NO317653B1 - Formulering som omfatter komplekser av kitosanoligomerer og nukleinsyre, fremgangsmate for a fremstille formuleringen samt anvendelser derav. - Google Patents
Formulering som omfatter komplekser av kitosanoligomerer og nukleinsyre, fremgangsmate for a fremstille formuleringen samt anvendelser derav. Download PDFInfo
- Publication number
- NO317653B1 NO317653B1 NO20022148A NO20022148A NO317653B1 NO 317653 B1 NO317653 B1 NO 317653B1 NO 20022148 A NO20022148 A NO 20022148A NO 20022148 A NO20022148 A NO 20022148A NO 317653 B1 NO317653 B1 NO 317653B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- chitosan
- formulation
- oligomers
- nucleic acid
- formulation according
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 73
- 238000009472 formulation Methods 0.000 title claims description 56
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 42
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 42
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 42
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 24
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 135
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 36
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 19
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 13
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 12
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 7
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 7
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 7
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000012387 aerosolization Methods 0.000 claims description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 5
- -1 cationic polysaccharide Chemical class 0.000 claims description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 claims description 4
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 3
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 claims description 3
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 claims description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 3
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 claims description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 2
- 238000011239 genetic vaccination Methods 0.000 claims description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 2
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims 1
- 229940043274 prophylactic drug Drugs 0.000 claims 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 claims 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 claims 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 32
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 31
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 28
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 17
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 11
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 11
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 11
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 11
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 10
- 108010089807 chitosanase Proteins 0.000 description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 10
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 9
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 9
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 9
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 9
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 7
- 238000000569 multi-angle light scattering Methods 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 4
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000002663 nebulization Methods 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- LKAPTZKZHMOIRE-KVTDHHQDSA-N (2s,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolane-2-carbaldehyde Chemical group OC[C@H]1O[C@H](C=O)[C@@H](O)[C@@H]1O LKAPTZKZHMOIRE-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 2
- QCQCHGYLTSGIGX-GHXANHINSA-N 4-[[(3ar,5ar,5br,7ar,9s,11ar,11br,13as)-5a,5b,8,8,11a-pentamethyl-3a-[(5-methylpyridine-3-carbonyl)amino]-2-oxo-1-propan-2-yl-4,5,6,7,7a,9,10,11,11b,12,13,13a-dodecahydro-3h-cyclopenta[a]chrysen-9-yl]oxy]-2,2-dimethyl-4-oxobutanoic acid Chemical compound N([C@@]12CC[C@@]3(C)[C@]4(C)CC[C@H]5C(C)(C)[C@@H](OC(=O)CC(C)(C)C(O)=O)CC[C@]5(C)[C@H]4CC[C@@H]3C1=C(C(C2)=O)C(C)C)C(=O)C1=CN=CC(C)=C1 QCQCHGYLTSGIGX-GHXANHINSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 2
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 159000000021 acetate salts Chemical group 0.000 description 2
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 2
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 2
- 238000000889 atomisation Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 2
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 2
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 2
- MCHWWJLLPNDHGL-KVTDHHQDSA-N (2r,3s,4s,5r)-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolane-3,4-diol Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MCHWWJLLPNDHGL-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 1
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FZHXIRIBWMQPQF-UHFFFAOYSA-N Glc-NH2 Natural products O=CC(N)C(O)C(O)C(O)CO FZHXIRIBWMQPQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010038988 Peptide Hormones Proteins 0.000 description 1
- 102000015731 Peptide Hormones Human genes 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000012436 analytical size exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004082 barrier epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N beta-D-glucosamine Chemical compound N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N 0.000 description 1
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000003467 cheek Anatomy 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- LKAPTZKZHMOIRE-UHFFFAOYSA-N chitose Natural products OCC1OC(C=O)C(O)C1O LKAPTZKZHMOIRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 description 1
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 1
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004890 epithelial barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 210000003918 fraction a Anatomy 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000012458 free base Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000001578 tight junction Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
- A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
- A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/007—Pulmonary tract; Aromatherapy
- A61K9/0073—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Otolaryngology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Denne oppfinnelsen gjelder et nytt ikke-viratt leveringssystem for nukleinsyrer i form av en formulering som omfatter komplekser av kationiske kitosanoligomerer og en nukleinsyre, nærmere bestemt et system for innføring av nukleinsyre i celler i vertsvev etter at vevet har fått tilført nukleinsyre. Dette systemet er basert på det biologisk nedbrytbare polysakkaridet kitosan som ved kjemiske modifikasjoner oppnår en mer effektiv levering av biologiske aktive nukleinsyrer, f.eks. oligo- eller polynukleotider som koder et ønsket produkt, og som vil kunne lage ønskede produkter i celler tilstede i et aktuelt vev. Videre omfatter foreliggende oppfinnelse fremgangsmåte for å fremstille formuleringen, samt anvendelser derav.
Konseptet genterapi er basert på at nukleinsyrer, dvs. DNA og RNA, kan brukes som farmasøytiske produkter til å lage terapeutiske proteiner på ønskede steder i levende organismer. Leveringssystemer for nukleinsyrer blir ofte klassifisert som virale og ikke-virale leveringssystemer. På grunn av de høyt utviklede og spesialiserte komponentene er virale systemer i øyeblikket de mest virkningsfulle midlene til å levere DNA fordi de er svært effektive både når det gjelder levering og produksjon. Imidlertid er det knyttet visse sikkerhetsproblemer til virale leveringssystemer. Toksisitet, immunogenisitet, begrensede muligheter til å nå frem til spesifikke celletyper, begrenset DNA-bæreevne, produksjons- og emballasjeproblemer, rekombinasjoner og svært høye produksjonskostnader hemmer klinisk utnyttelse (Luo og Saltzman, 2000). Av disse grunnene har ikke-virale leveringssystemer blitt stadig mer etterspurt både i laboratorier for grunnforskning og kliniske miljøer. Fra et farmasøytisk synspunkt er det imidlertid fremdeles en utfordring å levere nukleinsyrer siden det i levende organismer oppnås en relativt lav produksjon med ikke-virale leveringssystemer i forhold til virale leveringssystemer (Saeki er al., 1997).
En mengde ikke-virale leveringssystemer, deriblant kationiske lipider, peptider og polymerer i sammensetning med plasmid DNA (pDNA); er beskrevet tidligere (Boussif et ai, 1995, Felgner et al., 1994, Hudde et al., 1999). De negativt ladede nukleinsyrene reagerer med de kationiske molekylene primært via ione-ioneinteraksjoner og går over fra fri form til kompakt tilstand. I denne tilstanden kan de kationiske molekylene gi beskyttelse mot nukleasenedbrytning og kan også gi det nukleinsyre-kationiske molekylkomplekset overflate-egenskaper som fremmer interaksjon med cellene og opptak av cellene (Ledley, 1996).
Blant disse kationiske molekylene er det påvist at den syntetiske polymereren polyetylenimin (PEI) danner stabile komplekser med pDNA og fører til relativt stor ekspresjon av transgenet (uttrykk av transgenet) både in vitro og in vivo (Boussif et al., 1995, Ferrari et al., 1997, Gautam et al., 2001). Derfor brukes PEI ofte som referansesystem i eksperimentell sammenheng. Imidlertid har det blitt antydet at det eksisterer en korrelasjon mellom toksisitet og effektivitet for PEI (Luo og Saltzman, 2000), og nye undersøkelser har sett nærmere på toksisitet ved bruk av PEI (Godbey et al., 2001, Putnam et al., 2001). En annen ulempe med PEI er at det ikke er biologisk nedbrytbart, og følgelig kan det lagres i kroppen i lang tid. Derfor er det sterkt ønskelig å finne effektive og ikke-giftige biologisk nedbrytbare ikke-virale leveringssystemer.
I de fleste tilfellene har ikke-virale leveringssystemer blitt levert in vivo på parenteral måte. Etter intravenøs innføring i mus ble kompakte nukleinsyre-kationiske molekylkomplekser hovedsakelig avsatt i lungekapillærene der genet ble produsert i de indre celleveggene på kapillærene i lungeblærene (Li og Huang, 1997, Li et al., 2000, Song et al., 1997) og til og med i de alveolare cellene (Bragonzi et al., 2000, Griesenbach et al., 1998), men ikke i epitelet. Derimot ble fritt, nakent DNA raskt brutt ned i blodomløpet før det nådde målet og resulterte stort sett i ingen genekspresjon. Innsprøyting av nakent DNA i skjelettmusklene resulterte derimot i doseavhengig genekspresjon (Wolff et al., 1990), noe som ble ytterligere forsterket når det forekom sammen med en ikke-kompakterende, men "interaktiv" polymer, f.eks. polyvinylpyrrotidon (PVP) og polyvinylalkohol (PVA)
(WO 9621470) (Mumper et al., 1996, Mumper et al., 1998). Konklusjonen er at gentransfeksjon in vivo er avhengig av vevet på en uforutsigelig måte og derfor fortsatt utgjør en utfordring.
Levering av ikke-virale genleveringssystemer via slimhinnene er også beskrevet, dvs. levering via fordøyelsessystemet, nesen og luftveiene (Koping-Hoggard etat., 2001, Roy et al., 1999), WO 01/41810. Bortsett fra levering til nesevevet, der DNA i ikke-kompaktert form gir best genekspresjon (WO 01/41810), blir ofte kompakterte nukleinsyre-kationiske molekylkomplekser foretrukket fremfor ikke-kompaktert DNA når det kreves høy genekspresjon i slimhinnevevet.
