KR20220092764A - 세포 번역이 가능한 구조를 갖는 rna 발현카세트를 유효성분으로 하는 복합입자 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유효성분으로 세포 번역이 가능한 구조를 갖는 RNA 발현카세트, 양이온성 화합물과 음이온성 화합물을 포함하며 이들 간의 정전기적인 상호작용으로 복합입자를 형성하며 상기 RNA 발현카세트는 형성된 복합입자 구조에 봉입되어 있는 복합입자 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

세포 번역이 가능한 구조를 갖는 RNA 발현카세트를 유효성분으로 하는 복합입자 및 이의 용도{Composite particles using RNA expression cassettes having a structure capable of cell translation as an active ingredient and uses thereof}
본 발명은 유효성분으로 세포 번역이 가능한 구조를 갖는 RNA 발현카세트이고 양이온성 화합물과 음이온성 화합물을 포함하며 이들 간의 정전기적인 상호작용으로 복합입자를 형성하며 상기 RNA 발현카세트는 형성된 복합입자 구조에 봉입되어 있는 복합입자 및 이의 용도에 관한 것이다.
오늘날 다양한 질병은 펩타이드(peptide-), 단백질(protein-), 및 핵산 기초 약물(nucleic acid-based drugs)의 주입을 수반하는 치료, 특히 세포나 조직안으로 핵산의 형질주입(transfection)을 수반하는 치료를 필요로 한다.
펩타이드, 단백질, 및 핵산 기초 약물의 완전한 치료학적 잠재력은 포유류 세포의 원형질막을 통과하는데 제한된 능력으로 인해 종종 제대로 발휘되지 못하고, 그 결과 세포 통과(cellular access)가 좋지 않고, 부적절한 치료 효과를 가져온다. 오늘날 이러한 어려움들은 생물의학(biomedical) 발전과 많은 생물약제학(biopharmaceuticals)의 상업적 성공을 위한 중요한 도전을 의미한다.
핵산 기초 약물(nucleic acid-based drugs)은 디옥시리보핵산, 리보핵산 또는 백본(backbone), 당 또는 염기가 화학적으로 변형되거나 말단이 수식된 폴리뉴클레오타이드 유도체 등의 핵산, 예를 들어 RNA, DNA, RNA-guided genome editing system, siRNA(short interfering RNA), 압타머(Aptamer), 안티센스 ODN(antisense oligodeoxynucleotide), 안티센스 RNA(antisense RNA), 리보자임(ribozyme) 및 디엔에이자임(DNAzyme) 등의 핵산, 즉 음이온성 약물로서 등 매우 다양한 물질이 있으며 전달하고자 하는 핵산의 종류에 따라 상이한 전달체 및 제조방법이 요구되는바, RNA 전달체로서 안정성 및 제조 수율이 증가된 제형 및 그 제조방법이 요구되어 왔다.
mRNA(messenger RNA)는 단백질을 합성하기 전 단계의 물질로서, 유전정보를 담고있다. mRNA는 다양한 치료제로의 접근이 가능하여 예방용 또는 치료용 백신으로 활용 가능하며, 결여된 단백질도 mRNA를 통해 합성이 가능하다.
몇 가지 질병(diseases) 또는 장애(disorders)에 대해, 유전자 치료 접근법(gene therapeutic approaches)은 그러한 치료의 특수한 형태로서 발전되어왔다. 일반적으로 유전자 치료법이 추가적으로 유전병과 같은 질병을 치료하기 위하여 각각의 세포 및 조직 안으로 하나 이상의 핵산 또는 유전자의 주입을 수반하는 반면, 이러한 치료는 세포나 조직내로 핵산 또는 유전자의 형질주입을 이용하고, 이러한 치료법을 통하여 결함이 있는 돌연변이 형질이 기능적인 것으로 치환된다.
각각의 세포 안으로 이러한 핵산 또는 유전자 하나 또는 그 이상을 이동하거나 삽입하는 것은 오늘날에도 여전히 주요한 도전을 의미하고, 특히나 유전자 치료학(gene therapy)의 분야에서는 절대적으로 핵산에 기초한 약제의 우수한 치료학적 효과가 확실히 필요하다.
개개의 세포 안으로 핵산 또는 유전자의 이동을 성공적으로 수행하기 위하여, 많은 장애물을 넘어야만 한다. 핵산의 수송(transport)은 전형적으로 세포막(cell membrane)과 핵산의 회합(association)후, 엔도좀(endosomes)에 의한 흡수(uptake)를 통해서 일어난다. 엔도좀내에서, 도입된(introduced) 핵산은 엔도좀으로부터 분리된다. 세포질에서 발현(expression)이 일어날 때, 이러한 핵산은 엔도좀을 이탈해야 한다.
만약 핵산이 엔도좀 탈출(endosomal escape)을 제대로 하지 못하면, 엔도좀이 내용물의 분해를 야기하는 라이소좀(lysosome)과 융합되거나, 세포밖으로 내용물을 보내기 위해 세포막과 엔도좀이 융합된다. 핵산의 효과적인 이동을 위하여 엔도좀의 탈출은 형질주입의 능률에 감소시키는 가장 중요한 단계중의 하나로 여겨진다. 지금까지 이러한 문제를 다루는 각각의 접근법들이 있다. 그러나 어떠한 접근법도 모든 면에서 성공적인 것은 없었다.
오늘날 형질주입 시약은 전형적으로 극소입자(nano-) 및 극미립자(microparticles)뿐만 아니라 펩타이드(peptides), 다양한 폴리머(polymers), 지질(lipids)을 포함한다. 이러한 형질주입 약품은 전형적으로 시험관(in vitro) 반응에서 오로지 성공적으로 이용되어왔다.
핵산을 생체 내에서 살아있는 동물의 세포내로 형질주입할 때, 더 많은 조건들이 충족되어야 한다. 예로써, 응집작용(agglomerisation)에 대해 생리 식염액(physiological salt solutions)에서 안정적이어야 한다. 게다가, 호스트(host)의 보체(complement) 시스템의 일부와도 반응하지 않아야 한다. 복합체는 어디서든 일어나는 뉴클레아제(nuclease)에 의한 초기 세포 밖의 분해로부터 핵산을 보호해야한다.
유전자 치료 응용에 있어, 가장 중요한 것은 담체(carrier)가 후천성 면역계(immunogenicity)에 의해 인식되지 않고 비특이적 사이토카인 폭풍(cytokine storm(급성 면역반응))을 자극하지 않는 것이다.
적절한 유전자 발현이 있는 선택된 세포들로 치료상 유전자를 운반할 수 있는 방법의 개발은 유전자 치료를 향한 중요한 도전에 직면에 하게 된다. 그러나, 유전자 운반과 특히나 성공적으로 세포나 조직으로 핵산을 형질주입하는 것은 간단하지 않고 일반적으로 많은 요소들에 의존한다.
성공적인 운반을 위해서는, 예를 들어 세포 또는 조직 안으로 핵산이나 유전자의 운반은 많은 장애들을 극복해야만 한다. 이상적인 핵산 운반 방법은 3가지 중요한 특징을 충족한다. (1) 세포내 세포간질(matrices)에서 뉴클레아제(nuclease)에 의한 분해로부터 대상 핵산을 보호해야 한다. (2) 대상 핵산이 원형질막을 넘을 수 있도록 해야한다. (3) 불리한 효과가 없어야 한다.
이러한 목표는 다양한 화합물이나 벡터(vectors)의 조합을 이용하여 달성될 수 있다. 특히, 이러한 장애의 일부를 극복한 화합물이나 벡터들이 몇몇 존재한다.
핵산을 비롯한 음이온성 약물을 이용한 치료에 있어서, 안전하고 효율적인 약물 전달기술은 오랫동안 연구되어 왔으며, 다양한 전달체 및 전달기술이 개발되어 왔다. 전달체는 크게 아데노바이러스나 레트로바이러스 등을 이용한 바이러스성 전달체와 양이온성 지질 및 양이온성 고분자 등을 이용한 비바이러스성 전달체로 나뉜다. 바이러스성 전달체의 경우 비특이적 면역 반응 등의 위험성에 노출되어 있으며 생산 공정이 복잡하여 상용화하는 데 많은 문제점이 있는 것으로 알려져 있다.
RNA는 치료제로서 광범위한 잠재력을 가지고 있다. 현재 임상 노력은 예방 접종, 단백질 대체 요법 및 유전 질환 치료에 중점을 두고 있다. mRNA 치료제의 임상 사용은 RNA 제조 및 세포내 전달 방법의 디자인의 진보를 통해 가능해졌다.
그러나, RNA의 광범위한 적용은 여전히 개선된 전달체의 필요성에 의해 제한되고 있다. 따라서, 최근 연구 방향은 비바이러스성 전달체를 이용하여 그 단점을 개선하는 방향으로 진행되고 있다. 비바이러스성 전달체는, 바이러스성 전달체에 비하여 효율성에서 뒤떨어지지만, 생체 내 안전성의 측면에서 부작용이 적고, 경제성 측면에서 생산 가격이 저렴하다는 장점을 가지고 있다.
비바이러스성 전달체중 가장 대표적인 것은 양이온성 지질을 이용한 양이온성 지질과 핵산의 복합체(lipoplex) 및 폴리양이온성(polycation) 고분자와 핵산의 복합체(polyplex)이다. 이러한 양이온성 지질 혹은 폴리양이온성 고분자는, 음이온성 약물과 정전기적 상호 작용을 통해 복합체를 형성함으로써 음이온성 약물을 안정화시키고, 세포 내 전달을 증가시킨다는 점에서 다양한 연구가 진행되어 왔다.
그러나, 충분한 효과를 얻기 위해 필요한 양을 사용할 경우에, 바이러스성 전달체보다는 덜하지만, 심각한 독성을 유발하여 의약품으로 사용이 부적당하다는 결과를 나타내었다. 따라서, 독성을 유발할 수 있는 양이온성 고분자 또는 양이온성 지질의 사용량을 최소화하여 독성을 감소시키면서, 혈중 및 체액 내에서 안정하고, 세포 내 전달이 가능하여 충분한 효과를 얻을 수 있는 음이온성 약물 전달 기술의 개발이 필요하다.
마지막으로, 세포내 전달을 위한 방법 및 비히클은 RNA 치료제의 광범위한 적용에 대한 주요 장벽으로 남아있다. 일부 예외를 제외하고, RNA의 세포 내 전달은 일반적으로 작은 올리고 뉴클레오티드의 것보다 더 어려우며, 전달 나노 입자로의 캡슐화가 필요하다. 다른 유형의 RNA (작은 간섭 RNA [siRNA], ~ 14kDa; 안티센스 올리고 뉴클레오티드 [ASO]에 비해 상당히 큰 크기의 mRNA 분자 (300-5,000 kDa, 1-15 kb)로 인한 것이다.
약물 전달을 위한 의약품에 천연 다당류가 널리 사용되는 것은 생체 적합성, 생분해성 및 저독성이다. 또한 천연 다당류의 독성을 완화하기 위한 전략으로서 합성 재료와 조합하여 사용되어왔다. 이들의 구조적 다양성은 최종 적용의 필요에 따라 각 경우에 가장 적합한 다당류를 선택할 수 있게 하며, 더욱 중요한 것은 그들의 기능적 그룹에 대한 화학적 변형에 의해 기능적 특성이 조정되고 최적화될 수 있다는 점이다.
많은 천연 다당류는 특정 작용기의 존재로 인해 생물학적 접착 특성을 가지므로 체류 시간이 개선된 나노 캐리어 디자인, 특히 장 및 폐 응용 분야에 유용한 출발 물질이 된다. 이러한 기의 존재는 또한 그의 전달 또는 표적화 능력을 향상시키기 위한 중합체 구조의 특정 변형을 허용한다. 또한, 천연 다당류는 중성 (예를 들어, 셀룰로오스, 풀루란, 전분, 덱스트란), 음으로 (예를 들어, 히알루론산, 알기네이트, 콘드로이틴 설페이트), 또는 양으로 하전된 (예를 들어, 키토산) 일 수 있다.
본 발명에서 생체 재료 및 전달 전략에 중점을 두고 RNA 발현카세트 기반 치료제의 임상 사용을 위해 RNA 발현카세트 기반 치료의 임상 사용을 용이하게 할 수 있는 전달체에 대한 연구를 하여, 단백질 요법, 유전자 편집 및 예방 접종에 대한 RNA 발현카세트 기반 전달의 응용 프로그램을 개발하였다.
생물학에서 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)은 주로 동물의 구조적 지지 등을 담당하는 조직이다. 세포외기질은 동물의 결합 조직에 속한다. 세포외기질은 세포 사이의 기질과 기저막으로 구성된다. 세포 사이의 기질은 여러 세포들 사이의 공간을 채우는 기질이다. 다당류로 이루어진 겔과 단백질 섬유가 세포 사이에 채워져 있어 세포외기질의 완충 작용을 돕는다. 기저막은 얇은 종이처럼 구성되어 있으며, 그 위에 상피조직이 위치한다.
ECM의 구성 요소는 해당 세포에 의해 생성되어 엑소사이토시스(exocytosis)를 통해 세포외기질로 분비된다. 새로 생성된 세포외 기질은 분비되어 기존의 세포외기질에 통합된다. ECM은 섬유성 단백질 및 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycans)의 인터라킹 메쉬로 구성된다. ECM은 헤파란황산, 콘드로이틴 황산 및 케라탄황산과 같은 플테오글리칸, 히알루론산과 같은 비-프로테오글리칸 다당류, 콜라겐 및 엘라스틴과 같은 섬유, 피브로넥틴 및 라미닌으로 구성된다. ECM은 주로 히알루론 산(Hyaluronic acid, HA)와 루코사미노글리칸(gluosaminoglycans) 겔 내에 포매된 조밀 콜라겐 네트워크로 구성되며 ECM에서 간질 내 압력의 형태로 강력한 물리적 및 유체역학적 장벽을 만들어낸다.
이러한 거대 분자 성분은 상호 연결되어 세포 표면 수용체 및/또는 기질 이펙터에 대한 결합을 통해 세포와 능동적으로 통신하는 복잡한 네트워크를 형성한다. ECM은 조직에 조직 기능에 필수적인 구조적 무결성 및 기계적 특성을 제공하거나 조직 항상성을 유지하기 위해 세포 표현형 및 기능을 조절하는 등 다양한 역할을 수행한다. ECM 분자 구성과 구조는 조직마다 다르며, 정상적인 조직 복구 및 다양한 질병의 진행 중에 현저하게 변형된다. 실제로 병리학 적 상황에서 발생하는 비정상적인 ECM 리모델링은 세포-기질 상호 작용을 조절하여 질병의 진행을 유도한다.
암 조직에서의 ECM 파괴에 대한 치료전략은 PEG-PH20(PEGylated rHuPH20 효소, 재조합 인간 히알루로니데이즈 효소, hyaluronidase)을 포함하는 여러 임상시험을 진행하면서 임상적으로 빠르게 발전하고 있다. 또한, 기질 메탈로프로테이나제(MMP)가 ECM와 관련된 조직 파괴에 주된 역할을 한다. MMP는 세포외 기질의 분해 및 조직 리모델링에 참여하는 아연-의존적인 엔도펩티다제 패밀리이다. MMP 패밀리 멤버로 일부 28종이 있으며, 이는 콜라게나제, 젤라티나제, 스트로멜리신, 막-타입 MMP, 매트릴리신, 에나멜리신 등으로 분류될 수 있다. MMP1, MMP8, MMP13 및 MMP18으로 구성되는 콜라게나제는 3중 나선형의 원섬유콜라겐을 독특한 3/4 및 1/4 단편으로 분해할 수 있다. 또한, MMP14도 원섬유 콜라겐을 절단하며, MMP2 역시 콜라겐을 분해할 수 있다.
암 조직에서 효소 전달효율과 나노입자의 확산을 향상시키기 위해 고분자 나노입자에서 ECM 분해효소의 다가제시(multivalent presentation) 전략이 개발되었다. 그러나 이러한 나노제형의 문제점은 효소 고정화를 위한 추가공정으로 인해 효소특성의 비가역적으로 변화될 수 있다는 것이다. 아울러, 막-결합 글리코실 포스파티딜이노시톨(GPI) 도메인이 결여된 절단된 PH20 형태를 갖는 화학적으로 변형된 합성 나노입자의 치료효능에 대한 염려가 있다. 천연 PH20 hyaluronidase의 GPI 앵커링(anchorage)은 세포 표면에서 단백질의 이동성을 증가시켜 난보호막(egg vestment)로의 성공적인 침투를 위한 최대속도 및 난-정자 막 융합을 가능케 한다
암의 치료를 위한 나노약물에 관한 그동안의 연구성과에도 불구하고, 약물전달에 사용되는 대부분의 나노입자는 암조직의 ECM을 깊숙히 침투하지 못하고 ECM의 혈관 주변에만 국한되기 때문에 그 치료 효능이 제한되어 왔다. ECM내 나노입자 축적의 정도는 간질액 압력의 상승과 조밀하게 복잡한 ECM 때문에 심각하게 제한될 수 있다.
핵산, RNA 발현카세트는 양이온성 화합물, 음이온성 화합물과 용이하게 복합입자를 형성할 수 있다. 상기 복합입자의 생체 적합성 및 효능의 극대화를 위해서, 어떠한 유형의 특성을 갖는 어떠한 유형의 폴리머가 어떠한 유형의 조건하에 어떠한 복합입자를 형성할 수 있는 지는 공지되지 않았다.
상기 RNA 발현카세트는 비증폭 mRNA(non-amplifying mRNA) 구조체, 자가 증폭 mRNA(self-amplifying mRNA) 구조체를 포함한다. 각각 구조체는 5' 캡 구조, 5'UTR 및 3'UTR를 포함하여 RNA의 안정성 및 발현의 증가할 수 있도록 구조체에서 독특한 2차 구조를 가역적으로 유지하도록 해야 한다.
이러한 관점에서, 본 발명에 의해 해결하고자 하는 목적은 RNA 발현카세트를 복합입자로 형성하는 신규의 기술을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 복합입자를 의약품으로써 구성성분의 생분해성 및 생체적합성, 유효성분인 RNA 발현카세트의 생체 안정성, 반복 투여 및 유효탑재량(payload)를 고려한 운반체를 제공하는 것이다.
본 발명은 주로 RNA 발현카세트, 양이온성 화합물, 특히 프로타민(PS),키토산, 세포투과성 펩티드(CPP) 또는 이들의 유도체 그리고 음이온성 화합물, 특히 인간혈청알부민, 히알루론산 또는 이들 다당류의 유도체와의 상호 작용에 의존하는 RNA 발현카세트 복합입자를 제공하고자 한다.
본 발명은 주로 RNA 발현카세트, 양이온성 화합물 및 음이온성 화합물의 상호 작용에 의존하는 RNA 발현카세트 복합입자를 제공할 수 있으며, 상기 3종류의 물질 군에서 각각 1종보다 2종 이상을 선택하여 복합입자의 약물 성질을 우수하게 하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 RNA 발현카세트 복합입자는 고분자 전해질 복합 나노 입자, 나노 겔 및 중합체 미셀을 포함하는 복합입자를 제공하고자한다.
본 발명에 의해 해결하고자 하는 목적은 유효성분인 RNA 발현카세트의 생체내 안정성 및 담체의 무독성과 생체 분해성을 확보하기 위해서, RNA 발현카세트, 양이온성 화합물 및 음이온성 화합물을 함유하는 복합입자의 제조에 적합한 신규의 기술을 제공하는 것이다.
그러므로 본 발명의 기초를 이루는 목적은 담체 또는 복합체화 시약(complexing agent)을 제공하는 것이며, 특히 유전자 치료 또는 다른 치료학적 응용 목적의 RNA 발현카세트의 형질주입을 위한 것이며, 이들은 핵산, 바람직하게는 RNA 발현카세트와 응집화할 수 있고, 시험관내에서 뿐만 아니라 생체 내에서 각각의 세포주 내로 RNA 발현카세트의 충분한 형질주입을 가능하도록 하는 것이다.
본 발명의 목적은 상기 문제점을 포함한 추가적인 다양한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 보다 효율적인 ECM 분해효소 또는 분해효소 저해물질을 코딩하는 RNA 발현카세트를 포함하는 복합입자 및 이를 이용한 세포외 기질 파괴 전략으로 ECM 관련 질병 예방 및 악화 방지 효과, 특히 종양 조직에서의 항암물질의 이동 촉진을 통한 높은 항암 치료 성적을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 조성물의 구성성분 중, 유효성분으로 핵산, RNA 발현카세트이고, 양이온성 화합물 및 음이온성 화합물에 의하여 복합입자를 형성하고 유효성분으로 RNA 발현카세트는 복합입자 구조 내부에 봉입될 수 있다. 이러한 RNA 발현카세트 및 양이온성 화합물의 복합입자가 봉입된 고분자 복합입자 전달체의 대략적인 구조를 <도 1>에 나타내었다.
상기 RNA 발현카세트는 비증폭 mRNA(non-amplifying mRNA) 구조체, 자가 증폭 mRNA(self-amplifying mRNA) 구조체를 포함한다. 각각 구조체는 5' 캡 구조, 5'UTR 및 3'UTR를 포함하여 RNA의 안정성 및 발현의 증가할 수 있도록 세포 및 구조체에서 독특한 구조를 가역적으로 유지하도록 해야 한다.
치료제 목적을 위한 최적의 시험관 내 전사를 위해서 본 발명의 RNA 발현 키세트는 T7, T3 또는 Sp6 파지(phage) RNA 중합 효소(polymerase)를 사용하여 선형 DNA 주형(linear DNA template)으로부터 제조할 수 있다. 이렇게 만들어진 RNA 발현카세트는 카세트의 안정성 및 발현의 효율성이 향상되도록 표적 단백질을 암호화하고 있는 Open reading frame(orf), UTR, 5'Cap과 다중 아데노신 꼬리 서열(poly (A) tail)을 갖고 있는 개선된 형태일 수 있다.
5' 및 3’UTR은 주로 cis 조절 요소라고 통칭하는 서열 및 구조적 모티프와 RNA 결합 단백질(RBP) 또는 작은 RNA 전달 인자 간의 동적 상호 작용을 통해 기능을 하고 있다. 그들은 함께 특정 mRNA의 대사와 번역을 조정하여 세포 단백체를 형성할 수 있도록 한다. 5'UTR에서 시스 요소의 예는 5'-말단 올리고-피리미딘 모티프(5’terminal oligo-pyrimidine, 5’TOP) motif, 피리미딘이 풍부한 번역 요소(pyrimidine-rich translational element, PRTE) 또는 TOP- 유사 서열(TOP-like sequence), 시토신이 풍부한 번연의 조절인자(cytosine-enriched regulator of translation, CERT), G-quadruplex 구조(G-quadruplex structure), 및 진핵 개시 인자 3결합 줄기 루프 구조(eukaryotic initiation factor 3 (eIF3)-binding stem-loop structure) 등이다. 이러한 각 요소는 mRNA의 하위 집합에 존재하여 선별된 표적 단백질 네트워크의 표적 제어를 가능하게 해야 한다.
<도 1>을 참조하면, RNA 발현카세트는 양이온성 화합물과 정전기적 상호작용을 통해 서로 결합하여, RNA 발현카세트와 양이온성 화합물 복합체를 형성한다. 이러한 RNA 발현카세트와 양이온성 화합물이 형성한 복합체는, 음이온성 화합물에 의해 형성되는 기본 복합입자 구조 내에 봉입될 수 있다.
RNA 발현카세트, 양이온성 화합물 및 음이온성 화합물은 각각 여러 종류의 화합물들이 있으며 본 발명의 목적에 부합되도록 각각 그룹에서 1 종류 또는 2 종류 이상을 선정하여 사용할 수 있다.
<도 1>에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 기본 복합입자와 추가적인 음이온성 화합물에 의해 형성되는 복합입자는, 수성 환경에서 음이온성 화합물이 복합입자의 외벽을 형성하고, 양이온성 화합물이 복합입자의 내벽을 형성하며, 그 형성된 복합입자의 내부에 RNA 발현카세트와 양이온성 화합물 복합체가 봉입된 구조이다.
RNA 발현카세트 기반 요법에 사용되는 폴리머 중에서, 본 발명자들은 RNA 발현카세트 전달에 매우 적합한 적용 가능한 특성을 강조하기 위해 본 발명은 생분해성 및 생체 적합성이 있는 Protamine(PS), 키토산과 세포 침투성 펩티드(CPP)와 같은 양이온성 화합물 그리고 히알루론산 및 알부민 같은 음이온성 화합물을 선택하였다.
PS, 키토산과 CPP와 같은 양이온성 화합물은 RNA 발현카세트와 정전기적으로 상호 작용하여 안정적으로 양으로 하전된 폴리플렉스를 형성할 수 있으며, 중성 및 음이온성 화합물은 종종 RNA 발현카세트와 보다 효율적인 상호 작용을 선호하기 위해 다른 성분의 존재를 필요로 한다. 음이온성 화합물은 점막 점착성 폴리머이지만, 반대 전하를 가지고 있어 핵산 전달에 그 사용에 크게 영향을 미친다. 이러한 중요한 차이는 화학적 구조로부터 유래하는데, 이는 프로타민의 염기성 아미노산, 특히 아르기닌(arginine) 단량체에서 양으로 하전된 구아니디노(guanidino) 그룹 또는 히알루론산의 글루쿠론산 단위에서 음으로 하전된 카복실 기로 제공할 수 있다.
본 발명에서 제안된 핵산의 세포내 전달체는 양이온성 화합물에 의해 장점이 명백히 달성되고 음이온성 화합물에 의해 보완된다고 할 수 있다. 첫째, 음으로 하전된 핵산과의 양이온성 화합물의 효율적인 물리적 상호 작용은 뉴클레아제 분해로부터 이들을 보호한다. 둘째, 이들은 순 양전하를 제공하여 복합체와 세포의 음이온 표면과의 상호 작용을 향상시킨다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 전달체에서 알부민, 히알루론산과 같은 음이온성 다당류와의 회합은 사구체 모세관 벽을 통한 RNA 발현카세트 배출을 피함으로써 생체 이용률을 향상시킬 수 있다. 실제로, 음이온성 물질은 사구체 막의 음전하로 확립된 반발력으로 인해 "필터링이 불가능하다".
전달체는 양이온성 화합물 및 이들의 유도체는 상이한 유형의 전달체를 수득하기 위해 사용될 수도 있으며 또한, 음이온성 화합물 및 이들의 유도체는 상이한 유형의 전달체를 수득하기 위해 사용될 수도 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명은 주로 RNA 발현카세트, 특히 PS, CPP, 키토산과 같은 양이온성 화합물 및 히알루론산, 알부민 또는 이들 다당류의 유도체와 같은 음이온성 화합물의 상호 작용에 의존하여 RNA 발현카세트 전달체를 제공하고자한다.
이러한 관점에서, 본 발명에 의해 해결하고자 하는 목적은 양이온성 화합물, 음이온성 화합물 및 RNA 발현카세트를 함유하는 복합입자의 제조에 적합한 신규의 기술을 제공하는 것이다.
본 발명은 유효성분으로 RNA 발현카세트와 양이온성 폴리펩타이드로 핵, 기본 복합입자를 제조하고, 음이온성 다당류로 외각층을 형성하는 복합입자를 개발하였다.
본 발명자들은 복합입자를 제조하기 위해서, RNA 발현카세트를 포함하는 기본 복합입자를 형성할 수 있는 양이온성 화합물의 특성으로서 양이온화도가 중요함을 밝혀내었고, 이에 따라 본 발명을 완성시켰다.
상기 RNA 발현카세트와 양이온성 화합물 복합체는 상기 음이온성 화합물에 의해 형성되는 복합입자 구조체 내에 봉입된 상태를 유지하여 혈중 또는 체액 내에서의 안정성이 향상된다.
상기 양이온성 화합물은 상기 생분해성 및 생체 적합성 고분자 담체 분자로, 예를 들면, 활성(activity)의 손실 없이 유전자 치료 또는 다른 치료적 응용을 위해 핵산의 충분한 형질주입, 특히나 시험관내뿐만 아니라 생체 내에서 다른 세포주(cell lines)안으로 핵산의 충분한 형질주입을 목적으로 핵산을 충분하게 응집화하기 위한 것이다. 상기 고분자 담체 분자는 더군다나 세포에 유독하지 않고 핵산 전달물의 충분한 방출이 가능하도록 한다.
본 발명에서 추가적으로 핵산 전달물의 향상된 안정성을 제공하고, 면역계에 의해 고분자 담체 전달물 복합체의 인식을 방지하는 생분해성 및 생체 적합성 음이온성 화합물을 사용하며, 상기 음이온성 화합물의 말단에 특히나 친수성 중합체 사슬(예를 들면, PEG-단량체)의 가역적 첨가로 응집작용에 대해 향상된 저항성을 부여할 수도 있다.
비록 꽤 작은 비독성 단량체 단위를 이루고 있음에도 불구하고 PS와 CPP와 같은 양이온성 폴리펩타이드는 핵산 전달물 및 복합체 안정성의 강한 축합을 제공하는 정해진 사슬 길이를 갖는 양이온의 바인딩 서열(cationic binding sequence)을 형성한다. 세포기질의 환원 상태(예를 들면, cytosolic GSH)하에서, 복합체는 그들의 단량체로 빠르게 분해되고, 단량체는 더 분해되거나(예를 들면, 올리고펩타이드(oligopeptide)) 또는 분비된다(예를 들면, PEG). 이것은 세포기질내에서 핵산 전달물의 유도(deliberation)를 도와준다. 세포기질 내에서 작은 올리고펩타이드로 분해되기 때문에, 고분자 올리고펩타이드들 예를 들면, 고분자 올리고아르기닌(oligoarginine)에서 관찰되는 것으로 알려진 독성이 관찰되지 않는다.
상기 음이온성 화합물의 PEG-코팅은 그것의 말단에 친수성 코팅으로 상기 전달체를 덮고(coat), 이는 염-매개 응집작용 및 혈청 내용물들과의 원하지 않는 상호작용을 예방할 수 있다. 세포기질 내에서 이러한 코팅은 세포의 환원 상태하에서 쉽게 제거된다. 역시, 이러한 효과는 세포기질 내에서 핵산 전달물의 유도를 향상시킨다.
상기 복합입자의 입자 크기는 10 내지 1000 nm일 수 있고, 더욱 구체적으로는 10 내지 200 nm일 수 있다.
또한, 상기 복합입자의 표면 전하는 -30 내지 30 mV일 수 있고, 더욱 구체적으로 -20 내지 20 mV일 수 있다.
나노 담체는 고분자 전해질 복합 나노 입자, 나노 겔, 하이드로 젤 및 중합체 미셀에 해당한다. 복합입자의 입자 크기 및 표면 전하가 상기 수준을 유지할 경우, 복합입자 구조의 안정성 및 구성성분들의 함량과 체내에서 RNA 발현카세트의 흡수도 및 약제학적 조성물로서 멸균의 편의성면에서 바람직하다.
본 발명의 일 관점에 따르면 세포외 기질 분해효소 및 분해효소의 저해물질을 코딩하는 RNA 발현카세트를 포함하는 약물전달용 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 약물전달용 조성물을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 약물전달용 조성물에 세포외 기질 분해효소 및 분해효소의 저해물질을 코딩하는 RNA 발현카세트를 포함하고 내부에 항암 화합물이 봉입된 약물전달용 조성물을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명에서 발현하고자하는 표적 단백질을 코딩하는 RNA 발현카세트를 포함하는 복합입자를 제공하며 치료용 단백질, 항원 및 항체를 제공할 수 있으며, 일 실시예에 따른 세포외 기질 분해효소 또는 분해효소의 저해물질을 코딩하는 RNA 발현카세트를 포함하는 복합입자는 ECM 관련 질병을 예방 또는 악화 방지를 하거나 특히, 종양 조직 주변에 포진하여 면역세포, 핵산의약품 및 항암 화합물의 근접을 방해하는 세포외 기질을 분해시킴으로써 암세포를 선택적으로 제거할 수 있어, 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 약학적 유효성분으로 하는 RNA 발현카세트 복합입자의 개념도로 상기 RNA 발현카세트과 양이온성 화합물이 구성하는 기본복합입자(a) 및 약학적 유효성분으로 하는 RNA 발현카세트과 양이온성 화합물이 구성하는 층(10)과 음이온성 화합물 외곽층(20)을 포함하는 복합입자(b)이고,
도 2는 약학적 유효성분으로 하는 RNA 발현카세트 복합입자를 제조하는 방법을 도시한 것으로 약학적 유효성분으로 하는 RNA 발현카세트 자체가 음이온을 띄고 있다는 특성에 착안하여 양전하를 띄는 폴리머로 상기 약학적 유효성분으로 RNA 발현카세트를 코팅하고 추가적으로 음이온성 화합물을 2차 코팅하여 입자를 제조하는 방법을 제공하고,
도 3은 증폭된 PCR 산물을 EcoRI/BamHI 효소를 사용하여 절단한 다음, EcoRI/BamHI 효소로 선형화된 pUC19 벡터와 T4 DNA ligase를 이용하여 클로닝하고 상기 반응용액을 대장균에 형질전환하고 선정된 균주에서 플라스미드를 분리하여 EcoRI/BamHI 제한효소를 처리한 후 전기영동한 결과이고,
도 4는 <T7 promoter - 5'UTR - 표적단백질 ORF DNA - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL>을 가지는 DNA가 삽인된 pUC19 벡터를 증폭하여 얻은 PCR 산물을 주형으로 체외전사하여 얻은 전사체를 상이한 양으로 전기영동한 결과이고,
도 5는 천연 뉴클레오타이드로만 제조된 RNA 발현카세트, 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 RNA 발현카세트 및 3' 말단에 Cholesterol이 부가된 변형 RNA 발현카세트를 세포 배양액에 다양한 시간 동안 처리한 후 RT-PCR하여 in vitro 안정성을 확인한 결과이고,
도 6은 RNA 발현카세트/PS 기본입자-DW 및 RNA 발현카세트/PS 기본입자-CM에서 PS의 양에 따른 입자 크기를 PCS 측정한 결과이며, PDI 등급:(a) PDI ≤ 0.1, (b) PDI ≤ 0.15, (c) PDI ≤ 0.2. 분류가 없으면 PDI> 0.2이고,
도 7은 RNA 발현카세트의 비율에 따라 복합입자에 미 봉입된 RNA 발현카세트를 확인한 결과이고,
도 8은 RNA 발현카세트와 양이온성 화합물 프로타민(PS)와 양이온성 화합물 DOTAP를 사용한 조립경로 PC, DC 및 MP에 따른 기본 복합입자 2.0의 제조에서 RNA 발현 카세트의 미봉합 상태를 확인한 결과이고,
도 9는 30 ㎍ RNA 발현카세트, 90 ㎍ PS 및 0~2,000 ㎍의 HSA을 포함한 제제의 PCS 측정하였으며, PDI 등급:(a) PDI ≤ 0.1, (b) PDI ≤ 0.15, (c) PDI ≤ 0.2. 분류가 없으면 PDI> 0.2 이고,
도 10은 RNA 발현카세트, PS 및 HA를 순차적으로 weight ratio에 따라 sonication & extruder method로 반응한 후, PCS를 이용하여 sonication 및 extruder 방법에 따른 입자크기 변화를 분석한 결과이고,
도 11은 Sonication 및 Extruder 처리 단계 후 분석하기 위해 각각의 단계에서 1시간 동안 안정시키고 원심분리하여 얻은 상징액을 2% agarose gel에서 전기영동을 수행하여 각각의 HA 복합입자 1.1에 의해 RNA 발현카세트 미봉입을 확인한 결과이고,
도 12는 복합입자의 [RNA 발현카세트/PS]:HA 첨가몰비 1:1.5 질량비에서 시간에 따른 약물 방출 프로파일을 조사한 결과이고,
도 13은 HA와 압타머-SH를 이용하여 HA-DAB-압타머 접합체를 합성하여 분리 정제한 결과이고,
도 14는 두 가지 다른 Cross linker로 합성된 HA-DAB-압타머 접합체를 아가로즈 전기영동을 통해 분석한 결과(a)로 HA-ss-압타머는 HA와 압타머 사이에 이황화결합 (-ss-)이 포함된 접합체를 의미하고, HA-압타머는 이황화결합이 아닌 일반적인 공유결합으로 연결되어 있는 접합체(대조군)를 의미하며, 도 14b 내지 14d는 HA-DAB-압타머 접합체의 안전성을 평가하기 위하여 HA-DAB-압타머 접합체에 FBS를 첨가하여 시간별로 아가로즈 전기영동을 통해 남아있는 압타머의 양을 확인(b 내지 d)로 HA-압타머 Conjugate는 HA-DAB-압타머 접합체를 의미하고,
도 15는 표적 단백질 RNA 발현카세트:PS:HSA 복합입자에 의해 형질주입된 293T 세포들로부터의 복합입자의 양(a) 및 시간경과(b)에 따른 각각 단백질의 분비를 Human sTNFR2 ELISA Kit(MyBioSource, 미국), G-CSF Human Instant ELISA™ Kit(인비트로겐, 미국), EPO Quantikine ELISA™ Kit(R&D Systems, 미국), 항-RSV-F 항체 ELISA™ kit(ab94968, abcam사, 미국) 또는 Human Anti-Respiratory syncytial virus IgG ELISA™ Kit (RSV) (ab108765, abcam사, 미국)로 정량한 결과이고,
도 16은 다양한 양의 HYAL 1, PH20 또는 sPH20 RNA 발현카세트/PS/HA 복합입자를 세포에 형질주입한 후 복합입자의 양(a) 및 시간경과(b)dp 따라 정량한 결과이고,
도 17은 sPH20 복합입자로 형질주입한 세포를 6시간 동안 배양한 후 세척하고, 이어서, 0.5mg/mL의 소 aggrecan (Sigma-Aldrich사, 미국)을 첨가하여 함께 24시간 동안 배양하고, 그 후, 배지를 제거하고 PBS (pH 7.4)에서 2% 글루타르알데히드로 고정하고 109/mL 마우스 RBC가 있는 현탁액으로 교체한 후, 세포를 카메라 스캐너 및 이미징 프로그램 (DiagnostiC Instruments, Inc., 미국)이 결합된 위상차 현미경으로 이미지화한 결과이고,
도 18은 다양한 양의 MMP1, MMP 8 또는 MMP 13 RNA 발현카세트:PS]/HA 복합입자이 형질주입된 인간 피부 섬유모세포를 배양하면 입자의 양(a) 및 시간경과(b)에 따른 표적단백질의 발현량을 정량한 결과이고,
도 19는 다양한 양의 TIMP 1, TIMP 2, TIMP 3 또는 TIMP 4 RNA 발현카세트:PS]/HA 복합입자 1.1을 형질주입한 세포를 배양하면 입자의 양(a) 및 시간경과(b)에 따른 표적단백질의 발현량을 정량한 결과이고,
도 20은 TCA를 갖고 있는 복합입자를 MDCK-ASBT 세포 및 MDCK 세포에 형질주입하고 TIMP1 발현양을 정량한 결과이고,
도 21은 [MMP1 RNA 발현카세트:PS]/HA 복합입자 1.1이 형질주입된 EGFR+ 폐암 세포주 A549 세포, 대장암 세포주 SW48 및 피부암 세포주 A431에서 거의 발현이 없었으며, EGFR- 유방암 세포주, MDA-MB-453, 대장암 세포주 HT-29 및 신경모세포종 세포주 SK-N-MC에서 MMP1의 발현 정도를 조사한 결과(a)이고, [MMP1 RNA 발현카세트:PS]/HA-Apt_EGFR 복합입자를 형질주입한 EGFR+ 폐암 세포주 A549 세포, 대장암 세포주 SW48 및 피부암 세포주 A431에서는 MMP1 발현 정도는 상대적으로 높았으며, EGFR- 유방암 세포주, MDA-MB-453, 대장암 세포주 HT-29 및 신경모세포종 세포주 SK-N-MC에서 MMP1의 발현 정도를 조사한 결과(b)이다.
본 발명에서, 뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드 또는 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, 본 발명의 핵산들, 예를 들면, mRNA 분자)에서, "변형" 또는 적절하게는 "변형된"은 A, G, U 또는 C 리보뉴클레오타이드들에 관한 변형을 말한다. 일반적으로, 본 발명에서, 이들 용어들은 천연적으로 발생하는 5'-말단 mRNA 캡 모이어티 내의 리보뉴클레오타이드 변형들을 말하는 것으로 의도되지 않는다. 폴리펩타이드에서, "변형"은 20개 아미노산들의 정규 세트, 모이어티와 비교한 변형을 말한다.
핵산이 mRNA인 경우, 암호화 영역, 플랭킹 영역들(flanking regions) 및/또는 말단 영역들은 1개, 2개, 또는 그 이상의(임의로 상이한) 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 변형들을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포에 도입된 변형된 폴리뉴클레오타이드는, 변형되지 않은 폴리뉴클레오타이드와 비교하여, 세포에서 감소된 분해를 나타낼 수 있다.
폴리뉴클레오타이드들은, 당, 핵염기, 또는 뉴클레오사이드간 연결에 대한(예를 들면, 연결 포스페이트에 대한/포스포디에스테르 연결에 대한/포스포디에스테르 골격에 대한) 임의의 유용한 변형을 포함할 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드의 주요 그루브, 또는 핵염기의 주요 그루브 페이스는 하나 이상의 변형들을 포함할 수 있다. 피리딘 핵염기의(예를 들면, 주요 그루브 페이스 상의) 하나 이상의 원자들은, 임의로 치환된 아미노, 임의로 치환된 티올, 임의로 치환된 알킬(예를 들면, 메틸 또는 에틸), 또는 할로(예를 들면, 클로로 또는 플루오로)로 대체되거나 치환될 수 있다. 특정 실시형태에서, 변형들(예를 들면, 하나 이상의 변형들)은 각각의 당 및 뉴클레오사이드간 연결 각각에 존재한다. 본 발명에 따른 변형들은 리보핵산(RNA)의 데옥시리보핵산들(DNA)로의 변형들, 예를 들면, 리보푸라니실 환의 2'OH의 2'H, 트레오스 핵산(TNA), 글리콜 핵산(GNA), 펩타이드 핵산(PNA), 잠금(locked) 핵산(LNAs) 또는 이들의 하이브리드로의 치환일 수 있다. 추가의 변형들이 본 발명에 기술되어 있다.
본 발명에서, "게놈"은 핵에 존재하는 염색체 DNA 뿐만 아니라 세포 하위 구성 성분 (예, 미토콘드리아, 색소체)에 존재하는 기관 DNA를 포괄한다
"폴리뉴클레오티드", "핵산 서열", "뉴클레오티드 서열" 또는 "핵산 단편"은 상호 호환적으로 합성, 비-천연 또는 변형된 뉴클레오티드 염기를 선택적으로 포함하는, 단일 가닥 또는 이중 가닥의 RNA 또는 DNA로 된 폴리머를 지칭하기 위해 사용된다. 뉴클레오티드 (일반적으로 5'-모노포스페이트 형태로 발견됨)는 다음과 같이 단문자명으로 지칭된다: "A" = 아데닐레이트 또는 데옥시아데닐레이트 (각각 RNA 또는 DNA), "C" = 시티딜레이트 또는 데옥시시티딜레이트, "G" = 구아닐레이트 또는 데옥시구아닐레이트, "U" = 우리딜레이트, "T" = 데옥시티미딜레이트, "R" = 퓨린 (A 또는 G), "Y" = 피리미딘 (C 또는 T), "K" = G 또는 T, "H" = A 또는 C 또는 T, "I" = 이노신, "N" = 임의의 뉴클레오티드.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는, 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, mRNA)가 도입된 세포의 선천적 면역 반응을 실질적으로 유도하지 않는다. 유도된 선천적 면역 반응의 특징들로는 1) 염증-촉진성 사이토카인들의 증가된 발현, 2) 세포내 PRR들(RIG-I, MDA5 등)의 활성화, 및/또는 3) 단백질 번역에 있어서의 종결 또는 감소가 포함된다.
"폴리펩타이드", "펩타이드", "아미노산 서열" 및 "단백질"은 본 발명에서 상호 호환적으로 아미노산 잔기들로 된 폴리머를 지칭하기 위해 사용된다. 이들 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 대응되는 천연 아미노산의 인공적인 화학 유사체인 아미노산 폴리머 뿐만 아니라 천연 아미노산 폴리머에도 적용된다. 용어 "폴리펩타이드", "펩타이드", "아미노산 서열" 및 "단백질"은 또한 비-제한적인 예로, 당화, 지질 결합, 황산화, 글루탐산 잔기의 감마-카르복시화, 하이드록시화 및 ADP-화라이보실화 (ribosylation) 등의 변형을 포함한다.
변형된 핵산 분자를 세포내로 도입시켜 세포내적으로 분해되도록 하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 변형된 핵산 분자의 분해는, 단백질 생산의 정확한 시기선택(precise timing)이 요구되는 경우에 바람직할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 세포 내에서의 직접적인 방식으로 작용할 수 있는, 분해 도메인(domain)을 함유하는 변형된 핵산 분자를 제공한다. 주요 그루브 상호작용의 결합, 예를 들면, 파트너와 폴리뉴클레오타이드의 결합(예를 들면, 변형된 뉴클레오타이드가, 변형되지 않은 뉴클레오타이드와 비교하여, 주요 그루브 상호작용 파트너에 대한 결합 친화성을 감소시킨 경우)을 방해할 수 있는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드들을 제공한다. 폴리뉴클레오타이드들은 다른 제제들[예를 들면, RNAi-유도제, RNAi 제제, siRNA, shRNA, miRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 촉매적 DNA, tRNA, 삼중 나선 형성을 유도하는 RNA, 압타머(Aptamer), 벡터 등]을 임의로 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드들은 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드들(즉, 변형된 mRNA 분자들)을 갖는 하나 이상의 전령 RNA(mRNA)를 포함할 수 있다.
핵산 분자: 핵산 분자는 바람직하게는 핵산 성분을 포함하는, 바람직하게는 이루어진 분자이다. 용어, 핵산 분자는 DNA 또는 RNA를 나타낸다. 이는 용어 "폴리뉴클레오타이드"와 동의어로 사용된다. 핵산 분자는 뉴클레오타이드 단량체를 포함하거나 이로 이루어진 폴리머이며, 당/포스페이트-백본의 포스포디에스테르 결합에 의해 서로 공유 결합으로 연결되어 있다.
DNA: DNA는 데옥시리보핵산에 대한 일반적인 약자이다. 이는 핵산 분자, 즉, 뉴클레오타이드로 이루어진 폴리머이다. 이러한 뉴클레오타이드는 보통 당 성분(sugar moiety), 염기 성분 및 포스페이트 성분으로 구성된 데옥시아데노신-모노포스페이트, 데옥시티미딘-모노포스페이트, 데옥시구아노신-모노포스페이트 및 데옥시사이티딘-모노포스페이트 단량체이며, 특유의 백본 구조에 의해 중합된다. 백본구조는, 일반적으로, 단량체에 근접한 첫 번째 뉴클레오타이드의 당 성분 즉, 데옥시리보오스와 두 번째 포스페이트 성분 사이의 포스포디에스테르 결합에 의해 형성된다. 단량체의 특정 순서, 즉, 당/포스페이트-백본에 연결된 염기의 순서는 DNA-서열이라고 한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥 형태(double stranded form)에서, 첫 번째 가닥의 뉴클레오타이드는 일반적으로 두 번째 가닥의 뉴클레오타이드와 예를 들어, A/T-염기쌍 및 G/C-염기쌍으로 혼성화(hybridize)된다.
유전자: 유전자는 하나 이상의 세포 생성물을 생산하고/하거나 하나 이상의 세포 간 또는 세포 내 기능을 달성하기 위한 특정 핵산 서열을 지칭한다. 보다 구체적으로, 상기 용어는 특정 단백질 또는 기능적 또는 구조적 RNA 분자를 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산 섹션(전형적으로 DNA이지만, RNA 바이러스의 경우에는 RNA이다)에 관한 것이다.
발현은 그의 가장 일반적인 의미로 사용되며, RNA의 생산 또는 RNA 및 단백질의 생산을 포함한다. 이것은 또한 핵산의 부분적 발현을 포함한다. 뿐만 아니라, 발현은 일시적이거나 안정한 것일 수 있다. RNA 발현카세트와 관련하여, "발현" 또는 "번역"이라는 용어는 세포의 리포좀 내에서 메신저 RNA의 한 가닥이 아미노산 서열의 어셈블리를 지시하여 펩티드 또는 단백질을 만드는 프로세스에 관한 것이다.
RNA, mRNA: RNA는 리보핵산에 대한 일반적인 약자이다. 이는 핵산 분자 즉, 뉴클레오타이드로 이루어진 폴리머이다. 이들 뉴클레오타이드는 보통 소위 백본을 따라 서로 연결된 아데노신-모노포스페이트, 우리딘-모노포스페이트, 구아노신-모노포스페이트 및 사이티딘-모노포스페이드 단량체이다. 백본은 단량체에 근접한 첫 번째 당, 즉 리보오스, 및 두 번째 포스페이트 성분 사이에서 포스포디에스테르 결합에 의해 형성된다. 단량체의 특정 연쇄는 RNA-서열이라고 한다. 보통 RNA는 DNA-서열의 전사에 의해, 예를 들어, 세포 내부에서 수득 가능할 수 있다. 진행 세포에서, 전사는 일반적으로 핵 또는 미토콘드리아 내부에서 수행된다.
mRNA는 메신저-RNA를 의미하며 전형적으로 DNA 주형을 이용하여 생성되고 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 전사체에 관한 것이다. 전형적으로, mRNA는 5'UTR, 단백질 코딩 영역, 3'UTR, 및 폴리(A) 서열을 포함한다. mRNA는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있다. 시험관내 전사 방법론은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 것이다. 예를 들어, 시험관내 전사 키트가 시중에 다양하게 판매되고 있다. 본 발명에 따르면, mRNA는 변형 및 캡핑을 안정화시킴으로서 변형시킬 수도 있다.
생체 내에서(In vivo), 보통 DNA의 전사는 보통 mRNA로 약칭하는 소위 전령-RNA로 가공되어야 하는 소위 미성숙 RNA(premature RNA)로 된다. 예를 들어, 진핵 유기체에서 미성숙 RNA의 가공은 스플라이싱(splicing), 5'캡핑(capping), 아데닐산중합반응(polyadenylation), 핵 또는 미토콘드리아로부터 유출(export) 등의 다양한 상이한 전사 후-변형을 포함한다. 이들 가공의 합(sum)은 RNA의 성숙이라고 한다. 성숙 전령 RNA는 보통 특정 펩타이드 또는 단백질의 아미노산 서열로 번역될 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 일반적으로, 성숙 mRNA(mature mRNA)는 5'캡(cap), 선택적으로 5'UTR, 오픈 리딩 프레임, 선택적으로 3'UTR 및 폴리(A) 서열을 포함한다. 전령 RNA 이외에, 여러 비-코딩 유형의 RNA가 존재하며, 이는 전사 및/또는 번역의 조절과 관련될 수 있다. 용어 "RNA"는 바이러스 RNA(viral RNA), 레트로바이러스 RNA(retroviral RNA) 및 RNA(replicon RNA)과 같은, 다른 코딩하는 RNA 분자를 또한 포함한다.
발현카세트(Exprision Cassette): 발현카세트는 유기체에서 대상 뉴클레오티드 서열을 발현시키기에 적합한 구조체를 의미한다. 발현은 기능성 산물의 생성을 의미한다. 본 발명에서 뉴클레오티드 서열의 발현은 RNA를 단백질 전구체 또는 성숙한 단백질로 번역하는 것을 의미할 수 있다. 발현카세트는 번역될 수 있는 RNA (예, mRNA)일 수 있다. 발현카세트는 서로 다른 소스로부터 유래될 수 있는 대상 뉴클레오티드 서열 및 조절 서열, 또는 동일한 소스로부터 유래되지만 통상 천연적으로 발견되는 방식과는 다른 방식으로 정렬된 대상 뉴클레오티드 서열 및 번역 조절 서열을 포함할 수 있다.
오픈 리딩 프레임(Open reading frame, orf): 일반적으로 펩타이드 또는 단백질로 번역될 수 있는 여러 뉴클레오타이드 트리플렛(triplets, codon)의 서열일 수 있다. 오픈 리딩 프레임은 이의 5'말단 및 보통 다중 3개 뉴클레오타이드 길이를 나타내는 후속 영역(subsequent region)에 바람직하게는 시작 코돈, 즉, 보통 아미노산 메티오닌을 코딩하는 이후의 세 뉴클레오타이드의 조합(ATG 또는 AUG)을 함유한다. ORF는 바람직하게는 정지-코돈(예를 들어, TAA, TAG, TGA)에 의하여 종결된다. 일반적으로, 이는 오직 오픈 리딩 프레임의 정지-코돈이다. 따라서, 본 발명에서 오픈 리딩 프레임은 바람직하게는 시작 코돈(예를 들어, ATG 또는 AUG)으로 시작하고 바람직하게는 정지 코돈(예를 들어, TAA, TGA, 또는 TAG 또는 UAA, UAG, UGA, 각각)으로 종결되는 3으로 나뉘어질 수 있는 다수의 뉴클레오타이드로 이루어지는 뉴클레오타이드 서열이다. 오픈 리딩 프레임은 분리될 수 있거나 더 긴 핵산 서열, 예를 들어 벡터 또는 mRNA에 포함될 수 있다. 오픈리딩 프레임은 또한 "단백질 코딩 영역"으로 불리울 수 있다.
바이시스트로닉 RNA, 멀티시스트로닉 RNA(Bicistronic RNA, multicistronic RNA): 바이시스트로닉 또는 멀티시스트로닉 RNA는 일반적으로 두 개의(바이시스트로닉) 또는 그 이상의(멀티시스트로닉) 오픈 리딩 프레임(ORF)를 가질 수 있는 RNA, 바람직하게는 mRNA 이다. 오픈 리딩 프레임은 펩타이드 또는 단백질로 번역될 수 있는 코돈의 서열이다.
핵산 분자의 서열: 핵산 분자의 서열은 일반적으로 특정하고 개별적인 순서, 즉 이의 뉴클레오타이드의 연속인 것으로 이해된다. 단백질 또는 펩타이드의 서열은 일반적으로 순서, 즉, 이의 아미노산의 연쇄(succision)인 것으로 이해된다.
서열 상동성: 둘 이상의 서열은 만약 그들이 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 동일한 길이 및 순서를 나타낸다면 동일하다(상동성이 있다). 상동성의 백분율은 일반적으로 두 서열이 동일한 정도를 설명하며, 즉, 이는 일반적으로 그들의 서열 위치가 참조 서열(reference sequence)의 뉴클레오타이드와 상응하는 뉴클레오타이드의 백분율을 설명한다. 동일의 정도를 결정하기 위하여, 비교되는 서열은 동일한 길이, 즉, 비교될 서열의 가장 긴 서열의 길이를 나타내는 것으로 간주된다. 이는 8개 뉴클레오타이드로 이루어진 첫 번째 서열은 첫 번째 서열을 포함하는 10개 뉴클레오타이드로 이루어진 두 번째 서열과 80% 동일한 것을 의미한다. 다시 말하면, 본 발명에서, 서열의 동일은 바람직하게는 동일한 길이를 가지는 둘 이상의 서열에서 동일한 위치를 가지는 서열의 뉴클레오타이드의 백분율과 관련된다. 갭(gap)은 보통 정렬에서 이들의 실제 위치와 관계없이, 비-동일 위치로 간주된다.
안정화된 핵산 분자: 안정화된 핵산 분자는 변형 없는 핵산 분자보다, 예를 들어, 환경적 인자 또는 엑소- 또는 엔도뉴클레아제와 같은 효소 분해에 의한 붕괴(disintegration) 또는 분해(degradation)에 더 안정한, 그렇게 화학적 변형된 DNA 또는 RNA 분자이다. 본 발명에서, 안정화된 핵산 분자는 원핵 또는 진핵 세포, 인간 세포와 같은 포유동물 세포와 같은 세포에서 안정화된다. 안정화 효과는 또한 세포의 외부, 예를 들어, 버퍼 용액 등에서, 예를 들어, 안정화된 핵산 분자를 포함하는 약학적 조성물을 제조하는 공정에서 발휘될 수 있다.
이종 서열(Heterologous sequence): 일반적으로 두 서열은, 그들이 동일한 유전자로부터 이끌어낼 수 있는 것이 아니라면, '이종(heterologous)'으로 이해된다. 즉, 이종 서열은 동일한 유기체(organi)로부터 이끌어낼 수 있을 수 있지만, 그들은 동일한 mRNA에서와 같이, 동일한 핵산에서 자연적으로(자연에서) 발생하지 않는다.
G/C 화학적 변형: G/C-화학적 변형된 핵산은 일반적으로 바람직하게는 야생형 서열과 비교하여 증가된 수의 구아노신 및/또는 사이토신 뉴클레오타이드를 포함하는 화학적 변형된 야생형 서열에 기반한, 바람직하게는 RNA 분자일 수 있다. 이러한 증가된 수는 구아노신 또는 사이토신 뉴클레오타이드를 함유하는 코돈에 의해 아데노신 또는 티미딘 뉴클레오타이드를 함유하는 코돈의 치환에 의해 생성될 수 있다. 풍부한 G/C 함량이 DNA 또는 RNA의 코딩 영역에 발생하면, 이는 유전적 코드의 퇴화(degeneracy)를 사용한다. 따라서, 코돈 치환은 바람직하게는 코딩된 아미노산 잔기를 변형하지 않지만, 오로지 핵산 분자의 G/C 함량을 증가시킨다.
참조 RNA(Unmodified reference RNA): 자연에 존재하는 것과 같은 야생형 RNA 서열에 상응하는 RNA. 예를 들어, 비화학적 변형된 참조 mRNA는 자연적으로 발생하는 뉴클레오타이드를 포함하는 mRNA 서열에 상응하며, 자연적으로 발생하는 변형, 및/또는 자연적으로 발생하는 비번역 영역을 포함하는 뉴클레오타이드를 포함하고, 예컨대, 자연적으로 발생하는 5'캡(CAP) 구조 m7GpppN, 만약 자연적으로 발생하는 mRNA 서열에 존재한다면, 선택적으로 자연적으로 발생하는 5'UTR을 포함하고, 만약 자연적으로 발생하는 mRNA 서열 및 대략 30개 아데노신을 갖는 폴리 A 서열에 존재한다면, 야생형 오픈 리딩 프레임은, 선택적으로 자연적으로 발생하는 3'UTR을 포함한다.
"폴리(A) 서열" 또는 "폴리(A) 꼬리"는 전형적으로 RNA 분자의 3'-말단에 위치하는 연속되거나 중단된 아데닐레이트 잔기 서열을 지칭한다. 연속적인 서열은 연속적인 아데닐레이트 잔기를 특징으로 한다. 사실상, 연속적인 폴리(A) 서열이 전형적인 것이다. 폴리(A) 서열은 전사 후 주형-독립적 RNA 중합효소에 의해 RNA의 자유 3'-말단에 세포 핵에서 진핵세포 전사 중에 부착되지만, 통상적으로 진핵세포 DNA에서 암호화되지 않은 반면, 본 발명은 DNA에 의해 코딩된 폴리(A) 서열을 포함한다.
"주형 RNA"는 RNA 의존성 RNA 중합효소에 의해 전사되거나 복제될 수 있는 RNA를 지칭한다.
단백질: 본 발명에서 일반적으로 사용하는 단백질과 본 발명에서 발현하고자하는 단백질을 표적단백질로 지칭하고 두 용어는 거의 동의어로 사용하고 있으며, 일반적으로 단백질은 하나 이상의 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 일반적으로 단백질은 생물학적 기능을 발휘하는 단백질을 위해 요구될 수 있는 3차원 형태로 접힌다.
펩타이드: 일반적으로 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 연결된 아미노산 단량체의 폴리머이다. 이는 일반적으로 50 단량체 단위 미만으로 함유한다. 그렇지만, 용어 펩타이드는 50 단량체 단위를 초과하여 갖는 분자를 위한 권리를 포기하는 것은 아니다. 긴 펩타이드는 폴리펩타이드라고도 불리우며, 일반적으로 50 ~ 600 단량체 단위를 갖는다.
