JP2004518421A - 固体マトリックスから核酸分子を解放させるための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、固体マトリックスから核酸分子を解放させるための組成物および方法に関する。本発明はさらに、動物組織や植物材料などの生物材料から核酸分子を精製および単離するための組成物および方法に関する。本発明の方法は、複数の試料の迅速な処理に容易に適合させることができる。したがって本発明はさらに、数多くの試料から核酸分子を精製するための自動化法を提供する。本発明はまた、固体マトリックスから核酸分子を除去するためのキットにも関する。
Description
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、固体マトリックスから核酸分子を解放させるための組成物および方法に関する。本発明はさらに、動物組織や植物材料などの生物材料から核酸分子を精製および単離するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
集団内の数多くの個体および/または生物から得られる核酸分子試料を調製して解析することは多くの状況で望ましい。このような試料は、同じ地域または異なる地域に存在する個体の遺伝子型の判定に用いられることが少なくない。したがって試料の収集および解析は、集団内の個体の遺伝子型を判定する際に使用されることがある。このような解析を行うことで一般に、試料が由来する個体、および集団全体の両方に関連するデータが得られる。
【0003】
生物集団に由来する核酸分子を含む試料の収集および解析は、ウイルス、植物、および動物の集団の遺伝子型のデータを得るために行われることがある。集団内の多数の個体の遺伝子型解析が一般に行われる状況の一例では、ある地域における植物の遺伝子型に関するデータが考慮される。このようなデータは、特定の植物系統の拡散速度を決定する際に、または農業従事者に販売された種子から成長させた遺伝子組換え植物、または、このような種子から成長させた植物体の子孫を判定する際に得られる場合がある。
【0004】
いくつかの企業が現在、遺伝子組換え植物、およびこのような植物の種子を販売している。状況によっては、このような種子は、購入者(一般に農業従事者)が、購入した種子を成長させて得た植物体から得た種子から植物体を成長させる代わりに、種子をその供給者から再購入する条件で販売されている。さらにまた、一部の消費者団体ならびに政府機関は、遺伝子組換え植物から調製した農産物の販売に反対している。
【0005】
上述の個々の状況において、遺伝子型解析を行うことで遺伝子組換え植物か否かを判定することができる。このような解析は、農村地方で得られる多数の植物試料の収集から開始されることが多い。したがって、後に遺伝子型解析に使用可能な植物に由来する核酸分子を含む多数の試料の収集および簡便な保存を可能とする方法が求められている。
【0006】
他の状況では、遺伝子型解析は、動物(例えばヒト)に由来する試料を対象に行われ、これも各個体、または個体が集まった集団のいずれかに関連したデータが得られる。また動物または植物のいずれかに由来する試料を対象とした遺伝子型解析により、これらの生物に関連した成分に関連したデータが得られる場合がある。このような関連する成分の例には、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)などのウイルスが含まれる。特にHIV集団の遺伝子型解析は、ヒト血液試料から得られる核酸分子を用いて行うことができる。HIVがそのゲノムを変化させる速度は速いので、さまざまなウイルス系列の拡散および地域における優勢度を追跡するために遺伝子型解析が行われている。
【0007】
濾紙(例えばWhatman 3MM濾紙)の使用は、核酸分子(例えばRNA、プラスミド、ウイルスベクター、および染色体DNA)を含む試料を収集し、出荷し、また保存するための安価な方法である。これは特に、冷凍設備の整わない遠隔地で試料が採取される場合にあてはまる。
【0008】
血液試料の収集、出荷、および保存に用いる、濾紙をベースとした媒体の一例が、(i)一価の弱塩基;(ii)キレート化剤;(iii)陰イオン性界面活性剤;また選択的に(iv)尿酸または尿酸塩、を含浸させたセルロース材料を含むFTA(登録商標)紙である。FTA(登録商標)紙を使用することで、ヒトのゲノムDNAは例えば、細胞を紙と接触させることで溶解する、全血の乾燥スポットの状態で保存可能となる。室温で保存されたFTA(登録商標)紙上のゲノムDNAは少なくとも7.5年間は安定であることが報告されている(Burgoyneら、CONVENTIONAL DNA COLLECTION AND PROCESSING:DISPOSABLE TOOTHBRUSHES AND FTA(登録商標) PAPER AS A NON−THREATING BUCCAL−CELL COLLECTION KIT COMPATIBLE WITH AUTOMATABLE DNA PROCESSING、8th International Symposium on Human Identification、1997年9月17〜20日)。したがって核酸試料を濾紙(例えばFTA(登録商標)紙)上に保持することは、高価な冷凍庫に保管するガラスバイアルやプラスチックチューブと比較してコンパクトなアーカイブシステムとなる。
【0009】
血液スポットに由来するDNAは、複数の疾患に関連した遺伝子変異を判定する、新生児を対象としたスクリーニングプログラムに、また軍事関係者を同定する方法に用いられている(例えばSeltzerら、Biochem.Med.Metab.Biol. 46:105−109 (1991);Jinksら、Hum.Genet. 81:363−366 (1989);Skogerboeら、Clin.Chem. 37:454−458 (1991);McEwenら、Am.J.Hum.Genet. 55:196−200 (1994)を参照)。
【0010】
血液試料を乾燥濾紙上で保存することには、病原体を不活性化するいう別の利点がある。具体的には、HIVを始めとする数種の感染源は乾燥すると生存能を失うと考えられている。また核酸分子を含む、このような乾燥血液スポット、ならびに他の乾燥試料から得られる核酸分子は、メッセンジャーRNA (mRNA)の単離および逆転写に使用することもできる。
【0011】
細菌の核酸を濾紙上にスポットすることは、試料の保存および検索システムの一部として使用することもできる。RogersおよびBurgoyneは最近、FTA(登録商標)紙上に保存されたブドウ球菌(Staphylococcus)および大腸菌(Escherichia coli)の複数の細菌株の試料の特性をPCR−リボタイピング法で判定した(Rogersら、Anal.Biochem. 247:223 (1997))。
【0012】
濾紙に捕捉した核酸を解析する前に、洗浄段階を通常設け、安定化用の化合物(存在する場合)、および細胞由来の酵素反応阻害物質を除去する必要がある。DNAは、洗浄段階後に大部分が濾紙上に残るので、このような核酸を精製する操作は単純化され、また自動化に適している。
【0013】
FTA(登録商標)紙などの材料から核酸を解放させる複数の方法が開発されている。例えばBurgoyneは、ポリスチレンケース内の濾紙上に保存された精製プラスミドDNAが、尿酸溶液を用いることで回収可能なことを報告している(全体が参照として本明細書に組み入れられるBurgoyne、米国特許第5,496,562号)。核酸を解放させる別の方法には、水溶液中にキレート化剤を含む緩衝液が用いられる(例えば参照として本明細書に組み入れられる国際公開公報第99/39010号、国際公開公報第99/38962号、および国際公開公報第99/39009号を参照)。
【0014】
本発明は、現在当技術分野で用いられている方法と比較して比較的単純な、固体マトリックスからDNAを解放させる方法を提供する。また本発明の方法で解放されたDNAは、いくつかの過程(例えば遺伝子型解析)に直接使用することができる。
【発明の開示】
【0015】
発明の概要
本発明は、固体マトリックスから核酸分子(例えばDNA)を除去するための組成物および方法に関する。特に本発明の方法では、核酸分子の解放を促す解放性試薬が使用される。本発明はさらに、このような方法に関連する組成物を提供する。
【0016】
本発明は、核酸分子の精製法および/または単離法にも関する。
【0017】
1つの一般的な局面では、本発明は、1種または複数のアルカノールアミンを含む解放性試薬を固体マトリックスに接触させる段階を含む、固体マトリックスから核酸分子を除去する方法を提供する。
【0018】
別の一般的な局面では、本発明は、以下の段階を含む核酸分子の精製法および/または単離法を提供する:(a)核酸分子を固体マトリックスに、核酸分子が固体マトリックスに固着、付着、会合、および/または結合(共有結合的もしくは非共有結合的に)しやすい条件下で接触させる段階;ならびに(b)結合状態の核酸分子を含む固体マトリックスに、1種または複数のアルカノールアミンを含む解放性試薬を、固体マトリックスから核酸分子を解放させる条件下で接触させる段階。関連する局面では、本発明の方法は、固体マトリックスから解放された核酸分子を含む解放性試薬を回収する段階をさらに含む。
【0019】
特定の態様では、本発明の方法に使用される固体マトリックスは、1種もしくは複数の弱塩基、1種もしくは複数のキレート化剤、1種もしくは複数の陰イオン性表面活性剤、1種もしくは複数の陰イオン性界面活性剤、尿酸、および/または1種もしくは複数の尿酸塩などの、核酸分子の分解を防いだり抑えたりする化合物を含む。
【0020】
他の特定の態様では、本発明の方法に使用される固体マトリックスは、セルロースをベースとしたマトリックス、またはマイクロメッシュ状の合成プラスチックマトリックスである。本発明の特定の態様では、固体マトリックスは濾紙(例えばWhatman 3MM濾紙)、またはFTA(登録商標)紙のいずれかである。
【0021】
さらに他の特定の態様では、本発明の方法で使用される解放性試薬中に存在するアルカノールアミンはエタノールアミンを含む。特にエタノールアミンは、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、またはトリエタノールアミンの場合がある。
【0022】
関連する態様では、本発明の方法で使用される解放性試薬は、複数のエタノールアミン(例えば2種もしくは3種のエタノールアミン)を含む。
【0023】
ある態様では、本発明の方法で使用される解放性試薬は水溶液である。
【0024】
特定の態様では、本発明の方法で使用される解放性試薬のpHは約8.3〜約13、または約10〜約12の範囲である。本発明の特定の態様では、解放性試薬のpHは約11である。
【0025】
本発明の他の特定の態様では、1種または複数のアルカノールアミンが、解放性試薬中に約0.01%〜約5%(容積/容積)、約0.01%〜約3%(容積/容積)、約0.01%〜約1%(容積/容積)、または約0.1%〜約1%(容積/容積)の濃度で存在する。
【0026】
別の態様では、核酸分子を含む固体マトリックスを、約1〜約180分間、約1〜約120分間、約10〜約60分間、または約10〜約30分間かけて解放性試薬とインキュベートする。
【0027】
他の態様では、核酸分子を含む固体マトリックスを解放性試薬と約65℃〜約100℃、または約90℃〜約100℃でインキュベートする。
【0028】
ある態様では、本発明の方法は、解放された核酸分子を解放性試薬から分離する段階を含む。
【0029】
別の態様では、本発明の方法で固体マトリックスから解放された核酸分子は、ベクター(例えばプラスミド、人工染色体など)を含む。同様に、本発明の方法で固体マトリックスから解放された核酸分子は、細胞またはウイルスの核酸分子(例えば細胞またはウイルスのゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、葉緑体DNAなど)を含む場合がある。
【0030】
別の局面では、本発明は、本発明の方法で精製および/または単離された核酸分子を含む。特定の態様では、本発明の方法で精製および/または単離された核酸分子は、分子生物学的処理(例えばPCRによる増幅)に使用することができる。関連する局面では、本発明はさらに、本発明の方法で作製された核酸分子を導入する段階を含む、組換え宿主細胞を作製する方法に関する。
【0031】
別の局面では、本発明は、以下の段階を含む、RNAをDNAから分離する方法を提供する:(a)RNAおよびDNAを含む試料を固体マトリックスに接触させる段階;(b)(a)の固体マトリックスに洗浄液を、DNAを保持しながらRNAを十分除去する条件下(例えば固体マトリックスの1秒〜90分間の洗浄)で接触させる段階;および(c)1種または複数のアルカノールアミンを含む解放性試薬を、固体マトリックスからDNAを解放させる条件下で、洗浄後の固体マトリックスに接触させる段階。
【0032】
さらに別の局面では、本発明は、以下の段階を含む、閉環状核酸分子を直鎖状核酸分子から分離する方法を提供する:(a)閉環状核酸分子および直鎖状核酸分子を含む試料を固体マトリックスに接触させる段階;(b)(a)の固体マトリックスに洗浄液を、直鎖状核酸分子を保持しながら閉環状核酸分子を十分除去する条件下(例えば固体マトリックスの1秒〜90分間の洗浄)で接触させる段階;ならびに(c)1種または複数のアルカノールアミンを含む解放性試薬を、固体マトリックスから直鎖状核酸分子を解放させる条件下で、洗浄後の固体マトリックスに接触させる段階
【0033】
別の局面では、本発明は、以下の段階を含む、大きさを元に核酸分子を分離する方法をさらに提供する:(a)異なる大きさの核酸分子を含む試料を固体マトリックスに接触させる段階;(b)(a)の固体マトリックスに洗浄液を、大きい核酸分子を保持しながら小さい核酸分子を十分除去する条件下(例えば固体マトリックスの1秒〜90分間の洗浄)で接触させる段階;および(c)1種または複数のアルカノールアミンを含む解放性試薬を、固体マトリックスから、より大きい核酸分子を解放させる条件下で、洗浄後の固体マトリックスに接触させる段階。
【0034】
特定の態様では、本発明の方法で使用される洗浄液は、10 mM トリス−HCl、1 mM EDTA (pH 7.3)、水、またはFTA(登録商標) 精製用試薬(Purification Reagent)(Invitrogen Corp.、Life Technologies Division、カタログ番号10876−019)を含む。関連する特定の態様では、これらの洗浄液は、1種または複数の界面活性剤をさらに含む。
【0035】
他の特定の態様では、固体マトリックスを、約1秒間、約3秒間、約5秒間、約20秒間、約30秒間、約45秒間、約1分間、約5分間、約10秒間、および約30分間からなる群より選択される時間をかけて洗浄する。
【0036】
核酸分子を相互の大きさを元に分離する別の特定の態様では、平均サイズが約1kb〜約50kbの核酸分子を、平均サイズが約100kb〜約1,000kbの核酸分子から分離し;平均サイズが約50kb〜約100kbの核酸分子を、平均サイズが約250kb〜約500kbの核酸分子から分離し;または平均サイズが約50kb〜約100kbの核酸分子を、平均サイズが約1,000kb〜約4,000kbの核酸分子から分離する。
【0037】
本発明はさらに、核酸分子、固体マトリックス、および1種または複数のアルカノールアミンを含む解放性試薬を含む組成物を提供する。
【0038】
本発明はまた、本発明の方法を実施するための、ならびに本発明の組成物を調製するためのキットにも関する。したがって1つの一般的な局面では、本発明は、(1)本発明の1種または複数の解放性試薬、および(2)以下からなる群より選択される1種または複数の成分を含む、固体マトリックスから核酸分子を除去するためのキットを提供する:(a)少なくとも1種の固体マトリックス;(b)試料を固体マトリックスにアプライするための少なくとも1種の装置;(c)固体マトリックスを切断して、試料を含む切片にする少なくとも1種の装置;ならびに(d)少なくとも1種の洗浄液。
【0039】
特定の態様では、試料を固体マトリックスにアプライするための装置は、ピペット(例えばピペットマン(Pipetman)(商標) モデルP−2、P−10、P−20、P−100、P−200など、Rainin Instrument Company, Inc.、Rainin Road、Box 4026、Woburn、MA、01888)を含む。関連する態様では、試料を固体マトリックスにアプライするための装置(例えばピストンを用いる装置であるハンマーなど)によって、試料を粉砕して固体マトリックスの表面に押しつける。このような装置は、試料が植物から得られた材料を含む場合に特に有用である。別の関連する特定の態様では、試料をアプライするための装置は、複数の試料を固体マトリックスに一度にアプライすることができる。
【0040】
別の態様では、固体マトリックスを切片に切断する装置によって、さまざまな形状(例えば円形、正方形、長方形、不定形など)のマトリックスの小片が得られる。
【0041】
さらに別の特定の態様では、本発明のキットの洗浄液は、10 mM トリス−HCl、1 mM EDTA (pH 7.3)、水、またはFTA(登録商標) 精製用試薬(Purification Reagent)(Invitrogen Corp.、Life Technologies Division、カタログ番号10876−019)を含む。関連する特定の態様では、本発明のキットの洗浄液は、1種もしくは複数の界面活性剤をさらに含む。
【0042】
本発明の他の態様は、当技術分野で周知の知見、以下の図面、および本発明の説明、ならびに請求項を考慮して、当業者に明らかになると思われる。
【0043】
好ましい態様の詳細な説明
I.定義
以下の定義は、本発明の主題を明確にするために提供する。
【0044】
固体マトリックス:
本明細書で用いられる「固体マトリックス」という表現は、核酸分子が、セルロースをベースとした材料(例えばセルロースをベースとした濾紙)、およびマイクロメッシュ状の合成プラスチックマトリックスを含むがこれらに限定されない材料に固着し、(共有結合的もしくは非共有結合的に)結合し、付着し、および/または会合する、任意の固相支持体を意味する。このような材料の一例はFTA(登録商標)紙である(Fitzco Inc.、5600 Pioneer Creek Drive、Maple Plain、MN 55359 USA;Invitrogen Corp.、Life Technologies Division、9800 Medical Center Drive、Rockville、MD 20850 USA、カタログ番号10786−036)。他の例には、Schleicher and Schuellのグレード903、704E、402、404、および577の濾紙(Schleicher and Schuell、10 Optical Avenue、Keene、N.H. 03431 USA);Whatman BFC180、No.1、No.40、No.42、No.50、および3MM濾紙(Whatman International、Maidstone、Kent、UK);ニトロセルロース:ならびにセルロースアセテートなどがある。
【0045】
本発明の多くの態様では、使用される固体マトリックスは、セルロースをベースとした濾紙、または他の種類の濾紙(例えば植物繊維などのパルプ繊維から得られる層状集塊(laminar conglomerate))である。このような種類の固体マトリックスは、比較的安価で、また本発明の方法で通常良好に機能することから本質的に有用である。
【0046】
本発明の用途に適した固体マトリックスには、病原体(例えば単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルスなど)を不活性化するマトリックスが含まれる。この特徴は、固体マトリックスにアプライされる試料が、ヒト(例えば唾液、口腔スワブ、全血など)から得られる場合に特に有利である。
【0047】
固体マトリックスには、細胞の溶解を誘導する薬剤を含浸させることもできる。このような薬剤の例には、陰イオン性界面活性剤(例えばドデシル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム)、陽イオン性界面活性剤(例えば臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)、塩化セチルピリジニウム(CPC)、塩化ミリスチルトリメチルアンモニウム(MTAB)、塩化ジオクタデシルジメチルアンモニウム(DODMAC))、非イオン性界面活性剤(例えばツイーン(TWEEN) 80、トライトン(TRITON)X−100)、酵素、塩類、カオトロピック剤(例えば塩酸グアニジン)などがある。
【0048】
特定の態様では、固体マトリックスは、ガラス(例えば多孔性ガラスビーズ)、およびプラスチック(例えばポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ナイロンなど)を含む場合がある。
【0049】
本発明の用途に適した固体マトリックスは、ビーズ、フィルター、膜、シート、カラムなどの任意の形状または構造をとりうる。
【0050】
アルカノールアミン:
本明細書で用いられる「アルカノールアミン」という用語は、少なくとも1個のアミノ基、および少なくとも1個のアルコール基を含むC2−C50化合物を意味する。このような化合物の例には、N,N−ジメチルエタノールアミン、N−メチルジエタノールアミン、3−アミノプロピルジエタノールアミン、ジイソプロパノールアミン、N−メチルエタノールアミン、2−(ジブチルアミノ)エタノール、2−(ジイソプロピルアミノ)エタノール、2−(イソプロピルアミノ)エタノール、2−(プロピルアミノ)エタノール、2−(tert−ブチルアミノ)エタノール、2−ベンジルアミノエタノール、2−ブチルアミノエタノール、N−フェニルエタノールアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、およびトリエタノールアミン、ならびにさまざまなアルカノールアミンの混合物などがある。上記のアルカノールアミンは、Sigma−Aldrich Corporation(3050 Spruce Street、St. Louis、MO 63103 USA)などの業者から入手することができる。ある態様では、アルカノールアミンは、3−(シクロヘキシルアミノ)−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(CAPSO)、タンパク質、および/または分子量が100、150、200、250、300、350、400、450、または500を越える分子を含まない。
【0051】
解放性試薬:
本明細書で用いられる「解放性試薬」は、固体マトリックスからの核酸分子の解放を誘導する本発明の試薬を意味する。本発明の解放性試薬は、1種または複数のアルカノールアミンを含む。解放性試薬の他の特徴については後述する。
【0052】
核酸分子:
本明細書で用いられる「核酸分子」という表現は、DNAなどの、プリン塩基およびピリミジン塩基に連結されたリン酸とデオキシリボースが交互に出現する鎖を含む分子(例えばRNA、cDNA、ミトコンドリアDNA、葉緑体DNA、ゲノムDNA、二重微小染色体、人工染色体、染色体外因子、合成DNAなど)を意味する。核酸分子の代表例には、ベクター(例えばプラスミド、酵母人工染色体、哺乳類人工染色体、細菌人工染色体など)、ならびに原核生物、真核生物、およびウイルス(例えばエプスタイン・バーウイルス、1型ウシパピローマウイルス、アヒルB型肝炎ウイルス、マイコプラズマウイルスP1など)のゲノム核酸分子などがある。
【0053】
精製された:
本明細書で用いられる、生物分子(例えば核酸)に関して用いられる「精製された」という用語は、分子が周囲の分子群および/または材料から分離されることを意味する。したがって「精製された」とは、精製対象分子の近傍に存在する分子および/または材料に関する条件の変化に基づく相対的な用語である。したがって例えば、細胞溶解後に固体マトリックスに固着し、付着し、(共有結合的もしくは非共有結合的に)結合し、および/または会合するゲノム核酸分子は、少なくとも数種の細胞片、タンパク質、および/または糖質が洗浄段階で除去される場合に精製されたとみなされる。このような同じゲノム核酸分子は、固体マトリックスから本発明の方法で解放される場合にも精製される。この用語は、すべての除去対象物が精製対象分子から除去されることを意味することを意図しない。したがって、ある程度の量の混入物が、精製後の分子と共存する場合がある。