I tidligere artikler er ikke-virale genleveringssystemer basert på kationiske polymerer, f.eks. kitosan med temmelig stor molekylvekt, ofte flere hundre kilodalton (kDa) med 5 kDa som nedre grense, se for eksempel MacLaughlin et al., 1998, Roy et al., 1999 og WO 97/42975. Hovedgrunnen er at polymerer med lavere molekylvekt (< 5 kDa) danner ustabile sammensetninger med DNA, noe som resulterer i lav genekspresjon (Koping-Hoggard, 2001). Det er imidlertid mange ulemper forbundet med å bruke kationer med høy molekylvekt, for eksempel økt aggregering av kompakterte nukleinsyre-kationiske molekylkomplekser og problemer med løsningsevnen (MacLaughlin et al., 1998). Dessuten er det flere biologiske fordeler med å bruke kationiske molekyler med
, lavere molekylvekt. Generelt viser de for eksempel redusert toksisitet og redusert komplementær aktivering sammenlignet med kationer med høyere molekylvekt (Fischer ef a/., 1999, Plank ef a/., 1999).
I den tidligere artikkelen er det beskrevet noen eksempler på bruken av kationer med lav molekylvekt som danner sammensetninger med nukleinsyre (Florea 2001, Godbey et al., 1999, Koping-Hoggard, 2001, MacLaughlin, et al., 1998, Sato et al., 2001). Imidlertid er det slik at disse kationene med lav molekylvekt danner ustabile forbindelser med DNA og skiller seg i et elektrisk felt (agarosegel-elektroforese). Dette resulterer i ingen eller en svært utydelig genekspresjon in vitro sammenlignet med kationer med høyere molekylvekt. Dette kan forklares med at komplekser dannet mellom DNA og kationer med lav molekylvekt generelt sett er ustabile og lett dissosieres (Koping-Hoggard, 2001). Faktisk har dissosiasjonen av kationisk molekylære DNA-komplekser og frigjøring av nakent DNA ved agarosegel-elektroforese ofte blitt brukt som en analyse på å skille ineffektive fra effektive formuleringer i litteraturen (Fischer ef al., 1999, Gebhart og Kabanov, 2001, Koping-Hoggard et al., 2001).
Tidligere artikler omhandler forskjellige eksempler på metoder for levering av nukleinsyrer til luftveiene ved bruk av ikke-virale vektorer (Deshpande et al., 1998, Ferrari et al., 1997, Gautam et al., 2000). Nylig identifiserte og karakteriserte vi ett slikt system basert på den DNA-komplekserende polymereren kitosan (Koping-Hoggard et al., 2001), et lineært polysakkarid som kan fremstilles fra kitin. Kitosanbaserte genleveringssystemer er også beskrevet i US patent nr. 5, 972, 707 (Roy et al., 1999), US patentsøknad nr. 2001/0031497 (Rolland et al., 2001) og iWO 98/01160.
Kitosan har vist seg å kunne modifisere 'tight junctions' (celle-celle
kontaktpunkter mellom epitelceller) og dermed oppnå bedre levering av legemidler over epitelbarrierene (Artursson et al., 1994). Kitosan ansees for å være ikke-giftig når det tilføres gjennom munnen på mennesker og har blitt godkjent som tilsetning i matvarer og er også brukt som bestanddel i sårhelingsprodukt (lllum, 1998).
Kitosaner omfatter en familie med vannløselige, lineære polysakkarider som består av (1->4)-kjedete 2-acetamido-2-deoxy-p-D-glukose (GIcNAc, A-enhet) og 2-amino-2-deoxy-p-D-glukose (GlcN, D-enhet) i varierende sammensetning og sekvens (figur 1). Den definisjonen som er anvendt her, for å skjelne mellom kitin og kitosan er basert på at kitin ikke lar seg oppløse i fortynnet syreoppløsning og at kitosan lar seg oppløse i den samme fortynnede syreoppløsningen (Roberts, 1992).
Det relative innholdet av A- og D-enheter kan uttrykkes som en fraksjon av A-enheter:
Fa = antall A-enheter/(antall A-enheter + antall D-enheter)
Fa er relatert til den prosentvise delen av de-N-acetylenheter gjennom formelen: % de-N-acetylenheter = 100 % x (1-FA)
Hver D-enhet inneholder en hydrofil og protondannende aminogruppe der hver A-enhet inneholder en hydrofob acetylgruppe. De relative mengdene av de to monomerene (dvs. A/D = FA/(1-FA)) kan varieres over et bredt område og gi stor variasjon i de kjemiske, fysiske og biologiske egenskapene. Dette omfatter egenskapene til kitosanene i oppløst tilstand, i geltilstand og i fast tilstand samt deres interaksjoner med andre molekyler, celler og annet biologisk og ikke-biologisk materiale.
Påvirkningen av kitosanets kjemiske struktur ble demonstrert da kitosaner ble brukt i et ikke-viralt genleveringssystem (Koping-Hoggard et al., 2001). Kitosaner med forskjellig kjemisk sammensetning viste strukturavhengig effektivitet som genleveringssystem. Bare kitosaner som dannet stabile komplekser med pDNA viste betydelig transgenetisk ekspresjon. Slike komplekser krevet at minst 65% av kitosanmonomerene var deacetylert.
Kitosan kan bli depolymerisert enten kjemisk eller enzymatisk for å oppnå kitosanpolymerer eller oligomerer med ønsket molekylstørrelse. Forskjellige kjemiske nedbrytningsmekanismer kan brukes til å depolymerisere kitosaner, det kan være syrehydrolyse, salpetersyrling og oksidativ-reduktiv depolymerisering. Ultrasonisk depolymerisering av polymerer kan også brukes, men disse metodene er ikke hensiktmessige å bruke for å oppnå svært lav molekylvekt. Depolymerisering av kitosan ved hjelp av salpetersyrling er en måte for å oppnå kitosan med lav molekylvekt, for eksempel som beskrevet i US 3, 922,260 og US 5, 312, 908. Denne mekanismen innebærer deaminering av en D-enhet ved dannelse av 2,5-anhydro-D-mannose-enhet, på reduserende ende som videre kan reduseres til 2,5-anhydro-D-mannitol ved bruk av NaBH4 som vist på figur 2. Det er også mulig å bruke forskjellige enzymer til depolymerisering av kitosan, for eksempel US 5, 482, 843, kitosanaser, kitinaser og lysozym. I tillegg kan syrehydrolyse brukes til å depolymerisere kitosan (Vårum et al., 2001 og henvisninger der).
Tidligere har undersøkelser på effekt av kitosanets molekylvekt på transfeksjonseffektivitet in vitro av kitosan-pDNA-komplekser ikke påvist noen betydelig avhengighet av molekylvekt i området 20-200 kDa (Koping-Hoggard et al., 2001, MacLaughlin ef al., 1998). Men i en annen undersøkelse (Sato et al., 2001) viste kitosaner på 15 kDa og 52 kDa høyere genekspresjon enn kitosan > 100 kDa, mens det ikke ble detektert noen genekspresjon med kitosan på 1,3 kDa. I tillegg har undersøkelser av genekspresjon in vitro og i lungevev in vivo med bruk av kitosaner med lav molekylvekter (1,2 kDa, 2,4 kDa og 4,7 kDa) vist at kun kitosanet på 4,7 kDa formidlet en signifikant genekspresjon (Koping-Hoggard, 2001).
Kitosaner med forskjellig molekylvekter er blitt brukt som komponenter i komplekser til ikke-viral genlevering. For eksempel henviser US patentsøknad nr. 2001/0031497A til bruken av kitosan med lav molekylvekt som komponent i leveringssystemet, dvs. kitosan i området 2-4 kDa Mw, som resulterte i den minste partikkelen i genleveringssystemet, og også i en økt transfeksjon av celler med det kondenserte leveringssystemet in vitro.
Kitosaner med forskjellig molekylvekter som brukes i genleveringssystemer, kommer vanligvis som ufraksjonerte prøver fra leverandører på markedet, og lavere molekylvekter fås fra de nevnte prøvene ved partiell nedbrytning ved hjelp av organiske og uorganiske syrer, salpetersyre og kitosannedbrytende enzymer. I alle tilfeller er distribusjonen av molekylvekter relativt høy. For eksempel ble en kommersiell kitosan med en gjennomsnittlig molekylvekt (Mw) på 180 000 analysert med 'Size-exclusion chromatography with multi-angle laser light scattering (SEC-MALLS)' (Størrelsesfraksjoneringskromatografi med lys-spredningsdeteksjon ved flere spredningsvinkler). Figur 3A viser elusjonsprofilen, dvs. detektorsignalets brytningsindeks, som er proporsjonalt med konsentrasjonen av kitosan, kombinert med et plott av den beregnede molekylvekten (uttrykt som kitosan i acetatsalt form) som funksjon av elusjonsvolumet. Det er tydelig at prøven inneholder molekylvekter fra 10<6> g/mol (1000 kDa) til venstre i kromatogrammet og ned til 104 (10 kDa) til høyre i kromatogrammet. Ny beregning av disse dataene gir den kumulative distribusjonen av molekylvekter (figur 3B). Det kan sluttes av disse beregningene at 12 % (w/w) av prøven har en molekylvekt på under 40 kDa og 38 % av prøven en molekylvekt på under 100 kDa. Likeledes har 18 % av prøven en molekylvekt på over 300 kDa og 9 % en molekylvekt på over 400 kDa. Prøven er således polydispers siden den inneholder polymerer med forskjellige molekylvekter eller kjedelengder.
Kitosaner kan leveres i fri aminform eller som forskjellige salter, f.eks. kitosanklorid, kitosanglutamat og kitosanacetat. Saltformen påvirker forholdet mellom molekylvekten (M) og DP (antallet sukkerenheter per molekyl). De følgende ligningene beskriver dette forholdet mellom DP og M:
Den vektsgjennomsnittlige molekylvekten (Mw) på en polydispers prøve kan uttrykkes som Mw = ICjMj/ICj, der C\ er konsentrasjonen (g/l) av en spesiell molekylvekt (Mi) i fordelingen (Tanford, C. (1961) Physical chemistry of macromolecules, John Wiley and Sons, New York, del 8b). På samme måte kan det antalls gjennomsnittlige molekylvekten (Mn) uttrykkes som Mn = ECj/E(Ci/M|). I det tilfellet som det vises til over, er Mw = 180 kDa og Mn = 84,5 kDa, og polydispersitetsindeksen, som defineres som MJMn, lik 2,1. En polydispersitet på ca. 2 er karakteristisk for en lineær polymer som har vært utsatt for tilfeldig depolymerisering (Tanford, C. (1961) Physical chemistry of macromolecules, John Wiley and Sons, New York, del 33a).
