KR20060022434A

KR20060022434A - 키토산을 이용한 ｄｎａ 보관방법 및 분석방법 및 이를이용한 ｄｎａ 제품

Info

Publication number: KR20060022434A
Application number: KR1020040071254A
Authority: KR
Inventors: 문우철; 오명열; 임수빈; 엄태한; 이미애; 전부일
Original assignee: 굿젠 주식회사
Priority date: 2004-09-07
Filing date: 2004-09-07
Publication date: 2006-03-10
Also published as: CN101048501A; EP1802753A4; ATE483803T1; WO2006028323A1; US20070254294A1; EP1802753B1; JP2008512090A; KR100613734B1; DE602005024031D1; ES2352849T3; EP1802753A1

Abstract

본 발명은 키토산(chitosan)을 이용한 DNA의 보관방법과 이렇게 보관된 DNA를 분석하는 방법, 그리고 상기 보관방법을 이용한 제품에 관한 것이다. 본 발명에 따라 수용성 키토산에 인간이나 동물, 식물, 세균의 DNA 또는 혈액 등의 DNA를 함유한 생체 샘플을 적절하게 혼합하여 액상 상태나 또는 종이 같은 고체 매개물을 이용한 고형 상태로 보관하면 DNA를 실온에서 안정적으로 장기간 보관이 가능하고 이후 유전자 분석에도 유용하다. 본 발명에 따른 DNA 보관 방법은 간편하고 경제적이며 이를 응용한 DNA 카드와 PCR 키트 등의 제품은 다수의 DNA 샘플을 보관, 운반및 회수할 수 있으며 자동 분석하는 데에도 매우 유용하다. 또한 본 발명을 응용한 DNA ID 카드는 개개인의 DNA를 보관하는 DNA 은행역할과 함께 개개인의 유전자 정보를 기록 보관함으로서 개인 식별과 의료 등에도 도움이 될 수 있다.

DNA 보관, 수용성 키토산, DNA 카드, DNA ID 카드, PCR 키트

Description

키토산을 이용한 ＤＮＡ 보관방법 및 분석방법 및 이를 이용한 ＤＮＡ 제품{Method for storing DNA by using chitosan, Method for analyzing the DNA stored and products using the methods}

도 1은 본 발명에 따른 DNA와 수용성 키토산 결합 제품을 제조 및 분석하는 과정을 나타낸 블럭도이다.

도 2는 정상 성인의 단핵구세포에서 분리한 게놈(genomic) DNA를 1㎍/㎕의 농도로 다양한 농도의 수용성 키토산 수용액과 다양한 비율로 혼합하여 얻은 DNA/키토산 결합물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동한 사진이다(레인(Lane) 1: 사이즈 마커(Size Marker; 1kb), 레인 2: DNA만, 레인 3: 0.02%(w/v) 수용성 키토산 용액:DNA 수용액: = 1: 0.2, 레인 4: 0.02%(w/v) 키토산 용액: DNA 수용액 = 1:0.4, 레인 5: 0.02%(w/v) 키토산 용액: DNA 수용액 = 1: 0.6: 레인 6: 0.1%(w/v) 키토산 용액: DNA 수용액 = 1:1, 레인 7: 0.1%(w/v) 키토산 용액: DNA 수용액 =1:2, 레인 8: 0.1%(w/v) 키토산 용액: DNA 수용액 = 1:3, 레인 9: 0.25%(w/v) 키토산 용액: DNA 수용액 = 1: 2.5:, 레인 10: 0.25%(w/v) 키토산 용액: DNA수용액 = 1:5, 레인 11: .25%(w/v) 키토산 용액 : DNA 수용액=1: 7.5)

도 3은 크기 4.0 kb의 플라스미드 DNA(pCMV-beta-galactosidase)를 1㎍/㎕의 농도로 다양한 농도의 수용성 키토산 수용액과 다양한 비율로 혼합하여 얻은 DNA/키토산 결합물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동한 사진이다(레인1: 사이즈 마커(1kb), 레인 2: DNA만, 레인 3: 0.02%(w/v) 수용성 키토산 용액: DNA 수용액: = 1: 0.2, 레인 4: 0.02%(w/v) 키토산 용액: DNA 수용액 = 1:0.4, 레인 5: 0.02%(w/v) 키토산 용액: DNA 수용액 = 1: 0.6: 레인 6: 0.1%(w/v) 키토산 용액: DNA 수용액 = 1:1, 레인 7: 0.1%(w/v) 키토산 용액: DNA 수용액 =1:2, 레인 8: 0.1%(w/v) 키토산 용액: DNA 수용액 = 1:3, 레인 9: 0.25%(w/v) 키토산 용액: DNA 수용액 = 1: 2.5:, 레인 10: 0.25%(w/v) 키토산 용액: DNA수용액 = 1:5, 레인 11: .25%(w/v) 키토산 용액 : DNA 수용액=1: 7.5)

도 4는 키토산과 결합시킨 인체 림프구 게놈의 DNA와 키토산을 결합시키지 않은 DNA에 DNA분해효소(deoxyribonuclease, DNAase I)를 처리하여 1% 아가로스 겔 상에서 DNA의 분해 정도를 비교 분석한 사진이다(레인 1: 사이즈 마커(1 kb ladder), 레인 2: DNA만, 레인 3: 키토산/DNA 결합물 20분 경과, 레인 4: 키토산/DNA 결합물 40분 경과, 레인 5: 키토산/DNA 결합물 60분 경과, 레인 6: 키토산 비결합 DNA 20분 경과, 레인 7: 키토산 비결합 DNA 40분 경과, 레인 8: 키토산 비결합 DNA 60분 경과).

도 5는 0.1%(w/v) 키토산 수용액과 1㎍/㎕ 농도의 인체 백혈구 게놈 DNA 수용액을 부피비 1 : 1로 혼합하여 얻은 DNA/키토산 결합물 및 키토산을 결합시키지 않은 인체 백혈구의 게놈 DNA를 각각 주형으로 하여 베타-엑틴 유전자에 대한 PCR 을 수행하여 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다(레인 1: 사이즈 마커(100bp), 레인 2: 음성 대조군, 레인 3: 양성 대조군(백혈구의 게놈 DNA를 바로 분석함), 레인 4: DNA 카드 (1형)에 게놈 DNA를 점적하여 실온에서 1년간 보관 후 분석, 레인 5: DNA 카드 (2형)에 혈액을 점적하여 실온에서 1년간 보관 후 분석, 레인 6: 블라팅용 종이에 혈액 침지 후 실온에서 1년간 보관 후 분석, 레인 7: 블라팅용 종이에 백혈구의 게놈 DNA 침지후 실온에서 1년간 보관 후 분석).

도 6은 0.1%(w/v) 키토산 수용액과 1㎍/㎕ 농도의 인체 백혈구 게놈 DNA 수용액을 부피 1 : 1로 혼합하여 얻은 DNA/키토산 결합물과 키토산을 결합시키지 않은 DNA를 온도 및 시간을 달리하여 보관한 후 이들을 각각 주형으로 하여 베타-액틴 유전자에 대해 PCR을 수행하여 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다(레인 1: 사이즈 마커(100 bp), 레인 2: 음성 대조군, 레인 3: 양성 대조군(혈액에서 분리 정제 후 바로 PCR 수행한 DNA), 레인 4: DNA만을 -70℃에서 3개월간 보관, 레인 5: DNA만 실온에서 1주일 보관, 레인 6: DNA만 실온에서 1개월 보관, 레인 7: DNA/키토산 결합물을 실온에서 3주일 보관, 레인 8: DNA/키토산 결합물 실온에서 3개월 보관, 레인 9: DNA/키토산 결합물을 실온에서 1년 보관, 레인 10: DNA를 점적한 DNA카드 1형을 실온에서 3주일 보관, 레인 11: DNA를 점적한 DNA카드 1형을 실온에서 3개월 보관).

도 7은 키토산을 여러 종류의 블라팅(blotting) 종이에 흡착 후 건조하여 DNA카드 1형을 만들고 여기에 정상 성인 백혈구의 DNA를 피펫으로 점적하였으며, 실온에서 6개월 경과 후에 각각의 DNA카드를 PCR로 비교 분석한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 사진이다(레인 1: 사이즈 마커(100 bp), 레인 2: 음성 대조군, 레인 3: 양성 대조군(혈액에서 직접 분리 정제한 DNA), 레인 4: 0.3mm 두께의 블라팅 종이에 0.02% 키토산 용액으로 처리한 DNA카드, 레인 5: 0.9mm 블라팅 종이(0.02%), 레인 6: 0.3mm(0.1%), 레인 7: 0.9mm(0.1%), 레인 8: 0.3 mm(0.25%), 레인 9: 0.9mm(0.25%), 레인 10: 0.3mm (무처리), 레인 11: 0.9mm(무처리)).

도 8은 본 발명의 수용성 키토산과 DNA 카드 1형을 이용하여 보관하였던 인체 게놈의 DNA검체를 대상으로 PCR 후 RFLP 분석방법을 이용하여 유전자 형을 검사한 결과로 (a)는 양성 대조군으로 한 성인의 백혈구에서 분리 정제한 후 바로 PCR-RFLP를 수행한 것이고, (b)는 한 성인의 백혈구에서 분리 정제한 후 본 발명의 키토산 용액과 혼합하여 실온에서 3개월 동안 보관해 두었다가 PCR-RFLP를 수행한 것이며, (c)는 한 성인의 백혈구에서 분리 정제한 후 본 발명의 DNA카드 1형에 옮겨 보관해 두었다가 실온에서 1년 동안 보관해 두었다가 PCR-RFLP를 수행한 DNA샘플이다(레인 1과 12: 100bp 사이즈 마커, 레인 11: 25bp 사이즈 마커, 레인 2와 3: 아포리포단백질 E(Apolipoprotein E, Apo E)유전자의 분석, 레인 4와 5: 안지오텐시노겐(angiotensinogen, AGT)유전자의 분석, 레인 6과 7: 안지오텐신 전환효소(angiotensin converting enzyme, ACE) 유전자의 분석, 레인 8: 안지오텐신 수용체 1(angiotensin 1 receptor, AT1R) 유전자의 분석, 레인 9와 10: 혈관내피 산화질소 합성효소(endothelial nitric oxide synthase, eNOS) 유전자의 분석, 레인 13과 14: MTHFR 유전자의 분석).

도 9는 본 발명의 DNA 카드 2형에 혈액을 침지하여 보관하였다가 이 DNA카드의 샘플을 대상으로 PCR-RFLP 분석방법을 이용하여 유전자 형을 검사한 결과로 (a)는 양성 대조군으로 한 성인의 백혈구에서 DNA를 분리 정제한 후 바로 PCR-RFLP를 수행한 DNA 샘플, (b)는 성인의 혈액을 본 발명의 DNA카드 2형에 침지하여 실온에서 3개월 동안, (c)는 1년 보관해 두었다가 PCR-RFLP를 수행한 DNA샘플이다(레인 1과 8: 100bp 사이즈 마커, 레인 7과 15: 25bp 사이즈 마커, 레인 2와 3은 안지오텐시노겐유전자, 레인 4와 5는 안지오텐신 전환효소(ACE)유전자, 레인 6: 안지오텐신 수용체 1(AT1R) 유전자, 레인 9와 10: 혈관내피 산화질소 합성효소(eNOS)유전자, 레인 11와 12: MTHFR 유전자, 레인 13과 14: 아폴리포단백질 E(Apo E) 유전자).

도 10은 본 발명의 방법에 따라 수용성 키토산 용액에 혼합하여 실온에서 1개월간 보관해 두었던 성인 대장조직의 게놈 DNA를 주형으로 하여 APC (adenomatous polyposis coli)유전자에 대해 PCR을 수행하고, 그 산물을 클로닝 한 후 다시 자동염기서열분석법으로 검색한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 11은 본 발명의 방법에 따라 DNA카드에 점적하여 실온에서 3개월간 보관해 두었던 폐암조직의 게놈 DNA를 주형으로 하여 p53유전자에 대해 PCR을 수행하고, 그 산물을 클로닝 한 후 다시 자동염기서열분석법으로 검색한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 12는 키토산과 DNA 결합물로부터 SDS를 사용하여 키토산과 DNA을 분리한 결과를 나타내는 아가로스 겔 전기영동 사진이다(레인 1: 사이즈 마커(100 bp), 레 인 2: DNA만, 레인 3: 0.1%(w/v) 키토산 용액/DNA 수용액(1㎍/㎕), 레인 4는 0.1%(w/v) 키토산 용액/DNA 수용액(1㎍/㎕)의 결합물에 0.1%(w/v) SDS를 처리, 레인 5: 0.1%(w/v) 키토산 용액/DNA 수용액(1㎍/㎕)에 1%(w/v) SDS를 처리, 레인 6: 0.1 %(w/v) 키토산 용액/DNA 수용액(1㎍/㎕)에 5%(w/v) SDS).

