JP2008512090A - キトサンを用いたdna保存方法、及びその方法による生成物 - Google Patents
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Abstract
【選択図】
図5
Description
Sambrook, J. & Russell, D.W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, (2001) Errington N., Harding S.E., Varum K.M., Illum L., Int. J. Biol. Macromol., 15, 1123-1127 (1993) Illum L., Pharmaceutical Research, 15, 1326-1331 (1998) Chandy T., Sharma C.P., Biomat. Art. Cells Art. Org., 18, 1-24 (1990) Lee M., Nah J-W., Kwon Y., Koh J.J., Jo K.S., Kim S.W., Pharmaceutical Research, 18(4), 427-531 (2001) Borchard G., Advanced Drug Delivering Reviews, 52, 145-150 (2001) (Leong K.W., Mao H.Q., Turong-Lee V.L., Roy K., Walsh S.M., August J.T., J. controlled Rel., 53, 183-193 (1998) Mao H.Q., Turong-Lee V.L., August J.T., Leong K.W., Proc. Intl. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 24, 671-772 (1997) Sambrook J & Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Press. 2001:7.1-7.88 Sambrook J & Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001
正常成熟白血球からの細胞の全DNAは、分離され、その実験は知られている方法(例えば、非特許文献9参照)により、三次蒸留水を用いて行われた。
もし水溶性キトサンが、脱アセチル化の程度が60%以上であり、分子量が10kDa〜500kDaの生成物であるならば、本発明の用途として、具体的には、DNAとの安定な複合体を形成するために用いることができる。これらに該当する多くの水溶性キトサン生成物は、市販のものを用いることができる。それらのうち、本発明にあたる、平均脱アセチル化率が90.1%であり、平均分子量が約300kDaである水溶性キトサン生成物は、Jakwang社(韓国 アンソンシ)から購入し、滅菌三次蒸留水で溶解した。このキトサンに加えて、類似した特性を有する他の水溶性キトサンをまた用いてもよい。
前記水溶性キトサンは、滅菌三次蒸留水に溶解し、試験のため、0.02%から0.05%、0.1%、0.25%、0.5%及び1%の重量対体積比率(w/v)となるよう様々な濃度に調整した。ここで、DNAは、滅菌三次蒸留水で希釈し、500nμg/μl及び1μg/μlの濃度にし、その後これを用いた。
正常成熟単球及びプラスミドDNAから分離したゲノムDNAの1μg/μl濃度と、様々な濃度の前記水溶性キトサン溶液とを様々な比率で混和することにより得られたDNA/キトサン複合体は、上記方法に従って0.8%アガロースゲルに装填され、100Vで電気泳動された。その結果をそれぞれ図2及び図3に示す。その結果は、キトサンと混和されていない唯のDNAが電気泳動されたとき、標準的に移動したDNA及びrDNAのバンドは、18s及び28sに観察され、DNA水溶液(1μg/μl)は、0.02%、0.1%または0.25%キトサン溶液と混和され、それぞれ、1:0.2、1:1または1:2.5以上(この場合、混合物中のキトサンとDNAとの重量比は1:1以上である。)の各体積比率であるため、DNAは前記アガロースゲルにおいて決して移動しないような、キトサンと完全に結合をした。そのため、次の実験において、0.1%キトサン溶液と1μg/μl濃度のDNA溶液と体積比1:1(この場合、混合体中のキトサンとDNAとの重量比は、1:1である。)で混和されたものであるキトサンとDNAとの複合体の構成物はスタンダードとして作られた。しかしながら、これは構成の一つの例に過ぎず、適切な構成であれば、キトサン生成物の特性に従って、多様なものが使用されてもよい。
前記水溶性キトサンは、デオキシリボヌクレアーゼ(DNase)からDNAを防御することができるのかを確認するため、そして、その適切な条件を確立するために、キトサン溶液で処理されたDNA及び未処理のDNAは、それぞれデオキシリボヌクレアーゼ処理され、その効果をアガロースゲル電気泳動によって観察した。