【0054】
実際の応用に関して、水、塩類、および緩衝物などの材料の濃度は、生物分子が精製されているか否かを判定する際には考慮されない。したがって一例として、カラムクロマトグラフィーで他の生物分子から分離されているが、同過程で水性緩衝液で希釈された状態にある核酸分子は未だ、クロマトグラフィーによる分離プロセスで精製された状態にあるとみなされる。
【0055】
単離された:
本明細書で用いられる、生物分子(例えば核酸)に用いられる「単離された」という用語は、分子が生物系(例えば細胞内)に結合していた場合に、分子の周囲に存在する実質的にすべての分子群および/または材料から分子が分離されていることを意味する。生物分子が精製されているか否かを判定する際には、水、塩類、および緩衝物などの材料の濃度は、生物分子が「単離されている」か否かを判定する際に考慮されない。
【0056】
平均サイズ:
本明細書で用いられる「平均サイズ」という表現は、集団中の少なくとも85%の分子の大きさが、この値の約±10%であることを意味する。例えば、この値が100kbで、集団中の90%の核酸分子が90〜110kbの範囲内にあるとき、集団の平均サイズは100kbである。同じことが、核酸分子集団の98%が90〜110kbの範囲内にあるときにあてはまることは言うまでもない。
【0057】
1種または複数:
本明細書で用いられる「1種または複数」という表現は、1種もしくは2種以上を意味する。当業者であれば理解するように、2種以上という意味は特定の文脈では変わる場合がある。例えば、1種または複数のエタノールアミンの用途について言う場合、当業者は、この表現が一定数のエタノールアミン、1種、2種、もしくは3種のエタノールアミン、またはこれらのエタノールアミンの混合物を意味すると認識すると思われる。しかし、1種または複数の核酸分子について言う場合、当業者であれば、このような分子の集団中に存在する場合がある核酸分子のさまざまな数から、「1種または複数」という表現が1種、2種、3種、4種、5種、10種、20種、30種、50種、100種、1,000種、または1,000,000種を意味すると理解すると思われる。したがって特定の状況では、「1種または複数」という表現は例えば、1種、2種、3種、4種、5種、10種、15種、20種、30種、50種、100種、200種、1,000種、2,000種、5,000種、10,000種、100,000、1,000,000種、5,000,000種、10,000,000種、50,000,000種、100,000,000種、1,000,000,000種などを意味する。
【0058】
ベクター:
本明細書で用いられる「ベクター」という用語は、宿主細胞内で自律的に複製する能力を有する核酸分子を意味する。ベクターは、このような分子が、本質的な生物学的機能を失うことなく切断されて、核酸分子内にスプライスされて複製およびクローニングが行われる少数のエンドヌクレアーゼ制限酵素切断部位を有することを特徴とする場合もある。ベクターの例には、プラスミド、自律複製配列(ARS)、セントロメア、コスミド、フォスミド、ファジミド、細菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、哺乳類人工染色体(MAC)などがある。ベクターはさらに、PCR用、転写および/または翻訳用のプライマー結合部位、および/または制御部位、組換えシグナル、レプリコンなどを提供する場合がある。またベクターは、これらのベクターで形質転換した細胞、またはトランスフェクトした細胞の同定における使用に適した、1種もしくは複数の選択可能なマーカー(例えばカナマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性などをもたらす核酸分子)をさらに含む場合がある。
【0059】
本発明の特定の態様では、「ベクター」という用語は、約50kb未満、約75kb未満、約100kb未満、約125kb未満、約150kb未満、約175kb未満、約200kb未満、または約250kb未満の核酸分子を含まない。本発明の他の特定の態様では、「ベクター」という用語はプラスミドを含まない。
【0060】
本発明によれば、任意のベクターを使用することができる。特に、当技術分野で周知で、また市販されているベクター(およびベクターの変異体または誘導体)を本発明で使用することができる。このようなベクターは例えば、Vector Laboratories Inc.、Invitrogen Corp.、Promega、Novagen、NEB、Clontech、Boehringer Mannheim、Pharmacia、EpiCenter、OriGenes Technologies Inc.、Stratagene、Perkin Elmer、Pharmingen、およびResearch Geneticsから入手することができる。このようなベクターは次に例えば、対象核酸分子のクローニングまたはサブクローニングに使用することができる。一般的なクラスの特定の対象ベクターには、原核生物および/または真核生物のクローニングベクター、発現ベクター、融合ベクター、ツーハイブリッドベクター、またはリバースツーハイブリッドベクター、異なる宿主に使用されるシャトルベクター、変異誘発ベクター、転写用ベクター、大きな挿入を取り込むベクターなどが含まれる。
【0061】
他の対象ベクターには、ウイルス起源のベクター(M13ベクター、バクテリオファージλベクター、バキュロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびレトロウイルスベクター)、コピー数の程度を高、中、低に調節可能なベクター、1種類の宿主の併用に互換性のあるレプリコンを有するベクター(pACYC184およびpBR322)、ならびに真核生物のエピソーム複製ベクター(pCDM8)などがある。
【0062】
試料:
本明細書で用いられる「試料」という用語は、核酸分子を含み、固体マトリックスにアプライされる材料を意味する。試料の例には、細菌細胞、細菌細胞ホモジネート、真菌細胞、原生生物細胞、プレートから得られるウイルスプラーク、塩化セシウム遠心法で単離されるウイルス材料(例えばDNAもしくはRNA)、ヒト口腔スワブ、ヒト血液、精製ヒト血液細胞、血液細胞ホモジネート、ならびに植物材料(葉、根、茎、および果実など)が含まれる。したがって「試料」という用語は、核酸分子を含み、固体マトリックスにアプライ可能な状態の任意の材料を含む。
【0063】
後述するように、固体材料は固体マトリックスに直接アプライすることが可能であるほか、このような材料の溶液もしくは懸濁物をアプライする前に調製することができる。
【0064】
保存:
本明細書で用いられる「保存」という用語は、試料がアプライされた固体マトリックスを一定期間維持することを意味する。固体マトリックスは例えば、一定の湿度で約20℃〜30℃で5年間保存することができる。低い保存温度は、約0℃〜20℃、−20℃〜0℃、および−80℃〜−20℃の場合がある。
【0065】
本明細書で用いられる、組換えDNA技術、ならびに分子生物学および細胞生物学の分野で用いられる他の用語は一般に、適用可能な分野の当業者であれば理解することができる。
【0066】
II.本発明の組成物および方法
上述したように、核酸分子が固着する、付着する、(共有結合的もしくは非共有結合的に)結合する、および/または会合する固体マトリックスは、当技術分野で、保存を含むさまざまな応用に使用されている。また、固体マトリックスに結合した状態の核酸分子は生化学反応(例えばPCR)に使用することができる。
【0067】
本発明は、固体マトリックスから核酸分子を除去するための新しい組成物および方法に関する。特に本発明の方法は、核酸分子を結合させる固体マトリックスに、1種もしくは複数(例えば1種、2種、3種など)のアルカノールアミンを含む溶液を接触させる段階に関する。
【0068】
1つの比較的具体的な局面では、本発明は、固体マトリックスから核酸分子を解放させるための、以下の過程および試薬に関する。水溶液中に核酸分子を含む試料を固体マトリックス(例えばWhatman 3MM濾紙、FTA(登録商標)紙など)上にスポットする。次に、試料を含む固体マトリックスを乾燥させる。乾燥した固体マトリックスを次に、1種または複数のアルカノールアミン(例えばエタノールアミン)を含む解放性試薬中に配し、30分間沸騰させる。結果として得られた溶液を次に室温まで冷却して固体マトリックスを除去する。この溶液を次に、50倍容のPCR緩衝液で希釈し、標準的なプロトコルで核酸分子をPCRで増幅する。
【0069】
エタノールアミンは、緩衝剤として使用されることの多いアルカノールアミン類の1種である。水素結合および疎水的相互作用が強いため、エタノールアミンは通常、室温で粘稠な液体である。またエタノールアミンは、OH基およびH+基に対して強い親和性を有する。エタノールアミンはまた、溶液中で数種の金属イオンと複合体を形成する。このような複数の特性のすべてによって、エタノールアミンは、固体マトリックスから核酸を解放させる優れた試薬と言える。
【0070】
エタノールアミンはpH 10あたりでかなりの緩衝能を示す。pH 10では、多くの固体マトリックスは、−COOH基、および−Si−OH基が存在するために負に帯電している。理論に拘泥されることは望まれないが、ある塩基性pHにおける固体マトリックスの負電荷は、核酸分子の荷電性表面からの解放を招くと考えられる。
【0071】
またエタノールアミンは、核酸分子と水素結合を介して強く相互作用すると考えられている。この相互作用は、固体マトリックスからの核酸分子の抽出を促すと考えられている。またエタノールアミンは、金属イオンを核酸分子と共有する場合がある。というのは両化合物とも、可溶性の金属イオン複合体を形成可能であるからである。これは、エタノールアミンと核酸分子の可溶性複合体の形成につながると考えられている。
【0072】
後述するように、任意の核酸分子を保存して、本発明の方法および組成物を用いて後に回収することができる。また核酸分子は、固体マトリックスと固着、付着、(共有結合的もしくは非共有結合的に)結合、および/または会合した後に、固体マトリックスから解放される能力を元に、他の材料から分離することができる。特に本発明の方法および組成物は、核酸分子(例えば染色体DNA、ベクター、ウイルスの核酸分子など)を固体マトリックス(例えばFTA(登録商標)紙、またはこの誘導体、バリアント、もしくは修飾物)に接触させ、解放性試薬を用いて放出させる単純かつ効率の良い過程に関する。また詳しく後述するように、解放された核酸分子は、これも解放性試薬で解放される他の細胞材料から分離することもできる。したがって本発明は、核酸分子を精製および/または同定する方法をさらに提供する。
【0073】
本発明の用途に適した固体マトリックスには、セルロースをベースとした吸収性のマトリックス(例えばセルロースをベースとした紙)、または合成プラスチック材料のマイクロメッシュ(参照として全体が本明細書に組み入れられる米国特許第5,496,562号に記載されているものなど)を含む固体マトリックスなどが含まれる。また固体マトリックスは、弱塩基、キレート化剤、陰イオン性表面活性剤、または陰イオン性界面活性剤、および選択的に、尿酸もしくは尿酸塩を含む組成物の場合がある。FTA(登録商標)紙およびこの誘導体、変形体、および修飾物は、このような固体マトリックスに含まれる。
【0074】
一般に、試料が短期間(例えば1か月未満など)の保存だけを意図される場合、固体マトリックスは通常、核酸分子を安定化させる薬剤(例えばキレート化剤、界面活性剤、および尿酸もしくは尿酸塩などの薬剤)を含まない。また試料が長期間(例えば1か月以上)の保存たけを意図される場合、固体マトリックスは、核酸分子を安定化させる薬剤を含む場合がある。
【0075】
本発明の用途に適した固体マトリックスは、任意の数の形状または状態の場合がある。例えば固体マトリックスは、平面シート、またはチューブ内に充填された状態の場合がある。多数の分離後の試料を使用する場合に、平面シート状の固体マトリックスを使用することは通常有利である。平面シート、およびチューブ内に充填された状態の固体マトリックスは、加圧、遠心、または重力を利用した試料および試薬の流れを用いる、核酸の精製および単離のプロトコルに使用することができる。
【0076】
本発明の組成物および方法は、(1)精製された核酸分子、または(2)核酸分子を含む粗調製物とともに使用することができる。したがって本発明は、核酸分子を試料(例えばヒト血液、植物細胞ホモジネート、葉、種子、細菌細胞、ウイルス、ウイルスプラークなど)から精製および/または単離する方法を提供する。
【0077】
本発明の用途に適した試料は数多くの供給源から得られる。本発明の用途に適した試料の供給源は、口腔スワブ、植物細胞抽出物、植物組織、種子、動物体液、動物組織、器官、細菌培養物、真菌培養物、原生動物培養物;およびウイルスプラークなどから得られる。
【0078】
上述したように、固体マトリックスにアプライされる1つの一般的な試料がヒト血液である。ヒト血液中に存在するDNAの大部分は、白血球のミトコンドリアDNAおよび核DNAである。例えば、ヒト血液をFTA(登録商標)紙にアプライすると血液細胞が溶解し、核酸分子が紙に固着し、多くの病原体が不活性化される。
【0079】
状況によっては、固体マトリックスは、これに結合した状態の核酸分子の分解を防ぎ、また病原体を不活性化する。このような機能を発揮させるために使用可能な多数の薬剤が当技術分野で周知であり、界面活性剤、キレート化剤、抗生物質、ならびに酵素(例えばプロテイナーゼ、リパーゼ、およびヌクレアーゼ)などが含まれる。
【0080】
固体マトリックスに使用される薬剤は一般に、後にマトリックスから解放される核酸分子の質を実質的に低下させない濃度で選択されたり使用されたりする。例えば固体マトリックスからDNAを回収したい場合、RNAを選択的に分解する薬剤でマトリックスを処理する。このような薬剤の例には、RNAseや強塩基などが含まれる。当技術分野で周知の通り、DNAとは異なりRNAはアルカリ条件下で加水分解を受ける。アルカリ条件は、多くの微生物の成長を阻害することも知られている。したがって固体マトリックスのpHは、RNAを分解するために、また微生物の成長を阻害するために調節することができる。
【0081】
本発明の解放性試薬を用いて核酸分子を解放させる前に、核酸分子が結合した状態の固体マトリックスを処理して、溶媒、界面活性剤、タンパク質、他の核酸分子(例えばDNAが対象となる場合はRNA)、塩類などを除去することができる。タンパク質を例えばFTA(登録商標)紙から除去する際に当技術分野で現在用いられている1つの方法はフェノール抽出法である(例えばBurgoyne、米国特許第5,496,562号を参照)。また水溶性化合物(例えば界面活性剤や塩類など)は、マトリックスを水溶液(例えば脱イオン水)で処理することで除去できる。同様に揮発性薬剤は、マトリックスを空気または真空に曝露することで除去できる。
【0082】
試料をアプライした後、核酸を解放させる前の固体マトリックスの処理は、特定の応用によって変わる。例えば試料がタンパク質や脂質などのかなりの量の混入物質を含む状況では、このような材料を除去したり分解したりする薬剤で固体マトリックスを処理することには利点がある場合がある。また上述したように、タンパク質は固体マトリックスからフェノール抽出法で、また選択的にEDTAなどの金属イオンキレート化剤を添加してフェノールを安定化させることで除去することができる(Perlmanによる米国特許第5,098,603号を参照)。同様に、脂質および他の疎水性分子は、有機溶媒もしくは界面活性剤(例えば陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、および非イオン性界面活性剤)で洗浄することで抽出することで除去できる。
【0083】
固体マトリックスは、存在する薬剤を試料添加前に除去するように処理することもできる。例えばFTA(登録商標)紙は、試料に含まれる細胞の溶解を促す界面活性剤を含む。状況によっては、核酸を解放させる前に界面活性剤を除去することが有利な場合がある。このような界面活性剤を除去する1つの方法では、FTA(登録商標)紙を水で洗浄する。特定の状況では、適切な他の洗浄液は、水のほかに10 mM トリス、1 mM EDTA (pH 7.3または8.0)、およびFTA(登録商標) 精製用試薬(Purification Reagent)(Invitrogen Corp.、Life Technologies Division、カタログ番号10876−019)を含む。
【0084】
本発明の方法は、大きさ、および/または種類(例えばRNAかDNAか、プラスミドDNAか染色体DNAか)などの物理的特性に基づいて核酸分子を分離する際にも用いることもできる。例えば大きい核酸分子は小さい核酸分子と比較して、固体マトリックスにより強く結合する。また核酸分子の大きさが増すと、このような分子は、より強く固体マトリックスに結合すると考えられる。したがって小さい核酸分子(例えばプラスミド)は、大きい核酸分子(例えば染色体DNA)より容易に固体マトリックスから除去される。またプラスミドなどの閉環状核酸分子は、洗浄段階で固体マトリックスから解放されることが少なくない。これは直鎖状核酸分子が閉環状核酸分子と比べて、固体マトリックスと強く結合すると考えられているためである。またDNAはRNAと比較して固体マトリックスと強く結合すると考えられている。
【0085】
上述したように、本発明は、一連の物理的特性の任意の1つを元に、核酸分子を他の核酸分子から分離する方法をさらに提供する。例えば本発明は1つの局面で、DNAとRNAの両方を含む試料を固体マトリックスに接触させる段階と、これに続く、洗浄液を固体マトリックスに接触させる段階を含む、DNAをRNAから分離する方法を提供する。固体マトリックスに結合したままの核酸分子(例えばDNA)は次に、洗浄後の固体マトリックスに本発明の解放性試薬を接触させることで解放させることができる。
【0086】
当業者であれば理解するように、例えばプラスミドDNAの場合は、試料を含む固体マトリックスを解放性試薬で、洗浄段階を分断することなく、または極めて短い洗浄段階(例えば約3秒間)処理することが有利な場合がある。また例えば真核生物のゲノムDNA(例えば植物細胞や動物細胞のゲノムDNA)の場合、試料を含む固体マトリックスを1種もしくは複数の洗浄液で洗浄すること、または解放性試薬をマトリックスに接触させる段階に先立つ段階が有利な場合がある。
【0087】
1つの局面では、本発明は、直鎖状核酸分子(例えば剪断された染色体DNA)を閉環状核酸分子(例えばプラスミド)から分離する方法を提供する。したがって本発明は、直鎖状核酸分子と閉環状核酸分子の両方を含む試料を固体マトリックスに接触させる段階と、これに続く、洗浄液を固体マトリックスに接触させる段階を含む、直鎖状核酸分子を閉環状核酸分子から分離する方法をさらに提供する。固体マトリックスに結合したままの核酸分子は次に、洗浄後の固体マトリックスに本発明の解放性試薬を接触させることで解放させることができる。
【0088】
また、より大きい核酸分子は、より小さい核酸分子と比較して強く固体マトリックスと結合するので、本発明は、大きさが異なる核酸分子を分離する方法をさらに提供する。したがって本発明は、より小さい核酸分子と、より大きい核酸分子の両方を含む試料を固体マトリックスに接触させる段階、およびこれに続く、洗浄液を固体マトリックスに接触させる段階を含む、より小さい核酸分子を、より大きい核酸分子から分離する方法をさらに提供する。固体マトリックスに結合状態で留まる核酸分子は次に、洗浄後の固体マトリックスに本発明の解放性試薬を接触させることで解放させることができる。
【0089】
洗浄条件は例えば、より大きい核酸分子をマトリックスに固着、付着、(共有結合的もしくは非共有結合的に)結合、および/または会合させたまま、特定の大きさの、より小さい核酸分子を解放を促すように調節することができる。調節可能な洗浄条件の一例が洗浄時間の長さである。例えば固体マトリックスは、洗浄液で約1秒間、約5秒間、約10秒間、約20秒間、約30秒間、約45秒間、約1分間、約2分間、約5分間、約10分間、約15分間、約20分間、約30分間、約45分間、約60分間、約75分間、または約90分間洗浄することができる。当業者であれば理解するように、さまざまな洗浄条件が、さまざまな大きさの核酸分子の解放に及ぼす作用は、例えばゲル電気泳動法で容易に調べることができる。したがって当業者であれば、特定の大きさの核酸分子を、洗浄して固体マトリックスから除去し、また特定の大きさの核酸分子を同マトリックスに結合させたままとするように、洗浄条件を容易に調節することができる。また上述したように、このようなマトリックスに会合状態で留まる核酸分子は、本発明の解放性試薬を用いて後にマトリックスから除去することができる。
【0090】
上述の「より大きい核酸分子」は、平均サイズが約50kbまたはこれ以上(例えば約50kb、約100kb、約150kb、約200kb、約250kb、約300kb、約350kb、約400kb、約450kb、約500kb、約600kb、約700kb、約800kb、約900kb、約1,000kb、約1,500kb、約2,000kb、約2,500kb、約3,000kb、または約4,000kb)の場合がある。また上述の「より小さい核酸分子」は、平均サイズが約50kb未満(例えば約1kb、約5kb、約10kb、約20kb、または約40kb)の場合がある。
【0091】
同様に、上述の「より大きい核酸分子」は、平均サイズが約150kbまたはこれ以上(例えば約150kb、約200kb、約250kb、約300kb、約350kb、約400kb、約450kb、約500kb、約600kb、約700kb、約800kb、約900kb、約1,000kb、約1,500kb、約2,000kb、約2,500kb、約3,000kb、または約4,000kb)の場合があり、また上述の「より小さい核酸分子」は、平均サイズが約150kb未満(例えば約1kb、約5kb、約10kb、約20kb、約40kb、約80kb、約100kb、約120kb、または約140kb)の場合がある。
【0092】
また、上述の「より大きい核酸分子」は、平均サイズが約250kbもしくはこれ以上(例えば約250kb、約300kb、約350kb、約400kb、約450kb、約500kb、約600kb、約700kb、約800kb、約900kb、約1,000kb、約1,500kb、約2,000kb、約2,500kb、約3,000kb、または約4,000kb)の場合があり、また上述の「より小さい核酸分子」は、平均サイズが約250kb未満(例えば約1kb、約5kb、約10kb、約20kb、約40kb、約80kb、約100kb、約120kb、約140kb、約160kb、約180kb、約200kb、約220kb、または約240kb)の場合がある。
【0093】
また上述の「より大きい核酸分子」は、平均サイズが約500kbもしくはこれ以上(例えば約500kb、約600kb、約700kb、約800kb、約900kb、約1,000kb、約1,500kb、約2,000kb、約2,500kb、約3,000kb、または約4,000kb)の場合があり、また上述の「より小さい核酸分子」は、平均サイズが約500kb未満(例えば約1kb、約5kb、約10kb、約20kb、約40kb、約80kb、約100kb、約120kb、約140kb、約160kb、約180kb、約200kb、約220kb、約240kb、約250kb、約300kb、約350kb、約400kb、または約450kb)の場合がある。
【0094】
また、上述の「より大きい核酸分子」は、平均サイズが約1,000kbもしくはこれ以上(例えば約1,000kb、約1,500kb、約2,000kb、約2,500kb、約3,000kb、または約4,000kb)の場合があり、また上述の「より小さい核酸分子」は、平均サイズが約1,000kb未満(例えば約1kb、約5kb、約10kb、約20kb、約40kb、約80kb、約100kb、約120kb、約140kb、約160kb、約180kb、約200kb、約220kb、約240kb、約250kb、約300kb、約350kb、約400kb、約450kb、約500kb、約550kb、約650kb、約750kb、約850kb、または約950kb)の場合がある。
【0095】