단백질의 절편 또는 부분: 본 발명에서, 단백질의 절편 또는 부분은 일반적으로 단백질의 아미노산 서열의 연속적인 부분에 상응하는 펩타이드로 이해될 수 있으며, 바람직하게는 약 6 ~ 약 20개 또는 그 이상의 아미노산의 길이를 가지고, 예를 들어, MHC 클래스 I 분자에 의하여 가공되고 제시되는 부분, 바람직하게는 약 8 ~ 약 10개 아미노산의 길이를 가지는, 예를 들어, 8, 9, 또는 10개, (또는 11, 또는 12개 아미노산도), 또는 MHC 클래스 II 분자에 의하여 가공 및 제시되는 절편, 바람직하게는 약 13개 또는 그 이상의 아미노산, 예를 들어, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 아미노산의 길이를 가지며, 여기서 이들 절편은 아미노산 서열의 임의의 부분으로부터 선택될 수 있다. 이들 절편은 일반적으로 펩타이드 절편 및 MHC 분자로 이루어지는 복합체의 형태로 T 세포에 의하여 인지될 수 있고, 즉 절편은 일반적으로 그들의 천연 형태로 인지되지 않는다. 본원에 정의된 바와 같은 단백질의 절편 또는 부분은 또한 이들 단백질의 에피토프 또는 기능부(functional site)를 포함할 수 있다. 단백질의 절편 또는 부분은 항원, 특히 면역원, 예를 들어 항원 결정기(또한 '에피토프'로 불리우는)이거나 항원 특성(antigenic characteristics)을 갖고, 적응 면역 반응을 유도한다. 따라서, 단백질 또는 펩타이드의 절편은 적어도 하나의 이들 단백질 또는 펩타이드의 에피토프를 포함할 수 있다. 게다가 또한, 단백질의 도메인(domain)은, 세포 외 도메인, 세포 내 도메인 또는 막관통 도메인(transmembrane domain) 및 단백질의 짧거나 절단된 버전(versions)과 같이 단백질의 절편을 포함하는 것으로 이해될 수 있다.
키메라 효소: 키메라 효소는 자연에서 발견되는 천연 효소가 아닌 효소를 지칭한다. 따라서, 키메라 효소는, 자연에서 발견된 것과는 상이한 방식으로 배열된, 상이한 공급원(예: 상이한 효소)으로부터 유래된 촉매 도메인 또는 동일한 공급원(예: 동일한 효소)으로부터 유래된 촉매 도메인을 포함할 수 있다. 키메라 효소는 단량체성(즉, 단일 단위) 효소 뿐만 아니라 올리고머성(즉, 복수 단위) 효소, 특히 헤테로-올리고머성 효소를 포함한다. 단량체성 효소는 단지 하나의 폴리펩티드 쇄로 이루어진 단일-단위 효소와 관련된다.
면역자극성 RNA: 본 발명에서 면역자극성 RNA(isRNA)는 일반적으로 선천적 면역 반응을 유도할 수 있는 RNA 일 수 있다. 이는 일반적으로 오픈 리딩 프레임을 갖지 않으며, 따라서 펩타이드-항원 또는 면역원을 제공하지 않으나, 예를 들어, 톨-유사-수용체(TLR) 또는 다른 적합한 수용체의 특정한 종류에 결합에 의한 선천적 면역 반응을 유발한다. 그러나 물론, 또한 오픈 리딩 프레임을 가지며 펩타이드/단백질을 코딩하는 mRNA는 선천적 면역 반응을 유도할 수 있으며, 따라서 면역자극성 RNA 일 수 있다.
면역 시스템: 면역 시스템은 유기체를 감염으로부터 보호할 수 있다. 만약 병원체가 유기체의 물리적 장벽을 뚫고 유기체로의 침입에 성공하면, 선천적 면역 시스템은 즉시, 단 비-특이적인 반응을 제공한다. 만약 병원체가 이러한 선천적 반응을 회피하면, 척추동물은 보호의 두번째 층, 적응 면역 시스템을 갖는다. 여기에 면역 시스템은 병원체의 이의 인식을 증가시키기 위해 감염 동안 이의 반응을 맞춘다. 이러한 증진된 반응은 면역학적 기억의 형태로, 이후 병원체가 소멸된 이후에 남고, 이 병원체와 맞닥뜨릴 때마다 빠르고 강력한 공격을 시작하는 적응 면역 시스템을 허용한다. 이에 따라, 면역 시스템은 선천적 및 적응 면역 시스템을 포함한다. 이들 두 부분의 각각은 소위 체액성 및 세포성 성분을 함유한다.
적응 면역 시스템: 적응 면역 시스템은 본질적으로 병원체 성장을 제거 또는 억제하는 역할을 한다. 이는 일반적으로 특이적 병원체(면역을 발생시키는)를 인식 및 기억하고 병원체를 맞닥뜨릴 때마다 강한 공격을 시작하는 능력을 갖는 척추동물 면역 시스템을 제공함으로써 적응 면역 반응을 조절한다. 시스템은 체세포 초돌연변이(somatic hypermutation)(가속된 체세포 돌연변이의 과정), 및 V(D)J 재조합(항원 수용체 유전자 부분의 비가역적 유전적 재조합)으로 인해 적응력이 매우 높다. 이러한 메커니즘은 이후 각 개별적인 림프구에 독특하게 발현된 이후, 다른 항원 수용체의 방대한 수를 발생시키는 유전자의 소수를 허용한다. 유전자 재배열은 각 세포의 DNA에 비가역적 변형을 일으키기 때문에, 수명이 긴 특이적 면역에 대해 핵심(key)인 기억 B 세포 및 기억 T 세포를 포함하는, 그 세포의 자손(progeny)(후손(offspring)) 모두는 이후 동일한 수용체 특이성을 코딩하는 유전자를 상속할 것이다.
선천적 면역 시스템: 일반적으로, 비-특이적(또는 불특이적) 면역 시스템으로도 알려진 선천적 면역 시스템은 비특이적 방식에 다른 유기체에 의한 감염으로부터 숙주를 방어하는 세포 및 메커니즘을 포함한다. 이는 선천적 면역 시스템의 세포는 일반적인 방법으로 병원체를 인식 및 반응하지만, 적응 면역 시스템과는 다르게 숙주에 오래 지속되거나 방어적 면역을 부여하지 않는 것을 의미한다. 선천적 면역 시스템은 예를 들어, 톨-유사 수용체(TLRs) 또는 리포폴리다당류(lipopolysaccharide), TNF-알파, CD40 리간드, 또는 사이토카인, 모노카인(monokini), 림포카인(lymphokini), 인터루킨(interleukins) 또는 케모카인(chemokini), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-베타, TNF-알파, 성장 인자, 및 hGH, 인간 톨-유사 수용체 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10의 리간드, 쥣과(murine) 톨-유사 수용체 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 또는 TLR13의 리간드, NOD-유사 수용체의 리간드, RIG-I 유사 수용체의 리간드, 면역 자극성 핵산, 면역 자극성 RNA(isRNA), CpG-DNA, 항생제, 또는 항바이러스제와 같은 다른 보조(auxiliary) 물질에 의해 활성화될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 이러한 물질을 포함할 수 있다. 일반적으로, 선천적 면역 시스템의 반응은 사이토카인으로 불리는 특수한 화학 조절자를 포함하는, 화학적 인자의 생산을 통해, 감염의 부위에 면역 세포를 모으는 것(recruiting); 보체 연쇄(cascade)의 활성화; 특수한 백혈구 세포에 의해 기관, 조직, 혈액 및 림프 내에 존재하는 외래 물질의 선별 및 제거; 적응 면역 시스템의 활성화; 및/또는 감염성 제제에 물리적 및 화학적 장벽으로서 활동하는 것을 포함한다.
면역 반응: 면역 반응은 일반적으로 특정한 항원에 대한 적응 면역 시스템의 특이적 반응(소위, 특이적 또는 적응 면역 반응) 또는 선천적 면역 시스템의 비특이적 반응(소위, 비특이적 또는 선천적 면역 반응), 또는 이들의 조합일 수 있다.
적응 면역 반응: 적응 면역 반응은 일반적으로 면역 시스템의 항원-특이적 반응으로 이해된다. 항원 특이성은 특이적 병원체 또는 병원체-감염된 세포에 맞춰진 반응의 발생을 허용한다. 이들 맞춰진 반응을 시작하는 능력은 "기억 세포"에 의해 체내에 유지된다. 병원체가 인체를 한번 이상 감염해야 하고, 이들 특이적 기억 세포는 이를 빠르게 제거하는데 사용된다. 적응 면역 반응의 첫 번째 단계는 항원 제시 세포에 의한 항원 특이적 면역 반응을 유도할 수 있는 순수한 항원 특이적 T 세포 또는 상이한 면역 세포의 활성화이다. 이는 순수한 T 세포가 지속적으로 지나는 림프 조직 및 기관 내에서 발생한다. 항원 제시 세포로 제공될 수 있는 세 가지 세포 유형은 수상돌기세포, 대식세포, 및 B 세포이다. 이들 세포 각각은 면역 반응을 유도하는데 뚜렷한 기능을 갖는다. 수상돌기세포는 그들이 성숙 수상돌기세포로 분화하는 곳에서 식균작용(phagocytosis) 및 미세포음작용(micropinocytosis)에 의해 항원을 흡수할 수 있고, 예를 들어 국소 림프 조직에 외래 항원을 이동시킴과 함께 접촉에 의해 자극될 수 있다. 대식세포는 박테리아와 같은 입자 항원을 섭취하고 MHC 분자를 발현하는 감염성 제제 또는 다른 적절한 자극에 의해 유도된다. 그들의 수용체를 통해 용해성 단백질 항원을 결합 및 내재화하는 B 세포의 특수한 능력은 T 세포를 유도하는데 또한 중요할 수 있다. MHC 분자는 일반적으로 T 세포에 항원을 제시하는 역할을 한다. MHC 분자에 항원의 제시는 무장하는 이펙터 T 세포 내로 그들의 증식 및 분화를 유도하는 T 세포의 활성화를 일으킨다. 이펙터 T 세포의 가장 중요한 기능은 함께 세포-매개 면역을 일으키는 CD8+ 세포독성 T 세포에 의해 감염된 세포의 사멸 및 Th1 세포에 의한 대식세포의 활성화, 및 그에 따라 체액성 면역 반응을 일으키는, 상이한 종류의 항체를 생산하는 Th2 및 Th1 모두에 의한 B 세포의 활성화이다. T 세포는 항원을 직접적으로 인식 및 결합하지 못하는 그들의 T 세포 수용체에 의해 항원을 인식하지만, 그러나 대신 다른 세포의 표면에 MHC 분자에 결합하는, 예를 들어 병원체 유래 단백질 항원, 예를 들어 소위 에피토프(epitope)의 짧은 펩타이드 절편을 인식한다.
세포 면역/세포 면역 반응: 세포 면역은 일반적으로 대식세포, 자연 살상 세포(natural killer cells, NK), 항원 특이적 세포독성 T-림프구의 활성화, 및 항원에 반응하는 다양한 사이토카인의 방출과 관련된다. 보다 일반적인 방식으로, 세포 면역은 항체뿐만 아니라 면역 시스템의 세포의 활성화에 기반하지 않는다. 일반적으로, 세포 면역 반응은 예를 들어, 그들의 표면에 외래 항원의 에피토프(epitopi)를 보이는 세포, 예를 들어, 수상돌기세포 또는 다른 세포와 같은 특이적 면역 세포 내에서 세포 사멸을 유도할 수 있는 항원 특이적 세포독성 T-림프구의 활성화로 특징될 수 있다. 이러한 세포는 바이러스 감염되거나 세포 내 박테리아에 감염되거나, 종양 항원을 보이는 암세포일 수 있다. 또한, 특징은 병원체를 파괴할 수 있는 대식세포 및 자연 살상 세포의 활성화 및 적응 면역 반응 및 선천적 면역 반응에 포함된 다른 세포의 기능에 영향을 주는 다양한 사이토카인을 방출하는 세포의 자극일 수 있다.
면역원: 본 발명에서, 면역원은 일반적으로 면역 반응을 자극할 수 있는 화합물로 이해될 수 있다. 바람직하게, 면역원은 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질이다. 본 발명의 면역원이란 의미는 제공된 핵산 분자, 바람직하게 본원에 정의된 바와 같은 핵산 분자의 번역의 산물이다. 일반적으로, 면역원은 적어도 적응 면역 반응을 이끌어낸다.
항원: 항원은 일반적으로 면역 시스템에 의해 인지될 수 있고, 적응 면역 시스템에 의해, 예를 들어 적응 면역 반응의 일부로써 항체 및/또는 항원 특이적 T 세포의 형성을 통해, 항원 특이적 면역 반응을 유발할 수 있는 물질을 말한다. 일반적으로, 항원은 T 세포에 MHC에 의해 제시될 수 있는 펩타이드 또는 단백질일 수 있거나 포함할 수 있다.
에피토프(Epitope): 에피토프(또한 "항원 결정요인"으로 불리우는)는 T 세포 에피토프 및 B 세포 에피토프로 구별할 수 있다. T 세포 에피토프 또는 단백질의 일부는 약 6 ~ 약 20개 또는 그 이상의 아미노산의 길이를 가지는 절편을 포함할 수 있으며, 예를 들어 MHC 클래스 I 분자에 의해 가공되고 제시된 절편, 약 8 ~ 약 10개 아미노산, 예를 들어 8, 9, 또는 10개, (또는 11개, 또는 12개 아미노산도)의 길이를 갖는, 또는 MHC 클래스 II 분자에 의해 가공되고 제시된 절편, 약 13개 또는 그 이상의 아미노산, 예를 들어 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 아미노산의 길이를 가질 수 있고, 여기서, 이들 절편은 아미노산 서열의 임의의 일부로부터 선택될 수 있다. 이들 절편은 일반적으로 펩타이드 절편 및 MHC 분자로 이루어진 복합체의 형태로 T 세포에 의해 인식되고, 즉 절편은 일반적으로 그들의 천연 형태로 인식되지 않는다. B 세포 에피토프는 일반적으로 항체에 의해 인식될 수 있는, 즉 그들의 천연 형태에서, 5 ~ 15개 아미노산, 5 ~ 12개 아미노산, 또는 6 ~ 9개 아미노산을 갖는, (천연) 단백질 또는 펩타이드의 외부 표면에 위치하는 절편이다.
이러한 단백질 또는 펩타이드의 에피토프는 이러한 단백질 또는 펩타이드의 다양한 변이체로 부터 선택될 수 있다. 항원 결정기(antigenic determinants)는 단백질 또는 펩타이드의 부분으로 구성된 배좌 또는 불연속적인 에피토프일 수 있고, 그러나 단일 폴리펩타이드 사슬로 구성된 3차원 구조 또는 연속적 또는 선형 에피토프와 합칠 수 있다.
어쥬번트/어쥬번트 성분(Adjuvant/adjuvant component): 넓은 의미의 어쥬번트 또는 어쥬번트 성분은 일반적으로 변형할 수 있는 약리학적 및/또는 면역학적 제제이며, 예를 들어, 약물 또는 백신과 같은 다른 제제의 효과를 향상시킨다. 이는 넓은 의미로 해석되어야 하고 물질의 넓은 스펙트럼을 나타낸다. 일반적으로, 이들 물질은 항원의 면역원성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 어쥬번트 선천적 면역 시스템에 의해 인식될 수 있고, 예를 들어, 선천적 면역 시스템을 유발할 수 있다. "어쥬번트"는 일반적으로 적응 면역 반응을 유발하지 않는다. 그 범위에서, "어쥬번트"는 항원으로서 자격을 갖추고 있지 않다. 그들의 행동 방식은 적응 면역 반응의 결과로 항원에 의해 유발된 효과와 구별된다.
"일시적인 형질전환" 또는 형질주입은 핵산 분자 또는 단백질이 세포에 도입되어, 외인성 유전자가 안정적으로 유전되지 않으면서 그 기능을 수행하는 것을 의미한다. 일시적인 형질전환의 경우, 외인성 핵산 서열이 게놈에 삽입되지 않는다.
형질전환(Transfection): 형질전환은 핵산 분자, DNA 또는 RNA(예를 들어, mRNA) 분자의 세포, 바람직하게는 진핵 세포 내로의 도입을 말한다. 본 발명에서, 형질전환은 세포, 포유동물 세포(mammalian cell)와 같은 진핵 세포 내로 핵산 분자를 도입하는 통상의 기술자에게 알려진 임의의 방법을 포함한다. 이러한 방법은, 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 예를 들어, 양이온성 지질 및/또는 리포좀(liposome)에 기반한 리포펙션(lipofection), 칼슘 포스페이트 침전(calcium phosphate precipitation), 나노입자 기반의 형질전환, 바이러스 기반의 형질전환, 또는 DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민 등과 같은 양이온성 화합물에 기반한 형질전환을 포함한다. 도입은 비-바이러스성이다.
담체/폴리머 담체: 담체는 일반적으로 또 다른 화합물(cargo)의 수송 또는 복합화를 용이하게 하는 화합물일 수 있다. 폴리머 담체는 일반적으로 폴리머를 형성하는 담체이다. 담체는 이의 화물과 공유 또는 비-공유 상호작용에 의하여 연관될 수 있다. 담체는 표적 세포 내로 핵산, 예를 들어, RNA 또는 DNA를 수송할 수 있다. 담체는 양이온성 성분일 수 있다.
비히클(Vehicle): 비히클은 일반적으로 약학적 활성 화합물과 같은 화합물을 저장, 운반, 및/또는 투여하기 위한 적절한 물질로 이해된다. 예를 들어, 이는 약학적 활성 화합물을 저장, 운반 및/또는 투여하기 위한 적절한 생리학적으로 허용가능한 지질일 수 있다.
약학적 유효량(Pharmaceutically effective amount): 본 발명에서, 약학적 유효량은 일반적으로 발현된 펩타이드 또는 단백질의 병리학적 수준을 대체하는, 또는 결여 유전자 산물(lacking gene product)을 치환하는, 예를 들어, 병리학적 상황의 경우에 면역 반응과 같은 약학적 효과를 유도하기 위하여 충분한 양으로 이해된다.
백신: 백신은 일반적으로 적어도 하나의 항원, 면역원을 제공하는 예방 또는 치료 물질로 이해된다. 항원 또는 면역원은 백신 접종에 적절한 임의의 물질로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 항원 또는 면역원은 박테리아 또는 바이러스 입자(particli) 등과 같은 병원체로부터, 또는 종양 또는 암 조직으로부터 유래될 수 있다. 항원 또는 면역원은 적응 면역 반응을 제공하기 위하여 신체의 적응 면역 시스템을 자극한다.
유전적 백신 접종: 유전적 백신 접종은 일반적으로 항원 또는 면역원 또는 이들의 절편을 코딩하는 핵산 분자의 투여에 의한 백신 접종으로 이해될 수 있다. 핵산 분자는 개체의 신체 또는 개체의 분리된 세포에 투여될 수 있다. 신체의 특정 세포의 형질전환에 따라, 또는 분리된 세포의 형질전환에 따라, 항원 또는 면역원은 그들 세포에 의해 발현될 수 있고 이후에 적응, 즉 항원-특이적 면역 반응을 유발하는 면역 시스템에 제시될 수 있다. 따라서, 유전적 백신 접종은 일반적으로 a) 핵산, RNA 분자를 개체에, 환자에게, 또는 생체 내(in vivo)/생체 외(ex vivo) 또는 시험관 내(in vitro) 환자의 세포의 형질전환을 보통 초래하는 개체, 환자의 분리된 세포에 투여; b) 도입된 핵산 분자의 전사 및/또는 번역; 및 선택적으로 c) 핵산이 직접 환자에게 투여되지 않았다면, 개체, 환자에게 분리된, 형질전환된 세포의 재투여의 단계 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
Ⅰ. RNA 발현카세트
mRNA는 단백질 정보를 암호화하는 DNA의 전사와 세포질의 리보솜에 의한 단백질 생산과정 사이를 연결하는 중간 매개체이다. 현재까지 RNA 발현카세트의 두 가지 주요 유형은 비복제형 mRNA (non-replicating mRNA)와 바이러스에서 유래된 자가 증폭형 RNA (self-amplifying RNA)가 있다. 비복제형 mRNA 기반 발현카세트는 5' 와 3' 말단에 비번역구간(untranslational region, UTR)을 포함하는 반면에, 자가 증폭형 RNA는 항원뿐만 아니라 세포 내 RNA 증폭 및 풍부한 단백질 발현을 가능하게 하는 바이러스 복제 기작을 갖고 있다.
치료제 목적을 위한 최적의 시험관 내 전사를 위해서 본 발명의 RNA 발현 키세트는 T7, T3 또는 Sp6 파지(phage) RNA 중합 효소(polymerase)를 사용하여 선형 DNA 주형(linear DNA template)으로부터 제조할 수 있다. 이렇게 만들어진 RNA 발현카세트는 카세트의 안정성 및 발현의 효율성이 향상되도록 표적 단백질을 암호화하고 있는 Open reading frame, UTR, 5'Cap과 다중 아데노신 꼬리 서열(poly (A) tail)을 갖고 있는 개선된 형태를 선호한다. 따라서 이렇게 제작된 RNA 발현카세트는 완전히 성숙한 자연적인 mRNA 분자와 유사하며 진핵세포의 세포질에 자연적으로 존재할 수도 있다.
5' 및 3'UTR은 주로 cis 조절 요소라고 통칭하는 서열 및 구조적 모티프와 RNA 결합 단백질(RBP) 또는 작은 RNA 전달 인자 간의 동적 상호 작용을 통해 기능을 하고 있다. 그들은 함께 특정 mRNA의 대사와 번역을 조정하여 세포 단백체를 형성할 수 있도록 한다. 5'UTR에서 시스 요소의 예는 5'-말단 올리고-피리미딘 모티프(5’-terminal oligo-pyrimidine, 5'TOP) motif, 피리미딘이 풍부한 번역 요소(pyrimidine-rich translational element, PRTE) 또는 TOP- 유사 서열(TOP-like sequence), 시토신이 풍부한 번연의 조절인자(cytosine-enriched regulator of translation, CERT), G-quadruplex 구조(G-quadruplex structure), 및 진핵 개시 인자 3결합 줄기 루프 구조(eukaryotic initiation factor 3 (eIF3)-binding stem-loop structure) 등이다. 이러한 각 요소는 mRNA의 하위 집합에 존재하여 선별된 유전자 네트워크의 표적 제어를 가능하게 한다.
mRNA 치료제 유용성에 대한 가장 큰 장벽은 세포 내 전달이다. 향상된 치료 성적을 달성하기 위해, mRNA는 생체외에서 형질전환에 사용되는 수지상 세포로 전기 천공할 수 있다. 이 전략은 여러 임상 시험에 적용되었다. 그러나, 형질전환은 힘들고, 확장하기 어렵고, 불리한 면역원성을 유발할 수 있다. 따라서, 본 분야는 지질 또는 중합 체계 물질을 사용하여보다 효율적이고 잠재적으로 덜 독성인 mRNA 담체를 개발하고자하고 있다.
생체 내 전달(In vivo delivery)을 위한 mRNA의 복합체에 대해서도 최근에 많이 개발되고 있다. naked mRNA(단백질과 같은 물질로 둘러싸여 있지 않는 RNA 분자 자체)는 세포 외 RNA 분해효소(RNases)에 의해 빨리 분해되고 효과적으로 세포 안으로 들어가지 못 한다. 따라서, mRNA의 세포 흡수를 촉진하고 분해로부터 mRNA를 보호하는 다양한 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 형질주입(transfection) 기술이 개발되었다. 일단 mRNA가 세포질로 이동하면 번역 후 변형 (post-translational modification)을 거친 단백질을 생성하여 최적으로 접히고(3차 구조를 형성하고) 완전히 기능하는 단백질을 생성한다. 시험관 내 전사 mRNA는 정상적인 생리적 과정에 의해 최종적으로 분해되어 대사산물 독성의 위험이 적다.
바이러스에서 유래한 UTR을 원하는 타켓 유전자를 발현하는데 사용하는 대신에 사람 세포 유래 mRNA의 UTR 부분을 활용하여 RNA 백신 플랫폼을 개발하는 시도도 있다. 독일 CureVac 회사에서는 다양한 리보소옴(ribosome) 단백질 UTR을 활용한 플랫폼을 개발하고 있다. 예를 들면 5' 말단 oligopyrimidine tract이 없는 human ribosomal large protein의 5'UTR, human ribosomal protein의 3'-UTR, 64개의 poly A, 30개의 cytidylates를 가진 poly C 및 histone stem-loop 서열을 이용한 RNA 플랫폼을 개발하였다.
화학적 변형 및 서열 공학은 합성 mRNA 백신의 번역 및 저장 수명 둘 다를 향상시켰다.
본 발명의 RNA 발현카세트는 비증폭 mRNA(non-amplifying mRNA) 구조체와 자가 증폭 mRNA(self-amplifying mRNA) 구조체를 포함한다.
1. 비증폭 mRNA 구조체
비증폭 mRNA(non-amplifying mRNA) 구조체는 mRNA의 기본 구조를 포함하며, 원하는 항원을 암호화하는 오픈 리딩 프레임(ORF)이 있다.
비증폭 mRNA 구조체의 주요 특성은 (1) 자가 증폭 mRNA와 비교하여 비교적 작은 크기의 mRNA (2~3 대 약 10 kb); (2) 추가 단백질의 부재 (바이러스와 관련) 숙주와의 원치않는 면역 원성 상호 작용을 유발할 가능성을 최소화하는 시스템; (3) 확장 및 제조가 비교적 용이하여, 확산이 발생할 경우 신속한 사용이 가능하다. 그리고 (4) 백신 성능을 향상시키고 표적외 효과를 최소화하기 위한 용이한 유전공학 기술 등이다.
RNA 치료제의 가장 단순한 형태의 구조인 naked RNA 치료제는 양 끝에 짧은 5'-UTR 부위와 3'-UTR 부위가 있고 그 사이에 발현하고자 하는 단백질(표적단백질)의 유전 정보(ORF)가 있다.
이 구조의 장점은 단순성에 있다. 즉 비증폭 mRNA 플랫폼은 단백질 발현 조절에만 관여하는 양 말단의 UTR만 가지고 있고, 이 부분은 단백질 발현이 일어나지 않아 기본적으로는 숙주와 상호 작용하거나 면역 반응에 영향을 미칠 수 없다는 점이다.
따라서 발현을 원하는 가운데의 ORF 부분만 단백질을 발현한다. 그러나 mRNA의 지속적인 발현을 제한하려는 세포의 특성 때문에, 상대적으로 고농도의 RNA 투여가 필요하며, 만일 아무런 변형을 가하지 않은 naked RNA를 면역하면 생체 내에서 일시적이거나 낮은 수준의 발현만 가능할 수도 있다.
본 발명의 RNA 발현카세트는 표적단백질의 발현을 증가시키기 위한 세포내 번역이 가능한 구조를 갖춘 mRNA는 5'UTR, 상기 표적단백질을 코딩하는 RNA; 및 3'UTR;를 포함한다.
1) 세포 번역이 가능한 구조
표적단백질을 발현시키기 위한 표적단백질 mRNA는 5'캡 또는 IRES를 포함하는 5'UTR를 포함할 수 있다.
본 발명의 표적단백질 RNA 발현카세트 및 mRNA 분자는 소위 "5' 캡(CAP)" 구조의 첨가에 의해 변형될 수 있다.
5'캡(cap)은 독립체, 일반적으로 성숙한 mRNA의 5'말단을 "덮는(caps)" 일반적으로 변형 독립체이다. 5'캡(cap)은 일반적으로 변형, 특히 구아닌 뉴클레오타이드의 유도체에 의해 형성될 수 있다. 바람직하게, 5'캡(cap)은 5'5'트리포스페이트 결합을 통해 5'말단에 연결된다. 5'캡(cap)은 메틸화될 수 있으며, 예를 들어, m7GpppN, 여기서 N은 5'캡(cap), 일반적으로 RNA의 5'말단을 운반하는 핵산의 말단 5' 뉴클레오타이드이다. m7GpppN은 폴리머라아제 II에 의해 전사된 mRNA에서 자연적으로 발생하는 5'캡(CAP) 구조이고, 따라서, 본 발명에 따른 mRNA에 포함된 으로서 간주되지 않는다.
본 발명에 따른 mRNA는 5'캡(CAP)으로서 m7GpppN을 포함할 수 있는 것을 의미하지만, 추가적으로 mRNA는 본 원에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 추가의 변형을 포함한다.
표적단백질의 번역이 표적단백질 mRNA 상의 5'캡에 의해 유도된다. 표적단백질 mRNA 상의 5'캡이 표적단백질의 발현뿐만 아니라 시스템 전체의 성능에 매우 긍정적인 영향을 미친다. 트랜스로 코딩된 목적 RNA의 효율적인 생산을 달성할 수 있다.
본 발명의 표적단백질 mRNA는 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 요소를 포함하지 않는다. 일반적으로, 내부 리보솜 진입 부위, 약칭 IRES는 표적단백질 mRNA 서열의 5' 말단과 다른 위치, 예컨대 표적단백질 mRNA 서열의 중앙에서의 위치로부터의 메신저 RNA (mRNA)로부터의 번역 개시를 가능하게 하는 뉴클레오타이드 서열로 mRNA 서열의 중간에 위치한다.
본 발명에서 5'캡으로 IRES의 치환은 표적단백질 mRNA 분자에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 서열에 영향을 미치지 않는 RNA 분자의 특정 변형이다(비-폴리펩티드-서열 개질성 변형). 예를 들어, 진핵세포 메신저 RNA의 경우, 비-폴리펩티드-서열 개질성 변형은 특정 비번역된 영역의 선택, 인트론의 도입, 예를 들어 토끼 베타-글로빈 인트론 II 서열), 또는 코딩 서열의 침묵 변형, 예를 들어 코딩된 폴리펩티드 서열의 변형없이(침묵 변형) 대상 세포 또는 대상 유기체에서 우선 코돈 사용법에 적응하는 것에 의한 것을 포함한다.
본 발명에 해 코딩되는 표적 단백질의 생산은 캡이 표적단백질 mRNA 상에 존재할 때 효율적이다.
진핵세포 mRNA에서 5'캡의 존재는 그 중에서도 특히 mRNA의 핵내 방출 조절과 가공, 특히 5′근위부 인트론 절제의 촉진에서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 본 발명의 표적단백질 mRNA는 전형적으로 핵으로부터 배출되거나 가공될 필요가 없다. 그럼에도 불구하고, 표적단백질 mRNA 상에 5'캡이 존재하는 것이 유리하다.
진핵세포 mRNA의 경우, 5'캡은 또한 일반적으로 mRNA의 효율적인 번역에 관여한다. 일반적으로 진핵세포에서 번역은 IRES가 없는 한 mRNA 분자의 5' 말단에서만 시작된다.
진핵세포는 핵 내 전사 중에 5'캡을 갖는 RNA를 제공할 수 있다. 새로 합성된 mRNA는 통상적으로 전사체가 20 ~ 30개의 뉴클레오타이드의 길이에 도달할 때 5'캡 구조로 변형된다. 먼저, 5'말단 뉴클레오타이드 pppN(ppp는 트리포스페이트를 나타내고, N은 임의의 뉴클레오사이드를 나타냄)은 RNA 5'트리포스파타아제 및 구아닐릴 전이효소 활성을 갖는 캡핑효소에 의해 세포에서 5' GpppN으로 전환된다. 이어서, GpppN은 (구아닌-7)-메틸 전이효소 활성을 갖는 제2 효소에 의해 세포에서 메틸화되어 모노-메틸화된 m7GpppN 캡을 형성할 수 있다.
본 발명에서 사용된 5'캡은 자연성 5'캡이다.
본 발명에서, 자연성 5'캡 디뉴클레오타이드는 전형적으로 비-메틸화 캡 디뉴클레오타이드 (G(5')ppp(5')N; GpppN이라고도 함) 및 메틸화된 캡 디뉴클레오타이드 ((m7G(5')ppp(5')N; m7GpppN이라고도 함)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가적인 5'캡(cap) 구조의 예로는 글리세릴, 역(inverted) 데옥시 무염기 잔기(성분), 4',5' 메틸렌 뉴클레오타이드, 1-(베타-D-에리스로퓨라노실)뉴클레오타이드, 4'-티오 뉴클레오타이드, 카보사이클릭 뉴클레오타이드, 1,5-안하이드로헥시톨 뉴클레오타이드, L-뉴클레오타이드, 알파-뉴클레오타이드, 화학적 변형된 염기 뉴클레오타이드, 트레오-펜토퓨라노실 뉴클레오타이드, 아사이클릭(acyclic) 3',4'-세코(seco) 뉴클레오타이드, 아사이클릭 3,4-디하이드록시부틸 뉴클레오타이드, 아사이클릭 3,5 디하이드록시펜틸 뉴클레오타이드, 3'3'역 뉴클레오타이드 성분, 3'3'역 무염기 성분, 3'2'-역 뉴클레오타이드 성분, 3'2'-역 무염기 성분, 1,4-부탄디올 포스페이트, 3'포스포라미데이트, 헥실포스페이트, 아미노헥실 포스페이트, 3'포스페이트, 3'포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 가교(bridging) 또는 비-가교(non-bridging) 메틸포스포네이트 성분을 포함한다. 이들 화학적 변형된 5'캡(CAP) 구조는 본 발명에 따른 mRNA에 포함된 적어도 하나로 여겨진다.
특히 바람직한 화학적 변형된 5'캡(CAP) 구조는 CAP1(m7G 인접 뉴클레오타이드의 리보오스의 메틸화), CAP2(m7G의 제 2 뉴클레오타이드 다운스트림의 리보오스의 메틸화), CAP3(m7G의 제 3 뉴클레오타이드 다운스트림의 리보오스의 메틸화), CAP4(m7G의 제 4 뉴클레오타이드 다운스트림의 리보오스의 메틸화), ARCA(항-역 캡(CAP) 유사체, 화학적 변형된 ARCA (e.g. phosphothioate modified ARCA), 이노신, N1-메틸-구아노신, 2'-플루오로-구아노신, 7-데아자-구아노신, 8-옥소-구아노신, 2-아미노-구아노신, LNA-구아노신, 및 2-아지도-구아노신이다.
본 발명의 표적단백질 mRNA는 대상세포의 캡핑 장치에 의존하지 않는다. 대상세포 내로 형질주입되는 경우, 본 발명의 표적단백질 mRNA는 전형적으로 세포 핵, 즉 전형적인 진핵세포에서 캡핑이 일어나는 부위에 국한되지 않는 것으로 여겨진다.
종래 기술에서 IRES와 유사하게, 표적단백질 mRNA 상의 5'캡은 표적단백질의 번역 개시를 유발하는데 유용하다. 진핵세포 번역 개시 인자 elF4E는 캡핑된 mRNA를 리보솜과 결합시키는 데 관여하는 것으로 생각될 수 있다. 5'캡의 존재가 성능을 상당히 증가시킨다. 따라서, 본 발명의 표적단백질 mRNA는 5'캡을 포함한다.
5'캡의 존재는 또한 본 발명의 트랜스-복제 시스템에서 예기치 않은 상승적인 효과를 제공한다. 캡핑된 표적단백질 mRNA가 RNA에 대해 트랜스로 제공될 때 캡핑된 표적단백질 mRNA가 목적 단백질의 생산을 유발하는 것이 보다 효율적이다. 따라서, 트랜스로 5'캡 및 복제의 상승 효과, 즉 시스로 복제하는 것보다 우수한 효과가 있다.
본 발명의 캡핑된 RNA는 시험관내에서 제조될 수 있으므로 대상세포의 캡핑 장치에 의존하지 않는다. 시험관내에서 캡핑된 RNA를 형성하는데 가장 빈번하게 사용되는 방법은 모든 4개의 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 캡 디뉴클레오타이드 예컨대 m7G(5')ppp(5')G (m7GpppG라고도 함)의 존재 하에 박테리아 또는 박테리오파지 RNA 중합효소로 DNA 주형을 전사하는 것이다.
RNA 중합효소는 다음 주형 뉴클레오사이드 트리포스페이트 (pppN)의 α-포스페이트에서 m7GpppG의 구아노신 부분의 3'OH에 의한 친핵성 공격으로 전사를 개시하여 중간체 m7GpppGpN (여기서 N은 RNA 분자의 제2 염기이다)를 형성한다. 경쟁하는 GTP-개시된 생성물 pppGpN의 형성은 시험관내 전사 동안 캡 대 GTP의 몰비가 5 ~ 10으로 설정함으로써 억제된다.
5'캡은 5'캡 유사체이다. RNA가 시험관내 전사에 의해 수득되는 경우, 예를 들어 시험관내 전사된 RNA(IVT-RNA)인 경우에 특히 적합하다. 캡 유사체는 초기에 시험관내 전사에 의해 RNA 전사체의 대규모 합성을 용이하게 하기 위해 기술하였다.
이전에 기재된 조작된 복제 시스템과 대조적으로, 본 발명의 표적단백질 mRNA는 바람직하게는 캡 유사체를 포함한다. 따라서, 본 발명의 시스템의 표적단백질의 번역은 바람직하게는 캡 유사체에 의해 유도된다.
이상적으로, 보다 높은 번역 효율 및/또는 생체내 분해에 대한 증가된 내성 및/또는 시험관내 분해에 대한 증가된 내성과 관련된 캡 유사체가 선택된다. 따라서, 본 발명은 임의의 변형을 함유하지 않고 천연 캡 [(m7G(5')ppp(5')G; m7GpppG라고도하며, 시판된 ScriptCap m7G 캡핑 시스템 (Epicentre Biotechnology사에 의해 첨가할 수 있음)]을 포함하는 발현 시스템을 제시하고 있다.
2) 화학적 변형
"RNA 화학적 변형"은 당 변형 또는 염기 변형뿐만 아니라 백본 변형을 포함하는 화학적 변형을 나타낼 수 있다.
본 발명의 화학적 변형 RNA 분자는 뉴클레오타이드 유사체/변형체, 예를 들어, 백본 변형체, 당 변형체 또는 염기 변형체를 함유할 수 있다. 본 발명과 관련된 백본 변형은 본원에 정의된 바와 같은 핵산 분자에 함유된 뉴클레오타이드의 백본의 포스페이트가 화학적으로 변형된 변형이다. 본 발명과 관련된 당 변형은 핵산 분자의 뉴클레오타이드의 당의 변형이다. 더욱이, 본 발명과 관련된 염기 변형은 핵산 분자의 핵산 분자의 뉴클레오타이드 염기 성분의 변형이다. 뉴클레오타이드 유사체 또는 변형체는 바람직하게 전사 및/또는 번역에 적용할 수 있는 뉴클레오타이드 유사체로부터 선택된다.
(1) 당 변형체(Sugar Modifications):
본 발명의 변형 RNA 내로 포함될 수 있는 화학적 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 당 성분에서 화학적 변형될 수 있다. 예를 들어, 2' 하이드록실기(OH)는 상이한 수의 "옥시" 또는 "데옥시" 치환체와 함께 되거나 치환될 수 있다. "옥시" -2'하이드록실기 화학적 변형체의 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 알콕시 또는 아릴옥시(-OR, 예를 들어, R = H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당); 폴리에틸렌글리콜(PEG), -0(CH2CH2o)nCH2CH2OR; 2' 하이드록실이 예를 들어, 메틸렌 다리(methylene bridge)에 의해 동일한 리보오스 당의 4' 탄소에 연결된 "잠금(locked)" 핵산(LNA); 아미노기(-O-아미노, 여기서 아미노기 예를 들어, NRR은 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 디헤테로아릴 아미노, 에틸렌 디아민, 폴리아미노일 수 있다) 또는 아미노알콕시를 포함한다.
"데옥시" 변형체는 하이드로겐, 아미노(예를 들어, NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 디헤테로아릴 아미노, 또는 아미노산); 또는 연결자(linker)를 통해 당에 부착될 수 있는, 여기서 상기 연결자는 원자, C, N 및 O 중 하나 이상의 원자를 포함하는 아미노기를 포함한다.
당기(sugar group)는 또한 리보오스 내 상응하는 탄소와 반대의 입체화학적 배열을 가지는 하나 이상의 탄소를 함유할 수 있다. 따라서, mRNA는 예를 들어, 당으로서 아라비노스를 함유하는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
(2) 백본 변형체(Backbone Modifications):
포스페이트 백본은 또한, 본원에 설명된 바와 같이, 변형 RNA 내로 포함될 수 있는 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드로 변형될 수 있다. 백본의 포스페이트기는 상이한 치환체를 갖는 하나 이상의 산소 원자를 치환함으로써 변형될 수 있다. 또한, 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 본원에 설명된 바와 같은 변형된 포스페이트를 갖는 비화학적 변형된 포스페이트 성분의 총 치환을 포함할 수 있다. 변형된 포스페이트기의 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스테르, 하이드로겐 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스테르를 포함한다. 포스포로티오에이트는 황(sulfur)으로 치환된 모두 비-연결된 산소를 갖는다. 포스페이트 연결자는 또한 연결된 산소가 질소(가교 포스포로아미데이트), 황(가교 포스포로티오에이트) 및 탄소(가교 메틸렌-포스포네이트)의 치환에 의해 될 수 있다.
(3) 염기 변형체(base modifications):
변형 RNA 내로 포함될 수 있는 화학적 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 핵염기 성분(moiety)에서 추가로 될 수 있다. RNA에서 발견되는 핵염기의 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 아데닌, 구아닌, 사이토신 및 우라실이 포함된다. 예를 들어, 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 주홈면(major groove face)에서 화학적으로 될 수 있다. 화학적 변형체는 아미노기, 티올기, 알킬기, 또는 할로기를 포함할 수 있다.
(4) 지질 변형체(Lipid modification):
본 발명의 변형 RNA는 지질 변형을 함유할 수 있다. 이와 같은 지질-변형 RNA는 일반적으로 본원에 정의된 바와 같은 RNA를 포함한다. 본 발명의 지질-변형 RNA 분자는 일반적으로 RNA 분자와 공유결합된 적어도 하나의 연결자, 및 각각의 연결자와 공유결합된 적어도 하나의 지질을 추가적으로 포함한다. 대신에, 지질-변형 RNA 분자는 본원에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 RNA 분자 및 RNA 분자와 (연결자 없이) 공유결합된 적어도 하나의 (2 기능성) 지질을 포함한다. 세 번째 대안에 따라서, 지질-화학적 변형 RNA 분자는 본원에 정의된 바와 같은 RNA 분자, RNA 분자와 공유결합된 적어도 하나의 연결자, 및 각각의 연결자와 공유결합된 적어도 하나의 지질, 및 또한 RNA 분자와 (연결자 없이) 공유결합된 적어도 하나의 (2 기능성) 지질을 포함한다. 지질 변형은 선형 RNA 서열의 말단 끝에 존재하는 것이 특히 바람직하다.
3) 염기서열의 변형
(1) 오픈 리딩 프레임의 변형: G/C 함량의 변형:
본 발명의 mRNA는 적어도 하나의 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는, 코딩 영역의 G/C 함량은 변형되고, 이의 특정 야생형 코딩 영역, 즉, 비변형 코딩 영역의 G/C 함량과 비교하였을 때 특히 증가된다. 코딩 역역의 아미노산 서열은 특정 야생형 코딩 영역의 코딩된 아미노산 서열과 비교하였을 때 변형되지 않는 것이 바람직하다.
본 발명에서 mRNA 코딩 영역의 G/C-함량의 변형은, 번역될 임의의 mRNA 영역의 서열이 mRNA의 효율적인 번역에 중요하다는 사실을 기초로 한다. 따라서, 다양한 뉴클레오타이드의 조성 및 서열은 중요하다. 특히 G(구아노신)/C(사이토신) 함량이 증가된 mRNA 서열은, A(아데노신)/U(우라실) 함량이 증가된 mRNA 서열보다 더욱 안정하다. 본 발명에 따르면, 지속적으로 아미노산 서열로 번역되고 있는 코딩 영역의 코돈은, 이 코돈 중 G/C 뉴클레오타이드의 양이 증가되었다는 점에서 이의 야생형 코딩 영역의 코돈과는 상이하다. 몇몇 코돈은 하나의 동일한 아미노산을 코딩한다는 사실(소위 유전적 암호의 축퇴성(degeneration))에 비추어, 안정성에 가장 유리한 코돈이 결정될 수 있다. 이를 대안적 코돈 선호도(alternative codon usage)라고도 한다.
본 발명에서 mRNA의 코딩 영역에 의해 코딩될 아미노산에 따라서, 이의 야생형 코딩 영역과 비교할 때 RNA 서열, 예를 들어, 코딩 영역의 변형에 대한 다양한 가능성이 존재한다. 오직 G 또는 C 뉴클레오타이드만을 함유하는 코돈에 의해 코딩된 아미노산의 경우, 코돈의 변형은 필요하지 않다. 따라서, A 또는 U가 존재하지 않기 때문에, Pro(CCC 또는 CCG), Arg(CGC 또는 CGG), Ala(GCC 또는 GCG) 그리고 Gly (GGC 또는 GGG)에 대한 코돈은 변형이 필요하지 않다.
대조적으로, A 및/또는 U 뉴클레오타이드를 함유하는 코돈은, 동일한 아미노산을 코딩하지만 A 및/또는 U를 함유하지 않는 다른 코돈의 치환에 의해 변형될 수 있다.
본 발명에서 mRNA의 코딩 영역의 G/C 함량을, 특정 야생형 코딩 영역(즉 원래의 서열)의 G/C 함량에 비해 증가시키기 위해서는, 상기 나열된 치환들은 개별적으로 적용될 수 있거나, 가능한 임의의 조합으로 적용될 수 있다. 따라서, 예를 들어 야생형 서열에서 발생하는 Thr에 대한 모든 코돈은 ACC(또는 ACG)로 변형될 수 있다.
바람직하게 본 발명에서 mRNA의 코딩 영역의 G/C 함량은, 야생형 코딩 영역의 G/C 함량에 비하여 7% 이상, 더욱 바람직하게 15% 이상, 특히 바람직하게 20% 이상 증가된다. 병원성 항체 또는 절편, 이의 변이체 또는 유도체를 포함하는 적어도 하나의 펩타이드 또는 단백질을 하나 이상을 코딩하는 코딩 영역에서 치환 가능한 코돈들 중 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 더욱 더 바람직하게는 80% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 90% 이상, 95% 이상 또는 심지어 100%가 치환되며, 이로써 상기 코딩 영역의 G/C 함량이 증가하게 된다.
특히 바람직하게, 본 발명에서 mRNA의 코딩 영역의 G/C 함량은, 야생형 코딩 영역의 G/C 함량에 비하여 최대값(즉, 치환 가능한 코돈의 100%)만큼 증가할 수 있다.
(2) 코돈 최적화(Codon optimization):
일반적으로 유전 암호의 축퇴는 동일한 코딩 능력을 유지하면서 다른 코돈 (염기 삼중항)에 의해 RNA 서열에 존재하는 특정 코돈(아미노산을 코딩하는 염기 삼중항)을 대체할 수 있게 한다(코돈을 대체하는 것은 대체된 코돈과 동일한 아미노산을 코딩한다).
본 발명에서, RNA 분자에 포함된 오픈 리딩 프레임의 적어도 하나의 코돈은 오픈 리딩 프레임이 유래한 종에서 각각의 오픈 리딩 프레임의 각각의 코돈과 상이하다. 오픈 리딩 프레임의 코딩 서열은 "개조된" 것으로 언급된다.
예를 들어, 오픈 리딩 프레임의 코딩 서열이 변형되는 경우, 빈번하게 사용되는 코돈이 선택될 수 있다. 더욱 빈번하게 사용되는 희귀 코돈의 치환을 포함하여, 핵산 분자의 코딩 서열의 변형을 한다.
코돈 사용의 빈도는 대상세포 또는 대상 유기체에 따라 다르기 때문에, 그러한 유형의 변형은 특정 대상세포 또는 대상 유기체에서의 발현에 핵산 서열을 맞추는 것이 적합하다. 보다 빈번하게 사용되는 코돈은 전형적으로 대상세포 또는 대상 유기체에서 보다 효율적으로 번역되지만, 오픈 리딩 프레임의 모든 코돈의 변형이 항상 필요한 것은 아니다.
예를 들어, 오픈 리딩 프레임의 코딩 서열이 변형되는 경우, G (구아닐레이트) 잔기 및 C (시티딜레이트) 잔기의 함량은 각 아미노산에 대해 가장 풍부한 GC-함량을 갖는 코돈을 선택함으로써 변형될 수 있다. GC가 풍부한 오픈 리딩 프레임을 가진 RNA 분자는 면역 활성을 감소시키고 RNA의 번역 및 반감기를 향상시킬 가능성이 있다.
본 발명에 따른 RNA 발현카세트는 각각 개조될 수 있다.
본 발명에서 mRNA의 적어도 하나의 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 코딩 영역의 추가적인 바람직한 변형은 번역 효율이 세포 내 tRNA의 출현의 상이한 빈도에 의해 또한 결정된다는 발견에 기초한다. 따라서, 만약, 소위 "희귀(rare) 코돈"이 야생형 RNA 서열의 코딩 영역에 증가된 정도로 존재하면, 상대적으로 "빈번한(frequent)" tRNA를 코딩하는 코돈이 존재하는 경우보다 현저히 낮은 정도로 번역된다.
mRNA의 코딩 영역은 바람직하게 상응하는 야생형 코딩 영역과 비교하여 변형되는 결과, 적어도 하나의 세포 내에서 상대적으로 희귀한 tRNA를 코딩하는 야생형 서열의 코돈은, 세포 내에서 상대적으로 빈번한 tRNA를 코딩하고 상대적으로 희귀한 tRNA로서 동일한 아미노산을 운반하는 코돈으로 치환된다. 이러한 변형에 의해, 본 발명의 mRNA의 코딩 영역은 변형되는 결과, 빈번하게 발생하는 tRNA를 이용하기 위한 코돈이 삽입된다. 다시 말해서, 본 발명에 따르면, 이러한 변형에 의해 세포 내에서 상대적으로 희귀한 tRNA를 코딩하는 야생형 코딩 영역의 모든 코돈은 각각의 경우에서 세포 내에서 상대적으로 빈번한 tRNA를 코딩하는 코돈으로 치환될 수 있고, 각각의 경우에서 상대적으로 희귀한 tRNA로서 아미노산을 운반할 수 있다.
어떤 tRNA가 세포 내에서 상대적으로 빈번하게 발생하는지, 그리고 이와는 대조적으로 어떤 tRNA가 상대적으로 희귀하게 발생하는지는 통상의 기술자에게 알려져있다. 특정 아미노산을 위해 사용하는 가장 빈번하게 발생하는 tRNA, 예를 들어, (인간) 세포내에서 가장 빈번하게 발생하는 tRNA를 사용하는 Gly 코돈이 특히 바람직하다.
본 발명의 mRNA의 코딩 영역 내에 특히 최대로 증가된 서열 G/C 함량을, RNA 서열의 코딩 영역에 의해 코딩된 펩타이드 또는 단백질의 아미노산 서열이 변형되지 않은 "빈번한" 코돈과 연관짓는 것이 특히 바람직하다. 특히 효율적으로 번역 및 안정화된(화학적 변형된) RNA 서열을 제공한다.
(3) UTR의 변형
UTR
Untranslated region(UTR)은 전사되지만 아미노산 서열로 번역되지 않는 영역에 관한 것이거나 또는 mRNA 분자와 같은 RNA 분자 내의 상응하는 영역에 관한 것이다. UTR은 ORF의 상류 및/또는 표적단백질를 코딩하는 ORF의 하류에 존재할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 표적단백질 mRNA에서, "3'UTR"은 표적단백질에 대한 코딩영역의 3'에 위치하는 영역에 관한 것이고, "5'UTR" 이는 표적단백질에 대한 코딩영역의 5'에 위치하는 영역에 관한 것이다.
5' 및 3'UTR은 주로 cis 조절 요소라고 통칭하는 서열 및 구조적 모티프와 RNA 결합 단백질(RBP) 또는 작은 RNA 전달 인자 간의 동적 상호 작용을 통해 기능을 한다. 그들은 함께 특정 mRNA의 대사와 번역을 조정하여 세포 단백체를 형성하도록 한다.
5'UTR에서 시스 요소의 예는 5'-말단 올리고-피리미딘 모티프(5'-terminal oligo-pyrimidine, 5'TOP) motif, 피리미딘이 풍부한 번역 요소(pyrimidine-rich translational element, PRTE) 또는 TOP- 유사 서열(TOP-like sequence), 시토신이 풍부한 번연의 조절인자(cytosine-enriched regulator of translation, CERT), G-quadruplex 구조(G-quadruplex structure), 및 진핵 개시 인자 3결합 줄기 루프 구조(eukaryotic initiation factor 3 (eIF3)-binding stem-loop structure) 등이다. 이러한 각 요소는 mRNA의 하위 집합에 존재하여 선별된 유전자 네트워크의 표적 제어를 가능하게 한다.
5'UTR은 존재하는 경우 ORF의 시작코돈의 상류에 유전자의 5' 말단에 위치한다. 5'UTR은 5'캡의 하류, 예를 들어 5'캡 바로 옆에 있다(존재한다면).
5' 및/또는 3'UTR은 ORF와 기능적으로 연결될 수 있어서, 이들 영역이 ORF와 관련되어 안정성 및/또는 상기 ORF를 포함하는 RNA의 번역 효율이 증가된다.
UTR은 RNA의 운반을 이용한 효과적인 운반의 전제 조건인 RNA의 안정성 및 번역 효율에 관여한다. 특정 5' 및/또는 3'UTR을 선택함으로써, 5'캡 및/또는 3' 폴리(A)-꼬리에 관한 구조적 변형 이외에, 둘 모두 개선될 수 있다.
UTR 내의 서열 요소는 일반적으로 번역 효율 (주로 5'UTR) 및 RNA 안정성 (주로 3'UTR)에 영향을 미치는 것으로 이해된다. 핵산 서열의 번역 효율 및/또는 안정성을 증가시키기 위해 활성화한 5'UTR이 존재하는 것이 바람직하다. 독립적으로 또는 부가적으로, 핵산 서열의 번역 효율 및/또는 안정성을 증가시키기 위해 활성화한 3'UTR이 존재하는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 표적단백질 RNA 발현카세트는 표적단백질가 유래된 에 대해 이종 또는 고유하지 않은 5'UTR 및/또는 3'UTR을 포함한다. 이것은 원하는 번역 효율 및 RNA 안정성에 따라 비번역 영역을 설계할 수 있게 한다.
3'UTR은 존재하는 경우 ORF의 종결 코돈의 하류에 유전자의 3'말단에 위치하지만, "3'UTR"은 바람직하게는 폴리(A) 꼬리를 포함하지 않는다. 따라서, 3'UTR은 폴리(A) 꼬리의 상류, 예를 들어 폴리(A) 꼬리에 직접 인접하여 있다(존재한다면).
본 발명의 3'UTR은 엑소리보뉴클레아제의 장벽으로 작용하거나 RNA 안정성을 증가시키는 것으로 알려진 단백질(예컨대 RNA-결합 단백질)과 상호작용하는 스템-루프 구조를 제공하기 위해 폴딩할 수 있는 하나 이상의 역반복을 포함할 수 있다.
인간 베타-글로빈 3'UTR, 특히 인간 베타-글로빈 3'UTR의 2개의 연속적인 동일한 사본은 높은 전사 안정성 및 번역 효율에 기여한다.
따라서, 본 발명의 표적단백질 mRNA는 인간 베타-글로빈 3'UTR의 2개의 연속적인 동일한 사본을 포함한다. 따라서, 그것은 5'→3' 방향으로 (a) 선택적으로 5'UTR; (b) 표적단백질를 코딩하는 ORF; (c) 3'UTR; 인간 베타-글로빈 3'UTR의 2개의 연속적인 동일한 사본, 이의 단편, 또는 인간 베타-글로빈 3'UTR의 변이체 또는 이의 단편을 포함하는 상기 3'UTR을 포함한다.
본 발명의 표적단백질 mRNA는 번역 효율 및/또는 안정성을 증가시키기 위해 활성화하지만 인간 베타-글로빈 3'UTR, 이의 단편, 또는 인간 베타-글로빈 3'UTR의 변이체 또는 이의 단편이 아닌, 3'UTR을 포함한다.
본 발명에 따른 UTR-함유 RNA는 예를 들어, 시험관내 전사에 의해 제조될 수 있다. 이들은 5'UTR 및/또는 3'UTR을 갖는 RNA의 전사를 허용하는 방식으로 본 발명의 핵산 분자(예컨대 DNA)의 발현을 유전적으로 변형시킴으로써 달성될 수 있다.
3'UTR은 일반적으로 ORF 및 폴리(A) 서열 사이에 위치한 mRNA의 일부이다. mRNA의 3'UTR은 아미노산 서열내로 번역되지 않는다. 3'UTR은 일반적으로 유전자 발현 과정 중 각각의 mRNA 내로 전사되는 유전자에 의해 코딩된다. 게놈 서열은 먼저 선택적인 인트론을 포함하는 미성숙 mRNA로 전사된다. 그 이후, 미성숙 mRNA는 성숙 과정을 거쳐 성숙 mRNA로 되도록 추가로 처리된다. 이러한 성숙 과정은 5'캡핑(capping), 추가적인 인트로을 절단하기 위한 미성숙 mRNA 스플라이싱(splicing) 및 미성숙 mRNA 3'말단의 아데닐산중합반응 및 추가적인 엔도-(endo-) 또는 엑소(exo)뉴클레아제 절단 등과 같은 3'말단의 변형을 포함한다.
본 발명에서, 3'UTR는 ORF의 정지 코돈의 3'말단에, 바람직하게는 ORF의 정지 코돈의 3' 말단 바로 옆에 위치한 성숙 mRNA의 서열에 상응하며, 폴리(A) 서열의 5'측면, 바람직하게는 폴리(A) 서열의 5'말단 바로 옆 뉴클레오타이드까지 이어진다. 본 발명에서, 유전자의 3'UTR, 예컨대 알파 또는 베타 글로빈의 3'UTR는 이러한 유전자로부터 유래된 성숙 mRNA의 3'UTR에 상응하는 서열, 즉, 유전자의 전사 및 미성숙 mRNA의 성숙에 의해 수득된 mRNA에 상응하는 서열이다. 용어 "유전자의 3'UTR"은 3'UTR의 DNA 서열 및 RNA 서열을 포함한다.
5'UTR은 일반적으로 전령 RNA(mRNA)의 특정 부분(section)으로 이해된다. 이는 mRNA의 ORF의 5'에 위치한다. 일반적으로, 5'UTR은 전사 시작부(transcriptional start site)와 함께 시작하고 ORF의 시작 코돈의 하나의 뉴클레오타이드 전에 종료된다. 5'UTR은 조절 요소라고도 불리우는 유전자 발현을 조절하기 위한 요소를 포함할 수 있다. 이와 같은 조절 요소는 예를 들어, 리보솜 결합부 또는 5'말단 올리고피리미딘관(Oligopyrimidine Tract)일 수 있다. 5'UTR은 예를 들어, 5'캡(cap)의 첨가에 의해 전사 후 변형될 수 있다.
본 발명에서, 5'UTR은 5'캡(cap) 및 시작 코돈 사이에 위치한 성숙 mRNA의 서열에 상응한다. 바람직하게, 5'UTR은 5'캡(cap)의 3'에 위치한 뉴클레오타이드로부터, 바람직하게는 5'캡(cap)의 3' 바로 옆에 위치한 뉴클레오타이드로부터, ORF의 시작 코돈의 5'에 위치한 뉴클레오타이드까지, 바람직하게는 ORF의 시작 코돈의 5' 바로 옆에 위치한 뉴클레오타이드까지 이어지는 서열에 상응한다. 성숙 mRNA의 5'캡(cap)의 3' 바로 옆에 위치한 뉴클레오타이드는 일반적으로 전사 시작부에 상응한다.
5'UTR 서열이 5'UTR 서열을 정의하기 위해 사용되는 mRNA 서열과 같은 RNA 서열 또는 이와 같은 RNA 서열에 상응하는 DNA 서열일 수 있다. 유전자의 5'UTR은 이러한 유전자로부터 유래된 성숙 mRNA의 5'UTR에 상응하는 서열, 즉, 유전자의 전사 및 미성숙 mRNA의 성숙에 의해 수득된 mRNA에 상응하는 서열이다. 유전자의 5'UTR은 5'UTR의 DNA 서열 및 RNA 서열을 포함한다.
본 발명의 mRNA는 적어도 하나의 화학적 변형된 5' 및/또는 3' UTR 서열을 갖는다. 이들 5' 및/또는 3' UTR 내 변형은 세포 기질 내 RNA의 반감기를 증가시키는 효과를 가질 수 있거나 번역 효율을 증가시킬 수 있고 따라서 코딩된 단백질 또는 펩타이드의 발현을 향상시킬 수 있다. 이들 UTR 서열은 바이러스, 박테리아 및 진핵생물에서 발생한 자연적으로 발생하는 서열과 100% 서열 상동성을 가질 수 있으나, 부분적이거나 전체적으로도 합성될 수 있다.
본 발명에 따른 mRNA는 5' 및/또는 3' UTR 요소, 특히 TOP 유전자의 5'UTR로부터 또는 이의 절편, 동족체 또는 변이체로부터 유래된 핵산을 포함하거나 이로 이루어진 5'UTR 요소, 또는 안정한 mRNA를 제공하는 유전자로부터, 또는 이의 동족체, 절편 또는 변이체로부터 유래할 수 있는 5' 및/또는 3'UTR 요소; 히스톤-스템-루프 구조, 바람직하게는 이의 3' 비번역 영역 내 히스톤-스템-루프; 5'캡(CAP) 구조; 폴리-A 꼬리; 또는 폴리(C) 서열을 포함하는 군에서 적어도 하나의 구조적 요소를 포함한다.