도 13은 본 발명의 방법에 따라 췌장암 조직의 게놈 DNA 수용액(1㎍/㎕)을 0.1%(w/v)키토산 용액을 부피비 1:1로 혼합하여 얻은 DNA/키토산 결합물을 실온에서 3개월간 보관한 후 이를 주형으로 하여 K-ras유전자에 대해 서던블라팅(Southern blotting)을 수행한 사진이다(레인 1: 췌장암 조직의 DNA 실온에서 1개월 간 보관, 레인 2: 췌장암 조직 DNA/키토산 용액 결합물을 실온에서 1개월 간 보관, 레인 3은 정상인의 말초혈액 백혈구에서 얻은 DNA -70℃에서 1개월 간 보관, 레인 4는 정상인의 말초혈액 백혈구에서 얻은 DNA 실온에서 1개월 간 보관).

도 14는 본 발명의 DNA 카드를 이용하여 만든 플라스틱 DNA ID 카드를 제작하기 위한 과정을 나타낸 순서도 이다.

도 15는 본 발명의 플라스틱 DNA ID 카드의 일실시예의 모식도이다.

도 16은 개인의 유전형을 15조합의 STR 검사를 이용하여, 개인의 유전형을 확인 후, 개인 유전형 프로파일을 만들고, 개인의 유전형 자료를 엔코딩하는 과정을 나타낸 모식도이다.

도 17은 본 발명의 DNA ID 카드에 정보를 엔코딩하는 일실시예를 도시한 것이다.

도 18는 본 발명의 플라스틱 DNA ID 카드를 제작하는 과정에 있어서, DNA 카 드가 PVC 카드 내부에 합체 되는 것을 도시한 것이다.

도 19는 고온 고압으로 제작된 플라스틱 DNA 카드(혈액용)에 혈액과 gDNA를 보관시 플라스틱 DNA ID 카드에서 성인병 유전자 가운데 하나인 eNOS 유전자를 PCR 증폭하여 비교한 결과이다(레인 1 과 7: 사이즈마커(100bp) , 레인 2: 혈액을 점적한 DNA ID 카드(혈액용), 레인 3: gDNA를 점적한 DNA ID 카드(혈액용), 레인 4: 혈액을 점적한 DNA ID 카드(혈액용) 및 플라스틱 커버, 레인 5: gDNA를 점적한 DNA ID 카드(혈액용) 및 플라스틱 커버, 레인 6:음성 대조군).

도 20은 실험실에서 인위적으로 압력 없이 고온으로 처리한 것과 실제 고온 고압으로 제작된 플라스틱 DNA 카드를 이용하여, 검체를 넣는 시간을 변경하면서 성인병 유전자 가운데 하나인 eNOS 유전자를 PCR 증폭한 결과이다(레인 1: DNA 카드에 실온에서 DNA 로딩, 레인 2: 180℃로 30분 간 구운 후 DNA 로딩한 DNA 카드, 레인 3: 180℃로 1시간 구운 후 DNA 로딩한 DNA 카드, 레인 4: 실온에서 DNA 로딩 후 180℃로 1시간 처리한 DNA 카드, 레인 5: DNA 로딩 후 180℃로 30분 간 처리한 DNA 카드, 레인 6: DNA 로딩 후 180℃로 1시간 처리한 DNA 카드, 레인 7: 고압(125bar)과 고온(180℃)에서 플라스틱 DNA ID 카드 제조 후 혈액을 로딩, 레인 8: 고압(125bar)과 고온(180℃)에서 DNA ID 카드 제조 후에 DNA를 로딩, 레인 9: 혈액을 로딩한 후, 고압(125bar)과 고온(180℃)에서 제작된 DNA ID카드, 레인 10: DNA를 로딩한 후, 고압(125 bar)과 고온(180℃)에서 제작된 DNA ID 카드).

도 21은 고온 고압으로 제작된 플라스틱 DNA ID 카드, 즉, DNA 용과 혈액용 각각에, gDNA 150ng/㎕ 및 혈액을 이용하여 점적량을 변화시키면서 점적을 하고, 그 보관된 카드조각을 이용하여 성인병 유전자 가운데 하나인 eNOS 유전자를 PCR 증폭한 결과이다(레인 1: 음성 대조군, 레인 2: 양성대조군(혈액의 gDNA), 레인 3: DNA ID 카드(DNA용)에 실온에서 gDNA (5㎕)로딩, 레인 4: DNA ID 카드(DNA용)에 gDNA (10㎕) 로딩, 레인 5: DNA ID카드(DNA용)에 gDNA (50㎕) 로딩, 레인 6: DNA ID 카드(DNA용)에 혈액(10㎕) 로딩, 레인 7: DNA ID 카드(DNA용)에 혈액 (50㎕)로딩, 레인 8: DNA ID 카드(DNA용)에 혈액 (100㎕) 로딩).

도 22는 고온 고압으로 제작된 DNA ID 카드에 보관된 검체를 PCR 증폭 시에 전처리 과정으로 카드조각을 세척완충액(washing buffer)으로 처리하는 것과 처리하지 않은 것을 성인병 유전자 가운데 하나인 혈관내피 산화질소 합성효소(eNOS) 유전자를 PCR 증폭하여 나타낸 결과이다(레인 1과 10: 100bp 사이즈 마커, 레인 2: 음성대조군, 레인 3: DNA가 보관된 수집카드(collection card)를 실온에서 4일 후 세척완충액으로 처리한 카드 조각, 레인 4: DNA 가 보관된 BPB(Bromophenolblue)가 들어있는 수집카드를 실온에서 4 일 후 세척완충액으로 처리한 카드조각, 레인 5: DNA가 보관된 플라스틱 DNA ID 카드를 실온에서 4일간 두었다가 세척완충액으로 처리한 카드 조각, 레인 6: 0.1% 키토산/DNA 결합물을 점적한 후 오토클레이브 소독한 3mm 종이를 실온에 4 일간 두었다가 세척용 완충액으로 처리한 카드조각, 레인 7: 0.1% 키토산/DNA 결합물을 점적한 수집 카드를 실온에서 4일간 두었다가 세척용 완충액으로 처리한 카드 조각, 레인 8: 0.1% 키토산/DNA 결합물을 점적한 BPB 수집카드를 실온에 4일간 두었다가 세척용 완충액으로 처리한 카드 조각, 레인 9: 0.1% 키토산/DNA 결합물을 점적한 플라스틱 DNA ID 카드를 실온에서 4일 동안 두 었다가 세척용 완충액으로 처리한 카드 조각, 레인 11: 혈액상태로 DNA가 보관된 수집카드를 실온에서 4일 동안 보관한 후 세척용 완충액으로 처리하지 않은 카드 조각, 레인 12: 혈액상태로 DNA가 보관된 BPB 수집카드를 실온에서 4일 동안 보관한 후 세척 완충액으로 처리하지 않은 카드 조각, 레인 13: 혈액상태로 DNA가 보관된 플라스틱 DNA ID 카드를 실온에서 4일 동안 보관한 후 세척 완충액으로 처리하지 않은 카드 조각, 레인 14: 0.1% 키토산/DNA 결합물을 점적한 후 오토클레이브 소독한 3mm 종이를 실온에서 4일 동안 방치한 후 세척 완충액으로 처리하지 않은 카드 조각, 레인 15: 0.1% 키토산/DNA 결합물을 점적하여 보관시킨 수집카드를 실온에서 4일 동안 방치한 후 세척 완충액으로 처리하지 않은 카드 조각, 레인 16: 0.1% 키토산/DNA 결합물을 점적하여 보관시킨 BPB 수집카드를 실온에서 4일 동안 방치한 후 세척 완충액으로 처리하지 않은 카드 조각, 레인 17: 0.1% 키토산/DNA 결합물을 점적하여 보관시킨 플라스틱 DNA ID 카드를 실온에서 4일 동안 방치한 후 세척 완충액으로 처리하지 않은 카드 조각)

본 발명은 키토산을 이용한 DNA 보관방법과 이렇게 보관된 DNA의 분석방법, 및 상기 방법들을 이용한 제품에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 수용성 키토산을 DNA와 혼합한 DNA/키토산 결합물을 이용하여 DNA를 실온에서 장기간 안정된 상태로 유지시키고, 이러한 키토산/DNA 결합물을 이용하여 DNA를 보관 및 분석할 수 있는 다양한 제품에 관한 것이다. 상기 제품으로는 종이 상태로 DNA를 보관하는 DNA 카드와, 플라스틱 카드에 개개인의 DNA와 유전자 정보를 보관하는 DNA ID 카드 등이 있다.

인체를 포함한 다세포생물은 수많은 세포로 이루어져 있으며, 세포 중심의 핵에는 유전정보를 보관하는 DNA가 존재한다. 유전정보의 단위를 유전자(gene)라고 하며, 이는 DNA로 구성되어 있다. 세포의 모든 생명현상과 기능은 단백질에 의해 이루어지며, 유전자는 단백질을 만들기 위한 명령체계를 지시 전달하는 광대한 정보단위이다. 하나의 유전자는 하나 또는 다수의 특정 단백질을 만드는데 필요한 특수한 암호코드를 가지고 있다.

DNA의 모양은 이중 나선구조를 이루고 있고, 각각의 나선가닥에는 염기(base)라고 불리는 수많은 화학구조단위로 구성되어 있다. DNA의 염기에는 아데닌(A), 사이토신(C), 구아닌(G), 티민(T)의 4가지 종류가 있는데, 이 염기의 배열된 순서, 또는 염기서열(base sequence)이 곧 그 유전정보를 결정한다. 이 염기의 순서에 따라 만들어지는 단백질이 달라지며, 생로병사가 결정된다. 한 개인의 모든 세포의 DNA 염기서열은 병이 없는 한 동일하며, 각 개인 별로 DNA염기는 약 0.1%씩 서로 다르다.

한 생물체가 가지고 있는 모든 유전자의 총체를 게놈(genome)이라고 한다. 인간 게놈은 30억 개의 염기로 이루어지며, 약 3만개의 유전자가 존재하는 것으로 보고되고 있다. 최근 인간 게놈 전체의 염기서열을 판독하는 인간게놈프로젝트가 완성되어 유전자를 이용한 난치성 질환의 진단과 치료에 획기적인 발전이 이루어지고 있으며, 소위 맞춤의학, 예측의학의 시대가 열리고 있다.

핵 내에 보존되는 DNA의 유전정보가 세포질 내에서 단백질 생산으로 나타나기 위해서는 중간 매개물질이 필요하며, 이를 RNA라고 한다. DNA의 유전정보는 일차 mRNA로 바뀌며, 이를 전사(transcription)과정이라고 한다. mDNA의 유전정보는 세포질의 리보솜에서 tRNA와 rRNA의 도움 하에 단백질로 해석(translation)된다. 3개의 염기가 하나의 아미노산을 지정하며, 이러한 3개 염기의 단위를 코돈(codon)이라고 한다. 전사과정에서 DNA 중 단백질을 지정하는 부분(coding sequence)만 남고, 나머지 부분은 잘려나간다. 유전자를 구성하는 DNA중에 DNA와 단백질로 코딩되는 핵심 부분을 엑손(exon)이라고 하며, 코딩되지 않는 부분을 인트론(intron)이라고 한다. 인간의 전체 DNA중에서 엑손 부분은 약 1%에 지나지 않는다. 각각의 유전자는 평균 35,000개의 염기와 수개-수십 개의 엑손 및 인트론으로 구성되며, 한 유전자의 단백질 지정부위는 평균 1,500개의 염기로 구성된다. 리보솜에서 1차 생산된 단백질은 해석-후 변형(post-translational modification)을 거쳐 최종적인 활성 단백질로 만들어진다. 세포가 분열될 때 DNA는 똑같이 복제(replication)되어 자손 세포에 전달된다. mRNA에 상응하는 염기 서열을 갖는 DNA를 상보적 DNA(cDNA)라고 하며, 이렇게 DNA에서 cDNA를 만드는 과정을 역전사(reverse transcription, RT)라고 한다.

생명현상은 (1)게놈 DNA의 유전정보, (2)유전자의 전사, (3)발현되는 단백질의 3가지에 의해 결정된다. 생명현상을 이해하고 분석하며 질병의 진단과 치료 방 법의 개발을 위해서는 상기한 3가지를 정확하게 분석하는 것이 매우 중요하다. 한 개체의 유전자의 총체를 유전체 또는 게놈이라 하며, 이에 대해 한 개체에서 전사되는 유전자(즉 mDNA)의 총체를 전사체(transcriptome)라고 하고 발현되는 단백질의 총체를 단백질체(proteome)라고 한다. 최근 이들의 정보를 총체적으로 자동 분석하려는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 이를 위해 특히 마이크로어레이(microarray) 또는 바이오 칩(biochip)이 도움이 되며, 대표적인 예가 DNA칩과 단백질칩이다.

게놈 DNA의 유전정보를 질적 및 양적으로 분석하기 위한 통상적인 방법으로는 PCR, PCR-RFLP, 클로닝 및 라이브러리(library) 제작, 서던블라팅 등을 통한 하이브리디제이션(hybridization) 분석, 염기서열분석법, DNA 마이크로어레이 혹은 칩(microarray, chip) 등이 있다(Sambrook J & Russell DW. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Press. 2001).

DNA를 검사하면 그 사람의 건강 상태를 파악하며 암이나 감염 등 각종 질병에 이환이 되어 있는 지 여부를 진단할 수 있을 뿐 아니라 향후 유전질환의 발병 가능성과 자손에 병을 물려줄 가능성도 예측할 수 있다. 아울러 본인임을 증명하고자 할 때, 친자 등 혈족 관계의 증명에도 가장 정확한 검사이다. 물론 가계나 족보의 증명에도 도움이 된다. 이 때문에 법의학에 있어서도 필수적인 도구이며 골수나 기타 장기 기증 등의 경우에 적합성 여부를 판별하는 데에도 필수적인 검사이다. 또한 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 분석함으로써 향후 질병 발병 가능성과 약물에 대한 반응 등을 예측하는 데에도 큰 도움이 된다.