EDTA)を加え、混和し、その後反応させるため60℃で一晩保持した。その後、上澄みを回収し、新しいマイクロ遠心チューブに入れ、抽出した。300μlの無水EtOH(エタノール)及び15μlの3M NH4OAc(酢酸アンモニウム)をそこに加え、あらかじめ−70℃にしてあるディープ・フリーザーで20〜30分間立たせたまま放置した。その後、得られたものを、4℃、12,000rpmで20分間遠心分離し、液分を吸引除去した。付着した沈殿物は70%エタノールで再度洗浄、乾燥され、DNaseを含まない蒸留水20μlで溶解された。10μl(約1μgDNA)の結果物が、こうして得られた計8個のチューブそれぞれから得られ、1%アガロースゲルで電気泳動された。その結果を図4に示す。
実施例1及び2で準備した水溶性キトサンとDNAとの液状複合体を用いて、PCRは標的遺伝子が適切に増幅されているかどうかを確認するために行われ、それにより本発明によるDNA保存が、前記遺伝子アッセイに悪影響を及ぼさないかどうかを確認し、本発明によるDNA保存方法により保存されたDNAを、PCRに用いるための、適切な条件を確立した。ヒト白血球ゲノムDNAに対して、PCRは各?活動遺伝子を標的として行った。その方法と結果は以下の通りである。
上記結果から、前記水溶性キトサンはDNAとほぼ完全に結合し、デオキシリボヌクレアーゼの攻撃から安定してDNAを保存することがわかった。本実施例では、前記水溶性キトサンとDNAとの前記複合体が、長期間室温で、液体状態で保存されたときでも、前記保存されたDNAは、開裂されることなしに維持され、遺伝子増幅及び遺伝子アッセイを行うことが可能である。PCRアッセイは、次の通りに行われた。
室温で、最小限の空間で、多数のサンプルDNAを保存、運搬し、自動アッセイに役立つように、キトサンが適する紙に吸着されたカードが発展してきており、それはDNAカードといわれている。前記DNAカードは、様々な種類があり、その中で、DNA自身を保存するために用いられる紙製カードは、タイプ1DNAカードといわれている。
この、タイプ2DNAカードは、キトサンと細胞溶解バッファーを、ブロッティング及び乾燥させるために、様々な種類の紙に吸着させることにより生成された。このタイプ2DNAカードは、血液のような細胞含有体液としてのサンプルを保存し、その後、遺伝子アッセイのためにPCRにより増幅させるために用いることを目的とされた。このタイプ2DNAカード上に、ヒト血液を滴下し、一定期間後、その性能は比較され、PCRにより分析された。
実施例4に従って室温で長期間、液体として保存されたキトサン/DNA複合体に対して、PCRを行い、得られた生成物はクローニングした。その後、自動塩基シークエンシングによって、本発明の方法により保存されたDNAが、安定して維持でき、保存後に使用できるかどうかを確認した。
室温で長期間DNAカードに吸着されて保存されたDNAサンプルに対して、PCR及び自動塩基シークエンシングによって得られた生成物のクローニングは、適切に行うことができるかどうか、確認された。
本発明の方法により保存されたDNAとキトサンとの複合体を用いて、サザンブロット法及びそれに類するもののようなハイブリダイゼーションアッセイによる特定遺伝子の存在及び量を検査する際、キトサンと結合したDNAはアガロースゲル電気泳動で動かず、それでブロッティングアッセイを行うことが困難となっている。そのため、ブロッティングアッセイのために、前記DNAサンプルは、キトサンを取り除いて用いなければならない。そのため、本発明では、キトサンと結合したDNAからDNAの損傷なしでキトサンを取り除くための方法を確立させた。
PCRは、本発明のタイプ1DNAカードを用いて保存されたヒトゲノムDNAサンプルに対して行われ、その後、RFLP(制限断片長多型:restriction fagment length polymorphism)アッセイを用いて、遺伝子型決定試験が可能かどうか検査された。前記タイプ1DNAカードのDNAのPCR後、前記RFLPアッセイを用いた遺伝子型決定の結果を、図8に示す。更に、遺伝子型決定が、本発明のタイプ2DNAカード中に、血液として保存されたヒトサンプルに対して、PCR−RFLPを用いて可能かどうか調査された。その結果は、図9に示す。本発明のDNAカードが、実際に、遺伝子診断、心臓血管疾患の発病と関連する遺伝子に用いることができることを証明するために、PCRによって増幅され、特定の制限酵素で、次の通りに処理をされた。その結果は、電気泳動によって解析された。結果として、多重遺伝子型の調査に問題を有さないことが分かった。
上記準備した反応液を含む前記PCRチューブを、PE2700 thermal cycler(Perkin Elmer社製造、米国)に加え、次の通り、それぞれの遺伝子の条件に従い増幅した。