Fordelingen av kjedelengder etter en tilfeldig depolymerisering av en lineær polymer som kitosan er gitt ved ligningen (Tanford (1961):
Wx<=> xp<x-1>(1-p)<2>
Wx er vektfraksjonen av kjeder som inneholder x monomerer (for kitosaner er monomerene sukkerenheter), p er fraksjonen av intakte bindinger, og 1-p er
fraksjonen av spaltede bindinger. Antallsgjennomsnittet for polymeriseringsgraden (xn) er lik 1/(1-p). Siden Mn = Mox„, der Mo er monomerens ekvivalentvekt, som er 203 g/mol for N-acetyl-glukosamin når den opptrer i en kitosankjede og 161 g/mol for glukosamin i fri baseform når den opptrer i en kitosankjede. For en gitt Fa blir gjennomsnittlig M0 lik 203 FA + 161(1-FA).
Figur 4 viser SEC-MALLS kromatogram (4A) og differensiell (4B) og kumulativ (4C) distribusjon av molekylvekter for en kitosan som er depolymerisert med salpetersyrling for å oppnå forskjellig vektsgjennomsnittlige molekylvekter i området fra 41 500 til 13 400. Det vises tydelig at det fortsatt er en bred distribusjon av de beregnede molekylvektene. Disse dataene viser tydelig at kitosaner med forskjellige molekylvekter som er produsert fra høye molekylvekter med partiell nedbrytning, forblir polydisperse og inneholder kjeder med vidt forskjellige molekylvekter.
Molekylvektsfordelingen av en polymer kan modifiseres ved selektiv fjerning av visse deler av distribusjonen. Kitosan prøver med relativt korte kjeder kan fraksjoneres ved hjelp av gelfiltrering slik at det oppstår individuelle oligomerer eller fraksjoner med forholdsvis liten distribusjon av molekylvektene. Ett eksempel gis av Tømmeraas et al. (2001), som fikk rene kitosanoligomerer i området 2-10 monomerer per kjede.
Prøver med høyere molekylvekter kan også fraksjoneres ved hjelp av gelfiltrering som vist for kitosaner av Ottøy et al. (1996). Fraksjoner med Mw/M„-verdier på 1,2 - 1,5 ble oppnådd ved å fraksjonere en vanligvis polydispers prøve med Mw = 270 000 ved bruk av en gelfiltreringskolonne med Sepharose CL-4B og Sepharose CL-6B.
I en alternativ metode kan polydisperse kitosaner fraksjoneres ved dialyse eller membranteknikker, noe som gir mulighet for selektiv fjerning av de korteste kjedene, og hvor molekylvektsfordelings resultatet er avhengig av den opprinnelige molekylvektsfordelingen samt membran porøsitet og transport-koeffisienter i tillegg til driftsforholdene.
I forbindelse med den foreliggende oppfinnelsen ble det overraskende nok oppdaget at kitosaner som består av én enkelt kjedelengde eller kitosaner med smal molekylvektsfordeling, hadde forskjellige egenskaper som kompleksdannere ved genlevering enn andre prøver med sammenlignbar Mw eller Mn, men med større molekylvektsfordeling.
En annen ulempe ved mange kationer som brukes til komplekser med nukleinsyre, f.eks. PEI, polylysin og kitosan, er at de er masseproduserte kjemikalier med stor molekylvektsfordeling og følgelig temmelig udefinert (Godbey ef al., 1999). Det er godt kjent at slike kjemikalier kan vise variasjoner fra den ene serien til den andre. Fra et farmasøytisk synspunkt foretrekkes det derfor veldefinerte polykationer med smal molekylvektsfordeling.
Enda en ulempe med å bruke polykationer med bred molekylvektsfordeling til komplekser med nukleinsyrer og videre transfeksjon, er at kjeder med forskjellige lengder kan ha forskjellig effektivitet når det gjelder evnen til å danne komplekser og utføre transfeksjon.
Denne oppfinnelsen dreier seg om formuleringer som omfatter komplekser av: (a) kationiske kitosanoligomerer som er fremstilt fra kationisk polysakkaridkitosan der de nevnte kationiske oligomerene inneholder en vektfraksjon på mindre enn 20 % oligomerer med polymeriseringsgrad (DP)<10 i tillegg til en vektfraksjon på mindre enn 20 % med DP>50, og
(b) en nukleinsyre.
I forbindelse med den foreliggende oppfinnelsen er det uventet blitt oppdaget at formuleringer som omfatter veldefinerte kationiske kitosanoligomerer med en viss distribusjon av kjedelengder, og nukleinsyre er gunstige for å oppnå levering av nukleinsyre til celler av utvalgt vev for å oppnå ekspresjon in vivo av de ønskede molekylene som nukleinsyren er kodet for.
En annen hensikt med oppfinnelsen er å utvikle en fremgangsmåte for å fremstille formuleringen i henhold til oppfinnelsen som omfatter trinnene å: (a) eksponere den nevnte kationiske kitosanoligomeren for et vandig løsningsmiddel, (b) blande den vandige løsningen i trinn (a) med den nevnte nukleinsyren i et vandig løsningsmiddel, og (c) redusere volumet av produktløsningen i trinn (b) for å oppnå en ønsket konsentrasjon av den nevnte formulering.
Det beskrives en metode for å gi nukleinsyre til et pattedyr ved innføring av formuleringen ifølge denne oppfinnelsen i pattedyret.
Ytterligere et mål for oppfinnelsen er anvendelser av denne formuleringen ved fremstilling av et medikament til profylaktisk eller terapeutisk behandling av et pattedyr eller ved fremstilling av et diagnostisk middel til bruk i in vitro eller in vivo diagnostiske metoder.
Disse og andre mål for oppfinnelsen er beskrevet i versjonene av oppfinnelsen under.
Formuleringen ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan fremstilles fra kationisk polysakkaridkitosan ved bruk av kjemiske eller enzymatiske metoder.
En foretrukket formulering av oppfinnelsen er at de nevnte kationiske oligomerene helst skal inneholde en vektfraksjon på mindre enn 20 % av oligomerene med DP<12 i tillegg til en vektfraksjon på under 20 % med en DP>40 og helst en vektfraksjon på under 20 % oligomerer med DP<15 i tillegg til en vektfraksjon på under 20 % med en DP>30.
Formuleringer som omfatter komplekser mellom kationiske kitosanoligomerer med lav molekylvekt og nukleinsyre er beskrevet der de kationiske kitosanoligomerene har veldefinerte kjedelengder, smal distribusjon av kjede-lengdene og en veldefinert kjemisk sammensetning. Det typiske er at den kationiske kitosanoligomeren har en molekylvekt på mellom 500 og 10 000 Da, helst mellom 1200 og 5000 Da og aller helst mellom 3000 og 4700 Da. Det typiske er at den kationiske kitosanoligomeren har en fraksjon A-enheter (Fa) på 0-0,35 (65-100 % de-N-acetylerte enheter), helst mellom 0-0,1 (90-100 % de-N-acetylerte enheter) og aller helst mellom 0-0,01 (99-100 % de-N-acetylerte enheter). Den nevnte nukleinsyren omfatter en kodesekvens som vil uttrykke funksjonen sin når den nevnte nukleinsyren innføres i en vertscelle.
Ifølge en utførelse av oppfinnelsen er de nevnte oligomerene fremstilt fra kationiske polysakkarid kitosaner etterfulgt av fraksjonering av en mengde polydisperse oligomerer til oligomerer med veldefinerte kjedelengder, liten distribusjon av kjedelengder og en fraksjon A-enheter (Fa) på 0-0,35 (65-100 % de-N-acetylerte enheter), helst mellom 0-0,1 (90-100 % de-N-acetylerte enheter) og aller helst mellom 0-0,01 (99-100 % de-N-acetylerte enheter). Det typiske er at de nevnte oligomerene består av 6-50 monomerenheter, helst av 10-30 monomerenheter og aller helst av 15-25 monomerenheter med molekylvekt mellom 3000 og 4700 Da og en FA på under 0,01 (over 99 % de-A/-acetylerte enheter).
Ifølge en annen utførelse av oppfinnelsen velges den nevnte nukleinsyren fra gruppen som består av RNA- og DNA-molekyler. Disse RNA- og DNA-molekylene kan bestå av sirkelrunde molekyler, lineære molekyler eller en blanding av begge. Helst skal den nevnte nukleinsyren bestå av plasmid-DNA.
Ifølge en annen fortrukket utførelse av den foreliggende oppfinnelsen skal den nevnte nukleinsyren omfatte en kodende sekvens som vil uttrykke funksjonen sin når den nevnte nukleinsyren innføres i en vertscelle. Den kan foreksempel kode et biologisk aktivt produkt, f .eks. et protein, et polypeptid eller et peptid med terapeutiske, diagnostiske, immunogene eller antigene egenskaper
Denne oppfinnelsen tar også for seg formuleringer som beskrevet over, der den nevnte nukleinsyren omfatter en kodende sekvens som koder et protein, et enzym, et polypeptidantigen eller et polypeptidhormon, eller der den nevnte nukleinsyren omfatter en nukleotidsekvens som fungerer som et antisense-molekyl, f.eks. RNA.
Oppfinnelsens formulering skal helst ha en pH-verdi mellom 3,5 og 8.