본 발명에 따른 mRNA는 적어도 하나의 5' 또는 3'UTR 요소를 포함한다. UTR 요소는 임의의 자연적으로 발생하는 5' 또는 3'UTR로부터 유래되거나, 유전자의 5' 또는 3'UTR의 절편, 동족체 또는 변이체로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 본 발명에 따라 사용된 5' 또는 3'UTR 요소는 본 발명에 따른 mRNA의 코딩 영역에 이종(heterologous)이다. 자연적으로 발생하는 유전자로부터 유래된 5' 또는 3'UTR 요소가 바람직하다 하더라도, 본 발명에서 합성적으로 조작된 UTR 요소도 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 mRNA는 척색동물 유전자, 척추동물 유전자, 포유동물 유전자, 인간 유전자의 3'UTR로부터 유래되거나, 척색동물 유전자, 척추동물 유전자, 포유동물 유전자, 인간 유전자의 3'UTR의 변이체로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 적어도 하나의 3'UTR 요소를 추가로 포함한다.
3'UTR 요소는 3'UTR로부터 유래되거나 3'UTR의 변이체로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 서열을 나타낸다. 3'UTR 요소는 mRNA의 3'UTR을 대표할 수 있다. 따라서, 3'UTR 요소는 mRNA, 인공 mRNA의 3'UTR 일 수 있고, 또한 이는 mRNA의 3'UTR을 위한 전자 주형일 수 있다. 따라서, 3'UTR 요소는 mRNA의 3'UTR, 인공 mRNA, 예컨대 유전적으로 조작된 벡터 발현카세트의 전사에 의해 수득된 mRNA의 3'UTR에 상응하는 핵산 서열이다. 3'UTR 요소는 3'UTR의 기능을 실현하거나 3'UTR의 기능을 실현하는 서열을 코딩한다.
독창적인 mRNA는 (안정한 mRNA를 제공하는) 반감기가 향상된 RNA 발현카세트와 관련된 유전자로부터 유래될 수 있는 3'UTR 요소를 포함하며, 예를 들어, 하기 정의 및 설명된 바와 같은 3'UTR 요소이다.
3'UTR 요소는 알부민 유전자, α-글로빈 유전자, β-글로빈 유전자, 타이로신 하이드록실라아제 유전자, 리폭시게나아제 유전자, 및 콜라겐 알파 유전자, 예컨대 콜라겐 알파 1 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 3'UTR로부터 유래되거나, 알부민 유전자, α-글로빈 유전자, β-글로빈 유전자, 타이로신 하이드록실라아제 유전자, 리폭시게나아제 유전자, 및 콜라겐 알파 유전자, 예컨대 콜라겐 알파 1 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 3'UTR의 변이체로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 3'UTR 요소는 알부민 유전자, 척추동물 알부민 유전자, 포유동물 알부민 유전자일 수 있다,
가장 바람직하게는 인간 알부민 유전자의 3'UTR로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 발명에 따른 mRNA는 다른 핵산으로부터 유래된 상응하는 RNA 또는 이의 절편, 동족체 또는 변이체를 포함하는 3'UTR 요소를 포함하는 것이 특히 바람직하다.
예를 들어, 3'UTR 요소는 바람직하게는 서열번호 7에 따른 인간 α-글로빈 유전자와 같은 α-글로빈 유전자의 3'UTR의 중심, α-복합-결합 부분을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다:
적어도 하나의 5'UTR 요소 및 적어도 하나의 3'UTR 요소는 상기 설명된 바와 같은 본 발명에 따른 mRNA 유래 단백질 생산을 증가시키는데 상승적인 역할을 한다. 적어도 하나의 5'UTR 요소 및/또는 적어도 하나의 3'UTR 요소는 단백질 생산을 증가시키기 위해서 mRNA의 주입과 함께 상승적인 역할을 한다.
본 발명에 따른 mRNA는 - 적어도 하나의 변형을 첨가하여 - 내부 리보솜 유입점(internal ribosome entry site)(IRES) 서열 또는 IRES-모티프를 추가로 포함할 수 있고, 예를 들어, 만약 mRNA가 2 이상의 펩타이드 또는 단백질을 코딩하면 여러 오픈 리딩 프레임으로 분리될 수 있다. IRES-서열은 만약 mRNA가 바이- 또는 멀티시스트론 RNA라면 특히 도움이 될 수 있다.
본 발명에서 "RNA"는 한정되지 않고 임의의 리보 핵산을 나타낸다. 따라서, RNA는 예를 들어, 바이러스 RNA, (replicon) 또는 mRNA로서 코딩 RNA로서 기능하는 리보 핵산에, 또는 임의의 유형의 인공 표적단백질 RNA 발현카세트에 동등하게 적용한다.
본 발명에 따르면, mRNA는 RNA의 코딩 영역에 의해 코딩된 펩타이드 또는 단백질의 발현을 증가시키는 적어도 하나의 변형을 포함한다. 본 발명에 따른 mRNA는 변형 중 적어도 하나의 유형을 포함한다. 대신에, 또는 다른 유형의 변형과 조합하여, 특정 변형, 예컨대 3'UTR, 히스톤 스템-루프 또는 폴리 C 서열은 또한 본 발명에 따른 mRNA에 하나 이상의 복제물(copy)로 존재할 수 있다. 이는 바이- 또는 멀티시스트론 RNA에 대해 특히 마찬가지이다. 본 발명에 따른 mRNA는 여러 별개의 변형의 조합을 포함할 수 있으며, 예컨대, 임의의, 예를 들어, 5'UTR, 폴리 C 서열, 폴리 A 서열, 3'UTR 또는 히스톤 스템-루프와 GC-풍부(GC-enrichment)를 조합한 변형, 여기서 각각 별개의 변형은 RNA 당 단일 복제물의 형태 또는 RNA 당 다수의 복제물 형태로 존재할 수 있다.
폴리(A) 서열
본 발명의 RNA 발현카세트는 3' 폴리(A) 서열을 포함한다.
폴리(A) 서열은 본질적으로 적어도 20, 적어도 26, 적어도 40, 적어도 80, 적어도 100개이고, 500개 이하, 400개 이하, 300개 이하, 200개 이하, 특히 150개 이하의 A 뉴클레오타이드이고, 특히 약 120개의 A 뉴클레오타이드로 구성되거나 포함한다.
폴리(A) 서열에서 뉴클레오타이드 수에 따라 전형적으로 적어도 50%, 적어도 75%의 폴리(A) 서열에서의 대부분의 뉴클레오타이드가 A 뉴클레오타이드이지만, 나머지 뉴클레오타이드는 A 뉴클레오타이드 이외의 뉴클레오타이드, 예컨대 U 뉴클레오타이드 (유리딜레이트), G 뉴클레오타이드 (구아닐레이트), C 뉴클레오타이드 (시티딜레이트)인 것을 허용한다. 폴리(A) 서열에서의 모든 뉴클레오타이드, 즉 폴리(A) 서열에서의 뉴클레오타이드의 수에 따라 100%가 A 뉴클레오타이드인 것을 의미한다. 용어 "A 뉴클레오타이드" 또는 "A"는 아데닐레이트를 지칭한다.
본 발명은 코딩 가닥에 상보적인 가닥에서 반복된 dT 뉴클레오타이드 (데옥시티미딜레이트)를 포함하는 DNA 주형에 기반하여, RNA 전사 동안, 즉 시험관내 전사된 RNA의 제조 중에 부착되는 3' 폴리(A) 서열을 제공한다. 폴리(A) 서열을 코딩하는 DNA 서열(코딩 가닥)은 폴리(A) 카세트로 지칭된다.
DNA의 코딩 가닥에 존재하는 3' 폴리(A) 카세트는 본질적으로 dA 뉴클레오타이드로 이루어지지만, 4개의 뉴클레오타이드(dA, dC, dG, dT)의 균등한 분포를 갖는 무작위 서열에 의해 중단된다. 이러한 무작위 서열은 길이가 5 ~ 50개, 바람직하게는 10 ~ 30개, 보다 바람직하게는 10 ~ 20개일 수 있다.
본질적으로 dA 뉴클레오타이드로 이루어지지만, 4개의 뉴클레오타이드(dA, dC, dG, dT)의 균등한 분포를 갖고 길이가 예를 들어 5 ~ 50개의 뉴클레오타이드인 무작위 서열에 의해 중단되는 폴리(A) 카세트는 RNA 수준에서 RNA 안정성 및 번역 효율을 지지하는 것과 관련하여 유익한 특성과 여전히 연관되어 있다.
결과적으로, RNA 분자에 함유된 3' 폴리(A) 서열은 본질적으로 A 뉴클레오타이드로 구성되지만, 4개의 뉴클레오타이드(A, C, G, U)가 균등한 분포를 갖는 무작위 서열에 의해 중단된다. 이러한 무작위 서열은 길이가 5 ~ 50개, 10 ~ 30개, 10 ~ 20개일 수 있다.
아데닐산중합반응(polyadenylation)은 일반적으로 RNA 분자, 예를 들어, 미성숙 RNA 발현카세트와 같은 핵산 분자에 폴리(A) 서열이 첨가되는 것으로 이해된다. 아데닐산중합반응은 소위 아데닐산중합반응 신호에 의해 유도될 수 있다. 이 신호는 아데닐산중합반응될, RNA 분자와 같은 핵산 분자의 3'말단의 뉴클레오타이드의 스트레치(stretch) 내에 위치한다. 아데닐산중합반응 신호는 일반적으로 아데닌 및 우라실/티민 뉴클레오타이드로 이루어진 헥사머(hexamer), 헥사머 서열 AAUAAA 를 포함한다. 다른 서열, 헥사머 서열도 가능하다. 아데닐산중합반응은 프리-mRNA(미성숙-mRNA로도 불리우는)의 가공 중에 발생한다. RNA 성숙(프리-mRNA로부터 성숙 mRNA 까지)은 아데닐산중합반응의 단계를 포함한다.
더욱이, 투여될 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 mRNA에 있어서, 코딩 영역의 3'영역은 예를 들어, 아데닌 또는 사이토신 잔기의 다중 반복 스트레치의 삽입 또는 첨가에 의해 변형될 수 있다. RNA 분자의 3' 말단은 아데닌 뉴클레오타이드의 시리즈(serii)("폴리(A) 꼬리")의 첨가에 의해 화학적 변형된다.
폴리(A) 꼬리의 길이는 발현카세트를 구성하는 각각의 번역 효율에 주요한 영향을 갖는다. 효율적으로 번역되기 위해, 외생적으로(exogenously) 전달되는 mRNA의 폴리(A) 꼬리는 적어도 20개 A 잔기로 이루어져야 한다. 게다가, mRNA 발현은 폴리(A) 꼬리의 길이와 긍정적 상관관계가 있다. 120개 뉴클레오타이들로 측정된 폴리(A) 꼬리가 더 짧은 것에 비해 mRNA 안정성 및 번역 효율이 향상되는 것을 보여준다.
본 발명의 mRNA는 폴리(A) 꼬리를 (선택적으로 다른 변형과 조합하여) 포함하고, 여기서 폴리(A) 꼬리는 적어도 30개, 바람직하게는 50개를 초과하는, 더욱 바람직하게는 100개를 초과하는, 더욱 더 바람직하게는 200개를 초과하는 아데노신 뉴클레오타이드를 포함한다. 가장 바람직하게는, RNA는 64개 아데노신 뉴클레오타이드로 이루어진 폴리(A) 꼬리를 포함한다.
폴리(A) 꼬리가 30개 아데노신보다 길다면, 바람직하게는 50개 아데노신보다 길다면, 더욱 바람직하게는 100개 아데노신보다 길다면, 그리고 더욱 더 바람직하게는 200개 아데노신보다 길다면, 폴리(A) 꼬리는 단지 본 발명에 따른 mRNA에 포함된 적어도 하나의 변형으로서 고려된다.
폴리(A) 꼬리의 변형은 본 발명에 따른 mRNA의 적어도 하나의 변형으로 간주되지 않는다. 이는 본 발명에 따른 mRNA는 상기 정의된 바와 같은 폴리(A) 꼬리를 포함할 수 있지만, 본 발명의 적어도 하나의 추가적인 변형을 포함할 수 있는 것을 의미한다.
적어도 하나의 ORF를 포함하는 mRNA는 RNA의 코딩 영역의 영역 3'에 폴리(C) 서열을 (선택적으로 다른 변형과 조합하여) 포함한다. 폴리(C) 서열은 일반적으로 다수의 사이토신 뉴클레오타이드, 일반적으로 약 10 ~ 약 200개 사이티딘 뉴클레오타이드, 바람직하게는 약 10 ~ 약 100개 사이티딘 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 약 10 ~ 약 70개 사이티딘 뉴클레오타이드 또는 더욱 더 바람직하게는 약 20 ~ 약 50개 또는 심지어 약 20 ~ 약 30개 사이티딘 뉴클레오타이드의 스트레치(stretch)이다. 폴리(C) 서열은 바람직하게는 핵산에 의해 코딩 영역의 3'에 위치할 수 있다. 본 발명의 폴리(C) 서열은 폴리(A) 서열의 3'에 위치한다.
본 발명에 따른 mRNA는 적어도 하나의 변형으로서 이의 3' 말단에 히스톤 스템-루프를 포함하거나 코딩한다.
2. 자가 증폭 mRNA 구조체
상기 자가 증폭 mRNA(self-amplifying mRNA, SAM) 구조체는 (a) RNA dependent RNA polymerase(RdRp)를 발현시키기 위한 mRNA 구조; 및 (b) 상기 RdRp에 의해 복제될 수 있고 상기 관심 대상 폴리펩타이드를 코딩하는 ORF를 포함하는 mRNA 레플리콘(replicon)을 포함하며, 여기서, 상기 두 종류의 구성요소가 동일한 한 개의 RNA에 있는 시스-레플리콘 RNA 구조체 또는 각각 상이한 두 개의 RNA에 있는 트렌스 레플리콘 RNA 구조체를 포함한다.
SAM 구조체는 알파 바이러스 및 플라비 바이러스와 같은 양성 단일 가닥 RNA 바이러스로부터 조작된 RNA 바이러스 게놈을 인코딩하는 레플리콘 (replicon)이라고 불리는 RNA로, 일반적으로 RNA 캡핑 및 복제를 돕는 비구조 단백질을 인코딩하는 ORF 및 바이러스 구조 단백질을 대체하는 항원을 발현하는 ORF를 포함한다.
SAM은 비복제 대응물에 비해 지속 기간 (약 2 개월) 및 발현의 크기를 연장시키는 것과 같은 몇 가지 매력적인 특징을 갖는다. 그러나, 자기 증폭 활성을 유지하기 위해, 이들 RNA 레플리콘은 많은 합성 뉴클레오티드 변형 및 서열 변경을 해야 한다. SAM의 다른 제한은 (1) 잠재적 숙주 반응을 유도할 수 있는 관련없는 단백질의 포함; 및 (2) 셀 내부화 효율을 제한할 수 있는 큰 레플리콘 크기 (약 10kb) 등이다.
일반적으로, SAM은 알파바이러스 복제효소를 발현시키기 위한 RNA 구조체 및 복제효소에 의해 트랜스로 복제될 수 있는 RNA 레플리콘을 포함하는 시스템을 제공하고, 두 종류의 구성요소가 동일한 한 개의 RNA에 있는 시스-레플리콘 및 상이한 두 개의 RNA에 있는 트렌스 레플리콘으로 나눌 수 있다.
트랜스-레플리콘 시스템에서, 알파바이러스 복제효소를 발현시키기 위한 RNA 구조체, 복제효소에 의해 트랜스로 복제될 수 있는 RNA 레플리콘을 포함하는 시스템을 제공하고, 여기서 알파바이러스 복제효소를 발현시키기 위한 RNA 구조체는 5'-캡을 포함한다. 5'-캡은 복제효소의 번역을 유도하는 목적을 제공한다. 5'-캡은 천연 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 포함한다. 알파바이러스 복제효소를 발현시키기 위한 RNA 구조체는 복제효소의 번역을 유도하기 위한 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 요소를 포함하지 않는다.
따라서, 트랜스-레플리콘은 2개의 핵산 분자인, 복제효소를 발현하기 위한(즉, 복제효소를 코딩하는) 제 1 RNA 분자; 및 제 2 RNA 분자 (레플리콘)를 포함하는 시스템을 제공한다. 복제효소를 발현하기 위한 RNA 구조체는 본 발명에서 동의어로 "복제효소 구성체"이라 지칭한다.
알파바이러스 복제효소를 발현시키기 위한 RNA 구조체는 (1) 5' UTR, (2) 복제효소를 코딩하는 오픈 리딩 프레임, 및 (3) 3' UTR를 포함할 수 있다. 5'UTR 및/또는 3' UTR은 복제효소를 유도하는 알파바이러스에 고유한 것이 아닌 것을 특징으로 한다. 알파바이러스 복제효소를 코딩하는 오픈 리딩 프레임은 RNA 복제에 필요한 비구조성 단백질에 대한 코딩영역(들)을 포함한다. 알파바이러스 복제효소를 발현시키기 위한 RNA 구조체는 3' 폴리(A) 서열을 포함한다. 알파바이러스 복제효소를 발현시키기 위한 RNA 구조체는 복제효소에 의해 복제될 수 없다.
RNA 레플리콘은: (1) 알파바이러스 5' 복제인식서열, 및 (2) 알파바이러스 3' 복제인식서열을 포함한다. 알파바이러스 5' 복제인식서열 및 알파바이러스 3' 복제인식서열은 복제효소의 존재 하에서 RNA 레플리콘의 복제를 지시한다.
알파바이러스 5' 복제인식서열 및 알파바이러스 3' 복제인식서열은 복제효소를 유도하는 알파바이러스에 고유한 것이다. RNA 레플리콘은 이종 핵산을 포함한다. RNA 레플리콘은 관심 대상 폴리펩타이드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 관심 대상 폴리펩타이드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임은 복제효소가 유도된 알파바이러스에 고유한 것이 아니다.
관심 대상 폴리펩타이드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 발현은 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있다. 서브게놈 프로모터는 복제효소를 유도하는 알파바이러스에 고유한 것이다. 서브게놈 프로모터는 알파바이러스의 구조 단백질에 대한 프로모터이다.
RNA 레플리콘은 3' 폴리(A) 서열 및 5'-캡을 포함한다.
복제효소의 번역을 유도하기 위한 5'-캡을 포함하는 알파바이러스 복제효소를 발현시키기 위한 RNA 구조체이다. 알파바이러스 복제효소를 발현시키기 위한 RNA 구조체, RNA 레플리콘 또는 상기 시스템의 둘 모두를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 DNA를 제조할 수 있다.
트랜스-레플리콘 시스템에서, 복제효소의 역할은 레플리콘을 트랜스로 증폭시키는 것이다. 그러므로 상기 레플리콘은 트랜스-레플리콘으로 지칭될 수 있다. 상기 레플리콘이 발현을 위한 목적 유전자를 코딩하면, 목적 유전자의 발현 수준 및/또는 발현 지속 시간은 복제효소의 수준을 변경함으로써 트랜스로 조절될 수 있다.
트랜스-레플리콘 시스템은 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, RNA 분자는 DNA 주형에서 시험관내 전사될 수 있다.
트랜스-레플리콘 시스템의 RNA는 시험관내 전사된 RNA (IVT-RNA)이다. 따라서, 본 발명의 시스템은 IVT-RNA를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 시스템의 모든 RNA 분자는 IVT-RNA이다. 시험관내-전사된 RNA (IVT-RNA)는 특정 치료법에 특히 중요하다.
트랜스-레플리콘 시스템은 적어도 2개의 핵산 분자를 포함한다. 따라서, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 핵산 분자를 포함할 수 있다. 정확히 2개의 핵산 분자, 바람직하게는 RNA 분자, 레플리콘 및 복제효소 구성체를 함유한다.
시스템은 복제효소 구성체에 더하여, 각각 바람직하게는 적어도 하나의 관심 대상 폴리펩타이드를 코딩하는 둘 이상의 레플리콘을 포함한다. 복제효소 구성체에 의해 코딩된 복제효소는 각각의 레플리콘에 작용하여 복제 및 서브게놈 전사체의 생산을 유도할 수 있다. 예를 들어, 각각의 레플리콘은 약학적 활성 펩티드 또는 단백질을 코딩할 수 있다. 이는 예를 들어 여러 다른 항원에 대해 대상체의 백신접종이 필요한 경우에 유리하다.
바람직하게는, 트랜스-레플리콘 시스템은 바이러스 입자, 특히 차세대 바이러스 입자를 형성할 수 없다.
바람직하게는, 복제효소 구성체는 표적 세포 또는 표적 유기체에서 자체 복제가 불가능하다.
또는 RNA의 양상 및 이점이 본 발명에 기재되어 있지만, 트랜스-레플리콘 시스템은 하나 이상의 DNA 분자를 포함하는 것이 가능하다. 본 발명의 시스템의 임의의 하나 이상의 핵산 분자는, DNA 분자일 수 있다. 복제효소 구성체 및/또는 레플리콘이 DNA 분자인 것이 가능하다. DNA 분자의 경우, DNA 의존성 RNA 중합효소의 프로모터가 존재하는 것이 바람직하며, 이에 의해 감염되거나 백신 접종된 숙주세포 또는 숙주 유기체에서 전사가 가능해진다.
Ⅱ. 핵산 생분해성 복합입자
본 발명과 관련하여 생분해성 고분자 담체 복합입자의 핵산은, DNA든, 바람직하게 이들에 제한되지 않고 예를 들어, 유전체 DNA(genomic DNA), 단일가닥 DNA분자(single-stranded DNA molecules), 이중가닥 DNA분자(double-stranded DNA molecules), 코딩 DNA(coding DNA), DNA 프라이머(DNA primers), DNA프로브(DNA probes), pDNA, 면역자극 DNA(immunostimulating DNA)로부터 선택된 적절한 핵산일 수 있으며, PNA(펩타이드 핵산)든 이들로부터 선택될 수 있으며, RNA든, 바람직하게 이들에 제한되지 않고, 코딩 RNA(coding RNA), 메신저 RNA(messenger RNA, mRNA), siRNA, shRNA, 안티센스 RNA(antisense RNA), 또는 or 리보스위치(riboswitches), 면역자극 RNA (immunostimulating RNA, isRNA), 리보자임(ribozymes) 또는 압타머(Aptamer) 등으로부터 선택될 수 있다.
또한, 상기 핵산은 리보솜 RNA(ribosomal RNA, rRNA), 트랜스퍼 RNA(transfer RNA, tRNA), 메신저 RNA(messenger RNA, mRNA), 또는 바이러스 RNA(viral RNA, vRNA)일 수 있다. 바람직하게는, 상기 핵산은 RNA이고, 더욱 바람직하게는 코딩 RNA(coding RNA)이다.
상기 핵산은 선형(linear) 단일가닥 RNA일 수 있고, mRNA일 수 있다. mRNA는 일반적으로 몇 가지 구조적 요소(structural elememt), 예를 들면, 코딩 지역에 뒤따르는 상부에 위치한 리보좀 바인딩 사이트, 선택적 5'-UTR, 폴리-A-꼬리(및/또는 폴리-C-꼬리) 뒤에 있을 수 있는 선택적 3'-UTR를 포함하는 RNA이다. mRNA는 모노(mono-), 다이(di-), 또는 심지어 멀티시스트로닉 RNA(multicistronic RNA)로 나타날 수 있으며, 즉 본원에서 정의된 바와 같이 하나, 둘 또는 더 많은(동일하거나 다른) 단백질 또는 펩타이드의 코딩 서열(coding sequence)을 운반하는 RNA이다. 다이(di-), 또는 심지어 멀티시스트로닉 mRNA(multicistronic mRNA)에서 그러한 코딩 서열은 적어도 하나의 내부 리보좀 유입점(internal ribosome entry site, IRES)서열에 의해 분리될 수 있다.
게다가, 상기 생분해성 고분자 담체 전달물 복합체의 핵산은 단일가닥 또는 이중가닥 핵산은 두개의 단일가닥 핵산들(분자들)의 비공유 결합 때문일 수 있다.
또는 부분적으로 이중가닥 또는 부분적으로 단일가닥 핵산일 수 있고, 적어도 부분적으로 상보적으로 이들 모두다 부분적으로 이중가닥이거나 부분적으로 단일가닥인 핵산은 일반적으로 더 길고 더 짧은 단일가닥 핵산에 의해 만들어지거나 길이가 같은 두개의 단일가닥 핵산에 의해 만들어지고, 하나의 단일가닥 핵산은 다른 단일가닥 핵산에 부분적으로 상보적이며 따라서 둘은 이 부분에서 이중가닥 핵산 분자를 형성한다. 즉, 부분적으로 이중가닥 또는 부분적으로 단일가닥 핵산 (분자)를 형성한다.
바람직하게는, 핵산(분자)는 단일가닥 핵산 분자일 수 있다. 게다가, 핵산(분자)는 원형(circular) 또는 선형(linear) 핵산 분자일 수 있고, 바람직하게는 선형 핵산 분자일 수 있다.
RNA 전달체의 형질주입은 세포 외 및 세포 내 장벽에 직면한다. RNA 전달체는 혈청 핵산분해 효소 및 식세포 흡수에 노출되어 생물학적 반감기를 현저하게 감소시킨다. 또한, 세포외 기질(ECM) 뿐만 아니라 세포막의 음전하는 RNA 전달체가 표적에 도달하고 작용을 하는 것을 방해한다.
기능에 대한 많은 장벽 중 RNA는 세포질에 도달하기 위해 세포막을 가로 질러야한다. 세포막은 세포 내 전달에 대한 역동적이고 강력한 장벽이다. 다양한 이온 펌프 및 이온 채널이 음전위를 유지하는 데 도움이 된다. 세포막을 가로 질러 -40 ~ -80 mV), 대부분의 필수 금속 이온(예 : K+, Na+, Ca2+ 및 Mg2+)의 균형을 조절하여 세포질 공간에 음전하를 유지한다.
세포막은 매우 음으로 하전된 RNA 분자에 대한 강력한 장벽을 생성한다. 불포화 지질, 특히 시스-이중 결합된 지질은 막 구조에 결함을 도입함으로써 세포막 유동성을 증가시킨다. 이중층의 다른 주요 성분은 스테롤(총 지질의 약 30%)을 포함한다. 지질 이중층의 주요 스테롤인 콜레스테롤은 이중층 결함을 생성하여 지질 이중층의 유동화와 응축 사이의 균형을 유지하는 데 도움이 된다.
핵산의 형질주입은 바이러스(viral) 또는 비바이러스(non-viral) 벡터를 사용하여 수행된다. 성공적인 운반을 위해서, 이러한 바이러스 또는 비바이러스 벡터들은 상기 언급된 장애들을 반드시 극복해야만 한다. 가장 성공적인 유전자 치료 전략은 오늘날 아데노바이러스 (adenoviruses), 아데노 관련 바이러스 (adeno-associated viruses), 레트로바이러스 (retroviruses) 및 헤르페스 바이러스 (herpes viruses)와 같은 바이러스 벡터의 사용에 의존한다. 바이러스 벡터는 높은 효율과 장기간(long-term) 유전자 발현의 가능성을 갖는 유전자 도입을 매개할 수 있고, 3개의 가설 중에서 2개를 충족한다. 그러나, 유전자 치료 임상 실험에서 드러나는 급성 면역 반응(the acute immune response), 면역원(immunogenicity), 그리고 삽입 돌연변이 유발(insertional mutagenesis)은 흔히 사용되는 몇몇 바이러스 벡터들에 대한 안정성에 대한 심각한 염려를 일으킨다.
이러한 문제점에 대한 해결책은 비바이러스 벡터들의 사용에서 발견될 수도 있다. 비록 비바이러스 벡터들은 바이러스 벡터들만큼 효율이 좋지 않지만, 많은 비바이러스 벡터들은 유전자 치료법에서 더 안정적인 대안을 제공하고 있다.
비바이러스 유전자 운반 방법은 물리적(담체(carrier)를 사용하지 않는 유전자 운반) 그리고 화학적(합성 벡터에 기초한 유전자 운반) 접근법을 사용하여 연구되고 있다. 물리적 접근법은 보통 주사침(needle injection), 전기천공법(electroporation), 유전자총(gene gun), 초음파(ultrasound) 그리고 유체역학적 운반(hydrodynamic delivery)을 포함하고, 세포막을 투과하는 물리적 힘을 이용하며, 그리고 세포 내로 유전자 도입을 촉진한다. 화학적 접근법은 일반적으로 대상유전자를 세포 안으로 이동하기 위해 담체로써 합성되거나 자연적으로 발생된 화합물(양이온 지질(cationic lipids), 양이온 폴리머(cationic polymers), 지질-폴리머 혼성체(lipid-polymer hybrid systems))를 담체로 사용한다.
비록 기초과학분야와 다양한 비바이러스 유전자 운반 시스템에서 중요한 발전이 있지만 비바이러스 접근법의 대다수는 여전히 바이러스 벡터들보다 덜 효율적이고, 특히나 생체내 유전자 운반에서 더욱 그러하다.
본 발명의 RNA의 입체적 안정성을 달성하고 담체의 BD/PK 특성을 향상시키기 위해 다른 약제에서 FDA가 인간에게 사용하도록 승인한 폴리에틸렌글리콜 접합(PEGylated) 지질을 사용할 수 있다. 가능한 모든 면역 반응과 보체 시스템의 활성화가 최소화되도록 입자 표면 전체가 PEG로 덮여 있을 수도 있다.
고분자 전해질 복합체(Poly Electrolyte Complex, PEC)는 반대 전하의 두 중합체가 혼합될 때 자발적으로 형성되어 거대 분자가 주로 정전기적 상호작용에 의해 함께 결합되는 복합체이다. 또한, "나노 플렉스"는 양으로 하전된 나노 입자와 핵산, DNA 또는 RNA 사이에 형성된 복합체를 나타내기 위해 문헌에서 널리 사용된다. 양으로 하전된 성분이 키토산과 같은 양이온성 폴리펩타이드를 기반으로 하는 경우, 나노 플렉스는 폴리 플렉스로도 정의될 수 있다.
PEC는 주로 구형이며, 양이온 및 음이온성 중합체의 화학량론적 혼합물을 함유하고, 하전 안정화 쉘의 형성을 허용하는 과량의 고분자 전해질에 의해 둘러싸인 중성 코어로 구성된다.
PEC의 자체 조립은 가역적인 과정이므로 PEC와 매체 사이의 정전기 차폐 및 폴리 이온 교환으로 인해 다른 하전된 종의 존재 하에서 무결성이 손상될 수 있다. 따라서, PEC의 안정성은 하전된 단백질 및 고농도의 작은 전해질이 존재하는 생물학적 매질에서 심각한 영향을 받을 수 있다. 이 문제를 극복하기 위한 전략은 복합 다가 전해질을 공유 가교 결합하여 PEC로부터 폴리머 사슬의 분리를 방지함으로써 PEC의 안정성을 향상시키는 것이다. PEC 기반 나노 입자는 제조가 쉽고 비용 효율적이기 때문에 매력적이며, 정전기 상호작용의 가역성은 적절한 조건하에서 복합체의 무결성을 유지하면서 담체의 거동에 특별한 조정성을 제공하기 때문에 매력적이다.
RNA 전달을 위해 가장 많이 개발된 방법 중 하나는 지질 나노 입자(LNP)의 복합제제이다. LNP 제제는 일반적으로 (1) 폴리 음이온성 RNA를 캡슐화하기 위해 이온화 가능 또는 양이온성 지질 또는 3 차 또는 4 차 아민을 보유하는 고분자 재료; (2) 세포막의 지질과 유사한 양 이온성 지질(예를 들어, 1,2- 디오레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올 아민 [DOPE]); (3) LNP의 지질 이중층을 안정화시키는 콜레스테롤; 및 (4) 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-지질로 나노 입자에 수화층을 형성하여 콜로이드 안정성을 개선하며 단백질 흡수를 감소시킨다.
상기 캡슐화하여 제조하는 가장 대표적인 입자는 지질 나노 입자로 인지질은 생체 적합성, 대규모 생산의 상대적 용이성 및 임상 시험에서 사용되는 최근 승인으로 인해 RNA의 가장 유망한 전달체 중 하나로 인식되고 있다.
인지질은 물에 분산되면 자발적인 이중층 구조를 형성하는 양친매성 분자이며 분산된 친수성 하중을 성형 구조물의 수성 코어 내에 포집한다. 따라서 양이온성 폴리펩타이드로 이들 분자의 헤드 그룹을 화학적으로 변형시키면 정전기적 상호 작용을 통한 음으로 하전된 본 발명에서 제조하는 RNA의 포획이 촉진되어 전달체의 유망한 구성 요소가 된다.
본 발명의 RNA 전달체는 혈장 안정성 및 순환 시간 정도뿐 아니라 세포의 유입 측면에서 RNA 전달체의 약물 동태의 향상에 두고 있다.
본 발명의 RNA를 구성하는 핵산은 강력하게 음으로 하전된 폴리머로 입자를 제조하는 과정에서 양이온 폴리머가 매우 중요한 역할을 한다. 양이온성 폴리펩타이드는 정전기 상호작용, 세포 흡수, 양성자 스폰지 매개 엔도솜 탈출을 통해 음으로 하전된 RNA 발현카세트와의 복잡한 형성을 촉진하는 능력을 포함하는 몇 가지 이점을 제공한다. 그러나 양이온 폴리머의 단점은 세포막의 무결성 변화와 높은 면역원성 때문에 높은 독성이 있다는 것이다.
더 나아가 유전자 치료에서 더 전도유망한 접근법은 양이온 폴리머(cationic polymers)를 사용하는 것이다. 양이온 폴리머는 단단히 복합체를 형성하고 음전하를 띈 핵산을 응축하기 때문에 핵산의 형질주입에서 효용성이 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 많은 양이온 폴리머가 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 유전자 운반을 위한 담체로써 연구되고 있다.
양이온성 화합물은 일반적으로 전하를 띤(charged) 분자를 말하며, 이는 일반적으로 1 ~ 9, 9 미만(예를 들어 5 ~ 9), 또는 8 미만(예를 들어 5 ~ 8), 또는 7 미만(예를 들어, 5 ~ 7)의, 예를 들어 7.3 ~ 7.4의 생리학적 pH 값의 양전하를(양이온) 띤다. 따라서, 양이온성 성분은 임의의 양전하를 띤 화합물 또는 폴리머, 생리학적 조건하에서, 특히 생체 내(in vivo) 생리학적 조건 하에서 양전하를 띤, 양이온성 펩타이드 또는 단백질일 수 있다. '양이온성 펩타이드 또는 단백질'은 적어도 하나의 양전하를 띤 아미노산 또는 하나 이상의 양전하를 띤 아미노산, 예를 들어 Arg, His, Lys 또는 Orn 로부터 선택된 것을 함유할 수 있다. 따라서, '다중양이온성' 화합물 또한 주어진 조건하에서 하나 이상의 양전하를 보이는 범위 내이다.
이런 양이온 폴리머는 폴리에틸렌이민(polyethylenimine (PEI)), 폴리아미도아민 덴드리머(polyamidoamine dendrimers) 폴리프로필아민 덴드리머(polypropylamine dendrimers), 폴리아릴아민(polyallylamine), 양이온 덱스트란(cationic dextran), 키토산(chitosan), 양이온 단백질(cationic proteins) 및 양이온 펩타이드(cationic peptides)를 포함한다.
비록 대부분의 양이온 폴리머는 작은 입자(particles) 안에 DNA를 응축하고 세포 표면의 음이온 위치와 전하-전하 반응을 통한 엔도시토시스(endocytosis)에 의해 세포 흡수를 촉진하는 기능을 갖지만, 형질주입 활성(transfection activity)과 독성(toxicity)은 현저히 차이가 난다.
양이온 폴리머는 음전하를 띄는 핵산 전달물의 더 강력한 복합체화 때문에 분자량이 커질수록 더 나은 형질주입 능력을 보인다. 그러나, 분자량이 증가할수록 양이온 폴리머의 독성이 더욱 증가한다. 폴리에틸렌이민(PEI)는 아마 가장 활성이 좋고, 유전자 운반 분야에서 가장 많이 연구된 폴리머이지만, 형질주입 시약으로서 폴리에틸렌이민의 가장 큰 약점은 생물 분해성이 없는(non-biodegradable)성질 및 독성과 관련이 있다.
유전자 치료법에서 한 가지 특이한 접근법은 양이온 지질(cationic lipids)을 사용한다는 것이다. 그러나, 비록 많은 양이온 지질들이 세포 배양에서 우수한 형질주입 활성을 나타내지만, 대부분은 혈청의 존재 하에서는 잘 수행되지 않고 몇몇만이 생체 내에서 활성을 가진다. 리포플렉스(lipoplexes)가 압도적으로 많은 양의 음전하 및 혈액, 점액 상피 라이닝 유체(mucus epithelial lining fluid) 또는 조직 매트릭스(tissue matrix)에 존재하는 양친매성 단백질과 다당류에 노출될 때 사이즈, 표면 전하 그리고 지질 구조에서 현저한 변화가 일어난다.
생체 내로 일단 투여된 리포플렉스(lipoplexes)는 음전하로 하전된 혈액 성분과 반응하고, 큰 집합체(aggregates)를 형성하는 경향이 있으며, 이러한 큰 집합체는 순환하는 적혈구 세포의 표면에 흡착되거나, 두꺼운 점액층에 붙잡히게 되거나, 미소혈관계에 색전증(embolize)을 발생하게 하여, 리포플렉스가 먼 거리(distal location)에 있는 계획된 타겟 세포에 도달하는데 방해가 되게 한다.
게다가, 리포플렉스에 의한 유전자 도입(gene transfer)과 관련된 독성은 특히 염증성 사이토카인(inflammatory cytokines)의 유발을 포함한다. 사람에게서, 리포플렉스를 받은 환자들 사이에서 독감-유사 증상들을 포함한 다양한 정도의 부정적인 염증성 반응들이 보고되었다. 따라서, 리포플렉스가 모든 사람에게 안전하게 이용될 수 있는지는 여전히 의문이 남는다.
게다가, 비록 높은 분자량을 갖는 폴리머에 의해 만들어진 폴리플렉스는 생리학적 조건하에서 향상된 안정성을 나타내지만, 그러한 폴리머들은 벡터 언팩킹(vector unpacking)을 방해할 수 있다. 예를 들어, poly L-lysine(PLL)로 형성된 복합체에서 매우 빠르게 DNA가 해리된 명백히 향상된 단기 유전자 발현(short-term gene expression)이 생긴다. 수용체 매개 유전자 운반에 활성된 구조 안으로 DNA를 채워 넣기 위해서는 최소한 6에서 8의 양이온 아미노산 길이가 필요하다. 그러나, 짧은 다양이온으로 만들어진 폴리플렉스는 생리학적 조건하에서 안정하지 않고 일반적으로 생리 식염수 내에서 빠르게 응집체(aggregate)가 형성된다.
이러한 부정적인 면을 극복하기 위하여 핵산의 방출을 촉진하기 위하여 세포내 환경에 의해 절단될 수 있는 Cys-Lys10-Cys 펩타이드의 산화 중축합(oxidative polycondensation)에 의해 만들어진 선형의(linear) 환원성 다양이온(reducible polycation, RPC)에 기초를 둔 새로운 형태의 합성 벡터도 개발했다. RPC에 의해 만들어지는 폴리플렉스들은 DNA와 mRNA의 효과적인 방출을 가능하게 하는 환원 상태에 의해 불안정해질 수 있다는 것을 보여주었다.
양이온성 펩타이드 프로타민은 혈청 RNases에 의한 분해로부터 mRNA를 보호하는 것으로 나타났다. 그러나 프로타민과 복합체를 형성한 mRNA만으로는 프로타민과 mRNA 사이의 강력한 결합력 때문에 암 백신 모델에서 제한된 단백질 발현과 효능을 보여주었다. 이 문제는 프로타민 제형 RNA가 발현 벡터가 아닌 면역 활성제로만 작용하는 RNAtive 백신 플랫폼을 개발하였다. CureVac은 Th1 T 세포 반응을 유도하는 TLR 7/8 작용제 역할을 하는 프로타민-제조된 RNA 복합체에 기반한 RNActive 백신 플랫폼을 개발하였으며, 뉴클레오티드-개질된 mRNA는 항원 생산자로서 기능하였다. 이 백신 플랫폼은 전임상 동물 모델과 환자 모두에서 암과 전염병에 대해 유리한 면역 활성화를 일으켰다.
핵산의 세포 운반은 또한 단백질 형질전환 도메인(protein-transduction domains, PTDs)으로 표현하기도 하는 세포 투과 펩타이드(cell penetrating peptides, CPPs)의 물리적 조립(assembly) 또는 화학적 결합(ligation)으로 가능하다. CPP는 약 10에서 30개의 아미노산 서열을 가지고 있는 짧은 펩타이드에 해당하고 이것은 포유류 세포의 원형질막을 통과할 수 있고 따라서 세포의 약물 운반에 대해 전례가 없는 가능성을 제공하고 있다.
이러한 펩타이드들의 거의 대부분은 낮은 pH에서 알파-헬릭스(α-helix)형태인 서열들의 조합에서 양이온 아미노산 시리즈를 포함한다. pH가 생체 내(in vivo)에서 양성자 펌프로 인하여 계속적으로 더욱 낮아질 때, 펩타이드의 형태적 변화는 보통 빠르게 개시된다.
이러한 헬릭스 모티브(helix motif)는 세포질(cytoplaa) 안으로 내용물의 방출을 유도하는 엔도좀의 막 안으로 삽입을 매개한다. 절단된 HIV-1 Tat 단백질(HIV-1 Tat protein) 기본 도메인은 원형질막을 통과하고 세포 핵에 축적된다. 이러한 장점에도 불구하고, CPP로 매개된 약물 운반에 대한 주요 장애물은 종종 상피(epithelia)와 내피(endothelia)의 효소 장벽에 부딪히거나 통과할 때, 펩타이드의 빠른 대사 제거(metabolic clearance)를 포함하는 것으로 생각한다.
세포 전달 펩티드(CPP)는 핵산 전달의 세포내 전달을 위한 벡터로서의 잠재력에 대해 연구되었다. 그들의 내재화 메카니즘은 완전히 이해되지는 않지만, CPP는 세포 표면에서 음으로 하전된 글리코사미노 글리칸의 클러스터링을 촉진할 수 있다고 가정된다. 이는 거시 피노사이토시스 및 측면 확산을 유발하거나 지질 이중층을 직접 방해한다. 아르기닌이 풍부한 양친 매성 RALA 서열 반복을 갖는 CPP는 수지상 세포에 대한 mRNA 벡터로서 기능하고 T 세포 면역을 유발하는 것으로 보고되었다.
결론적으로, CPPs의 대사 안정성(metabolic stability)은 그들의 세포 생물학적 이용가능성(bioavailability)을 위한 중요한 생물약제학(biopharmaceutical)의 요인을 나타낸다. 그러나, 한편으로는 그들이 대사적으로(metabolically) 절단되기 전에 그들의 전달물을 타깃으로 운반할 만큼 충분히 안정한 반면, 다른 한편으로는 그들이 독성수준을 축적하고 도달할 수 있기 전에 조직에서 완전히 없어질 수 있는 CPPs를 종래에는 이용할 수 없었다.
세포막의 장벽 외에도, RNA는 피부 및 혈액에 풍부하게 존재하는 세포 외 리보뉴클레아제에 의해 분해에 직면한다. 뉴클레아제에 의한 분해로부터 mRNA를 보호하고 그것의 음전하를 보호하기 위해, 아민-함유 물질은 일반적으로 비바이러스성 벡터로서 사용된다.
RNA 복합입자는 RNA를 효소 분해로부터 완전히 보호할 수 있는 능력이 있어야 하며, 신장 제거를 방지하면서 표적 부위의 혈관 외 유출 및 체류를 허용하는 적절한 크기를 가져야 한다. 그것은 또한 혈청 단백질 상호 작용을 방지하고 phagolysosomes을 회피하면서 세포에 의해 효율적인 유입을 허용하는 적절한 표면 특성을 소유해야 한다. 임상 적용을 용이하게 하는 다른 바람직한 특성은 조직 특이성, 생체 적합성을 향상시키고 독성을 감소시키기 위해 리간드를 표적으로 하는 용이한 기능화이다. 또한 RNA의 전달체는 세포질에 위치한 단백질 합성 장소에 RNA를 전달하기 위해 적시에 엔도솜을 벗어나는 문제에 직면한다.
본 발명의 RNA 복합입자를 구성하는 mRNA의 골격은 핵산으로 핵산분해 효소들로부터 보호를 받아 혈액내에서 안정성이 확보되어야 하며, 본 발명의 이상적인 전달체는 상기 목적을 달성할 수 있어야 한다.
본 발명에서는 핵산의 화학적 변형, 핵산 말단의 보호 등을 실시할 수 있으며, 상기 RNA를 고분자 물질로 캡슐화하여 입자를 제조하는 방법을 제공할 수 있다.
RPC(reducible polycation)는 적은 분자량을 갖는 펩타이드와 비교할 수 있는 수준으로 다양이온의 독성을 감소시켰다. 이러한 접근법은 적절한 수준의 형질주입 효율을 향상시키기 위해 엔도좀 붕괴능(endosomolytic)약품 클로로퀸(chloroquine) 또는 양이온 지질 DOTAP가 추가적으로 필요하다는 것이다. 결과적으로 환원성 다양이온(RPCs)에 엔도좀의 완충 능력이 있는 것으로 알려진 히시티딘 잔기를 포함할 수 있다.
히스티딘이 많은 환원성 다양이온은 엔도좀 붕괴능 약품 클로로퀸 없이 플라스미드 DNA, mRNA, 그리고 siRNA 분자를 포함하는 다양한 핵산의 충분한 세포질 운반이 가능하도록 할 수 있다. 그러나, 히스티딘이 많은 환원성 다양이온을 바로 생체 내에 적용하는 것이 가능한 지에 대해 많은 연구가 필요하다. 폴리플렉스에 혈청 단백질이 결합되어 세포 흡수를 제한하기때문에 형질주입은 유전자 도입을 향상시킬 수 있는 히스티딘 잔기의 능력이 저해되는 것을 피하기 위해 혈청이 없이 수행되었다.
세포안으로 전달물 분자를 운반하는 기술에 대한 다른 접근법, 예를 들면, 유전자 치료법은 펩타이드 리간드(ligands)를 포함한다. 펩타이드 리간드는 타겟 암세포(target cancer cell)에 사용되는 EGF 펩타이드와 같은 수용체 인식에 필요한 필수아미노산을 대표하는 더 큰 단백질로부터 떨어져 나온 짧은 서열(sequences)일 수 있다. 다른 펩타이드 리간드는 렉틴 유사 산화 LDL 수용체(lectin-like oxidized LDL receptor (LOX-1))를 타겟으로 하는데 사용되는 리간드를 포함할 수도 있다.
상피 세포에서 LOX-1의 상향조절(Up-regulation)은 고혈압(hypertension) 및 아테롬성 동맥 경화증(atherosclerosis)과 같은 장애상태와 관련이 있다. 그러나, 펩타이드 리간드들은 복합체화나 부착에 의해 그들의 전달물 분자에 연결될 수 없고 공유결합을 필요로 하기 때문에 많은 유전자 치료학적 접근법에 적합하지 않으며, 일반적으로 세포 내에서 세포독성효과를 갖는 가교제(crosslinkers)를 예로들 수 있다.
유전자 치료와 다른 치료학적 응용의 목적을 위하여 핵산을 응집화(condensation)하고 안정화할 수 있고, 특히 생체내에서 핵산 전달물의 효과적인 방출 및 낮거나 전혀 없는 독성의 조합 측면에서, 효과적인 형질주입 활성을 보일 수 있는 적절한 방법이나 담체를 개발해야 한다.
유전자 운반의 목적을 위한 담체를 제공하기 위한 기술분야에서 여전히 강력한 요구가 있고, 이러한 강력한 요구는 그들이 대사적으로 절단되기 이전에 그들의 전달물을 타깃에 운반할 만큼 충분히 안정적이며, 다른 한편으로는 그들이 유독한 수준에까지 축적되거나 도달하기 이전에 조직으로부터 제거되어야 한다는 것이다.
RNA-기반 제제의 치료적 성공은 생체 내에서 RNA 전달과 관련된 많은 도전을 극복하는데 달려있다. 안전하고 효과적인 RNA 전달체의 개발은 RNA 기반 요법의 성공적인 적용을 위해 결정적이다. 나노 구조화된 전달체는 조기 분해로부터의 보호 및 생물학적 환경과의 개선된 상호 작용과 같은 고유한 장점을 제공한다. 또한 조직 흡수를 향상시키고 RNA 체류 시간을 연장하며 세포 내재화를 향상 시키며 RNA가 표적 세포의 세포질로 이동하는 것을 가능하게 한다.
RNA를 전달하는 전신적으로 전달된 LNP는 전달에 대한 다중 장벽에 직면한다. 특히 간과 비장에 있는 단핵식 포식작용 시스템 (MPS)은 나노 크기의 감염원에 대한 신체의 보호기능의 본래의 역할 때문에 주입된 나노 입자의 빈번한 목적지이다. 신장은 naked mRNA 또는 5.5 nm 미만의 유체 역학적 직경을 갖는 임의의 나노 입자를 걸러낸다.
대부분의 LNP는 직경이 약 100nm이고 MPS를 빠져 나가서 다른 관심 기관에 도달하지 못할 만큼 충분히 크다. MPS의 주요 기관인 간은 작은 구멍이 있는 혈관 구조를 가지며 양이온성 LNP를 보유하는 쿠퍼 세포와 같은 식세포가 있다. 또한, 큰 양이온성 LNP는 폐에 있는 모세혈관에서 유출되지 않고 신장에 의해 혈류로 여과될 수도 없다. 간, 폐 또는 다른 기관에 전달 물질이 축적될 수 있다. 따라서, 전달체 구성 요소의 클리어런스 및 생분해성은 mRNA 전달 물질을 개발할 때 한 가지 고려 사항이다.
에스테르 그룹은 생체 물질의 생분해성을 향상시키기 위해 가장 일반적으로 사용되는 기능 그룹이지만 다른 에스테르 결합의 생체내 분해는 분자 및 제형의 전체 화학에 따라 달라질 수 있다. 특정 조직에서, 에스테르 작용기의 존재는 LNP의 분해를 가속화시켜 잠재적으로 단백질 발현을 제한할 수 있다. 예를 들어, OF-Deg-Lin은 간 세포에 도달할 수 있었지만 비장에서 단백질 발현을 선택적으로 유도했다. 간 효소에 의한 LNP의 급속한 분해 때문일 수 있다고 가정했다. 폴리 에스테르 또는 폴리 카보네이트에 기초한 분해성 지질 또는 중합체의 합리적인 설계는 전달체의 분해를 보다 잘 제어할 수 있다.
LNP로 간 이외의 특정 장기 또는 조직을 표적으로 하는 것이 더 어려운 것으로 입증되었다. 일부 LNP는 아포지 단백질 E-의존적 방식을 통해 간에서 축적되거나 흡수된다. APE의 경우, 중합체의 3 차 아미노 알코올의 핵심 구조가 특정 장기를 표적으로 하는 데 중요한 역할을 할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이러한 표적화 전략에는 한계가 있으며 일반적으로 특정 조직에 대한 성공적인 표적 솔루션을 찾기 위한 처리량이 많은 스크리닝으로 얻은 리간드를 조직-특이적 수용체에 포함시키는 것과 같이 합리적으로 설계된 표적화 접근법은 대안적인 전략이다.
최근 수지상 세포 표면에서 시알 산-말단 당 단백질의 시험관내 활성 표적화를 보고했다. 글루탐산-알라닌-류신-알라닌 (GALA)을 갖는 30- 아미노산 합성 펩티드는 EGFP-mRNA를 운반하는 폴리 플렉스에 접합된 복합체이다. 그러나, 단백질 코로나를 형성하는 LNP의 임의의 옵소닌화는 표적화 리간드의 마스킹으로 인해 활성 표적화 전략에 해로울 수 있다. 따라서, 특정 조직을 표적화하는 새로운 전략이 임상적 과제를 해결하기 위해 연구될 필요가 있다.
RNA 기반 치료제를 세포에 전달하는 분야에서, 그 최종 종점에는 엔도좀 탈출이 자리하고 있다. 간으로의 ASO 및 siRNA 전달은 ASGPR 표적 GalNAc-siRNA 접합체에 의해 해결될 수 있고, LNP에 의한 mRNA 및 CRISPR 전달은 확실해 보이지만, 효과적이고 임상적으로 준비된 RNA 기반 치료제를 간 이외의 전신에 전달하기 위한 접근은 아직 최종 종점 단계에 머물러 있다.
정확한 이유는 알려져 있지 않지만, ASGPR은 거대 분자 약물이 간세포로 전달되는 데 매우 적합한 특성을 가지고 있다. ASGPR은 혈중 asialoglycoproteins에 결합하여 그들을 clathrin-coated endosome으로 끌어 들여 분해를 위해 리소좀에 유입시킨다. ASGPR 결합된 asi-aloglycoproteins은 세포질로 빠져 나가는 것으로는 생각되지 않는다.
그러나 간세포는 수많은 ASGPR를 세포 표면에 발현하는데, 이것들은 매 10~15분의 속도로 놀랄만큼 빠르게 순환한다. 최대의 RNAi 반응을 위해서는 최소 5,000개의 siRNA가 필요하다. ASGPR의 GalNAc 결합은 아주 드물게 막의 불안정성을 유발하며, 이는 수백만의 siRNA 분자가 ASGPR 엔도좀으로 매 15분 마다 들어가고, 0.01%보다 낮은 탈출 효율을 가짐으로써, GalNAc 전달을 통해 하루 동안 5,000개가 넘는 분자를 전달할 수 있다. 불행히도, 이렇게 빠른 속도로 수용체를 발현시키거나 엔도좀으로 빠르게 순환시킬 수 있는 다른 리간드-수용체 시스템은 존재하지 않는다.
사실, 대부분의 세포 표면 수용체는 10,000-100,000 범위(또는 그 이하)로 발현되며, 카베올린 및 클라트린 매개 세포막 포집은 일반적으로 90분 단위로 회전된다. 이론적으로, 수용체를 표적으로 하는 전달법은 매 2시간마다 세포의 엔도좀에 ~ 100,000개 이상의 siRNA를 가져올 수 있다. 그러나 엔도좀 탈출 효율이 0.01% 미만으로 추정되는 경우 최소 5,000개인 필요 임계점에 도달하기가 어렵게 된다. 현재 여러 연구 그룹이 엔도좀 탈출 문제에 대한 해결책을 연구하고 있다.
고전적인 접근법은 저분자성 엔도좀 분해 인자인 클로로퀸을 사용하는 것이다. 클로로퀸(chloroquine)은 세포막을 통해 수동적으로 확산하여 pH가 떨어지면 양성자가 되어 엔도좀 내부에 갇히게 되어 엔도좀 내 농도가 급격히 증가한다. 클로로퀸은 소수성 모티프를 지질 이중층에 삽입하고 일정 농도에서 엔도좀을 용해시킨다. 그러나 효과를 나타내는 농도에서 이러한 엔도좀 분해 인자들은 비 특이적으로 siRNA 화합물을 포함하는 엔도좀 뿐만 아니라 다른 세포 내 엔도좀을 용해시켜 독성을 일으킨다. 결과적으로, 이러한 저분자 엔도좀 분해 인자들은 개발 단계에서 주목을 받았지만, 현재 임상 용도로 쓰기에는 잠재적 독성 위험이 있다.
대안적인 엔도좀 탈출 접근법은 RNA에 직접적으로 엔도좀 분해성 펩타이드 또는 분자를 접합시켜 RNA 치료제를 함유하는 엔도좀에 대해 분해 작용을 제한시키는 방법으로 two-molecule dynamic polyconjugate(DPC) 시스템을 개발하였다. siRNA는 콜레스테롤과 결합하여 혈액으로 큰 골재구조(저밀도 지단백질)를 형성하여 간으로 이동하여 간세포로 세포막 포집에 의해 흡수된다. 두 번째 분자는 막을 용해하는 구멍형성 멜리틴 펩타이드 (벌독에서 유래)의 유도체이다. pH 민감성으로 멜리틴을 합성하고 이를 GalNAc에 접합시켰다. 간세포 엔도좀의 낮은 pH에서 멜리틴은 활성화되고 엔도좀을 분해하여 siRNA를 세포질로 방출하도록 한다. 하지만, 멜리틴으로 인한 독성으로 인해 FDA와 진행하던 멜리틴에 의존하는 세 가지 임상 프로그램을 모두 중단하기로 결정했다. 이런 점은 엔도좀 탈출 문제를 해결하는 것이 어려운 과제임을 보여준다.
Ⅲ. RNA 발현카세트를 포함하는 복합입자
본 발명에서, 상기 RNA 발현카세트는 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 RNA 발현카세트는 비증폭 mRNA(non-amplifying mRNA) 구조체; 및 자가 증폭 mRNA(self-amplifying mRNA) 구조체 등이 있다.
상기 비증폭 mRNA 구조체는 (a) 상기 표적 폴리펩타이드를 암호화하는 개방 판독 프레임(open reading frame, ORF): (b) 5' UTR; (c) 3' UTR; 및 (d) 5' 캡 구조(cap structure) 또는 IRES;를 포함한다.
상기 자가 증폭 mRNA(self-amplifying mRNA) 구조체는 (a) RNA dependent RNA polymerase(RdRp)를 발현시키기 위한 mRNA 구조; 및 (b) 상기 RdRp에 의해 복제될 수 있고 상기 관심 대상 폴리펩타이드를 코딩하는 ORF를 포함하는 mRNA 레플리콘(replicon)을 포함하며, 여기서, 상기 두 종류의 구성요소가 동일한 한 개의 RNA에 있는 시스-레플리콘 RNA 구조체 또는 각각 상이한 두 개의 RNA에 있는 트렌스 레플리콘 RNA 구조체를 포함한다.
<도 1>은 본 발명에 의한 RNA 발현카세트를 포함하는 기본 복합입자(10) 및 복합입자(20)를 포함하는 RNA 발현카세트 복합입자의 개념도로, 기본 복합입자(10)는 음전하를 갖는 RNA 발현카세트와 양이온성 화합물이 정전기적 상호작용으로 구성하는 복합체(a)이고 복합입자(20)는 RNA 발현카세트와 양이온성 화합물을 포함하는 기본 복합입자(10)의 층(21)과 음이온 폴리머 외곽층(22)을 포함하는 복합입자(b)이다.
상기 mRNA 발현카세트 그룹, 양이온성 화합물 그룹 및 음이온성 화합물 그룹은 각각 단일 종류일 수도 있지만 이에 제한하는 것은 아니다. 각각 그룹에서 다른 종류의 화합물이 선정되어 본 발명의 목적을 달성할 수도 있다.
바람직하게, 본 발명의 RNA 발현카세트 복합입자는 RNA 발현카세트, 양이온성 화합물과 음이온성 화합물의 혼합에 의한 복합입자일 수 있다.
양이온성 화합물 대 RNA 발현카세트의 비율, 즉 입자의 순 전하가 중요하다. 따라서, 본 발명에서 양이온성 화합물과 음이온성 화합물류를 이용한 RNA 발현카세트 복합입자 기반 전달 플랫폼을 개발하였다,
본 발명에서 RNA 발현카세트 전달을 촉진하고, 단백질 번역을 증가시키고 RNases으로부터 RNA 발현카세트를 보호하기 위해 다수의 새로운 RNA 발현카세트 복합입자를 개발하였다. 본 발명은 급속한 세포외 RNA 발현카세트 분해 및 혈청 단백질과의 응집에 대한 우려를 극복하여 RNA 발현카세트의 전신 투여를 위한 가능성을 제시하고자한다.
또 다른 중요한 문제는 전신 전달 후 RNA 발현카세트 전달체의 생체 분포이다. 주로 수지상 세포 활성화에 이상적이지 않은 간(liver)으로 특정 양이온성 지방 나노입자는 정맥 내 주사를 통해 전달되었다. 즉, 양전하를 띤 입자가 주로 폐를 표적으로 하는 반면, 음전하를 띤 입자는 이차 림프 조직 및 골수를 표적으로 전달되어 면역반응을 활성화시킨다.
본 발명에서 다중음이온성 핵산을 양이온성 폴리머로 기본입자를 제조하고 이를 음이온성 폴리머로 코팅하여 궁극적으로 음전하로 하전된 polyeletrolye complex를 제조하였다.
본 발명의 복합입자는 영상소재 및 중성 또는 양이온성 폴리펩타이드로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 또는 RNA 발현카세트에 영상 소재와 중성 분자인 콜레스테롤이 부착될 수 있다. 복합입자는 단백질의 암호화와 내포한 약학적 유효성분에 의한 약학적 기능, 영상 소재에 의한 영상화 기능 그리고 콜레스테롤에 의한 핵산의약품의 보호 기능을 동시에 함께 보유할 수 있다.
