５５４，５１７号、および同第６，０６３，６０３号（これらは各々、参考として本明細書中に援用される）を参照のこと）が挙げられる。使用され得る他の増幅方法は、米国特許第５，２４２，７９４号、同第５，４９４，８１０号、同第４，９８８，６１７号、および米国特許出願第０９／８５４，３１７号（これらは各々、本明細書中に参考として援用される）において記載される。

さらなるサンプル調製方法および核酸サンプルの複雑度を減少するための技術が、Ｄｏｎｇら、ＧｅｎｏｍｅＲｅｓｅｒａｃｈ１１，１４１８（２００１）、米国特許第６，３６１，９４７号、同第６，３９１，５９２号、ならびに米国特許出願第０９／９１６，１３５号、同第０９／９２０，４９１号、同第０９／９１０，２９２号、および同第１０／０１３，５９８号に記載されている。

ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイを実施するための方法は、当該分野において充分に開発されている。ハイブリダイゼーションアッセイの手順および条件は、その適用に依存して変化し、そして公知の一般的結合方法に従って選択される。そのような公知の一般的結合方法としては、Ｍａｎｉａｔｉｓら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）；ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２，ＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９８７）；ＹｏｕｎｇおよびＤａｖｉｓｍ，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．８０：１１９４（１９８３）において言及される方法が挙げられる。反復的な制御されたハイブリダイゼーション反応を実行するための方法および装置が、米国特許第５，８７１，９２８号、同第５，８７４，２１９号、同第６，０４５，９９６号および同第６，３８６，７４９号、同第６，３９１，６２３号（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）に記載されている。

（例示的なアッセイ形式）
ＰＮＡＦＩＳＨを実施するための例示的な方法は、Ｏｌｉｖｅｉｒａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４０：２４７〜２５１（２００２）；Ｒｉｇｂｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４０：２１８２〜２１８６（２００２）；Ｓｔｅｎｄｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７：２７６０〜２７６５（１９９９）；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ４７：２８１〜２９２（２００１）において見出され得る。一方法に従って、サンプル（例えば、陽性血液培養物であるが、これに限定されない）の塗抹標本が、顕微鏡スライドガラス上で調製され、ハイブリダイゼーション緩衝液中にある１滴の蛍光標識ＰＮＡプローブでカバーされる。カバーガラスが、その塗抹標本上に配置されて均一な被覆が確保される。その後、そのスライドガラスは、５５℃のスライドガラス加温器またはインキュベーターに９０分間配置される。ハイブリダイゼーションの後、予熱したストリンジェントな洗浄溶液中にそのスライドガラスを浸漬することによって、そのカバーガラスは取り外される。そのスライドガラスは、３０分間洗浄される。その塗抹標本は、最終的には、１滴の封入液を用いて封入され、カバーガラスで覆われ、蛍光顕微鏡によって検査される。

本発明のキット中に含まれるＰＮＡプローブを用いて分析され得る、（必要に応じてサンプル中に存在する）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種が、数種の器具によって評価され得る。そのような器具は、例えば、顕微鏡（例えば、Ｏｌｉｖｅｉｒａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４０：２４７〜２５１（２００２）を参照のこと）、放射線感光フィルム（例えば、Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９０：１８０〜１８９（２００１）を参照のこと）、カメラおよびインスタントフィルム（例えば、Ｓｔｅｎｄｅｒら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ４２：２４５〜２５３（２０００）を参照のこと）、照度計（例えば、Ｓｔｅｎｄｅｒら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．４６：６９〜７５（２００１）を参照のこと）、レーザー走査デバイス（例えば、Ｓｔｅｎｄｅｒら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．４５：３１〜３９（２００１）を参照のこと）、またはフローサイトメーター（例えば、Ｗｏｒｄｏｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：２８４〜２８９（２０００）を参照のこと）であるが、これらに限定されない。自動スライドガラススキャナーおよびフローサイトメーターが、対象サンプル中に存在する微生物の数を迅速に定量するために特に有用である。