95℃/5分、35サイクル(95℃/30秒、58℃/30秒、72℃/40秒)、72℃/10分とし、
2.ACE2遺伝子及びAPOE1/2E遺伝子に対し、
95℃/5分、35サイクル(95℃/30秒、65℃/30秒、72℃/40秒)、72℃/10分とした。
こうして得られたPCR生成物にRFLPを行うために、第一に、ACE遺伝子だけを除く他の5つの遺伝子のPCR生成物を、次の通り、DNA Clean & Concentrator kit(Zymo Research Corporation製造、米国カリフォルニア州)を用いて生成した。
実施例11:キトサンを含むPCRキットの製造
本発明のキトサンを用いたDNA保存方法の適用として、Taqポリメラーゼ、プライマー、dNTP及びバッファー及びそれに類するものが、キトサンと共に一つのチューブに加えられたもの(一体型チューブ:all in one tube)、並びにDNAまたは血清のようなサンプルが、PCRを誘導するためにチューブに加えられたものからなる、PCRキットが製造された。特徴として、このPCRキットは、DNA保存及びPCRアッセイの両方において用いることができる。
図14は、本発明のDNAカードを用いたプラスチックDNA IDカードを製造する手順を示したフローチャートである。図14のフローチャートにある手順を行い、プラスチック素材のDNA IDカードを開発した。
図15は、本発明のプラスチックDNA IDカードの一実施例の概略図である。前記カードの前面は、個人写真及び名前、簡単な個人情報(病院で、緊急時に直ちに処置できる程度)及び住所が記録される。前記カードの背面は、個人遺伝子情報がエンコードされた磁気帯があり、書名及びDNA保存場所を保持するように設計されている。
Claims (25)
- DNA溶液及び水溶性キトサン溶液を混和することにより生成されたキトサン/DNAの形態としてDNAを保存する方法において、前記水溶性キトサンは60%以上の度合いで脱アセチル化しており、分子量は10kDa〜500kDaであることを特徴とするDNA保存方法。
- 前記DNAは、動物、植物、菌類、バクテリア及びウイルスのゲノムDNA、cDNAまたはプラスミドDNAを含み、前記DNAの大きさは、数10〜数10億塩基対であることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 前記水溶性キトサンの水溶液の濃度は、0.02%(w/v)〜1%(w/v)であり、前記水溶性キトサンの、混合物中のDNAに対する重量比は1:0.5以上であることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 前記水溶性キトサンの水溶液の濃度は、0.02%(w/v)〜0.25%(w/v)であり、前記DNA溶液の濃度は、1μg/μl以下であり、水溶性キトサンの、混合物中のDNA量に対する重量比は、1:0.5〜1:3であることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 前記DNAとキトサンとの複合体は、−70℃から室温で保存されることを特徴とする請求項1記載の方法。
- キトサンと結合したDNAの前記複合体は、液体状態として保存されていることを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- DNAを保存する紙製DNAカードにおいて、前記DNAカードは水溶性キトサン及び尿酸を備える組成物中に浸漬され、乾燥され、そしてDNAは、DNA溶液を前記水溶性キトサンと結合しているDNAとしてカードに滴下することによって保存されることを特徴とするDNAカード。
- DNAを保存する紙製DNAカードにおいて、前記DNAカードは水溶性キトサン及び尿酸を含む細胞溶解バッファーを備える組成物中に浸漬され、乾燥され、そしてDNAは、前記水溶性キトサンと結合しているDNAとしての前記カードに、DNAを含むバイオサンプルを滴下することにより保存されることを特徴とするDNAカード。
- 前記紙は、ブロッティング用またはクロマトグラフィー用であり、該紙の厚さは0.3〜1.2mmであることを特徴とする請求項7または8に記載の紙製DNAカード。
- 前記カードは、12.3cm×8.1cm内に、6ウェル、24ウェル、96ウェル、384ウェルとなるよう、各ウェルの大きさに応じた印をつけられており、DNAまたは血液サンプルは各ウェルに滴下され、保存されることを特徴とする請求項7または8に記載の紙製DNAカード。
- 前記組成物は、0.1%〜1%(w/v)の水溶性キトサンと0.5mM〜20mMの尿酸とを、体積比1:1で混和することにより生成されることを特徴とする請求項7記載の紙製DNAカード。
- 前記細胞溶解バッファーは、トリス(8mM)、EDTA(エチレンジアミン四酢酸)(0.5mM)、SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)(0.1% w/v)及び尿酸(2mM)を含むことを特徴とする請求項8記載の紙製DNAカード。