상기 RNA 발현카세트는 그 자체로는 인체 내 뉴클레오티드로 구성된 핵산을 분해시키는 효소에 대해 무방비 상태이기 때문에 그 효능을 온전히 표적 조직 내부로 전달하기 힘들고 신장 여과 기능에 의해 배출되는 문제점이 있다. 따라서 본 발명은 복합체를 우수한 약물로 개발하기 위해, 상기 문제점을 극복하는 방법을 하기와 같이 제공하고 있다.
<도 2>는 본 발명에 의한 상기 RNA 발현카세트를 포함하는 복합입자를 제조하는 방법을 도시한 것이다. 본 발명에서는 RNA 발현카세트 자체가 음이온을 띄고 있다는 특성에 착안하여 양전하를 띄는 분자로 상기 RNA 발현카세트를 코팅하여 기본 복합입자(10)를 제조하고 추가적으로 음이온성 다당류를 2차 코팅하여 복합입자(20)를 제조하는 방법을 제공한다.
바람직하게, 본 발명의 RNA 발현카세트 복합입자는 RNA 발현카세트, 양이온성 화합물과 음이온성 화합물의 혼합에 의한 복합입자일 수 있다.
좀 더 구체적으로 살펴보면, 상기 양이온성 화합물은 상기 RNA 발현카세트와 정전기적 상호작용으로 응축된 기본 복합입자(10)를 형성한다.
상기 RNA 발현카세트가 n개의 뉴클레오티드로 구성되어 있으며 분자당 n-1개의 음전하이고 또는 1 몰당 1.8 × 1025 음전하이다.
상기 양이온성 화합물에서 대표적인 물질인, 프로타민(PS) 분자량이 5.8 kDa이고 염기성 아미노산, 특히 아르기닌(70~80 %)이 풍부하므로 몰당 양이온이 1.26 ± 1025이다. 따라서 복합체와 복합체를 형성하면 PS는 복합체 인산염 그룹의 음전하를 중성화시킨다. 일반적으로 PEC(Poly-Electrolyte Complex)라고 불리는 이 물질은 물에서 해리될 수 있는 그룹을 포함하고 있는 생물학적 거대 분자의 고분자로 구성되어 상호 작용하여 전하를 띤 구성 요소를 만든다.
본 발명의 RNA 발현카세트와 양이온성 화합물의 전하 비율(charge ratio)이 1:0.4 이상 즉 RNA는 1이고 PS는 0.4 이상으로 하는 방법을 제공할 수도 있다.
상기 RNA 발현카세트와 PS의 정전기적 상호작용으로 응집하는 기본 복합입자의 상호간의 결합은 RNA 발현카세트와 PS 각각의 전하(charge)에 따라 결정되며 본 발명의 입자에서는 상기 RNA 발현카세트와 PS (㎍/mL)의 중량비는 30:15~150, 바람직하게는 30:15~90, 더욱 바람직하게는 30:75일 수 있다.
상기 기본 복합입자(10)와 복합입자(20)를 구성하는 RNA 발현카세트와 양이온성 화합물의 정전기적 상호작용으로 RNA 발현카세트의 원만한 방출을 위해 인간혈청알부민(HSA), 히알루론산, 양치매성 생체 고분자, 음전하를 띤 나노입자 또는 RNA 발현카세트 및 CaCl2을 포함하는 염에서 선택된 어느 하나를 사용할 수도 있다.
본 발명에서 제시하는 기본 복합입자(10)에 있어서, RNA 발현카세트는 이온 복합체를 형성하기 위하여 반드시 양이온성 화합물을 더 포함한다. 즉 양이온성 화합물과 정전기적 상호작용으로 인해 양이온성 화합물 내부에 봉입된 음전하의 RNA는 형성된 이온 복합체는 입자의 코어 부분에 위치한다. 상기 RNA 발현카세트와 양이온성 화합물의 접촉으로 형성되는 기본 복합입자(10)의 층(21)은 강한 양전하를 띠고 있어 세포에 부착력이 증가하고 조직 장벽을 통과하기 힘들다는 문제가 있다.
본 발명에서는 이러한 문제점을 해결하고자 생체적합성이 좋으며 음전하를 띄고 있는 음이온성 화합물을 사용하여 2차로 상기 양이온성 화합물층(21) 외면에 코팅하여 음이온성 화합물 층(22)을 형성하여 복합입자(20)를 제조할 수 있다.
상기 음이온성 화합물 층 코팅단계는 음이온성 화합물을 넣어 상기 양이온 분자층(21) 외면에 상기 음이온성 화합물 층(22)을 정전기적 인력으로 코팅하는 단계이다.
상기 기본 복합입자(10)와 복합입자(20)의 조성물 및 제조방법을 자세히 살펴보면 하기와 같다.
상기 RNA 발현카세트는 혈중 안정성을 증가시키거나 면역 반응을 약화시키는 등의 목적을 위해 백본(backbone), 당 또는 염기가 화학적으로 변형되거나 말단이 수식될 수 있다. 구체적으로는, RNA의 포스포다이에스테르(phosphodiester) 결합의 일부를 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphate) 결합으로 대체하거나, 일부 리보오스 염기의 2'-OH 위치에 메틸기, 메톡시에틸기, 불소 등의 다양한 작용기가 도입된 수식된 뉴클레오티드를 1종 이상 포함할 수 있다.
또한, 상기 RNA 발현카세트의 하나 이상의 말단은 콜레스테롤, 토코페롤 및 탄소수 10 내지 24개의 지방산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 수식될 수 있다. 상기 콜레스테롤, 토코페롤 및 탄소수 10 내지 24개의 지방산에는 콜레스테롤, 토코페롤 및 지방산의 각 유사체, 유도체, 및 대사체가 포함된다.
본 발명에서, RNA 발현카세트는 전체 조성물의 중량을 기준으로, 0.05 내지 10 중량%로 포함될 수 있고, 보다 구체적으로는 0.1 내지 5중량%, 보다 더 구체적으로는 0.5 내지 3 중량%로 포함될 수 있다. 상기 RNA 발현카세트의 함량이 전체 조성물의 중량을 기준으로 0.05 중량% 미만이면 약물에 비하여 사용되는 전달체의 양이 너무 많아서 전달체에 의한 부작용이 있을 수 있고, 10 중량%를 초과하면, 나노입자의 크기가 너무 커져 나노입자의 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있다.
상기 양이온성 화합물는, RNA 발현카세트와 정전기적 상호작용에 의해 결합되어 복합체를 형성하고, 상기 복합체는 음이온성 화합물의 나노입자 구조 내부에 봉입된다. 따라서, 상기 양이온성 화합물는, RNA 발현카세트와 정전기적 상호작용에 의해 복합체를 형성할 수 있는 모든 형태의 화합물을 포함하며, 예를 들어, 양이온성 지질 또는 양이온성 고분자 종류일 수 있다.
양이온성 화합물
본 발명의 기본 복합입자(10)는 상기 RNA 발현카세트와 상기 양이온성 화합물은 정전기적 상호 작용에 의해 응축되는 복합체이다. (-) 전하를 띄는 상기 RNA 발현카세트와 (+) 전하를 띄는 양이온성 화합물이 서로 혼합되면 응축될 수 있다. 좀 더 구체적으로, 강한 양전하를 가지는 분자는 이 음전하의 RNA 발현카세트를 둘러싸면서 응축 또는 압축하여 입자 크기를 줄일 수 있다.
본 발명에 있어서, 표현 "양이온성 화합물" 는 적어도 수중에서의 양이온성을 나타내는 폴리머를 나타내고, 전체로서 양이온성을 나타내는 양쪽성 폴리머를 또한 포함한다.
본 발명에 있어서, 양이온화도가 0.2 이상인 폴리머를 사용한다. 상기 양이온성 화합물을 사용함으로써, 음이온성 화합물과 복합입자를 용이하게 형성할 수 있다.
다른 한편으로는, 음이온성 화합물과 복합입자를 형성하는 관점에서, 양이온성 화합물의 양이온화도에 대한 특정한 상한은 없다. 기준으로서, 양이온화도가 2 이하인 양이온성 화합물을 사용할 수 있다.
이와 관련하여, 표현 "양이온화도" 는 이하의 식에 따른 계산에 의해 얻을 수 있는 값을 나타낸다.
｛(폴리머에 함유되는 양이온성 관능기의 수) - (폴리머에 함유되는 음이온성 관능기의 수)｝/ 폴리머를 구성하는 모노머의 총량
본 발명에서 사용되는 양이온성 화합물는, 이것이 양이온성 관능기를 갖는 한, 천연물 또는 합성물일 수 있다.
양이온성 화합물에 함유되는 양이온성 관능기의 예는, 아미노 기, 구아니디노 기 및 이미노 기를 포함한다. 본 발명의 양이온성 화합물는, 이들 기를 폴리머의 측쇄 또는 주쇄에 함유한다.
상기 양이온성 화합물은 양이온성 폴리펩티드, 양이온성 다당류, 양이온성 지질, 양이온성 표면활성제, 답즙산 또는 답즙산 유도체가 공유결합한 양이온성 분자 및 합성 중합체 등을 포함할 수 있다.
바람직한 양이온성 또는 다중양이온성 화합물은 양이온성 폴리펩타이드는 프로타민, 폴리라이신(polylysine), 폴리아르기닌(polyarinine), 양이온성 다당류, 예를 들어 키토산, 폴리벤, 글라이콜 키토산(glycol chitosan), 양이온성 폴리머, 예를 들어 폴리에틸렌이민(PEI), 양이온성 지질, 예를 들어 DOTMA: [1-(2,3-시오레일옥시)프로필)]-N,N,N-트리메틸암모니움 클로라이트([1-(2,3-sioleyloxy)propyl)]-N,N,N-trimethylammonium chloride), DMRIE, 디-C14-아미딘, DOTIM, SAINT, DC-Chol, BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE: 디올레일 포스파티딜에탄올-아민(Dioleyl phosphatidylethanol-amine), DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS: 디옥타데실아미도글리실스페르민(Dioctadecylamidoglicylspermin), DIMRI: 디미리스토-옥시프로필 디메틸 히드록시에틸 암모늄 브로마이드(Dimyristo-oxypropyl dimethyl hydroxyethyl ammonium bromide), DOTAP: 디올레오일옥시-3-(트리메틸암모니오)프로판(dioleoyloxy-3-(trimethylammonio)propane), DC-6-14: O,O-디테트라데카노일-N-(α-트리메틸암모니오아세틸)디에타놀아민 클로라이드(O,O-ditetradecanoyl-N-(α-trimethylammonioacetyl)diethanolamine chloride), CLIP1: rac-[(2,3-디옥타데실옥시프로필)(2-히드록시에틸)]-디메틸암모니움 클로라이드, CLIP6: rac-[2(2,3-디헥사데실옥시프로필-옥시메틸옥시)에틸]트리메틸암모니움, CLIP9: rac-[2(2,3-디헥사데실옥시프로필-옥시석시닐옥시)에틸]-트리메틸암모니움, 올리고펙타민, 또는 양이온성 또는 다중양이온성 화합물, 예를 들어 β-아미노산-폴리머 또는 역(reversed) 폴리아미드 등과 같은 변형된 폴리아미노산, PVP (폴리(N-에틸-4-비닐피리디니움 브로마이드)), 등과 같은 변형된 폴리에틸렌, pDMAEMA (폴리(디메틸아미노에틸 메틸아크릴레이트)), 등과 같은 변형된 아크릴레이트, pAMAM (폴리(아미도아민)), 등과 같은 변형된 아미도아민, 디아민 및 변형된 1,4 부탄디올 디아크릴레이트-코-5-아미노-1-펜타놀 폴리머, 등과 같은 변형된 폴리베타아미노에스터(PBAE), 폴리프로필아민 덴드리머 또는 pAMAM 기초의 덴드리머 등과 같은 덴드리머, PEI:폴리(에틸렌이민), 폴리(프로필렌이민) 등과 같은 폴리이민(들), 폴리알릴아민, 사이클로덱스트린 기초의 폴리머, 덱스트란 기초의 폴리머, 키토산 등과 같은 당백본 기초의 폴리머, PMOXA-PDMS 코폴리머 등과 같은 실란 백본 기초의 폴리머, 하나 또는 그 이상의 양이온성 블록(예를 들어 상기 언급된 양이온성 화합물로부터 선택된 것)의 조합 및 하나 또는 그 이상의 친수성 또는 소수성 블록(예를 들어 폴리에틸렌글리콜); 등으로 이루어진 블록폴리머를 포함할 수 있다.
양이온성 화합물을 포함하는 복합입자는 더 작은 균일 한 입자 크기를 공식화하여 형질주입 효율을 향상시키는 추가 이점을 가지고 있다. 양이온성 화합물은 음전하를 띤 핵산을 응축하고 포장하는 경향이 있다. Poly-L-lysine (PLL)은 DNA transfection을 위해 조사된 최초의 양이온 성 폴리머이다. 또한 가장 높은 양이온 전하 밀도를 갖는 새로운 분지형 양이온 폴리머인 PEI (poly-ethylenimine)를 합성하였다. PEI는 하전된 아미노 그룹으로 인해 양성자화를 겪을 수 있는 고도로 분지된 폴리머이다. PEI의 더 높은 형질주입 효율은 엔도좀에 존재하는 소포 ATPase 양성자 펌프에 의해 펌핑된 양성자를 소멸시킬 수 있는 PEI상의 여러 아미노 그룹의 완충 능력에 기인한다. PEI의 이러한 '양성자-스펀지 효과'는 엔도솜에 염화물 이온과 물이 유입되어 결국 삼투압 팽창과 엔도좀 파괴로 이어진다. 그러나 PEI 기반 제제는 높은 양전하로 인해 혈청 단백질과 적혈구에 결합하기 때문에 세포 독성을 나타내어 원형질막 파괴를 일으킨다. 더욱이, PEI 폴리머로 처리된 세포주가 자가 포식, 괴사 및 세포 사멸을 보인다. 앞서 언급한 문제를 해결하기 위해 차세대 양이온 기반 폴리머인 폴리 [(2- 디메틸아미노) 에틸메타크릴레이트] (pDMAEMA), 폴리아미도아민 (PAMAM) 덴드리머, 생분해성 폴리 (β-아미노 에스테르) (PBAE) 폴리머가 개발되었다. 3차 아민 말단기 때문에 pDMAEMA 및 PBAE는 엔도좀 탈출을 돕고 우수한 형질주입 효율이 있다. PBAE는 PEI에 비해 독성이 적지만 표면 전하 밀도를 고려하여 여전히 주의해야 한다. 따라서 transfection 효율을 높이고 비특이적 결합을 줄이기 위해 새로운 세대의 poly (amino-co-ester) (PACE) 기반 폴리머가 개발되어 핵산 전달에 최적화되었다.
PACE 폴리머의 기본 토대는 엔도좀 파괴를 돕고 생물학적 조건에서 쉽게 가수 분해될 수 있는 절단 가능한 에스테르 모이어티를 갖는 분지형 아미노 그룹의 존재에 기반한다. PACE 기반 양이온성 고분자는 다른 종류의 양이온성 고분자에 비해 최소한의 세포 독성을 나타낸다. 고 분자량 (MW) PACE 폴리머는 더 많은 소수성 모이어티를 사용하여 합성되어 양이온 전하를 줄이고 전신 세포 독성을 줄였다. High MW PACE는 DNA의 상당한 축합과 안정적인 DNA 복합체 형성으로 인해 우수한 형질주입 효율이 있다.
본 발명에서 양이온성 폴리펩타이드의 종류는 특별히 한정되지는 않고, 전체 아미노산 잔기에 대한 염기성 아미노산 잔기의 비율이, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상인 염기성 RNA가 바람직하게는 사용된다.
특히, 염기성 아미노산 잔기만으로 구성되는 염기성 양이온성 폴리펩타이드가 바람직하게는 언급될 수 있다.
염기성 양이온성 폴리펩타이드로서, 아르기닌 및 라이신으로 구성되는 RNA가 특히 적합하게 언급될 수 있다.
구체적으로는, 폴리라이신, 또는 폴리아르기닌이 바람직하게는 사용된다.
또한, 양이온성 폴리펩타이드로서, 단일 아미노산 잔기로 구성되는 양이온성 폴리펩타이드, 또는 2종 이상의 아미노산 잔기로 구성된 양이온성 폴리펩타이드를 사용할 수 있다.
본 발명의 양이온성 화합물은 중량 평균 분자량은 100 내지 100,000인 분자로, 예를 들면 양이온성 폴리펩티드, 양이온성 다당류, 양이온성 지질, 양이온성 표면활성제 및 합성 중합체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 양이온성 폴리펩티드는 프로타민(Protamine, PS), 세포 침투성 펩티드(CPP), 폴리-L-라이신(PLL: poly-L-lysine) 및 폴리아미도아민 (PAMAM: polyamidoamine)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 PS일 수 있다.
상기 양이온성 폴리펩타이드에 대한 후보자는 다양한 응용을 갖는 폴리 양이온성 펩티드인 프로타민(protamine)이다. 특히 약물 전달에 사용되며 주입된 인슐린 현탁액의 흡수를 지연시키는 효과가 보고되었다. 프로타민은 분자량이 5.8 kDa이고 염기성 아미노산, 특히 아르기닌 (70~80 %)이 풍부하므로 몰당 양이온이 1.26 ± 1025이다. 따라서 DNA와 복합체를 형성하면 프로타민은 DNA 인산염 그룹의 음전하를 중성화시킨다. 일반적으로 PEC(Poly-Electrolyte Complex)라고 불리는 이 물질은 물에서 해리될 수 있는 그룹을 포함하고 있는 생물학적 거대 분자의 고분자로 구성되어 상호 작용하여 전하를 띤 구성 요소를 만든다. PS는 동물의 정소 중에서 특히 연어를 포함한 어류의 정자 핵에 많이 존재하며, 히스톤과 같이 DNA와 회합 또는 해리를 통하여 유전정보 발현에 관여하는 단백질로 알려져 있다. 통상, 어류의 정자핵으로부터 추출되는 PS의 분자량은 약 4,000 내지 10,000이며, 구성 아미노산의 70% 이상이 아르기닌으로 존재하나 본 발명이 여기에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 PS는 프로타민 P1(Protamine P1), 프로타민 1(Protamine 1) 및 프로타민 2(Protamine 2)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 두 가지 이상의 단백질일 수 있다.
본 발명의 PS는 PS 자체 및 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 모두 포함한다. 구체적으로 본 발명의 PS의 염은 염산염 또는 황산염을 포함한 산성 물질에 의한 염 형태를 포괄한다. PS은 염 형성 없이도 물에 용해가 가능하며 염 형태 또한 물에 용해가 가능하므로 어떤 형태로든 사용 가능하다.
더 치밀한 '입자' 구조를 얻기 위해, PS에 acrylamide를 처리하여 변형된 형태(mPS로 표시)과 HA에 acrylate 그룹을 처리하여 변형된 형태(mHA로 표시)를 사용할 수도 있으며, 이 경우 최종 겔은 UV 조사를 통해 광 가교 결합에 의해 구축할 수도 있다.
폴리-L-라이신(PLL: poly-L-lysine)은 생분해설인 펩티드 결합으로 연결되어 있어 복합체와 이온복합체를 형성해서 세포 내로 전달될 수 있으나, 다소 독성을 나타내므로 단독으로 높은 전달효율을 나타내는 데에는 한계가 있어 CPP와 pH 의존성 CPP를 포함하는 엔도좀 파괴 물질이나 엔도좀 융합 펩티드 등을 부착시켜 사용할 수 있다.
현재 가장 흔히 사용되는 RNA 발현카세트의 안정화 물질은 양전하를 띠는 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI)이나 체내 독성이 있어 사용에 제한이 있는 단점이 있다. 이에 반하여 PS는 세포독성이 없으며 음전하를 띠는 세포막(엔도솜의 막)으로의 투과와 RNA 발현카세트의 엔도솜 탈출(endosomal escape)을 증진시켜 RNA 발현카세트가 안전하게 세포질로 방출될 수 있도록 하는 장점이 있다.
세포 침투성 펩티드(CPP)는 RNA 발현카세트를 세포로 운반하는 데 광범위하게 사용된다. CPP는 세포 내에서 RNA 발현카세트의 안정성과 생체 이용률을 증가시킨다. 따라서, RNA 발현카세트를 전달하기 위한 CPP의 사용은 상당한 치료 이점을 가질 수 있다. 음으로 하전된 RNA 발현카세트를 양전하를 띤 펩티드에 결합시키는 일반적인 방법은 비공유 정전기 상호 작용이다.
상기 세포투과성 펩타이드(Cell Penetrating Peptides, CPP)에서 pH에 의해 세포투과성을 활성화하는 펩타이드는 (a) 유효농도(EC)이상의 높은 펩타이드 농도와 생리학적 pH 범위(pH 7.0)에서 막 투과성이 거의 없으며, (b) 엔도좀의 산성 pH 범위(pH5.5)와 유효농도(EC)이하 낮은 펩타이드 농도에서 막에 거대 분자 크기의 결함을 효율적으로 형성할 수 있으며 는 세포막투과를 증가시키는 도메인과 pH 의존성 막활성 도메인으로 구성된 펩타이드이다.
pH에 의해 세포투과성을 활성화하는 세포투과성 펩타이드(Cell Penetrating Peptides, CPP)
종류 아미노산서열 비고
Melittin GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ (서열번호 1) 넓은 pH 범위에서 막 활성화
LP GWWLALALALALALALASWIKRKRQQ (서열번호 2)
Hylin a1 IFGAILPLALGALKNLIK (서열번호 3)
LPE3-1 GWWLALAEAEAEALALASWIKRKRQQ (서열번호 4) 산성 pH에서
막 활성
pHD24 GIGAVLKVLATGLPALISWIKAAQQL (서열번호 5)
본 발명에 따르면, 본 발명은 Unmodified mRNA; Modified mRNA; Self-amplifying mRNA; 및 Trans-amplifying mRNA;를 포함하는 RNA 발현카세트/PS 기본 복합입자(10)를 제공한다.
본 발명에 따르면, 상기 RNA 발현카세트/PS 기본 복합입자(10)는 RNA 발현카세트와 PS이 1:0.4～1:5 범위의 질량비로 혼합되어 제조되며 200 nm이하의 크기를 가지고 있고 양전하 특성을 보이는 특징이 있다.
상기 RNA 발현카세트 및 PS의 중량비는 1:0.2~5, 바람직하게는 1:0.4~3.0일 수 있다. w/w의 비가 1:2.5 이하의 환경에서는 더욱 응축되다가 1:5 이상으로 PS가 추가될 경우 입자가 마이크로 이상의 크기가 될 수 있다.
본 발명의 입자는 물리 화학적 안정성으로 고순도의 물에서 안정적으로 유지되지만, 콜로이드 시스템에 염을 첨가하면 입자는 빠르게 응집될 수 있다. 소위 '입자'라고 불리는 이들 1세대 RNA 발현카세트/PS 입자의 또 다른 단점은 입자에서부터 RNA 발현카세트의 낮은 방출일 수도 있다.
두 가지 문제를 극복하기 위해, 기본 복합입자의 응집을 방지하기 위해 생분해성, 무독성 거대 분자, 음전하를 띤 나노입자 또는 염을 조사했다. 또한, RNA 발현카세트와 PS 사이의 세포 내 해리(dissociation)는 양친매성 생체 고분자, 음전하를 띤 나노입자 및 염으로 강화될 수 있다.
상기 음전하를 띤 나노입자는 은(Ag), 금(Au), 백금(Pt), 구리(Cu), 주석(Sn), 철(Fe), 니켈(Ni), 루테늄(Ru), 타이타늄 (Ti), 탄탈럼(Ta), 니오비움(Nb), 지르코늄(Zr), 알루미늄(Al) 등과 같은 전도성 금속원소 또는 이들의 금속산화물이 하나 또는 그 이상의 배합으로 합성된 그룹으로부터 선택되는 나노입자일 수 있다.
사람 혈청 알부민 (HSA)은 이러한 문제들을 해결할 수 있는 유망한 후보자일 수 있다. 약 65,000Da의 분자량과 생리 조건에서 약간 음의 표면 전하를 갖는 HSA는 및 미립자 제제 및 다른 의약품에서 널리 사용되는 무독성 거대 분자로 HSA는 보호 콜로이드이다. 이 콜로이드는 입자 매트릭스에만 작은 양으로 포획된다. 대부분의 거대 분자는 주변 매질에 남겨져 입자의 2차 응집을 억제한다. 높은 HSA 농도 (1000 ㎍/ml)에서 입자가 완전히 HSA로 코팅되어 이 보호 콜로이드에 의해 기본 복합입자의 안정성이 연장될 수 있다.
양이온성 다당류의 예는 키토산(chitosan), 글리코키토산, 양이온성 셀룰로오스, 양이온화 구아 검 및 양이온화 전분을 포함한다.
본 발명은 양이온성 화합물로 RNA 발현카세트 기반 요법에 사용된 모든 다당류 중에서, RNA 발현카세트 전달에 매우 적합한 적용 가능한 특성 및 특징적인 특징을 강조하기 위해 키토산을 구체적으로 선택하였다. 키토산의 글루코사민 단량체에서 양으로 하전된 아미노 그룹 또는 히알루론산의 글루쿠론산 단위에서 음으로 하전된 카복실 그룹을 제공한다.
키토산과 같은 양이온성 다당류는 RNA 발현카세트와 정전기적으로 상호 작용하여 안정적으로 양으로 하전된 폴리플렉스를 형성할 수 있으며, RNA 발현카세트의 가장 효율적인 세포내 전달은 양으로 하전된 나노 담체에 의해 명백히 달성된다. 이것은 두 가지 요소로 설명할 수 있다. 첫째, 음으로 하전된 핵산과의 효율적인 물리적 상호 작용은 뉴클레아제 분해로부터 이들을 보호한다. 둘째, 이들은 순 양전하를 제공하여 복합체의 세포의 음이온 표면과의 상호 작용을 향상시킨다.
발명에서 사용되는 양이온성 화합물는, 전체 조성물의 중량을 기준으로, 1 내지 50중량%로 포함될 수 있고, 보다 구체적으로는 2 내지 40중량% , 보다 더 구체적으로는 3 내지 30중량%로 포함될 수 있다. 상기 양이온성 지질의 함량이 전체 조성물의 중량을 기준으로 1중량% 미만이면 RNA 발현카세트와 복합체를 형성할 수 있는 충분한 양이 되지 못하고, 50중량%를 초과하면, 나노입자의 크기가 너무 커져 나노입자의 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있다.
상기 양이온성 화합물과 RNA 발현카세트는, 정전기적 상호작용을 통해 결합하여, 복합체를 형성한다. 구체적인 실시례으로서, 상기 RNA 발현카세트(P)과 양이온성 화합물(N)의 전하량의 비율(N/P; RNA 발현카세트의 음이온 전하에 대한 양이온성 화합물의 양이온 전하 비율)은, 0.5 내지 100일 수 있고, 보다 구체적으로는 1 내지 50, 보다 더 구체적으로는 2 내지 20일 수 있다. 상기 비율(N/P)이 0.5 미만인 경우에는 충분한 양의 RNA 발현카세트를 포함하는 복합체를 형성하기 어렵기 때문에, 0.5 이상이어야 충분한 양의 음이온 약물을 포함하는 복합체를 형성할 수 있어서 유리하다. 반면, 비율(N/P)이 100을 초과할 시에는 독성을 유발할 우려가 있으므로, 100 이하로 하는 것이 좋다.
음이온성 화합물
본 발명의 복합입자(20)는 상기 양이온성 화합물층(21) 외면에 코팅된 음이온성 화합물 층(22)을 포함한다.
상기 RNA 발현카세트로 이루어진 기본 복합입자(10) 입자 외면을 코팅하고 있는 양이온성 화합물 층(21)은 강한 양전하를 띠고 있어 조직 장벽을 통과하기 힘들다는 문제가 있다. 본 발명에서는 이러한 문제점을 해결하고자 생체 적합성이 좋으며 음전하를 띄고 있는 음이온성 화합물을 사용하여 2차로 상기 양이온성 화합물층 외면에 코팅하였다.
본 발명은 RNA 발현카세트, 양이온성 화합물과 음이온성 화합물을 혼합하여 입자를 제조할 수도 있다.
본 발명에 있어서, RNA 발현카세트와 이온 복합체를 형성하기 위하여 반드시 양이온성 화합물을 더 포함한다. 즉 음전하의 RNA 발현카세트는 양이온성 화합물과 정전기적 상호작용으로 인해 양이온성 화합물 내부에 봉입된 이온 복합체를 형성하고, 형성된 이온 복합체는 음이온성 화합물이 코팅하여 음이온성 화합물층(22)이 형성된 복합입자의 코어 부분에 위치한다.
상기 음이온성 화합물 층(22) 코팅단계는 음이온성 화합물을 넣어 상기 입자 외면에 상기 음이온성 화합물 층을 정전기적 인력으로 코팅하는 단계이다.
본 발명에 따른 복합입자는 필수 요소로서 음이온성 화합물을 함유한다. 음이온성 화합물은 인체에 대해 해가 없는 한 제한되지는 않고, 음이온성 화합물의 예는 적합하게는 실크 단백질 피브로인, 혈청알부민을 포함하는 음이온성 단백질, 폴리글루타민산 및 폴리아스파르트산을 포함하는 음이온성 폴리아미노산, 한천, 히알루로난, 콘드로이틴 설페이트, 덱스트란 설페이트, 헤파란 설페이트, 데르마탄 설페이트, 푸코이단, 케라탄 설페이트, 헤파린, 카라기난, 석시노글루칸, 아라비아 고무, 잔탄 검, 알긴산, 펙틴 및 카르복시메틸 셀룰로오스 등의 음이온성 다당류, 폴리아크릴산 및 이의 염을 포함한다. 특히, 히알루로난, 폴리글루타민산 및 이의 염이 적합하게는 언급될 수 있다.
음이온성 화합물로서, 시판 제품을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 음이온성 화합물의 분자량은 제한되지 않고, 바람직하게는 100~100000 kDa, 보다 바람직하게는 200~50000 kDa 이다.
구체적으로, 음이온성 폴리펩타이드로서 실크 단백질 피브로인 (Silk protein fibroin), 글라이아딘 (Gliadin), 알부민를 포함하는 단백질은(체내에서 발견되는 pH 7.4의 물에서 이온화되었을 때)은 음전하를 띤다.
알부민은 Abraxane과 다른 유형의 나노 의학의 향후 개발에서 성공을 보장하는 몇 가지 이점을 제공한다. 1) 알부민은 인간 혈액의 구성 요소이다. 내인성 단백질 (인간 혈청 35-50g / L)로 면역 원성이 없으며 알부민 기반 나노 입자에 대한 생체 적합성을 보장한다. 2) 인간 혈액에서 알부민의 반감기는 평균 약 19 일이다. 유리 약물과 달리 알부민은 혈장 곡선하 면적 (AUC) 값을 개선하는 데 도움이 되는 긴 반감기를 제공하여 상대적으로 긴 시간에 약물 농도를 유지한다. 3) 알부민은 고체 형태의 나노 의약품에 대한 우수한 동결 보호제이며 건조된 나노 입자를 주사 용액에 즉시 재분산할 수 있다. 이러한 장점은 임상 번역 가능한 나노 의약 개발에서 일반적인 문제인 약물 방출 및 침전물 형성을 피함으로써 상온 안정성 나노 의약 개발에 유리하다.
일반적으로 나노 입자를 구성하는 데 사용되는 알부민에는 인간 혈청 알부민 (HSA)과 소 혈청 알부민 (BSA)의 두 가지 유형이 있다. 두 종류의 알부민 모두 혈청 알부민 단백질 (각각 사람 혈청 및 소 혈청)이며 물에 대한 높은 용해도, 혈액 내 긴 반감기, 유사한 분자량 (65-70 kDa), 유사한 수 등 많은 특성을 공유한다. 아미노산 잔기의 수 (HSA의 경우 585 개 아미노산, BSA의 경우 583 개 아미노산). 나노 의약을 구성하는 데있어 눈에 띄는 특성 차이는 없다. 따라서 두 종류의 알부민은 다기능 나노 입자를 설계하는 데 널리 사용되었다. 대체 알부민으로 개발된 기술은 쉽게 대체 될 수 있다.
생체내 고분자 물질중 하나인 혈청 알부민은 생체 적합성이 우수할 뿐 아니라, 혈액 내에서 반감기가 19일에 이르는 매우 안정한 단백질로서 암조직과의 친화성이 우수하여 효과적인 암 축적능을 보인다. 따라서, 혈청 알부민은 다양한 저분자량 화학 약물, 단백질, 항체 등과 화학적으로 결합되어, 여러 약물의 생체 내에서의 안정성을 향상시키고 표적 암부위로 그 약물을 효과적으로 전달하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 대표적 소수성 항암제인 독소루비신(doxorubicin; Drug Delivery 6 (1999) 1-7)이나 메토트렉세이트 (methotrexate, MTX; Anticancer Drugs 8 (1997) 835-844) 등을 화학적으로 알부민에 결합시켜 암 표적성을 향상시키고, 약물의 혈액내 안정성을 향상시킨 연구가 보고된 바 있다. 또한, 알부민의 약물 전달체로서의 이용에 관하여는, 알부민의 암 조직에 대한 높은 표적성에 기초하여 암이 이식된 소동물에 알부민에 형광체를 붙이거나 방사선 동위원소로 표지하여 주입한 뒤 이를 영상화했을 때 많은 양의 알부민이 암 조직에 선택적으로 축적되는 것이 보고되었으며 (Cancer Research 46 (1986) 6387-6392), 이는 암 조직 주변의 느슨한 혈관에서 발생하는 증가된 침투 지연 (The Enhanced Permeability and Retention; EPR) 효과에 의해서 나타나는 것임을 알 수가 있다. 이와 같이 항암제 전달체로서의 알부민의 우수함은 알려진 바 있으나, 알부민 자체만으로는 강한 음전하를 띠는 siRNA 전달체로서 사용하기에는 결합력이 부족하다. 따라서 알부민의 고유한 특성은 유지하되 결합력을 증가시킬 수 있도록 변형이 필요하다.
히알루로난 염 및 폴리글루타메이트 염을 형성하는 염으로서, 소듐, 포타슘, 칼슘, 암모늄, 마그네슘, 염기성 아미노산 염 등이 언급될 수 있다.
보다 구체적으로는, 음이온성 다당류로서 히알루로난 또는 이의 염을 사용하는 경우, 분자량이 바람직하게는 100~2000 kDa, 더욱 바람직하게는 200~1500 kDa인 히알루로난 또는 이의 염을 사용할 수 있다.
또한, 음이온성 화합물로서 폴리글루타민산 또는 이의 염을 사용하는 경우, 분자량이 바람직하게는 500~30000kDa, 보다 바람직하게는 1000~20000 kDa, 더욱 바람직하게는 1500~15000 kDa 인 폴리글루탐산 또는 이의 염을 사용할 수 있다.
음이온성 화합물의 음이온화도는 특별히 한정되지는 않고, 양이온성 폴리펩타이드와의 복합입자의 형성을 촉진하는 관점에서, 하한은 바람직하게는 0.1 이상, 보다 바람직하게는 0.2 이상이다.
다른 한편으로, 양이온성 폴리펩타이드와 복합입자를 형성하는 관점에서, 음이온성 다당류의 음이온화도에 대한 특별한 상한은 없다. 기준으로서, 음이온화도가 2 이하인 음이온성 다당류를 사용할 수 있다.
이와 관련하여, 표현 "음이온화도" 는 이하의 식에 따른 계산에 의해 얻어질 수 있는 값을 나타낸다.
{(폴리머에 함유되는 음이온성 관능기의 수) - (폴리머에 함유되는 양이온성 관능기의 수)｝/ 폴리머를 구성하는 모노머의 총량
본 발명의 음이온성 다당류는 헤파린(heparin), 히알루론산(hyaluronic acid), 콘드로이틴황산(chondroitin sulfate), 카복시 메틸 셀룰로스(Carboxy methyl cellulose), 펙틴(Pectin), 카보폴스(Carbopols), 폴리아크릴레이츠(Polyacrylates) 및 음이온성 지질에서 선택될 수 있다.
상기 음이온성 지질은 포스파티딜세린, 포스파티드산, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜 글리세롤로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
상기 음이온성 다당류는 음전하를 띄며 생체적 합성이 있는 분자를 제한없이 사용할 수 있다.
헤파린은 히드록시기, 카복실기 및 아미노기를 포함하는 구조로, 비분획 헤파린, 분자량 헤파린, 저분자량 헤파린, 헤파린 단편, 재조합 헤파린, 헤파린 유사체, 헤파란 설페이트, 헤파린 활성을 갖는 설폰화된 다당류 등을 사용할 수 있다.
상기 히알루론산(HA)은 기본단위로 디사카라이드 글루쿠로닌산-β(1-3) N-아세틸글루코즈-아민β(1-4)이 최고 50,000쌍으로 구성된 큰 복합 올리고사카라이드이다. 이는 세포외 매트릭스의 주요 성분으로써 생체내에서 발견된다. 이의 3차 구조는 직경이 약 50㎚인 무작위(random) 코일 형태이다.
히알루론산(HA)은 전신 또는 국소적으로 인체의 질병과 질환을 치료하는데 사용되어 왔는 데 그 이유는 질병 또는 질환이 있는 부위로 활성물질을 표적 제공하는 능력이 있기 때문이다. 실험동물에서 손상된 경동맥(손상이 안 된 대측 동맥에 대해)과 대장암에서 HA가 형성됨을 볼 수 있고 이와 같은 실험동물의 피부에 유지된다는 것이 알려져 있다. 본 발명에서 사용 가능한 상기 음이온성 다당류로의 중량 평균 분자량은 5 ~ 90 K 범위일 수 있다.
히알루론산 등의 상기 음이온성 다당류층은 상기 양이온성 폴리펩타이드층 외면에 정전기적 인력으로 코팅된다. 상기 기본 복합입자와 상기 히알루론산의 중량비가 1:0.5~2(기본 복합입자:HA) 범위일 수 있다.
본 발명의 히알루론산(hyaluronic acid)은 아미노산과 우론산으로 이루어지는 복잡한 다당류의 하나로 세포독성이 없는 천연 분자 물질이며 체내 안정성이 뛰어나고 상기 히알루론산을 흡수할 수 있는 다양한 수용체가 존재하는 장점이 있다. 체내에 존재하는 히알루론산 수용체 중 CD44 수용체는 대부분의 암세포에 과발현되는 수용체로서 암을 선택적으로 표적하는 치료제의 타겟으로 사용될 수 있다.
상기 음이온성 화합물 층은 최외곽층을 형성하고, 따라서, 상기 복합입자도 그 외부가 (-)전하를 나타낸다. 정상 피부의 경우에는 입자 표면의 정전기적 성질이 피부의 투과에 영향을 약간 미치긴 하는데, 양이온성 성질이 이를 더 높인다고 알려져 있다. 하지만, 피부 같은 경우에는 피지 지질(sebaceous lipid)과 상피 인지질(epidermal phospholipid)에서의 지방산의 구조가 손상되며, 이러한 결과로 인한 피부의 산성도(acidity)의 감소는 본 발명과 같이 (-) 성질을 띤 음이온성 복합입자의 침투를 용이하게 만든다.
본 발명의 약물 조성물은 약학적 유효성분인 RNA 발현카세트(코어), 양이온성 화합물층(중간층) 및 음이온성 화합물층(최외각층)로 구성되며, 입자 크기는 50~500nm, 바람직하게는 100~400nm, 더욱 바람직하게는 150~300nm 일 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 코어로 제공되는 약학적 유효성분으로 복합체 하이드로겔보다 입자 사이즈가 감소되었다.
본 발명은 상기 RNA 발현카세트와 양이온성 폴리펩타이드로 이루어진 기본 복합입자의 외면층과 히알루론산 층을 더 포함하므로 생체 내 RNA 발현카세트를 분해시키는 효소로부터 RNA 발현카세트를 보호할 수 있다.
또한, 본 발명은 마이크로 사이즈 또는 이에 준하는 나노 사이즈의 크기를 갖는 약학적 유효성분으로 하는 RNA 발현카세트를 응축시켜 나노 사이즈로 입자 크기를 줄이고, 또한, 최외곽층을 (-) 전하를 띄는 히알루론산으로 코팅함에 따라 피부 장벽 통과가 용이한 입자를 제공할 수 있다.
천연 다당류
천연 다당류는 동물 (예: 키토산, 히알루론산), 식물 (예 : 전분, 셀룰로오스, 시클로 덱스트린, 펙틴), 조류 (예 : 알기네이트) 또는 박테리아 (예 : 덱스트란)에서 얻을 수 있다. 농업 및 식품 산업에서 화장품, 제약 및 생의학 분야에 이르기까지 광범위한 응용 분야가 있다. 다당류는 중성 또는 하전, 선형 또는 분지형 및 다양한 정도의 친수성을 갖는 탄수화물 구조를 형성하는 단당류에 의해 형성된다.
약물 전달을 위한 의약품에 천연 다당류가 널리 사용되는 것은 생체 적합성, 생분해 성 및 저독성이다. 또한 후자의 독성을 완화하기 위한 전략으로서 합성 재료와 조합하여 사용되어왔다. 이들의 구조적 다양성은 최종 적용의 필요에 따라 각 경우에 가장 적합한 다당류를 선택할 수 있게 하며, 더욱 중요한 것은 그들의 기능적 그룹에 대한 화학적 변형에 의해 기능적 특성이 조정되고 최적화 될 수 있다는 점이다.
많은 천연 다당류는 특정 작용기의 존재로 인해 생물학적 접착 특성을 가지므로 체류 시간이 개선된 나노 캐리어 디자인, 특히 장 및 폐 응용 분야에 유용한 출발 물질이 된다. 이러한 기의 존재는 또한 그의 전달 또는 표적화 능력을 향상시키기 위한 중합체 구조의 특정 변형을 허용한다. 또한, 천연 다당류는 중성 (예를 들어, 셀룰로오스, 풀루란, 전분, 덱스트란), 음으로 (예를 들어, 히알루론산, 알기네이트, 콘드로이틴 설페이트), 또는 양으로 하전된 (예를 들어, 키토산) 일 수 있다.
다당류의 종류
Animal Polysaccharides
Chitin
Chitosan
Glycosamminoglycans
Vegetal Polysaccharides
Land Vegetal Marine Vegetal
Cellulose
Pectins
Galactomannans
Acacia gum
Starch 		Alginate (Phaeophyceae brown seaweed)
Agar (Rhodophyceae red seaweed)
Carragenans (Rhodophyceae red seaweed)
-
-
Microorganis/Fungi
Alginate (Pseudomonas aeruginosa and Azotobacter vinelandii)
Dextran (Leuconostoc spp. and Lactobacillus spp.)
Gellan (Pseudomonas elodea)
Pullulan (Aureobasidium pullulans)
Scleroglucan (Sclerotium glucanicum) Xanthomonas campestris
Xanthan (Xanthomonas campestris)
RNA 발현카세트 기반 요법에 사용된 모든 다당류 중에서, 본 발명자들은 RNA 발현카세트 전달에 매우 적합한 적용 가능한 특성 및 특징적인 특징을 강조하기 위해 히알루론산을 구체적으로 선택하였다. 히알루론산은 점막 점착성 폴리머이지만, 반대 전하를 가지고 있어 핵산 전달에 그 사용에 크게 영향을 미친다. 이러한 중요한 차이는 화학적 구조로부터 유래하는데, 이는 히알루론산의 글루쿠론산 단위에서 음으로 하전된 카복실 그룹을 제공한다.
한편, RNA 발현카세트 발현카세트와 히알루론산과 같은 음이온성 다당류와의 회합은 사구체 모세관 벽을 통한 RNA 발현카세트 배출을 피함으로써 생체 이용률을 향상시킬 수 있다. 실제로, 음으로 하전된 종은 사구체 막의 음전하로 확립된 반발력으로 인해 "필터링이 불가능하다".
변형된 이온성 분자
<변형된 양이온 분자>
본 발명에 따르면, 상기 RNA 발현카세트와 양이온성 폴리펩타이드는 정전기적 상호작용으로 결합되어 있으며, 상기 양이온성 폴리펩타이드에 공유결합된 담즙산 또는 그의 유도체는 친수성의 이온성 기를 가진 형태로 입자의 표면에 위치하게 할 수도 있다.
담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 1종 이상의 양이온성 폴리펩타이드 및 복합체를 포함하고, 상기 공유결합된 담즙산 또는 담즙산 유도체는 이온성 기를 가지고 있는 입자를 제공한다.
본 발명의 입자는 담즙산 또는 이의 유도체가 공유결합된 양이온성 폴리펩타이드 및 복합체 간의 정전기적 상호작용으로 형성되거나, 담즙산 또는 이의 유도체가 공유결합된 음이온성 다당류, 양이온성 폴리펩타이드 및 RNA 발현카세트 간의 정전기적 상호작용으로 형성된 것으로, 보다 안전하게 RNA 발현카세트의 세포 내재화를 유도할 수 있다.
즉, 본 발명의 기본 복합입자는 양이온성 폴리펩타이드와 RNA 발현카세트가 입자의 코어에 존재하며, 친수성의 이온성 기를 가지는 담즙산이 입자의 표면에 위치하는, 담즙산이 표면 수식된 형태의 입자이다.
상기 RNA 발현카세트를 표적 세포로 전달하기 위하여 본 발명의 담즙산이 표면 위치하는 입자를 사용하는 경우 장 점막을 통해 복합체를 잘 전달함과 동시에 입자의 코어에 존재하는 이온 복합체로 인하여 위장관에서 매우 안전하였다. 이로부터 본 발명에 따른 복합체 전달용 입자는 경구 투여용으로 매우 적합함을 알 수 있다.
본 발명에서 상기 담즙산 또는 이의 유도체는 이온성 분자와 공유결합될 수 있는 작용기 이외에 친수성의 이온성 기를 가지고 있다. 상기 이온성 분자는 디옥시콜린산 (DCA: deoxycholic acid), 우로디옥시콜린산 (taurodeoxycholic acid), 타우로콜린산 (TCA: taurocholic acid), 글리코콜린산(glycocholic acid) 및 글리코케노디옥시콜린산(glycochenodeoxycholic acid)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 담즙산은 소장의 회장 부분을 통해 95%이상의 높은 효율로 흡수가 되어 간으로 흡수되는데 이를 '장간 순환(enterohepatic circulation)'이라 하며, 이러한 장간 순환으로 지질 이동에 중요한 역할을 하는 생물학적 계면활성제로, 말단 장 부분에 존재하는 ASBT(apical sodium-dependent bile acid transporter)에 의해 특이적으로 인식되므로, 경구 전달에 있어서 표적 리간드로 작용할 수 있다.
즉, 회장 부분을 통해 흡수가 이루어지는 답즙산은 상기 RNA 발현카세트 전달용 입자의 표면에 위치함으로써 ASBT를 통하여 기존의 경구 투여 방식의 가장 큰 문제점인 장 내벽을 통한 상기 RNA 발현카세트 전달용 입자의 타겟 세포내 흡수를 증대시키는 역할을 한다. 이로 인하여 본 발명의 RNA 발현카세트 전달용 입자는 담즙산을 흡수하는 회장 부분을 통해 흡수가 용이하므로 경구용으로 사용될 수 있으며, 이로 인하여 약물의 생체내 이용률을 증대시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 담즙산 또는 이의 유도체는 이온성 분자의 작용기 수에 따라 공유결합되는 정도가 달라질 수 있다. 바람직하게 상기 담즙산 또는 이의 유도체 및 이온성 분자는 1:1 내지 1:300의 몰비로 공유결합될 수 있다.
바람직하게, 상기 담즙산 또는 이의 유도체 및 키토산의 경우 1:1 내지 1:100의 몰비로 공유결합될 수 있다.
바람직하게, 상기 담즙산 또는 이의 유도체 및 헤파린의 경우 1:1 내지 1:30의 몰비로 공유결합될 수 있다.
바람직하게, 상기 담즙산 또는 이의 유도체 및 히알루론산의 경우에는 1:1 내지 1:200의 몰비로 공유결합될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 RNA 발현카세트 입자는 입자 크기에 관계없이 흡수가 가능하나, 바람직하게는 500 nm 이하일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 100 내지 300 nm이다.
본 발명에 있어서, RNA 발현카세트와 상기 담즙산 또는 담즙산 유도체가 이온결합된 이온성 분자는 1:0.5 내지 1:70의 질량비, 바람직하게는 1:0.5 내지 1:5의 질량비로 결합될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 담즙산 또는 담즙산 유도체가 이온결합된 복합체 및 양이온성 폴리펩타이드는 1:0.5 내지 1:10, 바람직하게는 1:0.5 내지 1:5 질량비로 혼합될 수 있다. 양이온성 폴리펩타이드가 결합할 수 있는 한계가 있고 최적의 강한 결합능력을 가질 수 있는 범위에서만 전달이 가능하기 때문에 상기 범위 내에서 양이온성 폴리펩타이드와 RNA 발현카세트의 정전기적 상호작용에 따른 이온복합체의 형성이 잘 이루어진다.
<변형된 음이온 분자>
또한, 본 발명은 담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 1종 이상의 음이온성 다당류, RNA 발현카세트를 포함하는 RNA 발현카세트/양이온성 폴리펩타이드 입자를 포함하고, 상기 공유결합된 담즙산 또는 담즙산 유도체는 이온성 기를 가지고 있는 RNA 발현카세트 입자를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 타우로콜린산은 담즙산의 일종으로 체내에서 분비되어 소화과정 중 지질 또는 비타민의 흡수를 돕는 물질로 알려져 있으며 장간 순환을 통해 90%이상 재흡수되는 특징이 있다. 상기 타우로콜린산은 소화과정에서 소장 말단에서 ASBT(Apical Sodium dependent Bile acid Transporter)에 의하여 대부분이 흡수된다. 따라서 타우로콜린산을 히알루론산에 결합하여 입자를 제조하면 소장에서의 경구 흡수율을 향상시킬 수 있으며 장간 순환을 통한 전달성이 향상되는 장점이 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 히알루론산(hyaluronic acid)-타우로콜린산(taurocholic acid) 결합체를 제공한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 히알루론산-타우로콜린산 결합체는 히알루론산과 타우로콜린산이 1:1~1:100 범위의 첨가몰비(feed mole ratio, 히알루론산:타우로콜린산)로 혼합되어 제조되며 음전하를 띠는 특징이 있다.
상기 히알루론산-타우로콜린산 결합체가 양전하의 특성을 띠면 양전하의 특성을 가지는 RNA 발현카세트/PS 결합체와 결합할 수 없는 단점이 있다.
본 발명에 따르면, 상기 히알루론산-타우로콜린산 결합체는 히알루론산과 타우로콜린산이 1:1～1:100 범위의 첨가몰비(feed mole ratio, 히알루론산:타우로콜린산)로 혼합하여 제조할 수 있다. 바람직하게는 상기 히알루론산-타우로콜린산 결합체는 히알루론산과 타우로콜린산이 1:1~1:50 범위의 첨가몰비로 혼합하여 제조할 수 있으며 보다 바람직하게는 1:10 범위의 첨가몰비로 혼합하여 제조할 수 있다.
상기 히알루론산과 타우로콜린산을 1:1 범위 미만의 첨가몰비로 혼합하여 제조하면 복합체/PS를 코팅하는데 효율적이지 않으며 상기 히알루론산과 타우로콜린산을 1:100 범위를 초과한 첨가몰비로 혼합하여 제조하면 결합비율이 유사한 히알루론산-타우로콜린산 결합체만이 만들어지므로 경제적으로 효율적이지 않다.
본 발명의 경구투여용 복합체 입자는 상기 RNA 발현카세트/PS가 히알루론산-타우로콜린산 결합체에 의해 코팅된 형태를 가진다.
상세하게는 본 발명의 경구투여용 복합체 입자는 내부에 상기 RNA 발현카세트/PS가 위치하고 상기 RNA 발현카세트/PS의 표면에 상기 히알루론산-타우로콜린산 결합체가 코팅된 형태를 가지며 음전하의 특성을 가지고 입자의 직경이 250nm 이하이며 상기 RNA 발현카세트/PS 단백질의 봉입률이 90% 이상인 특징이 있다.
상기 RNA 발현카세트/PS 입자의 직경이 100nm를 초과하면 하기 HA-TCA 결합체의 코팅으로 제조된 RNA 발현카세트/PS/HA-TCA 복합입자의 크기가 250nm를 초과하여 입자로서의 장점이 사라질 수 있으므로 이를 고려하여 상기 RNA 발현카세트/PS 기본 복합입자의 직경이 100nm 이하가 되도록 제조하는 것이 바람직하다. 또한 상기 RNA 발현카세트PS 기본 복합입자의 전하특성이 음전하를 띠게 되면 음전하를 띠는 HA-TCA 결합체와의 결합(코팅)이 어려운 단점이 있으므로 상기 RNA 발현카세트PS 기본 복합입자가 양전하를 띠도록 제조하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 RNA 발현카세트PS/HA-TCA 복합입자의 약제학적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 상기 음이온 분자에 표적화 분자를 공유결합으로 연결할 수도 있다. 상기 복합체 입자를 능동적 운반체로 사용할 수 있다. 상기 표적화 분자는 세포표면에 결합하는 화합물, 항체 또는 펩티드, 압타머 또는 이들의 조합일 수 있다.
2. RNA 발현카세트를 포함하는 복합입자의 제조
본 발명에서 제조하는 복합입자는 폴리머기반 나노입자 또는 하이드로 겔일 수 있다. 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명에서, 먼저, RNA 발현카세트의 수용액, 양이온성 화합물의 수용액과 음이온성 화합물의 수용액을 각각 별도로 제조되며 다음으로, RNA 발현카세트와 양이온성 화합물을 포함하는 기본 복합입자의 수용액을 제조되고, 이어서, 상기 기본 복합입자 수용액과 음이온성 화합물 수용액을 서로 혼합하여 RNA 발현카세트 전달용 복합입자를 제조할 수 있으며, 이를 제1 방법이라고 지칭하였다.
본 발명에서, 먼저, RNA 발현카세트의 수용액, 양이온성 화합물의 수용액과 음이온성 화합물의 수용액을 각각 별도로 제조되며 다음으로, RNA 발현카세트, 양이온성 화합물 및 음이온성 화합물을 서로 혼합하여 RNA 발현카세트 전달용 복합입자를 제조할 수 있으며, 이를 제2 방법이라고 지칭하였다.
여기서, RNA 발현카세트, 양이온성 화합물 또는 음이온성 화합물은 각각에서 선택되어진 한 종류 또는 그 이상일 수도 있다. 목적에 따라 각각의 비율을 달리할 수 있다.
본 발명은 먼저, 유효성분으로 RNA 발현카세트와 양이온성 화합물로 핵, 기본 복합입자를 제조한다.
본 발명에서, 양이온성 화합물은 폴리펩티드, 펩티드. 알릴계 아민 폴리머, 또는 양이온성 다당류이다. 이들 양이온성 화합물을 사용하는 것에 의해, 기본 복합입자의 안정성을 향상시킬 수 있다.
본 발명은 양이온성 화합물은 RNA 발현카세트와 기본 복합입자를 형성한다. 본 발명은 또한 상기 서술한 복합입자의 제조 방법에 관한 것이다. 즉, 본 발명의 제조 방법은, 수성 용매 중에서, RNA 발현카세트와 양이온화도가 0.2이상인 양이온성 화합물을 혼합하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따르면, 상기 서술한 기본 복합입자를 용이하게 제조할 수 있다.
본 발명은 RNA 발현카세트 수용액 (A), 및 양이온성 화합물의 수용액 (B)를 별도로 제조하고, 이들 수용액을 서로와 혼합하는 것을 특징으로 한다. 이로써, (A) 및 (B)의 수용액을 별도로 제조하여 기본 복합입자의 응집을 방지할 수 있다.
또한, 상기 기재된 수용액 (A)에 있어서의 RNA 발현카세트의 농도는 바람직하게는 1.7 mM 이하이다. 또한, 상기 기재된 수용액 (B)에 있어서의 전체 양이온성 화합물의 농도는 바람직하게는 1.7 mM 이하이다. 수용액 (A) 및 (B)에 있어서의 폴리머의 농도를 상기 기재된 범위로 설정함으로써, 응집하기 어려운 기본 복합입자를 제조할 수 있다.
본 발명은 상기 서술한 제조 방법에 의해 제조된 기본 복합입자에 관한 것이다. 본 발명의 기본 복합입자는 안정성이 우수하다.
프로타민, 세포투과성 펩타이드, 키토산과 같은 양이온성 화합물은 RNA 발현카세트와 정전기적으로 상호 작용하여 안정적으로 양으로 하전된 폴리플렉스, 기본 복합입자를 형성할 수 있다.
키틴은 셀룰로오스 다음으로 두 번째로 풍부한 천연 다당류이며 N-아세틸 글루코사민으로 구성된다. 키틴은 갑각류 외골격로부터 탄산 칼슘의 용해와 단백질 제거로 제조할 수 있다. 키토산은 키틴에 있는 N-아세틸 글루코사민 잔기의 전체 또는 부분 탈아세틸화로 제조된다. 키토산은 β (1 → 4) 글리코시드 결합으로 연결된 글루코사민과 N-아세틸 글루코사민의 공중 합체로 구성되며, 키틴의 부분적 알칼리 탈아세틸화로 제조된다. 키틴과 키토산은 생체 조직과 생체 적합성이 있으며 독성이 없다. "키토산"은 일반적으로 50 % 미만의 N-아세틸 글루코사민 잔기를 포함하는 천연 양이온성 바이오 폴리머를 의미한다. 키토산의 용해도, 소수성 및 정전기적 특성은 탈아세틸화 정도와 분자량에 따라 결정된다. 키토산은 리소자임에 의해 가수 분해되므로 생분해성 고분자이다. 키토산의 분해산물은 생체 적합성, 비발암성, 비면역성이며 항균 활성, 저콜레스테롤 혈증 기능, 항종양 활성 상처 치유의 기능 및 자극과 같은 생물학적 활성이 있다.
본 발명에 따라 양이온성 키토산과 음이온성 RNA 발현카세트는 정전기적인 상호작용으로 PEC(기본 복합입자)를 제조할 수 있어 키토산은 본 발명의 음이온성 RNA 발현카세트의 운반체로 사용할 수 있다.
키토산은 희석된 염산, 아세트산, 프로피온산, 아스코르브 산과 같은 산성 용매에만 용해되므로 이 시약은 상처 드레싱 및 생물학적 접착 치료에서 생체 물질로 취급하기 어렵다. 폴리머에 고급 기능성을 제공하기 위해 광범위한 pH 범위에서 키토산의 수용성을 변형을 통해 개선할 수 있다. 상기 변형에는 유당, 말토오스 및 셀로비오스를 포함한 다양한 유형의 이당류를 사용하여 탄수화물 분지화 및 유도체화에 대한 변경이 포함되었다. 반대로 하전된 바이오폴리머 사이의 정전기적 상호 작용에 의해 형성된 다목적 제형으로서 PEC에 대한 정의에 따르면 키토산 (및 유도체) 기반 하이드로 겔은 PEC를 형성할 수 있다. 키토산 기반 PEC 하이드로 겔은 가교 및 수화 키토산의 네트워크로 정의된다. 키토산 하이드로 겔은 이 정의에 따라 비가역적 공유 결합에 의해 형성된 화학적 키토산 하이드로 겔과 다양한 가역적 결합에 의해 형성된 물리적 키토산 하이드로 겔의 두 그룹으로 분류된다.
물리적 키토산 하이드로 겔에는 이온 가교 콜로이드, PEC 및 알기네이트, 키토산 및 후코이단을 포함하는 ACF-HS(alginate/chitosan/fucoidan complexed hydrocolloid sheets)가 포함된다. 대조적으로, 화학적 키토산 하이드로 겔에서 키토산과 그 유도체는 저 분자량 가교제에 의해 공유적으로 상호 연결되어 3 차원 (3D) 수화 네트워크를 형성한다. 키토산 및 그 유도체의 반복 단위에 대한 가교제의 몰비에 의해 결정되는 가교 밀도는 화학적으로 가교된 키토산 하이드로 겔의 특성에 영향을 미친다. 본 발명에 따라 이런 키토산 기반 PEG 하이드로 겔은 본 발명의 RNA 발현카세트에도 충분히 활용할 수 있다.
공유 가교된 키토산 하이드로 겔의 제조는 디알데히드로서의 글루타르알데히드와 같은 키토산 사슬을 가교하기 위해 2개 이상의 반응성 기를 갖는 가교제의 사용을 필요로 한다. 그러나 하이드로 겔에서 자유 미반응 디알데히드를 완전히 제거하는 것은 어렵기 때문에 독성 효과를 유발할 수 있다. 그림 1B는 광 가교제의 존재하에 가시광선 또는 자외선에 노출될 때 형성되는 광가교된 키토산 하이드로 겔을 제조할 수 있다.