自己報告（ｓｅｌｆ−ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ）ＰＮＡプローブを使用してリアルタイムＰＣＲを実施するための例示的方法が、Ｆｉａｎｄａｃａら、Ａｂｓｔｒａｃｔ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ−Ｂａｓｅｄｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＤＮＡ／ＲＮＡ／ＰＮＡＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，Ｍａｙ１４−１６，２００１；およびＰｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、Ａｂｓｔｒａｃｔ，ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｎＥｍｅｒｇｉｎｇＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ，Ａｔｌａｎｔａ，２００２において見出され得る。

（ｄ．キット）
なお別の実施形態において、本発明は、アッセイを実施するために適切なキットに関する。このアッセイは、（必要に応じてサンプル中に存在する）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種を分析する。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の分析のために適切なＰＮＡプローブの一般的特徴および好ましい特徴が、本明細書中に上記されている。好ましいプロービング核酸塩基配列は、表１において列挙されている。さらに、サンプル中にあるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種を分析するためにＰＮＡプローブを使用するのに適切な方法が、本明細書中に上記されている。

本発明のキットは、サンプル中のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種を分析するために、１種以上のＰＮＡプローブと、アッセイを実施するようにかそうでなければ用いられるアッセイの実施を簡単にするように選択される、他の試薬もしくは組成物とを備える。好ましい実施形態において、上記キットは、独立して検出可能なＰＮＡプローブを使用してＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種とＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓとを同時分析するための、ＰＮＡプローブを備える。

（ｅ．本発明を使用するための例示的適用）
本発明のＰＮＡプローブ、方法、およびキットは、臨床サンプル（例えば、尿、血液、創傷、痰、咽頭スワブ、胃洗浄物、気管支洗浄物、生検、吸引物、吐出物（ｅｘｐｅｃｔｏｒａｔｅ））中、ならびに食物、飲料、水、薬学的製品、パーソナルケア製品、日用品、または環境サンプル、ならびにそれらの培養物において、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の分析のために特に有用である。好ましい実施形態において、上記ＰＮＡプローブは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓの分析のためのＰＮＡプローブも含むＰＮＡプローブセットにおいて適用される。

本発明の好ましい実施形態が記載されているが、本明細書中に記載される概念を組み込む他の実施形態が使用され得ることが、今や当業者にとって明らかになる。従って、これらの実施形態は、開示される実施形態に限定されるべきではなく、むしろ、添付の特許請求の範囲の精神および範囲によってのみ限定されるべきであると思われる。

（実施例１）
（蛍光インサイチュハイブリダイゼーションによるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の分析）
ＰＮＡプローブ：（配列番号）：配列
Ｓｅｐ１６Ｓ０１／ｔａｍｒａ：（配列番号５）：Ｔａｍｒａ−ＯＯ−ＧＣＴ−ＣＣＡ−ＡＡＴ−ＧＧＴ−ＴＡＣ
Ｓａｕ１６Ｓ０３／ｆｌｕ：Ｆｌｕ−ＯＯ−ＧＣＴ−ＴＣＴ−ＣＧＴ−ＣＣＧ−ＴＴＣ
（注記：このＰＮＡプローブの末端を示すために使用される従来の術語；Ｏ＝８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸；ｆｌｕ＝５（６）−カルボキシ−フルオレセイン；ｔａｍｒａ＝テトラメチル−６−カルボキシローダミン。配列識別番号（配列番号）が、コアのプローブ配列と、実験において合成しそして使用した実際のプローブとを区別するために、内部参照に与えられることもまた注意されたい。）
（細菌株）
参照株（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，（ＡＴＣＣ）Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）の一晩培養物、またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓを含む）に相当する臨床単離株の一晩培養物、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓの一晩培養物を、調製した。また、種の正体についての情報をもたないコアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣＮＳ）も含んだ。