また本発明の方法で用いられる解放性試薬が、固体マトリックスから除去されることが望まれる実質的な量の細胞混入物、または核酸分子を可溶化しない場合は、固体マトリックスの中間処理(例えば洗浄)が、解放性試薬による処理を行う前に必要な場合がある。このような状況の一例が、試料を種子材料から得る場合である。種子は多量の糖質を含む。本発明の解放性試薬では、固体マトリックスから実質的な量の種子糖質は解放されない。したがって試料が種子材料を含む多くの場合は、試料を固体マトリックスに直接アプライした後に、中間処理を行うことなく解放性試薬で処理することができる。結果として固体マトリックスから核酸分子が解放され、種子糖質の大部分はマトリックスに結合した状態で留まる。
【0096】
本発明の解放性試薬は水性または非水性の場合がある。当業者であれば理解するように、解放性試薬の用途に適したさまざまなアルカノールアミンは、水溶液と非水溶液中で異なる溶解性を示す。また溶媒系の選択は、特定の応用、試料、および固体マトリックスによって変わる場合がある。本発明の解放性試薬に使用可能な非水性溶媒の例には、エタノール、メタノール、プロパノール、ブタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド(DMSO)、およびN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)などが含まれる。
【0097】
本発明の方法の1つの特定の態様では、核酸分子を結合させる2 mmのFTA(登録商標)紙のパンチを、1% モノエタノールアミンの水溶液(pH 11.0)を含む解放性試薬中に90〜100℃で20分間浸す。この態様では、実施例2で詳述するように、実質的な量の核酸分子がFTA(登録商標)パンチから解放される。当業者であれば理解するように、このような方法は、特定の応用に適するように修正することができる。したがって1つの一般的な局面では、本発明は、特定の条件下で一定の期間、アルカノールアミンを含む溶液を固体マトリックスに接触させる段階を含む、固体マトリックスから核酸分子を除去する方法に関する。
【0098】
特定の態様では、解放性試薬中のアルカノールアミン(例えばエタノールアミン)の濃度は、約0.01%〜約5.0%(容積/容積)、約0.01%〜約4.0%(容積/容積)、約0.01%〜約3.0%(容積/容積)、約0.01%〜約2.0%(容積/容積)、約0.01%〜約1.0%(容積/容積)、約0.01%〜約0.9%(容積/容積)、約0.01%〜約0.8%(容積/容積)、約0.01%〜約0.5%(容積/容積)、約0.1%〜約5.0%(容積/容積)、約0.1%〜約4.0%(容積/容積)、約0.1%〜約3.0%(容積/容積)、約0.1%〜約2.0%(容積/容積)、約0.1%〜約1.0%(容積/容積)、約0.1%〜約0.9%(容積/容積)、約0.1%〜約0.8%(容積/容積)、約0.1%〜約0.5%(容積/容積)、約0.2%〜約5.0%(容積/容積)、約0.2%〜約4.0%(容積/容積)、約0.2%〜約3.0%(容積/容積)、約0.2%〜約2.0%(容積/容積)、約0.2%〜約1.0%(容積/容積)、約0.2%〜約0.9%(容積/容積)、約0.2%〜約0.8%(容積/容積)、約0.2%〜約0.5%(容積/容積)、約0.4%〜約5.0%(容積/容積)、約0.4%〜約4.0%(容積/容積)、約0.4%〜約3.0%(容積/容積)、約0.4%〜約2.0%(容積/容積)、約0.4%〜約1.0%(容積/容積)、約0.4%〜約6.9%(容積/容積)、約0.4%〜約0.8%(容積/容積)、約0.4%〜約0.7%(容積/容積)、約0.8%〜約5.0%(容積/容積)、約0.8%〜約4.0%(容積/容積)、約0.8%〜約3.0%(容積/容積)、約0.8%〜約2.0%(容積/容積)、または約0.8%〜約1.0%(容積/容積)である。本発明は、約0.01%(容積/容積)、約0.1%(容積/容積)、約0.2%(容積/容積)、約0.4%(容積/容積)、約0.7%(容積/容積)、約0.8%(容積/容積)、約0.9%(容積/容積)、約1.0%(容積/容積)、約1.1%(容積/容積)、約1.2%(容積/容積)、約1.4%(容積/容積)、約1.6%(容積/容積)、約1.8%(容積/容積)、約2.0%(容積/容積)、約2.5%(容積/容積)、約3.0%(容積/容積)、約3.5%(容積/容積)、約4.0%(容積/容積)、約4.5%(容積/容積)、または約5.0%(容積/容積)を含む解放性試薬をさらに含む。
【0099】
使用されるアルカノールアミンの濃度は、特定のアルカノールアミン、試料中に存在する非核酸化合物の溶解度、解放性試薬のpH、インキュベーション条件(例えばインキュベーション時間の長さ、およびインキュベーション温度)、ならびに使用される固体マトリックスを含む因子の数によって変わる。当業者であれば、特定の応用に適したアルカノールアミン濃度の決定法を理解すると思われる。同様に当業者であれば、特定の応用に適したアルカノールアミンの選択法を理解すると思われる。
【0100】
本発明の解放性試薬のpHは例えば以下の範囲とすることができる:約8.0〜約14.0、約8.5〜約14、約9.0〜約14.0、約9.5〜約14.0、約10.0〜約14.0、約10.5〜約14.0、約11〜約14.0、約7.5〜約13.5、約7.5〜約13.0、約7.5〜約12.5、約7.5〜約12.0、約7.5〜約11.5、約7.5〜約11.0、約7.5〜約10.5、約7.5〜約10.0、約7.5〜約9.5、約8.0〜約12.0、約8.0〜約11.5、約8.0〜約11.0、約8.5〜約14.0、約8.5〜約13.0、約8.5〜約12.5、約8.5〜約12.0、約8.5〜約11.5、約8.5〜約11.0、約9.0〜約12.0、約9.0〜約11.5、約9.0〜約11.0、および約9.0〜約10.5。本発明は、pHが約8.0、約8.5、約9.0、約9.5、約10.0、約10.5、約11.0、約11.5、約12.0、約12.5、約13.0、約13.5、または約14.0の解放性試薬をさらに含む。
【0101】
本発明の用途に適したアルカノールアミンは緩衝剤として作用しうる場合がある。したがって条件によっては、本発明の実施に使用されるアルカノールアミンを溶媒(例えば水)で希釈し、酸または塩基で直接pHを調整することができる。他の状況では、解放性試薬中に緩衝剤(例えばトリス、2−[(トリス(ヒドロキシメチル)メチル)アミノ]−1−エタンスルホン酸(TES)、メチルアミン、CAPS、4−シクロヘキシルアミノ)−1−ブタンスルホン酸(CABS)、2−(N−シクロヘキシルアミノ)エタンスルホン酸(CHES)、トリシン(Tricine)、またはビシン(Bicine))を含めることが求められたり、望ましい場合があったりする。本発明の解放性試薬の用途に適した緩衝剤は、Sigma−Aldrich Corporation(3050 Spruce Street、St. Louis、MO 63103 USA)などの業者から入手することができる。
【0102】
本発明の方法は、固体マトリックスを解放性試薬とさまざまな温度で、またさまざまなインキュベーション時間でインキュベートすることで実施できる。例えばインキュベーションは、約65℃〜約100℃、約70℃〜約100℃、約80℃〜約100℃、約90℃〜約100℃、約65℃〜約90℃、約70℃〜約90℃、約80℃〜約90℃、約65℃〜約80℃、または約70℃〜約80℃の温度範囲で実施することができる。またインキュベーションは、約65℃、約70℃、約75℃、約80℃、約85℃、約90℃、約95℃、または約100℃などの温度で実施することができる。
【0103】
上述したように、核酸を解放させることが望まれる固体マトリックスは、解放性試薬とさまざまな時間インキュベートすることができる。当業者であれば理解するように、長いインキュベーション時間は、解放性試薬中の核酸分子の濃度と、固体マトリックスに結合状態の核酸分子の濃度が平衡に至るまで核酸分子の解放をもたらす。
【0104】
固体マトリックスは解放性試薬と、1〜60分間、5〜50分間、10〜40分間、20〜30分間、20〜40分間、30〜50分間、40〜60分間、または40〜90分間などのさまざまな時間インキュベートすることができる。またインキュベーションは、約1分間、5分間、10分間、15分間、20分間、25分間、30分間、35分間、40分間、45分間、50分間、55分間、60分間、65分間、70分間、75分間、80分間、85分間、90分間、120分間、180分間、または240分間実施することができる。このようなインキュベーション時間は、シート状の固体マトリックスから核酸分子を放出させる場合に有用な場合が少なくない。
【0105】
インキュベーション時間の長さが特定の条件で変わることは言うまでもない。比較的長いインキュベーション時間(例えば8時間、1日間、2日間、3日間、5日間、7日間)が望ましい条件の例には、固体マトリックス上の核酸分子の濃度が低く、アルカノールアミン濃度が低く(例えば0.1%のエタノールアミン)、および/またはインキュベーション時間が短い(例えば70℃またはそれ以上)といった条件が含まれる。
【0106】
また、インキュベーション時間の長さを始めとする他のインキュベーション条件は、試料に含まれる核酸分子の特定の量またはパーセンテージが解放性試薬中に解放されるように変えることができる。例えばインキュベーション条件は、固体マトリックス上に存在する核酸の0.5%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%が解放性試薬中に解放されるように調節することができる。当業者であれば、特定の応用に適したインキュベーション条件を決定する方法を理解すると思われる。
【0107】
本発明の方法の用途に適したチューブ状/カラム状の固体マトリックスは例えば以下の属性を有する。固体マトリックスは、チューブ内に、その一端から別の端にかけて、一端(先端)の空間に試料が収容されるように配することができる。このような態様では、固体マトリックスは一般にチューブ内において側壁から側壁へ広がる。したがって、チューブを通過する液体の大部分は、必然的に固体マトリックスを通過することになる。このような状況では、固体マトリックスおよびチューブは、クロマトグラフィーに使用されるカラムに似た構造をとる場合がある。したがって、このような固体マトリックス/チューブフォーマットは、「固体マトリックスカラム」と呼ばれる。上述したように固体マトリックスは、このようなカラム内に密な状態または緩い状態で充填される場合がある。
【0108】
本発明の平面シートの態様に関しては、固体マトリックスカラムにアプライされた試料を、上述の溶液で洗浄することができる。また、固体マトリックスカラムからの核酸分子の解放は、解放性試薬をカラムに通すことで誘導することができる。本発明の1つの特定の局面では、固体マトリックスカラム中のマトリックスを室温で洗浄して混入物質を除去する。次にカラムの底に栓をして液体が漏れないようにし、カラムを95℃で加熱した後に、解放性試薬(これも90℃に加熱)をカラムに注入する。カラムの底の栓を十分な時間開放して、解放性試薬をカラム内に行き渡らせてから再び栓を閉める。30分間の95℃におけるインキュベーション後に、カラムの栓を再び外して、解放性試薬を核酸分子とともにカラムから排出させる。具体的な1つの局面では、固体マトリックスカラムは、遠心装置内に収容可能なスピンカラムであり、解放性試薬をカラムから遠心除去する。
【0109】
当業者であれば理解するように、インキュベーション条件は、上述のインキュベーション条件と同様に変えることができる。また特定のインキュベーション時間も、試料、固体マトリックスから解放される核酸分子、および固体マトリックスそのものによって変わる。当業者であれば、特定の応用に適したインキュベーション条件を決定する方法を理解すると思われる、
【0110】
固体マトリックスから解放された核酸分子は、核酸合成、制限酵素による切断、ハイブリダイゼーション反応、他の核酸分子との連結、配列決定、増幅(例えばPCR)、形質転換、およびトランスフェクションなどの、1つもしくは複数の標準的な分子生物学的方法で使用することができるほか、操作することができる。一般に、解放された核酸分子は、別の溶媒(例えばトリス−EDTA)で希釈して、意図した用途(例えばPCR)に適した解放核酸分子/可溶化核酸分子とした後に使用される。
【0111】
本発明の組成物および方法は、固体マトリックスから比較的低塩量の溶液中へ核酸分子が解放されるように設計することができる。また上述したように、核酸分子を含む解放性試薬の塩濃度は、希釈することで低下させることができる。塩含量が望ましい量と比較して高い状況では、核酸分子を標準的な方法で使用前に脱塩処理することができる(例えば核酸分子をアルカノールアミンから分離することができる)。
【0112】
本発明は、本発明の方法で調製された核酸分子を含む組換え宿主細胞、ならびにこのような核酸分子を含む組換え宿主細胞の調製法をさらに提供する。適切な宿主の代表例には、細菌細胞(例えば大腸菌、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、真菌細胞(例えば出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)、アカパンカビ(Neurospora crassa))、昆虫細胞(例えばショウジョウバエ(Drosophila)S2細胞、スポドプテラ(Spodoptera)Sf9細胞)、動物細胞(例えばCHO細胞、COS細胞、Bowesメラノーマ細胞)、および植物細胞などがある。上述の宿主細胞の適切な培地および培養条件は当技術分野で周知である。
【0113】
本発明の方法で調製された核酸分子は、標準的な実験マニュアル(例えばSambrook、J.ら編、MOLECULAR CLONING、A LABORATORY MANUAL、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y. (1989)、第9章;Ausubel、F.ら編、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、John H. Wiley & Sons, Inc.(1997)、第16章を参照)に記載された、エレクトロポレーション、DEAE−デキストランによるトランスフェクション、トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン性脂質によるトランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレイプローディング(scrape loading)、微粒子銃による導入、および感染などを含む方法で宿主細胞に導入することができる。核酸分子を宿主細胞に導入する方法は例えば、Felgnerら、米国特許第5,580,859号に記載されている。
【0114】
本発明の方法で調製される核酸分子は、ベクター配列の染色体への組込みを可能とする遺伝因子を含む場合もある。このような因子は、異種配列の安定な維持に有用であり、部位特異的な組込み、および部位に依存しない組込みの両方をもたらす配列を含む。部位特異的な組込み(例えば相同的組込み)、および部位に依存しない組込み(「ランダムな組込み」と呼ばれることもある)は、異種対象配列の宿主細胞染色体への導入に用いることができる。遺伝材料の真核生物の染色体への挿入に関する記述および方法は例えばSambrook, J.ら編(MOLECULAR CLONING、A LABORATORY MANUAL、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y. (1989))を始めとする多くの情報源に記載されている。
【0115】
III.試料処理の自動化
本発明は、個々の個々の試料からの核酸分子の精製および/または単離に加えて、いくつかの応用に適した組成物、方法、および試薬を提供する。このような応用の一例は、集団の構成要素を代表する試料の収集物に由来する核酸分子の精製および/または単離である。
【0116】
1つの態様では、プレート上にウイルスプラーク(例えばT4ファージのプラーク)を含む試料を固体マトリックスに移す。特定の応用では、次に固体マトリックスを、後に使用するまで保存するか、または解放性試薬で処理して、ウイルスの核酸分子を解放させる。多くの場合、固体マトリックスを、さまざまな核酸分子を含む切片に切断する。固体マトリックスの断片化はランダムな場合があるほか、例えば特定のウイルスプラークに対応する核酸分子を含む個々の小片を生じる場合がある。
【0117】
同様に、さまざまな非ウイルス供給源に由来する試料を固体マトリックスに移して、個々の核酸分子の調製に使用することができる。例えば、さまざまな核酸分子を含む試料(例えば細菌培養物)を96ウェルプレート(例えば96ウェルマイクロプレート(96 well MicroPlate)の各ウェル内で調製することができる。このような試料の一部を次にDNAカードレジストレーションツール(DNA Card Registration Tool)(カタログ番号VP382CS)、およびスロットピンスポッター(Slot Pin Spotter)(カタログ番号VP408S5)(V&P Scientific, Inc.、9823 Pacific Heights Boulevard、Suite T、San Diego、CA 92121 USAから入手可能)を用いて固体マトリックスに移すことができる。この装置を用いて、96試料ウェルのそれぞれから5 μlをFTA(登録商標) クローンセーバー96カード(CloneSaver 96 Card)(Invitrogen Corp.、Life Technologies Division、9800 Medical Center Drive、RockviIIe、MD 20850 USAから入手可能)に一度に移すことができる。選択的に色素(例えばブロモフェノールブルー)を各試料ウェルに添加して、FTA(登録商標) クローンセーバー96カード(CloneSaver 96 Card)へアプライした後に試料位置をマークすることができる。
【0118】
FTA(登録商標) クローンセーバー96カード(CloneSaver 96 Card)などの固体マトリックスに試料をアプライしたら、固体マトリックスを小片に切断して、各試料がアプライされたマトリックスの部分を分離する。試料が特定のパターンでアプライされた状況(例えばDNAカードレジストレーションツール(DNA Card Registration Tool)、スロットピンスポッター(Slot Pin Spotter)、およびFTA(登録商標) クローンセーバー96カード(CloneSaver 96 Card)が上述のように使用される状況)では、各試料を分離するために固体マトリックスを切断するための装置を容易に設計することができる。FTA(登録商標) クローンセーバー96カード(CloneSaver 96 Card)を例にとると、試料を含む96か所の一部もしくは全体に対応するカードの部分にパンチを開けるように装置を設計することができる。このような各カード片を次に96ウェルプレートの各ウェル内に配し、さまざまな試薬で処理して混入物質を除いて核酸分子を解放させる。例えば試薬(例えば洗浄液)は、各ウェルに添加した後に吸引除去することができる。また解放性試薬を各ウェルに添加後に、吸引除去して別の容器に移すことができる。これに代わる1つの方法として、固体マトリックス(例えばカード片)を、インキュベーション後にウェルから除去して核酸分子を残すことができる。別の代替法として、固体マトリックスを、解放された核酸分子とともにウェル内に残すことができる。最適な作用過程は、核酸分子が使用される特定の応用によって変わる。
【0119】
本発明の自動化法の1つの特定の応用は、PCRによる核酸分子の高スループットの増幅と、これに続く増幅産物の配列決定である。系は、固体マトリックスにアプライされる各試料が、さまざまな核酸分子を含む細胞またはプラークを含むように設計することができる。
【0120】
また、本発明の組成物および方法で核酸分子を解放することができる核酸試料は、利便性を考慮して調製、保存、および販売するか、または本発明の方法で使用するために個人もしくは組織に移される場合がある。
【0121】
本発明の他の特定の態様では、ロボットシステムで、試料を用いた遺伝子型の判定に必要な本質的にすべての段階を行うことができる。このような応用では、96個の試料を収容して、補強用基材を有するように設計された試料カードを使用することができる。このような補強用基材は、カードの耐久性を増すことで、ロボットシステムによるカードの取扱いが容易になる点で有利である。液体ハンドリングシステムは、試料カード(例えばFTA(登録商標) クローンセーバー96カード(CloneSaver 96 Card))上のおおよその位置に試料(例えば各5 μl)を含む液体を蓄積するために使用される。試料を乾燥させた後に、同じ装置または別の装置が、各試料を含む、カードの部分を切断する(例えば2 mmの円がカードから打ち抜かれる)。このようなカードの部分は次に、同装置によって96ウェルプレートのウェル内に配される。試薬は、液体取扱い装置によってウェルに添加および除去される。熱サイクリングは例えばプレート上で実施することもできる。また、可溶化状態の核酸分子を含むウェルに由来する液体の一部を除去して別の容器内に配し、制限酵素切断断片長多型(RFLP)解析またはサザンブロット解析を行うことができる。
【0122】
本発明の過程は、多数の試料を用いて遺伝子型データを得る際に特に有用である。例えば多数の個体の遺伝子型解析は、本発明の過程でヒト血液を対象に実施した後に、蛍光プライマーを用いてPCRを行い、また自動配列決定装置で配列を決定することができる。
【0123】
本発明の過程はまた、植物、微生物、および非ヒト動物から得られた多数の試料の遺伝子型解析にも有用である。植物を例にとると、多数の植物試料を調製し、1つまたは複数の遺伝子型に関与する遺伝特性を対象にスクリーニングを行うことができる。これは特に、特定の地域で成長させた植物の特定の遺伝子型を判定する際に有用である。例えばダイズに由来する材料(例えば葉または種子)は、特定の地域の農場から採取することができる。植物材料は、固体マトリックスに直接アプライするか、または溶液中に分散させてから試料を添加することができる。
【0124】
植物材料、または他の任意の固体材料を固体マトリックスに直接アプライする場合は、圧縮力を用いて材料をマトリックスにアプライすることが通常有利である。言い替えると、固体材料を固体マトリックスの表面に押しつけて破砕させる場合がある。
【0125】
固体材料を固体マトリックスにアプライするには装置を使用することができる(例えばハンマー)。1つの態様では、このような装置は、核酸分子を含む固体材料を最初に収容するチャンバーを含む。ピストン、またはピストン様物体をチャンバーの一端に配し、固体マトリックスをもう一端に配する。したがって、ピストンまたはピストン様物体が、固体マトリックスへ向かって動くことで、固体材料が、固体マトリックスの表面に押しつけられる。固体材料に由来する核酸分子は、この過程中に固体マトリックス上に蓄積する。装置は選択的に、固体マトリックスの裏側を支持して固体材料がマトリックスを強制的に通過しないようにする固体部分を有する。この固体部分は、固体マトリックスが、ピストンまたはピストン様物体によって加えられて構造の全体性が損なわれる圧力に耐えるほど十分硬い場合には、必ずしも必要ではない。
【0126】
上記の装置は特に、特定の地域で植物材料試料を収集する際に有用である。このような装置は一般に比較的小型で、携帯性に優れ、またマニュアルで圧力を加えながら操作することができる。また、このような装置を使うことで、固体マトリックスへアプライするための試料溶液を調製する必要はなくなる。同装置ではまた、固体マトリックスの表面に均一に試料をアプライすることができる。したがって別の局面では、本発明は、試料を固体マトリックスにアプライするための装置を提供し、この装置は(1)核酸分子(すなわち試料)を含む固体材料を収容するチャンバー、(2)チャンバーの一端にあるピストンまたはピストン様物体、および(3)チャンバーの別の端に固体マトリックスを固定する結合部分を有する。
【0127】
本発明の方法に使用可能な植物には、ダイズ、トウモロコシ、ライムギ、コムギ、ソルガム、イネ、ピーマン、トウガラシ、エンドウマメ、マツ、アメリカハリモミ(blue spruce)、カエデ、草本(例えばKentucky Blue Grass)、およびワタが含まれるがこれらに限定されない。本発明の方法に使用可能な植物の部分には、茎、根、種子、葉、花弁、および萼片が含まれる。
【0128】