37℃에서 형태 변화로 인해 졸-겔 전이를 나타내는 온도에 민감한 키토산 하이드로 겔을 제조할 수 있다. 키토산은 고유한 열에 민감한 특성이 없기 때문에 온도에 민감한 키토산 하이드로 겔을 만들기 위해서는 온도에 민감한 물질의 도입이 필요하다. 예를 들어, 키토산과 β-글리세로포스페이트 (β-glycerophosphate) 또는 폴리에틸렌글리콜 (PEG)로 구성된 온도에 민감한 하이드로 겔이 열 및 pH 변화에 대한 졸-겔 전이를 제조할 수 있다. 이 하이드로 겔은 세포와 기능성 단백질의 운반체로 평가되었다. 본 발명에 따라 이런 키토산 기반 PEG 하이드로 겔은 본 발명의 RNA 발현카세트에도 충분히 활용할 수 있다.
락토비온 산(lactobionic acid)과 광 반응성 p-아지도벤조 산(p-azidobenzoic acid)을 모두 포함하는 광가교성 키토산 유도체(Az-CH-LA)는 광가교제로 사용된다. 사용된 키토산의 분자량은 300 ~ 500kDa이고 탈아세틸화 정도는 80%이다. 유당 모이어티는 키토산의 아미노기와 축합 반응을 통해 도입된다. 2% 락토비온 산이 도입된 키토산(CH-LA)은 심지어 중성 pH에서도 3w%까지 우수한 수용성을 나타낸다. 또한, 2cm의 램프 거리 (guide fiber unit(SF-101BQ)가 있는 Spot Cure ML-251C / A) 및 250W 램프 (240-380nm, 주요 피크가 340 nm 있는 Usio Electrics Co., Ltd., Tokyo, Japan)에서 자외선 (UV) 조사를 적용하여 2.5% p-azidebenzoic acid를 도입한 Az-CH-LA는 30 초 이내에 불용성 하이드로 겔을 제조할 수 있다. 3 % 이하의 Az-CH-LA 용액을 조직에 주입할 수 있으며 UV 광선으로 외부 조사 후 불용성 하이드로 겔이 형성된다. 또한 가교 폴리 도파민/나노 셀룰로오스 하이드로 겔, 온도에 민감한 키토산 기반 주사 가능한 하이드로 겔, PEG 폴리 (L- 알라닌) 써모 겔, chitosan-alginate hybrid hydrogels, 히알루로네이트/알지네이트를 포함한 다른 유형의 키토산 하이드로 겔이 생체 재료로 제조할 수 있다. 하이드로 겔, pH- 반응성 탄닌산-카르복실화 아가로스 복합 하이드로 겔, 카테콜 기능화된 키토산/플루로닉 하이드로 겔, UV 가교 생분해성 젤라틴을 포함하는 이 모든 하이드로 겔은 조직 접착제 및 조직 공학에서 상처 치유를 위한 잠재적인 응용 프로그램을 가지고 있다.
상기 키토산 기반 PEG 하이드로 겔은 본 발명의 RNA 발현카세트와 함께 제조되어 정전기적인 상호작용에 의해 자기 조립으로 제조할 수 있어 본 발명의 RNA 발현카세트에 대한 운반체로 충분히 활용할 수 있다.
키토산은 빠른 진피 재생을 촉진하고 대식세포를 자극하고 상처 치유에 필수적인 초기 사건인 호중구의 화학 유인제로 작용하여 상처 치유를 가속화한다. 호중구는 미생물을 죽이고 죽은 세포를 제거하며 다른 면역계 세포를 자극하여 감염 기회를 줄임으로써 전반적인 치유를 향상시킨다. 키토산과 그 유도체는 상처 치유를 위한 드레싱으로 적용되었다. 수용성 키틴/키토산 (WSC) 용액은 더 높은 인장 강도를 나타내며 불용성 키틴 및 키토산 분말보다 빠른 치유를 촉진한다. 분말에 비해 WSC 용액의 높은 생분해성과 친수성은 생체 적합성과 상처 치유 자극 활성을 증가시킬 수 있다. 또한 키토산은 사이토카인, GF 및 세포 외 기질 성분과 같은 여러 기능 분자와 결합되어 치유 과정을 개선한다. 키토산은 욕창 궤양과 상처 입은 반월판 조직의 치유를 향상시키고 치유 중 흉터 형성과 수축을 억제한다.
본 발명에 따라 상처 치유를 위해서 GP RNA 발현카세트를 포함하는 키토산 기반 PEC 하이드로 겔(PCH)은 구성성분간 정정기적인 상호작용에 의해 자기조립으로 제조할 수 있어 PCH는 본 발명의 RNA 발현카세트의 운반체로 충분히 활용할 수 있다.
정상 마우스와 쥐의 상처를 치료를 위한 PCH(photo-crosslinked chitosan hydrogel)의 적용은 현저한 상처 수축을 유도하여 상처 봉합 및 치유 과정을 가속화한다. 또한 PCH는 혈관 신생 GF의 지속적인 방출을 나타내어 생체 내에서 담체로 작용하고 혈관 형성을 촉진한다. 예를 들어, 섬유 아세포 성장인자 2 (FGF-2)는 PCH에서 키토산 분자와 상호 작용하며 생체내 생분해 동안 PCH에서 점차적으로 방출할 수 있다.
한편, RNA 발현카세트의 가장 효율적인 세포내 전달은 양으로 하전된 기본복합입자에 의해 두 가지 요소를 확인할 수 있다. 첫째, 음으로 하전된 RNA 발현카세트와의 효율적인 물리적 상호 작용은 뉴클레아제 분해로부터 이들을 보호한다. 둘째, 이들은 순 양전하를 제공하여 복합체의 세포의 음이온 표면과의 상호 작용을 향상시킨다.
상기 기본 복합입자 및 음이온성 다당류를 pH 6.5 전후의 중성 영역의 수성 용매 중에서 혼합함으로써, 복합입자를 제조할 수 있다.
본 발명에서 프로타민, 세포투과성 펩타이드, 키토산과 같은 양이온성 화합물 및 이들의 유도체로 구성된 기본 복합입자의 특징을 유지하며, RNA 발현카세트, 프로타민, 세포투과성 펩타이드 또는 키토산과 같은 양이온성 화합물 및 히알루론산 또는 이들 다당류의 유도체와 같은 음이온성 화합물의 상호 작용에 의존하는 RNA 발현카세트 전달체, 복합입자를 개발하였다.
본 발명의 복합입자는, pH 가 6.5 전후인 수성 용매 중에서 기본 복합입자 및 음이온성 화합물을 혼합하는 것을 특징으로 하는, RNA 발현카세트, 양이온성 화합물 및 음이온성 화합물을 함유하는 복합입자의 제조할 수 있다. 중성 및 음이온성 화합물은 종종 RNA 발현카세트와 보다 효율적인 상호 작용을 하여 복합입자를 제조하기 위해 다른 성분의 존재를 필요로 한다.
본 발명에서 개발한 복합입자에서 RNA 발현카세트와 히알루론산과 같은 음이온성 화합물의 회합은 사구체 모세관 벽을 통한 RNA 발현카세트 배출을 피함으로써 생체 이용률을 향상시킬 수 있다. 실제로, 음으로 하전된 물질은 사구체 막의 음전하로 발생하는 반발력으로 인해 "필터링이 불가능하다".
본 발명의 제조 방법에 따르면, 비교적 입자 직경이 작고 음이온성 화합물 및 RNA 발현카세트를 함유하는 복합입자를 제조할 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 음이온성 화합물은 히알루로난이다.
본 발명의 복합입자는 음이온성 화합물 및 RNA 발현카세트를 피부 내부에 침투시킬 목적으로 사용할 수 있다.
본 발명은 바람직하게는 인체에 유용한 작용을 갖는 RNA 발현카세트를 함유하는 복합입자의 제조에 적용된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, RNA 발현카세트의 수용액, 양이온 폴리머의 수용액 및 음이온성 화합물의 수용액은 별도로 제조되고, 이러한 수용액은 서로 혼합하여 RNA 발현카세트 전달용 복합입자를 제조할 수도 있으며, 이를 제2 방법이라 지칭하였다.
이로써, RNA 발현카세트의 수용액, 양이온 폴리머의 수용액 및 음이온성 화합물의 수용액을 별도로 제조하는 상기 구현 예를 취함으로써, 복합입자의 응집을 방지할 수 있다.
상기 복합입자 제조는 RNA 발현카세트를 포함하는 수용액, 양이온성 화합물을 포함하는 수용액 및 음이온성 화합물을 포함하는 수용액을 별도로 제조하고 이들 수용액을 서로와 혼합하는 것을 특징으로 하며 상기 혼합물을 초음파분쇄기(ultrasonicator)로 분산시키는 것을 포함할 수도 있다.
상기 초음파분쇄기로는 배쓰 타입 초음파분쇄기(bath type ultrasonicator)를 사용하는 것이 바람직하다. 배쓰타입 초음파분쇄기는 20 내지 40 W/L(Watt/Liter)의 약한 초음파분쇄를 제공하고 매우 불균일한 분포를 제공하는 것으로 알려져 있는 반면, 프로브 타입 초음파분쇄기(probe type ultrasonicator)는 대략 20,000 W/L을 가할 수 있다. 프로브 타입의 초음파분쇄기가 집중되고 균일한 초음파 강도 투입으로 인해 배쓰형 타입 초음파분쇄기 보다 약 1,000배 우수함을 의미하는 것이다.
일반적으로, RNA 발현카세트는 그 불안정성으로 인해, 초음파 분쇄가 불가능하거나 곤란한 것으로 알려져 있었으나, 본 발명과 같이 RNA 발현카세트를 고분자 나노입자 내에 봉입시킴으로써 비로소 초음파분쇄기를 사용하는 것이 가능해져 전달체 제조 시 보다 편리하고 효율적인 제조가 가능하다.
다른 실시례에서, 글리코사미노글리칸 (glycosaminoglycans, GAG)은 헤파리노이드 heparinoids[헤파린(heparin/헤파린 설페이트(heparin sulfate, HS) 및 기타 헤파린 유사 분자(heparin-like molecules)], 콘드로이틴 설페이트 (chondroitin sulfate), 더마탄 설페이트(dermatan sulfate) 및 케라탄 설페이트(keratan sulfate)와 같은 다당류 사슬이다. 모두 밀도와 위치가 다른 음전하를 띤다. 헤파리노이드는 헤파린 결합 성장인자(GF), 사이토카인, 세포외 기질 성분 및 접착 분자를 포함한 다양한 기능성 단백질과 상호 작용한다. 헤파리노이드의 대부분의 생물학적 기능은 이러한 기능성 단백질이 특정 도메인에 의해 매개되는 다당류 사슬에 결합하는 데 달려 있으며, 이는 서로 다른 당류 서열을 가지고 있다. 예를 들어, 헤파리노이드와 섬유 아세포 성장인자 (FGF)-1 및 FGF-2의 상호 작용은 서로 다른 설페이트 그룹 조합을 필요로 하므로 서로 다른 사카라이드 서열이 필요하다. 또한 특정 헤파리노이드 구조는 간세포 성장인자 및 혈관 내피 성장인자 (VEGF)와 상호 작용한다. 반대로 하전된 고분자 전해질 사이의 정전기적 상호 작용은 고분자 전해질 복합체(Polyelectrolyte Complexes, PECs)를 생성한다. 합성 및 천연 PEC 모두 단백질과 상호작용할 수 있다. PECs와 본 발명의 RNA 발현카세트의 정전기적인 상호 작용은 분산, 용해성 복합체, 유화 및/또는 무정형 침전물의 형성을 초래한다.
본 발명에 따라 음이온성 RNA 발현카세트, 양이온성 화합물 및 음이온성 Glycosaminoglycan (GAG)의 정전기적인 상호작용에 의한 자기조립으로 GAG 기반 PEC(복합입자)를 자기조립으로 제조할 수 있어 GAG 기반 PEC는 본 발명의 RNA 발현카세트의 운반체로 사용할 수 있다.
광 가교제 photocrosslinker, 이온가교 키토산 히드로 겔의 첨가에 의해 형성된 광가교 키토산 히드로겔 (photo-crosslinked chitosan hydrogel, PCH)과 같은 키토산과 가교제의 화학적 상호 작용에 의해 형성된 PEC 히드로 겔에 초점을 맞추고 있다. 온도에 민감한 키토산 하이드로 겔, 하이드로 콜로이드]는 가교제를 추가하지 않고 고분자 사슬 사이의 직접적인 상호 작용에 의해 형성된다. 또한 PCH 및 alginate/chitosan/fucoidan 복합 하이드로 콜로이드 시트(alginate/chitosan/fucoidan complexed hydrocolloid sheets, ACF-HSs) 및 PEC와 같은 키토산 기반 생체 재료의 잠재적인 의료 응용에 대해 많이 알려지고 있다.
본 발명에 따라 이런 ACF-HS 및 PEC는 본 발명의 RNA 발현카세트를 첨가하여 정전기적 상호작용에 의한 자기조립으로 복합입자로 제조할 수 있어 본 발명의 RNA 발현카세트에도 충분히 활용할 수 있다.
프로타민과 키토산과 같은 염기성 고분자와 복합된 GAG와 같은 산성 고분자는 정전기적 상호 작용을 통해 PEC를 형성한다. PEC의 산성 및 염기성 폴리머는 단백질의 등전점 위와 아래에서 사이토카인 및 GF와 같은 다양한 단백질에 결합한다. 이러한 상호 작용은 나노 입자, 콜로이드 입자, 용해성 복합체 및 무정형 침전물과 같은 다양한 형태를 생성한다(그림 3). 하전 폴리머 사이의 정전기적 상호 작용은 생물학적 상호 작용과 유사하기 때문에 매우 흥미롭다. 예를 들어, 핵산과 단백질 간의 상호 작용은 전사 과정에서 중요한 역할을 한다.
본 발명에 따라 RNA 발현카세트 함유 Glycosaminoglycan (GAG) 기반 PEC로부터 RNA 발현카세트를 안정화, 활성화 및 점진적으로 방출함으로써 본 발명의 RNA 발현카세트에도 충분히 활용할 수 있다.
키토산 PEC, 키토산/히알루로네이트 PEC, 키토산/콘드로이틴 설페이트 PEC은 제조과정에 RNA 발현카세트를 첨가하여 정전기적인 상호작용으로 복합입자를 자기조립으로 제조할 수 있어 본 발명의 RNA 발현카세트의 운반체로 기능하다. 또한, 불용성 PEC는 조직 재생을 위한 하이드로 겔, 시트, 마이크로 캡슐 및 스캔폴드와 같은 잠재적인 응용 분야를 가지고 있다.
중성 pH에서 수용성인 CH-LA는 산성 중합체의 수용액에 락토비온 산 lactobionic acid을 도입하여 제조되었다. CH-LA의 2 wt % 수용액은 GAG와 같은 산성 중합체 용액과 혼합할 때, 특히 헤파린 (헤파린 및 헤파린 유사 분자)과 혼합할 때 점성이 높고 쉽게 겔화된다. 이 제품은 비항응고제 (NAC)-헤파린, 6-O- 탈황 화 헤파린, 후코이단. FGF-2를 포함하는 NAC-heparin/CH-LA 하이드로 겔을 쥐나 생쥐의 등에 피하 주사했을 때 주사 부위 주변의 섬유 조직 형성과 혈관 신생이 현저하게 향상되었다. 더욱이, 하이드로 겔에서 FGF-2의 점진적인 방출은 부수적인 순환과 혈관 신생을 자극한다. 반대로, 혈관 신생 억제제이자 항암제인 파클리탁셀을 함유한 PCH는 쥐의 혈관 신생과 종양 성장을 효과적으로 억제한다.
GAG 기반 물질의 생물학적 특성과 응용이 조사되었다. 헤파리노이드를 포함하는 GAG는 자석, 금속, 합성 고분자 및 천연 바이오 폴리머]로 만들어진 마이크로/나노 입자의 표면에 증착되었다. 단백질 (예 : GF) 및 DNA와 같은 기능적 분자와 이러한 마이크로/나노 입자의 조합은 다양한 생물 의학 분야에서 잠재적으로 응용할 수 있는 입자를 제공할 수 있다. 마이크로/나노 입자는 GAG와 결합하여 표면성질의 변화로 반응성이 감소하여 생체 적합성을 개선할 수 있다. 모든 진핵 세포의 표면에서 발견되는 다당류는 이물질 코팅을 위한 또 다른 흥미로운 분자 군이다.
본 발명에 따라 RNA 발현카세트 함유 Glycosaminoglycan (GAG) 기반 PEC로부터 RNA 발현카세트를 안정화, 활성화 및 점진적으로 방출함으로써 본 발명의 RNA 발현카세트에도 충분히 활용할 수 있다.
반대로 하전된 고분자 전해질 사이의 정전기적 상호 작용은 저분자량 헤파린 (LH) (Fragmin) 및 프로타민(P)과 같은 고분자 전해질 복합체를 생성한다. Non-stoichiometric PEC는 이러한 상호 작용이 동등하지 않게 발생할 때 초과 전하를 전달한다. 이런 PEC는 다양한 기능성 단백질과 상호 작용하고 흡착할 수 있다. LH(MW : 약 5000 Da)와 같은 헤파리노이드는 사이토카인, GF, 세포외 기질, 접착 분자와 같은 다양한 단백질에 특이적으로 결합한다. 이러한 방식으로 헤파리노이드는 다양한 병리학적 상태를 치료하기 위한 의약품으로 유용할 수 있다. 그러나 고용량 헤파린의 사용은 과도한 출혈 위험을 수반한다. 대조적으로 LH는 헤파린에 비해 실용적이고 약리학적 이점을 제공한다.
본 발명에 따라 RNA 발현카세트 함유 Glycosaminoglycan (GAG) 기반 PEC로부터 RNA 발현카세트를 안정화, 활성화 및 점진적으로 방출함으로써 본 발명의 RNA 발현카세트에도 충분히 활용할 수 있다.
헤파린 결합 응고 인자에 대한 LH의 낮은 결합 친화성은 낮고 예측 가능한 항응고 반응을 유발하므로 약물 농도를 실험실에서 모니터링하여 복용량을 조정할 필요가 없다. 또한 LH의 혈장 반감기가 길기 때문에 하루에 한두 번의 피하 주사는 치료 농도를 유지하기에 충분하다. 반면 어류 정자에서 생성되는 염기성 단백질의 혼합물인 프로타민은 항응고 작용이 없는 안정한 복합체를 형성하여 헤파린과 LH의 혈액 항응고 작용을 중화시킨다. 프로타민(P)은 헤파린에 의한 출혈을 치료하기 위해 헤파린의 항응고 활성에 대한 길항제로 임상적으로 사용된다.
저분자량 헤파린/프로타민 나노/마이크로 입자 (LH/P N/MPs)를 포함하는 PEC는 LH와 P를 6:4의 비율로 혼합하여 제조할 수 있다. LH/P N/MP는 직경이 0.1-3 μm이며 혈소판에서 분비되는 FGF-2, HGF 및 기타 GF에 특이적으로 결합하며 다양한 GF를 보호하고 활성화 할 수 있다. 또한 LH/P N/MPs는 다양한 조직에서 세포 표면과 ECM에 흡착된다. GF RNA 발현카세트 함유 LH/P N/MPs는 GF 함유 LH/P N/MPs로부터 GF를 안정화, 활성화 및 점진적으로 방출함으로써 섬유 조직 형성 및 혈관화를 상당히 유도할 수 있다.
지방 유래 간질 세포 adipose-derived stromal cells (ADSC)의 다능 특성과 인체내 풍부함으로 인해 상처 복구 및 조직 공학을 위한 매력적인 잠재적 자원이 된다. ADSC 이식은 세포 시트, 하이드로 겔 및 3D 스캐폴드를 포함한 생체 재료와 함께 사용되어 ADSC의 사용이 재생 의학의 대안이다. ADSC는 1 ~ 6 % 인간 혈청과 LH/P N/MP가 보충된 겔과 혼합된 덜베코의 변형된 이글 배지(DMEM)로 구성된 3D 배양 배지에서 효율적으로 증식한다. 많은 LH/P N/MP는 인테그린과 같은 세포 표면 헤파린 결합 단백질과의 상호 작용을 통해 ADSC 및 종양 세포를 포함한 접착 세포의 표면에 결합한다. LH/P N/MPs와 세포 표면의 상호 작용은 2 시간 이내에 ADSC-LH/P N/MP-응집체의 형성으로 이어진다. 이러한 시험관내 ADSC-LH/P N/MP-응집체에서 세포 생존력이 크게 증가한다. ADSC-GF RNA 발현카세트 함유 LH/P N/MP-응집체의 주입은 생체 내에서 섬유 조직 형성 및 혈관화를 유도할 수 있다. 따라서 GF RNA 발현카세트 함유 LH/P N/MP는 세포 생존력을 증가시키는 세포 운반체로 기능할 수 있다.
본 발명에 따라 FGF-2 RNA 발현카세트 함유 LH/P N/MPs로부터 RNA 발현카세트를 안정화, 활성화 및 점진적으로 방출할 수 있어 본 발명의 RNA 발현카세트에도 지방 유래 기질 세포 (ADSC) 응집체에 충분히 활용할 수 있다.
ADSC는 LH/P N/MP를 포함하는 2 % 인간 혈장 -DMEM 겔을 사용하여 3D 배양에서 효율적으로 증식한다. 근친 랫트 (IR-) ADSC를 근친 랫트 혈장 (IRP) (6 %)-DMEM 겔로 구성된 혈장 겔에서 FGF-2-함유 LH/P N/MPs와 함께 배양한 다음, 뒤의 전체 두께 피부 상처에 적용했다. 스트렙토조토신 유도 당뇨병 쥐(그림 5C). IRP-DMEM 겔에서 ADSC로 치료한 상처는 FGF-2-함유 LH/P N/MPs로 치료되지 않은 상처보다 훨씬 빠르게 닫히고 치유된다. IR-ADSC로 치료한 상처의 조직학적 검사는 육아 조직 형성, 상피화 및 모세 혈관 형성을 유의하게 향상시켰다. 이러한 결과는 이식된 IR-ADSC의 일부가 피부 조직에 흡수되어 상처 치유를 촉진했으며 IRP-DMEM 겔에서 성장한 IR-ADSC가 당뇨병 쥐의 치유 장애 상처를 복구하는 데 효과적이라는 것을 시사한다.
키토산과 GAG로 구성된 고분자 전해질 복합 하이드로 겔은 호환성과 상처 치유, 항균 및 항종양 활성, 저콜레스테롤 혈증 기능과 같은 생물학적 활성이 있다. 양전하 키토산과 같은 다당류와 헤파리노이드 및 그 유도체와 같은 음전하 GAG를 사용하여 유용한 PEC 하이드로 겔을 제조할 수 있다. 광가교된 키토산 하이드로 겔 (PCH)은 광 가교제의 존재 하에 가시광선 또는 자외선에 노출될 때 형성되며 음전하를 띤 헤파리노이드 및 다양한 GF, 사이토카인 및 접착 분자와 상호 작용한다. 복합물은 기능성 지혈 및 상처 드레싱으로서의 가능성이 있다.
GAG, 특히 헤파리노이드의 유익한 효과는 본 발명의 RNA 발현카세트 전달 시스템에 통합하여 이용할 수 있다. 항응고 작용 외에도 헤파리노이드는 다양한 사이토카인 및 GF 생물학적 과정과 관련이 있다. 헤파리노이드는 수용성이 높고 물에 분산되기 때문에 종종 복합체를 흡착하거나 유지하기 위해 하이드로 겔 또는 PEC과 같은 적절한 매체가 필요할 수 있다. 헤파리노이드와 키토산으로 구성된 LH/P N/MP와 혼합된 프로타민으로 구성된 PEC는 본 발명의 RNA 발현카세트 전달 운반체와 같은 생의학 응용 분야에 많이 사용할 수 있다. 따라서 다당류 기반 복합 PEC 하이드로 겔 및 N/MP를 포함하는 생체 재료는 본 발명의 RNA 발현카세트 응용 분야에 잠재력을 가지고 있다.
본 발명은 또한 상기 서술한 제조 방법에 의해 제조한 RNA 발현카세트 복합입자를 함유하는 복합입자-함유 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 즉, 본 발명의 복합입자 함유 조성물의 제조 방법은, 제1 또는 제2 방법의 혼합 단계를 포함하고, 혼합 이후 조성물의 pH가 수성 용매의 pH와 상이할 수 있음을 특징으로 한다.
상기 서술한 제조 방법에 의해 제조된 복합입자는, 이후 pH가 변화되는 경우에도 사라지지 않는다. 따라서, 본 발명에 따르면, 복합입자 함유 조성물을 용이하게 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 또한 양이온성 화합물 및 RNA 발현카세트를 포함하는 복합입자에 관한 것이며, 복합입자는 RNA 발현카세트가 비증폭 RNA, 자가 증폭 mRNA(Self-amplifying mRNA)를 포함하는 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상으로 제조할 수도 있다.
본 발명의 복합입자의 입자 직경이 500 nm 이하임을 특징으로 한다.
상기 수혼화성 유기용매를 제거하는 단계 이후에, 동결건조 보조제를 가하여 동결건조 하는 공정을 더 포함할 수 있다.
상기 제조방법은, 상기 동결 건조 전에 고분자 나노입자 수용액을 멸균필터로 멸균하는 공정을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 동결건조 보조제는 동결건조된 조성물이 케이크 형태를 유지할 수 있도록 하거나, 음이온성 화합물 조성물을 동결건조 후, 재건(reconstitution)하는 과정에서 빠른 시간 내에 균일하게 녹는 것을 도와주기 위해 첨가하는 것으로, 구체적으로, 락토스, 만니톨, 솔비톨 및 슈크로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 동결건조 보조제의 함량은, 동결건조 조성물 전체 건조중량을 기준으로, 1 내지 90 중량%일 수 있고, 더 구체적으로는 10 내지 60 중량%일 수 있다.
이러한 본 발명에 따른 제조방법을 통해 제조된, RNA 발현카세트와 양이온성 화합물 복합체가 음이온성 화합물 나노입자 구조체에 봉입된 형태의 조성물 내의 나노입자는 혈중에서 안정하며, 그 크기는 구체적으로 10 내지 200 nm일수 있고, 더욱 구체적으로는 10 내지 150 nm일 수 있다.
다른 실시예에 따르면, 본 발명은 또한 약학적 조성물을 제공하며, 상기 약학 조성물은 본원에 정의된 핵산 전달물 및 일반식 생분해성 고분자 담체 전달물 복합체와 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 비히클(vehicle)을 포함한다.
첫 번째 중요한 요소로서, 생분해성 약학적 조성물은 핵산 전달물 및 생분해성 고분자 담체 분자에 의해 만들어진 고분자 담체 전달물 복합체를 포함한다.
두번째 중요한 요소로서, 생분해성 약학적 조성물은 적어도 하나의 추가적인 약학적 활성 구성요소를 포함할 수 있다. 이와 관련하여 약학적 활성 구성요소는 특정한 증상을 낫게(heal)하거나 개선(ameliorate)하거나 예방(prevent)하는데 치료상 효과가 있는 화합물이며, 바람직하게는 암질환, 자가면역 질환, 알러지 또는 전염병에 효과가 있는 화합물이다.
상기 생분해성 약학적 조성물은 인간을 위해 그리고 또한 수의학적인 목적을 위해 사용될 수 있고, 바람직하게는 인간을 위해 사용할 수 있고, 일반적인 약학적 조성물로서 또는 백신으로서 사용될 수 있다.
상기 정의된 것처럼, 상기 생분해성 고분자 담체 전달물 복합체는 그 자체로 생분해성 고분자 담체 전달물 복합체가 (다른 약학적으로 활성인 구성요소를 추가하지 않고) 면역자극 약품으로 사용되도록 하는 비특이적 선천성 면역 반응을 유발한다. 만약 다른 약학적으로 활성인 구성요소, 바람직하게는 특히 면역성 구성요소, 바람직하게는 항원과 함께 처리되면, 상기 본 발명의 핵산은 다른 약학적 활성 구성요소에 의해 유발되는 특이적 후천성 면역 반응을 도와주는 애쥬번트로서 역할을 한다.
다른 특히 바람직한 실시예에 따르면, 생분해성 약학적 조성물(또는 생분해성 고분자 담체 전달물 복합체)은 백신으로 제공되거나 사용될 수 있다.
만약 RNA 발현카세트나 mRNA가 핵산 전달물 및 생분해성 고분자 담체 전달물 복합체의 핵산분자로 사용된다면, 생분해성 백신은 일반적으로 생분해성 약학적 조성물처럼 구성되고 바람직하게는 치료할 환자의 면역계의 면역 반응, 예를 들면, 선천성 면역 반응을 돕거나 이끌어낸다. 더구나 또는 대체적으로, 바람직하게는 만약 핵산 전달물 및 생분해성 고분자 담체 전달물 복합체의 핵산이 후천성 면역 반응을 이끌어내는 상기 언급된 항원이나 단백질 중 어떤 것을 암호화한다면, 상기 생분해성 백신은 후천성 면역반응을 유발할 수 있다.
상기 생분해성 백신에 포함될 수 있는 다른 첨가물들은 유화제(emulsifiers), 가령, 트윈(Tween)　; 습윤제(wetting agents), 가령, 라우릴황산나트륨(sodium lauryl sulfate); 착색제(colouring agents); 풍미제(taste-imparting agents), 약학적 담체(pharmaceutical carriers); 정제형성제(tablet-forming agents); 안정제(stabilizers); 산화 방지제(antioxidants); 방부제(preservatives)를 포함할 수 있다.
게다가 본 발명은 생분해성 고분자 담체 분자의 몇가지 응용 및 용도를 제공하고, 핵산 전달물 및 생분해성 고분자 담체 분자에 의해 만들어진 생분해성 담체 전달물 복합체, 이들을 포함하는 약학적 조성물 또는 이들을 포함하는 키트(kits)를 제공한다.
한 가지 실시예에 따르면, 본 발명은 바람직하게는 유전자 치료법이나 본원에서 정의된 질환의 치료를 위한 의약품(medicament)로서, 생분해성 고분자 담체분자, 핵산 전달물 및 생분해성 고분자 담체 분자에 의해 만들어진 생분해성 고분자 담체 운반물 복합체의, 또는 이들을 포함하는 키트의 첫번째 의학적 용도에 관한 것이다.
상기 의약품은 약학적 조성물의 형태로 또는 약학적 조성물의 구체적인 형태인 애쥬번트나 백신의 형태로 존재할 수 있다. 본 발명과 관련하여 약학적 조성물은 일반적으로 생분해성 고분자 담체 분자 또는 핵산 전달물 및 생분해성 고분자 담체 분자에 의해 만들어진 생분해성 고분자 담체 전달물 복합체를 포함하며, 선택적으로 다른 성분들(ingredients) 예를 들어, 바람직하게는 본원에 정의된 바와 같은 생분해성 핵산 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 비히클을 포함한다.
Ⅲ. 표적단백질
본 발명의 발현하고자하는 표적단백질은 항원, 항체, 치료용 단백질, 펩타이드 및 융합 단백질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다. RNA 발현카세트는 치료 단백질 또는 펩타이드를 암화화하는 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 병원성 항원, 종양성 항원, 알러지성 항원 또는 자가 면역성 항원과 같은 항원은 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된다. 거기에, 항원을 코딩하는 RNA 발현카세트의 투여는 상기 항원을 포함하는 질환에 대한 유전적 백신 접종 접근에 사용된다. 항체는 본 발명에 따른 RNA 발현카세트의 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된다.
치료 단백질
혈액 장애, 순환계 질환, 호흡계 질환, 암 또는 종양 질환, 감염성 질환 또는 면역 결핍증 치료를 위한 치료 단백질 또는 어쥬번트 단백질은 일반적으로 치료되어야 할 동물에 따라서 포유동물 기원, 바람직하게는 인간 기원의 단백질이다. 인간 개체는, 예를 들어, 인간 기원의 치료 단백질에 의해 치료되는 것이 바람직하다.
병원성 어쥬번트 단백질은, 일반적으로 (포유동물에서) 선천적 면역 반응을 유도할 수 있는 병원성 어쥬번트 단백질을 포함하며, 더욱 바람직하게는 박테리아, 원생동물, 바이러스 또는 곰팡이 등으로부터 유래된 병원성 어쥬번트 단백질, 예를 들어, 박테리아 (어쥬번트) 단백질, 원생동물 (어쥬번트) 단백질(예를 들어, 톡소플라즈마곤디(Toxoplasma gondii)의 프로필린 유사 단백질), 바이러스 (어쥬번트) 단백질, 또는 곰팡이 (어쥬번트) 단백질 등으로부터 선택되는 병원성 어쥬번트 단백질을 포함한다.
박테리아 (어쥬번트) 단백질은 또한 박테리아 플라젤린(flagellin)을 포함할 수 있다. 원생동물 (어쥬번트) 단백질은 병원성 어쥬번트 단백질의 추가 예이다. 원생동물 (어쥬번트) 단백질은 어쥬번트 특성을 나타내는 임의의 원생동물 단백질로부터 선택될 수 있으며, 바이러스 (어쥬번트) 단백질은 병원성 어쥬번트 단백질의 또 다른 예이다. 바이러스 (어쥬번트) 단백질은 어쥬번트 특성을 나타내는 임의의 바이러스 단백질로부터 선택될 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 호흡기 합포체 바이러스(Ripiratory Syncytial Virus) 융합 당단백질(F-단백질), MMT 바이러스 유래 외피 단백질(envelope protein), 마우스 백혈병 바이러스 단백질, 야생형 홍역 바이러스의 헤마글루티닌(Hemagglutinin) 단백질 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 곰팡이 (어쥬번트) 단백질도 병원성 어쥬번트 단백질의 추가의 예이다. 본 발명에서, 곰팡이 (어쥬번트) 단백질은 어쥬번트 특성을 나타내는 임의의 곰팡이 단백질로부터 선택될 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 곰팡이 면역 조절 단백질(fungal immunomodulatory protein)(FIP; LZ-8) 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 마지막으로, 어쥬번트 단백질은 추가로 키홀-림펫 헤모시아닌(keyhole-limpet hemocyanin)(KLH), OspA 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수도 있다.
치료 단백질은 호르몬 대체 치료법, 특히 폐경기 여성의 치료에 사용될 수 있다. 이들 치료 단백질은 오에스테로겐(oitrogens), 프로게스테론 또는 프로게스틴(progitins), 및 종종 테스토스테론으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
더욱이, 치료 단백질은 체세포를 다능성(pluripotent) 또는 전능성(omnipotent) 줄기세포로 역분화하는데 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위하여, 여러 인자 특히, Oct-3/4, Sox 유전자 군(Sox1, Sox2, Sox3 및 Sox15), Klf 군(Klf1, Klf2, Klf4 및 Klf5), Myc 군(c-myc, L-myc 및 N-myc), Nanog 및 LIN28이 설명되어 있다.
치료 항체도 치료 단백질로서 본원에 정의되어 있다. 이들 치료 항체는 그 중에서도 암 또는 종양 질환의 치료에 사용되는 항체, 그 중에서도 혈액 장애의 치료에 사용되는 항체, 그 중에서도 면역 조절에 사용되는 항체, 당뇨병 치료에 사용되는 항체, 알츠하이머 질환 치료에 사용되는 항체, 천식 치료에 사용되는 항체를 포함할 수 있다,
본 발명에 따른 RNA 발현카세트의 코딩 영역은 모노-, 디-, 또는 심지어 멀티시스트론 RNA, 즉, 1, 2 또는 그 이상의 단백질 또는 펩타이드의 코딩 서열을 운반하는 RNA로서 발생할 수 있다. 이와 같은 디-, 또는 심지어 멀티시스트론 RNA 내 코딩 서열은 예를 들어, 본원에 설명된 바와 같은 적어도 하나의 내부 리보솜 도입 위치(IRES) 또는 여러 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드의 절단을 유도하는 신호 펩타이드에 의해 분리될 수 있다.
본 발명의 표적단백질은 대상 세포, 조직 및 개체에서 발현시키고자하는 단백질을 의미하며 특정 자연상 존재하거나 인위적인 폴리펩타이드에 적용할 수 있으며 특정단백질로 하는 제한은 없다.
일반적으로 약물은 특정 단백질의 특정 부위에 결합함으로써 그 단백질의 기능을 저해하는 방식으로 약효를 발현한다. 즉, 질병 관련 단백질의 특정 활성부위(active site) 또는 결합부위(binding pocket)의 공략 가능성에 따라 신규 치료제 발굴 가능 타겟(druggable target)인지 판단할 수 있다. 지금까지 미국 식품의약국(FDA)로부터 승인된 약물의 표적으로 쓰이는 단백질은 약 400여종으로, 대부분 효소이고 수용체, 전달물질, 각종 채널·막 단백질이다. 그러나 현재까지 알려진 바에 따르면 약 3000여개의 단백질이 사람의 질환을 야기한다고 알려져 있으며, 이중 불과 13%만이 표적 단백질로 개발되었다. 지금까지의 저분자화합물은 질병 관련 단백질의 기능을 저해하는데 초점이 맞추어져 있었으나, 새로운 개념으로 질병 관련 단백질 자체를 제거하는 선택적 단백질 분해 방법이 부상하고 있음. 이는 “undruggable target”의 제거뿐만 아니라 기 개발된 약물의 내성을 극복할 수 있는 전략으로 대두대고 있다.
세포 내 단백질 분해는 라이소좀(lysosome)과 프로테아좀(proteasome)에 의한 두 가지 경로를 통해 이루어진다. 세포 단백질의 대부분(80%)은 유비퀴틴(ubiquitin)에 의해 표지된 후 프로테아좀에 의해 세포질과 핵에서 분해되며, 이 과정을 ubiquitin-proteasome system (UPS)이라 한다). 이는 단백질 전환과 항상성 유지뿐만 아니라 세포주기, 신호조절, 전사조절, 세포사멸 등과 같은 세포의 생리적 기능을 조절함. 또한 비정상적 구조를 가지는 단백질, 손상된 단백질, 또는 돌연변이로 인하여 비정상적인 구조를 가지된 단백질들을 빠르게 제거하는 역할을 한다. 최근 유비퀴틴을 매개로 하는 단백질 분해가 여러 가지 질병, 특히 알츠하이머병, 파킨슨병과 같은 퇴행성뇌질환 및 유전병과 관련되어 있음이 보고되어, 단백질 분해 경로에 대한 이상이 암을 비롯한 여러 가지 형태의 질환의 원인으로 확인되고 있다.
유비퀴틴에 의한 단백질 분해 조절 시스템은 세포 내 불필요한 단백질을 청소해주는 체계로 이런 경로에 문제가 생긴다면 암을 비롯한 다양한 질환이 생길 수 있음. 반대로 유비퀴틴-프로테아좀 경로의 활성화를 이용한 질환 유발 단백질 제거가 근본적인 치료법이 될 수 있다.
유비퀴틴은 76개의 아미노산으로 구성된 단백질로, 거의 모든 진핵세포에 존재함. 유비퀴틴이 선택적으로 단백질을 분해하기 위하여 표지되는 과정(ubiquitination) 에는 일련의 효소계(E1, E2, E3)가 관여하며, 표지된 단백질은 ATP 의존성 단백질 분해효소 복합체인 26S proteasome에 의해 분해된다. 유비퀴틴과 기질의 결합은 기질분자의 Lys과 유비퀴틴-C-말단의 Gly 사이의 isopeptide bond 형성을 통해 일어나며, 기질 단백질에 결합된 유비퀴틴-C-말단 Lys에 또 다른 유비퀴틴이 연결될 수 있는데, 이러한 과정을 반복하여, 기질 단백질에 여러 개의 유비퀴틴 분자가 가지를 친 모양으로 연결되어 polyubiquitin chain을 형성하면, 그 단백질은 26S proteasome에 인식되어 선택적으로 분해된다.
사람에게는 E1은 2개, E2는 40여개, E3는 6000 여개 종류가 있다고 추산되며, 특히 E3는 구조와 기능에 따라 HECT, RING-finger, U-Box, PHD-finger로 나뉘어 진다. 중요한 점은 E3는 E2와 기질 단백질에 모두 결합하여, 유비퀴틴으로 표지될 기질 단백질을 인지하는 특이성을 제공함. 즉, 분해할 단백질의 선택은 ubiquitination과정의 E3 ligase효소에 의하여 결정되는데, 이때 모든 기질 단백질에는 특정 E3 효소에 의한 인식 부위와 유비퀴닌 연결부위가 존재한다.
단백질 분해 체계를 시작할 수 있는 E3 ligase 가까운 곳에 분해 대상으로 삼은 표적 단백질을 결합해 둠으로써, 표적 단백질이 손쉽게 분해될 수 있는 구조를 만들 수 있다. 이는 원하는 질병 관련 단백질을 E3 ligase 근처에 위치시킴으로써 문제의 단백질을 분해하여 원하는 치료효능을 기대할 수 있다.
본 발명의 특정 실시례에서 편의상 ECM 분해효소 및 분해효소 저해물질을 예시적으로 사용하였다. 종양 세포의 화학요법제 내성에 있어 ECM의 작용을 확인하였다. 종양 및 기질 세포는 콜라겐, 프로테오글리칸과, 종양 내부로 마크로분자의 이동을 어렵게 하는 그외 분자로 구성된 ECM을 만들어내고, 이를 조밀하게 조립한다.
개체의 모든 장기에 거대하게 조직화된 ECM은 전부는 아니지만 세포 내 사건을 초래하는 대부분의 기본 매개자로서의 독특한 역할을 수행한다. 따라서 알려진 거의 모든 질병의 메커니즘이 특정 ECM 구성 요소의 비정상적인 양 또는 활동 수준의 형태로 E의 일부로 거슬러 올라갈 수 있다. 이러한 결함은 하류 신호 축에 상당한 영향을 미쳐 명백한 세포 기능 장애, 장기 부전 및 사망을 초래한다. 피부에서 뼈로, 혈관에서 뇌로, 눈에서 모든 내부 장기에 이르기까지 E은 질병을 되돌리는 원인이자 잠재적인 수단으로서 놀라운 역할을 한다. 결합 조직 장애, 근이영양증, 섬유증 및 암을 포함한 인간의 만성질병은 모두 ECM과 관녈된 질병이다. ECM은 주로 개체의 구조적 기능을 담당하며, 세포와의 긴밀한 상호작용을 통해 노화와 질병으로 퇴행화, 손상된 조직의 재생 과정(근골격, 간 및 폐) 그리고 종양에 중요한 역할을 담당한다.
지난 25년 동안 고형 종양의 생물학을 이해하기 위한 접근 방식이 크게 바뀌 었다. 연구가 거의 오랫동안 개별 종양 세포에만 집중되어 있었지만, 변형으로 이어지는 과정이나 악성 종양을 전달하는 과정이 종양 전체와 완전한 복잡성으로 인해 점점 더 암 연구의 초점이 되었다. 종양을 복잡한 기관으로 보는 개념에서 시작하여 종양 미세 환경 (TME)이라는 용어를 사용하여 그 자체로 악성이 아닌 종양 성분 전체를 설명한다. 따라서 TME는 종양의 혈관계, 결합 조직, 침윤성 면역 세포 및 세포 외 기질 (ECM)로 구성되어 있으며, TME의 이러한 모든 개별 구성 요소는 빠르게 성장하는 암 분야에서 새로운 연구 커뮤니티의 초점이 되었다. 이러한 연구 노력은 이미 항 혈관 신생제와 면역 치료제의 도입을 시작으로 TME 표적 약물의 개발과 성공적인 임상 구현으로 이어졌다
ECM은 암을 치료하려는 노력에 영향을 미칠 뿐만 아니라 종양 형성 및 질병 진행에도 직접적으로 관여한다. 항 종양 요법의 효능에 대한 ECM 표적 접근법의 효과는 종종 종양 행동 또는 진행에 대한 직접적인 효과와 구별할 수 없다. 따라서 악성 종양에서 ECM의 즉각적인 관여와 그 변형이 질병의 진행에 어떻게 영향을 미치는지 논의해야 한다.
ECM은 종양 세포로의 약물 침투를 제한하는 고형 종양 내의 핵심 요소 중 하나이다. 종양 생물학의 이러한 측면은 수십 년 동안 인식되었으며 효소 또는 콜라겐/히알루로난 합성 억제제를 사용하여 ECM을 제거하려는 노력으로 광범위하게 검토되었다. 항체 및 나노 입자와 같은 거대 분자 종양 요법의 움직임은 저 분자량 약물보다 ECM에 더 민감하므로 ECM을 수정하려는 노력이 이러한 제제의 치료 활성에 가장 유익할 것이다.
유방, 췌장, 결장 직장, 난소 및 폐를 포함한 여러 종양은 높은 콜라겐 또는 히알루로난 함량이 불량한 예후와 관련이 있는 고밀도 E을 나타냈다. 암 관련 섬유 아세포는 혈관 신생, 세포 증식, 전이성 세포의 유출 또는 전 종양 면역 세포의 혈관 내 침투를 위한 '고속도로' 생성 등 종양 촉진 활동과 관련된 다량의 ECM 구성 요소를 생성한다. 주로 콜라겐과 히알루론산(HA)으로 구성된 종양 ECM은 다음을 포함하여 약물 전달을 방해하는 종양 미세 환경의 여러 측면에 기여한다. 1. 혈관 압박, 혈액 관류 감소 및 혈관의 일부에 대한 적절한 혈관 접근 제한 종양; 2. 약물이 세포 표적에 도달하는 것을 방지하는 종양 기질 간질을 통한 약물 밀매를 제한한다. 그리고 3. 혈액으로부터의 혈장 누출, 종양 내 기계적 스트레스 및 적절한 림프 배액 부족에 의해 생성된 높은 간질 유체 압력(IFP)의 유지 등이다. 제한된 미세 환경 내에서 종양 세포의 증식은 종양 미세 환경 내에서 기계적 스트레스에 더욱 기여한다. 이들 모두는 혈액에서 종양 세포로의 약물 이동을 제한한다.
이론적으로 종양 ECM을 감소시키는 접근법은 약물 침투를 증가시키고 종양 세포 내에서 더 높은 약물 농도를 가능하게 한다. 이 접근 방식에는 미묘한 측면이 있다. 종양 간질 공간에서 모든 바이오 폴리머를 완전히 제거하면 종양이 붕괴되고 약물 침투가 감소할 수 있다. 따라서 ECM의 정상화 개념이 이러한 치료의 목표로 제안되었다. ECM 분해에 대한 주요 접근 방식을 강조하지만 이러한 효소는 덜 널리 사용되고 히알루론산(HA)의 감소를 통해 달성된 가장 진보된 형태의 기질 분해와 기계적으로 구별될 수 있기 때문에 콜라게나제의 활성에 중점을 두었다.
1. 히알루로니다아제
히알루론산(hyaluronic acid, HA)은 음이온성 뮤코다당류로서, 동물 유래의 유리체, 관절액, 연골, 피부 등에 존재하는 생체 유래 물질이며, (C14H21NO11)n의 화학식을 가지는 물질이며, 히알루론산의 분자량에는 제한이 없으나, 중량평균분자량 범위가 10,000 내지 1,000,000일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예컨대, 중량평균자량은 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000 및 1,000,000 중 어느 두 값 사이의 범위를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
천연 고분자인 히알루론산(HA)은 넌설페이티드 (nonsulfated) 글라이코사미노글리칸(glycosaminoglycan;GAG)로서 N-acetyl-D-glucosamine 과 D-glucuronic acid로 구성되어 있으며, 세포 밖 구조체의 주요 성분으로서 높은 생체 적합성을 가지고 있다. 또한 피하조직과 연골조직 같은 연결조직의 세포 외측기질뿐 아니라 안구의 유리체 및 관절 동동의 활액에 존재하며, 히알루론산과 히알루론산 수용체인 CD44/RHAMM의 상호작용은 세포 이동성 및 세포증식과 특정 생리학적 과정들을 제어하는 것으로 알려져 있다. 이러한 특징으로 히알루론산은 치료적 용도를 가지며, 미국식품의약품(FDA)에서 정맥주사, 구강투여, 피부투여 등으로 인간에게 사용하는 것을 승인받은 천연 고분자이다.
현재로는 조직공학용 지지체와 약물전달용 하이드로젤로서 그 사용 범위가 증대되고 있다. 또한 활성산소에 의해 히알루론산이 분해되는 것이 최근 밝혀짐으로서 히알루론산 분해를 통한 활성산소 측정이 가능하게 되었다.
히알루론산을 분해하는 효소인 히알루로니다아제는 60 년 이상 의료용으로 사용되어 왔다. 미국 식품의 약국 (FDA)은 (1) 피하 수액 주입 (hypodermoclysis), (2) 피하 조직에서 약물의 흡수 및 분산을 가속화하거나 유출을 관리하기 위한 보조제로 히알루로니다아제를 승인했다. (3) 요로 혈관 조영술 (피하 요로 조영술)에서 조영제의 흡수를 촉진하는 보조제로 사용하고 있다. 또한 유럽에서 혈종 흡수를 증가시킬 목적으로 승인 및 사용되었다. Hyaluronidase는 승인된 적응증 외에도 다양한 용도로 사용된다. 현재 오프 라벨 용도로는 히알루론산 필러 용해, 육아 종성 이물질 반응 치료, 필러 주사와 관련된 피부 괴사 치료 등이 있다. 이러한 오프 라벨 적응증에 대한 히알루로니다아제의 사용이 크게 증가하고 있다.
인간 히알루로니다아제는 장기 (고환, 비장, 피부, 눈, 간, 신장, 자궁, 태반)와 체액 (눈물, 혈액, 정액) 모두에 존재한다. 6 가지 알려진 유형 (hyaluronidase 1~4, PH-20 및 HYALP1)이 있다. HYAL1 유전자에 의해 암호화되는 Hyaluronidase 1은 간, 신장, 비장 및 심장과 같은 주요 기관뿐만 아니라 혈청 및 소변에도 존재한다. 그것은 혈장에서 주요 히알루로니다아제로 작용하며 산성 pH에서 활성화된다. 히알루로니다제 2는 히알루로니다제 1보다 약한 효소 활성을 발휘하며 고 분자량 히알루론산만 분해한다. Hyaluronidase 3는 고환과 골수에서만 발견되며 그 역할은 알려져 있지 않다. 고환 PH20 히알루로니다제는 인간의 정자 표면과 첨체 내막에서 발견되며 수정 과정에서 난자의 히알루론산을 분해하는 역할을 한다.
히알루로니다아제를 작용 기전에 따라 세 가지 범주로 분류할 수 있다. 첫째, 포유류 히알루로니다제는 β-1,4 글리코시드 결합을 분해하여 사당류를 형성하는 엔도 -β-N- 아세틸 헥소사미니다제이다. 둘째, 거머리/구충 히알루로니다아제는 β-1,3 글리코시드 결합을 분해하여 5 당류와 6 당류를 형성하는 엔도 -β-D- 글루쿠로니다아제입니다. 마지막으로 미생물 히알루로니다아제는 히알루로네이트 분해효소로 분류된다. 다른 히알루로니다아제와는 달리 가수 분해 반응을 촉매하지 않는다. 대신, 그들은 β-1,4 글리코시드 결합에서 β- 제거 반응을 통해 불포화된 이당류를 생성한다.
히알루로니다아제는 또한 가장 활동적인 pH에 따라 두 가지 유형으로 분류될 수 있다. 산성 활성 히알루로니다아제는 pH 3 ~ 4에서 활성화된다. 뱀과 벌독에서 발견되는 히알루로니다아제 효소를 포함하는 중성 활성 히알루로니다아제는 pH 5 ~ 8에서 활성화된다.
과거에는 소 또는 양 고환에서 의료용 히알루로니다아제를 추출하여 정제하지 않고 사용했다. 그러나 이렇게 얻은 포유류의 히알루로니다아제는 순도가 낮고 면역 반응을 일으킬 수 있는 성분을 함유하고 있다. 그 후, 처리 단계로 포유류 히알루로니다아제의 정제를 수행하고, 부작용을 줄이기 위해 Streptococcus agalactiae 박테리아에서 얻은 미생물 히알루로니다아제도 사용했다.
히알루로니다아제를 체내에 주입하면 희석, 확산 및 비활성화로 인해 시간이 지남에 따라 활성이 점차 감소한다. 비활성화는 피하 조직과 혈장에서 다른 속도로 진행되는 항-히알루로니다아제 활성에 의해 발생한다. 설치류를 이용한 실험에서 히알루로니다아제의 피하 조직 반감기는 30 분 미만이었고 실험에 따라 1 시간까지 활성이 부분적으로 유지되었다. 혈장에서 히알루로니다아제를 사람에게 정맥 주사했을 때 반감기는 2 ~ 3 분이었으며, 반복 주입으로도 혈청 히알루로니다아제 수치가 지속적으로 상승하지는 않았다. 인간 혈장에서 히알루로니다아제의 짧은 반감기의 이유는 혈장에 수많은 히알루로니다아제 억제제가 존재하고 신장과 간에서 히알루로니다아제의 대사 때문이다.
신체의 Hyaluronidase는 다양한 약물의 영향을 받는다. 히알루로니다제 길항제는 항염증제 (예 : 인도 메타신, 덱사메타손 및 살리실레이트), 수많은 식물 기반 화합물 (예 : 플라보노이드 및 항산화제), 항히스타민제, 비만 세포 안정제, 헤파린, 비타민 C, 디 쿠마 렌 및 방사선 조영제를 포함한다.
히알루로니다제 억제제의 수치는 개인의 신체 상태에 따라 증가할 수 있다. 화상, 패혈증, 쇼크와 같은 급성기 반응에서 히알루로니다제 억제제 수치가 증가하여 히알루론산의 회전율을 감소시켜 순환 붕괴를 예방한다.
히알루로니다아제의 국소 주사는 국소 소양증 및 알레르기 반응과 같은 부작용을 일으킬 수 있다. 알레르기 반응의 발생률은 0.05 ~ 0.69 %로 보고되었으며 두드러기 및 혈관 부종도 낮은 빈도 (0.1 % 미만)에서 발생하는 것으로 보고되었다. 알레르기 반응은 히알루로니다아제 용량이 정맥 주사를 통해 100,000 IU 이상일 때 발생할 가능성이 더 높고, 용량이 200,000 IU로 증가하면 알레르기 합병증 발생이 31.3 %까지 증가한다.
대부분의 히알루로니다제의 알레르기 반응은 즉각적인 과민 반응 (I 형, 면역 글로불린 ECM 매개)이지만 지연된 과민 반응 (IV 형, T 세포 매개)도 발생할 수 있다. 히알루로니다아제에 의한 즉각적인 과민 반응은 1 ~ 2 시간 후에 홍 반성 부종으로 나타나며 항생제 치료에 대한 반응은 없다. 이러한 경우 전신 스테로이드, 항히스타민 제, 스테로이드 크림 도포가 도움이 된다. 히알루로니다아제에 의한 지연성 과민 반응은 24 시간 후에도 발생할 수 있으며,이 경우 피부 검사에서 20 분 이내에 양성 반응이 나오지 않아 음성으로 진단된다.
피부 테스트는 3 IU의 히알루로니다아제로 수행된다. 히알루로니다제를 사용하기 전에 피부 테스트를 수행하는 것이 권장되지만, 일반 클리닉에서는 종종 어려울 수 있다. 일반적으로 환자의 알레르기 병력과 히알루로니다아제에 대한 반응 사이에는 연관성이 없다. 그러나 히알루로니다아제의 기원에 따라 히알루로니다아제의 주사는 소 콜라겐과 벌침에 알레르기가 있는 환자에서 교차 반응이 발생할 수 있으므로 피해야 한다.
2. 기질 메탈로프로테이나제 (MMP)
기질 메탈로프로테이나제(MMP)는 세포외 기질(E)에서 펩타이드 결합을 절단하는 능력을 가진 아연 엔도펩티다제 그룹으로 구성되었다. 펩티다아제 효소는 엔도펩티다아제와 엑소펩티다아제의 두 그룹으로 나눌 수 있다. 엔도펩티다아제는 메탈 로프로테이나아제, 아스파르트 산, 세린, 시스테인, 글루탐산, 트레오닌 펩티다아제 등 6 개의 주요 계열로 구분한다. 메탈로프로테아제의 대부분의 분자 구조는 아연을 사용하나 일부는 코발트를 필요로 한다. 디신테그린 및 메탈로프로테이나제 단백질 및 MMP를 포함하는 메탈로프로테이나제, 메탈로엑소펩티다제 또는 메탈 카복시펩티다제 및 메탈로엔도펩티다제의 두 하위 그룹이 있다. MMP는 <표 1>과 같이 분류할 수 있는데, 콜라게나제 (MMP-1, MMP-8, MMP-13 및 MMP-18) 젤라티나제 (MMP-2 및 MMP-9), 스트로멜리신 (MMP-3, MMP-10, MMP-11 및 MMP-17), matrilysins (MMP-7 및 MMP-26), 멤브레인 유형 (MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-24 및 MMP-25) 및 기타 유형 (MMP -12, MMP-19, MMP-20, MMP-21, MMP-22, MMP-28, MMP-29) 등이다.
MMP는 거의 40 년 동안 광범위하게 연구되어 왔으며 원래는 ECM을 분해하는 역할을 한다. 구조적으로 MMP는 유사한 촉매 억제 도메인을 포함한다. 촉매 도메인은 각 MMP의 분해를 위해 표적에 특이성이 있다. MMP의 전통적인 분류는 처음으로 확인된 분해 대상을 기반으로 하였다. 수년에 걸쳐 MMP는 세포 자멸사, 면역, 세포 이동 및 혈관 신생과 같은 경로에서 세포 수준에서 현저한 수의 조절 역할을 한다. MMP 기능은 종종 침입, 면역계 회피 및 전이로 이어지는 고전적인 종양 특성과 연관이 있다. 이러한 특성을 감안할 때 MMP는 발암에 중요한 역할을 한다. <표 1>은 암에서 각 MMP의 특정 역할에 대한 개요이다.
MMP 발현의 조절 장애는 많은 암 유형의 단백질 및 RNA 수준에 대한 수많은 연구가 있다(표 3). 종종 MMP 조절 장애는 유방암, 난소 암, 결장암에서 나타나는 경향인 예후 차이와 관련이 있다.
MMP의 종류 및 역할
MMP Role in Cancer
Collagenases
1 Initial invasion, promotes metastasis
8
13 Growth, invasion, and angiogenesis of skin squamous cell carcinoma
Matrilysins
7 Contributes to invasive potential, proliferation, anti-apoptotic, immune surveillance
26 Activates MMP-9 in prostate cancer, role in early skin carcinogenesis
Metalloelastase
12 Protective inhibition of tumor growth, anti-angiogenic
Stromelysins
3 Invasion, metastasis, and epithelial to mesenchymal transition
10 Invasion, migration, and growth; prevents tumor cell apoptosis; produces angiogenic and metastatic factors
11 Produced by peritumoral stromal fibroblasts; regulates early tumor invasion, implantation, and expansion; prevents apoptosis of early cancer cells
Gelatinases
2 Proteolytic degradation of extracellular proteins in tumor invasion, collagenolytic pathway driver for lymphatic vessel formation, tumor angiogenesis
9 Proteolytic degradation of extracellular proteins during tumor invasion
Enamelysin
20 Synthesized in odontogenic tumors
Membrane-Type
14 Cleaves other pro MMPs (mainly MMP2) to activate them, role in invasive blood vessel growth, and promoting metastasis. In vitro has been shown to promote invasion
15 In vitro shown to play role in epithelial to mesenchymal transition, promotes angiogenesis
16 In vitro promotes invasion and metastasis
17 Induce angiogenesis promote growth and metastasis
24 Progression in brain tumors, aides in migration and metastasis
25 In vitro tumor growth promoter
Other
19 In vitro modulates proliferation, adhesion, and metastasis
21 Expression changes associated with cancer prognosis.
23A Expression levels altered in multiple cancers. Urinary levels decreased in renal cell carcinoma.