（塗抹標本の調製）
各株について、テフロン（登録商標）コートした顕微鏡用スライドガラス（ＡｄｖａｎＤｘ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）の直径８ｍｍのウェルに、培養液１滴と１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むリン酸緩衝化生理食塩水１滴とを混合することにより、塗抹標本を調製した。その後、そのスライドガラスを、５５℃のスライドガラス加温器の上に２０分間配置した。その時点で、塗抹標本が乾燥した。その後、その塗抹標本を、９６％（ｖ／ｖ）エタノール中へ５分間〜１０分間浸漬することによって殺菌し、風乾した。

（蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ））
塗抹標本を、１滴のハイブリダイゼーション溶液（１０％（ｗ／ｖ）硫酸デキストラン、１０ｍＭＮａＣｌ、３０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％（ｗ／ｖ）ピロリン酸ナトリウム、０．２％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、０．２％（ｗ／ｖ）フィコール、５ｍＭＥＤＴＡ二ナトリウム塩、１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）ならびに５００ｎＭＳｅｐ１６Ｓ０１／ｔａｍｒａおよび／またはＳｔａ１６Ｓ０３／ｆｌｕを含む）で覆った。カバーガラスをその塗抹標本上に静置して、ハイブリダイゼーション溶液によって均一に被覆されていることを確実にした。その後、そのスライドガラスを、スライドガラス加温器（Ｓｌｉｄｅｍｏａｔ，Ｂｏｅｋｅｌ，Ｆｅａｓｔｅｒｖｉｌｌｅ，ＰＡ）に配置し、５５℃で９０分間インキュベートした。ハイブリダイゼーション後に、スライドガラス１枚当たり約２０ｍｌの予熱した２５ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ１０）、１３７ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭＫＣｌの中へ５５℃の水浴中でそのスライドガラスを浸漬することによって、そのカバーガラスを取り外し、そのスライドガラスを３０分間洗浄した。最後に、各塗抹標本を、１滴の封入剤（ＡｄｖａｎＤｘ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）を使用して顕微鏡標本作製し、各塗抹標本をカバーガラスにより被覆した。顕微鏡による検査を、ＦＩＴＣ／ＴｅｘａｓＲｅｄデュアルバンドフィルターセットを装備する蛍光顕微鏡を用いて行った。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種を、赤色蛍光球菌により同定し、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓを、緑色蛍光球菌として同定した。

（実施例２）
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の分析のためのＰＮＡプローブの評価）
この実験は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーションによるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の分析のための本発明のＰＮＡプローブの性能を試験するように設計した。方法およびプローブ混合物は、ＰＮＡプローブであるＳｔａ１６Ｓ０３を添加しなかったことを除いて、実施例１に記載されているとおりである。
（表２）

表２に関して、この表は、実施例２からのデータを示し、列１に種の識別を、列２にその培養物の供給源を、そして列３にｔａｍｒａ標識されたプローブであるＳｅｐ１６Ｓ０１からのシグナルを表す。表２の列３、行Ｃに関して、赤色蛍光シグナルは、Ｓｅｐ１６Ｓ０１が、最も一般的に存在するコアグラーゼ陰性ブドウ球菌種であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、ならびに同定されていないコアグラーゼ陰性ブドウ球菌にハイブリダイゼーションする（行Ｄ、行Ｅ）が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓにはハイブリダイゼーションしない（行Ｂ）ことを示す。従って、Ｓｅｐ１６Ｓ０１は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の分析に適している。

（実施例３：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種と、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓとの分析のためのＰＮＡプローブセットの評価）
この実験は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の混合物の分析のためのＰＮＡプローブを、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓの分析のためのＰＮＡプローブとともに含む、本発明のＰＮＡプローブセットの性能を試験するために設計した。上記２種のプローブを、それぞれ、ｔａｍｒａ（赤色）およびフルオレセイン（緑色）で標識した。ｔａｍｒａおよびフルオレセインは、ＦＩＴＣ／ＴｅｘａｓＲｅｄデュアルバンドフィルターを使用して同時に観察され得る。方法およびプローブ混合物は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓの臨床単離株を代表的非ブドウ球菌として含んだこと以外は、実施例１において記載されるとおりである。