本発明の遺伝子型解析の方法は、地域を越えた植物系列および遺伝子マーカーの拡散のモニタリングに有用である。このような方法は、遺伝子組換え生物(G.M.O.)検出にも有用である。G.M.O.の一例は、別のG.M.O.の種子から成長させた植物である。したがって本発明は、植物から試料を得る段階、試料を固体マトリックスにアプライする段階、固体マトリックスに結合した状態の核酸分子を解放させる段階、および核酸分子を解析して、試料の供給元となった植物のある遺伝形質を関連する遺伝子型を判定する段階を含む、G.M.O.を同定する方法を提供する。関連する態様では、複数の形質に関連する遺伝子型(例えば2種、3種、4種、または5種)を判定することができる。
【0129】
植物材料をスクリーニングして、G.M.O.ならびに特定の植物系列を同定/検出する際には、分子マーカー検出法が一般に用いられる。例えばPCRを行うことで、1コピー遺伝子である核酸分子を増幅することができる。増幅された核酸分子を次に、配列決定、RFLP解析、またはハイブリダイゼーション解析などの方法で解析し、特定の植物がG.M.O.か否かを判定することができる。
【0130】
IV.キット
本発明の他の態様は、固体マトリックスから核酸分子を解放させるためのキット、ならびに核酸分子を精製および/または単離するためのキットを含む。キットは例えば、ひとまとめにされた複数の成分および試薬を提供することで、本発明の方法の実施を容易にする。また、このようなキットの試薬は、方法の精度および信頼性を高めるために、事前に測定された単位で供給される場合がある。
【0131】
固体マトリックスから核酸分子を除去するための本発明のキットは一般に、箱などのカートン、箱、チューブ、アンプル、ジャー、バッグ、プレートなどの1個または複数の容器、および1種類または複数の解放性試薬、ならびに以下からなる群より選択される1種または複数の成分を含む:(a)少なくとも1種類(例えば1種類、2種類、3種類、4種類、5種類、10種類、20種類、50種類、100種類)の固体マトリックス;(b)試料を固体マトリックスにアプライするための少なくとも1つの装置;(c)固体マトリックスを切断して、試料を含む切片にする少なくとも1つの装置;ならびに(d)少なくとも1種類の洗浄液。
【0132】
固体マトリックスに試料をアプライするための装置は、試料のアプライに使用可能な任意の装置を本質的に含む。このような装置の1例は、上述したような、96種の試料を固体マトリックスに一度にアプライする際に使用されるDNAカードレジストレーションツール(DNA Card Registration Tool)、およびスロットピンスポッター(Slot Pin Spotter)である。他の例には、ミクロキャピラリーチューブ、およびピペット(例えばピペットマン(Pipetman)(商標)などのマイクロピペット)、ならびに液体の移送に使用可能な他の装置が含まれる。さらに他の例には、実施例1で説明する、また固体材料を固体マトリックスにアプライする段階について上述した両方の装置などが含まれる。
【0133】
試料を含む切片に固体マトリックスを切断する装置は、紙やカードなどの材料を切断する装置を含む。このような装置の例には、はさみ、剃刀、ナイフ、およびハリスマイクロパンチ(HARRIS MICRO PUNCH)(商標) 装置などが含まれる。ハリスマイクロパンチ(HARRIS MICRO PUNCH)(商標) 装置のような装置が特に有用である理由は、固体マトリックスの、比較的均一な大きさ(例えば1.2 mmや2 mmなど)の円形片への切断に使用可能なためである。
【0134】
本発明のキットに供給される洗浄液は、キットが対象とする特定のアプライ法によって変わる。1例として、高濃度の脂肪および脂質を含む試料(例えば脂肪組織)からの高分子量の核酸分子の精製および/または単離用にキットが設計される場合、キットに含まれる1種もしくは複数の洗浄液は一般に界面活性剤(例えばトライトン(TRITON)X−100)を含む。
【0135】
またキットに複数の洗浄液が含まれる場合、洗浄過程の初期段階に使用される溶液は、後の洗浄段階で除去される薬剤を含む場合がある。例えば2つの洗浄段階を行う場合、第1の洗浄段階で使用される洗浄液は界面活性剤を含む場合がある。しかし、第2の洗浄段階で使用される洗浄液は界面活性剤を含まない場合があり、また第1の洗浄液によって固体マトリックスに添加された界面活性剤を除去するために部分的に使用される場合がある。
【0136】
本発明のさまざまな態様に使用可能な洗浄液の例には、10 mM トリス、1 mM EDTA (pH 7.3);水;および界面活性剤を含む溶液が含まれる。
【0137】
試料容器および容器の固体マトリックスも本発明のキットに含まれる場合がある。本発明のいくつかの態様における用途に適した容器の1例が、FTA(登録商標) 96ウェルマイクロプレート(96 well MicroPlate) (Invitrogen Corp.、Life Technologies Division、カタログ番号10786−028)である。このようなプレートは例えば、固体マトリックスにアプライする前の試料と、試料を含む固体マトリックスの小片の両方を収容するために使用することができる。
【0138】
カラムも、本発明のキット(例えば遠心処理(例えば微量遠心)に適したカラム)に含まれる場合がある。このようなカラムは例えば、試料を脱塩処理したり、より大きい核酸分子と、より小さい分子(ヌクレオチド、タンパク質、RNAなど)を分離したりする際に使用される。このようなカラムは当技術分野で周知であり、例えば、分子量に基づく分離用に設計された材料(セファデックス(Sephadex)(登録商標) G−50など)を含む場合がある。
【0139】
関連する技術分野の当業者であれば、本明細書に記載された方法および応用の他の適切な修正および変更が、当業者に既知の情報に鑑みて、本明細書に含まれる本発明の記述から容易に明らかになること、また本発明の範囲もしくは本発明の任意の態様から解離することなくなされることを理解すると思われる。本発明について詳細に説明したが、同内容は、説明のみを目的として本発明を制限する意図のないように含まれる以下の実施例を参照することで、さらに明瞭に理解されると思われる。
【0140】
実施例
実施例1
個々の木(Pinus pinus)に由来する松葉を、シェナンドー国立公園のさまざまなな場所から集める。個々の木の松葉を、FTA(登録商標) クローンセーバー96カード(CloneSaver 96 Card)の表面に配し、ハンマーを用いてカード上で押しつぶす。松葉は、カード上の各位置が1本の木にのみ由来する試料材料を含むようにカード中に配される。各試料をカードにアプライする際には、試料を特定の木に関連づけるために記録をつけておく。試料をカード上のすべての試料位置にアプライしたら、解析目的で実験室にカードを移すまで常温で保存する。
【0141】
実験室では、試料をFTA(登録商標)カードから、マット付きのハリスマイクロパンチ(HARRIS MICRO PUNCH)(商標) 装置を用いて「打ち抜く」。結果として得られる2 mmのパンチを次に、96ウェルプレートのウェル内に移し、トリス−EDTA (pH 7.3)で洗浄する。次に、KOHでpH 11.0に調節した50 μlのエタノールアミンを各ウェルに添加する。90℃で30秒間インキュベートした後に、解放された核酸分子を含む各ウェルの液体を吸引除去して0.5 mlの微量遠心チューブに移し、後にPCR反応で使用するまで凍結保存する。
【0142】
実施例2
方法
25 μlの新鮮な血液を、FTA(登録商標) クローンセーバー96カード(CloneSaver 96 Card)の各位置に、モデルP−200のピペットマン(Pipetman)(商標)(Rainin Instrument Company, Inc.、Rainin Road、Box 4026、Woburn、MA、01888)を用いてスポットした。カードは使用するまで室温で保存した。
【0143】
解放性試薬は水で0.01%〜1%の濃度に希釈したエタノールアミンを含むものを用いた。pH範囲は8.3〜13とした。pHはKOH水溶液を添加して調節した。最高の結果はpH 11で1%の濃度で得られた。エタノールアミン試薬を、15 mMおよび30 mMのCABS [4−(シクロヘキシルアミノ)−1−ブタンスルホン酸]緩衝液、CAPS[3−(シクロヘキシルアミノ)−1−プロパンスルホン酸]緩衝液、ジェントラ溶出緩衝液2(Gentra Elution Buffer 2) (ジェネレーション(GENERATION)(商標) キャプチャーカラム(CAPTURE COLUMN)(商標)キット(Gentra Systems社、13355 10th Avenue N.、Suite 120、Minneapolis、MN 55441、USA)とともに使用)、およびアンプダイレクト(AmpDirect) (Shimadzu, Inc.、1、Nishinokyo Kuwabaracho、Nakagyou−ku、Kyoto 604−8511、Japan)と比較した。
【0144】
試料をアプライした後に、FTA(登録商標)のパンチを、FTA(登録商標) 精製用試薬(Purification Reagent)(Invitrogen Corp.、Life Technologies Division、カタログ番号10876)、およびTE緩衝液を用いて業者の推奨手順で洗浄した。
【0145】
解放性試薬は2 mmのパンチあたり50 μlを添加した。次にパンチを90〜100℃で1〜30分間加熱した。最良の結果は、PCR解析では10〜20分間で得られた。この結論は、図1および図3で得られた結果に基づく。図1は、100 pg/mlが10分後に解放されることを示す。20分後の時点では、約1 ng/mlが解放性試薬によって解放されている。図4は、解放されたDNAを用いて得られたPCRの結果が、10分、15分、または20分の加熱後の結果と同等であることを示している。しかしPCR産物を1:10に希釈すると、産物量の差は顕著となる。ジェントラ溶出緩衝液2(Gentra Elution Buffer 2) およびエタノールアミン解放性試薬は、検討した他の試薬と比較して良好に機能した。PCR反応において、15分間および20分間の加熱で明瞭に視認可能となったPCR産物を1:10に希釈してゲルにロードする。
【0146】
解放されたDNAの濃度は、アセス(ACES)(商標)2.0+ヒトDNA定量システム(2.0+ Human DNA Quantitation System)を用いて決定した。この系では、10 μlの解放DNAを定量に用いる。定量後、解放された各DNAの挙動を、遺伝子型を判定するPCRアッセイ法で使用時の増幅産物を産生する能力について検討した。これは、標準的な遺伝子型PCRアッセイ法を準備した後に、1 μlの解放されたDNAを添加して検討した。各PCRアッセイ法は、総容量15 μlで行った。PCR産物は、1.5% アガロースゲルを用いた電気泳動で解析した。電気泳動は100ボルトで1時間かけて行った。次にゲルを臭化エチジウムで染色し、写真を撮影した。
【0147】
理解を助ける目的で、図および実施例を挙げて本発明をある程度詳しく説明したが、同内容が、本発明の範囲、または任意の特定の態様に影響を与えることなく、条件、剤形、および他のパラメータの広範囲で等価な範囲内で本発明を修正または変更することで実施されうること、また、このような修正または変更が、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されることは当業者に明らかである。
【0148】
本明細書で言及されたすべての出版物、特許、および特許出願は、本発明が属する技術分野の程度を示し、個々の出版物、特許、特許出願が具体的に、また個別に参照として組み入れられるのと同程度に本明細書に参照として組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【0149】
【図1】アセス(ACES)(商標)2.0+ヒトDNA定量システム(2.0+ Human DNA Quantitation System)(Invitrogen Corp.、Life Technologies Division、カタログ番号10294−015)を用いて実施したDNA定量アッセイ法の結果。図1に示したナイロンメンブレンは、同システムで提供されるプローブを用いて製造業者の指示書にしたがって調製した。この結果から、さまざまな試薬が、100℃で10〜20分間加熱することで、FTA(登録商標)紙の2 mmの血液パンチからDNAを解放させる能力をもつことがわかる。検討したすべての試薬が、20分間の加熱後に2 mmのパンチあたり50〜100 ngのDNAを解放した。加熱時間は3−(シクロヘキシルアミノ)−1−プロパンスルホン酸(CAPS)緩衝液にほとんど影響を及ぼさず、すべての加熱時間で解放されたDNAはほぼ同量であった。
【図2】濃度およびpHが、エタノールアミンによるFTA(登録商標)紙からのDNAを解放させる能力に及ぼす作用を示す、図1に記載されたように実施したアセス(ACES)定量アッセイ法の結果。図の左側に示すDNA濃度は、0.2 ng、0.4 ng、1 ng、2 ng、4 ng、10 ng、20 ng、および40 ngである。パンチは、50 μlのエタノールアミン溶液中で100℃で10分間インキュベートした。10 μlの解放されたDNAを定量に用いた。0.025%〜0.2%の濃度のエタノールアミン(いずれもpH 11)は、DNAのFTA(登録商標)紙からの解放にそれほど大きな影響を及ぼさなかった。しかしpHの変化はDNAの解放に影響を与えた。pH 8.3では、パンチあたり0.5 ngのDNA が解放されている。pH 9.7およびpH 13では、パンチあたり2 ngのDNAが解放されている。pH 11では、パンチあたり10 ngのDNAが解放されている。したがって実施例2で説明するように、解放されたDNAの量に関する最大収量はpH 11で得られた。
【図3】エタノールアミン濃度が、FTA(登録商標)紙からのDNAの解放に及ぼす作用を示す、図1に記載されたように実施したACES定量アッセイ法の結果。10 μlの解放されたDNAを、このアッセイ法に用いた。すべてのエタノールアミン溶液のpHは11とした。エタノールアミン濃度を0.00025%から0.025%に上昇させると、より多くのDNAがパンチから解放される。ほとんどのDNA (約50 ng)は1%の濃度で解放された。0.2%では約10 ngのDNAが解放された。試験の目的上、エタノールアミン濃度は0.2%および1%とした。
【図4】さまざまな試薬を用いてFTA(登録商標)紙から解放された核酸分子を対象に行われたPCRを示すアガロースゲル。パンチを、0.2% エタノールアミン(pH 11)中で10分間、15分間、または20分間加熱した。PCRは以下の手順で行った。各15 μlのPCR反応を、1 μlの解放されたDNAを用いて行った。PCR反応緩衝液は、20 mM トリス−HCl (pH 8.4)、50 mM KCl、1.5 mM MgCl2、200 μM dNTP、5 μl プライマー、0.04単位のプラチナ(Platinum)(登録商標)Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen Corp.、Life Technologies Division、9800 Medical Center Drive、Rockville、MD 20850 USA、カタログ番号10966−018)、およびD1S197マイクロサテライトマーカーDNA増幅用のプライマー対を含むものを使用した。熱サイクリングは以下の温度変化で行った:80℃で10分間、および94℃で1分間;94℃で30秒間、55℃で30秒間、および72℃で1分間を10サイクル;89℃で30秒間、55℃で30秒間、および72℃で1分間を20サイクル;ならびに72℃で10分間の最終伸長。PCR反応産物は分析を実施するまで4℃で保存した。5 μlのPCR反応物をアガロースゲルにロードした。また、1:10に希釈した5 μlのPCR反応物も、各検討試薬で得られた産物の量に差があるか否かを判定するためにゲルにロードした。このアガロースゲルから、0.2% エタノールアミンがジェントラ溶出緩衝液2(Gentra Elution Buffer 2) と同程度の性能を有することがわかった。両試薬とも1:10の希釈率でPCR産物が検出された(ゲルの写真上の短い境界線の右側)。
【図5】解放性試薬であるエタノールアミンの濃度(%)およびpHがPCR産物の形成に及ぼす作用を示すアガロースゲル。PCRは、1 μlの解放されたDNAを15 μlのPCR反応物中に用いて図4に記載された通りに実施した。5 μlのPCR反応物を電気泳動用アガロースゲルにロードした。以上の結果から、エタノールアミン濃度を上昇させたときに増幅量が若干上昇することがわかる。pHのもつ作用も、この場合はっきりしている。PCR産物はpH 8.3〜11で得た。pH 6.2およびpH 13ではPCR産物の生成は認められない。以上のデータは、エタノールアミンの濃度およびpHを検討したACES定量キットで過去に得られたデータを支持する(図3を参照)。
【図6】解放性試薬のpHがPCR産物の形成に及ぼす作用を示すアガロースゲル。PCRは、1 μlの解放されたDNAを15 μlのPCR反応物中に用いて図4に記載された通りに実施した。5 μlのPCR反応物を電気泳動用アガロースゲルにロードした。PCR産物はpH 6.2およびpH 13では生じなかった。生じたPCR産物の量はpHとともに上昇した。以上のデータは、解放性試薬のpHを8.3から11に上昇させると大量のDNAが解放されることを示す、図2に示したデータを支持する。この結果から、FTA(登録商標)紙からDNAを解放させる最も有効なpHが11であると結論づけられる。
【0001】
発明の分野
本発明は、固体マトリックスから核酸分子を解放させるための組成物および方法に関する。本発明はさらに、動物組織や植物材料などの生物材料から核酸分子を精製および単離するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
集団内の数多くの個体および/または生物から得られる核酸分子試料を調製して解析することは多くの状況で望ましい。このような試料は、同じ地域または異なる地域に存在する個体の遺伝子型の判定に用いられることが少なくない。したがって試料の収集および解析は、集団内の個体の遺伝子型を判定する際に使用されることがある。このような解析を行うことで一般に、試料が由来する個体、および集団全体の両方に関連するデータが得られる。
【0003】
生物集団に由来する核酸分子を含む試料の収集および解析は、ウイルス、植物、および動物の集団の遺伝子型のデータを得るために行われることがある。集団内の多数の個体の遺伝子型解析が一般に行われる状況の一例では、ある地域における植物の遺伝子型に関するデータが考慮される。このようなデータは、特定の植物系統の拡散速度を決定する際に、または農業従事者に販売された種子から成長させた遺伝子組換え植物、または、このような種子から成長させた植物体の子孫を判定する際に得られる場合がある。
【0004】
いくつかの企業が現在、遺伝子組換え植物、およびこのような植物の種子を販売している。状況によっては、このような種子は、購入者(一般に農業従事者)が、購入した種子を成長させて得た植物体から得た種子から植物体を成長させる代わりに、種子をその供給者から再購入する条件で販売されている。さらにまた、一部の消費者団体ならびに政府機関は、遺伝子組換え植物から調製した農産物の販売に反対している。
【0005】
上述の個々の状況において、遺伝子型解析を行うことで遺伝子組換え植物か否かを判定することができる。このような解析は、農村地方で得られる多数の植物試料の収集から開始されることが多い。したがって、後に遺伝子型解析に使用可能な植物に由来する核酸分子を含む多数の試料の収集および簡便な保存を可能とする方法が求められている。
【0006】
他の状況では、遺伝子型解析は、動物(例えばヒト)に由来する試料を対象に行われ、これも各個体、または個体が集まった集団のいずれかに関連したデータが得られる。また動物または植物のいずれかに由来する試料を対象とした遺伝子型解析により、これらの生物に関連した成分に関連したデータが得られる場合がある。このような関連する成分の例には、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)などのウイルスが含まれる。特にHIV集団の遺伝子型解析は、ヒト血液試料から得られる核酸分子を用いて行うことができる。HIVがそのゲノムを変化させる速度は速いので、さまざまなウイルス系列の拡散および地域における優勢度を追跡するために遺伝子型解析が行われている。
【0007】
濾紙(例えばWhatman 3MM濾紙)の使用は、核酸分子(例えばRNA、プラスミド、ウイルスベクター、および染色体DNA)を含む試料を収集し、出荷し、また保存するための安価な方法である。これは特に、冷凍設備の整わない遠隔地で試料が採取される場合にあてはまる。
【0008】
血液試料の収集、出荷、および保存に用いる、濾紙をベースとした媒体の一例が、(i)一価の弱塩基;(ii)キレート化剤;(iii)陰イオン性界面活性剤;また選択的に(iv)尿酸または尿酸塩、を含浸させたセルロース材料を含むFTA(登録商標)紙である。FTA(登録商標)紙を使用することで、ヒトのゲノムDNAは例えば、細胞を紙と接触させることで溶解する、全血の乾燥スポットの状態で保存可能となる。室温で保存されたFTA(登録商標)紙上のゲノムDNAは少なくとも7.5年間は安定であることが報告されている(Burgoyneら、CONVENTIONAL DNA COLLECTION AND PROCESSING:DISPOSABLE TOOTHBRUSHES AND FTA(登録商標) PAPER AS A NON−THREATING BUCCAL−CELL COLLECTION KIT COMPATIBLE WITH AUTOMATABLE DNA PROCESSING、8th International Symposium on Human Identification、1997年9月17〜20日)。したがって核酸試料を濾紙(例えばFTA(登録商標)紙)上に保持することは、高価な冷凍庫に保管するガラスバイアルやプラスチックチューブと比較してコンパクトなアーカイブシステムとなる。
【0009】
血液スポットに由来するDNAは、複数の疾患に関連した遺伝子変異を判定する、新生児を対象としたスクリーニングプログラムに、また軍事関係者を同定する方法に用いられている(例えばSeltzerら、Biochem.Med.Metab.Biol. 46:105−109 (1991);Jinksら、Hum.Genet. 81:363−366 (1989);Skogerboeら、Clin.Chem. 37:454−458 (1991);McEwenら、Am.J.Hum.Genet. 55:196−200 (1994)を参照)。
【0010】
血液試料を乾燥濾紙上で保存することには、病原体を不活性化するいう別の利点がある。具体的には、HIVを始めとする数種の感染源は乾燥すると生存能を失うと考えられている。また核酸分子を含む、このような乾燥血液スポット、ならびに他の乾燥試料から得られる核酸分子は、メッセンジャーRNA (mRNA)の単離および逆転写に使用することもできる。
【0011】
細菌の核酸を濾紙上にスポットすることは、試料の保存および検索システムの一部として使用することもできる。RogersおよびBurgoyneは最近、FTA(登録商標)紙上に保存されたブドウ球菌(Staphylococcus)および大腸菌(Escherichia coli)の複数の細菌株の試料の特性をPCR−リボタイピング法で判定した(Rogersら、Anal.Biochem. 247:223 (1997))。
【0012】
濾紙に捕捉した核酸を解析する前に、洗浄段階を通常設け、安定化用の化合物(存在する場合)、および細胞由来の酵素反応阻害物質を除去する必要がある。DNAは、洗浄段階後に大部分が濾紙上に残るので、このような核酸を精製する操作は単純化され、また自動化に適している。
【0013】
FTA(登録商標)紙などの材料から核酸を解放させる複数の方法が開発されている。例えばBurgoyneは、ポリスチレンケース内の濾紙上に保存された精製プラスミドDNAが、尿酸溶液を用いることで回収可能なことを報告している(全体が参照として本明細書に組み入れられるBurgoyne、米国特許第5,496,562号)。核酸を解放させる別の方法には、水溶液中にキレート化剤を含む緩衝液が用いられる(例えば参照として本明細書に組み入れられる国際公開公報第99/39010号、国際公開公報第99/38962号、および国際公開公報第99/39009号を参照)。
【0014】