23B
27
28 Promotes epithelial to mesenchymal transition, promotes invasion and metastasis
Collagenase는 1962년에 처음으로 확인되었다. 콜라게나아제와 MMP-13, MMP-18은 네 가지 유형의 콜라겐 (I, II, III, IV)을 분해하는 효소이며, 프로테아제 효소만이 다양한 생리학적 조건에서 콜라겐의 삼중 나선 도메인을 가수분해할 수 있다. 간질 콜라겐 섬유는 대부분의 단백질 분해효소에 의한 분해에 저항한다. MMP-1, MMP-2 및 MMP-3만이 손상되지 않은 삼중 나선 콜라겐과 I, II 및 III 유형의 콜라겐을 1/4 및 3/4 섹션으로 분해를 시작할 수 있다. MMP-1과 MMP-13은 각각 콜라겐 유형 II와 III를 우선적으로 분해하는 반면, 콜라게나아제는 기질 특이성의 일부인 덮개를 가지고 있다. 그러나 MMP-8은 MMP-1 또는 MMP-13보다 3 배 더 강력하게 I 형 콜라겐을 분해한다. 초기 분해 후, 원 섬유 콜라겐 단편은 MMP-2, MMP-3 및 MMP-9와 같은 다양한 MMP에 의해 추가로 분해되기 쉽다. 콜라겐이 작은 조각으로 분해되는 순간 내인성 효소가 섬유질 물질을 분해하는 데 도움을 준다. 콜라게나아제는 세포막에 해를 끼치지 않기 때문에 수년간 실험실에서 세포 분산, 조직 분리 및 세포 배양에 크게 사용되었다. 예를 들어, Clostridium histolyticum (C. histolyticum)은 미국 식품의 약국 (FDA)의 승인을 받아 Dupuytren의 뻣뻣한 코드를 분해하는 약물로 인간 세포 분리, 상처 치유 및 상처에 널리 사용된다.
미생물 세포와 동물 조직 모두에서 세 가지 유형의 콜라게나아제 효소를 분리하고 특성화할 수 있다. 주로 C. histolyticum과 같은 병원성 미생물은 미생물 콜라게나아제를 제공한다. 이러한 콜라게나제는 콜라겐의 각 폴리 펩타이드 사슬을 여러 부위로 분할할 수 있다. 이들은 외독소로 기능하고 숙주 세포에서 콜라겐의 가수 분해로 인해 결합 조직 대사를 방해하는 것으로 알려져 있다. 재조합 박테리아 콜라게나제는 난용성 천연 콜라겐과 수용성 변성 콜라겐 모두를 가수 분해할 수 있다. 단일 종에 초점을 맞추어 연구된 미생물 콜라게나아제와 달리, 조직 콜라게나아제는 다른 동물의 다양한 조직에서 분리되고 특성화되었다. 조직 콜라게나아제는 소화 효소이기 때문에 일반적으로 다양한 어류와 무척추 동물의 소화관에서 분리된다.
콜라게나제는 특정 질환의 치료에 사용되는 고유한 효소이며 과도한 콜라겐 응집은 세포 기관의 병인에 장애를 유발할 수 있다. 콜라겐은 힘줄, 피부, 연골 및 혈관과 같은 세포 외 섬유 조직의 주요 단백질은 물론 치아, 뼈 및 각막의 유기 성분입이다. 최근에는 두 가지 유형의 콜라게나아제가 확인되었다. 첫 번째 유형의 콜라게나아제는 일부 미생물에 의해 합성된다. 예를 들어, C. histolyticum은 가스 괴저를 일으키는 박테리아로 콜라겐의 폴리펩티드 사슬을 분해할 수 있는 콜라게나아제를 생성하고 c- 말단 결합에서 콜라겐을 가수 분해한다. 또한 유기체의 결합 조직 장벽을 변성시킬 수 있다. 따라서 결합 조직의 생물학적 과정은 콜라게나아제에 의존한다. 두 번째 유형의 콜라게나아제는 포유류에 의해 합성된다. 그것은 특정 지점에서 콜라겐 삼중 나선을 분해하고 각각 3/4 및 1/4의 트로포 콜라겐 분자를 포함하는 트로포 콜라겐 A와 B를 만들 수 있다. 이 분해 조각은 젤라틴 사슬로 변환된다. 콜라게나아제 외에도 온도와 같은 물리적 요인은 트로포 콜라겐 폴리펩티드 사슬을 분리하고 젤라틴 사슬을 생성할 수 있으며, 이는 다른 프로테아제에 의해 분해될 수 있다. 콜라겐 아미노산의 1/3은 글리신, 프롤린 및 하이드록시 프롤린으로 구성된다. 포유류의 콜라게나아제와 달리 박테리아 독성 요인 중 하나인 박테리아 콜라게나아제는 콜라겐 나선의 여러 부분을 공격하여 분해한다. 또한 C. histolyticum 및 Pseudomonas aeruginosa의 침습성 균주에는 콜라게나제가 있다.
콜라게나제는 의학 조사에서 조직 세포 분리에 더 자주 사용된다. 이러한 효소는 인슐린 분비선 세포를 제거하고 재배치하는 데 성공적으로 적용된다 (당뇨병 환자용). 콜라게나아제를 사용하여 손상되지 않은 간 실질 세포, 지방 세포 및 부신을 분리할 수도 있다. 분리된 후, 이들 세포는 세포 성장에 사용될 수 있다. Collagenase는 인간 염색체를 연구하기 위해 G-banding 기술에도 적용되었다. 오늘날, 콜라게나아제는 치료법으로 사용되고 있으며 과도한 콜라겐 침착이 신체 시스템의 일부 생리적 기능에 장애를 일으키는 질병에 대한 침습적 치료를 대체 할 수도 있다.
콜라겐은 인체 단백질의 1/3을 차지한다. 그러나 생산 또는 저하의 변화는 질병의 원인이 될 수 있다. 콜라겐은 부적합한 장소에서 필요하거나 생산되는 양보다 더 많이 생성되거나 적절한 시간 후에 분해되지 않을 수 있다. 이러한 경우, 주사 가능한 형태의 콜라게나아제 또는 그 연고의 사용은 폐쇄성 콜라겐의 분해에 도움이 될 수 있다.
3. 금속 단백 분해효소(MP)의 조직 억제제 (TIMP)
결합 조직 및 관절 연골은 세포외 기질 합성 및 분해의 반대 효과에 의해 동적 평형상태로 유지된다. 기질의 분해는 주로 기질 메탈로프로테이나제(MMP) 및 트롬보스폰딘 모티프(ADAMTS)와 디스인테그린(disintegrin)-메탈로프로테이나제를 포함한 메탈로프로테이나제의 효소 작용에 의해 일어난다. 이러한 효소는 많은 자연 과정(예를 들어 발달, 형태형성, 골 재형성, 상처 치유 및 혈관 신생)에서 중요하지만, 이러한 효소의 비정상적인 증가는 류마티스 관절염 및 골관절염뿐만 아니라 암 및 심혈관 질환을 비롯한 결합 조직의 분해 질환에 해로운 역할을 하는 것으로 여겨진다.
메탈로프로테이나제의 내인성 저해제는 혈장 알파 2-매크로글로불린 및 메탈로프로테이나제의 조직 저해제(TIMP)를 포함하며, 그 중 4개가 인간 게놈에 암호화되는 것으로 알려져 있다.
금속 단백 분해효소(MP)의 조직 억제제 (TIMP), TIMP-1, 2, 3 및 4 계열의 네 가지 구성원은 원래 분비된 금속 단백 분해효소 (MP)의 내인성 억제제로 설명되었으며, 대부분의 조직을 분해 억제할 수 있다. 세포외 기질의 단백질 분해 활성은 조직 전환 동안 일시적으로 발생할 수 있으며 TIMP의 표준 항 단백질 분해 기능에 의해 엄격하게 조절된다. 많은 질병에서 MP의 상향 조절과 활성화는 중요한 질병 유발 메커니즘으로 관찰된다. TIMP의 증가된 발현은 이러한 ECM 저하 활동의 균형을 시도하지만 실패하여 질병이 생긴다. 암에서 단백질 분해 활성은 침입과 전이를 지원하는 반면, 이러한 악성 종양의 공격적인 특징을 방지하기 위해 프로테아제 억제를 고려할 수 있다.
융합 단백질
융합 단백질은 단일 단위로 전사되고 번역되어 단일 폴리 펩타이드를 생성하도록 결합된 별도의 유전자에 의해 코딩된 적어도 두 개의 도메인 이상으로 구성된 단백질이다. 기본적으로 두 가지 유형의 융합 단백질이 있다. 첫 번째는 종단 간 융합되고 일반적으로 링커에 의해 연결된 두 개의 단백질 또는 단백질 서브 유닛으로 구성되고 두 번째는 두 공여자의 아미노산이 융합 단백질에 산재되어 있다.
전자는 링커 펩타이드로 융합된 이종 단백질 폴리펩타이드; 및 특수목적 펩타이드와 단백질이 결합한 폴리펩타이드;를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나일 수 있다.
융합 단백질은 통합된 단백질 도메인에 따라 분류될 수 있다. 종종 하나의 융합 파트너는 분자 인식 기능을 가지고 있는 반면 다른 파트너는 안정성 및 반감기 개선, 세포 독성 효과 또는 새로운 표적화 및 전달 경로와 같은 특정 기능이 있을 수 있다. 치료용 융합 단백질은 면역 독소, 사이토카인 융합, 단편 결정화 가능 (Fc) 융합, 알부민 융합 및 이들 부류에 속하지 않는 기타 일 수 있다. 현재 진행중인 대부분의 재조합 단백질 임상 시험은 단클론 항체를 포함하지만, 융합 단백질은 앞으로도 중요한 치료 분자가 될 것으로 예상된다.
병원성 항원(Pathogenic antigens):
본 발명에 따른 mRNA는 병원성 항원 또는 이의 절편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 단백질 또는 펩타이드를 코딩할 수 있다. 이와 같은 병원성 항원은 개체, 특히 포유동물 개체, 더욱 특히 인간에서 면역적 반응을 일으키는 병원성 유기체, 특히 박테리아, 바이러스 또는 원생동물(다세포(multicellular)) 병원성 유기체로부터 유래된다. 더욱 구체적으로, 바람직하게 병원성 항원은 표면 항원, 예를 들어, 바이러스 또는 박테리아 또는 원생동물 유기체의 표면에 위치한 단백질(또는 단백질의 절편, 예를 들어, 표면 항원의 외부 부분)이다.
병원성 항원은 바람직하게 감염성 질환과 관련된 병원체로부터 유래된 항원으로부터 선택된다. 특히 바람직한 항원은 인플루엔자 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스(RSV), 단순 포진 바이러스(HSV), 인유두종바이러스(HPV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 플라스모디움(Plsmodium), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 댕기 바이러스(Dengue virus), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 사이토메갈로바이러스(CMV), B형 간염 바이러스, 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 광견병 바이러스 및 황열병 바이러스로부터 선택된 병원체이다.
본 발명에 따른 mRNA는 광견병 바이러스 단백질 또는 펩타이드 또는 이의 항원성 절편을 코딩한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 mRNA는 광견병 바이러스의 당단백질 G(RAV-G), 핵단백질 N(RAV-N), 인단백질 P(RAV-P), 매트릭스 단백질 M(RAV-M) 또는 RNA 폴리머라아제 L(RAV-L), 또는 이의 절편, 변이체 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 항원성 단백질 또는 펩타이드를 코딩한다.
본 발명에 따른 mRNA는 호흡기 합포체 바이러스(ripiratory syncytial virus)(RSV) 단백질 또는 펩타이드 또는 이의 항원성 절편을 코딩한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 SM_mRNA는 호흡기 합포체 바이러스(RSV)의 융합 단백질 F, 당단백질 G, 짧은 소수성 단백질 SH, 매트릭스 단백질 M, 핵단백질 N, 라지 폴리머라아제 L, M2-1 단백질, M2-2 단백질, 인단백질 P, 비-구조 단백질 NS1 또는 비-구조 단백질 NS2, 또는 이의 절편, 변이체 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 항원성 단백질 또는 펩타이드를 코딩한다.
종양 항원:
본 발명에 따른 mRNA는 종양 항원, 상기 종양 항원의 절편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 펩타이드 또는 단백질을 포함하는 단백질 또는 펩타이드를 코딩할 수 있으며, 항원 또는 상기 종양 항원의 절편, 변이체 또는 유도체이다.
종양유전자(KRAS, p53 등) 돌연변이체의 암항원, 종양 항원 NY-iO-1, 5T4, MAGE-C1, MAGE-C2, 서바이빈(Survivin), Muc-1, PSA, PSMA, PSCA, STEAP 및 PAP는 특히 바람직하다. 투여되는 mRNA는 치료 단백질 또는 이의 절편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 단백질 또는 펩타이드를 코딩한다.
본 발명의 치료 단백질은 임의의 유전성(inherited) 또는 후천성(acquired) 질환의 치료에 유익하거나, 개인(individual)의 상태를 향상시키는 펩타이드 또는 단백질이다. 특히, 치료 단백질은 치료제의 생성에 큰 역할을 하며, 다른 기능 중 유전적 오류를 변형 및 수리, 암세포 또는 병원체 감염된 세포를 파괴, 면역계 장애를 치료, 대사 또는 내분비 장애를 치료할 수 있다. 예를 들어, 에리스로포이에틴(EPO), 단백질 호르몬은 신장 합병증의 일반적인 원인인 적혈구 결핍 환자를 치료하는데 이용될 수 있다. 또한, 어쥬번트 단백질, 치료 항체는 치료 단백질 및 예를 들어, 폐경기 여성의 치료에 이용될 수 있는 호르몬 대체 요법(hormone replacement therapy)에 의해서도 포함된다. 더욱 최근 접근에서, 환자의 체세포는 분쟁(disputed) 줄기세포 요법을 대체하는 다능성 줄기세포로 역분화하는데 사용된다. 또한, 체세포의 역분화에 사용되거나 줄기세포의 분화에 사용되는 이들 단백질은 치료 단백질로서 본원에 정의된다. 또한, 치료 단백질은 예를 들어, 상처 치료, 조직 재생, 신생 혈관 생성 등 다른 목적을 위해 사용될 수 있다.
따라서, 치료 단백질은 예를 들어, 감염성 질환, 신생물(neoplasm)(예를 들어, 암 또는 종양 질환), 혈액 및 혈액-형성 기관 질환, 내분비, 영양성 및 대사 질환, 신경계 질환, 순환계 질환, 호흡계 질환, 소화계 질환, 피부 및 피하 조직 질환, 근골격계 및 결합 조직 질환 및 비뇨생식계(genitourinary system) 질환과 같은 다양한 질환(독립적으로 유전성 또는 후천성인 경우)의 치료를 포함하는 다양한 목적에 사용될 수 있다.
그 중에서도 대사 또는 내분비 장애의 치료에 사용될 수 있는 특히 바람직한 치료 단백질은 기능성 단백질의 이의 부족한 내부 생산량을 충분한 양으로 교체하여 개체를 치료하기 위한 것이므로 치료 단백질로 이해된다. 따라서, 이와 같은 치료 단백질은 일반적으로 포유동물, 특히 인간 단백질이다. 혈액 장애, 순환계 질환, 호흡계 질환, 암 또는 종양 질환, 감염성 질환 또는 면역 결핍증의 치료를 위해서는 치료 단백질이 사용될 수 있다:
더욱이, 어쥬번트(adjuvant) 또는 면역 자극 단백질도 치료 단백질이란 용어에 포함된다. 어쥬번트 또는 면역 자극 단백질은 개체 내 면역 반응을 유도, 변형 또는 개선하여 특정 질환을 치료하거나 개체의 상태를 완화하는데 사용될 수 있다. 어쥬번트 단백질은 예를 들어, TLR에 대한 외부 TLR 리간드의 결합 반응으로서(포유동물에서) 선천적 면역 반응을 유도할 수 있는 임의의 인간 단백질 또는 펩티드를 일반적으로 포함하는 포유동물, 특히 인간 어쥬번트 단백질로부터 선택될 수 있다. 와 같은 단백질들로 이루어진 군으로부터 선택된다. 포유동물, 특히 인간 어쥬번트 단백질은 또한 열 충격 단백질, 또는 이와 같은 인간 어쥬번트 단백질 중 임의의 것의 임의의 종 동족체로 이루어진 군으로부터 선택될 수도 있다. 포유동물, 특히 인간 어쥬번트 단백질은 또한 선천적 면역 반응을 유도 또는 강화하는 단백질, 를 포함할 수 있다.
Ⅳ. RNA 발현카세트를 포함하는 복합입자의 용도
1. mRNA 치료제
본 발명의 RNA 발현카세트는 표적단백질을 코딩하는 ORF를 발현할 수 있는 구성을 갖춘 RNA 구조체이다.
사람을 포함하는 진핵세포는 유전정보를 담고 있는 핵을 둘러싼 막이 있어, 크게 핵과 세포질로 구별된다. 핵 속에 있는 DNA는 직접 단백질로 만들어지지 않고, 필요한 유전정보만 DNA에서 RNA로 전달하는 전사(transcription)의 과정을 거친다.
이때, 관여하는 RNA가 바로 mRNA(messenger RNA)이다. 핵 속에서 만들어진 mRNA는 세포질로 나와 단백질을 합성하는데, 이 단계를 번역(translation)이라 한다. 즉, DNA와 단백질의 중간매개의 역할을 하는 것이 mRNA이다.
사람의 생명현상을 조절하는 것은 마지막 결과물인 단백질이다. 단백질이 변형되어 제 기능을 못하거나, 생성되지 못하면 우리는 병에 걸리게 된다.
그렇다면, 질병을 치료하기 위해, DNA, RNA, 단백질 중 어떤 것을 타깃하는 것이 효과적일까? 우리가 알고 있는 대부분의 기존 의약품들은 단백질을 표적으로 한 치료제이다. 최근에는 생명공학 기술의 발달로, 질병의 치료를 너머 예방 차원에서 근본적인 원인을 해결할 수 있을 치료법들이 개발되고 있다. mRNA 기반 치료법이 그 중 하나이다.
특정 질병을 유발하는 단백질이 망가지거나 결핍되었다면, 환자의 세포에 정상 단백질을 코딩하는 mRNA를 주입하여, 번역된 정상 단백질이 제 역할을 하도록 하는 것이다.
DNA와 달리 mRNA는 핵 안까지 전달할 필요도 없으며, 외부 유전자가 DNA사이에 통합되는 Genome Integration이 일어날 가능성이 없어 리스크도 적다. 또한, 전달된 mRNA는 일시적으로 단백질을 만들고, 빠르게 분해되기 때문에 안전하다. 또한, 제조하기 쉬우며 비용마저 적게 든다.
이러한 많은 장점에도 불구하고, mRNA는 사람의 체액(눈물, 침, 점액, 땀 등)에서 발견되는 RNA 분해효소인 리보뉴클레아제(Ribonucleases)에 의해 쉽게 분해되는 불안정한 형태이기 때문에, 치료제로서 개발이 어려웠다. 하지만, mRNA의 구조 연구가 진행된 이후, 단백질 번역 효율과 mRNA의 반감기가 모두 높아진 변형된 형태의 mRNA가 제조되면서 mRNA 기반 치료법 개발이 시작되었다.
기본적으로 모든 mRNA 기반 치료제는 DNA에서부터 시작한다. 결핍된 단백질이나 (박테리아나, 바이러스에 의한) 감염을 일으키는 항원, 그리고 암의 경우, 종양을 일으키는 단백질에 대한 DNA 시퀀스에서 상보적으로 결합하는 mRNA를 쉽게 제조할 수 있다. 비용도 물론 적게 든다.
제조된 mRNA는 환자의 몸에 직접 주입하거나(in vivo transfection), 면역세포나 수지상세포 등과 같은 세포를 환자의 몸에서 추출하여 mRNA를 주입한 후, 변형된 세포를 다시 환자의 몸에 집어넣는 방법(ex vivo transfection)이 있다.
암 면역 백신(Cancer-immunotherapies)이 대표적인 예이다. 암은 종양특이적 항원을 가지고 있으며, 암의 종류별로, 개인별로 매우 다양하다. mRNA 기반 암 백신 치료제는 수지상 세포나 T세포에 특정 항원을 발현시켜 개인 맞춤형 항암백신으로 사용될 수 있다. 또한, 전염병 백신(Infectious disease vaccines), 면역치료제로서 몸에서 항체를 생산하게 만들어 직접 병을 치료할 수 있게 한다. 결핍된 단백질을 생산하여 내 몸 속에서 치료제를 직접 제조할 수도 있다.
뿐만 아니라, 기존의 단백질 기반 치료법으로는 할 수 없었던, 세포내(intracellular space) 단백질과, 막관통(tranembrane) 단백질을 타겟으로 하는 많은 질병들에 대해서도 새로운 치료제 시장을 열 것으로 기대된다.
단백질 요법
본 발명은 치료용 단백질의 발현을 위한 mRNA 전달용 복합입자의 사용은 광범위한 질병을 치료할 가능성을 보유한다. 치료적 적용은 (1) 희귀한 단발성 질환에 대한 단일 단백질의 기능을 회복시키기 위한 단백질 대체; (2) 전사 또는 성장 인자를 발현함으로써 mRNA가 세포 거동을 조절하기 위해 사용될 수있는 세포 리프로그래밍; 및 (3) mRNA- 코딩된 전사체가 표적 세포, 예를 들어 치료 항체에 대해 특이적인 면역 반응을 유발하는 면역 요법. 일반적으로, 치료 단백질을 발현하도록 설계된 mRNA는 낮은 면역원성, 연장된 안정성 및 강력한 번역을 나타내도록 조작된다. mRNA의 세포내 전달은 숙주 세포 및 조직 내부에서 사실상 임의의 원하는 단백질의 발현을 가능하게하고, 이는 숙주 세포에 선천적으로 암호화된 단백질의 번역 후 변형의 보존을 허용한다. 접근법은 또한 제형화 및 전달을 다룰 수 있다 단백질 기반 약물, 특히 세포 내 및 막 횡단 단백질의 복원을 목표로 하는 약물과 관련된 어려움. mRNA 기반 치료제의 다른 중요한 특징은 삽입 돌연변이 유발 위험이 낮고, 암호화된 단백질의 일시적 생성, 및 세포 장벽을 낮추는 mRNA의 세포질 활성을 포함한다.
치료 수준의 단백질을 유지하기 위해서는 mRNA 치료제의 반복 투여가 필요하다. 투여 빈도는 단백질의 반감기, 그의 활성 및 표적 세포의 전환율에 따라 달라질 수있다. 형질 감염된 변형 된 mRNA로부터의 평균 단백질 생산 반감기는 투여 경로에 따라 시험관내에서 50 시간 내지 생체 내 7 내지 30 시간의 범위에 있다. 최근에 합성적으로 설계된 외인성 원형 RNA가 3 배까지 제공하는 것으로 나타났다. 선형 변형된 RNA 발현카세트와 비교하여, 시험관내 단백질 생산의 반감기 및 강력한 발현의 증가. mRNA-기반 단백질 대체 요법의 대부분은 이들 조직으로의 mRNA 전달을 위한 비교적 효율적인 방법으로 인해 현재 간, 폐 및 심장을 향하고 있다. 다른 장기 및 세포 유형에 접근하려면 새로운 생체 물질, 능동적 표적화 또는 다른 투여 방법을 포함한 새로운 전달 전략의 지속적인 개발이 필요할 수 있다.
특히, 본 발명의 특정 실시형태에서 ECM과 관련된 질병은 암, 간 섬유증, 간경변증, 허파 섬유증(ILF를 포함)을 포함하는 폐 섬유증, 신장 섬유증을 야기하는 임의의 질환(예를 들어, ESRD를 포함하는 CKD), 복막 섬유증, 만성 간 손상, 원섬유형성, 다른 기관에서 섬유성 질병, 우연성 및 의원성(수술) 피부 손상의 모든 가능한 유형과 관련된 비정상적 흉터(켈로이드); 경피증; 심장섬유증, 뇌의 섬유증; 녹내장 여과수술의 실패; 및 장 점착으로 이루어진 군으로부터 선택된 질병이다.
일부 실시형태에서, 바람직한 적응증은 간 이식 후 C형 간염에 기인하는 간경변증; 비알코올성 지방간염(NASH)에 기인하는 간경변증; 특발성 폐 섬유증(IPF); 폐 섬유증을 유발하는 방사선 폐렴; 당뇨성 신증;지속석 복막 투석(CAPD)과 관련된 경화증 및 안반흔성유천포창을 포함한다.
섬유성 간 적응증은 알코올성 간경변증, B형 간염 간경변증, C형 간염 간경변증, 정위적 간 이식(orthotopic liver transplant, OLTX) 후 C형 간염(Hep C) 간경변증, NASH/NAFLD(NASH는 비알코올성 지방간 질환(NAFLD)의 극단적 형태임), 원발성 담즙성 간경변증(PBC), 원발 경화성 담관염(Primary sclerosing cholangitis, PSC), 담도폐쇄증, 알파1 항트립신 결핍증(alpha1 항트립신 결핍증, A1AD), 쿠퍼 저장병(윌슨병), 프럭토스혈증(Fructosemia), 갈락토스혈증, 당원 저장증(특히 III형, IV형, VI형, IX형 및 X형), 철분과다 증후군(Ironoverload syndrome)(혈색소침착증), 지질이상(예를 들어, 고셰병), 페록시좀병(예를 들어, 젤웨거증후군), 타이로신혈증, 선천성 간 섬유증, 박테리아 감염(예를 들어, 부루셀라증), 기생충(예를 들어, 포낭충증), 버드-키아리 증후군(간정맥 폐쇄 질환)을 포함한다.
폐 적응증은 특발성 폐 섬유증, 규폐증, 진폐증, 신생아 호흡곤란 증후군 후 기관지폐 이형성증, 블레오마이신/화학요법 유발 폐 손상, 폐 이식 후 기관지 폐색증(Brochiolitis Obliterans, BOS), 만성 폐쇄성 폐질환(Chronic obstructive pulmonary disorder, COPD), 낭포성 섬유증, 천식을 포함한다.
심장 적응증은 심근병증, 아테롬성 동맥경화증(버거스씨병 등), 심내막 심장 섬유증, 심방세동, 심근경색증(심근 Infarction, MI) 후 흉터를 포함한다.
다른 흉부 적응증은 텍스처드표면(textured) 유방 이식물 주변의 방사선-유발 캡슐 조직 반응 및 경구 점막하섬유증을 포함한다.
신장 적응증은 상염색체 우성 다낭성 신종(Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease (ADPKD), 당뇨성 신증(당뇨성 사구체경화증), FSGS(다른 조직적 변이체에 대한 붕괴), IgA 신증(버거씨병), 루푸스 신염, 베게너, 경피증, 굿페스쳐증후군, 세뇨관 간질성 섬유증: 약물 유발(보호적) 페니실린, 세팔로스포린, 진통제성 신증, 막증식성 사구체신염(Membranoproliferative glomerulonephritis, MPGN), 헤노호 쉰라인 자반증, 선천성 신증: 수질낭포병, 조슬개증후군 및 알포트 증후군을 포함한다.
골수 적응증은 림프관평활근종증(lymphangioleiomyomatosis, LAM), 이식편대숙주병, 진성다혈구증, 진성혈소판 증가증, 골수섬유증을 포함한다.
안구 적응증은 미숙아망막증(Retinopathy of Prematurity, RoP), 안반흔성유천포창, 눈물샘 섬유증, 망막 부착수술, 각막 혼탁, 헤르페스성 각막염, 익상편, 녹내장, 노인성 황반변성(Age-related 황반변성, AMD/ARMD), 망막 섬유증 관련 진성당뇨병(DM) 망막병증을 포함한다.
뇌 적응증은 뇌 경색과 관련된 섬유증을 포함한다.
부인과 적응증은 STD 섬유증/난관염 후 흉터 예방을 위한 호르몬 치료에 더해진 자궁내막증을 포함한다.
전신 적응증은 듀프트렌 구축증, 손바바닥 근막 섬유종증, 페이로니병, 레더호스병, 켈로이드, 다발성 섬유경화증, 신원성전신섬유증, 신성 골수섬유증(빈혈)을 포함한다.
손상 관련 섬유성 질병은 화상(화학적 화상을 포함) 유발 피부 및 연조직 흉터 및 수축, 암 치료 방사선 처치후 방사선 유발 피부 및 기관 흉터, 켈로이드(피부)를 포함한다.
수술 적응증은 복막 투석 카테터 후 복막 섬유증, 각막 이식, 달팽이관 이식, 다른 이식, 유방 내 실리콘 이식, 만성 부비동염; 점착, 투석 이식편의 가내막 비대증을 포함한다.
다른 적응증은 만성 췌장염을 포함한다. 본 발명에 의해 영향을 받을 수 있는 어떤 질병이든지 이것들로부터 선택된다.
국소 형질 감염
본 발명의 mRNA 복합입자의 직접 주사는 심장 조직으로의 전달을 위해 사용할 수 있으며, 여기서 변형된 mRNA는 성장 인자 (예를 들어, 혈관 내피 성장 인자-A [VEGF-A], 인슐린-유사 성장 인자 1 [IGF1], 표피 성장 인자 [EGF], 간세포 성장 인자 [HGF], 변형 성장 인자 [TGF] b1, TGFb2, 기질 세포 유래 인자 1 [SDF-1], 섬유 아세포 성장 인자 1 [FGF-1], 성장 호르몬 [GH] 및 줄기 세포 인자 [SCF]), RNAiMAX와 복합된 인간 VEGF-A를 코딩하는 변형된 RNA의 심근내 주사를 할 수 있다.
본 발명의 mRNA 복합체의 직접 형질도입의 치료 효과는 다른 조직에서도 할 수도 있다. 본 발명의 계면 활성 단백질 B(SP-B) mRNA 복합체를 동결건조하여 기관내 고압 분무 보호 마우스를 통해 폐 전달하여 국소화된 단백질 합성을 할 수도 있다.
2. 백신접종
"면역조치" 또는 "백신접종"은 일반적으로 치료적 또는 예방적 이유로 대상체를 치료하는 방법을 지칭한다. 치료, 특히 예방적 처치는 바람직하게는 예를 들어 하나 이상의 항원에 대해 대상체의 면역 반응을 유도하거나 증강시키는 것을 목표로 하는 처치이거나 이를 포함한다.
본 발명에 따르면, 본 발명에 기재된 바와 같은 RNA를 사용함으로써 면역 반응을 유도하거나 증진시키는 것이 바람직하다면, 면역 반응은 RNA에 의해 촉발되거나 강화될 수 있다.
본 발명은 바람직하게는 대상체의 백신접종인 것이거나 이를 포함하는 예방적 처치를 제공한다. 레플리콘이 면역학적 활성 화합물 또는 항원인 약학적 활성 펩티드 또는 단백질을 관심 대상 폴리펩타이드로서 코딩하는 본 발명은 백신접종에 특히 유용하다.
RNA 발현카세트는 병원균이나 암을 포함한 외래 물질에 대한 백신접종에 대해 종래에 기술되어 왔다. 종래 기술의 통상적인 접근법과는 대조적으로, 본 발명에 따른 RNA 발현카세트는 본 발명의 복제효소 구성체에 의해 코딩된 복제효소에 의해 트랜스로 복제될 수 있는 능력 때문에 효율적인 백신접종에 특히 적합한 요소이다.
본 발명의 RNA 발현카세트 복합입자 기반 암백신 및 기타 면역요법은 악성 종양을 치료하기 위한 유망한 대안 전략이다. 암 백신은 암세포에서 특이적으로 발현되는 종양 관련 항원 또는 체세포 돌연변이로 인해 발현되는 악성 세포의 항원을 표적으로 하도록 만들 수 있다. 대부분의 암 백신은 예방보다는 암의 치료에 목적을 두고 있으며, 종양을 제거하거나 줄일 수 있는 세포 독성 면역반응과 같은 세포 매개 반응을 유도한다.
본 발명의 mRNA 복합입자 백신의 투여 경로 및 전달 방법은 백신의 효과에 큰 영향을 줄 수 있다. 공통적인 전달 경로(피내, 근육 내, 피하 또는 비내 투여) 및 예방 접종 경로의 일부(관절 내, 정맥 내, 내장 내 또는 종양 내)를 사용하여 다양한 mRNA 암 백신 형식이 개발되었다.
본 발명의 mRNA 복합입자의 림프절내 투여는 비전통적이지만 효과적인 백신 전달 수단이다. 2차 림프 조직으로의 직접적인 본 발명의 mRNA 복합입자은 T 세포 활성화를 위한 항원 제시 세포를 표적으로 효과적인 항원을 전달할 수 있다. 몇몇 연구들은 림프절 내 주입된 본 발명의 mRNA 복합입자가 수지상 세포에 선택적으로 흡수될 수 있고 강력한 예방적 또는 치료적인 항종양 T 세포 반응을 유도할 수 있다.
종양 내 본 발명의 mRNA 복합입자 백신 접종은 종양 상주 T 세포의 신속하고 특이적인 활성화를 일으킨다. 초기 연구에서 알부민 mRNA 또는 프로타민-비종양 관련 유전자(GLB1)를 암호화하는 본 발명의 mRNA 복합입자의 종양내 투여는 종양 성장을 저해할 것이다.
피부는 다양한 항원 제시 세포가 존재하며 면역원 전달을 위한 백신 접종의 이상적인 부위가 된다. 따라서, 피내 경로(intradermal)를 통한 본 발명의 mRNA 복합입자 백신의 전달은 암 백신에 널리 이용될 수 있다.
전통적인 화학 요법, 방사선 요법 및 면역 체크포인트 억제제와 같은 보조 요법과 함께 본 발명의 RNA 발현카세트 복합입자 백신 접종의 조합은 일부 전임상 연구에서 백신 접종의 유효한 결과를 증가시킬 것이다.
재조합 단백질의 매우 강한 발현으로부터 입증된 바와 같이, 대상유전자-함유 레플리콘이 백신접종된 동물에서 높은 사본 수에 도달한다는 것을 가능하게 한다. 레플리콘이 치료용 단백질을 코딩하는 본 발명에 따른 백신접종이 매우 효율적이라는 것을 입증한다. 따라서, 본 발명은 알파바이러스-기반된 트랜스-복제 RNA 시스템을 이용한 효과적인 백신접종을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 백신접종을 포함하는 방법에서, 본 발명의 의약품은 특히 항원을 포함하는 질환을 갖거나 항원을 포함하는 질환에 걸릴 위험이 있는 대상체를 치료하는 것을 원하는 경우, 대상체에 투여된다.
본 발명에 따른 백신접종을 포함하는 방법에서, 본 발명에서 사용하는 레플리콘에 의해 코딩된 관심 대상 폴리펩타이드는 예를 들어, 면역 반응이 유도되는 박테리아 항원 또는 면역 반응이 유도되는 바이러스 항원, 또는 면역 반응이 유도되는 암 항원 또는 면역 반응이 유도되는 단세포 생물의 항원에 대해 암호화한다.
백신접종의 효능은 유기체로부터의 항원-특이적 IgG 항체의 측정과 같은 공지된 표준 방법에 의해 평가될 수 있다. 본 발명에 따른 알러젠 특이적 면역요법을 포함하는 방법에서, 본 발명에 따른 레플리콘에 의해 코딩된 관심 대상 폴리펩타이드는 알레르기 관련 항원을 암호화한다.
알러젠-특이 면역요법 (탈감작요법으로도 알려짐)은 바람직하게는 원인 알러젠에 대한 후속 노출과 관련된 증상이 경감되는 상태를 달성하기 위해, 알러젠 백신의 증가된 투여량을 하나 이상의 알레르기를 가진 유기체에 투여하는 것으로 정의된다. 알러젠 특이적 면역요법의 효능은 유기체로부터 알러젠 특이적 IgG 및 IgE 항체의 측정과 같은 공지된 표준 방법으로 평가할 수 있다.
본 발명의 의약품은 예를 들어 대상체의 백신접종을 포함한 대상체의 치료를 위해 대상체에게 투여될 수 있다.
본 발명은 생분해성 고분자 담체 분자, 또는 RNA 발현카세트 복합입자 및 본원에 정의된 질병의 치료를 위한 생분해성 고분자 담체 분자에 의해 만들어진 RNA 발현카세트 복합입자의 두번째 의학적 용도에 관한 것이며, 바람직하게는 본원에 정의된 다양한 질환들의 예방, 치료 및/또는 개선을 위한 의약품의 제조를 위한 RNA 발현카세트의, 또는 생분해성 고분자 담체 분자에 의해 만들어진 생분해성 RNA 발현카세트 복합입자의, 또는 이들을 포함하는 약학적 조성물의, 또는 이들을 포함하는 키트의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 생분해성 RNA 발현카세트 복합입자의 용도에 관한 것이며, 바람직하게는 본원에 정의된 RNA 발현카세트 복합입자의 용도에 관한 것이고, 면역요법(immunotherapy), 유전자 치료법(gene therapy), 백신 접종(vaccination)을 위한 RNA 발현카세트 및 생분해성 고분자 담체 분자에 의해 만들어진 생분해성 RNA 발현카세트 복합입자의 용도에 관한 것이거나, 애쥬번트로서 이들의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 본원에 정의된 질병들의 치료에 관한 것이고, 바람직하게는 본원에 정의된 다양한 질병들의 예방, 치료 및/또는 개선에 관한 것이며, 바람직하게는 핵산 전달물 및 생분해성 RNA 발현카세트 복합입자를 필요로 하는 환자들에 사용하거나 투여하여 치료하는 것에 관한 것이거나 본원에 정의된 생분해성 약학적 조성물 또는 백신에 관한 것이다.
또한 본 발명은 유전되지 않는 질병의 치료나 상기 카테고리에 요약되지 않은 질병도 치료한다. 그러한 질병은 예를 들어 상기 언급된 치료학적 활성 단백질과 같은 특정 단백질 요소를 필요로 하는 환자의 치료를 포함할 수 있다. 이것은 예를 들어 투석 환자를 포함할 수 있고, 이러한 환자들은 (정기적인) 콩팥(kidney)이나 신장(renal) 투석을 하거나, 본원에 정의된 특정 치료학적 활성 단백질, 예를 들어, ECM 분해효소 또는 분해효소 저해물질 등을 필요로하는 환자들을 포함할 수 있다.
본 발명은 키트를 제공하며, 특히 구성요소만을 포함하거나, 다른 성분들과 조합된, 적어도 하나의 RNA 발현카세트 및 생분해성 고분자 담체 분자에 의해 만들어진 적어도 하나의 생분해성 RNA 발현카세트 복합입자, 본원에서 정의된 적어도 하나의 핵산, 적어도 하나의 약학적 조성물 및/또는 이들을 포함하는 적어도 하나의 키트, 그리고 선택적으로 RNA 발현카세트, 핵산, 생분해성 RNA 발현카세트 복합입자 및/또는 생분해성 약학적 조성물의 처치 및 주사에 대한 정보를 가진 기술 지시(technical instructions)를 포함하는 키트, 특히 구성 부분들(parts)의 키트를 제공한다. 그러한 키트, 바람직하게는 일부 구성요소로 된 키트는 예를 들어 상기 언급된 응용 또는 용도들 중 어떤 것에 적용될 수 있다.
Ⅴ. 치료 고려 사항
Good manufacturing practice 생산
RNA 발현카세트는 재조합효소, 리보뉴클레오티드, 트리포스페이트(triphosphates) 및 DNA 주형과의 시험관내 반응에 의해 생성된다. 따라서 전통적인 아형 단백질 및 생바이러스 백신 생산 플랫폼과 비교할 때 RNA 발현카세트의 생산이 빠르고 간단하다. RNA 발현카세트 생산의 반응 수율 및 단순성은 작은 GMP 시설에서 신속한 mRNA 생산을 가능하게 한다. 제조 공정은 서열과 무관하며 주로 RNA 발현카세트의 길이, 뉴클레오티드 및 캐핑(capping) 화학 및 제품의 정제에 의해 결정된다. 현재의 경험에 따르면, 이 과정은 거의 모든 암호화 단백질 면역원을 생산하도록 표준화될 수 있어 신출현 감염병에 대한 신속한 대응에 특히 적합하다. RNA 발현카세트의 GMP 생산에 필요한 모든 효소와 반응 성분은 합성 화학 물질 또는 박테리아로 발현된 동물성 성분이 없는 시약으로 상업 공급 업체에서 얻을 수 있으므로 세포 배양에 기초한 백신 제조에 역효과를 주는 안전성 문제를 피할 수 있다.
RNA 발현카세트가 합성되면, 효소, 잔여 뉴클레오타이드, 잔여 DNA 및 절단된 RNA 단편을 포함하는 반응 성분을 제거하기 위한 여러 정제 단계를 거쳐 가공된다. 임상 규모에서의 정제는 유도체화 된 마이크로 비드를 배치 또는 칼럼 형식으로 진행한다. 일부 RNA 발현카세트 플랫폼의 경우 dsRNA 및 기타 오염 물질을 제거하는 것이 최종 제품의 효능에 중요하다. mRNA를 정제한 후, 최종 저장 완충액으로 교환하고 이후 임상 이용을 위한 튜브에 보관하기 위해 멸균 여과한다. 제제 버퍼는 오염된 RNase가 없도록 하고, 반응성 활성산소와 RNA 발현카세트 불안정성을 유도하는 2가 금속 이온의 영향을 최소화하는 항산화제 및 킬레이트제와 같은 완충 성분을 포함할 수 있는지 시험해 봐야 한다.
RNA 발현카세트의 약제학적 제형은 개발이 활발하게 되고 있는 영역이다. 초기 단계 연구에서는 대부분의 제품이 냉동(-70°C)으로 저장되었지만 백신 배포에 보다 적합한 고온에서 안정한 제형을 개발하려는 노력은 계속되고 있다. CurVac 사의 RNAtive 플랫폼은 동결 건조 후 5~25°C에서 3년간 그리고 40°C에서 6개월 동안 보관 후 활성이 있는 것으로 보고되었다. 또 다른 보고서는 동결 건조 naked mRNA가 냉장 조건에서 최소 10개월 동안 안정함을 보여주었다. RNA 발현카세트 제품의 안정성은 나노 입자 내에 포장하거나 RNase 저해제와 함께 배합함으로써 향상될 수 있다.
규제측면
RNA 발현카세트 복합입자 제품에 대한 FDA 또는 EMA (European Medicines Agency)의 구체적인 지침은 없다. 그러나 EMA 및 FDA 감독하에 실시된 임상 시험의 증가는 RNA 발현카세트 제품이 사람에게 테스트하기에 안전하고 수용 가능하다는 것을 입증하기 위해 다양한 조직에서 제안한 아이디어를 감독 기관이 수용했다는 것을 나타낸다. RNA 발현카세트 복합입자가 유전자 면역원의 광범위한 백신 범주에 속하기 때문에 DNA 백신 및 유전자 치료 벡터에 대해 정의된 많은 지침 원리는 RNA 발현카세트의 고유한 특징을 반영하는 일부 특징을 통해 RNA 발현카세트 복합입자에 적용될 수 있다. 백신 분야에서 mRNA 제품이 더욱 두드러지기 때문에, 새로운 RNA 발현카세트 복합입자를 생산하고 평가할 필요가 있는 구체적인 지침이 개발될 것이다.
안전
백신은 건강한 사람에게 투여하기 때문에 현대 예방 백신의 안전 요구 사항은 매우 엄격하다. RNA 발현카세트의 제조 과정은 우연한 바이러스로 오염될 수 있는 독성 화학 물질이나 세포 배양을 필요로 하지 않기 때문에 RNA 발현카세트 생산은 생바이러스, 바이러스 벡터, 불활성화 바이러스 및 아단위 단백질 백신을 비롯한 다른 백신 플랫폼에 존재하는 공통 위험을 피할 수 있다. 또한, RNA 발현카세트의 짧은 제조 시간은 오염 미생물이 생길 기회가 거의 없다. 백신을 접종한 사람들의 경우 벡터의 숙주 세포 DNA로의 감염 또는 통합의 이론적 위험은 RNA 발현카세트 복합입자의 경우 존재하지 않는다.
미래의 전임상 및 임상 연구에서 평가될 가능성이 있는 잠재적인 안전성 문제는 국소 염증 및 전신 염증, 면역원성의 생체 분포 및 지속성, 자가 반응 항체의 자극 및 모든 비천연 뉴클레오타이드 및 전달체 성분의 잠재적 독성 영향을 포함한다. 또 다른 잠재적 안전성 문제는 RNA 발현카세트 복합입자 투여 동안 세포외 RNA의 존재로부터 생길 수 있다. Extracellular naked RNA는 단단히 결합된 내피 세포의 투과성을 증가시키는 것으로 나타났으며 따라서 부종에 기여할 수 있다. 또 다른 연구는 세포외 RNA가 혈액 응고와 병리학적 혈전 형성을 촉진한다는 것을 보여주었다. 따라서 안전성은 다른 RNA 발현카세트 복합입자 방법 및 전달체가 인간에게 활용되기까지 지속적인 평가가 필요하다.
기능성 단백질 발현을 위해 리포좀에 캡슐화된 외인성 mRNA의 마우스 림프구로의 개념 증명 전달을 상세하게 설명하는 1978 년에 첫 번째 보고서 이후, 206개의 mRNA 치료제가 공개되었다. 단백질 대체, 유전자 편집 및 백신 접종을 포함하여 mRNA의 다양한 치료적 적용이 현재 학계 및 상업적 실체에 의해 조사되고있다. 지금까지, 임상 노력은 백신 치료에 주로 집중되는데, 여기서 mRNA 치료제는 종래의 전략보다 많은 장점을 갖는다. 그러나, mRNA는 또한 국소 및 전신 단백질 대체 요법을 위한 매개체로서 강력한 잠재력을 가지고있다. 마지막으로, mRNA는 ZFN 및 CRISPR-Cas 뉴 클레아 제와 같은 게놈-편집 도구의 생체 외 및 생체 내 전달에 대한 잠재력을 조사하여 비바이러스성 게놈-편집 요법의 길을 열었다. mRNA의 광범위한 적용은 여전히 개선된 전달체의 필요성에 의해 제한된다. 그러나, 우리는 다양한 다른 물질을 사용하여 mRNA 나노 포뮬레이션의 지속적인 발전이 궁극적으로 광범위한 질병의 치료를 위한 RNA 발현카세트의 사용으로 이어질 것으로 믿는다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
실시례 1. RNA 발현카세트 주형의 설계 및 제조
본 발명의 RNA 발현카세트는 세포에서 단백질 합성이 가능한 구조를 갖는 RNA를 제안하였다. 본 발명에서 사용되는 RNA 발현카세트의 표적단백질은 치료용 단백질(sTNFR2, EPO, G-CSF), 세포외기질 분해 효소(HYAL 1, Hyaluronidase PH20, MMP1, MMP 8, MMP 13), 세포외기질 분해 효소의 저해물질(TIMP 1, TIMP 2, TIMP 3 및 TIMP 4) 및 백신 접종용 목적 단백질(RAV-G 및 RSV-F 단백질)을 코딩하는 ORF를 포함하며 제한되는 것은 아니다. 상기 표적단백질을 포함한 다양한 단백질들이 안정적으로 발현할 수 있는 특히, 발현카세트가 선형 핵-비의존적으로 세포질 발현이 가능한 RNA 발현카세트는 다음과 같이 제조하였다.
1-1. RNA 발현카세트 주형의 설계
상기 RNA 발현카세트는 비증폭 mRNA(non-amplifying mRNA) 구조체; 및 자가 증폭 mRNA(self-amplifying mRNA) 구조체 등이 있다. 상기 비증폭 mRNA 구조체는 (a) 상기 표적 폴리펩타이드를 암호화하는 개방 판독 프레임(open reading frame, ORF): (b) 5' UTR; (c) 3' UTR; 및 (d) 5' 캡 구조(cap structure) 또는 IRES;를 포함한다. 상기 자가 증폭 mRNA(self-amplifying mRNA) 구조체는 (a) RNA dependent RNA polymerase(RdRp)를 발현시키기 위한 mRNA 구조; 및 (b) 상기 RdRp에 의해 복제될 수 있고 상기 관심 대상 폴리펩타이드를 코딩하는 ORF를 포함하는 mRNA 레플리콘(replicon)을 포함하며, 여기서, 상기 두 종류의 구성요소가 동일한 한 개의 RNA에 있는 시스-레플리콘 RNA 구조체 또는 각각 상이한 두 개의 RNA에 있는 트렌스 레플리콘 RNA 구조체를 포함한다.
본 발명의 RNA 발현카세트를 제조하기 위해, 표적 단백질 ORF를 제조할 수 있는 T7 프로모터가 있는 표적 단백질 DNA를 설계하고 제작하여 pUC19 클로닝 벡터에 재조합하고, 재조합 pUC19 벡터에서 얻은 T7 프로모터가 있는 표적 단백질 DNA를 주형으로 체외전사한 후, 5′Cap 구조를 전사체에 부가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 표적단백질 DNA는 표적단백질을 효율적으로 합성할 수 있는 DNA 절편으로 <T7 promoter - 5'UTR - 표적단백질 DNA - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL> 순서로 제조하였다.
본 발명의 표적단백질 DNA는 표적단백질 orf를 효율적으로 합성할 수 있는 DNA 절편으로 <T7 프로모터 다음에 5'UTR, 표적단백질를 코딩하는 ORF, 3'UTR>로 구성된 DNA 절편을 설계하였다.
본 발명의 표적단백질 DNA는 pUC19 벡터에서 T7 promoter와 5'UTR의 하류에 위치하면서, muag (mutated alpha-globin-3′UTR), A64 폴리(A) 서열, 폴리(C) 서열(C30) 및 히스톤 스템-루프 서열(히스톤-SL)서열의 상류에 위치하게 하였다.
상기 표적단백질 DNA 절편을 구성하는 단위 요소들은 다음과 같다.
표적단백질 RNA 발현카세트를 구성하는 염기서열
Backbone DNA or amino acid sequences
T7 promoter TAATACGACT CACTATAGGG (서열번호 6)
hAg-Kozak ATTCTTCTGG TCCCCACAGA CTCAGAGAGA ACCCGCCACC(서열번호 7)
Sec ATGAGAGTGA CCGCCCCCAG AACCCTGATC CTGCTGCTGT CTGGCGCCCT GGCCCTGACA GAGACATGGG CCGGAAGCGG ATCC (서열번호 8)
(M R V T A P R T L I L L L S G A L A L T E T W A G S G S; 서열번호 9)
muag - A64 - C30 - 히스톤S GCCCGATGGG CCTCCCAACG GGCCCTCCTC CCCTCCTTGC ACCGAGATTA ATAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAATGCA TCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CCAAAGGCTC TTTTCAGAGC CACCA (서열번호 10):
2 BgUTR CCGAGAGCTC GUCGGCCAAC AAAAGGTTCU TGCCCAAGTC CAACA CAAAC TGGGGGATAT TATGAAGGGC CTTGAGCATC TGGATTCTGC CTAATAAAAA ACATTTACAT TGCTGCGTCG AGAGCTCGCT TCTTGCTGTC CAATTTCTAT TAAAGGTTCC TTTGTTCCCT AAGTCCAACT ACTAAACTGG GGGATATTAT GAAGGGCCTT GAGCATCTGG ATTCTGCCTA ATAAAAAACA TTTACATTGC TGCGTC (서열번호 11)
A30LA70 GAGACCTGGT CCAGAGTCGC TAGCAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAGCATAT GACTAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA(서열번호 12)
(G4S)3-linker GGAGGCGGTG GTAGTGGAGG TGGCGGGTCC GGTGGAGGTG GAAGC(서열번호 13)
(G G G G S G G G G S G G G G S; 서열번호 14)
본 발명의 5*?**?*UTR는 마우스 리보솜 단백질 라지 35A (mRPL35A)일 수 있으며, 그 염기서열은 서열번호 15이다.
GGGCCATCTT GGCGCCTGTG GAGGCCTGCT GGGAACAGGA CTTCTAACAG CAAGTAAGCT TGAGGATG (서열번호 15)
5'UTR 요소는 5' 말단 올리고피리미딘관이 결여된 인간 리보솜 단백질 라지(Large) 32의 5'-UTR: human ribosamal protein Large 32 lacking the 5' terminal oligopyrimidine tract GGCGCTGCCTACGGAGGTGGCAGCCATCTCCTTCTCGGCATC (서열번호 16)
바람직하게는 인간 하이드록시스테로이드 (17-베타) 디하이드로게나아제 4 유전자(HSD17B4)로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
GGGTCCCGCA GTCGGCGTCC AGCGGCTCTG CTTGTTCGTG TGTGTGTCGT TGCAGGCCTT ATTCAAGCTT ACCATG (서열번호 17)
바람직하게, 상기 5'UTR는 hAg-Kozak로 서열번호 7이다
상기 5'UTR는 Kozak 컨센서스를 포함하며, Kozak 컨센서스 서열은 ACCAUGG (서열번호 18) 일 수도 있다.
3'UTR는 muag - A64 - C30 - 히스톤-SL 및 2 BgUTR-A30LA70을 포함하는 구조에서 선택되어진 어느 하나일 수 있다. 표적단백질이 융합단백질인 경우는 링커는 (G4S)3-linker 그리고. 표적단백질을 세포외부로 분비하는 목적으로 Sec을 사용할 수 있다.
여기에서 3'UTR은 서열 5'-GCCCGaTGGG CCTCCCAACG GGCCCTCCTC CCCTCCTTGC ACCG-3'(서열번호 19; muag; 밑줄 친 뉴클레오타이드는 야생형 서열과 비교하여 돌연변이임) (알파-)글로빈의 돌연변이된 UTR, 폴리(A) 꼬리는 64개의 아데닌 뉴클레오타이드, 폴리(C) 서열은 30개의 사이토신 뉴클레오타이드, 히스톤 스템-루프는 (5'-CAAAGGCUCU UUUCAGAGCC ACCA-3' 서열번호 20)로 이루어진 RNA 서열이다.
A64: GGACTAGTAG ATCTAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA (서열번호 21)
C30: TGCATCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCTCTA G (서열번호 22)
본 발명에 사용하는 표적단백질은 sTNFR2, EPO, G-CSF 및 E3 ligase를 포함하는 치료용 단백질; 히알루로니다제, MMP와 TIMP를 포함하는 ECM 분해관련 단백질; 그리고 광견병 바이러스의 G 단백질(RAV-G) 및 RSV 롱(long) 균주의 RSV-F 단백질를 포함하는 백신관련 단백질을 사용하였으며, 이들에 국한되는 것은 아니다.
<치료용 단백질>
sTNFR2
본 발명의 치료 단백질은, TNFR2 단백질 또는 이의 세포외 영역 단편이다. 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF)는 다면발현 사이토카인으로, 특히 TNF-α는 염증성 반응 및 면역 체계에서 중요한 역할을 담당한다. TNF 에 결합하는 수용체로서 TNFR1(분자량, 55 kD; TNF-R55) 및 TNFR2(분자량,75 kD; TNF-R75)가 알려져 있으며, 이 때 TNFR2에 대한 TNF-α의 친화도는 TNFR1에 대한 친화도보다 몇 배 더높다고 알려져 있다.
본 발명에서 TNFR2 단백질은 1386 bp DNA(NM_001066.3에 코딩되었으며, 이 단백질 또는 이의 세포외 영역 단편(sTNFR2)은 TNF-α에 대하여 높은 결합 친화도를 가지며 TNF-α의 작용을 억제함으로써 자가 면역 질환의 치료에 특히 우수한 효과를 나타낼 수 있다.
바람직하게, 상기 sTNFR2는 TNFR2 단백질 중 N말단으로부터 1번 내지 256번을 포함하는 서열번호 23의 아미노산 서열 폴리펩타이드일 수 있다.
또한 바람직하게, 상기 sTNFR2 cDNA는 서열번호 24의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.
sTNFR2: TNFR2의 1~ 256 아미노산으로 이루어진 transmembrane sequence 단편
MAPVAVWAAL AVGLELWAAA HALPAQVAFT PYAPEPGSTC RLREYYDQTA QMCCSKCSPG QHAKVFCTKT SDTVCDSCED STYTQLWNWV PECLSCGSRC SSDQVETQAC TREQNRICTC RPGWYCALSK QEGCRLCAPL RKCRPGFGVA RPGTETSDVV CKPCAPGTFS NTTSSTDICR PHQICNVVAI PGNASMDAVC TSTSPTRSMA PGAVHLPQPV STRSQHTQPT PEPSTAPSTS FLLPMGPSPP AEGSTG (서열번호 23)
sTNFR2 cDNA; sTNFR2에 상응하는 cDNA(768bp)
ATGGCGCCC GTCGCCGTCT GGGCCGCGCT GGCCGTCGGA CTGGAGCTCT GGGCTGCGGC GCACGCCTTG CCCGCCCAGG TGGCATTTAC ACCCTACGCC CCGGAGCCCG GGAGCACATG CCGGCTCAGA GAATACTATG ACCAGACAGC TCAGATGTGC TGCAGCAAAT GCTCGCCGGG CCAACATGCA AAAGTCTTCT GTACCAAGAC CTCGGACACC GTGTGTGACT CCTGTGAGGA CAGCACATAC ACCCAGCTCT GGAACTGGGT TCCCGAGTGC TTGAGCTGTG GCTCCCGCTG TAGCTCTGAC CAGGTGGAAA CTCAAGCCTG CACTCGGGAA CAGAACCGCA TCTGCACCTG CAGGCCCGGC TGGTACTGCG CGCTGAGCAA GCAGGAGGGG TGCCGGCTGT GCGCGCCGCT GCGCAAGTGC CGCCCGGGCT TCGGCGTGGC CAGACCAGGA ACTGAAACAT CAGACGTGGT GTGCAAGCCC TGTGCCCCGG GGACGTTCTC CAACACGACT TCATCCACGG ATATTTGCAG GCCCCACCAG ATCTGTAACG TGGTGGCCAT CCCTGGGAAT GCAAGCATGG ATGCAGTCTG CACGTCCACG TCCCCCACCC GGAGTATGGC CCCAGGGGCA GTACACTTAC CCCAGCCAGT GTCCACACGA TCCCAACACA CGCAGCCAAC TCCAGAACCC AGCACTGCTC CAAGCACCTC CTTCCTGCTC CCAATGGGCC CCAGCCCCCC AGCTGAAGGG AGCACTGGC (서열번호 24)
EPO
본 발명의 EPO RNA 발현카세트의 제조를 위하여, 쥣과의(murine) EPO cDNA의 염기서열은 다음과 같다.
EPO cDNA
ATGGGCG TGCCCGAGCG GCCGACCCTG CTCCTGCTGC TCAGCCTGCT GCTCATCCCC CTGGGGCTGC CCGTCCTCTG CGCCCCCCCG CGCCTGATCT GCGACTCCCG GGTGCTGGAG CGCTACATCC TCGAGGCCAA GGAGGCGGAG AACGTGACCA TGGGCTGCGC CGAGGGGCCC CGGCTGAGCG AGAACATCAC GGTCCCCGAC ACCAAGGTGA ACTTCTACGC CTGGAAGCGC ATGGAGGTGG AGGAGCAGGC CATCGAGGTC TGGCAGGGCC TGTCCCTCCT GAGCGAGGCC ATCCTGCAGG CGCAGGCCCT CCTGGCCAAC TCCAGCCAGC CCCCGGAGAC ACTGCAGCTC CACATCGACA AGGCCATCTC CGGGCTGCGG AGCCTGACCT CCCTCCTGCG CGTGCTGGGC GCGCAGAAGG AGCTCATGAG CCCGCCCGAC ACGACCCCCC CGGCCCCGCT GCGGACCCTG ACCGTGGACA CGTTCTGCAA GCTCTTCCGC GTCTACGCCA ACTTCCTGCG GGGCAAGCTG AAGCTCTACA CCGGGGAGGT GTGCCGCCGG GGCGACCGCT GA (서열번호 25)
GM CSF
본 발명의 GM CSF RNA 발현카세트의 제조를 위하여, GM CSF (CSF2) (NM_000758)의 염기서열은 다음과 같다.
GM CSF (CSF2) cDNA (NM_000758)
ATGTGGCTGC AGAGCCTGCT GCTCTTGGGC ACTGTGGCCT GCAGCATCTC TGCACCCGCC CGCTCGCCCA GCCCCAGCAC GCAGCCCTGG GAGCATGTGA ATGCCATCCA GGAGGCCCGG CGTCTCCTGA ACCTGAGTAG AGACACTGCT GCTGAGATGA ATGAAACAGT AGAAGTCATC TCAGAAATGT TTGACCTCCA GGAGCCGACC TGCCTACAGA CCCGCCTGGA GCTGTACAAG CAGGGCCTGC GGGGCAGCCT CACCAAGCTC AAGGGCCCCT TGACCATGAT GGCCAGCCAC TACAAGCAGC ACTGCCCTCC AACCCCGGAA ACTTCCTGTG CAACCCAGAT TATCACCTTT GAAAGTTTCA AAGAGAACCT GAAGGACTTT CTGCTTGTCA TCCCCTTTGA CTGCTGGGAG CCAGTCCAGG AGTGA (서열번호 26)
FBXW7
FBXW7은 E3 ligase에 속하는 잘 특성화된 SCF이며 C-MyC, 형질 전환 단백질 RhoA (RhoA), 전사 활성화 제 BRG1 (Brg1) 및 아연-핑거 단백질 GFI-1 (GFI1)과 같은 발암 성 단백질의 파괴를 촉진한다. 이러한 표적 단백질은 모두 종양 형성을 촉진합니다. 예를 들어, Brg1은 암의 전이를 촉진하고, RhoA는 종양 형성과 관련이 있으며, GFI1은 종양 단백질로서 세포 증식을 촉진한다.