（表３）

表３に関して、この表は、実施例３からのデータを示す。列１に種の識別を、列２に培養物の供給源を、列３に、ｔａｍｒａで標識したプローブであるＳｅｐ１６Ｓ０１またはｆｌｕで標識したプローブであるＳｔａ１６Ｓ０３からのシグナルを示す。表３の列３行Ｂに関して、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓの存在下で観察される蛍光シグナルは、緑色であり、これは、上記Ｓｔａ１６Ｓ０３プローブのハイブリダイゼーションを示す。同じ列の行Ｃにおいて、その蛍光シグナルは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ細胞の存在下では赤色であり、これは、上記Ｓｅｐ１６Ｓ０３プローブのハイブリダイゼーションを示す。列Ｄにおいて蛍光シグナルが存在しないことは、Ｓｔａ１６Ｓ０３プローブもＳｅｐ１６Ｓ０１プローブも、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ細胞にハイブリダイズしないことを示す。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓは、グラム陽性球菌であり、明視野顕微鏡によってブドウ球菌と類似する外観を有し、ブドウ球菌と混同される可能性があり得る。このデータはまた、同じ結果が、サンプルの供給源に関わらずにＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ細胞から得られ得る（列Ｂの臨床単離株、または列Ｅの血液培養ビン）ことを示す。これらの結果は、上記ＰＮＡプローブセットが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓと、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種との同時分析のために適切であることを示す。

（実施例４：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種とＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓとの混合培養物の分析）
この実験は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の混合物の分析のための本発明のＰＮＡプローブを、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓの分析のためのＰＮＡプローブとともに含むプローブセットを使用するという、利点を示すように設計した。これらの２種のプローブを、それぞれ、ｔａｍｒａ（赤色）およびフルオレセイン（緑色）で標識した。ｔａｍｒａおよびフルオレセインは、ＦＩＴＣ／ＴｅｘａｓＲｅｄデュアルバンドフィルターを使用して同時に観察され得る。方法およびプローブ混合物は、この実験の一部においてはＳｅｐ１６Ｓ０１プローブを使用しなかったこと以外は、実施例１において記載されるとおりである。

（表４）

^１．塗抹標本は、純粋単離株を混合することにより調製した。
^２．塗抹標本は、ＧＰＣＣ陽性血液培養ビンから直接調製した。

表４に関して、この表は、実施例４からのデータを示す。列１に種の識別を、列２に培養物の供給源を、列３において、ｔａｍｒａで標識したプローブであるＳｅｐ１６Ｓ０１またはｆｌｕで標識したプローブであるＳｔａ１６Ｓ０３からのシグナルを、列４においてはＳｔａ１６Ｓ０３プローブのみからのシグナルを、示す。表４の列３において観察され得るように、Ｓｅｐ１６Ｓ０１とＳｔａ１６Ｓ０３とのプローブセットを使用した場合、緑色蛍光球菌と赤色蛍光球菌との両方が、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓとＣＮＳとの混合培養物を検出した場合と同じ視野に存在した。表２の列Ｂと列Ｃとを比較することにより理解され得るように、サンプルの供給源は、その結果には影響を与えなかった。対照的に、Ｓｔａ１６Ｓ０３のみを使用した場合には緑色蛍光球菌のみが観察され、それによりＣＮＳの存在を欠いた（表４の列４を参照のこと）。

（実施例５：蛍光インサイチュハイブリダイゼーションによるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の分析）
ＰＮＡプローブ：（配列番号）：配列
ＣＮＳ３：（配列番号６）：Ｔａｍｒａ−ＯＯ−ＴＣＣ−ＴＣＧ−ＴＣＴ−ＧＴＴ−ＣＧＣ
ＣＮＳ４：（配列番号７）：Ｔａｍｒａ−ＯＯ−ＣＴＣ−ＣＴＴ−ＡＴＣ−ＴＧＴ−ＴＣＧ−Ｃ
ＣＮＳ５：（配列番号８）：Ｔａｍｒａ−ＯＯ−ＣＴＣ−ＣＴＴ−ＧＴＣ−ＴＧＴ−ＴＣＧ−Ｃ。