미래의 DNA 검사에 대비하여 DNA를 보관해 둘 필요가 인식됨에 따라 세계 각국에서는 이미 DNA 은행이 설립되고 있으며, 아울러 여행자 보험이나 상해보험등과 연계하여 DNA를 보관하며, 미군의 DNA를 보관하는 등 DNA 은행의 보관 검체 수는 급증하는 추세이다. 하지만, 국가 기관이나 상업기관에서 개인의 DNA를 보관하는 데에는 개인의 유전자 정보의 악용과 같은 문제가 발생할 우려가 있다. 아울러 현존 기술로 DNA를 안전하게 장기간 보존하기 위해서는 냉동고와 특정 시약이 필요하며, 이에 따라 그 보관비용도 적지 않다.

실제 세포로부터 분리 정제한 DNA를 실온에서 그냥 두면 DNA분해효소(Deoxyribonuclease, DNAse)에 의해 DNA가 급속하게 분해 내지 분절 되는 문제점이 발생한다. 따라서 유전자 연구를 위해서는 DNA를 보관하는 방법이 중요하다. 현재 DNA을 보관 내지 운반하기 위해 널리 사용되는 방법에는 혈액 등의 체액이나 세포, 조직에서 분리한 DNA를 정제하여 액체상태로 보관하는 방법, 냉동 보관 방법, 동결 건조 보관 방법, 2-프로필 알코올 상으로 보관하는 방법 등이 있으나 이들은 모두 비용이나 손상면에 있어서 단점이 많다. 액체상태로 정제된 DNA를 보관하는 방법은 즉시 사용하기가 용이하나, 장시간 보관 시 DNA가 쉽게 손상되는 단점이 있으며, 냉동 보관법과 동결 건조법은 시료를 사용하는 과정에서 반복적인 용해와 냉동으로 인해 DNA가 손상될 수 있는 단점이 있다. 알코올과 같은 시료를 이용한 보관방법 역시 다른 방법과 동일하게 전처리 과정과 후처리 과정이 번거롭다. 아울러 위와 같은 과정에서 가장 문제가 되는 점은 혈액과 같은 체액에서 먼저 DNA를 정제하여 보관하여야 한다는 것이다.

상술한 DNA의 보관 방법은 초저온 냉동고와 같은 특수한 고가장비와 액체질소 등을 필요로 하기 때문에 경제적인 면에서 부담스러울 뿐만 아니라 DNA 보관 후 분석을 위해 재사용 시 전처리 과정 및 후처리 과정이 요구되며, 반복적인 냉동 및 해동으로 DNA가 손상된다는 단점이 있다.

상기의 방법 외에 최근 플라스미드 DNA를 실온에서 보관하려는 용도로 FTA 카드나 화트만 사의 카드 등의 상업화된 제품이 몇 가지가 소개되고 있으나, 그 방법의 실효성에는 한계가 있으며, 실제 실온이 아니라 -15℃ 또는 -20℃에 보관할 것을 권유하고 있어서 기존의 방법에 비해 큰 장점이 없고 오히려 비용부담이 커지는 단점이 있다.

따라서 DNA와 안정한 결합체를 이루어서 DNA가 디옥시리보뉴클레아제에 의해 분해되지 않도록 보호하고, DNA가 실온에서 안정된 상태로 보존될 수 있게 하며, 나아가 DNA를 이용한 각종 연구와 분석에 직접 적용이 가능한 방법을 개발하는 것이 분자유전학과 의학에 있어서 중요한 과제가 되고 있다. 이상적인 보관 방법은 (1) DNA를 분해되지 않은 상태로 실온에서 안정하게 보관할 수 있어야 하고 (2) 방법이 간단해야 하며, (3) 비용이 저렴해야 하고, (4) 분리 정제된 DNA 자체를 보관할 뿐 아니라 혈액 등의 체액과 각종의 DNA를 함유한 샘플을 DNA 손상 없이 보관할 수 있어야 하며, (5) 한정된 공간 내에 다수의 DNA 샘플을 보관할 수 있도록 해야 하고, (6) 개개인이 자신의 DNA를 보관할 수 있도록 하고, (7) 이후의 각종 유전자 분석에 하등의 지장이 없어야 하며, 이러한 유전자검사 결과가 실제 진료나 연구에 도움이 되도록 해야 한다. 그러나 이러한 조건을 모두 만족시키는 방법이나 제품은 아직 개시된 적이 없다. 아울러 개개인의 DNA를 보관할 뿐 아니라 이와 함께 그 사람의 유전정보를 함께 보관할 수 있는 제품에 대한 보고는 찾을 수 없다.

키토산(chitosan)은 안정성과 생분해성 및 생체 적합성이 우수하여 의학 분야에 많이 활용되는 생체고분자 물질이다. 키토산을 산으로 처리하면 수용성의 키토산 염이 형성되는데 이는 강한 양성 전하(positive, cationic charge)를 띠게되어 현재 약물이나 단백질 및 DNA의 유력한 전달수단으로 주목받고 있다. 특히 수용성 키토산은 음이온성 물질인 DNA와 강력한 결합체를 이루어서 DNA를 보호하기 때문에 유전자를 전달하는 매개 물질로 사용될 수 있다.

키토산은 글루코사민(glucosamine)과 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine)의 이중 중합체로서 키틴(chitin)으로 부터 얻어진다. 키틴은 게나 새우등의 갑각류에 풍부하며, 셀룰로오스 다음으로 풍부한 천연 고분자 물질이다. 키토산은 키틴을 강알칼리로 탈아세틸화한 양이온성 폴리머를 총칭한다(Errington N, Harding SE, Varum KM, Illum L. Int J Biol Macromol. 1993:15:1123-7).

키토산은 중성 및 알칼리성 pH에서는 용해되지 않으며, 대신 글루타민산이나 염산, 젖산 등의 산과 반응시키면 키토산염 또는 양이온성 키토산을 형성한다. 키토산염은 물에 녹으며, 그 용해도는 탈아세틸화 정도와 pH에 비례한다. 수용성 키토산의 경우 아민군에 양자가 붙으면서 양성 전하를 띠게 된다. 수용성 키토산은 동결건조 상태로 만들 수도 있다.

수용성 키토산은 강한 양성 전하와 필름형성 능력, 겔 형성 능력을 나타낸 다. 이 때문에 키토산은 오수의 정수, 중금속 정화, 음료수 정수 및 항진균제로 사용되고 있으며, 식음료, 건강식품 및 화장품의 원료로도 이용되고 있다. 한편 키토산은 제약 분야에서도 중요한 도구가 되고 있다. 예컨대 정제생산과 방출조절 약물체계(controlled drug release system), 겔, 필름, 습윤제, 코팅제제, 미세구체(microsphere), 미세캡슐(microcapsule), 생체접착제, 점막을 통한 단백질, 펩타이드와 약물전달 촉진 용도, 백신전달 및 DNA전달 등에 광범위하게 사용되고 있다(Illum L. Pharmaceutical Research. 1998. 1998:15:1326-1331).

키토산은 매우 안전하며 면역촉진 부작용도 없다. 생체 내에 들어와서는 라이소자임(lysozyme)에 의해 N-아세틸글루코사민으로 분해되고, 이는 당단백질 합성에 사용된 후 이산화탄소의 형태로 배출된다(Chandy T, Sharma CP. Biomat Art Cells Art Org. 1990:18:1-24).

본 발명과 관련하여 수용성 키토산 또는 양이온성 키토산의 중요한 특성은 음이온성 물질인 DNA와 강력한 결합체를 이루며, 이는 DNA를 보호하고 DNA를 수송하는 수단, 즉 유전자전달물질로 사용될 수 있다는 것이다. 플라스미드 DNA를 이용한 실험에서 키토산은 DNA 분해효소인 DNase I 및 DNase II로부터 DNA가 분해되지 않고 안정적으로 유지되게 하며, 키토산과 플라스미드 DNA 복합물을 생체 외 배양 세포에 투여했을 때 전달 유전자를 발현시킴이 보고되고 있다(Lee M, Nah J-W, Kwon Y, Koh JJ, Jo KS, Kim SW. Pharmaceutical Research 18(4):427-531, 2001) 유전자 전달 효과는 (1)키토산의 분자량, (2)키토산과 DNA의 비, 특히 DNA의 음이온성인 분자와 키토산의 양이온성 질소 분자의 비(nitrogen/phosphate ratio)에 의 해 결정된다(Borchard G. Advanced Drug Delivery Reviews. 2001:52:145-150).

플라스미드 DNA를 자체대로 실온에 두면 수시간 내에 분해되나, 키토산과 결합한 형태로 보관하면 3개월 이상 보존이 가능하다고 한다(Leong KW, Mao HQ, Turong-Lee VL, Roy K, Walsh SM, August JT. J Controlled Rel. 1998:53:183-193). 한편 키토산과 플라스미드 DNA의 결합물을 동결건조 상태로 보관할 경우 4주까지 유전자전달 효과가 지속된다는 보고도 있다(Mao HQ, Turong-Lee VL, August JT. Leong KW. Proc Intl Symp Control Rel Bioact Mater. 1997:24:671-772).

그러나 키토산으로 포유류의 거대한 게놈 DNA를 안정적으로 보관할 수 있는 지에 대한 연구나 키토산이 DNA를 안정적으로 실온에서 장기 보관하게 해 줄 수 있는지에 대한 연구는 아직 보고된 바가 없으며 키토산을 이용하여 DNA를 보관하도록 제조된 제품 또한 제조된 바가 없다. 키토산과 결합된 DNA를 사용하여 유전자 발현 분석을 수행할 수 있는 가에 대해서도 보고 된 바가 없다. 또한 DNA 자체가 아닌 혈액 등의 체액 샘플과 키토산의 혼합 형태로 DNA를 보관하는 데 대한 보고도 없으며 나아가 본 발명의 제품 외에 키토산을 이용하여 인체나 동물의 게놈 DNA를 보관하고 운반하며, 분석할 수 있는 제품은 개시된 바가 없다.

본 발명에서는 동식물의 거대한 게놈 DNA를 보존할 수 있는 새로운 방법을 연구한 결과, 수용성 키토산을 DNA와 혼합하면 안정된 결합물을 형성하여 디옥시리보뉴클레아제에 의한 분해로부터 DNA를 보호하고 실온에서 안정된 상태로 장기간 보존할 수 있음을 확인하였고, 본 발명은 이를 기초로 완성하였다.

따라서, 본 발명의 1차적 목적은 수용성 키토산을 이용하여 DNA 샘플을 실온에서 안정된 상태로 보관 및 운반하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 다양한 DNA 검사 방법에 사용될 수 있는 안정된 DNA와 수용성 키토산의 결합물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 수용성 키토산-DNA 결합물을 이용한 DNA 보관, 운반 및 분석을 위한 제품을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 키토산을 이용한 DNA 보관 방법에서 DNA를 실온에서 장기간 보관 및 운반이 가능하게 하며, DNA 연구와 분석에 용이하고, 간편하게 응용할 수 있도록 DNA와 안정된 결합물을 형성할 수 있는 적절한 성상 및 농도의 키토산 용액을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 키토산과 DNA의 액상 혼합물 및 다수의 DNA 샘플을 최소한의 공간 내에 보관할 수 있는 종이 카드형의 키토산 함유물질(DNA 카드)을 제조하고 PCR, PCR-RFLP, 클로닝, 염기서열분석 및 사던블라팅, 마이크로어레이(microarray, chip) 검사 등의 유전자분석을 수행하는 방법과 혼합 상태로부터 키토산과 DNA를 분리하는 방법을 제공하는 것이다. 여기에서 DNA 카드에는 크게 1형과 2형이 있으며, 전자는 키토산함유 종이카드에 DNA 자체를 보관하는 것이며, 후자는 키토산과 세포용해완충액을 함유한 종이카드에 DNA가 아니라 혈액 등의 DNA 함유 생체샘플을 보관하는 것이다. 양자 모두 DNA를 실온에서도 장기간 안정상태로 보관시켰다가 나중에 필요할 때 여러 가지 다양한 유전자분석을 하려는 데 그 목적이 있다.

본 발명의 다른 목적은 개개인의 DNA검체를 키토산과 혼합 상태로 보관되고 그 개인의 개인 식별용 유전자 검사나 HLA 유전자검사 등의 검사를 수행하여 얻어진 개인의 유전자정보가 플라스틱 카드의 마그네틱 바(magnetic bar)나 칩에 저장된 DNA ID 카드(DNA identification 카드)를 제공하는 것이다. 이 플라스틱 DNA ID 카드는 각종 신용카드와 현금 카드, 중요기관의 출입카드, 바이오 여권, 군사 병력 등 특수 인원의 정보 보관, 골수 이식 등 장기 이식을 위한 유전자 정보 공유 등을 위해 사용될 수 있도록 한다.

본 발명의 방법과 제품이 이루고자 하는 조건은 다음과 같다.