FBXW7 cDNA(1770 nt): NM_001013415.2
ATGTCAAAAC CGGGAAAACC TACTCTAAAC CATGGCTTGG TTCCTGTTGA TCTTAAAAGT GCAAAAGAGC CTCTACCACA TCAAACTGTG ATGAAGATAT TTAGCATTAG CATCATTGCC CAAGGCCTCC CTTTTTGTCG AAGACGGATG AAAAGAAAGT TGGACCATGG TTCTGAGGTC CGCTCTTTTT CTTTGGGAAA GAAACCATGC AAAGTCTCAG AATATACAAG TACCACTGGG CTTGTACCAT GTTCAGCAAC ACCAACAACT TTTGGGGACC TCAGAGCAGC CAATGGCCAA GGGCAACAAC GACGCCGAAT TACATCTGTC CAGCCACCTA CAGGCCTCCA GGAATGGCTA AAAATGTTTC AGAGCTGGAG TGGACCAGAG AAATTGCTTG CTTTAGATGA ACTCATTGAT AGTTGTGAAC CAACACAAGT AAAACATATG ATGCAAGTGA TAGAACCCCA GTTTCAACGA GACTTCATTT CATTGCTCCC TAAAGAGTTG GCACTCTATG TGCTTTCATT CCTGGAACCC AAAGACCTGC TACAAGCAGC TCAGACATGT CGCTACTGGA GAATTTTGGC TGAAGACAAC CTTCTCTGGA GAGAGAAATG CAAAGAAGAG GGGATTGATG AACCATTGCA CATCAAGAGA AGAAAAGTAA TAAAACCAGG TTTCATACAC AGTCCATGGA AAAGTGCATA CATCAGACAG CACAGAATTG ATACTAACTG GAGGCGAGGA GAACTCAAAT CTCCTAAGGT GCTGAAAGGA CATGATGATC ATGTGATCAC ATGCTTACAG TTTTGTGGTA ACCGAATAGT TAGTGGTTCT GATGACAACA CTTTAAAAGT TTGGTCAGCA GTCACAGGCA AATGTCTGAG AACATTAGTG GGACATACAG GTGGAGTATG GTCATCACAA ATGAGAGACA ACATCATCAT TAGTGGATCT ACAGATCGGA CACTCAAAGT GTGGAATGCA GAGACTGGAG AATGTATACA CACCTTATAT GGGCATACTT CCACTGTGCG TTGTATGCAT CTTCATGAAA AAAGAGTTGT TAGCGGTTCT CGAGATGCCA CTCTTAGGGT TTGGGATATT GAGACAGGCC AGTGTTTACA TGTTTTGATG GGTCATGTTG CAGCAGTCCG CTGTGTTCAA TATGATGGCA GGAGGGTTGT TAGTGGAGCA TATGATTTTA TGGTAAAGGT GTGGGATCCA GAGACTGAAA CCTGTCTACA CACGTTGCAG GGGCATACTA ATAGAGTCTA TTCATTACAG TTTGATGGTA TCCATGTGGT GAGTGGATCT CTTGATACAT CAATCCGTGT TTGGGATGTG GAGACAGGGA ATTGCATTCA CACGTTAACA GGGCACCAGT CGTTAACAAG TGGAATGGAA CTCAAAGACA ATATTCTTGT CTCTGGGAAT GCAGATTCTA CAGTTAAAAT CTGGGATATC AAAACAGGAC AGTGTTTACA AACATTGCAA GGTCCCAACA AGCATCAGAG TGCTGTGACC TGTTTACAGT TCAACAAGAA CTTTGTAATT ACCAGCTCAG ATGATGGAAC TGTAAAACTA TGGGACTTGA AAACGGGTGA ATTTATTCGA AACCTAGTCA CATTGGAGAG TGGGGGGAGT GGGGGAGTTG TGTGGCGGAT CAGAGCCTCA AACACAAAGC TGGTGTGTGC AGTTGGGAGT CGGAATGGGA CTGAAGAAAC CAAGCTGCTG GTGCTGGACT TTGATGTGGA CATGAAGTGA (서열번호 27)
<세포외기질 분해 효소>
히알루로니다제
히알루로니다제(HA를 분해하는 효소)는 HYAL1 (NM_153281), HYAL2 (NM_033158), HYAL3 (NM_003549), HYAL4 (NM_012269) 및 Hyaluronidase PH20 (SPAM1) (NM_001174044), sPH20 등이 있다.
PH20 CDNA, 서열번호 28은 개시 코돈(ATG)에서 1467번 위치까지의 단백질 Hyaluronidase PH20 (SPAM1) (NM_001174044)에 대한 코딩 뉴클레오티드 서열이다.
Hyaluronidase PH20 (SPAM1) cDNA (NM_001174044)
ATGGGAGTGC TAAAATTCAA GCACATCTTT TTCAGAAGCT TTGTTAAATC AAGTGGAGTA TCCCAGATAG TTTTCACCTT CCTTCTGATT CCATGTTGCT TGACTCTGAA TTTCAGAGCA CCTCCTGTTA TTCCAAATGT GCCTTTCCTC TGGGCCTGGA ATGCCCCAAG TGAATTTTGT CTTGGAAAAT TTGATGAGCC ACTAGATATG AGCCTCTTCT CTTTCATAGG AAGCCCCCGA ATAAACGCCA CCGGGCAAGG TGTTACAATA TTTTATGTTG ATAGACTTGG CTACTATCCT TACATAGATT CAATCACAGG AGTAACTGTG AATGGAGGAA TCCCCCAGAA GATTTCCTTA CAAGACCATC TGGACAAAGC TAAGAAAGAC ATTACATTTT ATATGCCAGT AGACAATTTG GGAATGGCTG TTATTGACTG GGAAGAATGG AGACCCACTT GGGCAAGAAA CTGGAAACCT AAAGATGTTT ACAAGAATAG GTCTATTGAA TTGGTTCAGC AACAAAATGT ACAACTTAGT CTCACAGAGG CCACTGAGAA AGCAAAACAA GAATTTGAAA AGGCAGGGAA GGATTTCCTG GTAGAGACTA TAAAATTGGG AAAATTACTT CGGCCAAATC ACTTGTGGGG TTATTATCTT TTTCCGGATT GTTACAACCA TCACTATAAG AAACCCGGTT ACAATGGAAG TTGCTTCAAT GTAGAAATAA AAAGAAATGA TGATCTCAGC TGGTTGTGGA ATGAAAGCAC TGCTCTTTAC CCATCCATTT ATTTGAACAC TCAGCAGTCT CCTGTAGCTG CTACACTCTA TGTGCGCAAT CGAGTTCGGG AAGCCATCAG AGTTTCCAAA ATACCTGATG CAAAAAGTCC ACTTCCGGTT TTTGCATATA CCCGCATAGT TTTTACTGAT CAAGTTTTGA AATTCCTTTC TCAAGATGAA CTTGTGTATA CATTTGGCGA AACTGTTGCT CTGGGTGCTT CTGGAATTGT AATATGGGGA ACCCTCAGTA TAATGCGAAG TATGAAATCT TGCTTGCTCC TAGACAATTA CATGGAGACT ATACTGAATC CTTACATAAT CAACGTCACA CTAGCAGCCA AAATGTGTAG CCAAGTGCTT TGCCAGGAGC AAGGAGTGTG TATAAGGAAA AACTGGAATT CAAGTGACTA TCTTCACCTC AACCCAGATA ATTTTGCTAT TCAACTTGAG AAAGGTGGAA AGTTCACAGT ACGTGGAAAA CCGACACTTG AAGACCTGGA GCAATTTTCT GAAAAATTTT ATTGCAGCTG TTATAGCACC TTGAGTTGTA AGGAGAAAGC TGATGTAAAA GACACTGATG CTGTTGATGT GTGTATTGCT GATGGTGTCT GTATAGATGC TTTTCTAAAA CCTCCCATGG AGACAGAAGA ACCTCAAATT TTCTACAATG CTTCACCCTC CACACTATCT GCCACAATGT TCATTGTTAG TATTTTGTTT CTTATCATTT CTTCTGTAGC GAGTTTGTGA (서열번호 28)
sPH20
sPH20 cDNA는 서열번호 28, PH20 cDNA의 전사 시작 (ATG)에서 위치 1467까지의 염기서열로 PH20 단백질의 소수성 꼬리 (뉴클레오타이드 1468-1527)가 결여되고 마지막에 정지 코돈 (TAA)이 추가된 염기서열 형태로 세포에서 분비하는 단백질이다.
sPH20 cDNA
ATGGGAGTGC TAAAATTCAA GCACATCTTT TTCAGAAGCT TTGTTAAATC AAGTGGAGTA TCCCAGATAG TTTTCACCTT CCTTCTGATT CCATGTTGCT TGACTCTGAA TTTCAGAGCA CCTCCTGTTA TTCCAAATGT GCCTTTCCTC TGGGCCTGGA ATGCCCCAAG TGAATTTTGT CTTGGAAAAT TTGATGAGCC ACTAGATATG AGCCTCTTCT CTTTCATAGG AAGCCCCCGA ATAAACGCCA CCGGGCAAGG TGTTACAATA TTTTATGTTG ATAGACTTGG CTACTATCCT TACATAGATT CAATCACAGG AGTAACTGTG AATGGAGGAA TCCCCCAGAA GATTTCCTTA CAAGACCATC TGGACAAAGC TAAGAAAGAC ATTACATTTT ATATGCCAGT AGACAATTTG GGAATGGCTG TTATTGACTG GGAAGAATGG AGACCCACTT GGGCAAGAAA CTGGAAACCT AAAGATGTTT ACAAGAATAG GTCTATTGAA TTGGTTCAGC AACAAAATGT ACAACTTAGT CTCACAGAGG CCACTGAGAA AGCAAAACAA GAATTTGAAA AGGCAGGGAA GGATTTCCTG GTAGAGACTA TAAAATTGGG AAAATTACTT CGGCCAAATC ACTTGTGGGG TTATTATCTT TTTCCGGATT GTTACAACCA TCACTATAAG AAACCCGGTT ACAATGGAAG TTGCTTCAAT GTAGAAATAA AAAGAAATGA TGATCTCAGC TGGTTGTGGA ATGAAAGCAC TGCTCTTTAC CCATCCATTT ATTTGAACAC TCAGCAGTCT CCTGTAGCTG CTACACTCTA TGTGCGCAAT CGAGTTCGGG AAGCCATCAG AGTTTCCAAA ATACCTGATG CAAAAAGTCC ACTTCCGGTT TTTGCATATA CCCGCATAGT TTTTACTGAT CAAGTTTTGA AATTCCTTTC TCAAGATGAA CTTGTGTATA CATTTGGCGA AACTGTTGCT CTGGGTGCTT CTGGAATTGT AATATGGGGA ACCCTCAGTA TAATGCGAAG TATGAAATCT TGCTTGCTCC TAGACAATTA CATGGAGACT ATACTGAATC CTTACATAAT CAACGTCACA CTAGCAGCCA AAATGTGTAG CCAAGTGCTT TGCCAGGAGC AAGGAGTGTG TATAAGGAAA AACTGGAATT CAAGTGACTA TCTTCACCTC AACCCAGATA ATTTTGCTAT TCAACTTGAG AAAGGTGGAA AGTTCACAGT ACGTGGAAAA CCGACACTTG AAGACCTGGA GCAATTTTCT GAAAAATTTT ATTGCAGCTG TTATAGCACC TTGAGTTGTA AGGAGAAAGC TGATGTAAAA GACACTGATG CTGTTGATGT GTGTATTGCT GATGGTGTCT GTATAGATGC TTTTCTAAAA CCTCCCATGG AGACAGAAGA ACCTCAAATT TTCTACAATG CTTCACCCTC CACACTATCT TAA (서열번호 29)
HYAL1 cDNA(NM_153281)
ATGGCAGCCC ACCTGCTTCC CATCTGCGCC CTCTTCCTGA CCTTACTCGA TATGGCCCAA GGCTTTAGGG GCCCCTTGCT ACCCAACCGG CCCTTCACCA CCGTCTGGAA TGCAAACACC CAGTGGTGCC TGGAGAGGCA CGGTGTGGAC GTGGATGTCA GTGTCTTCGA TGTGGTAGCC AACCCAGGGC AGACCTTCCG CGGCCCTGAC ATGACAATTT TCTATAGCTC CCAGCTGGGC ACCTACCCCT ACTACACGCC CACTGGGGAG CCTGTGTTTG GTGGTCTGCC CCAGAATGCC AGCCTGATTG CCCACCTGGC CCGCACATTC CAGGACATCC TGGCTGCCAT ACCTGCTCCT GACTTCTCAG GGCTGGCAGT CATCGACTGG GAGGCATGGC GCCCACGCTG GGCCTTCAAC TGGGACACCA AGGACATTTA CCGGCAGCGC TCACGGGCAC TGGTACAGGC ACAGCACCCT GATTGGCCAG CTCCTCAGGT GGAGGCAGTA GCCCAGGACC AGTTCCAGGG AGCTGCACGG GCCTGGATGG CAGGCACCCT CCAGCTGGGG CGGGCACTGC GTCCTCGCGG CCTCTGGGGC TTCTATGGCT TCCCTGACTG CTACAACTAT GACTTTCTAA GCCCCAACTA CACCGGCCAG TGCCCATCAG GCATCCGTGC CCAAAATGAC CAGCTAGGGT GGCTGTGGGG CCAGAGCCGT GCCCTCTATC CCAGCATCTA CATGCCCGCA GTGCTGGAGG GCACAGGGAA GTCACAGATG TATGTGCAAC ACCGTGTGGC CGAGGCATTC CGTGTGGCTG TGGCTGCTGG TGACCCCAAT CTGCCGGTGC TGCCCTATGT CCAGATCTTC TATGACACGA CAAACCACTT TCTGCCCCTG GATGAGCTGG AGCACAGCCT GGGGGAGAGT GCGGCCCAGG GGGCAGCTGG AGTGGTGCTC TGGGTGAGCT GGGAAAATAC AAGAACCAAG GAATCATGTC AGGCCATCAA GGAGTATATG GACACTACAC TGGGGCCCTT CATCCTGAAC GTGACCAGTG GGGCCCTTCT CTGCAGTCAA GCCCTGTGCT CCGGCCATGG CCGCTGTGTC CGCCGCACCA GCCACCCCAA AGCCCTCCTC CTCCTTAACC CTGCCAGTTT CTCCATCCAG CTCACGCCTG GTGGTGGGCC CCTGAGCCTG CGGGGTGCCC TCTCACTTGA AGATCAGGCA CAGATGGCTG TGGAGTTCAA ATGTCGATGC TACCCTGGCT GGCAGGCACC GTGGTGTGAG CGGAAGAGCA TGTGGTGA (서열번호 30)
MMP는 <표 1>과 같이 분류할 수 있는데, 콜라게나제 (MMP-1, MMP-8, MMP-13 및 MMP-18) 젤라티나제 (MMP-2 및 MMP-9), 스트로멜리신 (MMP-3, MMP-10, MMP-11 및 MMP-17), matrilysins (MMP-7 및 MMP-26), 멤브레인 유형 (MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-24 및 MMP-25) 및 기타 유형 (MMP -12, MMP-19, MMP-20, MMP-21, MMP-22, MMP-28, MMP-29) 등이다.
본 발명의 MMP RNA 발현카세트의 제조를 위하여, 여러 종류의 MMP에서 선정된 MMP1 (NM_002421) 및 MMP9 (NM_004994)의 염기서열은 아래와 같다.
MMP1 cDNA(NM_002421)
ATGCACAGCT TTCCTCCACT GCTGCTGCTG CTGTTCTGGG GTGTGGTGTC TCACAGCTTC CCAGCGACTC TAGAAACACA AGAGCAAGAT GTGGACTTAG TCCAGAAATA CCTGGAAAAA TACTACAACC TGAAGAATGA TGGGAGGCAA GTTGAAAAGC GGAGAAATAG TGGCCCAGTG GTTGAAAAAT TGAAGCAAAT GCAGGAATTC TTTGGGCTGA AAGTGACTGG GAAACCAGAT GCTGAAACCC TGAAGGTGAT GAAGCAGCCC AGATGTGGAG TGCCTGATGT GGCTCAGTTT GTCCTCACTG AGGGGAACCC TCGCTGGGAG CAAACACATC TGACCTACAG GATTGAAAAT TACACGCCAG ATTTGCCAAG AGCAGATGTG GACCATGCCA TTGAGAAAGC CTTCCAACTC TGGAGTAATG TCACACCTCT GACATTCACC AAGGTCTCTG AGGGTCAAGC AGACATCATG ATATCTTTTG TCAGGGGAGA TCATCGGGAC AACTCTCCTT TTGATGGACC TGGAGGAAAT CTTGCTCATG CTTTTCAACC AGGCCCAGGT ATTGGAGGGG ATGCTCATTT TGATGAAGAT GAAAGGTGGA CCAACAATTT CAGAGAGTAC AACTTACATC GTGTTGCGGC TCATGAACTC GGCCATTCTC TTGGACTCTC CCATTCTACT GATATCGGGG CTTTGATGTA CCCTAGCTAC ACCTTCAGTG GTGATGTTCA GCTAGCTCAG GATGACATTG ATGGCATCCA AGCCATATAT GGACGTTCCC AAAATCCTGT CCAGCCCATC GGCCCACAAA CCCCAAAAGC GTGTGACAGT AAGCTAACCT TTGATGCTAT AACTACGATT CGGGGAGAAG TGATGTTCTT TAAAGACAGA TTCTACATGC GCACAAATCC CTTCTACCCG GAAGTTGAGC TCAATTTCAT TTCTGTTTTC TGGCCACAAC TGCCAAATGG GCTTGAAGCT GCTTACGAAT TTGCCGACAG AGATGAAGTC CGGTTTTTCA AAGGGAATAA GTACTGGGCT GTTCAGGGAC AGAATGTGCT ACACGGATAC CCCAAGGACA TCTACAGCTC CTTTGGCTTC CCTAGAACTG TGAAGCATAT CGATGCTGCT CTTTCTGAGG AAAACACTGG AAAAACCTAC TTCTTTGTTG CTAACAAATA CTGGAGGTAT GATGAATATA AACGATCTAT GGATCCAGGT TATCCCAAAA TGATAGCACA TGACTTTCCT GGAATTGGCC ACAAAGTTGA TGCAGTTTTC ATGAAAGATG GATTTTTCTA TTTCTTTCAT GGAACAAGAC AATACAAATT TGATCCTAAA ACGAAGAGAA TTTTGACTCT CCAGAAAGCT AATAGCTGGT TCAACTGCAG GAAAAATTGA (서열번호 31)
MMP9 cDNA(NM_004994)
ATGAGCCTCT GGCAGCCCCT GGTCCTGGTG CTCCTGGTGC TGGGCTGCTG CTTTGCTGCC CCCAGACAGC GCCAGTCCAC CCTTGTGCTC TTCCCTGGAG ACCTGAGAAC CAATCTCACC GACAGGCAGC TGGCAGAGGA ATACCTGTAC CGCTATGGTT ACACTCGGGT GGCAGAGATG CGTGGAGAGT CGAAATCTCT GGGGCCTGCG CTGCTGCTTC TCCAGAAGCA ACTGTCCCTG CCCGAGACCG GTGAGCTGGA TAGCGCCACG CTGAAGGCCA TGCGAACCCC ACGGTGCGGG GTCCCAGACC TGGGCAGATT CCAAACCTTT GAGGGCGACC TCAAGTGGCA CCACCACAAC ATCACCTATT GGATCCAAAA CTACTCGGAA GACTTGCCGC GGGCGGTGAT TGACGACGCC TTTGCCCGCG CCTTCGCACT GTGGAGCGCG GTGACGCCGC TCACCTTCAC TCGCGTGTAC AGCCGGGACG CAGACATCGT CATCCAGTTT GGTGTCGCGG AGCACGGAGA CGGGTATCCC TTCGACGGGA AGGACGGGCT CCTGGCACAC GCCTTTCCTC CTGGCCCCGG CATTCAGGGA GACGCCCATT TCGACGATGA CGAGTTGTGG TCCCTGGGCA AGGGCGTCGT GGTTCCAACT CGGTTTGGAA ACGCAGATGG CGCGGCCTGC CACTTCCCCT TCATCTTCGA GGGCCGCTCC TACTCTGCCT GCACCACCGA CGGTCGCTCC GACGGCTTGC CCTGGTGCAG TACCACGGCC AACTACGACA CCGACGACCG GTTTGGCTTC TGCCCCAGCG AGAGACTCTA CACCCGGGAC GGCAATGCTG ATGGGAAACC CTGCCAGTTT CCATTCATCT TCCAAGGCCA ATCCTACTCC GCCTGCACCA CGGACGGTCG CTCCGACGGC TACCGCTGGT GCGCCACCAC CGCCAACTAC GACCGGGACA AGCTCTTCGG CTTCTGCCCG ACCCGAGCTG ACTCGACGGT GATGGGGGGC AACTCGGCGG GGGAGCTGTG CGTCTTCCCC TTCACTTTCC TGGGTAAGGA GTACTCGACC TGTACCAGCG AGGGCCGCGG AGATGGGCGC CTCTGGTGCG CTACCACCTC GAACTTTGAC AGCGACAAGA AGTGGGGCTT CTGCCCGGAC CAAGGATACA GTTTGTTCCT CGTGGCGGCG CATGAGTTCG GCCACGCGCT GGGCTTAGAT CATTCCTCAG TGCCGGAGGC GCTCATGTAC CCTATGTACC GCTTCACTGA GGGGCCCCCC TTGCATAAGG ACGACGTGAA TGGCATCCGG CACCTCTATG GTCCTCGCCC TGAACCTGAG CCACGGCCTC CAACCACCAC CACACCGCAG CCCACGGCTC CCCCGACGGT CTGCCCCACC GGACCCCCCA CTGTCCACCC CTCAGAGCGC CCCACAGCTG GCCCCACAGG TCCCCCCTCA GCTGGCCCCA CAGGTCCCCC CACTGCTGGC CCTTCTACGG CCACTACTGT GCCTTTGAGT CCGGTGGACG ATGCCTGCAA CGTGAACATC TTCGACGCCA TCGCGGAGAT TGGGAACCAG CTGTATTTGT TCAAGGATGG GAAGTACTGG CGATTCTCTG AGGGCAGGGG GAGCCGGCCG CAGGGCCCCT TCCTTATCGC CGACAAGTGG CCCGCGCTGC CCCGCAAGCT GGACTCGGTC TTTGAGGAGC CGCTCTCCAA GAAGCTTTTC TTCTTCTCTG GGCGCCAGGT GTGGGTGTAC ACAGGCGCGT CGGTGCTGGG CCCGAGGCGT CTGGACAAGC TGGGCCTGGG AGCCGACGTG GCCCAGGTGA CCGGGGCCCT CCGGAGTGGC AGGGGGAAGA TGCTGCTGTT CAGCGGGCGG CGCCTCTGGA GGTTCGACGT GAAGGCGCAG ATGGTGGATC CCCGGAGCGC CAGCGAGGTG GACCGGATGT TCCCCGGGGT GCCTTTGGAC ACGCACGACG TCTTCCAGTA CCGAGAGAAA GCCTATTTCT GCCAGGACCG CTTCTACCGG CGCGTGAGTT CCCGGAGTGA GTTGAACCAG GTGGACCAAG TGGGCTACGT GACCTATGAC ATCCTGCAGT GCCCTGAGGA CTGA (서열번호 32)
<세포외기질 분해 효소의 저해물질: TIMP>
금속 단백 분해효소(MP)의 조직 억제제 (TIMP), TIMP-1, 2, 3 및 4 계열의 네 가지 구성원은 원래 분비된 금속 단백 분해효소 (MP)의 내인성 억제제이다.
본 발명의 TIMP RNA 발현카세트의 제조를 위하여, TIMP1 (NM_003254), TIMP2 (NM_003255), TIMP3 (NM_000362)및 TIMP4 (NM_003256)의 염기서열은 다음과 같다.
TIMP1 cDNA(NM_003254)
ATGGCCCCCT TTGAGCCCCT GGCTTCTGGC ATCCTGTTGT TGCTGTGGCT GATAGCCCCC AGCAGGGCCT GCACCTGTGT CCCACCCCAC CCACAGACGG CCTTCTGCAA TTCCGACCTC GTCATCAGGG CCAAGTTCGT GGGGACACCA GAAGTCAACC AGACCACCTT ATACCAGCGT TATGAGATCA AGATGACCAA GATGTATAAA GGGTTCCAAG CCTTAGGGGA TGCCGCTGAC ATCCGGTTCG TCTACACCCC CGCCATGGAG AGTGTCTGCG GATACTTCCA CAGGTCCCAC AACCGCAGCG AGGAGTTTCT CATTGCTGGA AAACTGCAGG ATGGACTCTT GCACATCACT ACCTGCAGTT TCGTGGCTCC CTGGAACAGC CTGAGCTTAG CTCAGCGCCG GGGCTTCACC AAGACCTACA CTGTTGGCTG TGAGGAATGC ACAGTGTTTC CCTGTTTATC CATCCCCTGC AAACTGCAGA GTGGCACTCA TTGCTTGTGG ACGGACCAGC TCCTCCAAGG CTCTGAAAAG GGCTTCCAGT CCCGTCACCT TGCCTGCCTG CCTCGGGAGC CAGGGCTGTG CACCTGGCAG TCCCTGCGGT CCCAGATAGC CTGA (서열번호 33)
TIMP2 cDNA(NM_003255)
ATGGGCGCCG CGGCCCGCAC CCTGCGGCTG GCGCTCGGCC TCCTGCTGCT GGCGACGCTG CTTCGCCCGG CCGACGCCTG CAGCTGCTCC CCGGTGCACC CGCAACAGGC GTTTTGCAAT GCAGATGTAG TGATCAGGGC CAAAGCGGTC AGTGAGAAGG AAGTGGACTC TGGAAACGAC ATTTATGGCA ACCCTATCAA GAGGATCCAG TATGAGATCA AGCAGATAAA GATGTTCAAA GGGCCTGAGA AGGATATAGA GTTTATCTAC ACGGCCCCCT CCTCGGCAGT GTGTGGGGTC TCGCTGGACG TTGGAGGAAA GAAGGAATAT CTCATTGCAG GAAAGGCCGA GGGGGACGGC AAGATGCACA TCACCCTCTG TGACTTCATC GTGCCCTGGG ACACCCTGAG CACCACCCAG AAGAAGAGCC TGAACCACAG GTACCAGATG GGCTGCGAGT GCAAGATCAC GCGCTGCCCC ATGATCCCGT GCTACATCTC CTCCCCGGAC GAGTGCCTCT GGATGGACTG GGTCACAGAG AAGAACATCA ACGGGCACCA GGCCAAGTTC TTCGCCTGCA TCAAGAGAAG TGACGGCTCC TGTGCGTGGT ACCGCGGCGC GGCGCCCCCC AAGCAGGAGT TTCTCGACAT CGAGGACCCA TGA(서열번호 34)
TIMP3 cDNA(NM_000362)
ATGACCCCTT GGCTCGGGCT CATCGTGCTC CTGGGCAGCT GGAGCCTGGG GGACTGGGGC GCCGAGGCGT GCACATGCTC GCCCAGCCAC CCCCAGGACG CCTTCTGCAA CTCCGACATC GTGATCCGGG CCAAGGTGGT GGGGAAGAAG CTGGTAAAGG AGGGGCCCTT CGGCACGCTG GTCTACACCA TCAAGCAGAT GAAGATGTAC CGAGGCTTCA CCAAGATGCC CCATGTGCAG TACATCCATA CGGAAGCTTC CGAGAGTCTC TGTGGCCTTA AGCTGGAGGT CAACAAGTAC CAGTACCTGC TGACAGGTCG CGTCTATGAT GGCAAGATGT ACACGGGGCT GTGCAACTTC GTGGAGAGGT GGGACCAGCT CACCCTCTCC CAGCGCAAGG GGCTGAACTA TCGGTATCAC CTGGGTTGTA ACTGCAAGAT CAAGTCCTGC TACTACCTGC CTTGCTTTGT GACTTCCAAG AACGAGTGTC TCTGGACCGA CATGCTCTCC AATTTCGGTT ACCCTGGCTA CCAGTCCAAA CACTACGCCT GCATCCGGCA GAAGGGCGGC TACTGCAGCT GGTACCGAGG ATGGGCCCCC CCGGATAAAA GCATCATCAA TGCCACAGAC CCCTGA (서열번호 35)
TIMP4 cDNA(NM_003256)
ATGCCTGGGA GCCCTCGGCC CGCGCCAAGC TGGGTGCTGT TGCTGCGGCT GCTGGCGTTG CTGCGGCCCC CGGGGCTGGG TGAGGCATGC AGCTGCGCCC CGGCGCACCC TCAGCAGCAC ATCTGCCACT CGGCACTTGT GATTCGGGCC AAAATCTCCA GTGAGAAGGT AGTTCCGGCC AGTGCAGACC CTGCTGACAC TGAAAAAATG CTCCGGTATG AAATCAAACA GATAAAGATG TTCAAAGGGT TTGAGAAAGT CAAGGATGTT CAGTATATCT ATACGCCTTT TGACTCTTCC CTCTGTGGTG TGAAACTAGA AGCCAACAGC CAGAAGCAGT ATCTCTTGAC TGGTCAGGTC CTCAGTGATG GAAAAGTCTT CATCCATCTG TGCAACTACA TCGAGCCCTG GGAGGACCTG TCCTTGGTGC AGAGGGAAAG TCTGAATCAT CACTACCATC TGAACTGTGG CTGCCAAATC ACCACCTGCT ACACAGTACC CTGTACCATC TCGGCCCCTA ACGAGTGCCT CTGGACAGAC TGGCTGTTGG AACGAAAGCT CTATGGTTAC CAGGCTCAGC ATTATGTCTG TATGAAGCAT GTTGACGGCA CCTGCAGCTG GTACCGGGGC CACCTGCCTC TCAGGAAGGA GTTTGTTGAC ATCGTTCAGC CCTGA (서열번호 36)
<백신 접종 단백질>
광견병 바이러스의 G 단백질(RAV-G)
본 발명의 RAV-G RNA 발현카세트의 제조를 위하여, 광견병 바이러스의 G 단백질(RAV-G)의 염기서열은 다음과 같다.
RAV-G cDNA
ATGGT GCCCCAGGCC CTGCTCTTCG TCCCGCTGCT GGTGTTCCCC CTCTGCTTCG GCAAGTTCCC CATCTACACC ATCCCCGACA AGCTGGGGCC GTGGAGCCCC ATCGACATCC ACCACCTGTC CTGCCCCAAC AACCTCGTGG TCGAGGACGA GGGCTGCACC AACCTGAGCG GGTTCTCCTA CATGGAGCTG AAGGTGGGCT ACATCAGCGC CATCAAGATG AACGGGTTCA CGTGCACCGG CGTGGTCACC GAGGCGGAGA CCTACACGAA CTTCGTGGGC TACGTGACCA CCACCTTCAA GCGGAAGCAC TTCCGCCCCA CGCCGGACGC CTGCCGGGCC GCCTACAACT GGAAGATGGC CGGGGACCCC CGCTACGAGG AGTCCCTCCA CAACCCCTAC CCCGACTACC ACTGGCTGCG GACCGTCAAG ACCACCAAGG AGAGCCTGGT GATCATCTCC CCGAGCGTGG CGGACCTCGA CCCCTACGAC CGCTCCCTGC ACAGCCGGGT CTTCCCCGGC GGGAACTGCT CCGGCGTGGC CGTGAGCTCC ACGTACTGCA GCACCAACCA CGACTACACC ATCTGGATGC CCGAGAACCC GCGCCTGGGG ATGTCCTGCG ACATCTTCAC CAACAGCCGG GGCAAGCGCG CCTCCAAGGG CAGCGAGACG TGCGGGTTCG TCGACGAGCG GGGCCTCTAC AAGTCCCTGA AGGGGGCCTG CAAGCTGAAG CTCTGCGGCG TGCTGGGCCT GCGCCTCATG GACGGGACCT GGGTGGCGAT GCAGACCAGC AACGAGACCA AGTGGTGCCC CCCCGGCCAG CTGGTCAACC TGCACGACTT CCGGAGCGAC GAGATCGAGC ACCTCGTGGT GGAGGAGCTG GTCAAGAAGC GCGAGGAGTG CCTGGACGCC CTCGAGTCCA TCATGACGAC CAAGAGCGTG TCCTTCCGGC GCCTGAGCCA CCTGCGGAAG CTCGTGCCCG GGTTCGGCAA GGCCTACACC ATCTTCAACA AGACCCTGAT GGAGGCCGAC GCCCACTACA AGTCCGTCCG CACGTGGAAC GAGATCATCC CGAGCAAGGG GTGCCTGCGG GTGGGCGGCC GCTGCCACCC CCACGTCAAC GGGGTGTTCT TCAACGGCAT CATCCTCGGG CCCGACGGCA ACGTGCTGAT CCCCGAGATG CAGTCCAGCC TGCTCCAGCA GCACATGGAG CTGCTGGTCT CCAGCGTGAT CCCGCTCATG CACCCCCTGG CGGACCCCTC CACCGTGTTC AAGAACGGGG ACGAGGCCGA GGACTTCGTC GAGGTGCACC TGCCCGACGT GCACGAGCGG ATCAGCGGCG TCGACCTCGG CCTGCCGAAC TGGGGGAAGT ACGTGCTGCT CTCCGCCGGC GCCCTGACCG CCCTGATGCT GATCATCTTC CTCATGACCT GCTGGCGCCG GGTGAACCGG AGCGAGCCCA CGCAGCACAA CCTGCGCGGG ACCGGCCGGG AGGTCTCCGT GACCCCGCAG AGCGGGAAGA TCATCTCCAG CTGGGAGTCC TACAAGAGCG GCGGCGAGAC CGGGCTGTGA GGACTAGTTA TAAGACTGAC TATGA (서열번호 37)
RSV 롱(long) 균주의 RSV-F 단백질
본 발명의 RSV-F RNA 발현카세트의 제조를 위하여, 호흡기세포융합바이러스 (Ripiratory SynCytial Virus, RSV) 롱(long) 균주의 RSV-F 단백질의 염기서열은 다음과 같다.
RSV-F long(GC) cDNA
ATGGAGC TGCCCATCCT CAAGGCCAAC GCCATCACCA CCATCCTGGC GGCCGTGACG TTCTGCTTCG CCAGCTCCCA GAACATCACC GAGGAGTTCT ACCAGAGCAC CTGCTCCGCC GTCAGCAAGG GCTACCTGTC CGCCCTCCGG ACCGGGTGGT ACACGAGCGT GATCACCATC GAGCTGTCCA ACATCAAGGA GAACAAGTGC AACGGCACCG ACGCGAAGGT GAAGCTGATC AACCAGGAGC TCGACAAGTA CAAGAACGCC GTCACCGAGC TGCAGCTGCT CATGCAGAGC ACGACCGCCG CCAACAACCG CGCGCGGCGC GAGCTGCCGC GGTTCATGAA CTACACCCTG AACAACACCA AGAAGACGAA CGTGACCCTC TCCAAGAAGC GCAAGCGGCG CTTCCTGGGG TTCCTGCTCG GCGTGGGGAG CGCCATCGCC TCCGGCATCG CCGTCAGCAA GGTGCTGCAC CTGGAGGGCG AGGTGAACAA GATCAAGTCC GCCCTCCTGA GCACCAACAA GGCGGTCGTG TCCCTGAGCA ACGGGGTGTC CGTCCTCACC AGCAAGGTGC TGGACCTGAA GAACTACATC GACAAGCAGC TCCTGCCCAT CGTGAACAAG CAGTCCTGCC GGATCAGCAA CATCGAGACG GTCATCGAGT TCCAGCAGAA GAACAACCGC CTGCTCGAGA TCACCCGGGA GTTCAGCGTG AACGCCGGCG TGACCACCCC CGTCTCCACG TACATGCTGA CCAACAGCGA GCTGCTCTCC CTGATCAACG ACATGCCCAT CACCAACGAC CAGAAGAAGC TGATGAGCAA CAACGTGCAG ATCGTGCGCC AGCAGTCCTA CAGCATCATG TCCATCATCA AGGAGGAGGT CCTCGCCTAC GTGGTGCAGC TGCCGCTGTA CGGGGTCATC GACACCCCCT GCTGGAAGCT CCACACGAGC CCCCTGTGCA CCACCAACAC CAAGGAGGGC TCCAACATCT GCCTGACGCG GACCGACCGC GGGTGGTACT GCGACAACGC CGGCAGCGTG TCCTTCTTCC CCCAGGCCGA GACCTGCAAG GTCCAGAGCA ACCGGGTGTT CTGCGACACC ATGAACTCCC TCACGCTGCC GAGCGAGGTG AACCTGTGCA ACGTCGACAT CTTCAACCCC AAGTACGACT GCAAGATCAT GACCTCCAAG ACCGACGTGA GCTCCAGCGT GATCACCTCC CTCGGCGCGA TCGTCAGCTG CTACGGGAAG ACGAAGTGCA CCGCCAGCAA CAAGAACCGC GGCATCATCA AGACCTTCTC CAACGGGTGC GACTACGTGA GCAACAAGGG CGTGGACACC GTCTCCGTGG GCAACACCCT GTACTACGTG AACAAGCAGG AGGGGAAGAG CCTGTACGTC AAGGGCGAGC CCATCATCAA CTTCTACGAC CCCCTCGTGT TCCCGTCCGA CGAGTTCGAC GCCAGCATCT CCCAGGTGAA CGAGAAGATC AACCAGAGCC TGGCCTTCAT CCGGAAGTCC GACGAGCTGC TGCACCACGT CAACGCCGGG AAGAGCACGA CCAACATCAT GATCACCACC ATCATCATCG TGATCATCGT GATCCTCCTG TCCCTGATCG CGGTCGGCCT CCTGCTGTAC TGCAAGGCCC GCAGCACGCC CGTGACCCTC TCCAAGGACC AGCTGA (서열번호 38)
1.2. 표적단백질 RNA 발현카세트의 제조
본 발명에서 사용되는 표적단백질 RNA 발현카세트의 표적단백질은 치료용 단백질(sTNFR2, EPO, G-CSF), 세포외기질 분해 효소(HYAL 1, Hyaluronidase PH20, MMP1, MMP 8, MMP 13), 세포외기질 분해 효소의 저해물질(TIMP 1, TIMP 2, TIMP 3 및 TIMP 4) 및 백신 접종용 목적 단백질(RAV-G 및 RSV-F 단백질)을 코딩하는 ORF를 포함하며 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 표적단백질 DNA 절편은 <T7 promoter - 5'UTR - 표적단백질 ORF DNA - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL> 순서로 합성하였으며(TriLink Biotenologies 사, 미국), 이를 주형으로 정방향 플라이머 5'-GAATTCTAAT ACGACTCACT ATAGGGGAGA CCACAACGGT TTCCCTCTAG AAAGAACCAT GAACACGATT AACA-3' (서열번호 39) 및 역방향 프라이머 5'-GGATCCTGGTG GCTCTAAAA GAGCCTTTGG-3' (서열번호 40)을 사용하여 증폭하였다. 여기서 T7pol의 표적 서열에 밑줄이 그어져 있다. 사용된 프라이머의 양 말단은 ECoRI/BamHI 인식서열이 포함되어 있다.
증폭된 PCR 산물을 EcoRI/BamHI 효소를 사용하여 절단한 다음, EcoRI/BamHI 효소로 선형화된 pUC19 벡터와 T4 DNA ligase를 이용하여 클로닝하였다. 상기 반응용액을 대장균에 형질전환하고 선정된 균주에서 플라스미드를 분리하여 ECoRI/BamHI 제한효소를 처리한 후 전기영동을 하였다(도 3).
본 발명에서는 캡된 화학적 변형이 있는 뉴클레오타이드를 포함하는 표적단백질 ORF으로 이루어진 RNA 발현카세트를 아래와 같이 제작하였다.
캡된 표적단백질 mRNA을 합성하기 위하여, 먼저 <T7 promoter - 5'UTR - 표적단백질 ORF DNA - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL>을 가지는 DNA가 삽인된 pUC19 벡터를 주형으로 정방향 프라이머 서열번호 20 및 역방향 프라이머 서열번호 21을 사용하여 증폭하였다. 여기서 T7pol의 표적 서열에 밑줄이 그어져 있다. 상기 PCR 산물을 주형으로 체외전사하였다(도 4).
상기 PCR 산물, T7 promoter-표적단백질 DNA를 주형으로 HighYield T7 ARCA mRNA Synthesis Kit (m5CTP/Ψ-UTP) (Jena BioSCienCe, 미국)를 이용하여 캡된 표적단백질 변형 mRNA를 포함하는 발현카세트를 시험관 내에서 합성하였다.
구체적으로 살펴보면, anti-reverse Cap analog [(ARCA) (3′-O-Me-7mG(5′)ppp(5′)G Cap analog라고도 부름)] 및 화학적 변형된 뉴클레오타이드 포함하는 반응용액 (6 mM ARCA, 1.5 mM GTP, 7.5 mM 5-Methyl-CTP, 7.5 mM Pseudo-UTP, 7.5 mM ATP)에서 체외전사를 실시하였다. dsDNA 주형을를 제거하기 위해서 DNA nuClease를 첨가하였고, 남아있는 캡된 표적단백질 변형 mRNA는 에탄올 침전법 또는 spin Column membrane을 이용하여 정제하였다.
대조군으로 T7 promoter-표적단백질 DNA 주형에서 얻은 RNA 전사체에 5′Cap 구조를 부가한 캡된 표적단백질 mRNA 합성은 Hiscribe™ T7 ARCA mRNA Kit(NEB, 미국)를 이용하여 실시하였는데, 천연 캡(m7G(5')ppp(5')G; m7GpppG)을 부가하여 제조하였다.
콜레스테롤의 부가 및 안정성
본 발명의 oligo-chol은 상기 RNA 발현카세트의 3'말단의 20개의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드와 cholesterol(chol)이 접합된 구조체로 제조하였다(바이오니아, 한국).
상기 항에서 제조한 캡된 RNA 발현카세트 또는 캡된 변형 RNA 발현카세트와 하기 제조된 oligo-chol을 혼성화하여 RNA 발현카세트(RNA)와 oligo-chol이 상보적인 결합을 한 RNA-oligo-chol 발현카세트 hybrid를 제조하였다.
여러 종류의 RNA 발현카세트 15 pmole과 oligo-chol 15 pmole을 섞어 총 5 ul가 되도록 nuclease free water를 넣어준 뒤 95℃에서 5분간 가열한 후 25℃에서 1시간 동안 혼성화하였다. 혼성화 비율은 RNA 발현카세트와 oligo-chol의 몰 비율로 1:1, 1:5, 1:10으로 하고 2% agarose gel로 retardation assay를 통해 확인한 결과 1:1로 혼성화하였을 때 단일밴드로 확인되었다.
상기 제조한 다양한 RNA-발현카세트와 oligo-chol로 제조한 hybrid의 혈청에서 안정성을 조사하였는데, 혈청 용액에 제조한 다양한 RNA-oligo-chol 발현카세트를 처리하여 시간별 시료를 채취하여 남아있는 hybrid를 분석하였다.
<도 5>에서 제시한 결과처럼, 상기 제조한 캡된 RNA 발현카세트, 캡된 변형 RNA 발현카세트 및 3말단에 cholesterol이 부가된 캡된 변형 RNA 발현카세트를 세포 배양액에 다양한 시간 동안 처리한 후 RT-PCR하여 in vitro 안정성을 확인하였다.
상기 제조한 캡된 변형 RNA 발현카세트는 캡된 RNA 발현카세트보다 in vitro 안전성이 매우 우수하였으며, 3'말단에 cholesterol이 부가된 캡된 변형 RNA-oligo-chol 발현카세트 접합체가 가장 안정성이 높았다.
영상소재의 부가
상기 제조된 Rhodamine Labelled Oligo 및 FITC Labelled Oligo를 주문 제조하고(Trilink Biotechnologies 사, 미국), 상기 제조된 RNA 발현카세트와 형광소재 표지된 올리고는 일정한 비율(W/W, 1:1~0.1)로 혼합하여 Rhodamine B 또는 FITC가 있는 복합입자의 제조에 사용할 수 있다.
실시예 2. 기본 복합입자
본 발명에서 사용되는 RNA 발현카세트의 표적단백질은 치료용 단백질(sTNFR2, EPO, G-CSF), 세포외기질 분해 효소(HYAL 1, Hyaluronidase PH20, MMP1, MMP 8, MMP 13), 세포외기질 분해 효소의 저해물질(TIMP 1, TIMP 2, TIMP 3 및 TIMP 4) 및 백신 접종용 목적 단백질(RAV-G 및 RSV-F 단백질)을 코딩하는 ORF를 포함하며 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 선택된 RNA 발현카세트와 양이온성 화합물을 혼합하여 자기조립으로 제조되는 입자를 기본 복합입자(10)라고 지칭하였다.
본 발명에서 하기 RNA 발현카세트/PS(Protamine) 기본 복합입자 1.0 및 RNA 발현카세트/PS/양이온성 지질 기본 복합입자 2.0을 포함하여 이들을 “기본 복합입자”라고 지칭하였다.
본 발명의 기본 복합입자 또는 복합입자의 제조는 음이온성 핵산, 양이온성 화합물 및 음이온성 화합물에 선택된 두 종류 물질을 반응용액 내에서 30초간 연속적으로 와동(vortexing)하면서 혼합하고 형성된 복합체 용액에 앞 단계에서 처리하지 못한 나머지 물질을 첨가하여 30초간 연속적으로 와동하여 반응이 끝난 후, 상온에서 1시간 동안 안정화시키는 제1 방법; 음이온성 핵산, 양이온성 화합물 및 음이온성 화합물에 선택된 두 종류 물질을 반응용액 내에서 가열없이 얼음 팩 위에서 1시간 동안 초음파 처리하면서 혼합하고 형성된 복합체 용액에 앞 단계에서 처리하지 못한 나머지 물질을 첨가하여 가열없이 얼음 팩 위에서 1시간 동안 추가적으로 초음파 처리하여 반응이 끝난 후, 상온에서 1시간 동안 안정화시키는 제2 방법; 및, 음이온성 핵산, 양이온성 화합물 및 음이온성 화합물에 선택된 두 종류 물질을 반응용액 내에서 가열없이 얼음 팩 위에서 1시간 동안 초음파 처리하면서 혼합하고 형성된 복합체용액에 앞 단계에서 처리하지 못한 나머지 물질을 첨가하여 가열없이 얼음 팩 위에서 1시간 동안 초음파 처리하여 반응이 끝난 후, 상온에서 1시간 동안 안정화시키고 Nano membrane Liposome Extruder (Avestin InC, 캐나다)를 이용하여 300 nm에서 200 nm 막 필터에서 각 막당 왕복 10회씩 처리하고 상온에서 1시간 동안 안정화시키는 제3 방법;을 포함하는 방법에서 선택된 이상적인 어느 한 방법을 사용하였다.
본 발명에서 입자의 정제는 입자가 포함된 버퍼에 100% EtOH를 첨가하여 70% EtOH이 되도록 하고 4’C에서 5분간 원심분리한 후 70% EtOH로 2회 세척하며 원심분리 4’C에서 5분간 원심분리한 후 멸균증류수 또는 등장액을 첨가하는 제4 방법; 20 μL isopropanol 첨가 후 태핑하고 -20’C에서 15분간 처리한 후 4’C에서 5분간 원심분리하며, 70% EtOH로 2회 세척한 후, 침전물을 말린 후 멸균증류수 또는 등장액을 첨가하는 제5 방법; 그리고 2.5X 양의 100% EtOH, 3M sodium acetate 첨가하고 태핑한 후 -20’C에서 15분간 처리하며 4℃에서 5분간 원심분히하고 70% EtOH로 2회 세척한 후 침전물을 말린 후 멸균증류수 또는 등장액을 첨가하는 제6 방법;을 포함하는 방법에서 선택된 이상적인 어느 한 방법을 사용하였다.
본 발명에서 약물 방출 분석 방법은 입자에 FBS 첨가하여 최종 50% FBS 농도의 반응액 제조하고 37˚C, CO2incubator에서 시간대별 반응한 후, 원심분리하여 상징액을 Gel retardation 분석법으로 분석하였다.
본 발명에서 동결건조는 입자 용액을 -70℃에서 O/N 동안 처리하고 동결건조기를 미리 가동하여 압력과 온도를 최대치까지 가동한 후, 상기 처리된 입자(고체)를 동결건조기에 연결하여 동결건조를 진행하였다. 동결건조 시간은 양에 따라 결정하였으며 1시간/100 μL으로 하였다. 동결건조가 완료된 시료는 진공상태를 유지한 채 동결건조기에서 분리된 용기를 사용하여 상온 보관하는 방법을 사용하였다.
2.1. 기본 복합입자 1.0의 제조
멸균 증류수(DW), PBS 완충액 (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1.8 mM; pH 7.4) 또는 페놀 레드가 없는 RPMI 1640 세포 배지를 사용하여 RNA 발현카세트 및 PS를 각각 2.5mg/mL 스톡 용액으로 준비하였다.
상기 선택된 RNA 발현카세트는 n개의 뉴클레오티드을 포함하고 있어 분자당 n-1개의 음전하이고 또는 1 몰당 1.8 × 1025 음전하이다. 상기 PS 분자량이 5.8 kDa이고 염기성 아미노산, 특히 아르기닌 (70~80 %)이 풍부하여 몰당 양이온이 1.26 × 1025이다. PS는 RNA 발현카세트 인산염 그룹의 음전하를 중성화시킨다. 따라서, 이론적으로는 상기 선택된 RNA 발현카세트와 PS의 전하 비율(Charge ratio)이 1:0.4 이상, 즉 RNA 발현카세트는 1이고 PS가 0.4이상으로 RNA 발현카세트 기본 입자를 제조할 수 있다.
양이온성 PS를 음이온성 RNA 발현카세트 용액에 첨가하며 PS와 RNA 발현카세트 사이의 상호작용이 일어났으며 PS와 RNA 발현카세트의 혼합물도 자발적으로 입자를 형성할 수 있다.
본 발명의 RNA 발현카세트 기반 기본 복합입자는 상기 RNA 발현카세트와 PS(Protamine) (㎍/mL)의 중량비는 30:15~150, 바람직하게는 30:15~90, 더욱 바람직하게는 30:75 조건으로 멸균증류수(DW) 또는 등장액(CM)에서 RNA 발현카세트/PS 입자로 이루어진 기본 복합입자를 제조하였다.
본 발명에서 HSA 및 PS로 구성된 수용액에 RNA 발현카세트를 첨가하여 입자를 제조하였으며, 이를 RNA 발현카세트/PS 기본 복합입자 1.1 또는 기본 복합입자 1.1이라고 지칭하였다.
그런 다음, 반응물을 상온에서 1시간 동안 안정화하고 동결건조하여 제조한 RNA 발현카세트/PS 기본 복합입자 1.1을 수득하였다.
본 발명에서 RNA 발현카세트/PS 기본 복합입자 1.0에서 PS 대신에 PS-TCA, CS 또는 CS-TCA를 사용할 수 있으며 이들로부터 형성된 기본 복합입자를 “기본 복합입자 1.0”이라고 총칭하였으며, 이를 세부하여 PS를 사용한 기본 복합입자는 기본 복합입자 1.1, PS-TCA를 사용하면 1.1, CS는 1.3 및 CS-TCA는 1.4라고 하였다.
PS-TCA 또는 CS-TCA의 제조는 본 발명자의 출원 특허 (대한민국 특허 출원:10-2019-0007873)를 참조하였다.
상기 결과들은 선택된 RNA 발현카세트에만 한정된 것이 아니라 다른 핵산에도 일반적으로 관찰되었다.
입자는 Phoenix RS-VA10 Vortexer (Phoenix Instrument,독일) (10 초, 25W) 및 SpeedMixerTM DAC 150.1 CM 41 (HausChild & Co KG, 독일) (5 분, 3000rpm)을 사용할 수도 있다.
2.2. 기본 복합입자 1.0의 평가
PS가 기본 복합입자 1.0의 크기에 미치는 영향
실시예 2.1항에서 제조된 기본 복합입자 1.1의 크기는 Malvern Zetasizer 3000 HSA(Herrenberg, 독일)로 광자 상관 분광법(Photon Correlation Spectroscopy, PCS)으로 결정하였다. 기본 복합입자 1.1의 크기는 평균 유체 역학적 직경(mean hydrodynamic diameter, dh)으로, 크기 분포의 폭은 다분산 지수(polydispersity index, PDI)로 표현하였다. 기본 복합입자 1.0의 크기 분포 계산을 위한 소프트웨어 데이터 분석은 비음수 제한 최소 제곱의 피팅 방법(Fitting method of non-negative constrained least-squares, NNLS)을 기반으로 하였다. 측정은 구성성분을 첨가한 혼합물의 배양 1시간 후 수행하였다.
본 발명의 연구결과에 따르면, Malvern Zetasizer 3000 HSA (Malvern Panalytical technologies, 독일)로 측정한 PCS 결과, 첫 단계에서 RNA 발현카세트와 PS의 초기 복합입자가 형성되었고 강한 양으로 하전된 PS을 추가로 첨가하면 RNA 발현카세트/PS 입자는 자기조립으로 형성하였다.
도 6을 살펴보면, 상기 기본 복합입자 1.1-DW 시료는 RNA 발현카세트:PS(㎍/ml) 비율이 30:15에서 매우 큰 입자이고 큰 크기 분포(PDI >0.2)가 관찰되었다. RNA 발현카세트:PS 비율이 약 30:45 질량비 이상에서부터 PS 농도를 증가시킴으로써 기본 복합입자 형성이 관찰되었다. 작은 크기 분포를 갖고 가장 적절한 크기로 안정된 복합입자는 RNA 발현카세트:PS (㎍/ml) 비율이 30:60 질량비보다 높은 PS 농도에서 제조할 수 있다.
도 6을 살펴보면, 기본 복합입자 1.1-CM 시료는 낮은 PS 농도에서 작은 크기 분포(PDI ≤0.2) 및 약 50nm의 dh를 나타내었고 PS 농도가 증가하면서 증가하다가 안정화되었다. RNA 발현카세트:PS 비율이 약 30:60 질량비보다 더 높은 PS 농도에서, 기본 복합입자 1.0-등장 시료는 기본 복합입자 1.0-DW 시료와 비교 가능한 dh 및 크기 분포 데이터를 나타내었다.
본 발명의 기본 복합입자 1.1은 상기 RNA 발현카세트와 PS (㎍/mL)의 중량비는 30:15~150, 바람직하게는 30:15~90, 더욱 바람직하게는 30:75 조건으로 증류수(DW)에서 이상적인 약물 전달체의 성질을 보유하고 있다.
PS 농도가 입자 크기에 미치는 영향을 연구한 결과, 등장액에서는 안정한 작은 monomodal size 분포를 갖는 RNA 발현카세트/PS 기본 복합입자 1.1을 제조하기 위해서는 RNA 발현카세트:PS 비는 최소 30:60 질량비가 이상적이다.
상기 연구결과는 이론적인 예상과 유사하다. 양이온성 화합물인 PS의 양으로 하전된 질소(N)와 mRNA의 음으로 하전된 인(P)사이의 비율에 의해 기본 복합입자 1.0의 물리 화학적 입자 특성과 생물학적 활성이 결정된다. 여기에 주어진 N/P 비율은 1mol 단위 전하를 운반하는 무게를 계산하여 얻을 수 있다.
2000개의 염기로 구성된 RNA 발현카세트는 약 340.5g/mol의 음전하이다. 따라서 1g RNA 발현카세트는 2.94mmol 음전하와 같다. 생리학적 pH에서 RNA 백본에 있는 인산염 그룹은 인산염 그룹의 관련 pKa를 기반으로 음이온성이다. PS의 양전하 양은 제조업체가 제공한 황산염 농도에 따라 결정된다. PS은 물질 1g 당 3.6mmol의 양전하를 가지고 있다. 전위차 적정(보충)은 pH 7.2 (제조 조건)에서 0.35 mmol이 결합한다. 요약하면, 1g 물질은 2.94mmol 음전하 RNA 발현카세트 및 3.6mmol 양전하 PS에 해당한다.
상기 결과들은 선택된 mRNA에만 한정된 것이 아니라 다른 RNA 발현카세트에서도 일반적으로 관찰되었다.
봉합 및 방출
기본 복합입자 1.0의 제조는 양전하의 PS와 음전하의 RNA 발현카세트를 혼합하여 정전기적 상호작용에 따라 입자 형태를 형성한다. 형성된 기본 복합입자 1.0는 안정화를 위해 30분간 상온에서 놓아두었다. PS와 RNA 발현카세트의 혼합을 위한 용매는 RNA 발현카세트의 분해를 방지하기 위해 DEPC 처리된 RNase-free 용매를 사용하였다.
RNA 발현카세트와 PS의 결합 확인은 2% agarose gel에서 전기영동을 수행하여 측정하였다. RNA 발현카세트는 0.5 μg/ml의 EtBr로 염색하였으며, 1x TBE buffer를 이용해 80 Volt 조건에서 20분 동안 전기영동을 수행하였다.
PS에 의한 RNA 발현카세트 봉입 결과를 확인하기 위하여 RNA 발현카세트와 PS의 질량비에 따라 제조된 기본 복합입자 1.0의 전기영동상 밴드의 이동정도를 확인하였다. RNA 발현카세트를 흡착하는데 필요한 RNA 발현카세트/PS (㎍/ml) 비율은 30:15, 30:30, 30:60, 30:75, 30:90 및 30:150으로 RNA 발현카세트를 PS와 혼합하여 반응시키고 1시간 동안 안정시키고 원심 분리하여 상징액(supernatant)을 전기영동하여 조사하였다.
<도 7>를 살펴보면, 기본 복합입자 1.1의 RNA 발현카세트/PS (㎍/ml) 비율 30:15 질량비에서 82% 미결합 RNA 발현카세트가 발견되었다. 30:30의 질량비에서 40% RNA 발현카세트가 용액에 남아있었다. 30:75, 30:90 및 30:150 질량비에서는 RNA 발현카세트는 정량적으로 입자 형태로 존재하였다. 이는 양전하를 띠는 PS의 영향으로 PS의 첨가량이 증가할수록 RNA 발현카세트와 강하게 반응하여 더욱 안정한 입자 형태를 형성한 것이다. 기본 복합입자 1.1에서 RNA 발현카세트:PS (㎍/ml) 비율 1:1 이상에서 PS가 증가함에 따라 mRNA와 PS 복합체가 강력하게 형성함을 알 수 있다. 이는 기존 다른 보고와 유사한 경향이다.
기본 복합입자 1.0의 안정성과 RNA 발현카세트의 방출은 PBS에서 37℃에서 조사하였다. 24 시간 후, RNA 발현카세트:PS 비율 30:90 및 30:150 조건에서 RNA 발현카세트 방출이 발생하지 않았다. 30:75 조건에서 RNA 발현카세트의 작은 방출을 보였으며 8.0 %의 미결합 RNA 발현카세트가 발견되었다. 기본 복합입자의 RNA 발현카세트:PS (㎍/ml) 비율 30:15 질량비 비율 90.0 %, 30:30 질량비에서 63.0%의 RNA 발현카세트가 용액에서 발견되었다.
기본 복합입자 1.0에서 RNA 발현카세트:PS (㎍/ml) 비율 1:1 이상에서 PS가 증가함에 따라 mRNA는 PS과 강력하게 결합하여 방출정도가 매우 났다. 이는 기존 다른 보고와 유사한 경향이다.
상기 결과들은 선택된 RNA 발현카세트에만 한정된 것이 아니라 다른 RNA 발현카세트에서도 일반적으로 관찰되었다.
실시예 3. 기본 복합입자 2.0
3.1. 기본 복합입자 2.0의 제조
양이온성 화합물인 PS과 DOTAP를 함께 사용하여 기본 복합입자 2.0을 제조할 때의 농도는 PS로부터 생기는 양전하의 비율은 15% (저), 45%/55% (중), 85% (고)로 다양하게 하였다.
세 가지 다른 조립 경로로 제조하였는데, PS/RNA 발현카세트 코어로 시작하여 DOTAP를 추가하는 공정(PC), 또는 그 반대로 DOTA/RNA 발현카세트 코어로 시작하여 PS을 추가하는 공정(DC), 그리고 먼저 RNA 발현카세트, DOTAP와 PS을 혼합하는 공정(MP)으로 기본 복합입자 2.0을 제조하였다.
그런 다음, 반응물을 상온에서 1시간 동안 안정화하고 동결건조하여 제조된 RNA 발현카세트/PS/DOTAP 기본 복합입자 2.0을 수득하였다.
입자는 Phoenix RS-VA10 Vortexer (Phoenix Instrument,독일) (10 초, 25W) 및 SpeedMixerTM DAC 150.1 CM 41 (HausChild & Co KG, 독일) (5 분, 3000rpm)을 사용할 수도 있다.