Formuleringen av oppfinnelsen kan også bli derivatisert med målbærende ligander og/eller stabiliseringsmidler.
Et videre aspekt ved oppfinnelsen er relatert til dråpestørrelsen på den nevnte formuleringen etter forstøvning. Dråpestørrelsen til formuleringen av oppfinnelsen skal helst være lik dråpestørrelsen til nakent pDNA etter forstøvning.
Den foreliggende oppfinnelsen er også rettet inn mot en fremgangsmåte for å fremstille den foreliggende formuleringen. Den nevnte fremgangsmåten omfatter da trinnene: å fremstille den foreliggende kationiske kitosanoligomeren som beskrevet over, (a) å eksponere de nevnte kationiske kitosanoligomerene for en vandig løsning med en pH-verdi fra 3,5 til 8,0, (b) å blande den vandige løsningen fra trinn (a) med den nevnte nukleinsyren i en vandig løsning og (c) dehydrere produktløsningen fra trinn (b) for å oppnå en høy konsentrasjon av sammensetningen før den innføres in vivo. Trinn (c) kan nås ved (1) å fordampe væsken fra produktløsningen i trinn (b) for å få den ønskede konsentrasjonen eller (2) frysetørke produktløsningen i trinn (b) etterfulgt av rehydrering av det frysetørkede produktet for å oppnå den ønskede konsentrasjonen av formuleringen. Det typiske er at den nevnte nukleinsyre skal finnes i en konsentrasjon på 1 ng/ml-300 ug/ml, helst 1 ug/ml-100 ug/ml og aller helst 10-50 ug/ml i trinn (b) og 10 ng/ml-3000 ug/ml, helst 10 ug/ml-1000 ug/ml og aller helst 100-500 ug/ml i trinn (c) ved bruk av fordampningsmetoden (1).
Man bør være klar over at en fagperson kan lage den foreliggende formuleringen med forskjellige ladninger med aminer/fosfater og få negative, nøytrale eller positive ladninger. Den realiseringen som foretrekkes, er imidlertid den som har en formulering av oppfinnelsen med netto positiv ladning.
Denne oppfinnelsen er videre opptatt med å finne anvendelser av formuleringen for fremstilling av profylaktisk eller terapeutisk medikament for å tilføre en nukleinsyre til et pattedyr ved å introdusere formuleringen i dyret. Den nevnte formuleringen skal helst gis til pattedyret gjennom slimhinnene i lunger, nese, munn, kinn, under tungen, i rektum eller vagina. I henhold til en annen versjon gis den nevnte sammensetningen til pattedyret på parenteral måte, f.eks. intravenøst, i musklene, i huden, under huden eller i hjertet.
Den foreliggende oppfinnelsen er også opptatt med anvendelse av formuleringen ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et medikament til profylaktisk eller terapeutisk behandling av pattedyr eller til produksjon av et diagnostisk middel til bruk i in vivo eller in vitro diagnostiske metoder, og spesifikt til produksjon av et medikament til bruk i genterapi, antisense-terapi eller genetisk vaksinering til profylaktisk eller terapeutisk behandling av ondartede svulster, autoimmune sykdommer, arvelige sykdommer, patogene infeksjoner og andre patologiske sykdommer.
Andre mål, funksjoner og fordeler med den foreliggende oppfinnelsen vil fremgå av den følgende detaljerte beskrivelsen. Det bør imidlertid være klart at den detaljerte beskrivelsen og de spesifikke eksemplene nok angir ønskede utførelser av oppfinnelsen, men at de bare er ment som illustrasjoner av oppfinnelsen.
BESKRIVELSE AV TEGNINGENE
Figur 1 viser den kjemiske sammensetningen av kitosan, der et fragment av kitosankjeden inneholder en enhet av N-acetyl-p-D-glukosamin (A-enhet) og 3 enheter av p-D-glukosamin (D-enheter). Aminogruppen av D-enhetene kan være i protondannende eller ikke protondannende form avhengig av pH-verdi.
Figur 2a viser den kjemiske strukturen som oppstår etter depolymerisering av en kitosan ved hjelp av en syre eller en kitosanase. Syrer spalter glykosidbindingen etter en A-enhet (A-enhet av det nye reduserte stoffet). Enzymene varierer i spesifisitet ved hydrolyse av begge typer monomerer. Figur 2B viser depolymerisering av kitosan ved hjelp av salpetersyre, som bare angriper D-rester, som danner 2,5-anhydro-D-mannose. Figur 3 viser resultatene der en kommersiell kitosan med vektsgjennom-snittlig molekylvekt (Mw) på 180 000 ble analysert med SEC-MALLS. Kolonner: TSK G6000PWXL, 5000PWXL og 4000 PWXL (seriekoplet). Ekstraksjonsmiddel: 0,2 M ammoniumacetat, pH 4,5. Rl-detektor: Optomed DSP (Wyatt). Lysspredningsdetektor. DAWN DSP (Wyatt). Prosessparametere (Astra software v. 4.70.07): dn/dc = 0,142 ml/g (bestemt 'off line' (frakoplet) for kitosanacetat, verdien ble funnet å være uavhengig av Fa). A2: 5,0-10"3 molmlg"2. 3A: Elusjonsprofil, dvs. detektorsignalets brytningstall, som er proporsjonalt med konsentrasjonen av kitosan, kombinert med et plott av den beregnede molekylvekten, som i dette tilfellet ble uttrykt som kitosan i acetatsalt form som funksjon av elusjonsvolumet. 3B: Den kumulative molekylvektsfordelingen av molekylvekt beregnet fra dataene i 3A. Figur 4 viser SEC-MALLS-kromatogram (4A) samt differensiell (4B) og kumulativ (4C) molekylvektsfordelingen av en kitosan som er depolymerisert med salpetersyrling og gir forskjellig gjennomsnittlig molekylvekt mellom 41 500 og 13 400. Forsøksforholdene var de samme som i figur 3. Figur 5: Beregnet kumulativ (A) og differensiell (B) molekylvektsfordeling som tilsvarer Kuhns fordeling for kitosan som er depolymerisert og gir 100, 50,20 og 10 enheter (DPn). Figur 6: SEC-kromatogram av en fullt de-A/-acetylert kitosan (FA<0.001) som er depolymerisert med a) salpetersyrlig og redusert med NaBH4 (N1-N4) og b) kitosanase (E1-E4) (Superdex 30: to 2,5 x 100 cm kolonner i serie, elueringsmiddel: 0,15M ammoniumacetat, pH 4,5, gjennomstrømningsmengde 0,8 ml/min). DP=6 indikerer elueringsvolumet for en fullt de-N-acetylert kitosanheksamer. Figur 7: SEC-MALLS-kromatogram (7A) av en fullt de-A/-acetylert kitosan (Fa<0.001), som er depolymerisert med salpetersyrling og redusert med NaBH4 (ufraksjonert prøve) og fraksjonene N1-N4, som man fikk som beskrevet i figur 6. Forsøksforholdene var de samme som i figur 3 bortsett fra at det ble brukt én enkelt kolonne (TSK G3000 PWXL). Figur 7B viser den tilsvarende kumulative distribusjonen av molekylvekt beregnet fra dataene i 7A. Figur 8: SEC-MALLS-kromatogram (8A) av en kitosan, som er depolymerisert med en kitosanase (ufraksjoner prøve) og fraksjonene E1-E4, som man fikk som beskrevet i figur 6. Forsøksforholdene var de samme som i figur 3 bortsett fra at det ble brukt én enkelt kolonne (TSK G3000 PWXL). Figur 8B viser den tilsvarende kumulative distribusjonen av molekylvekt beregnet fra dataene i 8A. Figur 9 viser in vivo produksjon av lungeluciferase (pg/mg) 3 dager etter innføring av 25 ug pLuc i luftveiene hos mus (fire dyr per gruppe). Det ble laget komplekser mellom kitosanoligomerer og pLuc med et forhold mellom amin/fosfat på 60:1 (+/-). Den største luciferaseproduksjonen ble oppnådd med pLuc kompleksert med kitosanoligomeren NO med 18 som antalls gjennomsnittlig polymeriseringsgrad, bestemt ved <13>C-NMR-spektroskopi. Statistiske forskjeller mellom gjennomsnittsverdiene ble undersøkt med bruk av ANOVA. Forskjellene mellom gruppegjennomsnittene ble ansett som signifikant når P < 0,05. Figur 10 viser in vivo produksjon av lungeluciferase (pg/mg) 3 dager etter innføring av 25 ug pLuc i luftveiene hos mus (fire dyr per gruppe). Kitosanoligomeren NO med 18 som antalls gjennomsnittlig polymeriseringsgrad, ble fraksjonert i fire forskjellige prøver med veldefinert og smal distribusjon av polymeriseringsgrad. Det ble laget komplekser mellom kitosanoligomerer og pLuc med et forhold mellom amin/fosfat på 60:1 (+/-). Komplekser basert på fraksjonen som inneholdt oligomerer med kjedelengder på mellom 15 og 21 monomerenheter
(N3), viste betydelig (p<0,05) høyere genekspresjon enn komplekser basert på den ufraksjonerte prøven NO med 18 som antalls gjennomsnittlig polymeriseringsgrad. Statistiske forskjeller mellom gjennomsnittsverdiene ble undersøkt med bruk av ANOVA. Forskjellene mellom gruppegjennomsnittene ble ansett som signifikant når P < 0,05. Figur 11 viser resultatene av en retardasjonstest på agarosegel. Det ble laget komplekser mellom kitosanoligomerer og pLuc med et forhold mellom amin/fosfat på 60:1 (+/-). Med økende molekylvekt (polymeriseringsgraden) av kitosanoligomeren, ble det observert større stabilitet i de kompleksene som ble dannet. Ingen vandring ble detektert for pLuc kompleksert med den fraksjonen som inneholdt 36-50 monomerenheter (N1) til sammenligning med komplekser dannet med 15-21 monomerenheter (N3). Figur 12 viser genekspresjon av med luciferase in vitro etter inkubasjon av 293 celler med to serier med fraksjonerte kationiske kitosanoligomerer med lav molekylvekt (N1 og E1), som var laget med ni måneders mellomrom, og kommersielle kitosaner (Protasan UPG 210) bestilt med tre års mellomrom. Genekspresjonen varierte 10-dobbelt mellom de to seriene med Protasan UPG 210 som var kompleksert med pLuc med et forhold mellom amin/fosfat på 2,4:1 {+/-), men ikke signifikant mellom de to seriene med fraksjonerte kationiske kitosanoligomerer med lav molekylvekt (N1 og E1) kompleksert med pLuc med et med et forhold mellom amin/fosfat på 10:1 (+/-). Statistiske forskjeller mellom gjennomsnittsverdiene ble undersøkt med bruk av ANOVA. Forskjellene mellom gruppegjennomsnittene ble ansett som signifikant når P < 0,05. Figur 13 viser dråpestørrelsen (massens mediandiameter, MMD) etter aerosolering av komplekser som inneholder kationer med pLuc. Fraksjoner av kitosanoligomerer med 15-21 (N3) og 36-50 (N1) monomerenheter og en helt ren kitosan, Protasan UPG 210 (UPC), ble podet med pLuc i forhold mellom amin/- fosfat på henholdsvis 60:1 (+/-) og 3:1 (+/-). MMD var helt tydelig avhengig av sammensetningen. Den minste dråpestørrelsen fikk man med nakent pLuc og komplekser med 15-21 monomerenheter (N3) og pLuc. Statistiske forskjeller mellom gjennomsnittsverdiene ble undersøkt med bruk av ANOVA. Forskjellene mellom gruppegjennomsnittene ble ansett som signifikant når P < 0,05.