첫째, DNA를 분해되지 않은 상태로 실온에서 안정상태로 보관할 수 있어야 하고,

둘째, 이 때의 DNA 샘플로는 인체나 동물, 식물, 세균의 게놈 DNA와 cDNA, 그리고 플라스미드 DNA가 모두 포함되며,

셋째, 방법이 간단하고, 사용에 특별한 장비나 도구를 사용할 필요가 없어야 하며,

넷째, 비용이 저렴해야 하고,

다섯째, 분리 정제된 DNA 자체를 보관할 뿐 아니라 혈액 등의 체액과 각종의 DNA를 보관한 생체 샘플을 DNA 손상 없이 보관할 수 있어야 하며,

여섯 번째, 종이나 카드 등 간편한 매체를 이용하여 DNA 샘플을 보관할 수 있도록 하고,

일곱번째, 한정된 공간 내에 다수의 DNA 샘플을 보관할 수 있도록 하며,

여덟 번째, 개개인이 자신의 DNA를 보관할 수 있도록 하고,

아홉번째, 상기한 방법 및 제품을 이용하여 보관 및 운반하였던 DNA 샘플에 대해서 장기간이 지난 후에도 PCR과 PCR-RFLP, 하이리다이제이션 (hybridization), 염기서열분석법(sequencing analysis), SNP 분석 등의 각종 유전자 분석이 정확하고 간편하게 이루어 질 수 있어야 하고, 연구 뿐 아니라 각종 임상 진료에도 도움이 되도록 해야 한다.

열번째, DNA ID 카드는 개개인의 DNA를 보관하는 DNA 은행의 역할을 할 뿐 아니라, 그 사람의 유전정보도 함께 보관할 수 있도록 한다.

이하 본 발명을 실시예와 도면을 참조하여 더욱 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

도 1은 본 발명에 따른 DNA와 수용성 키토산 결합 제품을 제조 및 분석하는 과정을 나타낸 블록도로서, 이를 참조하여 DNA와 수용성 키토산 결합 제품을 제조하는 과정을 살펴보면, 본 발명에서는 DNA와 안정된 결합물을 형성하며 DNA가 디옥시리보뉴클레아제에 의해 분해되는 것을 막고, 실온에서 안정된 상태로 보존하기 위하여 적절한 성상과 농도의 수용성 키토산 용액과 이를 함유하는 종이 카드나 PCR 키트, 플라스틱 재질의 DNA 카드 등을 사용한다.

본 발명에서 사용되는 키토산은 분자량이 10 내지 500kDa인 것이 바람직하다. 10kDa 미만의 것은 DNA와 안정된 결합체를 이루는데 문제가 있으며 500kDa을 초과하면 DNA를 이용한 유전자 발현 분석에 방해가 될 수 있다. 또한 탈아세틸화 정도가 60%이상인 키토산이 바람직하며, 탈아세틸화가 60% 미만이면 키토산의 수용성에 문제가 발생하며 DNA와 안정된 결합체를 이루기 힘들다. 제조 키토산 수용액의 농도는 무게 대 부피비(w/v)로, 0.02%에서 1%, 바람직하게는 0.1%이고, 키토산 수용액과 DNA 수용액의 혼합시 혼합비는 키토산 수용액 내의 키토산과 DNA 수용액 내의 DNA가 중량비로 1 : 0.5 이상이며, 1: 0.5 내지 1:3이 바람직하다(실시예 1과 2).

본 발명에 따른 DNA/키토산 결합물의 보관 온도는 실온에서 -70℃ 까지로 그 범위가 넓으며, 습하지 않은 암소에 보관한다.

한편, 본 발명의 방법에 따른 수용성 키토산과 결합된 형태로 보관된 DNA는 디옥시리보뉴클레아제에 의한 분해에도 안정되게 유지되어 유전자 분석에 사용될 수 있다(실시예 2 참고).

본 발명에 있어서, 키토산과 혼합하여 저장할 수 있는 DNA는 인간, 동물 또는 식물, 세균의 게놈 DNA, 플라스미드 DNA가 모두 포함되며, 바람직하게는 cDNA를 포함한다. 키토산과 혼합하여 저장 가능한 DNA의 크기는 수십 염기에서 수십억개 염기까지 다양하다.

한편, 본 발명의 방법에 따른 수용성 키토산과 결합하여 액상혼합체 상태로 보관된 DNA는 안정되게 유지되어 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR), 클로닝, 블라팅, 염기서열분석 등의 검사를 실시하여 본 발명의 DNA 보관 방법의 유용성을 용이하게 확인할 수 있다.

본 발명에 따르면, 적정한 농도의 키토산과 요산을 혼합하여, 특히 0.1% 내지 1%(w/v)의 수용성 키토산 용액과 0.5mM 내지 20mM농도의 요산의 혼합물 1:1의 부피비, 그 혼합물을 블라팅(blotting)용 종이에 흡착시킨 후 건조하여 DNA보관용 카드(DNA 카드 1형)를 제조할 수 있다. 상기 카드를 이용하여 실온에서 최소한의 공간 내에 다량의 DNA의 장기 보관과 운반이 가능하다. 상기 DNA 보관용 카드의 제조에 사용되는 종이는 상업적으로 이용 가능한 다양한 크로마토그라피용 종이나 블라팅용 종이를 사용할 수 있으며, 그 두께는 약 0.3mm에서 1.2 mm가 바람직하다. 상기 DNA 보관용 카드의 보관온도는 실온이 적합하나 -20℃ 및 -70℃ 까지 무방하며 실온에서 6개월 이상 보관이 가능하다(실시예 5).

본 발명에 있어서 PCR 수행시, DNA와 키토산 결합물이 액상인 경우 결합물 자체를 그대로 주형(template)으로 사용하며, 카드 형태인 경우는 카드 조각을 잘라서 주형으로 사용하여 통상적인 PCR 방법으로 증폭하고 클로닝과 염기서열분석을 수행할 수 있다. 그 결과 본 발명의 방법에 따라 보관된 DNA를 사용하여 유전자 분석 방법을 수행할 수 있을 정도로 충분히 DNA가 안정하게 유지함을 확인할 수 있다(실시예 5).

본 발명에 따르면, 적정한 키토산 용액과 Tris, EDTA, SDS 및 요산, 특히 Tris(8mM), EDTA(0.5mM), SDS(0.1%w/v) 및 요산(2mM),을 포함하는 세포용해 완충액의 혼합물을 블라팅 용 종이에 흡착시킨 후 건조하여 DNA보관용 카드(DNA 카드 2형)를 제조할 수 있다. 이 카드를 이용하면 혈액 등 DNA를 함유한 생체 시료 상태로 실온에서 DNA의 장기 보관과 운반이 가능하다(실시예 6).

한편, 본 발명의 DNA 카드를 이용하여 보관된 DNA는 안정되게 유지되어 있다가 PCR, PCR-RFLP, 클로닝, 염기서열분석 등의 검사를 실시할 수 있다(실시예 7-10 참고).

아울러 사던블라팅 수행을 위해서는 아가로스 겔상에서 DNA가 이동 가능하도록 DNA와 키토산 결합물을 분리하여 사용해야 하므로, 황산염(sulfate) 계열의 양이온성 염을 사용하여 DNA의 손상이 없이 사던블라팅의 결과에 영향을 주지 않고 DNA를 분리하였다. 상기 황산염 계열의 양이온성 염으로는 SDS(sodium dodecyl sulfate), SOS(sodium octyl sulfate) 또는 CTAB(cetyltrimethyl-ammonium bromide)를 사용할 수 있다(실시예 9).

본 발명에서는 키토산을 사용한 DNA 보관 방법을 응용하여 하나의 튜브 내에 키토산과 Taq중합효소, 프라이머, dNTP 및 완충용액 등을 함께 넣고 상기 튜브에 DNA 또는 혈청 등의 샘플을 넣어 PCR 반응이 일어나게 하는 PCR 키트를 제조하여 DNA의 보관과 PCR 분석이 모두 가능하도록 하였다(실시예 11참고).

또 한편, 본 발명에서는 개개인의 DNA검체를 키토산과 혼합된 형태로 플라스틱으로 된 카드에 보관시키고 이와 함께 그 개인의 개인 식별용 유전자 검사나 HLA 유전자형 검사(genotyping test)를 수행하여 얻어진 유전자 정보를 플라스틱 카드의 마그네틱 바(magnetic bar)나 칩에 저장할 수 있는 DNA ID 카드를 제공한다(실시예 12, 13 참고). 본 플라스틱 DNA ID 카드는 개개인의 DNA 은행 역할을 할 뿐 아니라 개인 식별과 개인의 장기 이식이나 임상 진료 등을 위한 개인의 유전자 정보 은행역할도 한다.

이하 하기 실시예를 통하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하지만, 이에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 아가로스 겔 전기영동을 통한 DNA와 키토산 결합물의 이동성 분석(mobility shift assay)

DNA와 혼합시 안정된 결합물을 이룰 수 있는 적정 키토산의 성상과 농도 및 혼합조건을 수립하기 위해 정상 성인 혈액의 단핵혈구에서 분리한 전체 DNA에 다양한 농도의 수용성 키토산을 다양한 비율로 혼합한 후 아가로스 겔 전기영동을 통해 키토산과 결합한 DNA의 이동성을 분석(mobility shift assay)하였다. 아울러 마우스 간조직의 게놈 DNA와 크기 4.0kb의 플라스미드(plasmid) DNA (pCMV-beta-galactosidase)를 대상으로 하여 동일한 방법으로 키토산과 결합한 DNA의 이동성을 분석하였다. 실험 방법과 결과는 다음과 같다.

가. DNA 분리 및 준비

정상 성인의 백혈구로부터 세포의 전체 DNA를 분리하였으며, 3차 증류수를 사용하여 공지의 방법(Sambrook J & Russell DW. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Press. 2001:7.1.-7.88)에 따라 실험을 수행하였다.

말초 정맥혈을 시트르산 나트륨(sodium citrate)이 들어 있는 튜브(vaccutainer CTAD tube, catalogue No #367946, Becton & Dickinson, USA)에 채혈을 하여, 원심분리를 통해 혈장과 단핵구의 백혈구연층(buffy coat layer)으로 분리하였다. 대부분이 림프구인 단핵구의 DNA는 QIAamp DNA 혈액 미니 키트(Qiagen, Germany)를 이용하여 다음과 같은 방법으로 분리하였다.

단백질 키나아제 K(QIAGEN 프로테아제) 20㎕를 1.5ml 마이크로원심분리 튜브에 넣고, 여기에 백혈구연층 200㎕를 넣고, 버퍼 AL 200㎕를 넣어 15초간 볼텍스 혼합한다. 56℃에서 10분간 방치하고 원심분리시켜 튜브 뚜껑에 묻어 있는 용액을 모은다. 여기에 에탄올 200㎕를 첨가하고 15초간 볼텍스 혼합한 후, 용액 전부를 QIAamp 스핀 컬럼에 넣어 8000rpm에서 1분간 원심분리한다. 그런 다음 2ml 수집 튜브를 상기 컬럼에 끼워 버퍼 AW1 500㎕를 첨가하고 다시 8000rpm에서 1분간 원심분리를 한다. 이렇게 얻어진 여과액은 버리고 새 튜브를 장착시켜 최고 속도로 1분간 더 원심분리를 해준다. 다시 새 1.5ml 마이크로원심분리 튜브를 끼워놓고 증류수나 버퍼 AE 200㎕를 넣어 실온에서 1분간 방치 후, 다시 8000 rpm에서 1분간 원심분리를 하여 DNA를 용출(elution)시킨다. 이렇게 분리된 DNA는 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 농도를 측정한 후, 분리된 DNA의 순도를 알기 위해 A260/A280 비를 비교한다. 이 때 DNA의 순도는 분광광도계측정에서 A260_/280가 1.6 내지 1.8이 나오도록 한다. 이상의 방법으로 인체혈액 200㎕에서 평균 6㎍의 순수한 DNA를 얻을 수가 있다.

나. 키토산의 준비

수용성의 키토산으로 탈아세틸화 정도가 60% 이상이고, 분자량이 10kDa내지 500kDa에 해당되는 제품이면 본 발명의 용도, 즉 DNA와 안정된 결합체를 이루는 데 사용이 가능하다. 이에 해당되는 수용성 키토산 제품은 다수가 시판되고 있다. 그 중 본 발명에서는 평균 탈아세틸화율(deacetylation rate)이 90.1%, 평균 분자량이 약 300kDa인 수용성 키토산 제품을 주식회사 자광(안성시, 대한민국)으로부터 구입한 후, 멸균한 3차 증류수에 용해하여 주로 사용하였다. 본 키토산 외에도 유사한 성상의 다른 수용성 키토산을 사용해도 무방하다.

다. 키토산과 DNA 결합물의 제조방법

수용성 키토산을 멸균한 3차 증류수에 용해하여 무게 대 부피 비 농도(w/v)가 0.02%에서부터 0.05%, 0.1%, 0.25%, 0.5% 및 1%까지로 다양하게 조성하여 검사하였다. 여기에 DNA 멸균한 3차 증류수로 희석하여 500ng/㎕ 및 1㎍/㎕의 농도로 조성하여 사용하였다.

1.5㎖ 원심분리 튜브에 DNA 수용액과 전술한 다양한 농도의 키토산 용액을 다양한 부피비로 혼합한 후, 15분간 실온에서 방치하여 결합물을 이루도록 유도하였다.