3.2. 기본 복합입자 2.0의 평가
양이온성 화합물인 PS과 DOTAP를 함께 사용하여 기본 복합입자 2.0을 제조할 때의 농도는 PS로부터 생기는 양전하의 비율은 15% (저), 45%/55% (중), 85% (고)로 다양하게 하였다.
양이온성 화합물인 PS과 DOTAP의 양으로 하전된 질소(N)와 mRNA의 음으로 하전된 인(P) 사이의 비율에 의해 기본 복합입자 2의 물리 화학적 입자 특성과 생물학적 활성이 결정된다. 여기에 주어진 N/P 비율은 1mol 단위 전하를 운반하는 무게를 계산하여 얻을 수 있다.
2,000개의 염기로 구성된 RNA 발현카세트는 약 340.5g/mol의 음전하이다. 따라서 1g RNA 발현카세트는 2.94mmol 음전하와 같다. 생리학적 pH에서 RNA 백본에 있는 인산염 그룹은 인산염 그룹의 관련 pKa를 기반으로 음이온성이다. PS의 양전하 양은 제조업체가 제공한 황산염 농도에 따라 결정된다. PS은 물질 1g 당 3.6mmol의 양전하를 가지고 있다. 전위차 적정(보충)은 pH 7.2 (제조 조건)에서 0.35 mmol이 결합한다. DOTAP의 분자량은 698.5g/mol이고 분자 당 하나의 4차 아민 그룹이다. 따라서 pH 값과 관계없이 이온화된다. DOTAP g 당 양전하량은 1.43mmol이다. 요약하면, 1g 물질은 2.94mmol 음전하 RNA 발현카세트, 3.6mmol 양전하 PS 및 1.43mmol 양전하 DOTAP에 해당한다.
따라서, 모든 기본 복합입자 2.0은 최종 N/P 비율 2에서 이상적으로 제조할 수 있다. 이는 실시례 2.1항에서 기본 복합입자 1.0의 제조에서 PS 농도가 입자 크기에 미치는 영향을 연구한 결과와 유사하다. 실시례 2.1항의 결과로 등장액에서는 안정한 작은 monomodal size 분포를 갖는 RNA 발현카세트/PS 기본 복합입자 1.0을 제조하기 위해서는 RNA 발현카세트:PS (㎍/ml) 비율은 최소 30:60 질량비가 이상적임을 확인하였다.
각 조립 경로에 대해 PS과 DOTAP의 세 가지 다른 N/P 비율 조성이 제조되었다. 0.3/1 중간체인 PC(저), DC(고)의 경우 mRNA는 양이온 화합물에 부분적으로만 결합하였다. 따라서 최종 PC(저) 및 DC(고) 입자의 경우 두 번째로 추가되는 물질과 미리 형성된 입자 및 유리 RNA와의 상호작용을 고려해야 하며, 이는 더 복잡한 기본 복합입자 2.0 구성으로 이어질 수 있다.
제한된 크기 (입자 크기 <300 nm, PDI <0.3)를 갖는 기본 복합입자 2.0은 조립 경로 및 선택된 최종 N/P 비율 2에서 PS:DOTAP 비율에 관계없이 획득할 수 있다. 이러한 조건에서 모든 기본 복합입자 2.0은 양의 제타이고, 전위>20mV이다. PS (저> 중> 고)의 양이 증가함에 따라 MP 기본 복합입자 2는 크기가 감소하는 반면 DC 기본 복합입자 2.0은 크기가 증가하고 PC 기본 복합입자 2.0은 크게 변하지 않는 경향이 있다.
기본 복합입자 2.0에 봉합된 RNA를 평가하기 위해 gel retardation assay를 실시하여 그 양을 평가하였다. 모든 기본 복합입자 2.0은 RNA 탑재를 확인하였다. MP로 합성된 기본 복합입자 2.0에서 다른 조립 경로 (PC/DC)에 비해 2배가 탑재된 RNA의 양이 측정되었다(도 8).
기본 복합입자 2.0을 더 차별화하기 위해 헤파린 트리거 RNA 방출을 조사하였다. 음이온성 헤파린은 DOTAP 및 PS의 양전하와 상호 작용하므로 헤파린은 상호작용 부위에서 음이온성 mRNA와 경쟁하여 양이온성 화합물에서 RNA를 방출한다. 첨가된 헤파린 농도는 RNA 농도 (% w/w)에 비해 10배에서 100배 과잉으로 증가시켰다.
DOTAP/RNA 또는 PS/RNA로만 구성된 N/P 비율이 2인 입자는 유사한 DOTAP/PS/RNA 절대 비율을 갖지만 다른 조립 경로에서 얻은 기본 복합입자들와 비교하여 평가하였다. DOTAP/RNA 리포플렉스의 경우 100배 과량의 헤파린조차도 RNA 방출을 관찰할 수 없었던 반면, PS/RNA 폴리플렉스의 경우 10배 초과량은 RNA를 방출하기에 충분하였다.
기본 복합입자 2.0에서 결합된 RNA의 80% RNA의 방출은 기본 복합입자 2.0에서 제조 경로에 따라 명확하게 달라졌다. PC(중) 기본 복합입자 2는 mRNA 방출이 거의 발생하지 않는 수준인 반면, DC(저)의 경우 중간 정도의 RNA 방출이 관찰되었으며 MP(중) 기본 복합입자 2.0의 경우 RNA 방출이 가장 많이 일어났다. MP(중) 기본 복합입자에서 높은 RNA 방출은 더 많은 양의 RNA가 탑재하기 때문으로 생각이 된다.
실시예 4. HSA 복합입자
본 발명에서 RNA 발현카세트/PS/HSA 복합입자 1.1, RNA 발현카세트/PS-TCA/HSA 복합입자 1.2, RNA 발현카세트/CS/HSA 복합입자 1.3 또는 RNA 발현카세트/CS-TCA/HSA 복합입자 1.4를 포함하여 “HSA 복합입자”라고 총칭하였다.
4.1. HSA 복합입자의 제조
본 발명에서 사용되는 RNA 발현카세트의 표적단백질은 치료용 단백질(sTNFR2, EPO, G-CSF), 세포외기질 분해 효소(HYAL 1, Hyaluronidase PH20, MMP1, MMP 8, MMP 13), 세포외기질 분해 효소의 저해물질(TIMP 1, TIMP 2, TIMP 3 및 TIMP 4) 및 백신 접종용 목적 단백질(RAV-G 및 RSV-F 단백질)을 코딩하는 ORF를 포함하며 제한되는 것은 아니다.
본 실시례의 HSA 복합입자는 치료용 단백질 및 백신용 단백질을 코딩하는 RNA 발현카세트를 사용하였으며, 이에 국한되는 것은 아니다.
상기 선택된 RNA 발현카세트, 양이온성 단백질 프로타민(PS) 및 음이온성 단백질 인간혈청알부민(HSA) 용액은 각각 증류수(DW), PBS 완충액 (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 10mM, KH2PO4 1.8mM; pH 7.4) 또는 페놀 레드가 없는 RPMI 1640 세포 배지를 사용하여 2.5mg/ml의 농도로 제조하였다.
0～2000㎍의 HSA를 15～150㎍의 PS에 첨가한 다음 5초 동안 혼합하였다. 그 후, 상기 제조한 30㎍ RNA 발현카세트를 1ml의 최종 용적에 도달시켜 첨가하고, 5초 동안 와동하여 입자를 제조하였다.
다른 방법은 3종류의 화합물의 첨가 순서를 임의로 결정할 수도 있다.
또 다른 방법은 상기 3종류 화합물을 혼합하여 제조할 수도 있다.
그런 다음, 반응물을 상온에서 1시간 동안 방치하고 2일 동안 동결건조하여 제조한 복합입자를 수득하였으며 이를‘RNA 발현카세트/PS/HSA 복합입자 1.1 또는 HSA 복합입자 1.1’이라고 지칭하였다.
여기에서 RNA 발현카세트는 상기 여러 종류에서 선택되어진 어느 한 종류이거나 복수의 종류가 혼합물이 될 수도 있다.
여기서, PS 대신에 PS-TCA, CS(Chitosan) 또는 CS-TCA을 사용할 수 있다. PS-TCA 또는 CS-TCA의 제조는 본 발명자의 출원 특허 (대한민국 특허 출원:10-2019-0007873)를 참조하였다.
상기 PS 대신에 PS과 DOTAP를 선정하여 제조할 수 있으며 이들의 농도는 PS로부터 생기는 양전하의 비율은 15% (저), 45%/55% (중) 및 85% (고)로 다양하게 하여 사용할 수도 있다.
4.2. HSA 복합입자의 평가
HSA가 입자 크기에 미치는 영향
도 9를 살펴보면, HSA 복합입자 1.1-DW는 30㎍ RNA 발현카세트, 90㎍ PS이 있는 1ml의 증류수에 100～500㎍의 HSA를 첨가하고 혼합하면 dh는 250～280nm의 범위이고 PDI가 ≤ 0.1이었다. RNA 발현카세트/PS/HSA 복합입자 1.1-DW는 1000～2000㎍의 HSA를 증가시키면 dh가 커지고 PDI가 0.2 이상이 되었다(빨간색 막대 그래프).
상기 HSA 복합입자 1.1-DW는 소량의 HSA가 있는 경우 작은 입자를 형성하나 HSA가 증가함에 따라 입자는 큰 구조로 응집되었다. 이러한 결과는 고농도의 HSA가 DW에서의 제조 과정에 부정적인 영향을 미치므로 덜 안정한 입자를 형성한 것이다.
도 9를 살펴보면, HSA 복합입자 1.1-등장액은 30㎍ RNA 발현카세트와 90㎍ PS이 있는 1ml 등장액에 첨가되는 100～2000㎍의 HSA를 첨가하고 혼합하면 안정성은 개선되었다. 이 입자의 dh는 사용된 등장액에 따라 1～2mm에서 250～400nm로 감소하였다. 페놀 레드가 없는 세포 배지 RPMI 1640 등장액에서 dh = 245nm 및 PDI ≤ 0.15를 갖는 입자를 형성하였다. 이를 RNA 발현카세트/PS/HSA 복합입자 1.1-RPMI이라고 지칭하였다.
도 9의 결과를 종합하면, HSA의 최적화 농도는 HSA 복합입자 1.1-DW에서 약 100㎍/ml이고 RNA 발현카세트/PS/HSA 복합입자 1.1-등장액에서 약 1000㎍/ml이며 PS의 최적화 농도는 15～150㎍ 범위로 평가되었다.
상기 HSA가 HSA 복합입자 1.1에 미치는 영향은 HSA 복합입자 1.2, 1.3. 및 1.4에서 유사하게 관찰되었다.
상기 결과들은 선택된 RNA 발현카세트에만 한정된 것이 아니라 다른 RNA 발현카세트에서도 일반적으로 관찰되었다.
실시예 5. HA 복합입자
본 발명에서 사용되는 RNA 발현카세트의 표적단백질은 치료용 단백질(EPO, G-CSF), 세포외기질 분해 효소(HYAL 1, Hyaluronidase PH20, MMP1, MMP 8, MMP 13), 세포외기질 분해 효소의 저해물질(TIMP 1, TIMP 2, TIMP 3 및 TIMP 4) 및 백신 접종용 목적 단백질(RAV-G 및 RSV-F 단백질)을 코딩하는 ORF를 포함하며 제한되는 것은 아니다.
RNA 발현카세트/PS/HSA 복합입자는 세포외기질 분해 효소(HYAL 1, Hyaluronidase PH20, MMP1, MMP 8, MMP 13), 세포외기질 분해 효소의 저해물질(TIMP 1, TIMP 2, TIMP 3 및 TIMP 4) 을 코딩하는 RNA 발현카세트를 사용하였으며, 이에 국한되는 것은 아니다.
상기 기본 복합입자와 음이온성 다당류를 혼합하여 자기조립으로 형성되는 입자 또는 mRNA, 양이온성 폴리펩타이드 및 음이온성 다당류를 혼합하면서 초음파 분사하여 형성되는 입자를 복합입자(20)라고 지칭하였다.
본 발명에서 하기 RNA 발현카세트/PS/HA 복합입자 1.1 및 RNA 발현카세트/PS/HA-TCA 복합입자 1.2를 포함하여 “HA 복합입자”라고 지칭하였다.
5.1. HA 복합입자의 제조
상기 RNA 발현카세트/PS/HA 복합입자의 제조는 먼저 제조한 기본 복합입자 1.0을 다시 표면 개질을 위하여, 음이온성 다당류인 히알루론산(Hyaluronic acid, HA, 83 kDa)을 멸균증류수 또는 등장액에 1mg/mL 용해시켜 0.1% 스톡 용액으로 제조하였다.
상기 RNA 발현카세트:PS (㎍/ml) 비율이 30:75 질량비에서 제조하여 동결건조한 기본 복합입자 1.0을 멸균증류수 또는 등장액에 1mg/mL로 용해시켜 0.1% 기본 복합입자 1.1 용액을 제조하였다.
상기 제조한 0.1% 기본 복합입자 1.0 용액과 0.1% HA 용액을 1:0.5, 1:1, 1:1.5 또는 1:2 첨가몰비(feed mole ratio, nmol)로 섞어준 뒤 5분 정도 처리하여 동결건조하여 HA 복합입자-DW를 수득하였다. 이어서, 상기 입자의 크기를 조절하기 위해 적절하게 초음파분석기(Sonicator) 또는 압출기(Extruder)를 사용할 수 있다. 동결건조하여 HA 복합입자 1.1-DW를 수득하였다.
또는, 상기 HA 복합입자 1.1의 다른 제조는 상기 RNA 발현카세트/PS]:HA 또는 [RNA 발현카세트/PS]:HA의 첨가몰비(feed mole ratio, nmol)는 상기 복합입자와 HA 첨가몰비 1:0.5, 1:1, 1:1.5 또는 1:2에 준하여 RNA 발현카세트, PS 및 HA를 5분 정도 섞어준 후, 상기 입자의 크기를 조절하기 위해 적절하게 초음파분석기(sonicator) 또는 압출기(extruder)를 사용할 수 있으며 동결건조하여 HA 복합입자 1.1을 수득하였다.
여기서, HA 대신에 HA-TCA를 사용할 수도 있다. 본 발명자의 출원 특허(대한민국 특허 출원: 10-2019-0007873)를 참조하여 제조한 HA-TCA 결합체는 HA와 TCA의 첨가몰비가 1:10인 조건에서 제조된 HA-TCA 결합체를 멸균증류수 또는 등장액 1mg/mL로 용해시켜 0.1% HA-TCA 수용액을 제조하였다.
본 발명의 RNA 발현카세트/PS/HA-TCA HA 복합입자 1.2는 상기 0.1% 기본 복합입자 1.1 용액과 0.1% HA-TCA 수용액에 1:0.5, 1:1, 1:1.5 또는 1:2 첨가몰비로 천천히 와동하면서 첨가하고 상온에서 1시간동안 안정화하고 동결건조하여 수득하였다.
상기 PS 대신에 PS과 DOTAP의 농도는 PS로부터 원하는 양전하의 비율은 15% (저), 45%/55% (중), 85% (고)로 다양하게 하여 사용할 수도 있다.
5.2. HA 복합입자의 평가
형태학적 분석 및 봉입 확인
실시예 5.1항에서 제조된 HA 복합입자 크기는 Malvern Zetasizer 3000 HSA(Herrenberg, Germany)로 광자 상관 분광법(Photon correlation spectroscopy, PCS)으로 결정하였다. 입자 크기는 평균 유체 역학적 직경(mean hydrodynamic diameter, dh)으로 표현하였고, 크기 분포의 폭은 다분산 지수(polydispersity index, PDI)로 표현하였다. 측정은 구성성분을 첨가한 혼합물의 배양 1시간 후 수행하였다.
다양한 비율로 제조한 HA 복합입자 1.1의 사이즈 분포를 조사한 결과는 도 11 및 <표 5>이다. 이들 결과는 상기 HA 복합입자 1.0의 크기가 200nm 범위인 경우 RNA 발현카세트/PS:HA의 비율은 1:0.5와 1:1임을 알 수 있었다.
다양한 조건에서 제조한 HA 나노입자 1.1의 Zetasizer 분석결과
첨가몰비
(feed mole ratio, nmol)		 RNA:PS 1 1 1 1
HA 1 1.5 2 2.5
RNA 발현카세트PS/HA
size(nm) 184.8±7.1 182.3±14.1 493.2±22.6 1259±147
PDI 0.30±0.07 0.34±0.04 0.30±0.02 0.35±0.09
Complex efficiency
(% vs RNA)		 80.9 71.7 100 100
상기 HA 복합입자 1.0를 RNA 발현카세트/PS];HA 첨가몰비를 1:1.5로제조하여 원심분리한 후, 동결건조하고 5% w/w Trehalose 용액으로 재수화하였으며 재수화전후의 전후의 입자 크기를 조사하였다.
<표 6>를 살펴보면, 동결건조하여 재수화 전후에 따라 입자 크기 변화는 거의 없으며 증류수(DW)보다 PBS에서 입자가 약 3~4% 정도 증가 현상이 이었다.
HA 복합입자 1.1을 동결건조한 후 재수화하여 PCS 분석결과
RNA 발현카세트/PS/HA
Size(nm) 202.0±30.4
PDI 0.15±0.22
동결건조 및 재수화
DW PBS
Size(nm) 209.7±5.4 224.5±19.7
PDI 0.12±0.06 0.17±0.1
CE(%) 96.4 100
상기 결과들은 선택된 RNA 발현카세트에만 한정된 것이 아니라 다른 RNA 발현카세트에서도 일반적으로 관찰되었다.
바람직한, 다른 HA 복합입자 1.1의 제조는 먼저, RNA 발현카세트, PS와 HA의 혼합을 위한 용매는 RNA 발현카세트의 분해를 방지하기 위해 DEPC 처리된 RNase-free 용매를 사용하였다.
RNA 발현카세트, PS 및 HA에 선택된 두 종류 물질을 반응 용액내에서 가열없이 얼음 팩 위에서 1시간 동안 sonication하면서 혼합하고 형성된 복합체 용액에 전단계에서 처리하지 못한 나머지 물질을 첨가하여 가열없이 얼음 팩 위에서 1시간 동안 sonication하여 반응이 끝난 후, 상온에서 1시간 동안 유지한 후 Nano membrane Liposome Extruder (Avestin Inc, 캐나다)를 이용하여 300 nm에서 200 nm 막 필터에서 각 막당 왕복 10회씩 처리하고 상온에서 1시간 동안 안정시킨 후, 형성된 HA 복합이자 1.1를 Zetasizer를 이용하여 입자 분석을 하였으며 그 결과는 표 7과 같다. 상기 형성 HA 복합입자 1,1의 분포 및 크기는 도 10과 같다.
MP에 의한 HA 복합입자 1.1을 제조한 PCS 분석결과
구성성분 1 2 3 4
RNA(㎍) 1 1 1 1
PS(㎍) 0.5 0.5 1 2
HA(㎍) 0.5 1 0.5 1
Sonication SiZE(nm) 184.8±7.1 182.3±14.1 493.2±22.6 1259±147
PDI 0.30±0.07 0.34±0.04 0.30±0.02 0.35±0.09
Kcps 80.2 56.4 181.4 225.5
Complex efficiency
(% vs RNA)		 80.9 71.7 100 100
Extrusion Size 159.6±1.2 163.2±1.3 186.5±9.9 258.3±11.3
PDI 0.17±0.004 0.21±0.008 0.33±0.05 0.22±0.01
Zeta -23.3±0.9 -16.6±4.6 -18.3±3.4 -8.6±0.8
Kcps 40.5 32.6 22.9 39.7
상기 Sonication 및 Extrusion 처리 단계 후 분석하기 위해 각각의 단계에서 1시간 동안 안정시키고 원심분리하여 얻은 상징액을 2% agarose gel에서 80 Volt 조건에서 20분 동안 1x TBE buffer를 이용해 전기영동을 수행하고 0.5 μg/ml의 EtBr(Ethidium bromide)로 염색하여 각각의 HA 복합입자 1.1에 의해 RNA 발현카세트 봉입을 확인한 결과, 도 11을 살펴보면, 기본 복합입자 1.1에서 방출되는 RNA 발현카세트만 젤을 이동하는 것을 알 수 있다.
HA 복합입자 약물 방출 프로파일
HA 복합입자 1.1의 안정성과 RNA 발현카세트의 방출은 PBS에서 37℃에서 24시간 처리한 후 원심분리하여 얻은 상징액을 조사하였었다. 상기 HA 복합입자 1.1에 의한 RNA 발현카세트 방출 프로파일은 다양한 조건에서 얻은 상징액을 2% agarose gel에서 1x TBE buffer를 이용해 80 Volt 조건에서 20분 동안 전기영동을 수행한 후, RNA 발현카세트는 0.5 μg/ml의 EtBr(Ethidium bromide)을 이용해 염색하였다.
[RNA 발현카세트/PS]:HA 첨가몰비 1:1.5 및 1:2 조건에서 mRNA 방출이 거의 발생하지 않았다. [RNA 발현카세트/PS]:HA 첨가몰비 1;0.5에서 90.0 % 및 1:1에서 63.0 % mRNA가 용액에서 발견되었다. 1:1.5 조건에서 RNA 발현카세트의 작은 방출을 보였으며 8.0 %의 미결합 RNA 발현카세트가 발견되었다. 이는 양전하를 띠는 HA의 영향으로 HA의 첨가량이 증가할수록 RNA 발현카세트와 강하게 반응하여 더욱 안정한 입자 형태를 형성한 것으로 판단할 수 있다.
상기 복합입자의 [RNA 발현카세트/PS]:HA 첨가몰비 1:1.5 질량비에서 시간에 따른 약물 방출 프로파일을 조사하였다(도 12).
도 12의 밴드 강도를 판독한 결과는 <표 8>과 같으며, HA 복합입자 1.1은 PBS 용액에서 120시간 동안에 누적된 RNA 발현카세트가 봉합된 수준의 100%를 방출하였으며 72~ 96시간 사이에 50%의 방출을 관찰하였다.
HA 복합입자 1.1로부터 시간대별 RNA 발현카세트의 방출 프로파일
Incubation Time (hours) 0 4 8 24 48 72 96 120
Band density(%) 20.0 27.9 25.5 36.0 48.0 42.7 41.2 50.2
Release of RNA
(%, normalization)		 0 7.9 5.5 17.0 33.8 43.6 65.3 104.9
실시례 6. HA-압타머 복합입자
HA-압타머 합성
HA-압타머 접합체는 EDC/NHS 화학을 사용하여 HA의 카르복실기와 압타머의 아민 기 사이의 커플링 반응에 의해 제조할 수 있다. 간단히 말해서, 83 kDa HA (1g, 20μmol)를 질소하에서 5 시간 동안 200mL의 멸균증류수에 용해시켰다. EDC (100.4 mg, 0.52 mmol) 및 NHS (60.7 mg, 0.52 mmol)를 HA 용액에 첨가하였다. 20분 후, 압타머-아민기 (99.4 mg, 0.52 mmol)를 천천히 첨가하였다. 0.1 M HCl을 사용하여 pH를 5.5로 조정하고 용액을 실온에서 밤새 반응시켰다. 미 반응 잔류 물 및 부산물은 증류수 (pH 5)에서 투석막 (MW Cut off = 100 kDa)으로 제거되었다. 최종 제품은 동결 건조하고 -20℃에서 보관하였다.
HA-DAB-압타머 합성
먼저, HA-DAB(1,4-diaminobutane)는 분자량 100kDa인 HA(100g)의 카르복실기(Carboxyl group)를 pH 6.0에서 1-에틸-3-[3-(디메틸아미노)-프로필]카르보디이민(1-ethyl-3- [3-(dimethylamino)-propyl]Carbodiimide, EDC) 및 1-히드록시 벤트리아졸 모노하이드레이트(1-hydroxy bentriazole monohydrate, HOBt)로 활성화 시킨 다음, 1,4-디아미노부탄(1,4-diaminobutane, DAB)을 첨가하여 합성하였다. 이 때 반응 시간을 1시간, 6시간, 24시간으로 다양하게 하여 서로 다른 치환율을 가진 합성물을 수득하였다. 상기와 같이 수득된 합성물을 여과 튜브(Cut off 100kDa)를 이용하여 여과 정제하여 HA-DAB를 제조하였다.
이어서, 상기 제조된 HA-DAB에 이황화 결합을 도입된 HA-DAB-SPDP를 제조하였다. 구체적으로, 상기 합성된 HA-DAB (20 mg; 4.8 x 10-5몰)와 숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate; SPDP) (5.6 mg; 1.8 x 10-5몰) 를 섞고 반응시켜 HA 체인에 피리딜기(pyridyl group)를 도입하고 여과 튜브(MW Cut off = 100 kDa)를 이용해 여과 정제하였다.
정제된 HA-DAB-SPDP는 TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine)를 처리하고 343nm에서 흡광도를 측정하여 피리딜기의 농도를 계산하였다(피리미딜기 농도: 34 mM).
본 실시례에 사용된 EGFR 압타머(Tan Y et al., Acta Pharmacologica Sinica (2013) 34: 1491-1498)는 서열번호 41의 N30 부위에 서열번호 42이 있는 염기서열이다
5′-GCAATGGTAC GGTACTTCC- (N30)-CAAAAG TGCACGCTAC TTTGCTAA-3′ (서열번호 41)
5′-TGAATGTTGT TTTTTCTCTT TTCTATAGTA-3′ (서열번호 42)
상기 EGFR 압타머는 3*?**?*말단에 티올기(Thiol group)가 도입된 단일가닥 DNA 구조로 유기합성하였다(TriLink Biotechnologies 사, 미국).
상기 제조된 HA-DAB-SPDP 용액에 3'말단에 티올기(Thiol group)가 도입된 EGFR 압타머를 상기 피리미딜기 농도의 0.2 몰 배에서 1배의 다양한 비율로 첨가하여 이황화 결합으로 HA-DAB-압타머 접합체를 합성하였다.
이 때 합성된 HA-DAB-압타머는 HA 100kDa 한 분자당 접합된 압타머의 개수를 2개에서 15개 사이로 조절할 수 있다.
HA-DAB-압타머 접합체 확인
상기 실시예 6에서 합성된 HA-DAB-압타머 접합체의 생성을 확인하기 위하여 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)를 이용하였다. 상기 HPLC 조건은 superdex 200 10/300 GL (GE Health) 컬럼을 사용하였고 이동상은 pH 7.0 50 mM 포스페이트 버퍼 (phosphate buffer), 흐름 속도는 0.5ml/min를 사용했고 210nm와 260nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과를 도 13에 기재하였고, 결과를 바탕으로 합성물을 분리 정제하였다. 도 13에서 알 수 있는 바와 같이, HA-DAB-압타머 접합체 생성률(반응률)은 약 64%인 것으로 확인되었다.
상기 접합체 생성률(반응률)은 다음의 식으로 계산하였다:
반응률(%) = {(접합체 생성에 소요된 압타머 수준)/(반응 초기에 첨가한 압타머 수준) }X100
또한 분리 정제된 합성물은 아가로스 젤 전기영동을 통해 합성 여부 및 환원제(TCEP)에 의한 분해 여부를 확인하여, 그 결과를 도 14a 내지 14d에 기재하였다.
도 14a는 두 가지 다른 Cross linker로 합성된 HA-DAB-압타머 접합체를 아가로즈 전기영동을 통해 분석한 결과이다. 구체적으로, 도 14a에서, HA-ss-압타머는 HA와 압타머 사이에 이황화결합 (-ss-)이 포함된 접합체를 의미하고, HA-압타머는 이황화결합이 아닌 일반적인 공유결합으로 연결되어 있는 접합체(대조군)를 의미한다. 오른쪽 두 컬럼에서 보는 바와 같이, 환원제인 TCEP를 처리했을 때 이황화결합이 포함된 접합체에서는 압타머가 분리되어 아래 부분에 밴드가 나타나는데 비하여, 대조군에서는 압타머가 분리되지 못하고 그대로 윗부분에 남아 있는 것을 확인할 수 있다.
또한 도 14b 내지 14d는 HA-DAB-압타머 접합체의 안전성을 평가하기 위하여 HA-DAB-압타머 접합체에 FBS를 첨가하여 시간별로 아가로즈 전기영동을 통해 남아있는 압타머의 양을 확인하였다(도 14b 및 도 14d에서 HA-압타머 Conjugate는 HA-DAB-압타머 접합체를 의미함). 그 결과 HA-DAB-압타머 접합체는 HA-DAB-압타머 접합하지 않은 압타머(naked 압타머)에 비해 오랜 시간 동안 분해되지 않고 남아있는 것을 확인할 수 있다.
HA-압타머 복합입자의 제조
상기 RNA 발현카세트:PS (㎍/ml) 비율이 30:75 질량비에서 제조하여 동결건조한 기본 복합입자 1.1을 멸균증류수 또는 등장액에 1mg/mL로 용해시켜 0.1% 기본 복합입자 1.1 용액을 제조하였다.
상기 제조한 0.1% 기본 복합입자 1.1 용액과 0.1% HA-압타머 용액을 1:0.5, 1:1, 1:1.5 또는 1:2 첨가몰비(feed mole ratio, nmol)로 혼합하여 복합입자를 제조하고 1시간 동안 안정화시킨 후, 동결건조하여 RNA 발현카세트/PS/HA-압타머 복합입자-DW를 수득하였다.
또는, 다른 방법의 상기 RNA 발현카세트/PS/HA-압타머 복합입자의 제조는 상기 RNA 발현카세트/PS]:HA-압타머의 첨가몰비(feed mole ratio, nmol)는 상기 복합입자와 HA-압타머 첨가몰비 1:0.5, 1:1, 1:1.5 또는 1:2에 준하여 RNA 발현카세트/PS 및 HA-압타머를 섞어준 뒤 5분 정도 상기 입자의 크기를 조절하기 위해 적절하게 초음파분석기(soniCator) 또는 압출기(extruder)를 사용할 수 있다. 동결건조하여 RNA 발현카세트/PS/HA-압타머 복합입자-DW를 수득하였다.
상기 PS 대신에 PS과 DOTAP의 농도는 PS으로부터 원하는 양전하의 비율은 15% (저), 45%/55% (중), 85% (고)로 다양하게 하여 사용할 수도 있다.
실시예 7. HSA 복합입자의 생물학적 평가
293T 세포(ATCC CRL-3216™, Thermo Fisher 사 미국)을 DMEM + 2mM Glutamine + 10% Fetal Bovine Serum (FBS) 배지에서 >70%의 배양용기를 커버될 정도까지 성장시킨다. 신선한 배지로 세척한 후, 0ng, 46.875ng, 93.75ng, 187.5ng, 375ng, 750ng, 또는 1500ng의 [sTNFR2 RNA 발현카세트:PS]/HSA 복합입자 1.1, [G-CSF RNA 발현카세트:PS]/HSA 복합입자 1.1, [EPO RNA 발현카세트:PS]/HSA 복합입자 1.1, [RSV-F RNA 발현카세트:PS]/HSA 복합입자 1.1, 또는 [RAV-G RNA 발현카세트:PS]/HSA 복합입자 1.1을 배지에 첨가하여, 6시간 동안 배양하고 신선한 배지로 세척하고, 신선한 배지에서 다시 배양하여 293T 세포에 형질주입하였다.
배양 배지 중에 분비된 각각 단백질 농도는 각각의 RNA 발현카세트의 각각의 농도에 대해 형질감염 후 0, 6, 12, 24, 및 48시간째에 3회 측정된다.
형질주입된 293T 세포들로부터의 각각 단백질의 분비는 Human sTNFR2 ELISA Kit(MyBioSource, 미국), G-CSF Human Instant ELISA™ Kit(인비트로겐, 미국), EPO Quantikine ELISA™ Kit(R&D Systems, 미국), 항-RSV-F 항체 ELISA™ kit(ab94968, abcam사, 미국) 또는 Human Anti-Respiratory syncytial virus IgG ELISA™ Kit (RSV) (ab108765, abcam사, 미국)를 사용하여 정량하였다(도 15).
실시예 8. HA 복합입자 1.1의 생물학적 평가
HYAL 1, Hyaluronidase PH20 및 sPH20
PC3 세포주(ATCC CRL-1435™, Thermo Fisher 사, 미국)을 F-12K Medium (Kaighn's ModifiCation of Ham's F-12 Medium) + 2mM Glutamine + 10% Fetal Bovine Serum (FBS) 배지에서 배양하여 본 실시례에 사용하였다.
40mm 세포 배양 접시에 2㎖의 세포 배양액을 넣고, 세포를 약 1.2x105 의 농도로 접종한 후, >70%의 배양용기를 커버될 정도까지 배양하였다. 신선한 배지로 세척한 후, 0ng, 46.875ng, 93.75ng, 187.5ng, 375ng, 750ng 또는 1500ng의 HYAL 1, PH20 또는 sPH20 RNA 발현카세트/PS/HA 복합입자를 배지에 첨가하여, 6시간 동안 배양하고 신선한 배지로 세척하고, 신선한 배지에서 다시 배양하였다. 배양 배지에 분비된 sPH20 농도는 각각의 RNA 발현카세트의 각각의 농도에 대해 형질주입 후 0, 6, 12, 24, 및 48시간째에 3회 sPH20 ELISA™ Kit(인비트로겐, 미국)를 사용하여 정량하였다(도 16).
상기 다양한 용량의 HA 복합입자로 형질주입한 세포를 37℃에서 6시간 동안 배양한 후 세척하고, 이어서, 0.5mg/mL의 소 aggrecan (Sigma-Aldrich사, 미국)을 첨가하여 함께 0, 1, 2, 8, 16, 24 및 48시간 동안 배양하였다. 그 후, 배지를 제거하고 PBS (pH 7.4)에서 2% 글루타르알데히드로 고정하고 109/mL 마우스 RBC가 있는 현탁액으로 교체하였다. 세포는 카메라 스캐너 및 이미징 프로그램 (DiagnostiC Instruments, Inc., 미국)이 결합된 위상차 현미경으로 이미지화하였다(도 17).
MMP: MMP1, MMP 8 및 MMP 13
인간 피부 섬유모세포(Human skin fibroblast) CCD-986Sk (ATCC　 CRL-1947™)는 37℃, 5% 이산화탄소의 조건하에서 10% FBS, 0.1 mM 비필수 아미노산, 1.5 g/L 중탄산나트륨, 1mM 피르빈산나트륨을 첨가한 Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) 배지(이하 세포 배지로 약함)에서 배양하였다.
40mm 세포 배양 접시에 2㎖의 세포 배양액을 넣고, 인간섬유아세포를 약 1.2x105 의 농도로 접종한 후, >70%의 배양용기를 커버될 정도까지 배양하였다. 0ng, 46.875ng, 93.75ng, 187.5ng, 375ng, 750ng, 또는 1500ng의 MMP1, MMP 8 또는 MMP 13 RNA 발현카세트:PS]/HA 복합입자를 인간 피부 섬유모세포에 형질주입시킨다. 배양 배지 중에 분비된 MMP 농도는 각각의 RNA 발현카세트의 각각의 농도에 대해 형질감염 후 0, 6, 12, 24, 및 48시간째에 3회 측정된다. 형질감염된 293T 세포들로부터의 MMP1, MMP 8 또는 MMP 13의 분비는 MMP1, MMP 8 또는 MMP 13 Human Instant ELISA™ Kit(인비트로겐, 미국)를 사용하여 정량하였다(도 18).
40mm 세포 배양 접시에 2㎖의 세포 배양액을 넣고, 인간섬유아세포를 약 1.2x105 의 농도로 접종한 후, 37℃, 5% CO2 환경에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 실시예 1에서 제조된 MMP1 RNA 발현카세트:PS]/HA 복합입자 1.1(각각 10 또는 100㎍/㎖)을 포함한 배지로 교체하여 3일간 배양하였다. 이후 배양액을 수확하여 4℃, 7500rpm 환경에서 5분간 원심분리하여 ELISA 방법을 이용하여 타입 1 프로콜라겐(Procollagen Type I C Peptide EIA Kit, Takara, Shiga, Japan)의 단백질 변화를 확인하였다. 인간섬유아세포 실험에서, MMP1 RNA 발현카세트:PS]/HA 복합입자 처리군은 타입 1 프로콜라겐 단백질의 생성을 농도 의존적으로 억제시키고 있음을 알 수 있었다. 이러한 효과는 MMP1 RNA 발현카세트:PS]/HA 복합입자를 비처리한 군과 비교할 때, 월등한 것으로 나타났는데, 비처리 군 대비, 처리된 군에서는 각각 10 또는 100㎍/㎖ 용량에서 109% 또는 138%의 타입1 프로콜라겐 단백질의 억제를 하였다.
상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 MMP1 RNA 발현카세트:PS]/HA 복합입자가 형질주입된 세포는 콜라겐 분해 효소인 MMP-1의 발현이 증가하여 타입1 프로콜라겐의 생성을 억제하였다.
sPH20 mRNA발현카세트와 MMP1 RNA발현카세트를 혼합하여, PS 및 HA를 사용하여 복합입자를 제조하여 히알루론산 및 콜라젠이 주성분으로 이루어진 암조직의 ECM을 효율적으로 분해할 수도 있다.
TIMP: TIMP 1, TIMP 2, TIMP 3 및 TIMP 4
인간 피부 섬유아세포(Human skin fibroblast) CCD-986Sk (ATCC　 CRL-1947™)는 37℃, 5% 이산화탄소의 조건하에서 10% FBS, 0.1 mM 비필수 아미노산, 1.5 g/L 중탄산나트륨, 1mM 피르빈산나트륨을 첨가한 IMDM 배지(이하 세포 배지로 약함)에서 배양하였다.
40mm 세포 배양 접시에 2㎖의 IMDM 배양액을 넣고, 인간섬유아세포를 약 1.2x105의 농도로 접종한 후, 37℃, 5% CO2 환경에서 24시간 동안 배양하였다. 0ng, 46.875ng, 93.75ng, 187.5ng, 375ng, 750ng, 또는 1500ng의 제조된 TIMP 1, TIMP 2, TIMP 3 또는 TIMP 4 RNA 발현카세트:PS]/HA 복합입자 1.1을 포함한 배지로 교체하여 6시간 배양한 후 신선한 배지로 교체하여 3일간 배양하였다. 이후 배양액을 수확하여 4℃, 7500rpm 환경에서 5분간 원심분리하여 ELISA 방법을 이용하여 배양 배지 중에 분비된 TIMP 농도는 각각의 RNA 발현카세트의 각각의 농도에 대해 형질감염 후 0, 6, 12, 24, 및 48시간째에 3회 측정된다. 형질주입된 인간섬유아세포들로부터의 TIMP 1, TIMP 2, TIMP 3 또는 TIMP 4의 분비는 TIMP 1, TIMP 2, TIMP 3 또는 TIMP 4 Human Instant ELISA™ Kit(인비트로겐, 미국)를 사용하여 정량하였다(도 19).
40mm 세포 배양 접시에 2㎖의 DMEM 배양액을 넣고, 인간섬유아세포를 약 1.2x105 의 농도로 접종한 후, 37℃, 5% CO2 환경에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 실시예 1에서 제조된 TIMP 1 RNA 발현카세트:PS]/HA 복합입자(각각 10, 및 100㎍/㎖)을 포함한 배지로 교체하여 3일간 배양하였다. 이후 배양액을 수확하여 4℃, 7500rpm 환경에서 5분간 원심분리하여 ELISA 방법을 이용하여 타입 1 프로콜라겐(ProCollagen Type I C Peptide EIA Kit, Takara, Shiga, Japan)의 단백질 변화를 확인하였다. 인간섬유아세포 실험에서, TIMP RNA 발현카세트:PS]/HA 복합입자 처리군은 타입 1 프로콜라겐 단백질의 생성을 농도 의존적으로 증가시키고 있음을 알 수 있었다. 이러한 효과는 TIMP RNA 발현카세트:PS]/HA 복합입자를 비처리한 군과 비교할 때, 월등한 것으로 나타났는데, 비처리 군 대비, 처리된 군에서는 각각 10 또는 100㎍/㎖ 용량에서 109% 또는 138% 개선된 타입 1 프로콜라겐 단백질의 생성 증가를 나타내어, TIMP 1 RNA 발현카세트:PS]/HA 복합입자 처리시 타입 1 프로콜라겐 단백질의 생성 증가 효과가 더욱 큰 것으로 나타났다.
상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 TIMP RNA 발현카세트:PS]/HA 복합입자는 MMP 신호전달체계에 작용하여 타입 1 프로콜라겐의 생성을 촉진시키고, 콜라겐 분해 효소인 MMP-1의 발현을 억제하는 작용을 통해, 주름 생성을 효과적으로 예방하고, 생성된 주름을 개선하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 9. HA-TCA 복합입자 1.2의 세포흡수 실험
상기 [TIMP1 RNA 발현카세트:PS]/HA-TCA(Taurocholate) 복합입자 1.2의 담즙산 수용체에 의한 세포흡수 정도를 평가하기 위하여 ASBT가 발현되지 않은 MDCK 및 ASBT가 발현되는 MDCK-ASBT 세포(BioIVT 사, 미국)를 이용하여 실험을 수행하였다. MDCK 또는 MDCK-ASBT 세포는 10% FBS이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium에서 배양하였다.
40mm 세포 배양 접시에 2㎖의 DMEM 배양액을 넣고, 세포를 약 1.2x105의 농도로 접종한 후, 37℃, 5% CO2 환경에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 실시예 2에서 제조된 [TIMP1 RNA 발현카세트:PS]/HA 복합입자 1.2를 포함한 배지로 교체하여 6시간 배양한 후 신선한 배지로 교체하여 3일간 배양하였다.
이후 배양액을 수확하여 4℃, 7500rpm 환경에서 5분간 원심분리하여 ELISA 방법을 이용하여 배양 배지 중에 분비된 TIMP1 농도는 각각의 RNA 발현카세트의 각각의 농도에 대해 형질주입한 후 0, 6, 12, 24, 및 48시간째에 3회 측정된다. 형질주입된 세포들로부터의 TIMP1의 분비는 TIMP1 Human Instant ELISA™ Kit(인비트로겐, 미국)를 사용하여 정량하였다.
상기 TCA는 담즙산의 일종으로 담즙산 수용체에 의한 장간순환이 가능한 물질로 약물의 체순환(Systemic circulation)을 증가시키며, 소장 말단 부분에서의 ASBT(Apical Sodium Dependent Bile Acid Transporter)에 의해 경구흡수를 증진시키는 장점이 있다. MDCK-ASBT 세포는 ASBT가 수용체가 과발현된 세포이며 대조군으로 MDCK 세포를 사용하였다.
도 20를 살펴보면, TCA를 갖고 있는 복합입자는 시간이 경과함에 따라 MDCK-ASBT 세포로 유입되어 TIMP1 발현이 증가함을 확인할 수 있다. 실험결과 ASBT가 발현되지 않은 MDCK 세포에서는 TIMP1 발현 정도가 거의 없었다. MDCK-ASBT 세포에서는 TIMP1 발현양이 대조군보다 확실하게 높은 것을 확인하였으며 시간이 경과할수록 더욱더 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 상기 TIMP1 RNA 발현카세트:PS/HA-TCA 입자 1.2가 MDCK-ASBT 세포의 ASBT 수용체에 의해 흡수되었는지를 확인하기 위하여 TCA를 고농도로 전처리한 후 상기 TIMP1의 발현 정도를 확인한 결과, HA-TCA 복합입자 1.2의 MDCK-ASBT 세포 흡수가 확연히 줄어든 것을 확인할 수 있었다.
따라서 본 발명의 [RNA 발현카세트:PS]/HA-TCA 복합입자는 세포독성이 매우 낮으며 소장 말단을 통해 장간 순환으로 진입할 수 있음을 확인하였다.
실시예 10. HA-압타머 복합입자의 암세포 표적화 분석
상기 [MMP1 RNA 발현카세트:PS]/HA 복합입자 1.1과 [MMP1 RNA 발현카세트:PS]/HA-Apt_EGFR 복합입자가 형질주입된 세포에서 EGFR의 발현정도에 따라 MMP1 발현에 미치는 영향 평가를 하였다. 본 실시예에 사용한 세포주는 EGFR+ 세포주로 <폐암 세포주 A549, 대장암 세포주 SW48 및 피부암 세포주 A431>; 그리고 EGFR- 세포주로 <유방암 세포주 MDA-MB-453, 대장암 세포주 HT-29 및 신경모세포종 세포주 SK-N-MC>이다.
40mm 세포 배양 접시에 2㎖의 배양액을 넣고, 세포를 약 1.2x105의 농도로 접종한 후, 37℃, 5% CO2 환경에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 실시예 2에서 제조된 [MMP1 RNA 발현카세트:PS]/HA 복합입자 1.1과 [MMP1 RNA 발현카세트:PS]/HA-Apt_EGFR 복합입자를 포함한 배지로 교체하여 6시간 배양한 후 신선한 배지로 교체하여 3일간 배양하였다.
이후 배양액을 수확하여 4℃, 7500rpm 환경에서 5분간 원심분리하여 ELISA 방법을 이용하여 배양 배지 중에 분비된 TIMP 농도는 각각의 RNA 발현카세트의 각각의 농도에 대해 형질주입한 후 0, 6, 12, 24, 및 48시간째에 3회 측정된다. 형질주입된 세포들로부터의 MMP1의 분비는 MMP1 Human Instant ELISA™ KiT(인비트로겐, 미국)를 사용하여 정량하였다.
도 21a을 살펴보면, 상기 EGFR 리간드가 없는 [MMP1 RNA 발현카세트:PS]/HA 복합입자 1.1은 EGFR+ 폐암 세포주 A549 세포, 대장암 세포주 SW48 및 피부암 세포주 A431에서 거의 발현이 없었으며, EGFR- 유방암 세포주, MDA-MB-453, 대장암 세포주 HT-29 및 신경모세포종 세포주 SK-N-MC에서는 MMP1의 발현 정도는 높았다.
도 21b을 살펴보면, 상기 EGFR 리간드가 있는 [MMP1 RNA 발현카세트:PS]/HA-Apt_EGFR 복합입자는 EGFR+ 폐암 세포주 A549 세포, 대장암 세포주 SW48 및 피부암 세포주 A431에서는 MMP1 발현 정도는 상대적으로 높았으며, EGFR- 유방암 세포주, MDA-MB-453, 대장암 세포주 HT-29 및 신경모세포종 세포주 SK-N-MC에서는 거의 측정할 수 없었다.
이러한 세포독성 결과는 상기 암세포에 EGFR 표적 분자의 유무에 따라 선택적으로 EGFR 리간드가 있는 [MMP1 RNA 발현카세트:PS]/HA-Apt_EGFR 복합입자 전달하여 MMP1 발현을 유도한다는 것을 나타낸다. 평균 ± 표준편차(n = 5).
상기 결과들은 선택된 mRNA에만 한정된 것이 아니라 다른 mRNA에서도 일반적으로 관찰되었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
10: 기본 복합입자 20: 복합입자
21: 양이온성 화합물층 22: 음이온성 화합물층

Claims (36)

  1. (a) 유효성분으로써 핵산에서 선택되어진 한 종류 또는 2종류 이상;
    (b) 양이온성 화합물에서 선택되어진 2종류 이상; 및
    (C) 음이온성 화합물에서 선택되어진 한 종류 또는 2종류 이상;을 포함하며
    여기서, 상기 유효성분, 양이온성 화합물 및 음이온성 화합물은 정전기적 상호작용에 의해 복합입자를 형성하고, 상기 유효성분은 형성된 복합입자 구조에 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도.
  2. (a) 유효성분으로써 세포 번역이 가능한 구조가 있는 mRNA 발현카세트에서 선택되어진 한 종류 또는 2종류 이상;
    (b) 양이온성 화합물으로 양이온성 지질, PACE-based cationic polymers, 양이온성 폴리펩타이드 및 양이온성 다당류으로 이루어진 군에서 선택되어진 한 종류; 및
    (C) 음이온성 화합물에서 선택되어진 한 종류 또는 2종류 이상;을 포함하며
    여기서, 상기 유효성분, 양이온성 화합물 및 음이온성 화합물은 정전기적 상호작용에 의해 복합입자를 형성하고, 상기 유효성분은 형성된 복합입자 구조에 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도.
  3. 제1항에 있어서, 상기 핵산은
    (a) antisense, DNA aptamers 및 gene therapy를 포함하는 DNA Therapeutcs; 및
    (b) mRNA, micro RNAs, RNA aptamer, short interfering RNAs, ribozymes, RNA decoys 및 circular RNAs를 포함하는 RNA therapeutics;를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도.
  4. 제2항에 있어서, 상기 세포 번역이 가능한 구조가 있는 mRNA 발현카세트는
    비증폭 mRNA(non-amplifying mRNA) 구조체; 및
    자가 증폭 mRNA(self-amplifying mRNA) 구조체;를 포함하는 RNA 구조체에서 선택되어진 어느 하나 이상을 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도.
  5. 제4항에 있어서, 상기 비증폭 mRNA 구조체는
    (a) 상기 표적 폴리펩타이드를 코딩하는 ORF(open reading frame):
    (b) 5' UTR;
    (C) 3' UTR; 및
    (d) 5' 캡 구조(Cap structure) 또는 IRES(internal ribosome entry site);를 포함하는, 폴리펩타이드를 코딩하는 단리된 RNA 구조체를 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도.
  6. 제4항에 있어서, 상기 자가 증폭 mRNA 구조체는
    (a) RNA dependent RNA polymerase(RdRp)를 발현시키기 위한 mRNA 구조; 및
    (b) 상기 RdRp에 의해 복제될 수 있고 상기 관심 대상 폴리펩타이드를 코딩하는 ORF;를 포함하는 mRNA 레플리콘(replicon)을 포함하며,
    여기서, 상기 두 종류의 구성요소가 동일한 한 개의 RNA에 있는 시스-레플리콘 RNA 구조체 또는 각각 상이한 두 개의 RNA에 있는 트렌스 레플리콘 RNA 구조체를 포함하는 것을 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도.
  7. 제2항 내지 제6항에 있어서, 상기 RNA 발현카세트는
    당 변형, 염기 변형, 백본 변형 및 지질 변형을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 포함하는 화학적 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도.
  8. 제2항 내지 제7항에 있어서, 상기 RNA 발현카세트는
    G/C 함량, 코돈 최적화(optimization), UTR 변형, 30개 초과의 아데노신 뉴클레오타이드를 갖는 폴리(A) 꼬리, 폴리(C) 서열, 5'캡(CAP) 구조 및 히스톤-스템-루프 서열을 포함하는 염기서열 변형으로부터 선택된 적어도 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도.
  9. 제2항 내지 제8항에 있어서, 상기 RNA 발현카세트는 콜레스테롤(Cholesterol)과 비공유결합 또는 공유결합을 하는 것을 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도.
  10. 제2항에 있어서, 상기 mRNA는,
    치료용 단백질, 펩타이드, 융합 단백질, 항원 및 항체를 포함하는 군에서 선택된 어느 하나를 코딩하는 ORF를 포함하는 것을 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도.
  11. 제10항에 있어서, 상기 치료용 단백질은
    세포외 기질 분해효소 및 상기 분해효소 저해물질로 이루어진 MSECM 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도.
    여기서, MSECM은 ECM의 구조를 변형할 수 있는 폴리펩타이드를 지칭한다.
  12. 제11항에 있어서, 상기 세포외 기질 분해효소는
    (a) 히알루로니다아제(Hyaluronidase, HAase); 및
    (b) Matrix metalloproteinases(MMP)를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도.
  13. 제12항에 있어서, 상기 분해효소 저해물질은
    TIMP를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나를 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도.
  14. 제1항에 있어서, 상기 양이온 화합물은
    양이온성 지질, PACE-based cationic polymers, 양이온성 폴리펩타이드 및 양이온성 다당류를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도.
  15. 제2항 및 제14항에 있어서, 상기 양이온 폴리펩타이드는
    프로타민(Protamine), 세포투과 펩타이드(Cell penetrating peptide (CPP)), 키메릭 CPP(Chimeric CPP), pH 의존성 CPP, 뉴클레오린(nucleoline), 스페르민(spermine), 스페르미딘(spermidine), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine (PLL)), 염기성 폴리펩타이드(basic polypeptide), 폴리-아르기닌(poly-arginine), 트랜스포탄(Transportan), MPG 펩타이드(MPG peptide), HIV(인간 면역결핍 바이러스)-결합 펩타이드(HIV(Human Immunodeficiency Virus)-binding peptide), 트랜스-액티베이팅 트랜스크립셔널 액티베이터(Trans-activating Transcriptional aCtivator, tat), HIV-1 tat (HIV), tat-유래 펩타이드(tat-derived peptide), 올리고아르기닌, 페네트라틴 패밀리 구성원(penetratin family member), 페네트라틴(Penetratin), 안테나페디아-유래 펩타이드(Antennapedia-derived peptide), 드라소필라 안테나페디아 펩티드(Drosophila Antennapedia peptide, pAntp), 아일렛-1 펩티드(Islet-1 peptide, pIsl), 항균물질-유래 CPP(antimicrobial-derived CPP), 부포린-2(Buforin-2), 박테네신 7 펩티드 단편 15-24(bactenecin 7 peptide fragment 15-24, Bac715-24), 신사이틴(syncytin B, SynB), SynB(1), 혈관 내피 캐드헤린 유래 세포 투과 펩티드(vascular endothelial cadherin derived cell penetrating peptide, pVEC), 인간 칼시토닌(human calcitonin, hCT)-유래 펩타이드, 스윗 애로우 펩티드(sweet arrow peptide, SAP), 모델 양친매성 펩티드(model amphipathic peptide, MAP), KALA, PptG20, 프롤린-풍부 펩타이드(Proline-rich peptide), 롤리고미어(Lologomere), 아르기닌-풍부 펩타이드(Arginine-riCh peptide), 칼시토닌-펩타이드(Calcitonin-peptide), 섬유아세포 성장 인자(Fibroblast growth faCtors, FGF), 락토페린(Lactoferrin), 히스톤(histone), VP22 펩타이드(VP22 peptide), 단순포진 바이러스(Herpes simplex virus, HSV), VP22(단순포진(Herpes simplex)), 단백질 형질도입 도메인(protein Transduction domain(PTD), 라이신-풍부 펩타이드(lysine-rich peptide), Pep-1, L-올리고머(L-oligomer)를 포함하는 양이온 폴리펩타이드에서 선택되어진 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도.
  16. 제2항 및 제14항에 있어서, 상기 양이온성 다당류는
    (a) 키토산, 글리코키토산 및 인위적으로 유도된 양이온 다당류;
    (b) 답즙산 또는 답즙산 유도체가 공유결합한 양이온성 분자; 및
    (C) 양이온성 다당류 유도체 또는 염 및 이들의 조합;을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 1종 이상을 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도.
  17. 제1항에 있어서, 상기 선택되어진 어느 한 양이온성 화합물은
    선택된 다른 양이온성 화합물들에 대해 10~100%(몰비)를 포함하는 것을 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도.
  18. 제1항 내지 제2항에 있어서, 상기 음이온성 화합물은
    (a) 카르복실기, -OSO3H 기, -SO3H 기, 포스페이트 기 및 이의 염으로부터 선택된 관능기를 갖는 다당류 및 이의 유도체;
    (b) 음으로 하전된 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 함유하는 폴리 아미노산;
    (C) 카르복실 측쇄를 갖는 PEG 유도체;
    (d) 카르복실기, -OSO3H 기, -SO3H 기, 포스페이트 기 및 이들의 염으로부터 선택된 관능기를 갖는 합성 폴리머;
    (e) 카르복실기, -OSO3H 기, -SO3H 기, 포스페이트 기 및 이의 염; 및
    (f) 임의로 치환된 아미노기, 암모늄기 또는 이의 염으로부터 선택된 관능기를 갖는 폴리머 및 이들의 조합;를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도.
  19. 제18에 있어서, 상기 음이온성 화합물은
    (a) 실크 단백질 피브로인 (Silk protein fibroin), 글라이아딘 (Gliadin) 및 알부민를 포함하는 음이온성 단백질;
    (b) 폴리글루타민산 및 폴리아스파르트산을 포함하는 음이온성 폴리아미노산;
    (c) 한천, 히알루로난, 콘드로이틴 설페이트, 덱스트란 설페이트, 헤파란 설페이트, 데르마탄 설페이트, 푸코이단, 케라탄 설페이트, 헤파린, 카라기난, 석시노글루칸, 아라비아 고무, 잔탄 검, 알긴산, 펙틴 및 카르복시메틸 셀룰로오스 및 이들의 변형체를 포함하는 음이온성 다당류;
    (d) 폴리아크릴산; 및
    (e) 인위적으로 유도된 음이온 다당류 및 이의 염; 를 포함하는 군에서 선택된 1종 이상을 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도.
  20. 제18항 내지 제19항에 있어서, 상기 음이온성 화합물은
    혈청알부민, 히알루론산(hyaluronic acid, HA) 또는 이의 변형체;를 포함하는 복합입자 및 이의 용도.
  21. 제1항 내지 제20항에 있어서, 상기 선택되어진 어느 한 음이온성 화합물은
    선택된 다른 음이온성 화합물들에 대해 10~100%(몰비)를 포함하는 것을 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도.
  22. 제1항 내지 제21에 있어서, 고분자 약물, 약물을 포함하는 고분자 약물 및 형광물질을 포함하는 고분자를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도.
  23. 제22항에 있어서, 상기 고분자 약물은
    단백질, 항체 및 핵산을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도.
  24. (a) 히알루로니다아제(Hyaluronidase, HAase) 및 MMP를 포함하는 세포외 기질(ECM) 분해효소 그리고 TIMP와 상기 분해효소의 기질을 포함하는 상기 분해효소 저해 폴리펩타이드;를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 코딩하는 MSECM RNA 발현카세트; 및
    (b) 상기 양이온성 화합물에서 선택되어진 어느 하나 이상;을 포함하며
    (C) 상기 RNA 발현카세트 및 양이온성 화합물은 정전기적 상호작용에 의해 복합입자를 형성하고, 상기 RNA 발현카세트는 형성된 복합입자 구조에 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도.
  25. (a) 히알루로니다아제(Hyaluronidase, HAase) 및 MMP를 포함하는 세포외 기질(ECM) 분해효소 그리고 TIMP와 상기 분해효소의 기질을 포함하는 상기 분해효소 저해 폴리펩타이드;를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 코딩하는 MSECM RNA 발현카세트;
    (b) 상기 양이온성 화합물에서 선택되어진 어느 하나 이상; 및
    (C) 상기 음이온성 화합물에서 선택되어진 어느 하나 이상: 을 포함하며
    여기서, 상기 RNA 발현카세트 및 양이온성 화합물은 정전기적 상호작용에 의해 복합입자를 형성하고, 상기 RNA 발현카세트는 형성된 복합입자 구조에 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도.
  26. (a) 약물; 및
    (b) 제24항 내지 제25에서 제조한 복합입자;를 포함하는 것을 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도.
  27. 제26항에 있어서, 상기 약물은
    단백질 의약품(protein drugs), 항체(antibody), 소분자 화합물(small moleCules), 압타머(Aptamer), mRNA, RNAi, antisense 또는 세포 치료제인 것을 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도.
  28. 제24항 내지 제27항에 있어서, 상기 복합입자를 먼저 투여하고,
    순차적으로 다른 약물을 투여하는 것을 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도.
  29. 제1항 내지 제28항에 있어서,
    상기 입자의 최외각층을 구성하는 폴리머 또는 그와 결합한 리간드에 의한 능동적 약물 전달체를 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도.
  30. 제1항 내지 제29항에 있어서,
    상기 복합입자의 치료적 유효량을 개체에게 투여하고, 이에 의해 질병을 치료하는 과정을 포함하는 이를 필요로 하는 개체에서 질병을 치료하는 복합입자 및 이의 용도.
  31. 제1항 내지 제30항에 있어서, 상기 복합입자는
    주사제, 크림 및 구강 점막 투여로 이루어진 군에서 선택된 1종을 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도.
  32. 제1항 내지 제31항에 있어서, 상기 복합입자는
    상기 핵산과 양이온성 화합물이 기본 복합입자를 형성하고, 상기 음이온성 화합물이 외각층을 형성하는 것을 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도.
  33. 제1항 내지 제32항에서 상기 복합입자는
    상기 핵산, 양이온성 화합물 및 음이온성 화합물이 혼합된 것을 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도.
  34. 제1항 내지 제33항에서 상기 복합입자는
    초음파 발생기(sonicator) 및 가압 압출기(extruder)를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 사용하여 제조하는 것을 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도.
  35. 제1항 내지 제34항에 있어서, 상기 복합입자는 hydrogel을 특징으로 하는 복합입자 및 이의 용도
  36. MSECM mRNA 발현카세트를 포함하는 복합입자 및 이의 용도
KR1020210018173A 2020-12-24 2021-02-09 세포 번역이 가능한 구조를 갖는 rna 발현카세트를 유효성분으로 하는 복합입자 및 이의 용도 KR20220092764A (ko)

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