Med bruk av et kontrollprotein, luciferase, som modell for et terapeutisk protein i en in vivo lungemodell fant man at formuleringer med plasmid DNA og en spesiell sammensetning av kitosanoligomerer med veldefinert kjedelengde, distribusjon av kjedelengder og kjemisk sammensetning er gunstige for å levere nukleinsyre til celler i et utvalgt vev og for å få in vivo produksjon av de ønskede molekylene som nukleinsyrene er kodet for å gi.
Det ble funnet at en fraksjon av kitosanoligomer fremstilt fra kitosan med antalls gjennomsnittlig polymeriseringsgrad på 18 (DPn=18 bestemt ved <13>C-NMR-spektroskopi), som har relativ smal størrelsesfordeling sammenlignet med Kuhns fordeling og med over 99 % D-enheter (FA<0,01), dannet stabile komplekser (vist ved agarosegel-elektroforese) med pLuc med et forhold mellom amin/fosfat på 60:1 (+/-). Et vesentlig høyere in vivo genekspresjon av luciferase ble oppnådd med en polydispers DPn=18- prøve enn med monodisperse kitosanoligomerer med 6,10 og 12 monomerenheter som dannet ustabile komplekser med pLuc med et forhold mellom amin/fosfat på 60:1 (+/-). Det faktum at stabile komplekser resulterte i en større genekspresjon enn ustabile komplekser stemmer med tidligere artikler (Fischer et al., 1999, Gebhart og Kabanov, 2001, Koping-Hoggard et al., 2001). Men det ble lavere produksjon av luciferase med stabile komplekser som ble dannet med kitosanoligomerer med større gjennomsnittlige molekylstørrelser enn for DPn18-prøven. Fraksjonen DP„18 ble ytterligere fraksjonert i fraksjoner med mindre distribusjon, dvs. 10-14 monomerenheter (N4), 15-21 monomerenheter (N3), 22-35 monomerenheter (N2) og 36-50 monomerenheter (N1). Komplekser mellom fraksjoner med 15-21 monomerenheter og pLuc resulterte uventet nok i den største in vivo genekspresjonen i lungene selv om det ble dannet ustabile sammensetninger med et forhold mellom amin/fosfat på 60:1 (+/-). Fraksjonen 10-14 monomerenheter dannet også ustabile sammensetninger med pLuc og resulterte kun i beskjeden produksjon av luciferase.
Dessuten resulterte aerosolering av kompleksene mellom fraksjoner med 15-21 monomerenheter og pLuc i sammenlignbare dråpestørrelser i form av en aerosolert løsning av nakent pLuc. Derimot bandt aerosolerte fraksjoner med 36-50 monomerenheter seg til pLuc og UPC (ca. 1000-mer) kompleksert med pLuc og gav henholdsvis 2 og 3 ganger større dråpestørrelse. Denne formulerings-avhengige virkningen på dråpestørrelsen kan forklares med økt viskositet av løsningen når polykationets molekylvekt øker, slik at det dannes større dråper.
EKSEMPLER
Eksempel 1. Fremstilling av kitosaner med lav molekylvekt
Kitosanet Protasan UP G 210 (Fa=0,17, gjennomsnittlig molekylvekt på 162 000) er fra Pronova Biomedical AS, Oslo, Norge. Oligomeren av N-glukosamin med lav molekylvekt ble fremstilt ved kjemisk depolymerisering av kitosan med bruk av NaN02 og videre reduksjon ved hjelp av NaBH4 som beskrevet av Tømmeraas et al., 2001, der molekylvekten ble styrt av mengden NaN02 i forhold til mengden av kitosan. Fraksjonen av acetylerte enheter ble kontrollert av heterogen deacetylering for å få Fa med mindre enn 0,001 som bestemt ved proton-NMR-spektroskopi som tidligere beskrevet (Vårum et al., 1991). Det typiske var at 1,0 gram kitosan ble oppløst i 100 ml med 2,5 % vannholdig eddiksyre, oppløst oksygen ble fjernet ved å sende nitrogengass gjennom løsningen i 5 minutter, og 5 ml med en helt fersk løsning av NaN02 i destillert vann (10 mg/ml) ble tilført. Reaksjonen pågikk i 4 timer i mørke, og deretter ble den depolymeriserte kitosanen redusert ved tilsetning av 3 grams med NaBH4 og henstand i mørke over natt. pH-verdien ble justert til 4,5 med eddiksyre. Løsningen ble dialysert (Medicells dialyserør, MWCO 12000-14000) tre ganger med 0,2M NaCI og seks ganger med destillert vann og og frysetørket for å få oligomer med lav molekylvekt som hydrokloridsalt. Oligomerene med lav vekt ble også fremstilt ved hjelp av enzymatsk depolymerisering med bruk av kitosanase fra Streptomyceus griseus (Sigma C 9830 og Sigma C 0794), der molekylvekten styres av mengden av enzymer i forhold mengden av kitosan og inkubasjonstiden. 0.5 gram med kitosan ble oppløst i en konsentrasjon på 20 mg/ml i 0,1 M natrium-acetat/eddiksyre (pH 5,5), og 0,65 enheter med kitosanase (Sigma C 0794) ble tilsatt kitosanløsningen, som så stod i 18 timer ved 37 °C. Enzymreaksjonen ble stoppet ved å redusere pH-verdien til 2 påfulgt av koking i 5 minutter. Den depolymeriserte kitosanen ble dialysert og frysetørket som beskrevet over for å få et lav molekylært, enzym nedbrutt kitosan på hydrokloridsalt form.
Eksempel 2. Produksjon og karakterisering av fraksjonerte prøver
Kitosanene med lav molekylvekt som ble fremstilt slik det er beskrevet i eksempel 1, ble fraksjonert ved hjelp av SEC i to seriekoplede kolonner på 2,5 x 100 cm som beskrevet tidligere (Tømmeraas et al., 2001). Fraksjoner på 4 mL ble samlet og sammenstilt i henhold til kromatogrammene i figur 6 (a og b). Fire fraksjoner med forskjellig molekylvekt ble fremstilt:
N1 (spaltet ved hjelp av salpetersyrling) eller E1 (spaltet ved hjelp av kitosanase) N2 (spaltet ved hjelp av salpetersyrling) eller E2 (spaltet ved hjelp av kitosanase) N3 (spaltet ved hjelp av salpetersyrling) eller E3 (spaltet ved hjelp av kitosanase) N4 (spaltet ved hjelp av salpetersyrling) eller E4 (spaltet ved hjelp av kitosanase)
Eksempel 3. Formulering og in vivo uttrykk for gener i lunger
En polydispers fraksjon av kationisk kitosanoligomer med en polymeriseringsgrad (DP) mellom 6 og 50 (antalls gjennomsnittlig DP på 18 bestemt fra de ikke-reduserende endene i <13>C-nmr-spekteret, NO) og veldefinerte kationiske oligomerer med DP på 6,10,12,10-14 (N4), 15-21 (N3), 22-35 (N2), 36-50 (N1) ble fremstilt av kitosan i henhold til de metodene som er beskrevet i eksempel 1 og eksempel 2. Ildflueluciferase plasmid DNA (pLuc) ble kjøpt fra Aldevron, Fargo, ND, USA. Stamløsninger av egne kationiske kitosanoligomerer (2 mg/ml) ble fremstilt i sterilt destillert deionisert vann, pH 6,2 ± 0,1 fulgt av steril filtrering. Komplekser mellom kationiske kitosanoligomerer og pLuc ble formulert i et forhold på 60:1 (+/-) ved tilsetting av kationiske oligomerer og deretter pLuc i sterilt vann under intens omrøring i en vortex mikser (Heidolph REAX 2000, KEBO Lab, Spånga, Sverige). Etter 15 minutter ble kompleksene kondensert ved hjelp av mild fordampning i vakuum i en SpeedVac Plus-sentrifuge (Savant Instruments, Holbrook, NY) i ca. 90 minutter for å få pLuc-konsentrasjoner på omtrent 250 ug/ml) (Koping-Hoggard et al., 2001). Dessuten ble pLuc formulert med PEI 25 kDa (Aldrich Sweden, Stockholm, Sverige) og en ultraren kitosan, Protasan UPG 210 (Pronova Biopolymer, Oslo, Norge) under optimale forhold, forhold på henholdsvis 5:1(+/-) og 3:1 (+/-) (Bragonzi et al., 2000, Koping-Hoggard et al., 2001).