라. 아가로스 겔 전기영동을 통한 DNA와 키토산 결합물의 이동성 분석

상술한 방법에 따라 혼합하여 15분간 실온에서 방치한 DNA와 키토산의 결합 용액을 0.8% 아가로스 겔에 넣고(loading), 100V에서 전기영동을 실시하였다. 그 결과 키토산을 혼합하지 않은 DNA만을 전기영동한 경우는 DNA가 정상적으로 이동하여 18s 및 28s rDNA의 밴드(band)가 관찰되는 반면, 0.02%, 0.1% 또는 0.25%의 키토산 용액 각각에 대하여 DNA 수용액(1㎍/㎕)을 각각 부피비 1: 0.2 , 1 : 1 또는 1: 2.5 이상으로 DNA와 혼합한 경우(이 때 혼합물 내에서 키토산과 DNA의 중량비는 1:1이상)는 DNA가 키토산에 완전히 결합되어 아가로스 겔 상에서 전혀 이동하지 않음을 보여주었다(도 2와 3 참조). 따라서, 이후의 실험에서 키토산과 DNA 결합물의 조성 은 0.1% 키토산 수용액을 1㎍/㎕ 농도의 DNA 수용액과 부피비 1 : 1(이 때 혼합물 내에서 키토산과 DNA의 중량비는 1:1임)로 혼합하는 것을 표준으로 하였다. 그러나 이는 하나의 조성 예일 뿐 사용한 키토산 제품의 성상에 따라 적정 조성은 다소 달라질 수 있다.

실시예 2 키토산의 디옥시리보뉴클레아제 방어 효과 분석(deoxyribonuclease protection assay)

수용성 키토산이 디옥시리보뉴클레아제(deoxyribonuclease, DNAse)로부터 DNA를 보호할 수 있는가를 확인하고, 그 적정 조건을 수립하기 위해 키토산 용액으로 처리한 DNA와 처리하지 않은 DNA를 각각 디옥시리보뉴클레아제로 처리하고 아가로스 겔 전기영동을 통해 그 효과를 관찰하였다.

그 방법과 결과는 다음과 같다. 동일 실험을 인체 림프구의 게놈 DNA와 마우스 간조직의 게놈 DNA를 가지고 반복하여 수행하였다.

8개의 튜브를 2군으로 나누어서 하나의 군에는 미세원심분리튜브(1.5㎖)에 증류수에 녹인 키토산(20㎍)과 DNA(10㎍)를 혼합한 결합물을 제조하고 다른 한 군의 튜브에는 키토산을 넣지 않고 DNA(10㎍)만을 넣었다. 1군과 2군 각각의 튜브에 1 unit/㎕의 농도로 녹인 5㎕의 디옥시리보뉴클레아제(DNAse I)를 넣어 최종 부피 100㎕가 되도록 증류수를 넣은 후, 37℃ 인큐베이터(incubator)에서 0분과 20분, 40분, 60분간 각각 반응 시켰다. 반응이 끝나자마자 정지액(stop solution) 25㎕을 넣어 잘 혼합하여 DNAse I을 비활성화 (inactivation) 시켰다. 반응을 비활성화 시킨 각각의 4개 튜브에 TE 버퍼(10mM Tris, 0.1mM EDTA) 110㎕를 첨가하여 섞은 후, 60 ⁰C에서 밤새 반응시킨 후 페놀/클로로포름 150㎕를 넣어 1분간 볼텍스 혼합하여 실온에서 5-8분간 원심분리 하였다. 이후 상층액을 취하여 새 미세원심분리 튜브에 옮겨 추출(extraction)을 하여 무수 EtOH 300㎕와 3M NH4OAC 15㎕를 넣어, 미리 -70 ⁰C로 초저온냉동고에서 20 내지 30분간 방치한 후, 4 ⁰C에서 12,000rpm으로 20분간 원심분리를 하여 액상은 흡입 제거하고 가라앉은 펠렛 (pellet)은 다시 70% 에탄올로 세척한 후 건조하여 DNAse가 제거된 증류수 20㎕에 녹인다. 이렇게 얻어진 총 8개의 튜브에서 각각 10㎕(약 1㎍의 DNA)씩를 취하여 1% 아가로스 겔에서 전기영동 하였다.

그 결과 키토산을 처리하지 않은 DNA의 경우에는 DNAse I 으로 처리한지 40분 후 거의 대부분 분해된 반면, 키토산으로 처리한 DNA는 DNAse I 으로 처리한지 40분이 지난 후에도 분해되지 않고 대부분이 웰(well)에 남아 있는 것을 확인할 수 있다(도 4 참조). 이러한 결과는 본 발명의 방법에 따라 키토산과 DNA를 중량비 1 : 0.5로 혼합하는 경우에도 디옥시리보뉴클레아제에 의해 DNA가 분해되는 것을 유효하게 차단함을 나타내는 것이며, 본 발명에 따른 방법이 DNA의 보관에 효과적임을 입증하는 것이다.

실시예 3: DNA와 키토산 결합물에 대한 유전자 증폭 가능성 조사

실시예 1과 실시예 2에 따라 조성한 수용성 키토산과 DNA의 액상 결합물을 사용하여 PCR을 수행하여 표적 유전자들이 적절하게 증폭되는 가를 확인함으로서 본 발명의 DNA 보관 방법이 유전자 분석에 장애를 미치지 않음을 확인하고, 본 발 명에 따른 DNA 보관 방법을 통해 보관한 DNA를 PCR에 사용하는 적정 조건을 수립하였다. 인체 림프구의 게놈 DNA를 대상으로 각각 베타-엑틴(β-actin) 유전자를 표적으로 하여 PCR을 수행하였으며(도 5 참조)그 방법과 결과는 다음과 같다. .

PCR은 대상 DNA 100ng을 주형으로 하여 표적 유전자의 순방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer)를 각각 10pmol씩 넣고, 다시 2.5mM의 디옥시뉴클레오티드(dNTPs), 1 unit의 Taq 중합효소, 10×중합효소 완충용액(500mM KCl, 100mM Tris-Cl, 15mM MgCl₂, 0.1% 젤라틴)을 첨가하여 반응을 수행하였다. PCR 조건은 진앰프 2700 열 순환기(GeneAmp 2700 thermal cycler)(퍼킨 엘머 바이오시스템사, 미국)를 사용하여 먼저 95℃에서 5분을 수행한 후에 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초의 과정을 40회 수행하였고, 마지막으로 72℃에서 7분을 수행하여 PCR 산물을 얻었다.

실험 결과 0.1% 키토산과 DNA(1㎍/㎕)를 부피비 1 : 1로 혼합하여 조성한 인간과 마우스의 게놈 DNA 샘플과 키토산을 혼합하지 않은 DNA를 각각 주형으로 하여 베타-액틴 유전자에 대해 PCR을 수행하여 1.5% 아가로스 겔 상에서 전기영동한 결과, 키토산과 혼합한 양자 모두 동일한 정도로 661bp 크기의 베타-액틴 유전자 DNA 밴드가 강하게 나타났다(도 5 참조). 이는 본 발명의 키토산 혼합 매개물이 PCR에 악영향을 미치지 않으며, 유전자발현 검색에 유용하게 사용될 수 있음을 입증한다.

실시예 4: 실온에서 장기간 보관한 DNA와 키토산 결합물의 PCR 증폭실험

상기한 결과들로부터 수용성 키토산과 DNA가 거의 완전하게 결합하며, 디옥 시리보뉴클레아제의 공격으로부터 DNA를 안정적으로 보존함을 확인하였다. 본 실시예에서는 수용성 키토산과 DNA의 결합물을 액상 형태로 실온에서 장기간 보관하였을 때 보관된 DNA가 분해되지 않고 유지되어서 유전자 증폭과 분석이 가능한 가를 PCR분석을 통해 다음과 같이 확인하였다.

0.1% 수용성 키토산 용액(w/v) 1㎕와 정상 성인의 혈액의 단핵구의 게놈 DNA 1㎕(500ng/㎕)를 혼합하여 결합물을 형성하고 증류수를 8㎕추가하여 최종 부피를 10㎕로 조정한 24개의 시료를 원심분리 튜브 내에 준비하여 실온에 보관하였다. 동일한 백혈구 DNA 1㎕에 키토산을 처리하지 않고 최종 부피를 10㎕로 맞추어서 9개의 시료를 준비하고, 이 중 3개는 -70℃에 보관하였으며 나머지 6개의 시료는 실온에 보관하였다. 수용성 키토산과 혼합하여 실온에서 튜브 내에 보관한 DNA는 1주, 2주, 3주, 4주, 3개월, 6개월, 9개월 및 1년 시점에 각각 3개의 DNA 샘플을 실시예 3의 방법을 따라 PCR 반응을 수행하여 표적 유전자들이 적절하게 증폭되는 지를 확인하였다. 키토산과 혼합하지 않은 DNA 샘플중 -70℃에 보관한 샘플 3개는 3개월 후에 PCR을 수행하였으며, 실온에서 보관한 DNA 샘플은 각각 3개씩 3개월과 1년 후에 PCR을 각각 수행하였다.

PCR 실험 결과 실온에서 3개월과 1년 간 키토산과 결합시키지 않은(naked) DNA상태로 미세 원심분리 튜브 내에 보관하였던 경우에는 하우스키핑(housekeeping) 유전자인 베타-액틴이 전혀 발현되지 않았다. 이에 반해 1주 내지 1년 동안 키토산과 결합하여 액상으로 튜브에 넣어 실온에서 보관하였던 DNA 샘플의 경우에는 베타-액틴 유전자가 뚜렷하게 검출되었다. 기존의 방법대로 키토산과 결합시키지 않고 -70℃에서 보관한 DNA 샘플은 본 발명의 방법에 따라 키토산과 결합된 상태로 실온에서 보관한 DNA 샘플과 비교하여 증폭된 베타-액틴의 양이 유사함을 확인할 수 있었다(도 6 참조).

이와 같은 결과는 본 발명의 방법에 따른 DNA를 수용성 키토산과 결합시켜 액상으로 보관하는 방법이 최소 1년 이상 DNA를 안정적으로 유지시킬 수 있고, 보관된 DNA를 PCR분석에 사용하는데도 문제가 없으며 기존의 초저온 냉동고 보관법과 비교하여 유사하게 DNA를 안정적으로 보관할 수 있음을 확인하였다. 본 실시예에서의 보관 온도는 실온에서 -70℃ 까지로 다양하며, 바람직하게는 습하지 않은 암소에 보관한다.

실시예 5: 키토산을 종이에 흡착시켜 만든 DNA 카드(1형)의 제작 및 이의 유전자 증폭 가능성 조사

다수의 샘플 DNA를 실온에서 최소한의 공간 내에 보관하며 운반하고 자동 분석에 도움이 될 수 있게 하기 위해 적정 종이에 키토산을 침지하여 카드를 개발하여 이를 DNA 카드라고 명명하였다. DNA 카드에는 여러 가지 종류가 있으며, 그 중 DNA자체를 보관하는 용도의 종이 카드를 1형 DNA 카드라고 하였다.

가장 효과적인 수용성 키토산 용액의 농도와 적당한 두께의 종이를 선택하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

다양한 종류의 블라팅 용 종이를 0.02 %, 0.1 % 또는 0.25 % (w/v) 농도의 수용성 키토산 용액에 충분한 시간동안 침지시킨 후 건조하여 DNA 카드 제조에 사용하였다. 이 때의 종이로는 와트만(Whatman)사(영국) 또는 Schleicher & Schuell 사(독일) 등 여러 회사에서 판매되고 있는 블라팅 용 종이 중 적정 두께의 종이를 선택하여 사용하면 된다. 본 발명에서는 0.3mm, 0.9mm 및 1.2mm 두께의 블라팅 용 종이를 와트만사로부터 구입하여 사용하였다. 키토산을 사용한 DNA 보관용 DNA카드의 종류와 크기는 용도에 따라 다양하게 제작할 수 있는데, 키토산이 흡착된 블라팅 종이의 크기는 일반적으로 널리 사용되는 24-웰과 96-웰 및 384-웰 플레이트(multiwell-plate)(직경 8.1cm ×12.3cm)와 동일한 크기로 자르고, 종이 위에 상기 플레이트와 마찬가지로 웰과 칸을 인쇄하여 표시하였으며, 각각의 웰내에 DNA 샘플을 피펫으로 점적하고 1주 내지 1년 이상 실온에서 보관하였다. 따라서 1장의 DNA의 카드에는 24개에서 96개 내지 384개의 DNA 샘플을 보관할 수 있다.

상기한 수용성 키토산 침착 DNA카드를 합성하는 방법은 다음과 같다.

와트만사의 0.3mm 두께의 블라팅 용 종이를 오토클레이브(autocalve)로 고온 살균하여 건조 한 후, 미리 제조된 0.1 % (w/v) 농도의 수용성 키토산 용액과 2mM 요산(uric acid) 용액을 1:1의 부피비로 혼합하여 충분한 시간동안 침지시킨 후, 건조하여 DNA 카드 1형을 제조 하였다.