本発明は、現在当技術分野で用いられている方法と比較して比較的単純な、固体マトリックスからDNAを解放させる方法を提供する。また本発明の方法で解放されたDNAは、いくつかの過程(例えば遺伝子型解析)に直接使用することができる。
【発明の開示】
【0015】
発明の概要
本発明は、固体マトリックスから核酸分子(例えばDNA)を除去するための組成物および方法に関する。特に本発明の方法では、核酸分子の解放を促す解放性試薬が使用される。本発明はさらに、このような方法に関連する組成物を提供する。
【0016】
本発明は、核酸分子の精製法および/または単離法にも関する。
【0017】
1つの一般的な局面では、本発明は、1種または複数のアルカノールアミンを含む解放性試薬を固体マトリックスに接触させる段階を含む、固体マトリックスから核酸分子を除去する方法を提供する。
【0018】
別の一般的な局面では、本発明は、以下の段階を含む核酸分子の精製法および/または単離法を提供する:(a)核酸分子を固体マトリックスに、核酸分子が固体マトリックスに固着、付着、会合、および/または結合(共有結合的もしくは非共有結合的に)しやすい条件下で接触させる段階;ならびに(b)結合状態の核酸分子を含む固体マトリックスに、1種または複数のアルカノールアミンを含む解放性試薬を、固体マトリックスから核酸分子を解放させる条件下で接触させる段階。関連する局面では、本発明の方法は、固体マトリックスから解放された核酸分子を含む解放性試薬を回収する段階をさらに含む。
【0019】
特定の態様では、本発明の方法に使用される固体マトリックスは、1種もしくは複数の弱塩基、1種もしくは複数のキレート化剤、1種もしくは複数の陰イオン性表面活性剤、1種もしくは複数の陰イオン性界面活性剤、尿酸、および/または1種もしくは複数の尿酸塩などの、核酸分子の分解を防いだり抑えたりする化合物を含む。
【0020】
他の特定の態様では、本発明の方法に使用される固体マトリックスは、セルロースをベースとしたマトリックス、またはマイクロメッシュ状の合成プラスチックマトリックスである。本発明の特定の態様では、固体マトリックスは濾紙(例えばWhatman 3MM濾紙)、またはFTA(登録商標)紙のいずれかである。
【0021】
さらに他の特定の態様では、本発明の方法で使用される解放性試薬中に存在するアルカノールアミンはエタノールアミンを含む。特にエタノールアミンは、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、またはトリエタノールアミンの場合がある。
【0022】
関連する態様では、本発明の方法で使用される解放性試薬は、複数のエタノールアミン(例えば2種もしくは3種のエタノールアミン)を含む。
【0023】
ある態様では、本発明の方法で使用される解放性試薬は水溶液である。
【0024】
特定の態様では、本発明の方法で使用される解放性試薬のpHは約8.3〜約13、または約10〜約12の範囲である。本発明の特定の態様では、解放性試薬のpHは約11である。
【0025】
本発明の他の特定の態様では、1種または複数のアルカノールアミンが、解放性試薬中に約0.01%〜約5%(容積/容積)、約0.01%〜約3%(容積/容積)、約0.01%〜約1%(容積/容積)、または約0.1%〜約1%(容積/容積)の濃度で存在する。
【0026】
別の態様では、核酸分子を含む固体マトリックスを、約1〜約180分間、約1〜約120分間、約10〜約60分間、または約10〜約30分間かけて解放性試薬とインキュベートする。
【0027】
他の態様では、核酸分子を含む固体マトリックスを解放性試薬と約65℃〜約100℃、または約90℃〜約100℃でインキュベートする。
【0028】
ある態様では、本発明の方法は、解放された核酸分子を解放性試薬から分離する段階を含む。
【0029】
別の態様では、本発明の方法で固体マトリックスから解放された核酸分子は、ベクター(例えばプラスミド、人工染色体など)を含む。同様に、本発明の方法で固体マトリックスから解放された核酸分子は、細胞またはウイルスの核酸分子(例えば細胞またはウイルスのゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、葉緑体DNAなど)を含む場合がある。
【0030】
別の局面では、本発明は、本発明の方法で精製および/または単離された核酸分子を含む。特定の態様では、本発明の方法で精製および/または単離された核酸分子は、分子生物学的処理(例えばPCRによる増幅)に使用することができる。関連する局面では、本発明はさらに、本発明の方法で作製された核酸分子を導入する段階を含む、組換え宿主細胞を作製する方法に関する。
【0031】
別の局面では、本発明は、以下の段階を含む、RNAをDNAから分離する方法を提供する:(a)RNAおよびDNAを含む試料を固体マトリックスに接触させる段階;(b)(a)の固体マトリックスに洗浄液を、DNAを保持しながらRNAを十分除去する条件下(例えば固体マトリックスの1秒〜90分間の洗浄)で接触させる段階;および(c)1種または複数のアルカノールアミンを含む解放性試薬を、固体マトリックスからDNAを解放させる条件下で、洗浄後の固体マトリックスに接触させる段階。
【0032】
さらに別の局面では、本発明は、以下の段階を含む、閉環状核酸分子を直鎖状核酸分子から分離する方法を提供する:(a)閉環状核酸分子および直鎖状核酸分子を含む試料を固体マトリックスに接触させる段階;(b)(a)の固体マトリックスに洗浄液を、直鎖状核酸分子を保持しながら閉環状核酸分子を十分除去する条件下(例えば固体マトリックスの1秒〜90分間の洗浄)で接触させる段階;ならびに(c)1種または複数のアルカノールアミンを含む解放性試薬を、固体マトリックスから直鎖状核酸分子を解放させる条件下で、洗浄後の固体マトリックスに接触させる段階
【0033】
別の局面では、本発明は、以下の段階を含む、大きさを元に核酸分子を分離する方法をさらに提供する:(a)異なる大きさの核酸分子を含む試料を固体マトリックスに接触させる段階;(b)(a)の固体マトリックスに洗浄液を、大きい核酸分子を保持しながら小さい核酸分子を十分除去する条件下(例えば固体マトリックスの1秒〜90分間の洗浄)で接触させる段階;および(c)1種または複数のアルカノールアミンを含む解放性試薬を、固体マトリックスから、より大きい核酸分子を解放させる条件下で、洗浄後の固体マトリックスに接触させる段階。
【0034】
特定の態様では、本発明の方法で使用される洗浄液は、10 mM トリス−HCl、1 mM EDTA (pH 7.3)、水、またはFTA(登録商標) 精製用試薬(Purification Reagent)(Invitrogen Corp.、Life Technologies Division、カタログ番号10876−019)を含む。関連する特定の態様では、これらの洗浄液は、1種または複数の界面活性剤をさらに含む。
【0035】
他の特定の態様では、固体マトリックスを、約1秒間、約3秒間、約5秒間、約20秒間、約30秒間、約45秒間、約1分間、約5分間、約10秒間、および約30分間からなる群より選択される時間をかけて洗浄する。
【0036】
核酸分子を相互の大きさを元に分離する別の特定の態様では、平均サイズが約1kb〜約50kbの核酸分子を、平均サイズが約100kb〜約1,000kbの核酸分子から分離し;平均サイズが約50kb〜約100kbの核酸分子を、平均サイズが約250kb〜約500kbの核酸分子から分離し;または平均サイズが約50kb〜約100kbの核酸分子を、平均サイズが約1,000kb〜約4,000kbの核酸分子から分離する。
【0037】
本発明はさらに、核酸分子、固体マトリックス、および1種または複数のアルカノールアミンを含む解放性試薬を含む組成物を提供する。
【0038】
本発明はまた、本発明の方法を実施するための、ならびに本発明の組成物を調製するためのキットにも関する。したがって1つの一般的な局面では、本発明は、(1)本発明の1種または複数の解放性試薬、および(2)以下からなる群より選択される1種または複数の成分を含む、固体マトリックスから核酸分子を除去するためのキットを提供する:(a)少なくとも1種の固体マトリックス;(b)試料を固体マトリックスにアプライするための少なくとも1種の装置;(c)固体マトリックスを切断して、試料を含む切片にする少なくとも1種の装置;ならびに(d)少なくとも1種の洗浄液。
【0039】
特定の態様では、試料を固体マトリックスにアプライするための装置は、ピペット(例えばピペットマン(Pipetman)(商標) モデルP−2、P−10、P−20、P−100、P−200など、Rainin Instrument Company, Inc.、Rainin Road、Box 4026、Woburn、MA、01888)を含む。関連する態様では、試料を固体マトリックスにアプライするための装置(例えばピストンを用いる装置であるハンマーなど)によって、試料を粉砕して固体マトリックスの表面に押しつける。このような装置は、試料が植物から得られた材料を含む場合に特に有用である。別の関連する特定の態様では、試料をアプライするための装置は、複数の試料を固体マトリックスに一度にアプライすることができる。
【0040】
別の態様では、固体マトリックスを切片に切断する装置によって、さまざまな形状(例えば円形、正方形、長方形、不定形など)のマトリックスの小片が得られる。
【0041】
さらに別の特定の態様では、本発明のキットの洗浄液は、10 mM トリス−HCl、1 mM EDTA (pH 7.3)、水、またはFTA(登録商標) 精製用試薬(Purification Reagent)(Invitrogen Corp.、Life Technologies Division、カタログ番号10876−019)を含む。関連する特定の態様では、本発明のキットの洗浄液は、1種もしくは複数の界面活性剤をさらに含む。
【0042】
本発明の他の態様は、当技術分野で周知の知見、以下の図面、および本発明の説明、ならびに請求項を考慮して、当業者に明らかになると思われる。
【0043】
好ましい態様の詳細な説明
I.定義
以下の定義は、本発明の主題を明確にするために提供する。
【0044】
固体マトリックス:
本明細書で用いられる「固体マトリックス」という表現は、核酸分子が、セルロースをベースとした材料(例えばセルロースをベースとした濾紙)、およびマイクロメッシュ状の合成プラスチックマトリックスを含むがこれらに限定されない材料に固着し、(共有結合的もしくは非共有結合的に)結合し、付着し、および/または会合する、任意の固相支持体を意味する。このような材料の一例はFTA(登録商標)紙である(Fitzco Inc.、5600 Pioneer Creek Drive、Maple Plain、MN 55359 USA;Invitrogen Corp.、Life Technologies Division、9800 Medical Center Drive、Rockville、MD 20850 USA、カタログ番号10786−036)。他の例には、Schleicher and Schuellのグレード903、704E、402、404、および577の濾紙(Schleicher and Schuell、10 Optical Avenue、Keene、N.H. 03431 USA);Whatman BFC180、No.1、No.40、No.42、No.50、および3MM濾紙(Whatman International、Maidstone、Kent、UK);ニトロセルロース:ならびにセルロースアセテートなどがある。
【0045】
本発明の多くの態様では、使用される固体マトリックスは、セルロースをベースとした濾紙、または他の種類の濾紙(例えば植物繊維などのパルプ繊維から得られる層状集塊(laminar conglomerate))である。このような種類の固体マトリックスは、比較的安価で、また本発明の方法で通常良好に機能することから本質的に有用である。
【0046】
本発明の用途に適した固体マトリックスには、病原体(例えば単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルスなど)を不活性化するマトリックスが含まれる。この特徴は、固体マトリックスにアプライされる試料が、ヒト(例えば唾液、口腔スワブ、全血など)から得られる場合に特に有利である。
【0047】
固体マトリックスには、細胞の溶解を誘導する薬剤を含浸させることもできる。このような薬剤の例には、陰イオン性界面活性剤(例えばドデシル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム)、陽イオン性界面活性剤(例えば臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)、塩化セチルピリジニウム(CPC)、塩化ミリスチルトリメチルアンモニウム(MTAB)、塩化ジオクタデシルジメチルアンモニウム(DODMAC))、非イオン性界面活性剤(例えばツイーン(TWEEN) 80、トライトン(TRITON)X−100)、酵素、塩類、カオトロピック剤(例えば塩酸グアニジン)などがある。
【0048】
特定の態様では、固体マトリックスは、ガラス(例えば多孔性ガラスビーズ)、およびプラスチック(例えばポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ナイロンなど)を含む場合がある。
【0049】
本発明の用途に適した固体マトリックスは、ビーズ、フィルター、膜、シート、カラムなどの任意の形状または構造をとりうる。
【0050】
アルカノールアミン:
本明細書で用いられる「アルカノールアミン」という用語は、少なくとも1個のアミノ基、および少なくとも1個のアルコール基を含むC2−C50化合物を意味する。このような化合物の例には、N,N−ジメチルエタノールアミン、N−メチルジエタノールアミン、3−アミノプロピルジエタノールアミン、ジイソプロパノールアミン、N−メチルエタノールアミン、2−(ジブチルアミノ)エタノール、2−(ジイソプロピルアミノ)エタノール、2−(イソプロピルアミノ)エタノール、2−(プロピルアミノ)エタノール、2−(tert−ブチルアミノ)エタノール、2−ベンジルアミノエタノール、2−ブチルアミノエタノール、N−フェニルエタノールアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、およびトリエタノールアミン、ならびにさまざまなアルカノールアミンの混合物などがある。上記のアルカノールアミンは、Sigma−Aldrich Corporation(3050 Spruce Street、St. Louis、MO 63103 USA)などの業者から入手することができる。ある態様では、アルカノールアミンは、3−(シクロヘキシルアミノ)−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(CAPSO)、タンパク質、および/または分子量が100、150、200、250、300、350、400、450、または500を越える分子を含まない。
【0051】
解放性試薬:
本明細書で用いられる「解放性試薬」は、固体マトリックスからの核酸分子の解放を誘導する本発明の試薬を意味する。本発明の解放性試薬は、1種または複数のアルカノールアミンを含む。解放性試薬の他の特徴については後述する。
【0052】
核酸分子:
本明細書で用いられる「核酸分子」という表現は、DNAなどの、プリン塩基およびピリミジン塩基に連結されたリン酸とデオキシリボースが交互に出現する鎖を含む分子(例えばRNA、cDNA、ミトコンドリアDNA、葉緑体DNA、ゲノムDNA、二重微小染色体、人工染色体、染色体外因子、合成DNAなど)を意味する。核酸分子の代表例には、ベクター(例えばプラスミド、酵母人工染色体、哺乳類人工染色体、細菌人工染色体など)、ならびに原核生物、真核生物、およびウイルス(例えばエプスタイン・バーウイルス、1型ウシパピローマウイルス、アヒルB型肝炎ウイルス、マイコプラズマウイルスP1など)のゲノム核酸分子などがある。
【0053】
精製された:
本明細書で用いられる、生物分子(例えば核酸)に関して用いられる「精製された」という用語は、分子が周囲の分子群および/または材料から分離されることを意味する。したがって「精製された」とは、精製対象分子の近傍に存在する分子および/または材料に関する条件の変化に基づく相対的な用語である。したがって例えば、細胞溶解後に固体マトリックスに固着し、付着し、(共有結合的もしくは非共有結合的に)結合し、および/または会合するゲノム核酸分子は、少なくとも数種の細胞片、タンパク質、および/または糖質が洗浄段階で除去される場合に精製されたとみなされる。このような同じゲノム核酸分子は、固体マトリックスから本発明の方法で解放される場合にも精製される。この用語は、すべての除去対象物が精製対象分子から除去されることを意味することを意図しない。したがって、ある程度の量の混入物が、精製後の分子と共存する場合がある。
【0054】
実際の応用に関して、水、塩類、および緩衝物などの材料の濃度は、生物分子が精製されているか否かを判定する際には考慮されない。したがって一例として、カラムクロマトグラフィーで他の生物分子から分離されているが、同過程で水性緩衝液で希釈された状態にある核酸分子は未だ、クロマトグラフィーによる分離プロセスで精製された状態にあるとみなされる。
【0055】
単離された:
本明細書で用いられる、生物分子(例えば核酸)に用いられる「単離された」という用語は、分子が生物系(例えば細胞内)に結合していた場合に、分子の周囲に存在する実質的にすべての分子群および/または材料から分子が分離されていることを意味する。生物分子が精製されているか否かを判定する際には、水、塩類、および緩衝物などの材料の濃度は、生物分子が「単離されている」か否かを判定する際に考慮されない。
【0056】
平均サイズ:
本明細書で用いられる「平均サイズ」という表現は、集団中の少なくとも85%の分子の大きさが、この値の約±10%であることを意味する。例えば、この値が100kbで、集団中の90%の核酸分子が90〜110kbの範囲内にあるとき、集団の平均サイズは100kbである。同じことが、核酸分子集団の98%が90〜110kbの範囲内にあるときにあてはまることは言うまでもない。
【0057】
1種または複数:
本明細書で用いられる「1種または複数」という表現は、1種もしくは2種以上を意味する。当業者であれば理解するように、2種以上という意味は特定の文脈では変わる場合がある。例えば、1種または複数のエタノールアミンの用途について言う場合、当業者は、この表現が一定数のエタノールアミン、1種、2種、もしくは3種のエタノールアミン、またはこれらのエタノールアミンの混合物を意味すると認識すると思われる。しかし、1種または複数の核酸分子について言う場合、当業者であれば、このような分子の集団中に存在する場合がある核酸分子のさまざまな数から、「1種または複数」という表現が1種、2種、3種、4種、5種、10種、20種、30種、50種、100種、1,000種、または1,000,000種を意味すると理解すると思われる。したがって特定の状況では、「1種または複数」という表現は例えば、1種、2種、3種、4種、5種、10種、15種、20種、30種、50種、100種、200種、1,000種、2,000種、5,000種、10,000種、100,000、1,000,000種、5,000,000種、10,000,000種、50,000,000種、100,000,000種、1,000,000,000種などを意味する。
【0058】
ベクター:
本明細書で用いられる「ベクター」という用語は、宿主細胞内で自律的に複製する能力を有する核酸分子を意味する。ベクターは、このような分子が、本質的な生物学的機能を失うことなく切断されて、核酸分子内にスプライスされて複製およびクローニングが行われる少数のエンドヌクレアーゼ制限酵素切断部位を有することを特徴とする場合もある。ベクターの例には、プラスミド、自律複製配列(ARS)、セントロメア、コスミド、フォスミド、ファジミド、細菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、哺乳類人工染色体(MAC)などがある。ベクターはさらに、PCR用、転写および/または翻訳用のプライマー結合部位、および/または制御部位、組換えシグナル、レプリコンなどを提供する場合がある。またベクターは、これらのベクターで形質転換した細胞、またはトランスフェクトした細胞の同定における使用に適した、1種もしくは複数の選択可能なマーカー(例えばカナマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性などをもたらす核酸分子)をさらに含む場合がある。
【0059】
本発明の特定の態様では、「ベクター」という用語は、約50kb未満、約75kb未満、約100kb未満、約125kb未満、約150kb未満、約175kb未満、約200kb未満、または約250kb未満の核酸分子を含まない。本発明の他の特定の態様では、「ベクター」という用語はプラスミドを含まない。
【0060】
本発明によれば、任意のベクターを使用することができる。特に、当技術分野で周知で、また市販されているベクター(およびベクターの変異体または誘導体)を本発明で使用することができる。このようなベクターは例えば、Vector Laboratories Inc.、Invitrogen Corp.、Promega、Novagen、NEB、Clontech、Boehringer Mannheim、Pharmacia、EpiCenter、OriGenes Technologies Inc.、Stratagene、Perkin Elmer、Pharmingen、およびResearch Geneticsから入手することができる。このようなベクターは次に例えば、対象核酸分子のクローニングまたはサブクローニングに使用することができる。一般的なクラスの特定の対象ベクターには、原核生物および/または真核生物のクローニングベクター、発現ベクター、融合ベクター、ツーハイブリッドベクター、またはリバースツーハイブリッドベクター、異なる宿主に使用されるシャトルベクター、変異誘発ベクター、転写用ベクター、大きな挿入を取り込むベクターなどが含まれる。
【0061】
他の対象ベクターには、ウイルス起源のベクター(M13ベクター、バクテリオファージλベクター、バキュロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびレトロウイルスベクター)、コピー数の程度を高、中、低に調節可能なベクター、1種類の宿主の併用に互換性のあるレプリコンを有するベクター(pACYC184およびpBR322)、ならびに真核生物のエピソーム複製ベクター(pCDM8)などがある。
【0062】
試料:
本明細書で用いられる「試料」という用語は、核酸分子を含み、固体マトリックスにアプライされる材料を意味する。試料の例には、細菌細胞、細菌細胞ホモジネート、真菌細胞、原生生物細胞、プレートから得られるウイルスプラーク、塩化セシウム遠心法で単離されるウイルス材料(例えばDNAもしくはRNA)、ヒト口腔スワブ、ヒト血液、精製ヒト血液細胞、血液細胞ホモジネート、ならびに植物材料(葉、根、茎、および果実など)が含まれる。したがって「試料」という用語は、核酸分子を含み、固体マトリックスにアプライ可能な状態の任意の材料を含む。
【0063】
後述するように、固体材料は固体マトリックスに直接アプライすることが可能であるほか、このような材料の溶液もしくは懸濁物をアプライする前に調製することができる。
【0064】
保存:
本明細書で用いられる「保存」という用語は、試料がアプライされた固体マトリックスを一定期間維持することを意味する。固体マトリックスは例えば、一定の湿度で約20℃〜30℃で5年間保存することができる。低い保存温度は、約0℃〜20℃、−20℃〜0℃、および−80℃〜−20℃の場合がある。
【0065】
本明細書で用いられる、組換えDNA技術、ならびに分子生物学および細胞生物学の分野で用いられる他の用語は一般に、適用可能な分野の当業者であれば理解することができる。
【0066】
II.本発明の組成物および方法
上述したように、核酸分子が固着する、付着する、(共有結合的もしくは非共有結合的に)結合する、および/または会合する固体マトリックスは、当技術分野で、保存を含むさまざまな応用に使用されている。また、固体マトリックスに結合した状態の核酸分子は生化学反応(例えばPCR)に使用することができる。
【0067】
本発明は、固体マトリックスから核酸分子を除去するための新しい組成物および方法に関する。特に本発明の方法は、核酸分子を結合させる固体マトリックスに、1種もしくは複数(例えば1種、2種、3種など)のアルカノールアミンを含む溶液を接触させる段階に関する。