この実験は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種に対するＰＮＡプローブを試験するために設計した。方法およびプローブ混合物は、上記のｔａｍｒａで標識したＰＮＡプローブ、ＣＮＳ３、ＣＮＳ４、またはＣＮＳ５のうちのいずれか５００ｎＭからＰＮＡプローブ混合物がなったこと以外は、実施例１に記載されるとおりである。この実験におけるプローブすべては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種間でわずかに変化するｒＲＮＡ標的配列の系統学的に保存された領域に対する。これもまた実施例１とは異なるのは、同定されていないＣＮＳ細胞を省略し、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｈｏｍｉｎｉｓのＡＴＣＣ参照株の一晩培養物、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓのＡＴＣＣ参照株の一晩培養物、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓのＡＴＣＣ参照株の一晩培養物、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓのＡＴＣＣ参照株の一晩培養物を含めたことである。

（表５）

表５に関して、この表は、実施例５からのデータを示し、列１には種の識別を、列２にはＣＮＳ３プローブについての蛍光シグナルを、列３においてＣＮＳ４プローブを、そして列４においてＣＮＳ５プローブを示す。行Ｂの列２、列３および列４に関して、試験したどのプローブも、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓにおける赤色蛍光シグナルを生じない。対称的に、行Ｃ〜行Ｇに記載される種のすべてが、列２、列３、および列４において記載されるプローブを用いて検出した場合に、２つ以上の場合において赤色蛍光を示す。これらの結果は、プローブＣＮＳ３、プローブＣＮＳ４、およびプローブＣＮＳ５がすべて、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外の数種のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の検出のために個々に使用され得ることを示す。

（実施例６：蛍光インサイチュハイブリダイゼーションによるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の分析）
この実験は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ以外のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種のコホートに対するＰＮＡプローブ混合物を、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓの分析のためのＰＮＡプローブと一緒に試験するために設計した。方法およびプローブ混合物は、ＰＮＡプローブ混合物が、５００ｎＭのＳｔａ１６Ｓ０３（セットＡ）からなったか、または５００ｍＭＳｔａ１６Ｓ０３と、実施例５に記載される３種のｔａｍｒａで標識されたＰＮＡプローブ（ＣＮＳ３、ＣＮＳ４、およびＣＮＳ５）の各々とからなった以外は、実施例１に記載されるとおりである。この実験におけるプローブすべては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種間でわずかに変化するｒＲＮＡ標的配列の系統学的に保存された領域に対する。これもまた実施例１とは異なって、同定されていないＣＮＳ細胞を省略し、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｈｏｍｉｎｉｓのＡＴＣＣ参照株の一晩培養物、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓのＡＴＣＣ参照株の一晩培養物、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓのＡＴＣＣ参照株の一晩培養物、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓのＡＴＣＣ参照株の一晩培養物、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉのＡＴＣＣ参照株の一晩培養物、およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓのＡＴＣＣ参照株の一晩培養物を、含めた。

（表６）

表６に関して、この表は、実施例６からのデータを示す。列１に種の同定を示し、列２にセットＡプローブ混合物についての蛍光シグナルを示し、列３にセットＢプローブ混合物についての蛍光シグナルを示す。列２に関して、プローブセットＡの使用は、試験した細菌種のうちの２種（ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ）において緑色蛍光シグナルを生じ、試験した他の細菌においては、何の蛍光シグナルも生じない。列３において理解され得るように、プローブセットＢの使用は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓについて緑色蛍光シグナルを生じ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉについて赤色蛍光シグナルを生じた。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓについては、いずれのプローブセットを用いても蛍光シグナルは観察されなかった。

Ｓｔａ１６Ｓ０３プローブは、そのプローブと標的配列とが完全には相補的ではない（Ｏｌｉｖｅｉｒａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４０：２４７〜２５１（２００２））が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉと安定なハイブリッドを形成することが、上記の実験において実証された。プローブセットＡを用いた場合の緑色から、プローブセットＢを用いた場合の赤色への、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉの蛍光において観察される変化は、標的配列についてのプローブ間の競合を反映する。すべてのプローブは、類似する標的配列に対するが、ただ１つのプローブのみが、１回に標的配列に結合し得るので、最も安定なハイブリッドが形成される。この様式で、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉに対するＳｔａ１６Ｓ０３プローブの交差ハイブリダイゼーションは、セットＢ中に他のプローブを含めることによって防止される。