상기에서 제작된 DNA 카드 1형에 인체의 게놈 DNa를 스파팅하여 장기간 보관된 인체의 게놈 DNA를 점적하여 일정시간동안 보관하고 보관된 DNA 카드로부터 펀치(punch)나 집게(forceps), 핀셋 등을 이용하여 약 1mm 내지 2mm직경의 카드 조각을 취하여 PCR을 수행하기 위한 튜브에 넣고 이 카드의 조각을 주형으로 하여 실시예 3에 제시된 방법으로 베타-액틴 유전자에 대한 PCR을 수행하였다. 이 PCR 반응의 방법은 다음의 순서대로 하였다.

1. DNA가 보관된 키토산 침지 종이카드에서 펀치 등을 이용하여 약 1.2 mm 직경을 가지는 조각을 취하여 PCR용 튜브에 넣는다.

2. 200 μl의 TE 버퍼 (10 mM Tris-Cl, 0.1 mM EDTA, pH = 8.0)를 첨가하고, 혼합한 후 실온에서 5분간 방치한다. 이후 피펫을 이용하여 TE 버퍼를 완전히 제거한다.

3. 2번 과정을 2회 반복한다.

4. 실온에서 1시간, 혹은 56℃에서 10분동안 건조 시킨다.

5. 위의 과정으로 처리한 카드 조각에 적정 조성의 PCR 시료를 넣고 실시예 3에서와 같은 방법으로 베타-엑틴 유전자를 PCR 증폭하였다.

실험 결과 0.1% 키토산 용액에 침지하여 만든 DNA 카드들 전부에서 표적 유전자가 강력하게 발현되었으며, 종이 두께가 0.9mm나 1.2mm로 더 두꺼운 경우 더 많은 PCR 산물이 생성됨을 발견 할 수 있었다. 또한, 본 발명의 DNA카드에 흡착시킨 상태로 보관한 경우, 실온에서 3개월에서 1년이란 장기간이 지난 후에도 PCR시 -70℃에 보관하였을 때와 마찬가지로 베타-액틴 유전자가 강하게 증폭됨을 보였다(도 7 참조). 이와 같은 결과는 본 발명에 따른 DNA카드에 보관 시, 다수의 다양한 DNA 샘플을 실온에서도 장기간 안정되게 보존할 수 있으며, 장기간 이후에도 분석이 가능함을 입증한다. 따라서 본 발명의 DNA카드는 다수의 다양한 DNA 샘플을 간편하게 실온에서 장기 보관하고 운반하는 데 유용하며, 나아가 본 실시예와 하기 실시예에서 보듯이 PCR이나 염기서열분석 등 여러 가지 유전자 분석에도 유용함을 알 수 있다.

실시예 6 키토산과 세포용해용 완충액 (lysis buffer)이 종이에 흡착된 DNA 카드(2형)의 제조 및 이의 유전자 증폭 가능성 조사

본 DNA 카드 2형은 키토산과 세포용해용 완충액을 여러 종류의 블라팅용 종이에 흡착한 후 건조하여 제조하였다. 본 DNA 카드 2형은 혈액과 같은 세포 함유 체액의 상태로 시료를 보관하여 두었다가 이후 PCR로 증폭하여 유전자분석을 할 수 있도록 고안되었다. 본 DNA 카드 2형에 인체 혈액을 점적하여 적정 시간이 지난 후 그 성능을 PCR로 비교분석하였다.

실시예 5에서와 같이 제작한 블라팅 용 종이 카드에 수용성 키토산 용액과 세포용해 완충액을 충분한 시간동안 침지시킨 후 건조하여 DNA 카드 제조에 사용하였다. 이 때의 종이로는 0.3mm와 0.9mm 및 1.2mm 두께의 블라팅 용 종이를 와트만사로부터 구입하여 사용하였다. 상기한 혈액 상태 보관용 DNA 카드 2형을 합성하는 방법은 다음과 같다.

와트만사의 0.3mm 두께의 블라팅 용 종이를 고온살균하여 건조 한 후, 미리 제조된 0.1 % (w/v) 농도의 수용성 키토산 용액과 세포용해용 완충액 (lysis buffer:0.5mM EDTA, 8mM Tris-Cl, 2mM 요산, 1%(w/v) SDS)을 1:1의 부피비로 혼합하여 충분한 시간동안 침지시킨 후, 건조하여 DNA 카드 2형을 제조 하였다.

상기한 DNA 카드로부터 실시예 5에서와 같이 약 1mm 내지 2mm직경의 카드 조각을 취하여 PCR을 수행하기 위한 튜브에 넣고 이 카드의 조각을 주형으로 하여 베타-액틴 유전자에 대한 PCR을 수행하였다. 이 PCR 반응의 방법은 다음의 순서대로 하였다.

1. DNA가 보관된 키토산 침착 종이카드에서 펀치 등을 이용하여 약 1.2 mm 직경을 가지는 조각을 취하여 PCR용 튜브에 넣는다.

2. 세척액 (GG purification reagent; 0.5mM EDTA, 8mM Tris-Cl, 2mM Uric acid, 1%(w/v) SDS ) 200 μl을 첨가하고, 혼합한 후 실온에서 5분간 방치한다. 이후 피펫을 이용하여 세척액을 완전히 제거한다.

3. 2 번 과정을 3회 반복한다.

4. 이 후 200 μl의 TE 버퍼(10 mM Tris-Cl, 0.1 mM EDTA, pH = 8.0)를 첨가하고, 혼합한 후 실온에서 5분간 방치한다. 이후 피펫을 이용하여 TE 버퍼를 완전히 제거한다.

5. 4번 과정을 2, 3회 반복한다.

6. 실온에서 1시간, 혹은 56℃에서 10분동안 건조 시킨다.

7. 위의 과정으로 처리한 카드 조각에 적정 조성의 PCR 시료를 넣고 실시 예 2에서와 같은 방법으로 베타-엑틴 유전자를 PCR 증폭하였다.

실험 결과 DNA 카드 2형 전부에서 표적 유전자가 강력하게 증폭되었으며, 종이 두께가 0.9mm나 1.2mm로 더 두꺼운 경우 더 많은 PCR 산물이 생성됨을 발견 할 수 있었다. 또한, 본 발명의 DNA카드에 흡착시킨 상태로 보관 한 경우, 실온에서 3개월에서 1년이란 장기간이 지난 후에도 베타-액틴 유전자가 강하게 증폭됨을 보였다. 이와 같은 결과는 본 발명에 따른 DNA카드에 보관 시, DNA를 분리 정제할 필요 없이 혈액 상태로 DNA 샘플을 실온에서 장기간 안정되게 보존할 수 있으며, 장기간 이후에도 분석이 가능함을 입증한다. 따라서 본 발명의 DNA카드는 혈액상태의 DNA 샘플을 간편하게 실온에서 장기 보관하고 운반하는 데 유용하며, 나아가 PCR 등 여러 가지 유전자 분석에도 유용함을 알 수 있다.

실시예 7 장기 보관된 DNA와 키토산 결합물에 대한 표적 유전자의 클로닝 및 염기서열분석 가능성 조사

실시예 4에 따라 액상으로 실온에서 장기 보관된 키토산 : DNA 결합물에 대해 PCR을 수행하고 얻은 산물을 클로닝(cloning)하여 자동염기서열분석(automated sequencing analysis)을 통해 본 발명의 방법에 따라 보관된 DNA가 보관 이후 안정되게 유지되어 사용될 수 있는가를 확인하였다.

본 발명의 방법에 따라 0.1% 수용성 키토산과 혼합하여 실온에서 3개월간 보관해 두었던 성인 대장조직의 게놈 DNA 샘플을 주형으로 하여 아데노마터스 폴리포시스 콜리(adenomatous polyposis coli)(APC) 유전자에 대해 PCR을 수행하고, 그 산물을 플라스미드 벡터에 클로닝한 후 다시 염기서열분석법으로 검색하였다. 그 방법은 다음과 같다.

유전자의 PCR 산물을 서열분석(sequencing) 반응의 주형으로 이용하기 위해, 적합한 농도로 맞추는 것이 중요한 바, 본 발명에서는 APC유전자 10ng을 이용하였다. PCR 튜브에 APC유전자의 각 엑손 별 PCR 산물과 순방향 또는 역방향 프라이머 가운데 하나를 3.2pmol, 반응 혼합물(Terminator ready reaction mix; Perkin Elmer, USA) 8㎕를 넣고 최종 20㎕가 되도록 멸균 증류수를 넣어 잘 혼합한다. 상기 혼합물을 96℃에서 10초, 50℃에서 5초 및 60℃에서 6분간 25회, 진앰프 2700 열 순환기를 사용하여 사이클(cycle) 서열분석 반응을 수행하였다. 얻어진 반응 산 물을 에탄올로 침전시키고 원심분리하여 유리 프라이머(free primer)와 반응혼합물(terminator ready reaction mix)내의 형광부착 디디옥시뉴클레오티드(dideoxynucleotide) (fluorescence labeled ddNTPs)를 제거하고 건조시켰다. 이렇게 얻어진 DNA는 포름아마이드: 25mM EDTA (pH 8.0): 블루 덱스트란(blue dextran) 혼합물과 로딩(loading) 완충용액 10㎕를 혼합하여, 끓는 물에서 5분간 변성(denaturation)시킨 후, 샘플을 얼음에 놓고 미리 5.5% 롱 레인저 겔(long ranger gel)(BMA, 카탈로그 번호, 미국)로 캐스팅(casting)한 플레이트의 각 웰에 변성 DNA 샘플을 넣고 2 내지 4시간동안 전기영동을 수행하여 ABI 프리즘(Prism) 377 자동서열분석기(automatic sequencer)(퍼킨-엘머 바이오시스템, 미국)의 소프트웨어를 이용하여 염기서열을 분석하였다.

APC 유전자의 자동염기서열분석결과는 도 10에 도시하였다.

서열 분석 결과 정상 APC유전자가 정확하게 증폭되었음을 확인하였고, 따라서 본 발명의 방법에 따른 DNA와 키토산의 액상 결합물은 실온에서 장기간 보관 후에도 클로닝과 염기서열분석이 가능할 정도로 DNA가 안정되게 보존됨을 확인하였으며, 이는 나아가 유전자돌연변이 검사와 암 검색에도 유용함을 나타내는 것이다.

실시예 8 DNA카드에 장기 보관한 DNA에 대한 유전자의 클로닝 및 염기서열분석 가능성 조사

DNA카드에 흡착시켜서 실온에서 장기 보관된 DNA 샘플에 대해 PCR로 얻은 산물의 클로닝과 자동염기서열분석이 적절하게 이루어질 수 있는 가를 확인하였다.

실시예 5에 따라 제작한 DNA카드에 점적하여 6개월 간 보관해 두었던 인체 폐암조 직의 게놈 DNA 샘플을 주형으로 하여 p53 종양억제유전자에 대해 PCR을 수행하고, 그 산물을 플라스미드 벡터에 클로닝한 후 다시 자동염기서열분석법으로 검색하였다. 그 방법은 실시예 7과 동일하다.

그 결과 돌연변이형의 p53유전자가 정확하게 증폭되었음을 확인하였으며(도 11), 본 발명의 방법에 따라 제작한 DNA카드를 이용하여 DNA를 보관할 경우 장기간이 지난 후에도 클로닝과 자동염기서열분석이 가능할 정도로 DNA가 보존되어, 나아가 유전자돌연변이 검사와 암 검색에도 유용함을 확인하였다.

실시예 9 DNA/키토산 결합물을 주형으로 한 사던블라팅 (Southern blotting) 방법

본 발명의 방법에 따라 보관된 DNA와 키토산 결합물을 이용하여 사던블라팅 등의 하이브리디제이션 분석법으로 특정 유전자의 존재 유무와 정도를 분석하고자 할 때 키토산과 결합된 DNA는 아가로스 겔 전기영동에서 이동하지 않아 블라팅 분석이 곤란하다는 문제가 있다. 따라서, 블라팅 분석을 위해서는 키토산을 제거하여 DNA 샘플을 사용해야 한다. 그러므로, 본 발명에서는 키토산과 결합된 DNA에서 DNA의 손상없이 키토산만을 제거하기 위한 방법을 수립하였다.

상술한 바와 같이, 수용성 키토산은 양이온성 염이므로 DNA와 결합을 하게 되는 것으로, 황산염(sulfate)계열인 SDS(sodium dodecyl sulfate, SOS(sodium octyl sulfate), CTAB(cetyltrimethyl-ammonium bromide)와 같은 강력한 양이온성 염을 처리하여 키토산을 DNA로부터 분리할 수 있다. 이 경우의 상기 양이온성 염은 가격이 저렴하고 DNA에 손상없이 블라팅 분석에 영향을 주지 않아야 한다. 따라서, 본 발명에서는 가격이 저렴하며 DNA와 프로브간의 하이브리디제이션 반응에도 영향을 주지 않는 SDS(시그마사, 미국)를 사용하였다.

본 발명의 방법에 따른 키토산 용액과 췌장암 조직의 DNA를 혼합하여 얻은 DNA/키토산 결합물을 실온에서 3개월간 보관한 후 5 내지 10㎍의 DNA/키토산 결합물에 5%(w/v) SDS를 섞어 사던블라팅용 아가로스 겔에 전기영동을 하고 K-ras유전자에 대해 공지의 방법(Sambrook J & Russell DW. Molecular cloning: a laboratory manual. 2001)으로 사던블라팅을 수행하였다.