- a)請求項7記載のDNAカードの断片をPCRチューブに加える工程;
b)TEバッファー(10mMのトリス‐Cl、0.1mMのEDTA、pH=8.0)を前記チューブに加え、混和後、前記チューブを室温で5分間立たせたまま放置し、その後、ピペットを用いてTEバッファーを取り除く工程;
c)工程b)を2回繰り返す工程;
d)室温で1時間または56℃で10分間で、前記チューブを乾燥させる工程;及び、
e)PCRサンプルを前記チューブに加え、PCRによる増幅を行う工程;を備えることを特徴とするDNAカードを用いたPCRアッセイ方法。 - a)請求項8記載のDNAカードの断片をPCRチューブに加える工程;
b)洗浄バッファー(GG精製試薬;0.5mMのEDTA、8mMのトリス‐Cl、2mMの尿酸、1%(w/v)のSDS)を前記チューブに加え、混和後、前記チューブを室温で5分間立たせたまま放置し、その後ピペットを用いて洗浄バッファーを取り除く工程;
c)工程b)を3回繰り返す工程;
d)TEバッファー(10mMのトリス‐Cl、0.1mMのEDTA、pH=8.0)を前記チューブに加え、混和後、前記チューブを室温で5分間立たせたまま放置し、その後、ピペットを用いてTEバッファーを取り除く工程;
e)工程d)を2回または3回繰り返す工程;
f)室温で1時間または56℃で10分間で、前記チューブを乾燥させる工程;及び、
g)PCRサンプルを前記チューブに加え、PCRによる増幅を行う工程;を備えることを特徴とするDNAカードを用いたPCRアッセイ方法。 - 分析方法において、請求項6記載の保存方法により保存されたDNAまたは請求項7若しくは8によるDNAカードで保存されたDNAは、PCR−RFLP、クローニング、ライブラリー合成、シークエンシング分析またはサザンブロッティングに用いられることを特徴とする分析方法。
- DNA分析方法において、請求項6の保存方法により液体状態で保存されたキトサン/DNA複合体または、請求項7若しくは8によりDNAカードに保存されたキトサン/DNA複合体から、サルフェートを基礎としたカチオン塩を用いて、分離された前記DNAは、遺伝子分析に用いられることを特徴とするDNA分析方法。
- 前記サルフェートを基礎としたカチオン塩は、SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)、SOS(オクチル硫酸ナトリウム)、CTAB(臭化セチルトリメチルアンモニウム)を含むことを特徴とする請求項16記載のDNA分析方法。
- オリゴd(T)、プライマー、TaqDNAポリメラーゼ、反応バッファー溶液、dNTP及び水溶性キトサンを含むチューブを備えるPCRキットにおいて、前記チューブは、更に、DNAまたは血清サンプルを含み、そして前記チューブは、PCRを行うために用いられることを特徴とするPCRキット。
- DNA IDカードにおいて、キトサンと個人のDNAとの混合物は、請求項1のDNA保存方法により、前記混合物の一部が保存され、個人の遺伝子情報は、磁気帯または組み込みチップに保存されることを特徴とするDNA IDカード。
- 前記DNA IDカードの基本素材はプラスチックであることを特徴とする請求項19記載の前記DNA IDカード。
- a)PVC軟層に、請求項7または8の紙製DNAカードを積み重ねる工程;
b)前記紙製DNAカードに、前記紙製カードと同じ大きさの穴を有した第一PVCコア層を積み重ねる工程;
c)前記第一PVCコア層の穴の上に、前記第一PVCコア層の穴より小さい二つの穴を有する第二PVCコア層を積み重ねる工程;
d)第二PVCコア層に、PVC軟層を積み重ねる工程;及び、
e)該積み重ねられた層を互いに熱接着するために、熱と圧力を加える工程;を備えることを特徴とするDNA IDカードの生成方法。 - 請求項20によるDNA IDカードは、
第一PVC軟層、紙製DNAカード、紙製DNAカードの大きさと等しい大きさの穴を有する第一PVCコア層、DNAまたはDNAを含むバイオサンプルを滴下した時、前記紙製DNAカードに通じる穴を有する第二PVCコア層、及び第二PVC軟層を備え、
前記磁気帯は、前記紙製DNAカード上に前記DNAまたはバイオサンプルが保存されている側面に、対向する側面に位置していることを特徴とするDNA IDカード。 - 情報、疾病コード、個人のSTR(縦列型反復配列)型またはHLA(ヒト白血球型抗原)型は、前記磁気帯にエンコードされていることを特徴とする請求項22記載のDNA IDカード。
- 前記DNA IDカードに滴下するgDNAの量は、1.5μg以上であることを特徴とする請求項22に記載のDNA IDカード
- 分析方法において、請求項19のDNA IDカードの断片は、洗浄バッファーで処理されずにPCR増幅に用いられることを特徴とする分析方法。
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