これらのデータは、ある１つの蛍光標識により種コホートを検出し、第二の蛍光標識を用いて単一種を検出する、プローブ混合物が作製され得ることを示す。この実験において試験するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種は、最も臨床的に適切であると考えられるが、本明細書中には含めていない他の実験は、他の多くのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種が、プローブセットＢを用いて検出され得ることを実証した。プローブセットＢを用いて試験したすべての種のうち、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓのみが、緑色蛍光シグナルを生じた。

本明細書中で引用されるすべての参考文献は、それが活字出版形態であろうと、電子媒体形態であろうと、コンピュータ読出し可能記憶媒体形態であろうと、他の形態であろうと、その全体が参考として明示的に援用される。その参考文献としては、要約、論文、雑誌、刊行物、教科書、学術論文、技術データシート、インターネットウェブサイト、データベース、特許、特許出願、および特許公開物が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の多くの実施形態が、記載されている。それにも関わらず、種々の実施形態が、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが、理解される。従って、他の実施形態が、特許請求の範囲の範囲内にある。

Claims

黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）以外の１種以上のブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の分析のためのＰＮＡプローブセットであって、
配列番号６を含むＰＮＡプローブ；
配列番号７を含むＰＮＡプローブ；および
配列番号８を含むＰＮＡプローブ；
を含む、ＰＮＡプローブセット。
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）以外の２種以上のブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の分析のためのＰＮＡプローブセットであって、
配列番号６を含むＰＮＡプローブ；
配列番号７を含むＰＮＡプローブ；および
配列番号８を含むＰＮＡプローブ；
を含む、ＰＮＡプローブセット。
請求項１〜２に記載のＰＮＡプローブセットであって、前記ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の標的配列は、ｒＲＮＡ、ｒＤＮＡ、またはｒＲＮＡの相補体もしくはｒＤＮＡの相補体である、ＰＮＡプローブセット。
請求項１〜２に記載のＰＮＡプローブセットであって、前記ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種は、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカスヘモリティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカスホミニス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｈｏｍｉｎｉｓ）、スタフィロコッカスルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、およびスタフィロコッカスサプロフィティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）からなる群より選択される、ＰＮＡプローブセット。
請求項１または２に記載のＰＮＡプローブセットであって、前記ＰＮＡプローブは、
ＴＣＣ−ＴＣＧ−ＴＣＴ−ＧＴＴ−ＣＧＣ（配列番号６）、
ＣＴＣ−ＣＴＴ−ＡＴＣ−ＴＧＴ−ＴＣＧ−Ｃ（配列番号７）、および
ＣＴＣ−ＣＴＴ−ＧＴＣ−ＴＧＴ−ＴＣＧ−Ｃ（配列番号８）
から選択される、ＰＮＡプローブセット。
請求項１または２に記載のＰＮＡプローブセットであって、前記ＰＮＡプローブは、長さが１５サブユニット〜１７サブユニットである、ＰＮＡプローブセット。
請求項１または２に記載のＰＮＡプローブセットであって、前記ＰＮＡプローブは、少なくとも１つの検出可能な部分で標識されている、ＰＮＡプローブセット。
請求項７に記載のＰＮＡプローブセットであって、前記検出可能な部分は、結合体、分枝型検出系、発色団、フルオロフォア、スピン標識、放射性同位体、酵素、ハプテン、アクリジニウムエステル、および発光化合物からなる群より選択される、ＰＮＡプローブセット。
請求項７に記載のＰＮＡプローブセットであって、前記ＰＮＡプローブは、自己報告プローブである、ＰＮＡプローブセット。
請求項９に記載のＰＮＡプローブセットであって、前記ＰＮＡプローブは、ＰＮＡＬｉｎｅａｒＢｅａｃｏｎである、ＰＮＡプローブセット。
請求項１または２に記載のＰＮＡプローブセットであって、前記ＰＮＡプローブは、標識されていない、ＰＮＡプローブセット。
請求項１１に記載のＰＮＡプローブセットであって、前記ＰＮＡプローブは、支持体に結合されている、ＰＮＡプローブセット。
請求項１または２に記載のＰＮＡプローブセットであって、前記ＰＮＡプローブは、スペーサーまたはリンカーをさらに含む、ＰＮＡプローブセット。
請求項１または２に記載のＰＮＡプローブセットであって、インサイチュハイブリダイゼーションが、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）以外の１種以上のブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の分析のために使用される、ＰＮＡプローブセット。
請求項１〜１４に記載のＰＮＡプローブセットであって、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）の分析のための少なくとも１つのＰＮＡプローブをさらに含む、ＰＮＡプローブセット。