그 결과 5% SDS를 함께 전기영동한 경우 DNA와 키토산이 분리되어 DNA가 겔상에서 이동함을 확인하였다(도 12 참조).

또한, 사던블라팅 결과 키토산과 결합하지 않고 -70℃에서 보관하였던 DNA와 키토산/DNA 형태로 6개월간 보관한 DNA 모두에서 K-ras유전자가 강하게 발현됨을 보여 주었다(도 13 참조). 따라서, 본 발명의 방법에 따른 DNA 보관 방법으로 장기간 보관한 DNA를 사용하여 사던블라팅을 수행하는 방법을 확립하였으며, 아울러 본 발명의 방법으로 보관한 DNA가 하이브리디제이션 분석에 유용함을 확인하였다.

실시예 10 DNA카드에 장기 보관한 DNA에 대한 유전자의 PCR-RFLP 분석 가능성 조사

본 발명의 DNA 카드 1형을 이용하여 보관하였던 인체 게놈의 DNA검체를 대상으로 PCR 후 RFLP(restriction fragment length polymorphism) 분석방법을 이용하여 유전자 형(genotyping)의 검사가 가능한지를 분석하였다. 아울러 본 발명의 DNA 카드 2형에 혈액 상태로 보관시켰던 인체 검체를 대상으로 PCR-RFLP 분석법으 로 유전자형의 검사가 가능한 지를 연구하였다. 본 발명의 DNA 카드가 실제로 유전자 진단에 이용이 가능한 지를 증명하기 위해, 심혈관질환 발병에 연관이 있는 유전자들을 PCR한 후 다음과 같이 특정 제한 효소들로 처리하여 전기영동으로 그 결과를 분석한 결과, 다수의 유전자형을 함께 검색하는데 손색이 없음을 확인 하였다 (도 8과 도 9 참조).

본 실시예를 좀 더 자세히 기술하면 다음과 같다.

본 발명의 DNA 카드 1형과 DNA 카드 2형, 그리고 플라스틱 ID 카드를 이용하여 다음과 같은 성인병에 관련된 6개 유전자를 아래 표와 같은 반응액을 이용하여 PCR 튜브에 각각 준비하였다.

표 1

조성	eNOS1/2	MTHFR1/2	AGT1/2	ACE1	ACE2	AT1R	APOE1/2
D.W	20.8	20.8	19.3	19.1	17.6	20.3	17.8
10 x buffer	3	3	3	3	3	3	3
25mM MgCl₂	2	2	2.5	2	2	3	2
2.5mM dNTPs	1	1	2	1.2	1.2	1.5	1
F(10pmole)	1	1	1	1	1	0.5	1
R(10pmole)	1	1	1	1	1	0.5	1
DMSO	-	-	-	1.5	3	-	3
GenePol 5U/l	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
주형 DNA	1	1	1	1	1	1	1
최종부피(μl)	30	30	30	30	30	30	30

상기에서 만들어진 반응액이 들어있는 PCR 튜브를 PE2700 열순환기(Perkin Elmer, USA)에 넣어 아래와 같이 각 유전자에 따라 증폭을 하였다.

1. eNOS1/2, MTHFR1/2, AGT1/2, AT1R, ACE1 유전자의 경우:

95℃/5min, 35 Cycels (95℃/30 sec, 58℃/30 sec, 72℃/40 sec), 72℃/10min

2. ACE2와 APOE1/2 유전자의 경우:

95℃/5min, 35 Cycels (95℃/30 sec, 65℃/30 sec, 72℃/40 sec), 72℃/10min

상기에서 얻어진 각각의 유전자의 PCR 산물은 EtBr이 들어있는 1.2% 아가로즈 겔 상에서 전기영동을 수행하여 확인하였다. 그 각각의 유전자 산물의 크기는 다음의 표 2와 같다.

표 2

유전자	위치	크기(bp)
Apo E	C112R	330
Apo E	R158C	330
AGT	M235T	303
AGT	T174M	354
ACE	D/I	319/597
ACE	D/D	335/No amplification
ATIB	A1166C	404
eNOS	G10-T	676
eNOS	E298D	371
MTHFB	A222V	198
MTHFB	A429E	128

이렇게 얻어진 PCR 산물을 가지고 RFLP를 수행하기 위해 우선 ACE 유전자 만을 제외한 나머지 5개 유전자 (eNOS, MTHFR, AGT, AT1R, APOE)의 PCR 산물을 DNA Clean & Concentrator kit(Zymo Research Corporation, CA USA)를 이용하여 다음과 같이 정제하였다.

1. PCR 산물 (약 25㎕)에 2배 용적의 DNA 결합용액(binding solution) 50㎕를 넣는다.

2. 미리 장착한 자이모(zymo) 스핀 컬럼에 상기 1을 모두 넣고 13,000rpm에서 30초간 원심분리 한다.

3. 수집 튜브에 모아진 용액을 피펫으로 버린다.

4. 세척용 완충액 200㎕를 상기 컬럼에 넣어 13,000rpm에서 30초간 원심분리 한다 (2번 반복).

5. 빈 튜브로 13,000rpm에서 40초간 원심분리하여 남아 있는 세척완충액을 완전히 제거한다.

6. 수집 튜브를 제거하고 깨끗한 1.5ml 미세원심분리 튜브를 새 컬럼에 장착시킨 후, 멸균된 3차 증류수 20㎕를 넣고 13,000rpm에서 40초간 원심분리하여 용출(elution) 시켰다. 혹은 65℃정도로 가열한 멸균 3차 증류수를 이용하기도 한다.

상기와 같은 방법으로 정제되어 얻어진 PCR 산물에 대해 하단에 명시된 각 유전자별로 맞는 제한효소를 각 제한효소의 반응조건에 맞게 준비한 후, 37℃ 수조에서 4-6시간 반응하였고, 이후 2.5% 아가로즈 겔 전기영동에서 각 유전자의 위험도를 검색하였다.

표 3

유전자	위치	효소
APOE	C112R	AfIIII
APOE	R158C	HaeII
AGT	M235T	LweI
AGT	T174M	Ncol
ATIB	A1166C	Ddel
ecNOS	G10-T	HincII
ecNOS	E298D	Eco24I
MTHFB	A222V	HinfI
MTHFB	A429E	MboII

실시예 11: 키토산을 함유한 PCR 키트의 제조

본 발명의 키토산을 사용한 DNA 보관 방법을 응용하여 하나의 튜브 내에 Taq중합효소, 프라이머, dNTP 및 완충용액등과 키토산을 함께 넣고(all in one tube) 상기 튜브에 DNA 또는 혈청 등의 샘플을 넣어 PCR 반응이 일어나게 하는 PCR 키트를 제조하였다. 본 PCR 키트는 DNA의 보관과 PCR 분석이 모두 가능하도록 한 것이 특징이다.

본 실시예에서는 B형 간염환자의 혈액에서 얻은 DNA를 사용하여 B형 간염바이러스의 유전자의 유무를 본 발명의 PCR 키트로 검색하였으며, 이는 암 관련 유전자의 진단을 통한 암의 진단, B형 바이러스 간염 또는 인유두종바이러스 감염, 성전파감염, 기타 세균 감염등에서 원인 균 진단에도 모두 적용이 가능하다.

본 키트의 사용방법은 다음과 같다.

5 ×GG one step PCR 완충용액™ 10㎕와 핫스타트(hot start)형의 Taq 중합효소(AmpliTaq Gold, 퍼킨엘머사, 미국), 10mM dNTP 혼합물 2.0㎕, 표적 유전자의 순방향 프라이머와 역방향 프라이머(5pmole)가 각각 1.0㎕ 씩, 그리고 0.1.% 농도의 키토산이 들어 있는 올-인-원 튜브에 DNA 주형을 1 내지 3㎍ 넣고 총 50㎕가 되도록 키트에 증류수를 채워서 잘 섞어 준 후 PCR을 수행하였다. 먼저 50℃에서 30분간 역전사 반응을 수행하고, 이어서 PCR 증폭은 95℃에서 15분 변성한 후 94℃에서 1분, 53℃에서 40초, 72℃에서 1분간 총 25 내지 40 사이클후 72℃에서 10분간 반응하여 종료하였다. 그 결과 본 발명의 PCR 키트를 사용하여 B형 간염바이러스의 DNA가 존재함을 확인하였다(자료첨부안함).

실시예 12: 플라스틱 DNA ID 카드의 제조

플라스틱 재질의 DNA ID 카드를 개발하기 위해 도 14 의 모식도와 같은 순서로 진행 하였다.

1. 수송된 개인의 검체, 즉 혈액이나 구강세포, DNA 카드등과 개개인의 사진자료를 접수한다.

2. 검체에서 게놈 DNA를 분리하고 혈액형을 검사한다.

3. 추출된 게놈 DNA를 이용하여 HLA 유전자형을 분석하고 STR 개인 식별 유전자검사를 수행하여 그 결과를 분석한다(도 16).

4. 여분의 DNA는 2개의 DNA 카드 중 은행 보관 카드에 점적하여 보관한다.

5. 부착용 종이 DNA 카드를 플라스틱카드와 합체하여 열과 압력을 함께 가하여 가하여 DNA ID 카드의 틀을 제작한다. 도 18에 제시한 것처럼 맨 하단에는 PVC 연질 층을, 그 위로 DNA 카드 1형이나 DNA 카드 2형을 놓고, 이 종이 DNA 카드 크기 만큼의 구멍(종이카드의 두께와 종이가 PVC와 이종 물질이기 때문에 가열로 인한 합체 시 합체가 되지 않으므로 반드시 카드 크기의 구멍을 만들어 주어야한다. 즉, 이 구멍에 종이카드가 끼워지는 것이다)이 있는 PVC 코어층을 놓고, 그 위에 다시 작은 2개의 구멍(이는 열을 가하여 카드를 합체하기 때문에 빈 공간이 거의 없어 DNA 종이카드에 DNA나 Blood를 주입하기 위한 것이므로 종이카드의 위치 위에 오도록 한다)을 낸 PVC 코어층을 놓고 맨 마지막으로 PVC 연질 층을 올려놓고 고압(100~140bar)에서 160~180℃의 고온으로 8~30분간 가열을 하여 열접착 시킨다. 이때, 종이 DNA 카드가 놓이는 곳은 마그네틱 바와는 정 반대의 위치여야 하며, 사진을 전사 시키는 위치와도 반대여야 한다(도 15 참조).

6. 분석된 자료를 플라스틱 ID 카드의 마그네틱 바(Magnetic bar)나 칩(chip)에 기록(encoding)한다. 보통 마그네틱 바는 1, 2, 3의 3가지 트랙으로 구성되어 보통 영문을 표기할 수 있는 트랙은 1번으로 사용 가능한 78 bit 이고, 2번 트랙은 38 bit이며, 3번 트랙은 107 bit를 사용할 수가 있다. 따라서 개인의 간단한 신상정보는 도 17에 제시한대로 1번 트랙에 엔코딩을 하고, 환자 고유의 질병코드는 2번 트랙에 엔코딩하며(예: C61-전립선암 또는 N40-양성전립선과다형성),STR 이나 HLA 타이핑 결과는 3번 트랙에 엔코딩하는 방법을 이용한다. 다만 은행 등과의 연계시의 플라스틱 DNA ID 카드의 엔코딩 방법은 메인서버에만 유전자 정보가 등록이 되어 있고, 은행이 원하는 방식대로 엔코딩을 하여, 개인의 유전 정보등은 POS 시스템을 이용하여, 본 메인서버에서 자료를 전송해 주는 방식으로 한다. 이러한 방식은 한 층 더 본 발명의 플라스틱 DNA ID 카드의 유용성을 극대화 하는 것이다.

7. 개인의 사진과 간략한 개인 정보를 전사시켜, 엠보싱 방법에 의해 플라스틱 ID 카드에 각인시킨다.

8. 슈퍼 컴퓨터 (서버용)에 개인의 자료를 입력하고 플라스틱 DNA ID 카드에 개인 고유의 ID 코드를 부여하고, 개인이 패스워드를 설정한다.

9. 상기와 같이 제작된 플라스틱 DNA ID 카드에 들어있는 종이 DNA 카드에 개인의 게놈 DNA를 주입한 후, 홀로그람 또는 스티커 등으로 구멍을 막아서 DNA ID 카드를 완성시킨다.

10. POS 시스템을 구축하여 국내 뿐 아니라 국외에서도 각 개인이나, 병원, 각 기관이나 은행등에서도 필요시에 플라스틱 DNA ID 카드에 내장되어 있는 ID와 패스워드를 이용하여, 개인의 정보접근이 보안유지 조건에 따라 가능하도록 실행시킨다.

도 15는 본 발명의 플라스틱 DNA ID 카드의 일실시예의 모식도이다. 카드의 전면에는 개인의 사진과 이름 그리고 간단한 개인정보 (응급 시 병원에서 바로 대처할 수 있는 정도)와 주소가 등록되어 있으며, 카드 뒷면에는 개인의 유전정보를 코드화한 마그네틱 스트립이 있으며, 서명란과, DNA 보관 부위가 위치하도록 디자인 하였다.

실시예 13: 플라스틱 DNA ID 카드에 합체로 보관시킨 종이 DNA 카드 조각으로 부터 유전자 증폭실험.