Mus (hann Balb/c, 6-8 uker gamle, 4 dyr per gruppe, Charles River, Uppsala, Sverige) ble bedøvet med ketamin/xylazin (5/20 volumprosent, 0,1 ml/10 g kroppsvekt), og luftrøret ble blottlagt med et 0,5 cm langt snitt i nakken. 100 pl av de kompleksene som er beskrevet over, ble langsomt ført dråpevis inn i luftrøret, og musene ble sydd igjen. 72 timer etter innføring ble dyrene drept med karbondioksid, og lungene ble fjernet på kirurgisk måte, skylt i PBS, og det ble tilført 0,3 ml iskald luciferaselysebuffer (Promega, Madison, Wl) med en blanding av proteaseinhibitor (Complete, Boehringer Mannheim Scandinavia AB, Bromma, Sverige). Vevsprøvene ble raskt frosset ned i flytende nitrogen og lagret ved -80 °C til de skulle analyseres.
Vevsprøvene ble homogenisert ved hjelp av en morter i et kaldt rom (Biospec Products, Inc., OK) og deretter sentrifugert (Centrrfuge 5403, Eppendorf-Nethelar-Hinze GmbH, Hamburg, Tyskland) ved 4 °C og 15 000 rpm (omdreininger pr. min) i 10 min. En mengde på 50 pl av det klare skummet fra hvert reagensrør ble blandet med 50 pl av luciferase som reaksjonsmiddel (Promega) og analysert med et luminometer (Mediators PhL, Wien, Østerrike) med en integrasjonstid på 8 sekunder. For å kvantifisere luciferaseekspresjonen ble det laget en standardkurve av luciferase (Sigma, St. Louise, MO) ved tilsetning av definerte mengder av luciferasestandarden til skummet på homogenisert vev fra ubehandlede dyr i en kontrollgruppe. Det samlede proteininnholdet i hver prøve ble analysert ved BCA-analyse (Pierce, Rockford, IL) og kvantifisert med BSA (bovine serum albumin) som referanseprotein. Absorpsjonsevnen ble målt ved 540 nm på en mikroplateleser (Multiscan MCC/340, Labsystems Oy, Helsinki, Finland).
Resultatene av genenes transfeksjonseffektivitet i muselunger 72 timer etter innføring av pLuc kompleksert med kationiske kitosanoligomerer med forskjellige
grader av polymerisering (molekylvekt) vises i figur 9. Overraskende nok ble det
vesentlig høyeste luciferaseuttrykket oppnådd med pLuc kompleksert med en kitosanoligomer NO med 18 som antalls gjennomsnittlig polymeriseringsgrad.
Resultatene av genenes transfeksjonseffektivitet i muselunger 72 timer etter innføring av pLuc komplekset med kationiske kitosanoligomerer med forskjellige
grader av polymerisering (molekylvekt) vises i figur 10. Kitosanoligomeren NO med 18 som antalls gjennomsnittlig polymeriseringsgrad ble fraksjonert, som beskrevet i eksempel 2, i fire prøver med veldefinert og liten distribusjon av polymeriseringsgrad. Det var overraskende å se at fraksjonen med kitosanoligomerer med kjedelengder på mellom 15 og 21 monomerenheter (N3) viste større genekspresjon enn for PEI og betydelig større genekspresjon sammenlignet med den ufraksjonerte prøven NO med 18 som antalls gjennomsnittlig polymeriseringsgrad.
Resultatene av retardasjonstesten på agarosegel vises i figur 11. Når molekylvekten (graden av polymerisering) på kitosanoligomeren øker, økes også stabiliteten til de kompleksene som dannes. Ingen vandring ble detektert for pLuc kompleksert med den fraksjonen som inneholdt 22-35 (N2) og 36-50 monomerenheter (N1) til sammenligning med komplekser dannet med 10-14 (N4) og 15-21 monomerenheter (N3). Den ufraksjonerte prøven NO med 18 som antalls gjennomsnittlig polymeriseringsgrad dannet også stabile sammensetninger med pDNA. Et betydeligere in vivo genekspresjon (figur 10) ble overraskende nok oppnådd med de mindre stabile sammensetningene 15-21 (N3) enn for de stabile sammensetningene dannet med DPn18 (NO).
Eksempel 4. In vitro uttrykk for gener
To forskjellige serier med fraksjonerte kitosanoligomerer med lav molekylvekt: N1 og E1, som beskrevet i eksempel 2 og laget med 9 måneders mellomrom og kommersiell kitosan (Protasan UPG 210, serie 1: tilsynelatende viskositet på 70 mPas, serie 2: tilsynelatende viskositet på 146 mPas) bestilt med 3 års mellomrom ble sammensatt med pLuc, henholdsvis med et forhold på 10:1 (+/-) og 2,4:1 (+/-), som beskrevet i eksempel 2. Det ble brukt stabile pDNA-sammensetninger. 24 timer før transfeksjon ble epitelvevet i en cellekultur fra en nyre til et menneske-foster 293 (ATCC, Rockville, MD, USA) seedet med 70 % konfluks i dyrkningsbrett med 96 brønner (Costar, Cambridge, Storbritannia). Før transfeksjon ble cellene skylt, og deretter ble 50 pl (som tilsvarer 0,33 ug pLuc) av de polyplekse formuleringene tilsatt per brønn. Etter en inkubasjon på 5 timer ble formuleringene fjernet, og 0,2 ml nytt dyrkningsmedium ble tilsatt. Mediet ble skiftet annenhver dag for eksperimentering i overkant av to dager. Etter 96 timer og 144 timer ble cellene skylt med PBS (pH 7,4), åpnet (Promega), og luciferase genekspresjonen ble målt med et luminometer (Mediators PhL). Mengden av produsert luciferase ble fastsatt ved hjelp av en standardkurve laget av ildflueluciferase (Sigma), og det totale celleproteinet ble fastsatt med bruk av 'bichinchoninic'syretest (Pierce).
Resultatene av genekspresjon med luciferase in vitro etter inkubasjon av 293 celler med to serier med fraksjonerte kationiske kitosanoligomerer med lav molekylvekt, N1 og E1, og kommersiell kitosanholdig Protasan UPG 210 vises i figur 12. Ekspresjonen for gener varierte 10-dobbelt mellom de to seriene med Protasan UPG 210, men ikke vesentlig mellom de to seriene med de fraksjonerte kationiske kitosanoligomerer med lav molekylvekt, N1 og E1.
Eksempel 5. Dråpestørrelse etter aerosolering
Komplekser mellom kationiske kitosanoligomerer og pLuc ble laget som beskrevet i eksempel 3 for å få konsentrasjoner av pLuc på 500 pg/ml. Som kontroll ble det brukt en ultrarent kitosan (UPC, polymeriseringsgrad på ca. 1000) kompleksert med pLuc ved optimale forhold, forhold på 3:1 (+/-) (Koping-Hoggard et al., 2001). Aerosoler med komplekser mellom kationiske kitosanoligomerer og pLuc ble fremstilt ved hjelp av et forstøvningskateter (Trudell Medical International, London Ontario, Canada) med væske- og gasskanaler (luftkanaler). Først ble 100 ul av den sammensatte løsningen matet inn i en væskebeholder forbundet med forstøvningskateteret (væskeinnløp). For å oppnå aerosoler ble det deretter brukt pulser med trykkluft (3,5 bar) i korte perioder over væskebeholderen (20 ms) og gasskanalene til forstøvningskateteret (50 ms). Dråpestørrelsen på aerosolene som ble produsert, ble målt med en Mastersizer X (Malvern Instruments Ltd., Malvern, Storbritannia).
Størrelsen på væskedråpene (massens mediandiameter, MMD) etter aerosolisering av sammensetningene med kationer kompleksert med pLuc, vises i figur 13. MMD var helt tydelig avhengig av sammensetningen. De minste dråpestørrelsene fikk man med "nakent" pLuc og formuleringen med 15-21 monomerenheter (N3) kompleksert med pLuc.
KILDER
Artursson P, LindmarkT, Davis SS and lllum L (1994) Effect of chitosan on the permeability of monolayers of intestinal epithelial cells (Caco-2). Pharm Res 11:1358-1361.
Boussif O, Lezoualch F, Zanta MA, Mergny MD, Scherman D, Demeneix B and Behr JP (1995) A versatile vector for gene and oligo nucleotide transfer into cells in culture and in vivo: Polyetylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 92:7297-7301.
Bragonzi A, Dina G, Villa A, Calori G, Biffi A, Bordignon C, Assael BM and Conese M (2000) Biodistribution and transgene expression with non-viral cationic vector/DNA complexes in the lungs. Gene Ther 7:1753-1760.
Deshpande D, Blezinger P, Pillai R, Duguid J, Freimark B and Rolland A (1998) Target specific optimization of cationic lipid-based systems for pulmonary gene therapy. Pharm Res 15:1340-1347.
Felgner JH, Kumar R, Sridhar CN, Wheeler CJ, Tsai YJ, Border R, Ramsey P, Martin M and Felgner PL (1994) Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations. Journal ofBiological Chemistry 269:2550-2561.
Ferrari S, Moro E, Pettenazzo A, Behr J, Zacchello F and Scarpa M (1997) ExGen 500 is an efficient vector for gene delivery to lung epithelial cells in vitro and in vivo. Gene Therapy 4:1100-1106.