請求項１５に記載のＰＮＡプローブセットであって、前記ＰＮＡプローブは、２種以上のブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の独立した分析のために別々に標識されている、ＰＮＡプローブセット。
請求項１５に記載のＰＮＡプローブセットであって、前記黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）の分析のための少なくとも１つのＰＮＡプローブは、請求項１〜１４に記載のＰＮＡプローブセットの１つ以上のＰＮＡプローブとは別々に標識されている、ＰＮＡプローブセット。
請求項１７に記載のＰＮＡプローブセットであって、前記黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）の分析のための少なくとも１つのＰＮＡのうちの１つの少なくとも一部は、ＧＣＴ−ＴＣＴ−ＣＧＴ−ＣＣＧ−ＴＴＣから選択される、ＰＮＡプローブセット。
請求項１〜１４に記載のＰＮＡプローブセットであって、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）以外の１種以上のブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の分析のための少なくとも１つのＰＮＡブロッキングプローブをさらに含む、ＰＮＡプローブセット。
請求項１９に記載のＰＮＡプローブセットであって、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）の分析のためのＰＮＡブロッキングプローブをさらに含む、ＰＮＡプローブセット。
請求項２０に記載のＰＮＡプローブセットであって、前記黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）の分析のためのＰＮＡブロッキングプローブのうちの少なくとも一部は、
ＴＣＣ−ＴＣＧ−ＴＣＴ−ＧＴＴ−ＣＧＣ（配列番号６）、
ＣＴＣ−ＣＴＴ−ＡＴＣ−ＴＧＴ−ＴＣＧ−Ｃ（配列番号７）、
ＣＴＣ−ＣＴＴ−ＧＴＣ−ＴＧＴ−ＴＣＧ−Ｃ（配列番号８）、
ＣＴＴ−ＣＴＣ−ＡＴＣ−ＴＧＴ−ＴＣＧ−Ｃ（配列番号９）、
ＴＣＣ−ＴＣＧ−ＴＣＣ−ＧＴＴ−ＣＧＣ（配列番号１０）、
ＴＣＣ−ＴＴＧ−ＴＣＣ−ＧＴＴ−ＣＧＣ（配列番号１１）、
から選択される、ＰＮＡプローブセット。
サンプル中にある黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）以外のブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の分析のための方法であって、該方法は、
ａ）請求項１〜１４に記載のＰＮＡプローブセットを、該サンプルと接触させる工程、
ｂ）該ＰＮＡプローブを、該サンプル中にある黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）以外のブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の標的配列に対してハイブリダイズさせる工程、および
ｃ）該ハイブリダイゼーションを検出する工程であって、該ハイブリダイゼーションの検出は、該サンプルにおける黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）以外のブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の存在、正体、および／または量を示す、工程、
を包含する、方法。
２種以上のブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の分析のための方法であって、該方法は、
ａ）請求項１〜１４に記載のＰＮＡプローブセットを、サンプルと接触させる工程、
ｂ）該ＰＮＡプローブを、該サンプルにあるブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の標的配列に対してハイブリダイズさせる工程、および
ｃ）該ハイブリダイゼーションを検出する工程であって、該ハイブリダイゼーションの検出は、該サンプルにおけるブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の存在、正体、および／または量を示す、工程、
を包含する、方法。
請求項２２〜２３に記載の方法であって、前記２種以上のブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）と、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）以外の１種以上のブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種とである、方法。
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）以外のブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種のコホートの分析のための、請求項２２〜２４に記載の方法。
請求項２５に記載の方法であって、前記検出される黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）以外のブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種のコホートは、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌である、方法。
請求項２２〜２６に記載の方法であって、前記プローブは、独立して検出可能であるか、非独立的に検出可能であるか、または独立して検出可能であるものと非独立的に検出可能であるものとの組み合わせであり、該プローブは、わずか一塩基だけ互いに異なり、該プローブは、系統的に関連する生物の部分的に保存された標的領域に対して相補的である、方法。