이미 고온과 고압으로 처리가 되어 만들어진 플라스틱 DNA ID 카드 내에 합체시킨 1형이나 2형의 종이 DNA 카드에 보관된 DNA로부터 유전자를 증폭할 수 있는 가를 확인하기위해 성인병 유전자 가운데 하나인 eNOS 유전자를 PCR로 증폭하였다. 그 방법은 상기한 실시예 10과 동일하게 수행을 하였다.

고온 고압으로 제작된 플라스틱 DNA ID 카드 내에 1형의 DNA 카드 및 2형의 DNA카드를 각각 합체시켜서 각각에 인체 게놈 DNA와 혈액을 침지하여 보관시킨 후 이들 플라스틱 DNA ID 카드를 이용하여 성인병 유전자 가운데 하나인 eNOS 유전자를 PCR로 증폭하여 비교하였다. 이 실험을 통하여, 본 발명에서 혈액침착용 DNA카드 2형을 이용하는 경우에는 반드시 혈액샘플을 점적해야만 하며(도 19 참조), PCR 증폭 시에는 플라스틱 DNA ID 카드의 플라스틱 덮개(cover)를 반드시 먼저 제거를 해야만 한다는 사실을 알게 되었다.

실험실에서 인위적으로 압력없이 고온으로 처리한 것과 실제 고온 고압으로 제작된 플라스틱 DNA ID 카드를 이용하여, 카드가 제작되기 전에 검체를 넣은 것과 제작된 후에 검체를 넣은 것을 비교하기 위해 각각의 카드 조각을 이용하여 성인병 유전자 가운데 하나인 eNOS 유전자를 PCR 증폭한 결과이다. 본 실험을 통하여, 보관하는 시료가 DNA 이나 혈액이든 간에 상관없이 일단 먼저 제작된 플라스틱 DNA ID 카드에 시료를 점적하는 것이 좋다는 결과를 얻었다(도 20).

고온 고압으로 제작된 플라스틱 카드에 DNA 점적용 DNA카드 1형과 혈액 점적용DNA카드 2형을 각각 부착하여 DNA ID 카드를 제작하여 각각에 대해 점적할 시료의 적절한 농도와 양을 알아보기 위해서 게놈 DNA 의 경우 150ng/㎕의 농도로 다양한 용적의 DNA시료를 점적하였고, 이렇게 준비된 카드조각을 이용하여 eNOS 유전자를 PCR로 증폭하여 분석하였다. 본 실험을 통하여, DNA카드 1형(DNA용)에는 혈액을 로딩하는 것이 부적절하며 DNA를 점적하는 경우 최소한 1.5μg정도가 점적되는 것이 적절함을 알 수 있었다(도 21).

고온 고압으로 제작된 플라스틱 DNA 카드에 보관된 검체를 PCR 증폭 시에 전 처리 과정으로 카드 조각을 세척용 완충액를 처리하는 것과 처리하지 않은 것과의 차이를 성인병 유전자 가운데 하나인 eNOS 유전자를 PCR 증폭하여 비교 분석하였다. 그 결과 플라스틱 ID 카드를 이용하여 PCR을 할 때는 카드 조각을 사전에 세척용 완충액으로 처리하지 않는 경우에 PCR증폭이 더 잘되었다.(도 22).

본 발명에 따른 수용성 키토산을 이용한 DNA보관 방법은 DNA의 보관효능이 우수하며, 기존의 방법 들과 달리 실온에서 안정적으로 장기 보관이 가능하다. 본 방법을 이용하면 크기가 작은 플라스미드 DNA는 물론이며 거대한 동식물의 게놈 DNA와 cDNA, 진균과 박테리아, 바이러스의 게놈 DNA도 모두 실온에서 안정적으로 장기 보관하고 운반할 수 있다. 본 방법에 따라 보관된 DNA는 PCR과 RFLP, 클로닝, 염기서열분석, 사던블라팅 등의 유전자 분석에 모두 유용하다. 아울러 이는 PCR 키트 등에도 광범위하게 이용될 수 있으며 간편하고 경제적이다.

특히 본 방법대로 생산한 DNA카드(DNA 카드 1형)는 다수의 DNA 샘플을 실온에서 장기 보관하며 이송하는 데 매우 유용하며 본 방법대로 생산된 DNA 카드(DNA카드 제 2형)는 혈액 등의 DNA를 함유한 각종의 생체 샘플을 DNA 손상 없이 장기간 실온에서 보관할 수 있다. 또한 이들 DNA 카드에 보관된 샘플에 대해서는 장기간이 지난 후에도 PCR과 PCR-RFLP, 히브리다이제이션, 염기서열분석, SNP 분석 등의 각종 유전자 분석이 정확하고 간편하게 이루어 질 수 있으며, 이는 기초 연구 뿐 아니라 각종 임상 진료에도 크게 도움이 된다.

본 발명의 방법대로 만들어진 DNA ID 카드는 개개인의 DNA를 보관하는 DNA 은행의 역할을 할 뿐 아니라, 그 사람의 유전정보도 함께 보관함으로서 개인 식별과 장기이식 등 진료에도 도움이 될 수 있다.

Claims

DNA 수용액과 수용성 키토산 수용액을 혼합하여 제조되는 키토산/DNA 결합물의 형태로 DNA를 보관하며, 상기 수용성 키토산은 탈아세틸화 정도가 60% 이상이며, 분자량은 10kDa에서 500kDa인 것을 특징으로 하는 DNA 보관 방법.
제1항에 있어서, 상기 DNA는 동물과 식물, 및 진균, 박테리아, 바이러스의 게놈 DNA와 cDNA, 플라스미드 DNA를 포함하며, 그 크기는 수십 염기 내지 수십억 염기인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 수용성 키토산 수용액의 농도는 0.02%(w/v) 내지 1%(w/v)이며, 상기 혼합물 내의 수용성 키토산과 DNA의 중량비는 1:0.5 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 수용성 키토산 수용액의 농도는 0.02%(w/v) 내지 0.25%(w/v)이며, 상기 DNA 수용액의 농도는 1㎍/㎕이하이고, 상기 혼합물 내의 수용성 키토산과 DNA의 중량비는 1:0.5 내지 1: 3인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 DNA와 키토산 결합물은 실온 내지 -70℃의 온도로 보관되는 것을 특징으로 하는 DNA 보관 방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, DNA를 수용성 키토산과 결합시킨 결합물을 액상 상태로 보관하는 것을 특징으로 하는 DNA 보관방법.
수용성 키토산 및 요산을 포함하는 조성물에 침지하고 건조시켜 제조되며, DNA 수용액을 점적하면 상기 수용성 키토산과 DNA가 결합물을 형성함으로써 DNA를 보관하기 위한 종이 형태의 DNA 카드.
수용성 키토산, 및 요산을 함유하는 세포용해성 완충액을 포함하는 조성물에 침지하고 건조시켜 제조되며 DNA를 함유한 생채 시료를 점적하면 상기 수용성 키토산과 DNA가 결합물을 형성함으로써 DNA를 보관하기 위한 종이 형태의 DNA 카드.
제 7 항 또는 제 8항에 있어서, 상기 종이는 블라팅 용 종이 또는 크로마토크라피 용 종이이며 그 두께가 0.3 내지 1.2mm인 것을 특징으로 하는 DNA 카드.
제 7항 또는 제 8항에 있어서, 직경이 약 12.3cm x 8.1cm인 웰(well)이 6개, 24개, 96개, 또는 384개 표시되어 있으며, 각 웰에 DNA 샘플 또는 혈액 샘플을 점적하여 보관하는 것을 특징으로 하는 DNA 카드.
제 7항에 있어서, 상기 조성물은 0.1% 내지 1%(w/v)의 수용성 키토산 용액에 0.5mM 내지 20mM농도의 요산을 부피비 1:1로 혼합하여 제조되는 것을 특징으로 하는 DNA 카드
제 8항에 있어서, 상기 세포용해용 완충액의 조성은 Tris(8mM), EDTA(0.5mM), SDS(0.1%w/v) 및 요산(2mM)을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 카드.
a) 제 7항의 DNA 카드에서 조각을 취하여 PCR용 튜브에 넣는 단계;

b) 상기 튜브에 TE 버퍼 (10 mM Tris-Cl, 0.1 mM EDTA, pH = 8.0)를 첨가하고, 혼합한 후 실온에서 5분간 방치한 후 피펫으로 TE 버퍼를 제거하는 단계;.

c) 상기 b)단계의 과정을 2회 반복하는 단계;

d) 상기 튜브를 실온에서 1시간 또는 56℃에서 10분간 두어 건조시키는 단계 및

e) 상기 튜브에 PCR 시료를 넣고 PCR 증폭하는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 카드의 PCR 분석방법.
a) 제 8항의 DNA 카드에서 조각을 취하여 PCR용 튜브에 넣는 단계;

b) 상기 튜브에 세척액 (GG purification reagent; 0.5mM EDTA, 8mM Tris-Cl, 2mM Uric acid, 1%(w/v) SDS )을 첨가하고, 혼합한 후 실온에서 5분간 방치한 후 피펫으로 세척액을 제거하는 단계;.

c) 상기 b)단계의 과정을 3회 반복하는 단계;

d) 상기 튜브에 TE 버퍼 (10 mM Tris-Cl, 0.1 mM EDTA, pH = 8.0)를 첨가하고, 혼합한 후 실온에서 5분간 방치한 후 피펫으로 TE 버퍼를 제거하는 단계;.

e) 상기 d)단계의 과정을 2 내지 3회 반복하는 단계;

f) 상기 튜브를 실온에서 1시간 또는 56℃에서 10분간 두어 건조시키는 단계; 및

e) 상기 튜브에 PCR 시료를 넣고 PCR 증폭하는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA카드의 PCR 분석방법.
제 6항의 보관방법에 의하여 보관된 DNA, 또는 제 7항 또는 제 8항의 DNA카드에 보관된 DNA를 PCR-RFLP, 크로닝, 라이브라리 합성, 염기서열분석 또는 사던블라팅에 사용하는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
황산염 계열 양이온성 염을 사용하여 제 6항의 보관방법에 의하여 보관된 액상 상태의 키토산/DNA 결합물 또는 제 7항 또는 제 8항의 DNA 카드에 존재하는 키토산/DNA 결합물로부터 DNA를 분리하여 유전자 분석에 사용하는 것을 특징으로 하는 DNA의 분석방법.
제 16항에 있어서, 상기 황산염 계열 양이온성 염은 SDS(sodium dodecyl sulfate, SOS(sodium octyl sulfate) 또는 CTAB(cetyltrimethyl-ammonium bromide) 인 것을 특징으로 하는 DNA 분석방법.
올리고(oligo) d(T) 프라이머(primer), Taq 중합효소, 반응 완충용액, dNTP, 디옥시뉴클레오타이드(dNTP) 및 수용성 키토산을 포함하는 튜브에 DNA 또는 혈청 검체를 첨가하여 보관해 두었다가 상기 튜브를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 특징으로 하는 PCR 키트.
제 1항의 DNA 보관방법에 의하여 키토산과 개인의 DNA의 결합물이 일정부분에 보관되며 마그네틱 바 또는 내장된 칩 내에 그 개인의 유전정보가 보관되는 것을 특징으로 하는 DNA ID 카드.
제 19항에 있어서, 상기 DNA ID 카드의 기본 재질이 플라스틱으로 이루어진 것을 특징으로 하는 DNA ID 카드.
a) PVC 연질층 위에 제 7항 또는 제 8항의 DNA 종이 카드를 적층하는 단계;

b) 상기 DNA 종이 카드 위에 상기 카드 크기의 구멍을 갖는 제 1 PVC 코어층을 적층하는 단계;

c) 상기 제 1 PVC 코어층 위에 제 1 PVC 코어층의 구멍위에 위치하도록 이보다 작은 크기의 구멍을 2개 갖는 제 2 PVC코어층을 적층하는 단계;

d) 상기 제 2 PVC 코어층 위에 PVC 연질층을 적응하는 단계; 및

e) 상기 적층물에 열과 압력을 함께 가하여 열접착시키는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA ID 카드의 제조 방법.
제 20항에 있어서, 상기 DNA 카드는 제 1 PVC 연질층, DNA종이카드, 상기 DNA 종이카드 크기의 구멍을 갖는 제 1 PVC 코어층, 상기 제 1 PVC 코어층의 구멍위에 위치하며 상기 DNA 종이카드에 DNA 또는 DNA를 포함하는 생체 검체를 점적할 수 있는 구멍을 갖는 제 2 PVC코어층, 제 2 PVC 연질층의 적층물로 구성되며 상기 마그네틱 바는 상기 DNA 종이카드에 DNA 또는 DNA를 포함하는 생체 검체를 점적하여 보관되는 면의 반대면에 형성되는 것을 특징으로 하는 DNA ID 카드.
제 22항에 있어서, 상기 마그네틱 바에는 개인의 신상정보, 질병코드 및 STR 또는 HLA 타이핑이 엔코딩 되는 것을 특징으로 하는 DNA ID 카드.
제 19항, 제 20항, 제 22항, 또는 제 23항에 있어서, 상기 DNA ID 카드상에 점적된 gDNA가 1.5 ㎍이상인 것을 특징으로 하는 DNA ID 카드.
제 19항, 제 20항, 제 22항, 또는 제 23항의 DNA ID 카드 조각을 세척용 완충액(washing buffer)의 처리없이 PCR 증폭하는 것을 특징으로 하는 분석 방법