Fischer D, Bieber T, Li Y, Elsasser HP and Kissel T (1999) A novel non-viral vector for DNA delivery based on low molecular weight, branched polyethylenimine: effect of molecular weight on transfection efficiency and cytotoxicity. Pharm Res 16:1273-1279.
Florea B, Thanou, M., Geldof, M., Meaney, C, Junginger, H. E. and Borchard, G.
(2001) Modified chitosan oligosaccharides and polyethylenimine as transfection agents for gene therapy in cystic fibrosis. Journal
Gautam A, Densmore CL, Golunski E, Xu B and Waldrep JC (2001) Transgene expression in mouse airway epithelium by aerosol gene therapy with PEI-DNA complexes. Mol Ther 3:551-556.
Gautam A, Densmore CL, Xu B and Waldrep JC (2000) Enhanced gene expression in mouse lung after PEI-DNA aerosol delivery. Mol Ther 2:63-70. Gebhart CL and Kabanov AV (2001) Evaluation of polyplexes as gene transfer agents. J Control Release 73:401-416.
Godbey WT, Wu KK and Mikos AG (1999) Size matters: Molecular weight affects the efficiency of poly(ethylenimine) as a gene delivery vehicle. J Biomed Mater Res 45:268-275.
Godbey WT, Wu KK and Mikos AG (2001) Poly(ethylenimine)-mediated gene delivery affects endothelial cell function and viability. Biomaterials 22:471-480. Griesenbach U, Chonn A, Cassady R, Hannam V, Ackerley C, Post M, Tanswell AK, Olek K, 0'Brodovich H and Tsui LC (1998) Comparison between intra tracheal and intravenous administration of liposome-DNA complexes for cystic fibrosis lung gene therapy. Gene Ther 5:181 -188.
Hudde T, Rayner SA, Corner RM, Weber M, Isaacs JD, Waldmann H, Larkin DF and George AJ (1999) Activated polyamidoamine dendrimers, a non-viral vector for gene transfer to the corneal endothelium. Gene Ther 6:939-943.
Illum L (1998) Chitosan and its use as a pharmaceutical excipient. Pharm Res 15:1326-1331.
Koping-Hoggard M, Melnikova, Y., Vårum K. M., Lindman, B. and Artursson, P.
(2001) Chitosan polyplexes as a gene delivery system. Characterization of structure-activity relationships from supramolecular shape. Unpublished Koping-Hoggard M, Tubulekas I, Guan H, Edwards K, Nilsson M, Vårum KM and Artursson P (2001) Chitosan as a non-viral gene delivery system. Structure-property relationships and characteristics compared with polyethylenimine in vitro and after lung administration in vivo. Gene Ther 8:1108-1121. Ledley FD (1996) Pharmaceutical approach to somatic gene therapy. Phanm Res 13:1595-1614. Li S and Huang L (1997) In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther 4:891-900. Li S, Tan Y, Viroonchatapan E, Ritt BR and Huang L (2000) Targeted gene delivery to pulmonary endothelium by anti-PECAM antibody. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 278:L504-511. Luo D and Saltzman WM (2000) Synthetic DNA delivery systems. Nat Biotechnol 18:33-37. MacLaughlin FC, Mumper RJ, Wang J, Tagliaferri JM, Gill I, Hinchcliffe M and Rolland AP (1998) Chitosan and depolymerized chitosan oligomers as condensing carriers for in vivo plasmid delivery [In Process Citation]. J Controlled Release 56:259-272. Mumper RJ, Duguid JG, Anwer K, Barron MK, Nitta H and Rolland AP (1996) Polyvinyl derivatives as novel interactive polymere for controlled gene delivery to muscle. Pharm Res 13:701-709.
Mumper RJ, Wang J, Klakamp SL, Nitta H, Anwer K, Tagliaferri F and Rolland AP
(1998) Protective interactive noncondensing (PINC) polymers for enhanced plasmid distribution and expression in rat skeletal muscle. J Control Release 52:191-203. Ottøy MH, Vårum KM, Christensen BE, Anthonsen MW & Smidsrød O (1996) Preparative and analytical size-exclusion chromatography of chitosans. Carbohydr. Polym. 31:253-261. Plank C, Tang MX, Wolfe AR and Szoka FC, Jr. (1999) Branched cationic peptides for gene delivery: role of type and number of cationic residues in formation and in vitro activity of DNA polyplexes [published erratum appears in Hum Gene Ther 1999 Sep 1;10(13):2272]. Hum Gene Ther 10:319-332. Putnam D, Gentry CA, Pack DW and Langer R (2001) Polymer-based gene delivery with low cytotoxicity by a unique balance of side-chain termini. Proe Nati Acad Sei USA 98:1200-1205.
Roberts, G.A.F., "Chitin Chemistry" (1992), Macmillan, London, page 6-7.
Roy K, Mao HQ, Huang SK and Leong KW (1999) Oral gene delivery with chitosan-DNA nanoparticles generates immunologic protection in a murine model of peanut allergy. Nat Med 4:387-391.
Saeki Y, Matsumoto N, Nakano Y, Mori M, Awai K and Kaneda Y (1997) Development and characterization of cationic liposomes conjugated with HVJ (Sendai virus): reciprocal effect of cationic lipid for in vitro and in vivo gene transfer. Hum Gene Ther 8:2133-2141.
Sato T, Ishii T and Okahata Y (2001) In vitro gene delivery mediated by chitosan. effect of pH, serum, and molecular mass of chitosan on the transfection efficiency. Biomaterials 22:2075-2080.
Song YK, Liu F, Chu S and Liu D (1997) Characterization of cationic liposome-mediated gene transfer in vivo by intravenous administration. Hum Gene Ther 8:1585-1594.
C. Tanford (1961) Physical chemistry of macromolecules, John Wiley and Sons, New York, Section 8b and 33a)
Tømmeraas K, Vårum KM, Christensen BE and Smidsrød O (2001) Preparation and characterisation of oligosaccharides produced by nitrous acid depolymerisation of chitosans. Carbohydr Res 333:137-144.
Vårum KM, Anthonsen MW, Grasdalen H and Smidsrød 0 (1991) Determination of the degree of N-acetylation and the distribution of N-acetyl groups in partially N-deacetylated chitins (chitosans) by high-field n.m.r. spectroscopy. Carbohydr Res 211:17-23.
Vårum, KM, Ottøy, MH and Smidsrød, 0 (2001) Acid hydrolysis of chitosans. Carbohydr. Polym. 46: 89-98.
Wolff JA, Malone RW, Williams P, Chong W, Acsadi G, Jani A and Felgner PL
(1990) Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science 247:1465-1468.
Claims (17)
1. Formulering, karakterisert ved at den omfatter komplekser av: (a) kationiske kitosanoligomerer fremstilt fra kationisk polysakkaridkitosan der de nevnte kationiske oligomerene inneholder en vektfraksjon på mindre enn 20 % oligomerer med en polymeriseringsgrad (DP)<10 i tillegg til en vektfraksjon på mindre enn 20 % med DP>50, og (b) en nukleinsyre.
2. Formulering i henhold til krav 1, karakterisert ved at de nevnte kationiske kitosanoligomerene oppnås fra kitosan ved anvendelse av kjemiske eller enzymatiske metoder.
3. Formulering i henhold til kravene 1 og 2, karakterisert ved at de nevnte kationiske oligomerene fortrinnsvis inneholder en vektfraksjon på mindre enn 20 % oligomerer med DP<12 i tillegg til en vektfraksjon på mindre enn 20 % med en DP>40 og aller helst en vektfraksjon på mindre enn 20 % oligomerer med DP<15 i tillegg til en vektfraksjon på mindre enn 20 % med en DP>30.
4. Formulering i henhold til kravene 1-3, karakterisert ved at fraksjonen av N-acetylerte enheter (Fa) av de nevnte kitosanoligomerene er mindre enn 0,60, fortrinnsvis mindre enn 0,35, helst mindre enn 0,1 og aller helst mindre enn 0,01.
5. Formulering i henhold til kravene 1-4, karakterisert ved at nevnte formulering i det vesentlige har en netto positiv ladning.
6. Formulering i henhold til krav 1, karakterisert ved at de nevnte kitosanoligomerene er derivatisert med målbærende ligander og stabiliseringsmidler.
7. Formulering i henhold til krav 1, karakterisert ved at de nevnte formuleringene omfatter en kodende sekvens som vil uttrykke funksjonen sin når den nevnte nukleinsyren innføres i en vertscelle.
8. Formulering i henhold til krav 7, karakterisert ved at nevnte nukleinsyre velges fra gruppen som består av DNA- og RNA-molekyler.
9. Formulering i henhold til krav 8, karakterisert ved at nevnte sammensetning har en pH mellom 3,5 og 8.
10. Formulering i henhold til krav 9, karakterisert ved at nevnte formulering etter aerosolisering i det vesentlige har en sammenlignbar dråpestørrelse med en formulering som består av bare nukleinsyre ved like konsentrasjoner av nukleinsyre.
11. Fremgangsmåte for å fremstille formuleringen i henhold til kravene 1-10, karakterisert ved at den omfatter trinnene å: (a) eksponere den nevnte kationiske kitosanoligomeren for et vandig løsningsmiddel, (b) blande den vandige løsningen i trinn (a) med den nevnte nukleinsyren i et vandig løsningsmiddel, og (c) redusere volumet av produktløsningen i trinn (b) for å oppnå en ønsket konsentrasjon av den nevnte formulering.
12. Anvendelse av formuleringen i henhold til kravene 1 -10, for fremstilling av et profylaktisk eller terapeutisk medikament for å tilføre en nukleinsyre til et pattedyr ved å introdusere formuleringen i pattedyret.
13. Anvendelse i henhold til krav 12, der formuleringen skal føres inn i pattedyret via administrasjon til slimhinnevevet i lunger, nese, munn, kinn, under tungen, i rektum eller vagina.