請求項２７に記載の方法であって、プローブまたはプローブセットが、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）特異的プローブと、スタフィロコッカスシュライフェリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ）標的との間の交差ハイブリダイゼーションを排除または減少するために使用される、方法。
請求項２２〜２８に記載の方法であって、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）と、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）以外の１種以上のブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種とが、同時かつ独立的に検出される、方法。
請求項２２〜２９に記載の方法であって、前記分析は、インサイチュで行われる、方法。
請求項３０に記載の方法であって、前記分析は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーションにより行われる、方法。
請求項２２〜２９に記載の方法であって、該方法は、標的配列を含む核酸を検出するために使用され、該核酸は、反応において合成または増幅されている、方法。
請求項３２に記載の方法であって、好ましい核酸合成反応または核酸増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、およびＱβレプリカーゼからなる群より選択される、方法。
請求項２２〜３３に記載の方法であって、該方法は、
非標的配列に対する前記ＰＮＡプローブのハイブリダイゼーションを減少または排除するために、少なくとも１つのブロッキングプローブを添加する工程、
をさらに包含する、方法。
請求項２２〜２９に記載の方法であって、前記標的配列は、表面に固定される、方法。
請求項２２〜２９に記載の方法であって、前記ＰＮＡプローブは、表面に固定される、方法。
請求項２２〜２９に記載の方法であって、前記ＰＮＡプローブは、アレイの一構成成分である、方法。
請求項２２〜３７に記載の方法であって、前記サンプルは、生物学的サンプルである、方法。
請求項３８に記載の方法であって、前記生物学的サンプルは、血液、尿、分泌物、汗、痰、糞便、粘液、またはそれらの培養物である、方法。
サンプルにおける黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）以外の１種以上のブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の分析のためのアッセイを実施するためのキットであって、該キットは、
ａ）請求項１〜１４に記載のＰＮＡプローブセット、および
ｂ）該アッセイを実施するために必要な他の試薬または組成物、
を備える、キット。
請求項４０に記載のキットであって、サンプル中に存在する、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）以外の１種以上のブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種と、少なくとも１種の他の微生物とが、独立して、検出、同定、および／または定量される、キット。
請求項４１に記載のキットであって、サンプル中に存在する、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）以外の１種以上のブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種と、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）とが、独立して、検出、同定、および／または定量される、キット。
請求項４０〜４２に記載のキットであって、サンプル中に存在する、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）以外の１種以上のブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種が、検出、同定、および／または定量され、抗菌剤に対する該ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種の感受性が、決定される、キット。
請求項４０〜４３に記載のキットであって、検出される黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）以外の１種以上のブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種は、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌である、キット。
請求項４０〜４４に記載のキットであって、該キットは、インサイチュハイブリダイゼーションにおいて使用される、キット。
請求項４５に記載のキットであって、該キットは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）以外の１種以上のブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種と黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）との、同時の独立的な同定のための蛍光インサイチュハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用される、キット。
請求項４０〜４４に記載のキットであって、該キットは、リアルタイムＰＣＲアッセイのために使用される、キット。
請求項４０〜４７に記載のキットであって、該キットは、臨床標本またはその培養物、あるいは臨床サンプルを検査するために使用される、キット。