【0068】
1つの比較的具体的な局面では、本発明は、固体マトリックスから核酸分子を解放させるための、以下の過程および試薬に関する。水溶液中に核酸分子を含む試料を固体マトリックス(例えばWhatman 3MM濾紙、FTA(登録商標)紙など)上にスポットする。次に、試料を含む固体マトリックスを乾燥させる。乾燥した固体マトリックスを次に、1種または複数のアルカノールアミン(例えばエタノールアミン)を含む解放性試薬中に配し、30分間沸騰させる。結果として得られた溶液を次に室温まで冷却して固体マトリックスを除去する。この溶液を次に、50倍容のPCR緩衝液で希釈し、標準的なプロトコルで核酸分子をPCRで増幅する。
【0069】
エタノールアミンは、緩衝剤として使用されることの多いアルカノールアミン類の1種である。水素結合および疎水的相互作用が強いため、エタノールアミンは通常、室温で粘稠な液体である。またエタノールアミンは、OH基およびH+基に対して強い親和性を有する。エタノールアミンはまた、溶液中で数種の金属イオンと複合体を形成する。このような複数の特性のすべてによって、エタノールアミンは、固体マトリックスから核酸を解放させる優れた試薬と言える。
【0070】
エタノールアミンはpH 10あたりでかなりの緩衝能を示す。pH 10では、多くの固体マトリックスは、−COOH基、および−Si−OH基が存在するために負に帯電している。理論に拘泥されることは望まれないが、ある塩基性pHにおける固体マトリックスの負電荷は、核酸分子の荷電性表面からの解放を招くと考えられる。
【0071】
またエタノールアミンは、核酸分子と水素結合を介して強く相互作用すると考えられている。この相互作用は、固体マトリックスからの核酸分子の抽出を促すと考えられている。またエタノールアミンは、金属イオンを核酸分子と共有する場合がある。というのは両化合物とも、可溶性の金属イオン複合体を形成可能であるからである。これは、エタノールアミンと核酸分子の可溶性複合体の形成につながると考えられている。
【0072】
後述するように、任意の核酸分子を保存して、本発明の方法および組成物を用いて後に回収することができる。また核酸分子は、固体マトリックスと固着、付着、(共有結合的もしくは非共有結合的に)結合、および/または会合した後に、固体マトリックスから解放される能力を元に、他の材料から分離することができる。特に本発明の方法および組成物は、核酸分子(例えば染色体DNA、ベクター、ウイルスの核酸分子など)を固体マトリックス(例えばFTA(登録商標)紙、またはこの誘導体、バリアント、もしくは修飾物)に接触させ、解放性試薬を用いて放出させる単純かつ効率の良い過程に関する。また詳しく後述するように、解放された核酸分子は、これも解放性試薬で解放される他の細胞材料から分離することもできる。したがって本発明は、核酸分子を精製および/または同定する方法をさらに提供する。
【0073】
本発明の用途に適した固体マトリックスには、セルロースをベースとした吸収性のマトリックス(例えばセルロースをベースとした紙)、または合成プラスチック材料のマイクロメッシュ(参照として全体が本明細書に組み入れられる米国特許第5,496,562号に記載されているものなど)を含む固体マトリックスなどが含まれる。また固体マトリックスは、弱塩基、キレート化剤、陰イオン性表面活性剤、または陰イオン性界面活性剤、および選択的に、尿酸もしくは尿酸塩を含む組成物の場合がある。FTA(登録商標)紙およびこの誘導体、変形体、および修飾物は、このような固体マトリックスに含まれる。
【0074】
一般に、試料が短期間(例えば1か月未満など)の保存だけを意図される場合、固体マトリックスは通常、核酸分子を安定化させる薬剤(例えばキレート化剤、界面活性剤、および尿酸もしくは尿酸塩などの薬剤)を含まない。また試料が長期間(例えば1か月以上)の保存たけを意図される場合、固体マトリックスは、核酸分子を安定化させる薬剤を含む場合がある。
【0075】
本発明の用途に適した固体マトリックスは、任意の数の形状または状態の場合がある。例えば固体マトリックスは、平面シート、またはチューブ内に充填された状態の場合がある。多数の分離後の試料を使用する場合に、平面シート状の固体マトリックスを使用することは通常有利である。平面シート、およびチューブ内に充填された状態の固体マトリックスは、加圧、遠心、または重力を利用した試料および試薬の流れを用いる、核酸の精製および単離のプロトコルに使用することができる。
【0076】
本発明の組成物および方法は、(1)精製された核酸分子、または(2)核酸分子を含む粗調製物とともに使用することができる。したがって本発明は、核酸分子を試料(例えばヒト血液、植物細胞ホモジネート、葉、種子、細菌細胞、ウイルス、ウイルスプラークなど)から精製および/または単離する方法を提供する。
【0077】
本発明の用途に適した試料は数多くの供給源から得られる。本発明の用途に適した試料の供給源は、口腔スワブ、植物細胞抽出物、植物組織、種子、動物体液、動物組織、器官、細菌培養物、真菌培養物、原生動物培養物;およびウイルスプラークなどから得られる。
【0078】
上述したように、固体マトリックスにアプライされる1つの一般的な試料がヒト血液である。ヒト血液中に存在するDNAの大部分は、白血球のミトコンドリアDNAおよび核DNAである。例えば、ヒト血液をFTA(登録商標)紙にアプライすると血液細胞が溶解し、核酸分子が紙に固着し、多くの病原体が不活性化される。
【0079】
状況によっては、固体マトリックスは、これに結合した状態の核酸分子の分解を防ぎ、また病原体を不活性化する。このような機能を発揮させるために使用可能な多数の薬剤が当技術分野で周知であり、界面活性剤、キレート化剤、抗生物質、ならびに酵素(例えばプロテイナーゼ、リパーゼ、およびヌクレアーゼ)などが含まれる。
【0080】
固体マトリックスに使用される薬剤は一般に、後にマトリックスから解放される核酸分子の質を実質的に低下させない濃度で選択されたり使用されたりする。例えば固体マトリックスからDNAを回収したい場合、RNAを選択的に分解する薬剤でマトリックスを処理する。このような薬剤の例には、RNAseや強塩基などが含まれる。当技術分野で周知の通り、DNAとは異なりRNAはアルカリ条件下で加水分解を受ける。アルカリ条件は、多くの微生物の成長を阻害することも知られている。したがって固体マトリックスのpHは、RNAを分解するために、また微生物の成長を阻害するために調節することができる。
【0081】
本発明の解放性試薬を用いて核酸分子を解放させる前に、核酸分子が結合した状態の固体マトリックスを処理して、溶媒、界面活性剤、タンパク質、他の核酸分子(例えばDNAが対象となる場合はRNA)、塩類などを除去することができる。タンパク質を例えばFTA(登録商標)紙から除去する際に当技術分野で現在用いられている1つの方法はフェノール抽出法である(例えばBurgoyne、米国特許第5,496,562号を参照)。また水溶性化合物(例えば界面活性剤や塩類など)は、マトリックスを水溶液(例えば脱イオン水)で処理することで除去できる。同様に揮発性薬剤は、マトリックスを空気または真空に曝露することで除去できる。
【0082】
試料をアプライした後、核酸を解放させる前の固体マトリックスの処理は、特定の応用によって変わる。例えば試料がタンパク質や脂質などのかなりの量の混入物質を含む状況では、このような材料を除去したり分解したりする薬剤で固体マトリックスを処理することには利点がある場合がある。また上述したように、タンパク質は固体マトリックスからフェノール抽出法で、また選択的にEDTAなどの金属イオンキレート化剤を添加してフェノールを安定化させることで除去することができる(Perlmanによる米国特許第5,098,603号を参照)。同様に、脂質および他の疎水性分子は、有機溶媒もしくは界面活性剤(例えば陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、および非イオン性界面活性剤)で洗浄することで抽出することで除去できる。
【0083】
固体マトリックスは、存在する薬剤を試料添加前に除去するように処理することもできる。例えばFTA(登録商標)紙は、試料に含まれる細胞の溶解を促す界面活性剤を含む。状況によっては、核酸を解放させる前に界面活性剤を除去することが有利な場合がある。このような界面活性剤を除去する1つの方法では、FTA(登録商標)紙を水で洗浄する。特定の状況では、適切な他の洗浄液は、水のほかに10 mM トリス、1 mM EDTA (pH 7.3または8.0)、およびFTA(登録商標) 精製用試薬(Purification Reagent)(Invitrogen Corp.、Life Technologies Division、カタログ番号10876−019)を含む。
【0084】
本発明の方法は、大きさ、および/または種類(例えばRNAかDNAか、プラスミドDNAか染色体DNAか)などの物理的特性に基づいて核酸分子を分離する際にも用いることもできる。例えば大きい核酸分子は小さい核酸分子と比較して、固体マトリックスにより強く結合する。また核酸分子の大きさが増すと、このような分子は、より強く固体マトリックスに結合すると考えられる。したがって小さい核酸分子(例えばプラスミド)は、大きい核酸分子(例えば染色体DNA)より容易に固体マトリックスから除去される。またプラスミドなどの閉環状核酸分子は、洗浄段階で固体マトリックスから解放されることが少なくない。これは直鎖状核酸分子が閉環状核酸分子と比べて、固体マトリックスと強く結合すると考えられているためである。またDNAはRNAと比較して固体マトリックスと強く結合すると考えられている。
【0085】
上述したように、本発明は、一連の物理的特性の任意の1つを元に、核酸分子を他の核酸分子から分離する方法をさらに提供する。例えば本発明は1つの局面で、DNAとRNAの両方を含む試料を固体マトリックスに接触させる段階と、これに続く、洗浄液を固体マトリックスに接触させる段階を含む、DNAをRNAから分離する方法を提供する。固体マトリックスに結合したままの核酸分子(例えばDNA)は次に、洗浄後の固体マトリックスに本発明の解放性試薬を接触させることで解放させることができる。
【0086】
当業者であれば理解するように、例えばプラスミドDNAの場合は、試料を含む固体マトリックスを解放性試薬で、洗浄段階を分断することなく、または極めて短い洗浄段階(例えば約3秒間)処理することが有利な場合がある。また例えば真核生物のゲノムDNA(例えば植物細胞や動物細胞のゲノムDNA)の場合、試料を含む固体マトリックスを1種もしくは複数の洗浄液で洗浄すること、または解放性試薬をマトリックスに接触させる段階に先立つ段階が有利な場合がある。
【0087】
1つの局面では、本発明は、直鎖状核酸分子(例えば剪断された染色体DNA)を閉環状核酸分子(例えばプラスミド)から分離する方法を提供する。したがって本発明は、直鎖状核酸分子と閉環状核酸分子の両方を含む試料を固体マトリックスに接触させる段階と、これに続く、洗浄液を固体マトリックスに接触させる段階を含む、直鎖状核酸分子を閉環状核酸分子から分離する方法をさらに提供する。固体マトリックスに結合したままの核酸分子は次に、洗浄後の固体マトリックスに本発明の解放性試薬を接触させることで解放させることができる。
【0088】
また、より大きい核酸分子は、より小さい核酸分子と比較して強く固体マトリックスと結合するので、本発明は、大きさが異なる核酸分子を分離する方法をさらに提供する。したがって本発明は、より小さい核酸分子と、より大きい核酸分子の両方を含む試料を固体マトリックスに接触させる段階、およびこれに続く、洗浄液を固体マトリックスに接触させる段階を含む、より小さい核酸分子を、より大きい核酸分子から分離する方法をさらに提供する。固体マトリックスに結合状態で留まる核酸分子は次に、洗浄後の固体マトリックスに本発明の解放性試薬を接触させることで解放させることができる。
【0089】
洗浄条件は例えば、より大きい核酸分子をマトリックスに固着、付着、(共有結合的もしくは非共有結合的に)結合、および/または会合させたまま、特定の大きさの、より小さい核酸分子を解放を促すように調節することができる。調節可能な洗浄条件の一例が洗浄時間の長さである。例えば固体マトリックスは、洗浄液で約1秒間、約5秒間、約10秒間、約20秒間、約30秒間、約45秒間、約1分間、約2分間、約5分間、約10分間、約15分間、約20分間、約30分間、約45分間、約60分間、約75分間、または約90分間洗浄することができる。当業者であれば理解するように、さまざまな洗浄条件が、さまざまな大きさの核酸分子の解放に及ぼす作用は、例えばゲル電気泳動法で容易に調べることができる。したがって当業者であれば、特定の大きさの核酸分子を、洗浄して固体マトリックスから除去し、また特定の大きさの核酸分子を同マトリックスに結合させたままとするように、洗浄条件を容易に調節することができる。また上述したように、このようなマトリックスに会合状態で留まる核酸分子は、本発明の解放性試薬を用いて後にマトリックスから除去することができる。
【0090】
上述の「より大きい核酸分子」は、平均サイズが約50kbまたはこれ以上(例えば約50kb、約100kb、約150kb、約200kb、約250kb、約300kb、約350kb、約400kb、約450kb、約500kb、約600kb、約700kb、約800kb、約900kb、約1,000kb、約1,500kb、約2,000kb、約2,500kb、約3,000kb、または約4,000kb)の場合がある。また上述の「より小さい核酸分子」は、平均サイズが約50kb未満(例えば約1kb、約5kb、約10kb、約20kb、または約40kb)の場合がある。
【0091】
同様に、上述の「より大きい核酸分子」は、平均サイズが約150kbまたはこれ以上(例えば約150kb、約200kb、約250kb、約300kb、約350kb、約400kb、約450kb、約500kb、約600kb、約700kb、約800kb、約900kb、約1,000kb、約1,500kb、約2,000kb、約2,500kb、約3,000kb、または約4,000kb)の場合があり、また上述の「より小さい核酸分子」は、平均サイズが約150kb未満(例えば約1kb、約5kb、約10kb、約20kb、約40kb、約80kb、約100kb、約120kb、または約140kb)の場合がある。
【0092】
また、上述の「より大きい核酸分子」は、平均サイズが約250kbもしくはこれ以上(例えば約250kb、約300kb、約350kb、約400kb、約450kb、約500kb、約600kb、約700kb、約800kb、約900kb、約1,000kb、約1,500kb、約2,000kb、約2,500kb、約3,000kb、または約4,000kb)の場合があり、また上述の「より小さい核酸分子」は、平均サイズが約250kb未満(例えば約1kb、約5kb、約10kb、約20kb、約40kb、約80kb、約100kb、約120kb、約140kb、約160kb、約180kb、約200kb、約220kb、または約240kb)の場合がある。
【0093】
また上述の「より大きい核酸分子」は、平均サイズが約500kbもしくはこれ以上(例えば約500kb、約600kb、約700kb、約800kb、約900kb、約1,000kb、約1,500kb、約2,000kb、約2,500kb、約3,000kb、または約4,000kb)の場合があり、また上述の「より小さい核酸分子」は、平均サイズが約500kb未満(例えば約1kb、約5kb、約10kb、約20kb、約40kb、約80kb、約100kb、約120kb、約140kb、約160kb、約180kb、約200kb、約220kb、約240kb、約250kb、約300kb、約350kb、約400kb、または約450kb)の場合がある。
【0094】
また、上述の「より大きい核酸分子」は、平均サイズが約1,000kbもしくはこれ以上(例えば約1,000kb、約1,500kb、約2,000kb、約2,500kb、約3,000kb、または約4,000kb)の場合があり、また上述の「より小さい核酸分子」は、平均サイズが約1,000kb未満(例えば約1kb、約5kb、約10kb、約20kb、約40kb、約80kb、約100kb、約120kb、約140kb、約160kb、約180kb、約200kb、約220kb、約240kb、約250kb、約300kb、約350kb、約400kb、約450kb、約500kb、約550kb、約650kb、約750kb、約850kb、または約950kb)の場合がある。
【0095】
また本発明の方法で用いられる解放性試薬が、固体マトリックスから除去されることが望まれる実質的な量の細胞混入物、または核酸分子を可溶化しない場合は、固体マトリックスの中間処理(例えば洗浄)が、解放性試薬による処理を行う前に必要な場合がある。このような状況の一例が、試料を種子材料から得る場合である。種子は多量の糖質を含む。本発明の解放性試薬では、固体マトリックスから実質的な量の種子糖質は解放されない。したがって試料が種子材料を含む多くの場合は、試料を固体マトリックスに直接アプライした後に、中間処理を行うことなく解放性試薬で処理することができる。結果として固体マトリックスから核酸分子が解放され、種子糖質の大部分はマトリックスに結合した状態で留まる。
【0096】
本発明の解放性試薬は水性または非水性の場合がある。当業者であれば理解するように、解放性試薬の用途に適したさまざまなアルカノールアミンは、水溶液と非水溶液中で異なる溶解性を示す。また溶媒系の選択は、特定の応用、試料、および固体マトリックスによって変わる場合がある。本発明の解放性試薬に使用可能な非水性溶媒の例には、エタノール、メタノール、プロパノール、ブタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド(DMSO)、およびN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)などが含まれる。
【0097】
本発明の方法の1つの特定の態様では、核酸分子を結合させる2 mmのFTA(登録商標)紙のパンチを、1% モノエタノールアミンの水溶液(pH 11.0)を含む解放性試薬中に90〜100℃で20分間浸す。この態様では、実施例2で詳述するように、実質的な量の核酸分子がFTA(登録商標)パンチから解放される。当業者であれば理解するように、このような方法は、特定の応用に適するように修正することができる。したがって1つの一般的な局面では、本発明は、特定の条件下で一定の期間、アルカノールアミンを含む溶液を固体マトリックスに接触させる段階を含む、固体マトリックスから核酸分子を除去する方法に関する。
【0098】
特定の態様では、解放性試薬中のアルカノールアミン(例えばエタノールアミン)の濃度は、約0.01%〜約5.0%(容積/容積)、約0.01%〜約4.0%(容積/容積)、約0.01%〜約3.0%(容積/容積)、約0.01%〜約2.0%(容積/容積)、約0.01%〜約1.0%(容積/容積)、約0.01%〜約0.9%(容積/容積)、約0.01%〜約0.8%(容積/容積)、約0.01%〜約0.5%(容積/容積)、約0.1%〜約5.0%(容積/容積)、約0.1%〜約4.0%(容積/容積)、約0.1%〜約3.0%(容積/容積)、約0.1%〜約2.0%(容積/容積)、約0.1%〜約1.0%(容積/容積)、約0.1%〜約0.9%(容積/容積)、約0.1%〜約0.8%(容積/容積)、約0.1%〜約0.5%(容積/容積)、約0.2%〜約5.0%(容積/容積)、約0.2%〜約4.0%(容積/容積)、約0.2%〜約3.0%(容積/容積)、約0.2%〜約2.0%(容積/容積)、約0.2%〜約1.0%(容積/容積)、約0.2%〜約0.9%(容積/容積)、約0.2%〜約0.8%(容積/容積)、約0.2%〜約0.5%(容積/容積)、約0.4%〜約5.0%(容積/容積)、約0.4%〜約4.0%(容積/容積)、約0.4%〜約3.0%(容積/容積)、約0.4%〜約2.0%(容積/容積)、約0.4%〜約1.0%(容積/容積)、約0.4%〜約6.9%(容積/容積)、約0.4%〜約0.8%(容積/容積)、約0.4%〜約0.7%(容積/容積)、約0.8%〜約5.0%(容積/容積)、約0.8%〜約4.0%(容積/容積)、約0.8%〜約3.0%(容積/容積)、約0.8%〜約2.0%(容積/容積)、または約0.8%〜約1.0%(容積/容積)である。本発明は、約0.01%(容積/容積)、約0.1%(容積/容積)、約0.2%(容積/容積)、約0.4%(容積/容積)、約0.7%(容積/容積)、約0.8%(容積/容積)、約0.9%(容積/容積)、約1.0%(容積/容積)、約1.1%(容積/容積)、約1.2%(容積/容積)、約1.4%(容積/容積)、約1.6%(容積/容積)、約1.8%(容積/容積)、約2.0%(容積/容積)、約2.5%(容積/容積)、約3.0%(容積/容積)、約3.5%(容積/容積)、約4.0%(容積/容積)、約4.5%(容積/容積)、または約5.0%(容積/容積)を含む解放性試薬をさらに含む。
【0099】
使用されるアルカノールアミンの濃度は、特定のアルカノールアミン、試料中に存在する非核酸化合物の溶解度、解放性試薬のpH、インキュベーション条件(例えばインキュベーション時間の長さ、およびインキュベーション温度)、ならびに使用される固体マトリックスを含む因子の数によって変わる。当業者であれば、特定の応用に適したアルカノールアミン濃度の決定法を理解すると思われる。同様に当業者であれば、特定の応用に適したアルカノールアミンの選択法を理解すると思われる。
【0100】
本発明の解放性試薬のpHは例えば以下の範囲とすることができる:約8.0〜約14.0、約8.5〜約14、約9.0〜約14.0、約9.5〜約14.0、約10.0〜約14.0、約10.5〜約14.0、約11〜約14.0、約7.5〜約13.5、約7.5〜約13.0、約7.5〜約12.5、約7.5〜約12.0、約7.5〜約11.5、約7.5〜約11.0、約7.5〜約10.5、約7.5〜約10.0、約7.5〜約9.5、約8.0〜約12.0、約8.0〜約11.5、約8.0〜約11.0、約8.5〜約14.0、約8.5〜約13.0、約8.5〜約12.5、約8.5〜約12.0、約8.5〜約11.5、約8.5〜約11.0、約9.0〜約12.0、約9.0〜約11.5、約9.0〜約11.0、および約9.0〜約10.5。本発明は、pHが約8.0、約8.5、約9.0、約9.5、約10.0、約10.5、約11.0、約11.5、約12.0、約12.5、約13.0、約13.5、または約14.0の解放性試薬をさらに含む。
【0101】
本発明の用途に適したアルカノールアミンは緩衝剤として作用しうる場合がある。したがって条件によっては、本発明の実施に使用されるアルカノールアミンを溶媒(例えば水)で希釈し、酸または塩基で直接pHを調整することができる。他の状況では、解放性試薬中に緩衝剤(例えばトリス、2−[(トリス(ヒドロキシメチル)メチル)アミノ]−1−エタンスルホン酸(TES)、メチルアミン、CAPS、4−シクロヘキシルアミノ)−1−ブタンスルホン酸(CABS)、2−(N−シクロヘキシルアミノ)エタンスルホン酸(CHES)、トリシン(Tricine)、またはビシン(Bicine))を含めることが求められたり、望ましい場合があったりする。本発明の解放性試薬の用途に適した緩衝剤は、Sigma−Aldrich Corporation(3050 Spruce Street、St. Louis、MO 63103 USA)などの業者から入手することができる。
【0102】
本発明の方法は、固体マトリックスを解放性試薬とさまざまな温度で、またさまざまなインキュベーション時間でインキュベートすることで実施できる。例えばインキュベーションは、約65℃〜約100℃、約70℃〜約100℃、約80℃〜約100℃、約90℃〜約100℃、約65℃〜約90℃、約70℃〜約90℃、約80℃〜約90℃、約65℃〜約80℃、または約70℃〜約80℃の温度範囲で実施することができる。またインキュベーションは、約65℃、約70℃、約75℃、約80℃、約85℃、約90℃、約95℃、または約100℃などの温度で実施することができる。
【0103】
上述したように、核酸を解放させることが望まれる固体マトリックスは、解放性試薬とさまざまな時間インキュベートすることができる。当業者であれば理解するように、長いインキュベーション時間は、解放性試薬中の核酸分子の濃度と、固体マトリックスに結合状態の核酸分子の濃度が平衡に至るまで核酸分子の解放をもたらす。
【0104】
固体マトリックスは解放性試薬と、1〜60分間、5〜50分間、10〜40分間、20〜30分間、20〜40分間、30〜50分間、40〜60分間、または40〜90分間などのさまざまな時間インキュベートすることができる。またインキュベーションは、約1分間、5分間、10分間、15分間、20分間、25分間、30分間、35分間、40分間、45分間、50分間、55分間、60分間、65分間、70分間、75分間、80分間、85分間、90分間、120分間、180分間、または240分間実施することができる。このようなインキュベーション時間は、シート状の固体マトリックスから核酸分子を放出させる場合に有用な場合が少なくない。
【0105】
インキュベーション時間の長さが特定の条件で変わることは言うまでもない。比較的長いインキュベーション時間(例えば8時間、1日間、2日間、3日間、5日間、7日間)が望ましい条件の例には、固体マトリックス上の核酸分子の濃度が低く、アルカノールアミン濃度が低く(例えば0.1%のエタノールアミン)、および/またはインキュベーション時間が短い(例えば70℃またはそれ以上)といった条件が含まれる。
【0106】
また、インキュベーション時間の長さを始めとする他のインキュベーション条件は、試料に含まれる核酸分子の特定の量またはパーセンテージが解放性試薬中に解放されるように変えることができる。例えばインキュベーション条件は、固体マトリックス上に存在する核酸の0.5%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%が解放性試薬中に解放されるように調節することができる。当業者であれば、特定の応用に適したインキュベーション条件を決定する方法を理解すると思われる。
【0107】
本発明の方法の用途に適したチューブ状/カラム状の固体マトリックスは例えば以下の属性を有する。固体マトリックスは、チューブ内に、その一端から別の端にかけて、一端(先端)の空間に試料が収容されるように配することができる。このような態様では、固体マトリックスは一般にチューブ内において側壁から側壁へ広がる。したがって、チューブを通過する液体の大部分は、必然的に固体マトリックスを通過することになる。このような状況では、固体マトリックスおよびチューブは、クロマトグラフィーに使用されるカラムに似た構造をとる場合がある。したがって、このような固体マトリックス/チューブフォーマットは、「固体マトリックスカラム」と呼ばれる。上述したように固体マトリックスは、このようなカラム内に密な状態または緩い状態で充填される場合がある。
【0108】
本発明の平面シートの態様に関しては、固体マトリックスカラムにアプライされた試料を、上述の溶液で洗浄することができる。また、固体マトリックスカラムからの核酸分子の解放は、解放性試薬をカラムに通すことで誘導することができる。本発明の1つの特定の局面では、固体マトリックスカラム中のマトリックスを室温で洗浄して混入物質を除去する。次にカラムの底に栓をして液体が漏れないようにし、カラムを95℃で加熱した後に、解放性試薬(これも90℃に加熱)をカラムに注入する。カラムの底の栓を十分な時間開放して、解放性試薬をカラム内に行き渡らせてから再び栓を閉める。30分間の95℃におけるインキュベーション後に、カラムの栓を再び外して、解放性試薬を核酸分子とともにカラムから排出させる。具体的な1つの局面では、固体マトリックスカラムは、遠心装置内に収容可能なスピンカラムであり、解放性試薬をカラムから遠心除去する。
【0109】
当業者であれば理解するように、インキュベーション条件は、上述のインキュベーション条件と同様に変えることができる。また特定のインキュベーション時間も、試料、固体マトリックスから解放される核酸分子、および固体マトリックスそのものによって変わる。当業者であれば、特定の応用に適したインキュベーション条件を決定する方法を理解すると思われる、
【0110】
固体マトリックスから解放された核酸分子は、核酸合成、制限酵素による切断、ハイブリダイゼーション反応、他の核酸分子との連結、配列決定、増幅(例えばPCR)、形質転換、およびトランスフェクションなどの、1つもしくは複数の標準的な分子生物学的方法で使用することができるほか、操作することができる。一般に、解放された核酸分子は、別の溶媒(例えばトリス−EDTA)で希釈して、意図した用途(例えばPCR)に適した解放核酸分子/可溶化核酸分子とした後に使用される。
【0111】
本発明の組成物および方法は、固体マトリックスから比較的低塩量の溶液中へ核酸分子が解放されるように設計することができる。また上述したように、核酸分子を含む解放性試薬の塩濃度は、希釈することで低下させることができる。塩含量が望ましい量と比較して高い状況では、核酸分子を標準的な方法で使用前に脱塩処理することができる(例えば核酸分子をアルカノールアミンから分離することができる)。
【0112】
本発明は、本発明の方法で調製された核酸分子を含む組換え宿主細胞、ならびにこのような核酸分子を含む組換え宿主細胞の調製法をさらに提供する。適切な宿主の代表例には、細菌細胞(例えば大腸菌、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、真菌細胞(例えば出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)、アカパンカビ(Neurospora crassa))、昆虫細胞(例えばショウジョウバエ(Drosophila)S2細胞、スポドプテラ(Spodoptera)Sf9細胞)、動物細胞(例えばCHO細胞、COS細胞、Bowesメラノーマ細胞)、および植物細胞などがある。上述の宿主細胞の適切な培地および培養条件は当技術分野で周知である。
【0113】
本発明の方法で調製された核酸分子は、標準的な実験マニュアル(例えばSambrook、J.ら編、MOLECULAR CLONING、A LABORATORY MANUAL、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y. (1989)、第9章;Ausubel、F.ら編、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、John H. Wiley & Sons, Inc.(1997)、第16章を参照)に記載された、エレクトロポレーション、DEAE−デキストランによるトランスフェクション、トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン性脂質によるトランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレイプローディング(scrape loading)、微粒子銃による導入、および感染などを含む方法で宿主細胞に導入することができる。核酸分子を宿主細胞に導入する方法は例えば、Felgnerら、米国特許第5,580,859号に記載されている。
【0114】
本発明の方法で調製される核酸分子は、ベクター配列の染色体への組込みを可能とする遺伝因子を含む場合もある。このような因子は、異種配列の安定な維持に有用であり、部位特異的な組込み、および部位に依存しない組込みの両方をもたらす配列を含む。部位特異的な組込み(例えば相同的組込み)、および部位に依存しない組込み(「ランダムな組込み」と呼ばれることもある)は、異種対象配列の宿主細胞染色体への導入に用いることができる。遺伝材料の真核生物の染色体への挿入に関する記述および方法は例えばSambrook, J.ら編(MOLECULAR CLONING、A LABORATORY MANUAL、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y. (1989))を始めとする多くの情報源に記載されている。
【0115】
III.試料処理の自動化
本発明は、個々の個々の試料からの核酸分子の精製および/または単離に加えて、いくつかの応用に適した組成物、方法、および試薬を提供する。このような応用の一例は、集団の構成要素を代表する試料の収集物に由来する核酸分子の精製および/または単離である。
【0116】
1つの態様では、プレート上にウイルスプラーク(例えばT4ファージのプラーク)を含む試料を固体マトリックスに移す。特定の応用では、次に固体マトリックスを、後に使用するまで保存するか、または解放性試薬で処理して、ウイルスの核酸分子を解放させる。多くの場合、固体マトリックスを、さまざまな核酸分子を含む切片に切断する。固体マトリックスの断片化はランダムな場合があるほか、例えば特定のウイルスプラークに対応する核酸分子を含む個々の小片を生じる場合がある。
【0117】
同様に、さまざまな非ウイルス供給源に由来する試料を固体マトリックスに移して、個々の核酸分子の調製に使用することができる。例えば、さまざまな核酸分子を含む試料(例えば細菌培養物)を96ウェルプレート(例えば96ウェルマイクロプレート(96 well MicroPlate)の各ウェル内で調製することができる。このような試料の一部を次にDNAカードレジストレーションツール(DNA Card Registration Tool)(カタログ番号VP382CS)、およびスロットピンスポッター(Slot Pin Spotter)(カタログ番号VP408S5)(V&P Scientific, Inc.、9823 Pacific Heights Boulevard、Suite T、San Diego、CA 92121 USAから入手可能)を用いて固体マトリックスに移すことができる。この装置を用いて、96試料ウェルのそれぞれから5 μlをFTA(登録商標) クローンセーバー96カード(CloneSaver 96 Card)(Invitrogen Corp.、Life Technologies Division、9800 Medical Center Drive、RockviIIe、MD 20850 USAから入手可能)に一度に移すことができる。選択的に色素(例えばブロモフェノールブルー)を各試料ウェルに添加して、FTA(登録商標) クローンセーバー96カード(CloneSaver 96 Card)へアプライした後に試料位置をマークすることができる。
【0118】
FTA(登録商標) クローンセーバー96カード(CloneSaver 96 Card)などの固体マトリックスに試料をアプライしたら、固体マトリックスを小片に切断して、各試料がアプライされたマトリックスの部分を分離する。試料が特定のパターンでアプライされた状況(例えばDNAカードレジストレーションツール(DNA Card Registration Tool)、スロットピンスポッター(Slot Pin Spotter)、およびFTA(登録商標) クローンセーバー96カード(CloneSaver 96 Card)が上述のように使用される状況)では、各試料を分離するために固体マトリックスを切断するための装置を容易に設計することができる。FTA(登録商標) クローンセーバー96カード(CloneSaver 96 Card)を例にとると、試料を含む96か所の一部もしくは全体に対応するカードの部分にパンチを開けるように装置を設計することができる。このような各カード片を次に96ウェルプレートの各ウェル内に配し、さまざまな試薬で処理して混入物質を除いて核酸分子を解放させる。例えば試薬(例えば洗浄液)は、各ウェルに添加した後に吸引除去することができる。また解放性試薬を各ウェルに添加後に、吸引除去して別の容器に移すことができる。これに代わる1つの方法として、固体マトリックス(例えばカード片)を、インキュベーション後にウェルから除去して核酸分子を残すことができる。別の代替法として、固体マトリックスを、解放された核酸分子とともにウェル内に残すことができる。最適な作用過程は、核酸分子が使用される特定の応用によって変わる。
【0119】
本発明の自動化法の1つの特定の応用は、PCRによる核酸分子の高スループットの増幅と、これに続く増幅産物の配列決定である。系は、固体マトリックスにアプライされる各試料が、さまざまな核酸分子を含む細胞またはプラークを含むように設計することができる。
【0120】
また、本発明の組成物および方法で核酸分子を解放することができる核酸試料は、利便性を考慮して調製、保存、および販売するか、または本発明の方法で使用するために個人もしくは組織に移される場合がある。
【0121】
本発明の他の特定の態様では、ロボットシステムで、試料を用いた遺伝子型の判定に必要な本質的にすべての段階を行うことができる。このような応用では、96個の試料を収容して、補強用基材を有するように設計された試料カードを使用することができる。このような補強用基材は、カードの耐久性を増すことで、ロボットシステムによるカードの取扱いが容易になる点で有利である。液体ハンドリングシステムは、試料カード(例えばFTA(登録商標) クローンセーバー96カード(CloneSaver 96 Card))上のおおよその位置に試料(例えば各5 μl)を含む液体を蓄積するために使用される。試料を乾燥させた後に、同じ装置または別の装置が、各試料を含む、カードの部分を切断する(例えば2 mmの円がカードから打ち抜かれる)。このようなカードの部分は次に、同装置によって96ウェルプレートのウェル内に配される。試薬は、液体取扱い装置によってウェルに添加および除去される。熱サイクリングは例えばプレート上で実施することもできる。また、可溶化状態の核酸分子を含むウェルに由来する液体の一部を除去して別の容器内に配し、制限酵素切断断片長多型(RFLP)解析またはサザンブロット解析を行うことができる。
【0122】
本発明の過程は、多数の試料を用いて遺伝子型データを得る際に特に有用である。例えば多数の個体の遺伝子型解析は、本発明の過程でヒト血液を対象に実施した後に、蛍光プライマーを用いてPCRを行い、また自動配列決定装置で配列を決定することができる。
【0123】
本発明の過程はまた、植物、微生物、および非ヒト動物から得られた多数の試料の遺伝子型解析にも有用である。植物を例にとると、多数の植物試料を調製し、1つまたは複数の遺伝子型に関与する遺伝特性を対象にスクリーニングを行うことができる。これは特に、特定の地域で成長させた植物の特定の遺伝子型を判定する際に有用である。例えばダイズに由来する材料(例えば葉または種子)は、特定の地域の農場から採取することができる。植物材料は、固体マトリックスに直接アプライするか、または溶液中に分散させてから試料を添加することができる。
【0124】
植物材料、または他の任意の固体材料を固体マトリックスに直接アプライする場合は、圧縮力を用いて材料をマトリックスにアプライすることが通常有利である。言い替えると、固体材料を固体マトリックスの表面に押しつけて破砕させる場合がある。
【0125】
固体材料を固体マトリックスにアプライするには装置を使用することができる(例えばハンマー)。1つの態様では、このような装置は、核酸分子を含む固体材料を最初に収容するチャンバーを含む。ピストン、またはピストン様物体をチャンバーの一端に配し、固体マトリックスをもう一端に配する。したがって、ピストンまたはピストン様物体が、固体マトリックスへ向かって動くことで、固体材料が、固体マトリックスの表面に押しつけられる。固体材料に由来する核酸分子は、この過程中に固体マトリックス上に蓄積する。装置は選択的に、固体マトリックスの裏側を支持して固体材料がマトリックスを強制的に通過しないようにする固体部分を有する。この固体部分は、固体マトリックスが、ピストンまたはピストン様物体によって加えられて構造の全体性が損なわれる圧力に耐えるほど十分硬い場合には、必ずしも必要ではない。
【0126】
上記の装置は特に、特定の地域で植物材料試料を収集する際に有用である。このような装置は一般に比較的小型で、携帯性に優れ、またマニュアルで圧力を加えながら操作することができる。また、このような装置を使うことで、固体マトリックスへアプライするための試料溶液を調製する必要はなくなる。同装置ではまた、固体マトリックスの表面に均一に試料をアプライすることができる。したがって別の局面では、本発明は、試料を固体マトリックスにアプライするための装置を提供し、この装置は(1)核酸分子(すなわち試料)を含む固体材料を収容するチャンバー、(2)チャンバーの一端にあるピストンまたはピストン様物体、および(3)チャンバーの別の端に固体マトリックスを固定する結合部分を有する。
【0127】
本発明の方法に使用可能な植物には、ダイズ、トウモロコシ、ライムギ、コムギ、ソルガム、イネ、ピーマン、トウガラシ、エンドウマメ、マツ、アメリカハリモミ(blue spruce)、カエデ、草本(例えばKentucky Blue Grass)、およびワタが含まれるがこれらに限定されない。本発明の方法に使用可能な植物の部分には、茎、根、種子、葉、花弁、および萼片が含まれる。
【0128】
本発明の遺伝子型解析の方法は、地域を越えた植物系列および遺伝子マーカーの拡散のモニタリングに有用である。このような方法は、遺伝子組換え生物(G.M.O.)検出にも有用である。G.M.O.の一例は、別のG.M.O.の種子から成長させた植物である。したがって本発明は、植物から試料を得る段階、試料を固体マトリックスにアプライする段階、固体マトリックスに結合した状態の核酸分子を解放させる段階、および核酸分子を解析して、試料の供給元となった植物のある遺伝形質を関連する遺伝子型を判定する段階を含む、G.M.O.を同定する方法を提供する。関連する態様では、複数の形質に関連する遺伝子型(例えば2種、3種、4種、または5種)を判定することができる。
【0129】
植物材料をスクリーニングして、G.M.O.ならびに特定の植物系列を同定/検出する際には、分子マーカー検出法が一般に用いられる。例えばPCRを行うことで、1コピー遺伝子である核酸分子を増幅することができる。増幅された核酸分子を次に、配列決定、RFLP解析、またはハイブリダイゼーション解析などの方法で解析し、特定の植物がG.M.O.か否かを判定することができる。
【0130】
IV.キット
本発明の他の態様は、固体マトリックスから核酸分子を解放させるためのキット、ならびに核酸分子を精製および/または単離するためのキットを含む。キットは例えば、ひとまとめにされた複数の成分および試薬を提供することで、本発明の方法の実施を容易にする。また、このようなキットの試薬は、方法の精度および信頼性を高めるために、事前に測定された単位で供給される場合がある。
【0131】
固体マトリックスから核酸分子を除去するための本発明のキットは一般に、箱などのカートン、箱、チューブ、アンプル、ジャー、バッグ、プレートなどの1個または複数の容器、および1種類または複数の解放性試薬、ならびに以下からなる群より選択される1種または複数の成分を含む:(a)少なくとも1種類(例えば1種類、2種類、3種類、4種類、5種類、10種類、20種類、50種類、100種類)の固体マトリックス;(b)試料を固体マトリックスにアプライするための少なくとも1つの装置;(c)固体マトリックスを切断して、試料を含む切片にする少なくとも1つの装置;ならびに(d)少なくとも1種類の洗浄液。
【0132】
固体マトリックスに試料をアプライするための装置は、試料のアプライに使用可能な任意の装置を本質的に含む。このような装置の1例は、上述したような、96種の試料を固体マトリックスに一度にアプライする際に使用されるDNAカードレジストレーションツール(DNA Card Registration Tool)、およびスロットピンスポッター(Slot Pin Spotter)である。他の例には、ミクロキャピラリーチューブ、およびピペット(例えばピペットマン(Pipetman)(商標)などのマイクロピペット)、ならびに液体の移送に使用可能な他の装置が含まれる。さらに他の例には、実施例1で説明する、また固体材料を固体マトリックスにアプライする段階について上述した両方の装置などが含まれる。
【0133】
試料を含む切片に固体マトリックスを切断する装置は、紙やカードなどの材料を切断する装置を含む。このような装置の例には、はさみ、剃刀、ナイフ、およびハリスマイクロパンチ(HARRIS MICRO PUNCH)(商標) 装置などが含まれる。ハリスマイクロパンチ(HARRIS MICRO PUNCH)(商標) 装置のような装置が特に有用である理由は、固体マトリックスの、比較的均一な大きさ(例えば1.2 mmや2 mmなど)の円形片への切断に使用可能なためである。
【0134】
本発明のキットに供給される洗浄液は、キットが対象とする特定のアプライ法によって変わる。1例として、高濃度の脂肪および脂質を含む試料(例えば脂肪組織)からの高分子量の核酸分子の精製および/または単離用にキットが設計される場合、キットに含まれる1種もしくは複数の洗浄液は一般に界面活性剤(例えばトライトン(TRITON)X−100)を含む。
【0135】
またキットに複数の洗浄液が含まれる場合、洗浄過程の初期段階に使用される溶液は、後の洗浄段階で除去される薬剤を含む場合がある。例えば2つの洗浄段階を行う場合、第1の洗浄段階で使用される洗浄液は界面活性剤を含む場合がある。しかし、第2の洗浄段階で使用される洗浄液は界面活性剤を含まない場合があり、また第1の洗浄液によって固体マトリックスに添加された界面活性剤を除去するために部分的に使用される場合がある。
【0136】
本発明のさまざまな態様に使用可能な洗浄液の例には、10 mM トリス、1 mM EDTA (pH 7.3);水;および界面活性剤を含む溶液が含まれる。
【0137】
試料容器および容器の固体マトリックスも本発明のキットに含まれる場合がある。本発明のいくつかの態様における用途に適した容器の1例が、FTA(登録商標) 96ウェルマイクロプレート(96 well MicroPlate) (Invitrogen Corp.、Life Technologies Division、カタログ番号10786−028)である。このようなプレートは例えば、固体マトリックスにアプライする前の試料と、試料を含む固体マトリックスの小片の両方を収容するために使用することができる。
【0138】
カラムも、本発明のキット(例えば遠心処理(例えば微量遠心)に適したカラム)に含まれる場合がある。このようなカラムは例えば、試料を脱塩処理したり、より大きい核酸分子と、より小さい分子(ヌクレオチド、タンパク質、RNAなど)を分離したりする際に使用される。このようなカラムは当技術分野で周知であり、例えば、分子量に基づく分離用に設計された材料(セファデックス(Sephadex)(登録商標) G−50など)を含む場合がある。
【0139】
関連する技術分野の当業者であれば、本明細書に記載された方法および応用の他の適切な修正および変更が、当業者に既知の情報に鑑みて、本明細書に含まれる本発明の記述から容易に明らかになること、また本発明の範囲もしくは本発明の任意の態様から解離することなくなされることを理解すると思われる。本発明について詳細に説明したが、同内容は、説明のみを目的として本発明を制限する意図のないように含まれる以下の実施例を参照することで、さらに明瞭に理解されると思われる。
【0140】
実施例
実施例1
個々の木(Pinus pinus)に由来する松葉を、シェナンドー国立公園のさまざまなな場所から集める。個々の木の松葉を、FTA(登録商標) クローンセーバー96カード(CloneSaver 96 Card)の表面に配し、ハンマーを用いてカード上で押しつぶす。松葉は、カード上の各位置が1本の木にのみ由来する試料材料を含むようにカード中に配される。各試料をカードにアプライする際には、試料を特定の木に関連づけるために記録をつけておく。試料をカード上のすべての試料位置にアプライしたら、解析目的で実験室にカードを移すまで常温で保存する。
【0141】
実験室では、試料をFTA(登録商標)カードから、マット付きのハリスマイクロパンチ(HARRIS MICRO PUNCH)(商標) 装置を用いて「打ち抜く」。結果として得られる2 mmのパンチを次に、96ウェルプレートのウェル内に移し、トリス−EDTA (pH 7.3)で洗浄する。次に、KOHでpH 11.0に調節した50 μlのエタノールアミンを各ウェルに添加する。90℃で30秒間インキュベートした後に、解放された核酸分子を含む各ウェルの液体を吸引除去して0.5 mlの微量遠心チューブに移し、後にPCR反応で使用するまで凍結保存する。
【0142】
実施例2
方法
25 μlの新鮮な血液を、FTA(登録商標) クローンセーバー96カード(CloneSaver 96 Card)の各位置に、モデルP−200のピペットマン(Pipetman)(商標)(Rainin Instrument Company, Inc.、Rainin Road、Box 4026、Woburn、MA、01888)を用いてスポットした。カードは使用するまで室温で保存した。
【0143】
解放性試薬は水で0.01%〜1%の濃度に希釈したエタノールアミンを含むものを用いた。pH範囲は8.3〜13とした。pHはKOH水溶液を添加して調節した。最高の結果はpH 11で1%の濃度で得られた。エタノールアミン試薬を、15 mMおよび30 mMのCABS [4−(シクロヘキシルアミノ)−1−ブタンスルホン酸]緩衝液、CAPS[3−(シクロヘキシルアミノ)−1−プロパンスルホン酸]緩衝液、ジェントラ溶出緩衝液2(Gentra Elution Buffer 2) (ジェネレーション(GENERATION)(商標) キャプチャーカラム(CAPTURE COLUMN)(商標)キット(Gentra Systems社、13355 10th Avenue N.、Suite 120、Minneapolis、MN 55441、USA)とともに使用)、およびアンプダイレクト(AmpDirect) (Shimadzu, Inc.、1、Nishinokyo Kuwabaracho、Nakagyou−ku、Kyoto 604−8511、Japan)と比較した。
【0144】
試料をアプライした後に、FTA(登録商標)のパンチを、FTA(登録商標) 精製用試薬(Purification Reagent)(Invitrogen Corp.、Life Technologies Division、カタログ番号10876)、およびTE緩衝液を用いて業者の推奨手順で洗浄した。
【0145】
解放性試薬は2 mmのパンチあたり50 μlを添加した。次にパンチを90〜100℃で1〜30分間加熱した。最良の結果は、PCR解析では10〜20分間で得られた。この結論は、図1および図3で得られた結果に基づく。図1は、100 pg/mlが10分後に解放されることを示す。20分後の時点では、約1 ng/mlが解放性試薬によって解放されている。図4は、解放されたDNAを用いて得られたPCRの結果が、10分、15分、または20分の加熱後の結果と同等であることを示している。しかしPCR産物を1:10に希釈すると、産物量の差は顕著となる。ジェントラ溶出緩衝液2(Gentra Elution Buffer 2) およびエタノールアミン解放性試薬は、検討した他の試薬と比較して良好に機能した。PCR反応において、15分間および20分間の加熱で明瞭に視認可能となったPCR産物を1:10に希釈してゲルにロードする。
【0146】
解放されたDNAの濃度は、アセス(ACES)(商標)2.0+ヒトDNA定量システム(2.0+ Human DNA Quantitation System)を用いて決定した。この系では、10 μlの解放DNAを定量に用いる。定量後、解放された各DNAの挙動を、遺伝子型を判定するPCRアッセイ法で使用時の増幅産物を産生する能力について検討した。これは、標準的な遺伝子型PCRアッセイ法を準備した後に、1 μlの解放されたDNAを添加して検討した。各PCRアッセイ法は、総容量15 μlで行った。PCR産物は、1.5% アガロースゲルを用いた電気泳動で解析した。電気泳動は100ボルトで1時間かけて行った。次にゲルを臭化エチジウムで染色し、写真を撮影した。
【0147】
理解を助ける目的で、図および実施例を挙げて本発明をある程度詳しく説明したが、同内容が、本発明の範囲、または任意の特定の態様に影響を与えることなく、条件、剤形、および他のパラメータの広範囲で等価な範囲内で本発明を修正または変更することで実施されうること、また、このような修正または変更が、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されることは当業者に明らかである。
【0148】
本明細書で言及されたすべての出版物、特許、および特許出願は、本発明が属する技術分野の程度を示し、個々の出版物、特許、特許出願が具体的に、また個別に参照として組み入れられるのと同程度に本明細書に参照として組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【0149】
【図1】アセス(ACES)(商標)2.0+ヒトDNA定量システム(2.0+ Human DNA Quantitation System)(Invitrogen Corp.、Life Technologies Division、カタログ番号10294−015)を用いて実施したDNA定量アッセイ法の結果。図1に示したナイロンメンブレンは、同システムで提供されるプローブを用いて製造業者の指示書にしたがって調製した。この結果から、さまざまな試薬が、100℃で10〜20分間加熱することで、FTA(登録商標)紙の2 mmの血液パンチからDNAを解放させる能力をもつことがわかる。検討したすべての試薬が、20分間の加熱後に2 mmのパンチあたり50〜100 ngのDNAを解放した。加熱時間は3−(シクロヘキシルアミノ)−1−プロパンスルホン酸(CAPS)緩衝液にほとんど影響を及ぼさず、すべての加熱時間で解放されたDNAはほぼ同量であった。
【図2】濃度およびpHが、エタノールアミンによるFTA(登録商標)紙からのDNAを解放させる能力に及ぼす作用を示す、図1に記載されたように実施したアセス(ACES)定量アッセイ法の結果。図の左側に示すDNA濃度は、0.2 ng、0.4 ng、1 ng、2 ng、4 ng、10 ng、20 ng、および40 ngである。パンチは、50 μlのエタノールアミン溶液中で100℃で10分間インキュベートした。10 μlの解放されたDNAを定量に用いた。0.025%〜0.2%の濃度のエタノールアミン(いずれもpH 11)は、DNAのFTA(登録商標)紙からの解放にそれほど大きな影響を及ぼさなかった。しかしpHの変化はDNAの解放に影響を与えた。pH 8.3では、パンチあたり0.5 ngのDNA が解放されている。pH 9.7およびpH 13では、パンチあたり2 ngのDNAが解放されている。pH 11では、パンチあたり10 ngのDNAが解放されている。したがって実施例2で説明するように、解放されたDNAの量に関する最大収量はpH 11で得られた。
【図3】エタノールアミン濃度が、FTA(登録商標)紙からのDNAの解放に及ぼす作用を示す、図1に記載されたように実施したACES定量アッセイ法の結果。10 μlの解放されたDNAを、このアッセイ法に用いた。すべてのエタノールアミン溶液のpHは11とした。エタノールアミン濃度を0.00025%から0.025%に上昇させると、より多くのDNAがパンチから解放される。ほとんどのDNA (約50 ng)は1%の濃度で解放された。0.2%では約10 ngのDNAが解放された。試験の目的上、エタノールアミン濃度は0.2%および1%とした。
【図4】さまざまな試薬を用いてFTA(登録商標)紙から解放された核酸分子を対象に行われたPCRを示すアガロースゲル。パンチを、0.2% エタノールアミン(pH 11)中で10分間、15分間、または20分間加熱した。PCRは以下の手順で行った。各15 μlのPCR反応を、1 μlの解放されたDNAを用いて行った。PCR反応緩衝液は、20 mM トリス−HCl (pH 8.4)、50 mM KCl、1.5 mM MgCl2、200 μM dNTP、5 μl プライマー、0.04単位のプラチナ(Platinum)(登録商標)Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen Corp.、Life Technologies Division、9800 Medical Center Drive、Rockville、MD 20850 USA、カタログ番号10966−018)、およびD1S197マイクロサテライトマーカーDNA増幅用のプライマー対を含むものを使用した。熱サイクリングは以下の温度変化で行った:80℃で10分間、および94℃で1分間;94℃で30秒間、55℃で30秒間、および72℃で1分間を10サイクル;89℃で30秒間、55℃で30秒間、および72℃で1分間を20サイクル;ならびに72℃で10分間の最終伸長。PCR反応産物は分析を実施するまで4℃で保存した。5 μlのPCR反応物をアガロースゲルにロードした。また、1:10に希釈した5 μlのPCR反応物も、各検討試薬で得られた産物の量に差があるか否かを判定するためにゲルにロードした。このアガロースゲルから、0.2% エタノールアミンがジェントラ溶出緩衝液2(Gentra Elution Buffer 2) と同程度の性能を有することがわかった。両試薬とも1:10の希釈率でPCR産物が検出された(ゲルの写真上の短い境界線の右側)。
【図5】解放性試薬であるエタノールアミンの濃度(%)およびpHがPCR産物の形成に及ぼす作用を示すアガロースゲル。PCRは、1 μlの解放されたDNAを15 μlのPCR反応物中に用いて図4に記載された通りに実施した。5 μlのPCR反応物を電気泳動用アガロースゲルにロードした。以上の結果から、エタノールアミン濃度を上昇させたときに増幅量が若干上昇することがわかる。pHのもつ作用も、この場合はっきりしている。PCR産物はpH 8.3〜11で得た。pH 6.2およびpH 13ではPCR産物の生成は認められない。以上のデータは、エタノールアミンの濃度およびpHを検討したACES定量キットで過去に得られたデータを支持する(図3を参照)。
【図6】解放性試薬のpHがPCR産物の形成に及ぼす作用を示すアガロースゲル。PCRは、1 μlの解放されたDNAを15 μlのPCR反応物中に用いて図4に記載された通りに実施した。5 μlのPCR反応物を電気泳動用アガロースゲルにロードした。PCR産物はpH 6.2およびpH 13では生じなかった。生じたPCR産物の量はpHとともに上昇した。以上のデータは、解放性試薬のpHを8.3から11に上昇させると大量のDNAが解放されることを示す、図2に示したデータを支持する。この結果から、FTA(登録商標)紙からDNAを解放させる最も有効なpHが11であると結論づけられる。
Claims (129)
- 1種または複数のアルカノールアミンを含む解放性試薬を固体マトリックスに接触させる段階を含む、固体マトリックスから核酸分子を除去する方法。
- 固体マトリックスが、弱塩基、キレート化剤、および陰イオン性表面活性剤または陰イオン性界面活性剤を含む、請求項1記載の方法。
- 固体マトリックスが、尿酸または尿酸塩をさらに含む、請求項2記載の方法。
- 固体マトリックスがセルロースをベースとしたマトリックス、またはマイクロメッシュ状の合成プラスチックマトリックスである、請求項1記載の方法。
- 固体マトリックスが濾紙である、請求項4記載の方法。
- 固体マトリックスがFTA(登録商標)紙である、請求項4記載の方法。
- 開放性試薬が複数のエタノールアミンを含む、請求項1記載の方法。
- 開放性試薬がエタノールアミンを含む、請求項1記載の方法。
- エタノールアミンがモノエタノールアミンである、請求項8記載の方法。
- エタノールアミンがジエタノールアミンである、請求項8記載の方法。
- エタノールアミンがトリエタノールアミンである、請求項8記載の方法。
- 解放性試薬が水溶液である、請求項1記載の方法。
- 開放性試薬のpHが約8.3〜約13である、請求項1記載の方法。
- 開放性試薬のpHが約10〜約12である、請求項13記載の方法。
- 開放性試薬のpHが約11である、請求項14記載の方法。
- アルカノールアミンの濃度が約0.01%〜約5%(容積/容積)である、請求項1記載の方法。
- アルカノールアミンの濃度が約0.01%〜約3%(容積/容積)である、請求項16記載の方法。
- アルカノールアミンの濃度が約0.01%〜約1%(容積/容積)である、請求項17記載の方法。
- アルカノールアミンの濃度が約0.1%〜約1%(容積/容積)である、請求項18記載の方法。
- 固体マトリックスを解放性試薬と約1〜約180分間インキュベートする、請求項1記載の方法。
- 固体マトリックスを解放性試薬と約1〜約120分間インキュベートする、請求項20記載の方法。
- 固体マトリックスを解放性試薬と約10〜約60分間インキュベートする、請求項21記載の方法。
- 固体マトリックスを解放性試薬と約10〜約30分間インキュベートする、請求項22記載の方法。
- 固体マトリックスを解放性試薬と約65℃〜約100℃でインキュベートする、請求項1記載の方法。
- 固体マトリックスを解放性試薬と約90℃〜約100℃でインキュベートする、請求項24記載の方法。
- 核酸分子を解放性試薬から分離する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 核酸分子がDNAを含む、請求項1記載の方法。
- 核酸分子がベクターを含む、請求項1記載の方法。
- ベクターがプラスミドまたは人工染色体を含む、請求項28記載の方法。
- 核酸分子が細胞またはウイルスに由来する、請求項1記載の方法。
- 以下の段階を含む、核酸分子を単離する方法:
(a)核酸分子を固体マトリックスに、核酸分子を固体マトリックスに固着、付着、会合、および/または結合させる条件下で接触させる段階;ならびに
(b)結合状態の核酸分子を含む固体マトリックスに、1種または複数のアルカノールアミンを含む解放性試薬を、固体マトリックスから核酸分子を解放させる条件下で接触させる段階。 - 解放された核酸分子を含む解放性試薬を収集する段階をさらに含む、請求項31記載の方法。
- 固体マトリックスが弱塩基、キレート化剤、および陰イオン性表面活性剤または陰イオン性界面活性剤を含む、請求項31記載の方法。
- 固体マトリックスが尿酸または尿酸塩をさらに含む、請求項33記載の方法。
- 固体マトリックスがセルロースをベースとしたマトリックス、またはマイクロメッシュ状の合成プラスチックマトリックスである、請求項31記載の方法。
- 固体マトリックスが濾紙である、請求項35記載の方法。
- 固体マトリックスがFTA(登録商標)紙である、請求項35記載の方法。
- 開放性試薬が複数のエタノールアミンを含む、請求項31記載の方法。
- 開放性試薬がエタノールアミンを含む、請求項31記載の方法。
- 解放性試薬が水溶液である、請求項31記載の方法。
- 開放性試薬のpHが約8.3〜約13である、請求項31記載の方法。
- 開放性試薬のpHが約10〜約12である、請求項41記載の方法。
- 開放性試薬のpHが約11である、請求項42記載の方法。
- アルカノールアミンの濃度が約0.01%〜約5%(容積/容積)である、請求項31記載の方法。
- アルカノールアミンの濃度が約0.01%〜約3%(容積/容積)である、請求項44記載の方法。
- アルカノールアミンの濃度が約0.01%〜約1%(容積/容積)である、請求項45記載の方法。
- アルカノールアミンの濃度が約0.1%〜約1%(容積/容積)である、請求項46記載の方法。
- 固体マトリックスを解放性試薬と約1〜約180分間インキュベートする、請求項31記載の方法。
- 固体マトリックスを解放性試薬と約1〜約120分間インキュベートする、請求項48記載の方法。
- 固体マトリックスを解放性試薬と約10〜約60分間インキュベートする、請求項49記載の方法。
- 固体マトリックスを解放性試薬と約10〜約30分間インキュベートする、請求項50記載の方法。
- 固体マトリックスを解放性試薬と約65℃〜約100℃でインキュベートする、請求項31記載の方法。
- 固体マトリックスを解放性試薬と約90℃〜約100℃でインキュベートする、請求項52記載の方法。
- 核酸分子を解放性試薬から分離する段階をさらに含む、請求項31記載の方法。
- 核酸分子がDNAを含む、請求項31記載の方法。
- 核酸分子がベクターを含む、請求項31記載の方法。
- ベクターがプラスミドまたは人工染色体を含む、請求項56記載の方法。
- 核酸分子が細胞またはウイルスに由来する、請求項31記載の方法。
- 請求項31記載の方法で単離される核酸。
- 核酸分子がPCRで増幅される、請求項31記載の方法。
- 請求項60記載の方法で作製される核酸を含む、組換え宿主細胞。
- 核酸がベクターを含む、請求項61の宿主細胞。
- 請求項60記載の方法で作製された核酸を宿主細胞に導入する段階を含む、組換え宿主細胞を作製する方法。
- 以下の段階を含む、RNAをDNAから分離する方法:
(a)固体マトリックスにRNAおよびDNAを含む試料を接触させる段階;
(b)DNAを保持しながらRNAを十分除去する条件下で、(a)の固体マトリックスに洗浄液を接触させる段階;ならびに
(c)洗浄後の固体マトリックスに、1種または複数のアルカノールアミンを含む解放性試薬を、固体マトリックスからDNAを解放させる条件下で接触させる段階。 - 洗浄液が水または10 mM トリス−HCl、1 mM EDTA (pH 7.3)のいずれかを含む、請求項64記載の方法。
- 固体マトリックスに1秒〜90分間の洗浄時間で洗浄液を接触させる、請求項64記載の方法。
- 洗浄時間が以下からなる群より選択される、請求項66記載の方法:
(a)約5秒;
(b)約20秒;
(c)約30秒;
(d)約45秒;
(e)約1分;
(f)約5分;
(g)約10分;および;
(h)約30分。 - 以下の段階を含む、閉環状核酸分子を直鎖状核酸分子から分離する方法:
(a)閉環状核酸分子および直鎖状核酸分子を含む試料を固体マトリックスに接触させる段階:
(b)直鎖状核酸分子を保持しながら閉環状核酸分子を十分除去する条件下で、(a)の固体マトリックスに洗浄液を接触させる段階;ならびに
(c)固体マトリックスから直鎖状核酸分子を解放させる条件下で、1種または複数のアルカノールアミンを含む解放性試薬を、洗浄後の固体マトリックスに接触させる段階。 - 洗浄液が水または10 mM トリス−HCl、1 mM EDTA (pH 7.3)のいずれかを含む、請求項68記載の方法。
- 固体マトリックスに1秒〜90分間の洗浄時間で洗浄液に接触させる、請求項68記載の方法。
- 洗浄時間が以下からなる群より選択される、請求項70記載の方法:
(a)約5秒;
(b)約20秒;
(c)約30秒;
(d)約45秒;
(e)約1分;
(f)約5分;
(g)約10分;および
(h)約30分。 - 以下の段階を含む、核酸分子を大きさで分離する方法:
(a)固体マトリックスに、大きさの異なる核酸分子を含む試料を接触させる段階;
(b)より大きい核酸分子を保持しながら、より小さい核酸分子を十分除去する条件下で、(a)の固体マトリックスに洗浄液を接触させる段階;ならびに
(c)固体マトリックスから、より大きい核酸分子を解放させる条件下で、1種または複数のアルカノールアミンを含む解放性試薬を、洗浄後の固体マトリックスに接触させる段階。 - 洗浄液が水または10 mM トリス−HCl、1 mM EDTA (pH 7.3)のいずれかを含む、請求項72記載の方法。
- 固体マトリックスに1秒〜90分の洗浄時間で洗浄液を接触させる、請求項72記載の方法。
- 洗浄時間が以下からなる群より選択される、請求項74記載の方法:
(a)約5秒;
(b)約20秒;
(c)約30秒;
(d)約45秒;
(e)約1分;
(f)約5分;
(g)約10分;および
(h)約30分。 - より小さい核酸分子の平均サイズが約1kb〜約50kbで、より大きい核酸分子の平均サイズが約100kb〜約1,000kbである、請求項72記載の方法。
- より小さい核酸分子の平均サイズが約50kb〜約100kbで、より大きい核酸分子の平均サイズが約250kb〜約500kbである、請求項72記載の方法。
- より小さい核酸分子の平均サイズが約50kb〜約100kbで、より大きい核酸分子の平均サイズが約1,000kb〜約4,000kbである、請求項72記載の方法。
- 核酸分子、固体マトリックス、および1種または複数のアルカノールアミンを含む解放性試薬を含む組成物。
- 固体マトリックスが弱塩基、キレート化剤、および陰イオン性表面活性剤または陰イオン性界面活性剤を含む、請求項79記載の組成物。
- 固体マトリックスが尿酸もしくは尿酸塩をさらに含む、請求項79記載の組成物。
- 固体マトリックスがセルロースをベースとしたマトリックス、またはマイクロメッシュ状の合成プラスチックマトリックスである、請求項79記載の組成物。
- 固体マトリックスが濾紙である、請求項82記載の組成物。
- 固体マトリックスがFTA(登録商標)紙である、請求項82記載の組成物。
- 開放性試薬が複数のエタノールアミンを含む、請求項79記載の組成物。
- 開放性試薬がエタノールアミンを含む、請求項79記載の組成物。
- エタノールアミンがモノエタノールアミンである、請求項86記載の組成物。
- エタノールアミンがジエタノールアミンである、請求項86記載の組成物。
- エタノールアミンがトリエタノールアミンである、請求項86記載の組成物。
- 溶液が水溶液である、請求項86記載の組成物。
- 開放性試薬のpHが約8.3〜約13である、請求項79記載の組成物。
- 開放性試薬のpHが約10〜約12である、請求項91記載の組成物。
- 開放性試薬のpHが約11である、請求項92記載の組成物。
- アルカノールアミンの濃度が約0.01%〜約5%(容積/容積)である、請求項79記載の組成物。
- アルカノールアミンの濃度が約0.01%〜約3%(容積/容積)である、請求項94記載の組成物。
- アルカノールアミンの濃度が約0.01%〜約1%(容積/容積)である、請求項95記載の組成物。
- アルカノールアミンの濃度が約0.1%〜約1%(容積/容積)である、請求項96記載の組成物。
- 核酸分子がDNAを含む、請求項79記載の組成物。
- 核酸分子がベクターを含む、請求項79記載の組成物。
- ベクターがプラスミドまたは人工染色体を含む、請求項99記載の組成物。
- 核酸分子が細胞またはウイルスに由来する、請求項79記載の組成物。
- (1)1種または複数のアルカノールアミンを含む解放性試薬、および(2)以下からなる群より選択される1種もしくは複数の成分を含む、固体マトリックスから核酸分子を除去するためのキット:
(a)固体マトリックス;
(b)試料を固体マトリックスにアプライするための装置;
(c)固体マトリックスを切断して、試料を含む切片にする装置;ならびに
(d)洗浄液. - 固体マトリックスが弱塩基、キレート化剤、および陰イオン性表面活性剤または陰イオン性界面活性剤を含む、請求項102記載のキット。
- 固体マトリックスが尿酸または尿酸塩をさらに含む、請求項102記載のキット。
- 固体マトリックスがセルロースをベースとしたマトリックス、またはマイクロメッシュ状の合成プラスチックマトリックスである、請求項102記載のキット。
- 固体マトリックスが濾紙である、請求項105記載のキット。
- 固体マトリックスがFTA(登録商標)紙である、請求項105記載のキット。
- 開放性試薬が複数のエタノールアミンを含む、請求項102記載のキット。
- 開放性試薬がエタノールアミンを含む、請求項102記載のキット。
- エタノールアミンがモノエタノールアミンである、請求項109記載のキット。
- エタノールアミンがジエタノールアミンである、請求項109記載のキット。
- エタノールアミンがトリエタノールアミンである、請求項109記載のキット。
- 溶液が水溶液である、請求項102記載のキット。
- 開放性試薬のpHが約8.3〜約13である、請求項102記載のキット。
- 開放性試薬のpHが約10〜約12である、請求項114記載のキット。
- 開放性試薬のpHが約11である、請求項115記載のキット。
- アルカノールアミンの濃度が約0.01%〜約5%(容積/容積)である、請求項102記載のキット。
- アルカノールアミンの濃度が約0.01%〜約3%(容積/容積)である、請求項117記載のキット。
- アルカノールアミンの濃度が約0.01%〜約1%(容積/容積)である、請求項118記載のキット。
- アルカノールアミンの濃度が約0.1%〜約1%(容積/容積)である、請求項119記載のキット。
- 核酸分子がベクターを含む、請求項102記載のキット。
- ベクターがプラスミドまたは人工染色体を含む、請求項121記載のキット。
- 核酸分子が細胞またはウイルスに由来する、請求項102記載のキット。
- 試料を固体マトリックスにアプライするための装置がマイクロピペットを含む、請求項102記載のキット。
- 試料を固体マトリックスにアプライするための装置が、複数の試料を固体マトリックスに一度にアプライ可能な、請求項102記載のキット。
- 試料を固体マトリックスにアプライするための装置によって、固体マトリックスの表面に破砕される試料が得られる、請求項102記載のキット。
- 装置が固体マトリックスを円形、正方形、長方形、または不定形の切片に切断する、請求項102記載のキット。
- 洗浄液が10 mM トリス−HCl、1 mM EDTA (pH 7.3)を含む、請求項102記載のキット。
- 洗浄液が界面活性剤をさらに含む、請求項102記載のキット。
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