14. Anvendelse i henhold til krav 12, der formuleringen skal føres inn i pattedyret ved administrering til underslimhinnevevet på parenteral måte, det vil si intravenøst, intramuskulært, i huden, under huden eller i hjertet, eller inn i de indre organer, blodkar eller andre kroppsoverflater eller hulrom som blottlegges i forbindelse med kirurgisk behandling.
15. Anvendelse i henhold til krav 12 som omfatter formuleringen i henhold til hvilket som helst av kravene 1-10, der den nevnte nukleinsyren er i stand til å uttrykke funksjonen sin inne i den nevnte cellen.
16. Anvendelse av formuleringen i henhold til hvilke som helst av kravene 1-10, for fremstilling av et medikament til profylaktisk eller terapeutisk behandling av et pattedyr, eller ved fremstilling av et diagnostisk middel til bruk ved in vivo eller in v/fro-diagnostiske metoder.
17. Anvendelse av formuleringen i henhold til krav 16, for fremstilling av et medikament til anvendelse i genterapi, antisense-terapi eller genetisk vaksinering for profylaktisk eller terapeutisk behandling av ondartede svulster, autoimmune sykdommer, arvelige sykdommer, patogene infeksjoner og andre patologiske sykdommer.
Priority Applications (9)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
NO20022148A NO317653B1 (no) | 2002-05-03 | 2002-05-03 | Formulering som omfatter komplekser av kitosanoligomerer og nukleinsyre, fremgangsmate for a fremstille formuleringen samt anvendelser derav. |
JP2004500922A JP4658592B2 (ja) | 2002-05-03 | 2003-05-02 | 非ウイルス性遺伝子送達システム |
EP03725897A EP1501550A1 (en) | 2002-05-03 | 2003-05-02 | Non-viral gene delivery system |
CA2486678A CA2486678C (en) | 2002-05-03 | 2003-05-02 | Non-viral gene delivery system |
US10/513,429 US20050170355A1 (en) | 2002-05-03 | 2003-05-02 | Non-viral gene delivery system |
CNB038123452A CN100391543C (zh) | 2002-05-03 | 2003-05-02 | 非病毒类基因送递系统 |
PCT/NO2003/000143 WO2003092739A1 (en) | 2002-05-03 | 2003-05-02 | Non-viral gene delivery system |
AU2003228156A AU2003228156B2 (en) | 2002-05-03 | 2003-05-02 | Non-viral gene delivery system |
US11/809,816 US7767456B2 (en) | 2002-05-03 | 2007-06-01 | Non-viral gene delivery system |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
NO20022148A NO317653B1 (no) | 2002-05-03 | 2002-05-03 | Formulering som omfatter komplekser av kitosanoligomerer og nukleinsyre, fremgangsmate for a fremstille formuleringen samt anvendelser derav. |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO20022148D0 NO20022148D0 (no) | 2002-05-03 |
NO20022148L NO20022148L (no) | 2003-11-04 |
NO317653B1 true NO317653B1 (no) | 2004-11-29 |
Family
ID=19913595
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20022148A NO317653B1 (no) | 2002-05-03 | 2002-05-03 | Formulering som omfatter komplekser av kitosanoligomerer og nukleinsyre, fremgangsmate for a fremstille formuleringen samt anvendelser derav. |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20050170355A1 (no) |
EP (1) | EP1501550A1 (no) |
JP (1) | JP4658592B2 (no) |
CN (1) | CN100391543C (no) |
AU (1) | AU2003228156B2 (no) |
CA (1) | CA2486678C (no) |
NO (1) | NO317653B1 (no) |
WO (1) | WO2003092739A1 (no) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100613734B1 (ko) * | 2004-09-07 | 2006-08-22 | 굿젠 주식회사 | 키토산을 이용한 dna 보관방법 및 분석방법 및 이를이용한 dna 제품 |
EP1948810A4 (en) * | 2005-11-04 | 2010-06-30 | Biosyntech Canada Inc | COMPOSITION AND METHOD USING CHITOSAN FOR THE EFFICIENT ADMINISTRATION OF NUCLEIC ACIDS TO CELLS |
WO2007111333A1 (ja) * | 2006-03-29 | 2007-10-04 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | 核酸導入時の細胞障害を低減する方法 |
EP2034954B1 (en) | 2006-03-30 | 2019-02-20 | Engene, Inc. | Non-viral compositions and methods for transfecting gut cells in vivo |
US20100015232A1 (en) | 2006-07-07 | 2010-01-21 | Aarhus Universitet | Nanoparticles for nucleic acid delivery |
BRPI0716925A2 (pt) * | 2006-09-15 | 2013-09-17 | Fmc Biopolymer As | composiÇço, mÉtodos para preparar a composiÇço, para administrar Ácido nucleico a um mamÍfero, e para usar a composiÇço, e, uso da composiÇço |
PL2195035T3 (pl) * | 2007-09-28 | 2018-07-31 | Engene, Inc. | Kompozycje polipleksów chitozan-kwas nukleinowy o wysokim stężeniu |
CN102154352B (zh) * | 2010-12-30 | 2012-11-07 | 江苏大学 | 阳离子化多糖纳米粒基因传递系统及其制法 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3198782B2 (ja) | 1994-03-17 | 2001-08-13 | 日立電線株式会社 | 送電線の故障区間標定方法及び電力設備の故障機器標定方法 |
US6316007B1 (en) * | 1995-04-04 | 2001-11-13 | Wound Healing Of Oklahoma | Combined physical and immunotherapy for cancer |
US6184037B1 (en) * | 1996-05-17 | 2001-02-06 | Genemedicine, Inc. | Chitosan related compositions and methods for delivery of nucleic acids and oligonucleotides into a cell |
JP2000514440A (ja) * | 1996-07-09 | 2000-10-31 | ザ ジョーンズ ホプキンス ユニバーシティー | 遺伝子輸送システム |
AU726518C (en) | 1996-07-10 | 2002-01-03 | West Pharmaceutical Services Drug Delivery & Clinical Research Centre Limited | Compositions suitable for delivery of genes to epithelial cells |
FR2754824B1 (fr) * | 1996-10-23 | 1999-03-05 | Transgene Sa | Nouvelle composition contenant du chitosan |
JP2002509116A (ja) | 1998-01-16 | 2002-03-26 | ザ・ジョーンズ・ホプキンス・ユニバーシティ | 核酸およびサイトカインの単一溶媒での同時輸送による遺伝子免疫 |
-
2002
- 2002-05-03 NO NO20022148A patent/NO317653B1/no not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-05-02 AU AU2003228156A patent/AU2003228156B2/en not_active Ceased
- 2003-05-02 US US10/513,429 patent/US20050170355A1/en not_active Abandoned
- 2003-05-02 CN CNB038123452A patent/CN100391543C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2003-05-02 WO PCT/NO2003/000143 patent/WO2003092739A1/en active Search and Examination
- 2003-05-02 EP EP03725897A patent/EP1501550A1/en not_active Ceased
- 2003-05-02 CA CA2486678A patent/CA2486678C/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-05-02 JP JP2004500922A patent/JP4658592B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-06-01 US US11/809,816 patent/US7767456B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NO20022148D0 (no) | 2002-05-03 |
JP2005533016A (ja) | 2005-11-04 |
WO2003092739A1 (en) | 2003-11-13 |
CA2486678C (en) | 2011-08-02 |
US7767456B2 (en) | 2010-08-03 |
CN1655825A (zh) | 2005-08-17 |
EP1501550A1 (en) | 2005-02-02 |
US20050170355A1 (en) | 2005-08-04 |
CN100391543C (zh) | 2008-06-04 |
NO20022148L (no) | 2003-11-04 |
AU2003228156B2 (en) | 2008-07-03 |
CA2486678A1 (en) | 2003-11-13 |
JP4658592B2 (ja) | 2011-03-23 |
US20070298048A1 (en) | 2007-12-27 |
AU2003228156A1 (en) | 2003-11-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10729786B2 (en) | Mucus penetrating gene carriers | |
US20080085242A1 (en) | Non-viral gene delivery system | |
US7767456B2 (en) | Non-viral gene delivery system | |
Kim et al. | Chemical modification of chitosan as a gene carrier in vitro and in vivo | |
US8492142B2 (en) | Freeze-dried product for introducing nucleic acid, oligonucleic acid or derivative thereof | |
Sharma et al. | Chitosan-based systems for gene delivery | |
Mumper et al. | Polymeric gene delivery systems for in vivo gene therapy | |
Issa | Linear and Branched Chitosan Oligomers as Delivery Systems for pDNA and siRNA in vitro and in vivo | |
Qiu et al. | Pulmonary Delivery of Messenger RNA (mRNA) Therapeutics for Respiratory Diseases | |
CA2268804A1 (fr) | Composition contenant du chitosan | |
I Khatri et al. | Patents review in siRNA delivery for pulmonary disorders | |
Kaur et al. | Chitosan nanoparticles: a therapeutic carrier for delivery of DNA, siRNA and CpG-ODNs | |
Köping-Höggård | Chitosan Polyplexes as Non-Viral Gene Delivery Systems: Structure-Property Relationships and In Vivo Efficiency | |
KR20220092764A (ko) | 세포 번역이 가능한 구조를 갖는 rna 발현카세트를 유효성분으로 하는 복합입자 및 이의 용도 | |
MUMPER et al. | GENEMEDICINE, INC., 8301 New Trails Drive, The Woodlands, Texas 77381–4248 | |
Kaul et al. | Polymeric gene delivery systems | |
Morais | Enhancement of non-viral transfection efficiency with nuclear localization signal peptides | |
Hetti | Development of novel biodegradable core-shell nanoparticles as carriers for gene delivery | |
Danielsen | Chitosan-mediated DNA condensation as a basis for gene delivery: Influence of polyelectrolyte molecular parameters on the condensation behaviour | |
Kaul et al. | Northeastern University Boston, Massachusetts, USA |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |