KR20220138309A - 면역세포를 표적화하고 관심 mRNA가 봉입된 구조체, 이의 용도 및 이의 제조방법 - Google Patents

면역세포를 표적화하고 관심 mRNA가 봉입된 구조체, 이의 용도 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생체 내에서 순환하는 두 종류 이상의 면역세포를 재프로그래밍하는 기술로 질병 관련 항원을 인식하기 위해 순환하는 면역세포의 일시적인 재프로그래밍을 위한, 관심 mRNA가 봉입된 면역세포 표적화 구조체, 이의 용도 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

면역세포를 표적화하고 관심 mRNA가 봉입된 구조체, 이의 용도 및 이의 제조방법{Structures targeting immune cells and encapsulating the mRNA of interest, its use, and its preparation method}
본 발명은 고형암을 구성하는 ECM 분해 및 면역종양 치료 기술을 제안하고 있다. 구체적으로 ECM 분해 또는/및 생체 내에서 두 종류 이상의 순환하는 면역세포를 프로그래밍하는 기술로 질병 관련 항원을 인식하기 위해 순환하는 면역세포의 일시적인 재프로그래밍을 하는 관심 mRNA가 봉입된 면역세포 표적화 구조체, 이의 용도 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
환자 또는 기증자로부터 채취하는 면역세포 치료제로 암이나 감염원을 관심으로 하기 위한, 유전적으로 변형되는 강력한 방식인 입양 면역세포 요법의 효능은 인상적인 결과를 보여주는 수많은 임상시험에 의해 뒷받침되고 있다. 그러나 표준화된 형태로 대량으로 약물을 준비하는 것이 거의 불가능하고 각 환자를 위한 맞춤형 면역세포치료제를 제조하는 데 수반되는 복잡성과 높은 비용으로 인해 소분자 약물 또는 단일 클론 항체와 같은 최전선 치료 옵션과 경쟁하기가 어려운 상황이다.
현재 면역세포 치료제를 대표하는 CAR-T 및 TCR 조작 T 세포는 현재 다음을 포함하는 번거로운 과정으로 제조된다. (i) 백혈구 채취법으로 몇 시간 동안 두 개의 정맥 튜브로 연결된 환자로부터 T 세포를 추출한다. 이는 환자에게 불편하고 상당한 금전적 비용이 발생하며 궁극적으로 자가 T 세포의 대규모 채택에 대한 속도 제한이 될 수 있다. (ii) T 세포의 활성화 및 형질 도입; (iii) 사이토카인이 보충된 조직 배양 배지에서 대략 2주 동안 형질 도입된 T 세포의 확장; (iv) 투여 전 T 세포 세척 및 농축. 중앙 시설에서 만들어지고 원격 치료 센터로 운반되는 T 세포 제품의 경우 세포를 냉동 보존해야 한다. (v) CAR-T 제품의 각 배치에 대해 품질 관리 방출 분석이 필요하다. 전체 프로세스는 유지 관리 및 실행 비용이 많이 드는 환경적으로 제어되는 GMP 준수 조건에서 수행되어야 한다. 각 CAR-T 제품은 치료할 환자의 출발 물질 (T 세포)로 만들어지기 때문에 규모의 경제가 없다.
시험관 내 전사 (IVT) mRNA는 치료적으로 관련된 관심 단백질을 생체 내에서 직접 인코딩하는 데 사용할 수 있는 혁신적인 신약 클래스로 등장하였다. 합성 mRNA 분자는 비교적 적은 비용으로 효율적이고 빠르게 설계 및 조작되고 대량 생산될 수 있다. 지난 수십 년 동안 과학자들은 mRNA를 약리학적 및 면역학적으로 최적화하여 임상 적용을 위한 약물과 유사하게 만드는 방법을 개발 중이다.
현재의 유전자 전달을 통해 CAR 또는 TCR을 림프구에 삽입하는 것은 현재 환자의 신체 외부, 특수 제조실에서 발생하지만, 세포를 클린룸으로 이동하는 과정과 유전자 전달 절차 자체 모두 노동 집약적이고 비용과 시간이 많이 든다. 조작된 T 세포 또는 NK 세포 요법이 다양한 암 유형에 걸쳐 다양한 집단으로 확장될 것이라는 약속에 도달하면 경제 및 제조 문제가 커질 것이다.
질병 특이적 수용체를 일시적으로 발현하도록 체내 순환 면역세포를 유전적으로 재프로그래밍하기 위해 환자로부터 순환하는 면역세포를 추출 및 배양할 필요성이 없는 약물로서 mRNA 치료제를 개발할 필요성이 있다.
본 발명에서 체내 순환 한 종류 또는 두 종류 이상의 면역세포를 선택적으로 표적화하며, 관심 mRNA를 봉입하는 구조체 특히, 지질나노입자, 고분자 전해질 복합체(polyelectrolyte complexes, PEC) 또는 다층 고분자 전해질(polyelectrolyte multilayer, PEM)을 제조하고 이를 균질화한 면역세포 표적화 나노입자를 제공하는 기술을 완성하였다.
본 발명에서 생체 재료 및 전달 전략에 중점을 두고 관심 mRNA 기반 치료제의 임상 사용을 위해 관심 mRNA 기반 치료의 임상 사용을 용이하게 할 수 있는 전달체에 대한 연구를 하여, 단백질 요법, 유전자 편집 및 예방 접종에 대한 관심 mRNA 기반 전달의 응용 프로그램을 개발하였다.
본 발명의 목적은 고형암을 구성하는 ECM 분해 및 면역종양 치료이다. 구체적으로 생체 내에서 한 종류 또는 두 종류 이상의 면역세포를 재프로그래밍하는 기술로 질병 관련 항원을 인식하기 위해 순환하는 면역세포의 일시적인 재프로그래밍을 하는 한 종류 또는 두 종류의 관심 mRNA가 봉입된 면역세포 표적화 구조체, 이의 용도 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 의해 해결하고자 하는 목적은 관심 mRNA의 생체내 안정성 및 담체의 무독성과 생체 분해성을 확보하기 위해서, 관심 mRNA 및 양이온성 생체적합성 폴리머를 함유하는 면역세포 표적화 구조체의 제조에 적합한 신규의 기술을 제공하는 것이다.
바람직하게, 상기 구조체에 음이온성 생체적합성 폴리머를 포함할 수 있다.
본 발명의 목적은 상기 문제점을 포함한 추가적인 다양한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 고형암을 구성하는 ECM 분해 및 보다 효율적인 한 종류 또는 두 종류 이상의 관심 mRNA을 포함하고 체내에서 한 종류 또는 두 종류 이상의 면역세포를 표적화하는 구조체 및 이를 이용한 높은 치료 성적을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 생체 내에서 두 종류 이상의 면역세포를 프로그래밍하는 기술로 질병 관련 항원을 인식하기 위해 순환하는 면역세포의 일시적인 유전적 재프로그래밍을 위한, 상기 한 종류 또는 두 종류 이상의 관심 mRNA가 봉입된 면역세포 표적화 구조체, 이의 용도 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
바람직하게, 상기 구조체에 음이온성 생체적합성 폴리머를 포함할 수 있다.
본 발명에서 제안하는 관심 mRNA가 봉입된 면역세포 표적화 구조체는 관심 mRNA를 구조체 내부에 봉입하는 면역세포 표적화 지질 복합체 및 그리고 이들을 균질화하여 제조된 면역세포 표적화 지질 나노입자를 포함하고 입자 형태를 갖는다.
본 발명에서 제안하는 관심 한 종류 또는 두 종류 이상의 mRNA가 봉입된 면역세포 표적화 구조체는 바람직하게, 나노입자, 고분자 전해질 복합체(polyelectrolyte complex, PEC) 및 면역세포 표적화 다층 고분자 전해질(polyelectrolyte multilayer, PEM) 그리고 이들을 균질화하여 제조된 면역세포 표적화 다층 고분자 전해질 나노입자(polyelectrolyte multilayer nanoparticles, PEMN)를 포함하고 입자 형태이거나 막 형태일 수 있다.
본 발명은 생체 내에 순환하는 면역세포 표적화 PEC, PEM 및 PEMN을 포함하는 폴리머나노입자(Polymer Nanoparticle, PNP)를 사용하여 상기 면역세포를 원하는 형질을 갖도록 프로그래밍하는 기술을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 표적화 구조체, 특히, 구조체의 최외각 층을 구성하는 폴리머에는 면역세포에 특이적으로 결합하는 리간드가 있어, 본 발명의 구조체는 특정 면역세포와 특이적인 결합을 할 수 있다. 이런 구조체를 면역세포 표적화 구조체라고 하였다.
서로 다른 면역세포를 인지하는 리간드를 사용하여 제작된 표적화 구조체로 이종 순환하는 면역세포를 각각 프로그래밍할 수도 있다. 예를 들어 T 세포와 NK 세포를 인지하는 리간드로 제조된 구조체를 체내로 혼합 투여하거나 순차적으로 투여하여 T 세포와 NK 세포를 각각 프로그래밍할 수도 있다.
면역세포는 면역 체계의 일부이며 신체가 감염 및 기타 질병과 싸우는 데 도움이 되는 세포이다. 면역세포는 골수에 있는 줄기세포에서 발생하며 호중구, 호산구, 호염기구, 비만 세포, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 자연 살해(NK) 세포 및 림프구 (B 세포 및 T 세포)가 포함된다.
바람직하게, 본 발명의 면역세포는 T 세포 및 NK 세포를 의미할 수도 있다.
본 발명은 면역세포를 표적화하기 위해, 최외각 층에 면역세포에 특이적 결합을 하는 리간드를 포함하는 면역세포 표적화 PEMN을 제공하는 것이다.
바람직하게, 본 발명에서 면역세포가 T 세포 경우는 예시적으로 CD8, NK 세포 경우는 예시적으로 CD56 또는 CD16에 특이적으로 결합하는 리간드를 사용하는 방법을 제공한다.
상기 리간드는 면역세포의 세포막의 외부 표면에 특이적 결합하는 항체, 압타머 및 펩타이드를 포함한다.
본 발명에서 면역세포 표적화 PEMN의 최외각 층을 구성하는 폴리머와 리간드의 결합은 하기와 같다. 본 발명에서 면역세포 표적화 PEMN의 최외각 층을 구성하는 폴리머는 양이온성 또는 음이온성 폴리머일 수 있다.
본 발명의 면역세포 표적화 PEMN의 제조방법 또한 제공된다. 하나의 예로 (a) 음이온성 폴리머-링커 화합물과 리간드-링커 화합물을 포함하는 군을 각각 준비하는 단계; (b) 상기 (a) 군에서 선택된 두 개의 화합물에 의해 형성된 음이온성 폴리머-링커-리간드 화합물들의 군을 준비하는 단계; 및 (c) 상기 (b)군으로부터 준비된 한 종류의 음이온성 폴리머-리간드 화합물과 양이온성는 폴리머 군에서 선택된 폴리머, 관심 mRNA를 준비하는 단계로 이루어진 방법이다.
본 발명의 면역세포 표적화 PEMN의 제조방법 또한 제공된다. 하나의 예로 (a) 양이온성 폴리머-링커 화합물과 리간드-링커 화합물을 포함하는 군을 각각 준비하는 단계; (b) 상기 (a) 군에서 선택된 두 개의 화합물에 의해 형성된 양이온성 폴리머-링커-리간드 화합물들의 군을 준비하는 단계; 및 (c) 상기 (b)군으로부터 준비된 한 종류의 폴리머-리간드 화합물과 관심 mRNA를 준비하는 단계로 이루어진 방법이다.
상기 관심 mRNA는 키메라 항원 수용체(CAR), T 세포 수용체(TCR) 및 면역세포들의 활성을 올릴 수 있는 기능 촉진 인자들에서 선택될 수 있다.
바람직하게, 기능 촉진 인자는 CD40, OX40 및 4-1BB를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명은 상기 면역세포 표적화 PEMN을 의약품으로써 구성성분의 생분해성 및 생체적합성, 관심 mRNA의 생체 안정성, 반복 투여 및 유효탑재량(payload)를 고려한 운반체를 제공하는 것이다.
본 발명의 관심 mRNA는 백본(backbone), 당 또는 염기가 화학적으로 변형되거나 말단이 수식된 폴리뉴클레오타이드 유도체 등의 관심 mRNA, 즉 음이온성 약물로서 등 매우 다양한 물질이 있으며 관심 mRNA 전달체로서 안정성 및 제조 수율이 증가된 제형 및 그 제조방법을 제공하고자한다.
본 발명은 주로 관심 mRNA, 양이온성 생체적합성 폴리머, 특히 프로타민(PS), 키토산, 세포투과성 펩티드(CPP) 또는 이들의 유도체 그리고 음이온성 생체적합성 폴리머, 특히 인간혈청알부민, 히알루론산 또는 이들 다당류의 유도체와의 상호작용에 의존하는 면역세포 표적화 PEMN을 제공하고자 한다.
본 발명은 주로 관심 mRNA, 양이온성 생체적합성 폴리머 및 음이온성 생체적합성 폴리머의 상호작용에 의존하는 관심 mRNA PEMN을 제공할 수 있으며, 상기 3종류의 물질 군에서 각각 1종보다 2종 이상을 선택하여 면역세포 표적화 PEMN의 약물 성질을 우수하게 하는 방법을 제공하고자 한다.
관심 mRNA과 양이온 폴리머를 혼합하여 이들 간의 정전기적 상호작용으로 제조된 코어입자 및 상기 제조된 코어입자와 음이온성 폴리머를 혼합하여 이들 간의 정전기적 상호작용으로 면역세포 표적화 PEC을 제조하는 방법; 및
관심 mRNA, 양이온 폴리머 및 음이온성 폴리머를 혼합하여 이들 간의 정전기적 상호작용으로 면역세포 표적화 PEC을 제조하는 방법; 및
관심 mRNA, 양이온 폴리머 및 음이온성 폴리머를 교대로 기판에 잉크젯을 포함한 다양한 layer by layer 증착기술로 제조되고 용출하여 면역세포 표적화 PEM을 제조방법;을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나로 특징으로 하는 면역세포 표적화 PEM의 제조방법을 제공하고자한다.
상기 제조된 PEC 및 PEM을 균질화하여 면역세포 표적화 PEMN(Polyelectrolyte multilayer nanoparticles)를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 PEMN, 이의 용도 및 이의 제조방법을 제공하고자한다.
상기 PEC 제조 단계에서 진탕 및 초음파 처리를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 실시하는 것을 특징으로 하는 면역세포 표적화 PEMN 및 이의 제조방법을 제공하고자한다.
본 발명의 면역세포 표적화 PEMN의 입자 크기는 10 내지 1000 nm일 수 있고, 더욱 구체적으로는 상기 면역세포 표적화 PEMN은 입자크기가 50 ~ 400 나노미터이고 다분산지수 (PDI)는 0.3 이하를 특징으로 하는 면역세포 표적화 PEMN 및 이의 제조방법을 제공하고자한다.
또한, 상기 본 발명의 면역세포 표적화 PEMN의 표면 전하는 -50 내지 50 mV일 수 있고, 더욱 구체적으로 -40 내지 40 mV일 수 있다.
상기 면역세포 표적화 PEMN을 제조하는 단계는 압출 균질화, 상류 압력 균질화, 고압 균질화 및 초고압 균질화를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 특징으로 하는 PEMN 및 이의 제조방법을 제공하고자한다.
상류 압력은 20 ~ 60 MPa이고, 고압은 최대 150 ~ 200 MPa이며, 초고압은 최대 350 ~ 400 MPa;일 수 있다.
상기 면역세포 표적화 PEMN에서 유효성분이 관심 mRNA이 일정한 속도를 방출되는 것을 특징으로 하는 면역세포 표적화 PEMN 및 이의 제조방법을 제공하고자한다.
관심 mRNA 기반 요법에 사용되는 폴리머 중에서, 본 발명자들은 관심 mRNA 전달에 매우 적합한 적용 가능한 특성을 강조하기 위해 본 발명은 생분해성 및 생체 적합성이 있는 Protamine(PS), 키토산과 세포 침투성 펩티드(CPP)와 같은 양이온성 생체적합성 폴리머 그리고 히알루론산 및 알부민 같은 음이온성 생체적합성 폴리머를 선택하였다.
PS, 키토산과 CPP와 같은 양이온성 생체적합성 폴리머는 관심 mRNA과 정전기적으로 상호 작용하여 안정적으로 양으로 하전된 폴리플렉스를 형성할 수 있으며, 중성 및 음이온성 생체적합성 폴리머는 종종 관심 mRNA과 보다 효율적인 상호 작용을 선호하기 위해 다른 성분의 존재를 필요로 한다. 음이온성 생체적합성 폴리머는 점막 점착성 폴리머이지만, 반대 전하를 가지고 있어 관심 mRNA 전달에 그 사용에 크게 영향을 미친다. 이러한 중요한 차이는 화학적 구조로부터 유래하는데, 이는 프로타민의 염기성 아미노산, 특히 아르기닌(arginine) 단량체에서 양으로 하전된 구아니디노(guanidino) 그룹 또는 히알루론산의 글루쿠론산 단위에서 음으로 하전된 카복실 기로 제공할 수 있다.
본 발명에서 추가적으로 관심 mRNA 전달물의 향상된 안정성을 제공하고, 면역계에 의해 면역세포 표적화 PEMN의 인식을 방지하는 생분해성 및 생체 적합성 음이온성 생체적합성 폴리머를 사용하며, 상기 음이온성 생체적합성 폴리머의 말단에 특히나 친수성 중합체 사슬(예를 들면, PEG-단량체)의 가역적 첨가로 응집작용에 대해 향상된 저항성을 부여할 수도 있다.
본 발명의 면역세포 표적화 PEMN을 구성하는 PS와 CPP와 같은 양이온성 폴리펩타이드는 비록 꽤 작은 비독성 단량체 단위를 이루고 있음에도 불구하고 관심 mRNA 전달물 및 복합체 안정성의 강한 축합을 제공하는 정해진 사슬 길이를 갖는 양이온의 바인딩 서열(cationic binding sequence)을 형성한다.
본 발명의 면역세포 표적화 PEMN을 구성하는 음이온성 생체적합성 폴리머의 PEG-코팅은 그것의 말단에 친수성 코팅으로 상기 전달체를 덮고(coat), 이는 염-매개 응집작용 및 혈청 내용물들과의 원하지 않는 상호작용을 예방할 수 있다. 세포기질 내에서 이러한 코팅은 세포의 환원 상태하에서 쉽게 제거된다. 역시, 이러한 효과는 세포기질 내에서 관심 mRNA 전달물의 유도를 향상시킨다.
본 발명의 PEM은 고분자 전해질, 다층 고분자 전해질, 나노 겔, 하이드로 젤 및 중합체 미셀에 해당한다. 본 발명의 면역세포 표적화 PEMN의 입자 크기 및 표면 전하가 상기 수준을 유지할 경우, 면역세포 표적화 PEMN 구조의 안정성 및 구성성분들의 함량과 체내에서 관심 mRNA의 흡수도 및 약제학적 조성물로서 멸균의 편의성 면에서 바람직하다.
고형암은 종양 세포뿐만 아니라 혈관계, 세포 외 기질(extracellular matrix, ECM), 기질 및 면역 세포로 구성된 복잡한 기관 유사 구조로. 종종이 종양 미세 환경(TME)은 전체 종양 질량의 더 큰 부분을 차지할 수도 있다. TME의 다른 구성 요소와 마찬가지로 고형 종양의 ECM은 정상 기관의 ECM과 크게 다른다. 종양 내 신호 전달, 전달 메커니즘, 대사, 산소화 및 면역 원성은 ECM에 의해 제어되지 않으면 강력한 영향을 받는다. 이 조절 제어를 발휘하는 ECM은 종양의 악성 종양 및 성장뿐만 아니라 치료에 대한 반응에도 영향을 미친다.
본 발명에 기재된 치료 프로토콜은 또한 치료 부위, 고형암에서 ECM을 분해하는 것을 포함할 수 있다. 상기 ECM의 분해는 ECM을 구성하는 분자의 분해효소 또는 이들을 코딩하는 mRNA를 이용할 수 있다. 치료 부위에서 ECM을 분해하는 것은 치료되는 대상체의 ECM에 의한 종양 억압을 극복할 수 있으며 바이오의약품의 종양 부위로 유입을 촉진할 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 약물전달용 조성물을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물이 제공된다.
본 발명은 고형암을 구성하는 ECM의 분해 및 면역종양 치료의 전략을 제안하고 있다. 한 종류 또는 두 종류 이상의 관심 mRNA를 엔지니어링하면 관심 치료를 위한 질병 특이적 면역세포를 생성하는 데 도움이 되지만, 생체 외에서 조작된 면역세포를 제조하는 것과 관련된 비용과 엄격함은 엄청날 수 있으므로 생체 내에서 순환하는 한 종류 또는 두 종류 이상의 면역세포를 재프로그래밍하는 것이 대안일 수 있다. 실행 가능한 대안으로 질병 관련 항원을 인식하기 위해 순환하는 면역 세포의 일시적으로 재프로그래밍을 위한 시험관내 전사(IVT) 관심 mRNA를 제공하는 주사 가능한 표적화 구조체를 개발하였다. 면역세포의 생체 공학. 제조, 유통 및 관리의 용이성을 감안할 때 이러한 면역세포 표적화 구조체 및 관련 플랫폼은 광범위한 질병에 대한 치료제가 될 수 있다.
도 1은 생체 내에서 순환하는 NK 세포 또는 NK 세포를 포함한 두 종류 이상의 면역세포를 한 종류 또는 두 종류 이상의 관심 ORF(open reading frame)를 포함하는 mNRA 발현 카세트를 봉입한 표적화 구조체로 일시적으로 재프로그램하고 그 산물, 재프로그래밍된 면역세포 및 고형암의 세포외기질의 분해 기술을 이용한 고형암 치료의 개념도이고,
도 2는 관심 mRNA 발현 카세트 주형 DNA를 pUC19 벡터에 클로닝한 후, 재조합된 플라스미드를 EcoRI/BamHI 제한효소를 처리한 후 전기영동한 결과이고,
도 3은 관심 mRNA 발현 카세트를 체외전사하여 얻은 제조 산물을 전기영동한 결과이고,
도 4는 합성된 HA-DAB-압타머 접합체의 생성을 확인하기 위하여 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)를 이용하였다. 상기 HPLC 조건은 superdex 200 10/300 GL (GE Health) 컬럼을 사용하였고 이동상은 pH 7.0 50 mM 포스페이트 버퍼 (phosphate buffer), 흐름 속도는 0.5ml/min를 사용했고 210nm와 260nm에서 흡광도를 측정한 결과이고,
도 5는 분리 정제된 HA-DAB-압타머 접합체을 아가로스 젤 전기영동을 통해 합성 여부 및 환원제(TCEP)에 의한 분해 여부를 확인한 결과이고,
도 6은 PEC 1.0-DW 시료 및 PEC 1.0-CM 시료에서 PS 농도에 따른 크기 분포를 조사한 결과이고,
도 7은 PEC 1.0의 관심 mRNA의 봉합정도를 조사한 결과이고,
도 8은 PEC 2.0의 관심 mRNA의 봉합정도를 조사한 결과이고,
도 9는 HSA PEM 1.1의 구성성분의 비율에 따른 구조체의 안정성을 조사한 결과이고,
도 10은 초음파 및 압축기에 의해 균질화된 면역세포 표적화 HA PEMN 1,1을 DLS 분석한 결과이고,
도 11은 면역세포 표적화 PEM의 [관심 mRNA/PS]:HA-리간드에서 시간에 따른 약물 방출 프로파일을 조사한 결과이고,
도 12는 초고압 균질화로 제조된 면역세포 표적화 PEMN을 DLS 분석한 결과이고,
도 13은 CAR-NK 92 세포를 형광이 부착된 CD56 및 CD107a 또는 IFN-감마에 대한 항체가 첨가된 FACS 완충액에서 20분 동안 상온에서 반응 후, 상기 세포를 원심분리기를 이용하여 세척 및 회수한 다음 CD107a+ 세포 및 IFN-감마+NK 세포를 FACS 분석한 결과이고,
도 14는 대조군 NK-92 대조군 대비 HLA G-CAR-NK-92 세포의 암세포 살상능을 확인하기 위해서, 각 HLA G-CAR-NK-92 세포 수에 비례하게 암세포 살상능을 조사한 결과이고,
도 15는 HLA G 음성 대장암 세포주 LoVo, HLA G 양성 대장암 세포주 COLO320 및 항 CD3 항체에 의한 자극이 있을 경우 HLA G-CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포에서 다양한 조건에서 IL-7 및 CCL-19가 배지로 분비되는 것을 조사한 결과이고,
도 16은 쥐 IgG2a, 항 CD127 항체 및 항 CCR7 항체의 존재하에서 COLO 320으로 자극했을 경우 HLA G-CAR 발현 T 세포를 조사한 결과이고,
도 17은 a. 생후 8주차의 누드 마우스(Balb/c-nude Mouse, 평균무게 20-25g)의 등에 HLA G가 많이 발현되는 대장암 세포주 COLO320 1x107개 세포/ml 200 μl을 피하 주입(Subcutaneous Injection)하여, 대장장암세포 이종이식 마우스 동물 모델을 제조하였으며 이식 5일 후, 마우스를 10x106개의 NK-92 세포로 재구성하고, 재구성 3일 후, HLA-G CAR NK-PEMN (50μg mRNA/용량)을 6일마다 투여하는 프로토콜; b, 본 투여 프로토콜에서 마우스 종양의 변화를 조사한 결과이고
도 18은 a. 생후 8주차의 누드 마우스(Balb/c-nude Mouse, 평균무게 20-25g)의 등에 HLA G가 많이 발현되는 대장암 세포주 COLO320 1x107개 세포/ml 200 μl을 피하 주입하여, 대장장암세포 이종이식 마우스 동물 모델을 제조하였으며, 이식 5일 후, 마우스를 10x106개의 T 세포로 재구성하고, 재구성 3일 후, HLA G-CAR T-PEMN 또는 HLA G-CAR-IL-7/CCL19 T-PEMN을 투여하는 프로토콜; b, 본 투여 프로토콜에서 마우스 종양의 변화를 조사한 결과이고
도 19는 a. 생후 8주차의 누드 마우스(Balb/c-nude Mouse, 평균무게 20-25g)의 등에 HLA G가 많이 발현되는 대장암 세포주 COLO320 1x107개 세포/ml 200 μl을 피하 주입하여, 대장장암세포 이종이식 마우스 동물 모델을 제조하였으며, 이식 5일 후, 마우스를 10x106개의 NK-92 세포 및 10x106개의 T 세포로 재구성하고, 재구성 3일 후, HLA G-CAR NK-PEMN 및 HLA G-CAR-IL-7/CCL19 T-PEMN을 투여하는 프로토콜; b, 본 투여 프로토콜에서 마우스 종양의 변화를 조사한 결과이고
도 20은 a. 생후 8주차의 누드 마우스(Balb/c-nude Mouse, 평균무게 20-25g)의 등에 HLA G가 많이 발현되는 대장암 세포주 COLO320 1x107개 세포/ml 200 μl을 피하 주입하여, 대장장암세포 이종이식 마우스 동물 모델을 제조하였으며, 이식 5일 후, 마우스를 10x106개의 NK-92 세포 및 10x106개의 T 세포로 재구성하고, 재구성 3일 후, 고형암에 대한 ECM 분해 효소 PEMN(50μg mRNA/용량), HLA G-CAR NK-PEMN(50μg mRNA/용량) 및 HLA G-CAR-IL-7/CCL19 T-PEMN(50μg mRNA/용량)을 각각 6일마다 투여하는 프로토콜; b, 본 투여 프로토콜에서 종양의 변화를 조사한 결과이다.
본 발명에서 일반적으로 복합입자 또는 입자는 본 발명에서 사용하는 구조체, 지질입자, PEC 및 PEMN을 포함하는 용어, 또는 거의 동의어로 사용하고 있다. 또한, 본 발명에서 일반적으로 사용하는 단백질과 본 발명에서 발현하고자 하는 단백질을 관심 단백질로 지칭하고 두 용어는 거의 동의어로 사용하고 있다.
본 발명에서, "생체 외"는 대상체 또는 공여자의 신체 외부 세포에 대해 지시된 방법을 지칭한다. "생체 내"는 대상체의 신체 중 세포에 대해 지시된 방법을 지칭한다. "시험관 내"는 일차 세포보다는 배양에서 성장된 세포에 관한 방법을 지칭한다.
본 발명에서, "세포 표적화 리간드" 또는 "선택된 세포 표적화 리간드"는 상호 교환적으로 사용되며(예컨대, 선택된 세포의 표면 상의 마커 단백질을 통해) 선택된 세포에 선택적으로 결합하는 생체분자 (예컨대, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드)를 지칭한다. 일반적으로 세포 표적화 리간드는 생체 내에서 나노담체를 선택 세포에 선택적으로 표적화한다. 예시적인 세포 표적화 리간드는 항체 단편, 예컨대, 단일 쇄 가변 단편(scFv), 조작된 리간드, 예컨대, 합리적으로 조작된 결합제, 소-분자 리간드 또는 압타머를 포함한다.
일반적으로 단백질은 하나 이상의 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 일반적으로 단백질은 생물학적 기능을 발휘하는 단백질을 위해 요구될 수 있는 3차원 형태로 접힌다.
펩타이드: 일반적으로 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 연결된 아미노산 단량체의 폴리머이다. 이는 일반적으로 50 단량체 단위 미만으로 함유한다. 그렇지만, 용어 펩타이드는 50 단량체 단위를 초과하여 갖는 분자를 위한 권리를 포기하는 것은 아니다. 긴 펩타이드는 폴리펩타이드라고도 불리우며, 일반적으로 50 ~ 600 단량체 단위를 갖는다.
단백질의 절편 또는 부분: 본 발명에서, 단백질의 절편 또는 부분은 일반적으로 단백질의 아미노산 서열의 연속적인 부분에 상응하는 펩타이드로 이해될 수 있으며, 바람직하게는 약 6 ~ 약 20개 또는 그 이상의 아미노산의 길이를 가지고, 예를 들어, MHC 클래스 I 분자에 의하여 가공되고 제시되는 부분, 바람직하게는 약 8 ~ 약 10개 아미노산의 길이를 가지는, 예를 들어, 8, 9, 또는 10개, (또는 11, 또는 12개 아미노산도), 또는 MHC 클래스 II 분자에 의하여 가공 및 제시되는 절편, 바람직하게는 약 13개 또는 그 이상의 아미노산, 예를 들어, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 아미노산의 길이를 가지며, 여기서 이들 절편은 아미노산 서열의 임의의 부분으로부터 선택될 수 있다. 이들 절편은 일반적으로 펩타이드 절편 및 MHC 분자로 이루어지는 복합체의 형태로 T 세포에 의하여 인지될 수 있고, 즉 절편은 일반적으로 그들의 천연 형태로 인지되지 않는다. 본발명에 정의된 바와 같은 단백질의 절편 또는 부분은 또한 이들 단백질의 에피토프 또는 기능부(functional site)를 포함할 수 있다. 단백질의 절편 또는 부분은 항원, 특히 면역원, 예를 들어 항원 결정기(또한 '에피토프'로 불리우는)이거나 항원 특성(antigenic characteristics)을 갖고, 적응 면역 반응을 유도한다. 따라서, 단백질 또는 펩타이드의 절편은 적어도 하나의 이들 단백질 또는 펩타이드의 에피토프를 포함할 수 있다. 게다가 또한, 단백질의 도메인(domain)은, 세포 외 도메인, 세포 내 도메인 또는 막관통 도메인(transmembrane domain) 및 단백질의 짧거나 절단된 버전(versions)과 같이 단백질의 절편을 포함하는 것으로 이해될 수 있다.
키메라 효소: 키메라 효소는 자연에서 발견되는 천연 효소가 아닌 효소를 지칭한다. 따라서, 키메라 효소는, 자연에서 발견된 것과는 상이한 방식으로 배열된, 상이한 공급원(예: 상이한 효소)으로부터 유래된 촉매 도메인 또는 동일한 공급원(예: 동일한 효소)으로부터 유래된 촉매 도메인을 포함할 수 있다. 키메라 효소는 단량체성(즉, 단일 단위) 효소 뿐만 아니라 올리고머성(즉, 복수 단위) 효소, 특히 헤테로-올리고머성 효소를 포함한다. 단량체성 효소는 단지 하나의 폴리펩티드 쇄로 이루어진 단일-단위 효소와 관련된다.
본 발명에서, 뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드 또는 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, 본 발명의 관심 mRNA들, 예를 들면, mRNA 분자)에서, "변형" 또는 적절하게는 "변형된"은 A, G, U 또는 C 리보뉴클레오타이드들에 관한 변형을 말한다. 일반적으로, 본 발명에서, 이들 용어들은 천연적으로 발생하는 5'-말단 mRNA 캡 모이어티 내의 리보뉴클레오타이드 변형들을 말하는 것으로 의도되지 않는다. 폴리펩타이드에서, "변형"은 20개 아미노산들의 정규 세트, 모이어티와 비교한 변형을 말한다.
관심 mRNA이 mRNA인 경우, 암호화 영역, 플랭킹 영역들(flanking regions) 및/또는 말단 영역들은 1개, 2개, 또는 그 이상의(임의로 상이한) 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 변형들을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포에 도입된 변형된 폴리뉴클레오타이드는, 변형되지 않은 폴리뉴클레오타이드와 비교하여, 세포에서 감소된 분해를 나타낼 수 있다.
폴리뉴클레오타이드들은, 당, 핵염기, 또는 뉴클레오사이드간 연결에 대한(예를 들면, 연결 포스페이트에 대한/포스포디에스테르 연결에 대한/포스포디에스테르 골격에 대한) 임의의 유용한 변형을 포함할 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드의 주요 그루브, 또는 핵염기의 주요 그루브 페이스는 하나 이상의 변형들을 포함할 수 있다. 피리딘 핵염기의(예를 들면, 주요 그루브 페이스 상의) 하나 이상의 원자들은, 임의로 치환된 아미노, 임의로 치환된 티올, 임의로 치환된 알킬(예를 들면, 메틸 또는 에틸), 또는 할로(예를 들면, 클로로 또는 플루오로)로 대체되거나 치환될 수 있다. 특정 실시형태에서, 변형들(예를 들면, 하나 이상의 변형들)은 각각의 당 및 뉴클레오사이드간 연결 각각에 존재한다. 본 발명에 따른 변형들은 리보관심 mRNA(RNA)의 데옥시리보관심 mRNA들(DNA)로의 변형들, 예를 들면, 리보푸라니실 환의 2'OH의 2'H, 트레오스 관심 mRNA(TNA), 글리콜 관심 mRNA(GNA), 펩타이드 관심 mRNA(PNA), 잠금(locked) 관심 mRNA(LNAs) 또는 이들의 하이브리드로의 치환일 수 있다. 추가의 변형들이 본 발명에 기술되어 있다.
"폴리뉴클레오티드", "관심 mRNA 서열", "뉴클레오티드 서열" 또는 "관심 mRNA 단편"은 상호 호환적으로 합성, 비-천연 또는 변형된 뉴클레오티드 염기를 선택적으로 포함하는, 단일 가닥 또는 이중 가닥의 RNA 또는 DNA로 된 폴리머를 지칭하기 위해 사용된다. 뉴클레오티드 (일반적으로 5'-모노포스페이트 형태로 발견됨)는 다음과 같이 단문자명으로 지칭된다: "A" = 아데닐레이트 또는 데옥시아데닐레이트 (각각 RNA 또는 DNA), "C" = 시티딜레이트 또는 데옥시시티딜레이트, "G" = 구아닐레이트 또는 데옥시구아닐레이트, "U" = 우리딜레이트, "T" = 데옥시티미딜레이트, "R" = 퓨린 (A 또는 G), "Y" = 피리미딘 (C 또는 T), "K" = G 또는 T, "H" = A 또는 C 또는 T, "I" = 이노신, "N" = 임의의 뉴클레오티드.
"폴리펩타이드", "펩타이드", "아미노산 서열" 및 "단백질"은 본 발명에서 상호 호환적으로 아미노산 잔기들로 된 폴리머를 지칭하기 위해 사용된다. 이들 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 대응되는 천연 아미노산의 인공적인 화학 유사체인 아미노산 폴리머 뿐만 아니라 천연 아미노산 폴리머에도 적용된다. 용어 "폴리펩타이드", "펩타이드", "아미노산 서열" 및 "단백질"은 또한 비-제한적인 예로, 당화, 지질 결합, 황산화, 글루탐산 잔기의 감마-카르복시화, 하이드록시화 및 ADP-화라이보실화 (ribosylation) 등의 변형을 포함한다.
변형된 관심 mRNA 분자를 세포내로 도입시켜 세포내적으로 분해되도록 하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 변형된 관심 mRNA 분자의 분해는, 단백질 생산의 정확한 시기선택(precise timing)이 요구되는 경우에 바람직할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 세포 내에서의 직접적인 방식으로 작용할 수 있는, 분해 도메인(domain)을 함유하는 변형된 관심 mRNA 분자를 제공한다. 주요 그루브 상호작용의 결합, 예를 들면, 파트너와 폴리뉴클레오타이드의 결합(예를 들면, 변형된 뉴클레오타이드가, 변형되지 않은 뉴클레오타이드와 비교하여, 주요 그루브 상호작용 파트너에 대한 결합 친화성을 감소시킨 경우)을 방해할 수 있는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드들을 제공한다. 폴리뉴클레오타이드들은 다른 제제들[예를 들면, RNAi-유도제, RNAi 제제, siRNA, shRNA, miRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 촉매적 DNA, tRNA, 삼중 나선 형성을 유도하는 RNA, 압타머(Aptamer), 벡터 등]을 임의로 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드들은 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드들(즉, 변형된 mRNA 분자들)을 갖는 하나 이상의 전령 RNA(mRNA)를 포함할 수 있다.
관심 mRNA 분자: 관심 mRNA 분자는 바람직하게는 관심 mRNA 성분을 포함하는, 바람직하게는 이루어진 분자이다. 용어, 관심 mRNA 분자는 DNA 또는 RNA를 나타낸다. 이는 용어 "폴리뉴클레오타이드"와 동의어로 사용된다. 관심 mRNA 분자는 뉴클레오타이드 단량체를 포함하거나 이로 이루어진 폴리머이며, 당/포스페이트-백본의 포스포디에스테르 결합에 의해 서로 공유 결합으로 연결되어 있다.
DNA: DNA는 데옥시리보관심 mRNA에 대한 일반적인 약자이다. 이는 관심 mRNA 분자, 즉, 뉴클레오타이드로 이루어진 폴리머이다. 이러한 뉴클레오타이드는 보통 당 성분(sugar moiety), 염기 성분 및 포스페이트 성분으로 구성된 데옥시아데노신-모노포스페이트, 데옥시티미딘-모노포스페이트, 데옥시구아노신-모노포스페이트 및 데옥시사이티딘-모노포스페이트 단량체이며, 특유의 백본 구조에 의해 중합된다. 백본구조는, 일반적으로, 단량체에 근접한 첫 번째 뉴클레오타이드의 당 성분 즉, 데옥시리보오스와 두 번째 포스페이트 성분 사이의 포스포디에스테르 결합에 의해 형성된다. 단량체의 특정 순서, 즉, 당/포스페이트-백본에 연결된 염기의 순서는 DNA-서열이라고 한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥 형태(double stranded form)에서, 첫 번째 가닥의 뉴클레오타이드는 일반적으로 두 번째 가닥의 뉴클레오타이드와 예를 들어, A/T-염기쌍 및 G/C-염기쌍으로 혼성화(hybridize)된다.
유전자: 유전자는 하나 이상의 세포 생성물을 생산하고/하거나 하나 이상의 세포 간 또는 세포 내 기능을 달성하기 위한 특정 관심 mRNA 서열을 지칭한다. 보다 구체적으로, 상기 용어는 특정 단백질 또는 기능적 또는 구조적 RNA 분자를 코딩하는 관심 mRNA을 포함하는 관심 mRNA 섹션(전형적으로 DNA이지만, RNA 바이러스의 경우에는 RNA이다)에 관한 것이다.
발현은 그의 가장 일반적인 의미로 사용되며, RNA의 생산 또는 RNA 및 단백질의 생산을 포함한다. 이것은 또한 관심 mRNA의 부분적 발현을 포함한다. 뿐만 아니라, 발현은 일시적이거나 안정한 것일 수 있다. 관심 mRNA과 관련하여, "발현" 또는 "번역"이라는 용어는 세포의 리포좀 내에서 메신저 RNA의 한 가닥이 아미노산 서열의 어셈블리를 지시하여 펩티드 또는 단백질을 만드는 프로세스에 관한 것이다.
RNA, mRNA: RNA는 리보관심 mRNA에 대한 일반적인 약자이다. 이는 관심 mRNA 분자 즉, 뉴클레오타이드로 이루어진 폴리머이다. 이들 뉴클레오타이드는 보통 소위 백본을 따라 서로 연결된 아데노신-모노포스페이트, 우리딘-모노포스페이트, 구아노신-모노포스페이트 및 사이티딘-모노포스페이드 단량체이다. 백본은 단량체에 근접한 첫 번째 당, 즉 리보오스, 및 두 번째 포스페이트 성분 사이에서 포스포디에스테르 결합에 의해 형성된다. 단량체의 특정 연쇄는 RNA-서열이라고 한다. 보통 RNA는 DNA-서열의 전사에 의해, 예를 들어, 세포 내부에서 수득 가능할 수 있다. 진행 세포에서, 전사는 일반적으로 핵 또는 미토콘드리아 내부에서 수행된다.
mRNA는 메신저-RNA를 의미하며 전형적으로 DNA 주형을 이용하여 생성되고 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 전사체에 관한 것이다. 전형적으로, mRNA는 5'UTR, 단백질 코딩 영역, 3'UTR, 및 폴리(A) 서열을 포함한다. mRNA는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있다. 시험관내 전사 방법론은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 것이다. 예를 들어, 시험관내 전사 키트가 시중에 다양하게 판매되고 있다. 본 발명에 따르면, mRNA는 변형 및 캡핑을 안정화시킴으로서 변형시킬 수도 있다.
생체 내에서(In vivo), 보통 DNA의 전사는 보통 mRNA로 약칭하는 소위 전령-RNA로 가공되어야 하는 소위 미성숙 RNA(premature RNA)로 된다. 예를 들어, 진핵 유기체에서 미성숙 RNA의 가공은 스플라이싱(splicing), 5'캡핑(capping), 아데닐산중합반응(polyadenylation), 핵 또는 미토콘드리아로부터 유출(export) 등의 다양한 상이한 전사 후-변형을 포함한다. 이들 가공의 합(sum)은 RNA의 성숙이라고 한다. 성숙 전령 RNA는 보통 특정 펩타이드 또는 단백질의 아미노산 서열로 번역될 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 일반적으로, 성숙 mRNA(mature mRNA)는 5'캡(cap), 선택적으로 5'UTR, 오픈 리딩 프레임, 선택적으로 3'UTR 및 폴리(A) 서열을 포함한다. 전령 RNA 이외에, 여러 비-코딩 유형의 RNA가 존재하며, 이는 전사 및/또는 번역의 조절과 관련될 수 있다. 용어 "RNA"는 바이러스 RNA(viral RNA), 레트로바이러스 RNA(retroviral RNA) 및 RNA(replicon RNA)과 같은, 다른 코딩하는 RNA 분자를 또한 포함한다.
관심 mRNA 분자의 서열: 관심 mRNA 분자의 서열은 일반적으로 특정하고 개별적인 순서, 즉 이의 뉴클레오타이드의 연속인 것으로 이해된다. 단백질 또는 펩타이드의 서열은 일반적으로 순서, 즉, 이의 아미노산의 연쇄(succision)인 것으로 이해된다.
안정화된 관심 mRNA 분자: 안정화된 관심 mRNA 분자는 변형 없는 관심 mRNA 분자보다, 예를 들어, 환경적 인자 또는 엑소- 또는 엔도뉴클레아제와 같은 효소 분해에 의한 붕괴(disintegration) 또는 분해(degradation)에 더 안정한, 그렇게 화학적 변형된 DNA 또는 RNA 분자이다. 본 발명에서, 안정화된 관심 mRNA 분자는 원핵 또는 진핵 세포, 인간 세포와 같은 포유동물 세포와 같은 세포에서 안정화된다. 안정화 효과는 또한 세포의 외부, 예를 들어, 버퍼 용액 등에서, 예를 들어, 안정화된 관심 mRNA 분자를 포함하는 약학적 조성물을 제조하는 공정에서 발휘될 수 있다.
"일시적인 형질도입" 또는 형질도입은 관심 mRNA 분자 또는 단백질이 세포에 도입되어, 외인성 유전자가 안정적으로 유전되지 않으면서 그 기능을 수행하는 것을 의미한다. 일시적인 형질도입의 경우, 외인성 관심 mRNA 서열이 게놈에 삽입되지 않는다.
형질도입(Transfection): 형질도입은 관심 mRNA 분자, DNA 또는 RNA(예를 들어, mRNA) 분자의 세포, 바람직하게는 진핵 세포 내로의 도입을 말한다. 본 발명에서, 형질도입은 세포, 포유동물 세포(mammalian cell)와 같은 진핵 세포 내로 관심 mRNA 분자를 도입하는 통상의 기술자에게 알려진 임의의 방법을 포함한다. 이러한 방법은, 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 예를 들어, 양이온성 지질 및/또는 리포좀(liposome)에 기반한 리포펙션(lipofection), 칼슘 포스페이트 침전(calcium phosphate precipitation), 나노입자 기반의 형질도입, 바이러스 기반의 형질도입, 또는 DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민 등과 같은 양이온성 생체적합성 폴리머에 기반한 형질도입을 포함한다. 도입은 비-바이러스성이다.
담체/폴리머 담체: 담체는 일반적으로 또 다른 생체적합성 폴리머(cargo)의 수송 또는 복합화를 용이하게 하는 생체적합성 폴리머일 수 있다. 폴리머 담체는 일반적으로 폴리머를 형성하는 담체이다. 담체는 이의 화물과 공유 또는 비-공유 상호작용에 의하여 연관될 수 있다. 담체는 관심 세포 내로 관심 mRNA, 예를 들어, RNA 또는 DNA를 수송할 수 있다. 담체는 양이온성 성분일 수 있다.
비히클(Vehicle): 비히클은 일반적으로 약학적 활성 생체적합성 폴리머와 같은 생체적합성 폴리머를 저장, 운반, 및/또는 투여하기 위한 적절한 물질로 이해된다. 예를 들어, 이는 약학적 활성 생체적합성 폴리머를 저장, 운반 및/또는 투여하기 위한 적절한 생리학적으로 허용가능한 지질일 수 있다.
약학적 유효량(Pharmaceutically effective amount): 본 발명에서, 약학적 유효량은 일반적으로 발현된 펩타이드 또는 단백질의 병리학적 수준을 대체하는, 또는 결여 유전자 산물(lacking gene product)을 치환하는, 예를 들어, 병리학적 상황의 경우에 면역 반응과 같은 약학적 효과를 유도하기 위하여 충분한 양으로 이해된다.
유전적 백신 접종: 유전적 백신 접종은 일반적으로 항원 또는 면역원 또는 이들의 절편을 코딩하는 관심 mRNA 분자의 투여에 의한 백신 접종으로 이해될 수 있다. 관심 mRNA 분자는 개체의 신체 또는 개체의 분리된 세포에 투여될 수 있다. 신체의 특정 세포의 형질도입에 따라, 또는 분리된 세포의 형질도입에 따라, 항원 또는 면역원은 그들 세포에 의해 발현될 수 있고 이후에 적응, 즉 항원-특이적 면역 반응을 유발하는 면역 시스템에 제시될 수 있다. 따라서, 유전적 백신 접종은 일반적으로 a) 관심 mRNA, RNA 분자를 개체에, 환자에게, 또는 생체 내(in vivo)/생체 외(ex vivo) 또는 시험관 내(in vitro) 환자의 세포의 형질도입을 보통 초래하는 개체, 환자의 분리된 세포에 투여; b) 도입된 관심 mRNA 분자의 전사 및/또는 번역; 및 선택적으로 c) 관심 mRNA이 직접 환자에게 투여되지 않았다면, 개체, 환자에게 분리된, 형질도입된 세포의 재투여의 단계 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
본 발명에서 체내 한 종류 또는 두 종류 이상의 순환하는 면역세포들에 선택적으로 각각에 형질주입하고 관심 mRNA를 봉입하는 구조체, 이의 용도 및 이의 제조방법을 제공하고자한다.
Ⅰ. 면역세포
본 발명은 생체 내에서 순환하는 한 종류 또는 두 종류 이상의 면역세포를 프로그래밍하는 기술 및 고형암의 mRNA로 세포외기질의 분해 기술로 질병 관련 항원을 인식하기 위해 순환하고 일시적으로 한 종류 또는 두 종류 이상의 mRNA로 재프로그램된 면역세포를 이용한 고형암 치료의 개념은 <도 1>에 제시하였으며 이을 위한, 상기 관심 mRNA가 봉입된 면역세포 표적화 구조체, 이의 용도 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
면역세포는 면역 체계의 일부이며 신체가 감염 및 기타 질병과 싸우는 데 도움이 되는 세포이다. 면역세포는 골수에 있는 줄기세포에서 발생하며 호중구, 호산구, 호염기구, 비만 세포, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 자연 살해(NK) 세포, NKT 세포 및 림프구 (B 세포 및 T 세포)를 포함한다. 또한, NKT 세포는 αβ T 세포 수용체를 공동 발현하는 T 세포의 하위 집합이지만 NK1.1과 같은 NK 세포와 일반적으로 관련된 다양한 분자 마커도 발현한다.
본 발명에서 "면역 세포"는 일반적으로, 골수 내에서 생산된 조혈 줄기 세포 (HSC)로부터 유래되는 백혈구 (백혈구)를 포함한다. "면역 세포"는 예로서, 림프구 (T 세포, B 세포, 자연 킬러 (NK) 세포) 및 골수성-유래된 세포 (호중구, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포)를 포함한다.
"T 세포"는 T-보조 세포 (CD4+ 세포), 세포독성 T-세포 (CD8+ 세포), T-조절 세포 (Treg) 및 감마-델타 T 세포를 비롯하여, CD3을 발현하는 모든 유형의 면역 세포를 포함한다.
"세포독성 세포"는 CD8+ T 세포, 자연-킬러 (NK) 세포, 그리고 호중구를 포함하고, 이들 세포는 세포독성 반응을 매개할 수 있다.
본 발명에서 "줄기 세포"는 일반적으로, 만능성 또는 다능성 줄기 세포를 포함한다. "줄기세포"는 예로서, 배아 줄기 세포 (ES); 중간엽 줄기 세포 (MSC); 유도된-만능성 줄기 세포 (iPS); 그리고 수임된 선조체 세포 (조혈 줄기 세포 (HSC); 골수 유래 세포 등)를 포함한다.
일반적으로 면역표현형에서 세포표면항원무리(cluster of differentiation, CD)로 이용되어 세포의 표면에 있는 분자에 따라 세포를 정의할 수 있게 한다. 세포 표지자는 특정한 면역 기능과 세포를 연관지을 때 사용한다. 단 하나의 CD를 이용하여 세포 집단을 정의하는 것은 드물다(그러한 예시가 아예 없지는 않음). 여러 표지자를 결합하여 세포 유형을 나타냄으로써 면역계 내에서 매우 구체적으로 세포를 정의할 수 있다.
<표 1>에서처럼, CD 분자는 유세포 분석을 포함하여 세포를 분류하는 다양한 기법에서 이용된다.
세포유형에 따른 CD
세포 유형 CD 표지자
줄기세포 CD34+, CD31-, CD117
모든 백혈구 무리 CD45+
과립구 CD45+, CD11b, CD15+, CD24+, CD114+, CD182+
단핵구 CD45+, CD14+, CD114+, CD11a, CD11b, CD91+, CD16+
T 림프구 CD45+, CD3+
보조 T 세포 CD45+, CD3+, CD4+
조절 T 세포 CD4+, CD25+, Foxp3+
세포독성 T 세포 CD45+, CD3+, CD8+
B 림프구 CD45+, CD19+ 혹은 CD45+, CD20+, CD24+, CD38, CD22
혈소판 CD45+, CD61+
자연살해세포 CD16+, CD56+, CD3-, CD31, CD30, CD38
본발명의 특정 실시례는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 면역 세포에 관한 것이다. 면역 세포는 T 세포 (예를 들어, 조절 T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 감마-델타 T 세포), 자연 살해 (NK) 세포, 불변의(invariant) NK 세포, 또는 NKT 세포일 수 있다. 또한, 면역 세포를 생산 및 조작하는 방법뿐만 아니라, 입양 세포 요법을 위해 세포를 사용 및 투여하는 방법이 제공되며, 이 경우 세포는 자가유래(autologous) 또는 동종이계일 수 있다. 따라서, 면역 세포는 암 세포를 표적으로 하는 것과 같은 면역요법으로서 사용될 수 있다.
면역 세포는 대상체, 특히 인간 대상체로부터 단리될 수 있다. 면역 세포는 관심 대상체, 예컨대 특정한 질환 또는 병태를 갖는 것으로 의심되는 대상체, 특정한 질환 또는 병태에 대한 소인을 갖는 것으로 의심되는 대상체, 특정한 질환 또는 병태에 대한 요법을 받고 있는 대상체, 건강한 자원 봉사자 또는 건강한 공여자인 대상체, 또는 혈액 은행으로부터 수득할 수 있다. 면역 세포는 혈액, 제대혈, 비장, 흉선, 림프절, 및 골수를 포함하나 이에 제한되지는 않는 대상체에 존재하는 임의의 부위로부터 수집될 수 있다. 단리된 면역 세포는 직접적으로 사용될 수 있거나, 예컨대 동결에 의해 일정 기간 동안 저장될 수 있다.
면역 세포는 혈액 (혈액 은행 또는 제대혈 은행에 의해 수집된 혈액 포함), 비장, 골수, 수술 절차 동안에 제거 및/또는 노출된 조직, 및 생검 절차를 통해 얻은 조직을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 조직으로부터 농축/정제될 수 있다. 면역 세포가 농축, 단리, 및/또는 정제되는 조직/기관은 살아 있는 대상체 및 살아있지 않은 대상체 둘 다로부터 단리될 수 있으며, 여기서 살아있지 않은 대상체는 장기 공여자이다. 특정한 구성 성분에서, 면역 세포는 말초 혈액 또는 제대혈과 같은 혈액으로부터 단리된다. 일부 측면에서, 제대혈로부터 단리된 면역 세포는 CD4- 또는 CD8- 양성 T 세포 억제에 의해 측정되는 바와 같이 증강된 면역조정 능력을 갖는다. 구체적 측면에서, 면역 세포는, 면역조정 능력을 증강시키기 위해, 풀링된 혈액, 특히 풀링된 제대혈로부터 단리된다. 풀링된 혈액은 2개 이상의 공급원, 예컨대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 공급원 (예를 들어, 공여자 대상체)일 수 있다.
면역 세포의 집단은 요법을 필요로 하거나 감소된 면역 세포 활성과 연관된 질환을 앓고 있는 대상체로부터 수득할 수 있다. 따라서, 세포는 요법을 필요로 하는 대상체에게 자가유래가 될 것이다. 대안적으로, 면역 세포의 집단은 공여자, 바람직하게는 조직적합성 매칭된 공여자로부터 수득할 수 있다. 면역 세포 집단은 말초 혈액, 제대혈, 골수, 비장, 또는 면역 세포가 상기 대상체 또는 공여자에 존재하는 임의의 다른 기관/조직으로부터 수확될 수 있다. 면역 세포는 풀링된 제대혈과 같은, 대상체 및/또는 공여자의 풀로부터 단리할 수 있다.
면역 세포의 집단이 대상체와 구별되는 공여자로부터 수득될 때, 수득된 세포가 대상체에 도입될 수 있다는 점에서 대상체-적합성이라면, 공여자는 바람직하게는 동종이계이다. 동종이계 공여자 세포는 인간-백혈구-항원(HLA)-적합성이거나 아닐 수 있다. 대상체-적합성이 되도록 하기 위해, 동종이계 세포는 면역원성을 감소시키도록 처리될 수 있다.
1) T 세포
면역 세포는 T 세포이다. 기능성 항종양 이펙터 세포의 유도, 활성화 및 확장에 대한 몇몇 기본 접근법이 지난 20년 동안 기재되어 왔다. 이들은, 자가유래 세포, 예컨대 종양-침윤 림프구 (TIL); 자가유래 DC, 림프구, 인공 항원-제시 세포 (APC) 또는 T 세포 리간드 및 활성화 항체로 코팅된 비드를 사용하여 생체외에서 활성화된 T 세포, 또는 표적 세포막을 포획함으로써 단리된 세포; 항-숙주 종양 T 세포 수용체 (TCR)를 자연적으로 발현하는 동종이계 세포; 및 "T-바디(bodies)"로 공지된 항체-유사 종양 인식 능력을 나타내는 종양-반응성 TCR 또는 키메라 TCR 분자를 발현하도록 유전적으로 재프로그래밍되거나 "재지향된(redirected)" 비-종양-특이적 자가유래 또는 동종이계 세포를 포함한다. 이들 접근법은 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있는 T 세포 제조 및 면역화를 위한 수많은 프로토콜을 발생시켰다.
T 세포는 혈액, 골수, 림프, 제대, 또는 림프 기관으로부터 유래된다. 일부 측면에서, 세포는 인간 세포이다. 세포는 전형적으로 1차 세포, 예컨대 대상체로부터 직접 단리되고/거나 대상체로부터 단리되고 동결된 것들이다. 일부 구성 성분에서, 세포는 T 세포의 하나 이상의 서브세트 또는 다른 세포 유형, 예컨대 전체 T 세포 집단, CD4+세포, CD8+세포, 및 그의 아집단, 예컨대 기능, 활성화 상태, 성숙도, 분화,확장, 재순환, 국소화의 잠재성 및/또는 지속성 용량, 항원-특이성, 항원 수용체의 유형, 특정한 기관 또는 구획에서의 존재, 마커 또는 시토카인 분비 프로파일, 및/또는 분화 정도에 의해 정의된 것들을 포함한다. 치료될 대상체와 관련하여, 세포는 동종이계 및/또는 자가유래일 수 있다. 일부 측면에서, 예컨대 기성(off-theshelf) 기술의 경우, 세포는 분화다능(pluripotent) 및/또는 다분화능(multipotent), 예컨대 줄기 세포, 예컨대 유도된 분화다능 줄기 세포 (iPSC)이다. 일부 구성 성분에서, 방법은, 본원에 기재된 바와 같이, 대상체로부터 세포를 단리하고, 세포를 제조, 가공, 배양, 및/또는 조작하고, 동결보존 전 또는 후에, 동일한 환자에게 세포를 재도입하는 것을 포함한다. T 세포의 아형 및 아집단 (예를 들어, CD4+및/또는 CD8+T 세포) 중에 나이브 T (TN) 세포, 이펙터 T 세포(TEFF), 기억 T 세포 및 그의 아형, 예컨대 줄기 세포 기억 T (TSCM), 중앙 기억 T (TCM), 이펙터 기억 T (TEM), 또는 최종 분화된(terminally differentiated) 이펙터 기억 T 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 미성숙 T 세포, 성숙 T 세포, 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 점막-연관 불변 T (mucosa-associated 불변의 T) (MAIT) 세포, 자연 발생 및 적응 조절성 T (Treg) 세포, 헬퍼 T 세포, 예컨대 TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 여포성 헬퍼 T 세포, 알파/베타 T 세포, 및 델타/감마 T 세포가 있다.
T 세포 집단 중 하나 이상은 표면 마커와 같은 특이적 마커에 대해 양성이거나, 특이적 마커에 대해 음성인 세포가 풍부하거나 고갈되어 있다. 일부 경우에, 이러한 마커는 T 세포의 특정 집단에서 상대적으로 낮은 수준으로 발현되거나 부재하는 것들 (예를 들어, 비-기억 세포), 그러나 T 세포의 특정 다른 집단에서 상대적으로 더 높은 수준으로 발현하거나 존재하는 것들 (예를 들어, 기억 세포)이다.
T 세포는 비-T 세포, 예컨대 B 세포, 단핵구, 또는 다른 백혈구, 예컨대 CD14 상에서 발현된 마커의 음성 선택에 의해 PBMC 샘플로부터 분리된다. 일부 측면에서, CD4+ 또는 CD8+ 선택 단계는 CD4+헬퍼 및 CD8+세포독성 T 세포를 분리하기 위해 사용된다. 이러한 CD4+ 및 CD8+집단은 하나 이상의 나이브, 기억, 및/또는 이펙터 T 세포 아집단에서 상대적으로 더 높은 정도로 발현되거나 발현된 마커에 대한 양성 또는 음성선택에 의해 아집단으로 추가로 분류될 수 있다.
CD8+T 세포는, 예컨대 각각의 소집단과 연관된 표면 항원에 기초한 양성 또는 음성 선택에 의해, 나이브, 중앙 기억, 이펙터 기억, 및/또는 중앙 기억 줄기 세포가 추가로 풍부하게 되거나 고갈되어 있다. 일부 구성 성분에서, 중앙 기억 T (TCM) 세포의 강화는 효능을 증가시키기 위해, 예컨대 투여 후 장기간 생존, 확장, 및/또는 생착을 향상시키기 위해 수행되며, 이는 일부 측면에서 이러한 아집단에서 특히 강력하다.
2).NK 세포
면역 세포는 자연 살해 (NK) 세포이다. 자연 살해 (NK) 세포는 여러 가지의 종양 세포, 바이러스-감염 세포, 및 골수 및 흉선의 일부 정상 세포에 대해 자발적인 세포독성을 갖는 림프구의 아집단이다.NK 세포는 형질전환 및 바이러스-감염 세포에 대한 초기 선천적 면역 반응의 중요한 이펙터이다. NK 세포는 인간 말초 혈액에서 림프구의 약 10%를 구성한다. 인터류킨 2 (IL-2)의 존재하에 림프구가 배양될 때, 강한 세포 독성 반응성이 발생한다. NK 세포는 그들의 더 큰 크기 및 그의 세포질에 특징적인 아주르친화성(azurophilic) 과립의 존재 때문에 큰 과립 림프구로서 공지된 이펙터 세포이다 (Herberman, 1986). NK 세포는 골수, 림프절, 비장, 편도선, 및 흉선에서 분화되고 성숙된다. NK 세포는 인간에서 특이적 표면 마커, 예컨대 CD16, CD56 및 CD8에 의해 검출될 수 있다. NK 세포는 T-세포 항원 수용체, 팬(pan) T 마커 CD3, 또는 표면 면역글로불린 B 세포 수용체를 발현하지 않는다.
NK 세포의 자극은 세포 표면 활성화 및 억제 수용체로부터 유래된 신호의 누화(cross-talk)를 통해 달성된다. NK 세포의 활성화 상태는 생식계열(germ-line)-코딩된 활성화 및 억제 수용체의 어레이로부터 수신된 세포내 신호의 균형에 의해 조절된다 (Campbell, 2006). NK 세포가 비정상 세포 (예를 들어, 종양 또는 바이러스-감염 세포)에 직면하고 활성화 신호가 우세한 경우, NK 세포는 퍼포린 및 그랜자임을 함유하는 세포용해성 과립의 지향된 분비 또는 사멸 도메인-함유 수용체의 관여를 통해 표적 세포의 아폽토시스를 급속히 유도할 수 있다. 활성화된 NK 세포는 또한 유형 I 시토카인, 예컨대 인터페론-γ, 종양 괴사 인자-α 및 과립구-대식세포 집락 자극 인자 (GM-CSF)를 분비할 수 있으며, 이는 선천성 및 적응성 면역 세포뿐만 아니라 다른 시토카인을 활성화시킨다. 초기 선천성 면역 반응에서 NK 세포에 의한 이들 가용성 인자의 생성은 다른 조혈 세포의 동원 및 기능에 유의하게 영향을 미친다. 또한, 물리적 접촉 및 시토카인의 생산을 통해, NK 세포는 수지상 세포 및 호중구와의 조절 누화 네트워크에서 면역 반응을 촉진 또는 억제하기 위한 중심 역할자(player)이다.
3) 면역 세포의 조작
본 발명에서 체내 한 종류 또는 두 종류 이상의 순환하는 면역세포들에 선택적으로 각각에 형질주입하고 관심 mRNA를 봉입하는 구조체, 이의 용도 및 이의 제조방법을 제공하고자한다. 체외에서 T 세포 (예를 들어, 자가유래 또는 동종이계 T 세포 (예를 들어, 조절 T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포,또는 감마-델타 T 세포), NK 세포, 불변의 NK 세포, 또는 NKT 세포의 유전자 조작으로 항원 수용체 예컨대 조작된 TCR 및/또는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현할 수 있다. 예를 들어, 체외에서 숙주 세포 (예를 들어, 자가유래 또는 동종이계 T-세포)는 변형되어 암 항원에 대해 항원 특이성을 갖는 T 세포 수용체 (TCR)를 발현한다. 특정한 구성 성분에서, 체외에서 NK 세포는 TCR을 발현하도록 조작된다. NK 세포는 CAR을 발현하도록 추가로 조작될 수 있다. 예컨대 다른 항원에 대해, 다수의 CAR 및/또는 TCR이 단일 세포 유형, 예컨대 T 세포 또는 NK 세포에 첨가될 수 있다.
적합한 변형 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 기 보고된 형질도입 기술을 사용하여 암 항원에 대한 항원 특이성을 갖는 T 세포 수용체 (TCR)를 발현하도록 형질도입될 수 있다.
일부 구성 성분에서, 세포는 하나 이상의 항원 수용체를 코딩하는 mRNA 발현카세트는 유전 공학을 통해 도입된 하나 이상의 mRNA 발현카세트, 및 이러한 mRNA 발현카세트의 유전자 조작된 생성물을 포함한다. 일부 구성 성분에서, mRNA 발현카세트은 이종성이며, 즉, 세포로부터 수득된 세포 또는 샘플, 예컨대 또 다른 유기체 또는 세포에 존재하지 않으며, 이는 예를 들어, 조작되고 있는 세포 및/또는 이러한 세포가 유래되는 유기체에서 통상적으로 발견되지 않는다. 일부 구성 성분에서, 자연 발생이 아니며, 예컨대 자연에서 발견되지 않는 mRNA 발현카세트 (예를 들어, 키메라)이다
본 발명에서 체내 한 종류 또는 두 종류 이상의 순환하는 면역세포들에 선택적으로 각각에 형질주입하고 관심 mRNA를 봉입하는 구조체, 이의 용도 및 이의 제조방법을 제공하고자한다.
Ⅱ. 관심 mRNA
본 발명에서 사용되는 관심 mRNA은 면역세포가 암세포를 인식하도록 하는 CAR 및 TCR 그리고 암세포의 면역회피를 저해하는 IL-7 및 CCL19를 포함하는 사이토카인 등을 포함하는 면역관련 단백질뿐만이 아니라 추가적으로고형암의 종양미세환경을 구성하는 세포이 기질을 분해하는 Matrix metalloproteinase, Hyaluronidase 및 Heparanase를 포함하는 고형암의 ECM(extracellular matrix)을 분해하는 효소 mRNA 등이며 이에 한정되는 것은 아니다.
면역세포의 기능을 제어할 수 있는 분자는 적어도 생체 내에 수백 종류나 존재한다. 면역 세포에서의 추가적인 항종양 효과를 높이기 위한 제어 분자로서 지금까지의 식견이나 경험을 바탕으로, 방대한 조합 중에서 우선은 IL-7과 CCL19를 선택하는 한편, 각각 단독이 아니라 2개의 조합, 즉 IL-7과 CCL19의 조합을 선택하여, 이러한 면역 세포의 면역 기능 촉진 인자와 CAR을 모두 발현하는 mRNA 카세트 주형을 제작하였다. 상기 주형을 IVT하여 제조된 mRNA에 5'CAP하여 단백질을 제조하는 mRNA 카세트를 제조하였다. 상기 관심 mRNA 카세트는 다양한 단백질들이 안정적으로 발현할 수 있는 특히, 발현카세트가 핵-비의존적으로 세포질 발현이 가능한 관심 mRNA은 다음과 같이 제조하였다.
상기 관심 mRNA은 비증폭 mRNA(non-amplifying mRNA) 구조체; 및 자가 증폭 mRNA(self-amplifying mRNA) 구조체 등이 있다. 상기 비증폭 mRNA 구조체는 (a) 상기 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 개방 판독 프레임(open reading frame, ORF): (b) 5'UTR; (c) 3'UTR; 및 (d) 5'캡 구조(cap structure) 또는 IRES;를 포함한다. 상기 자가 증폭 mRNA(self-amplifying mRNA) 구조체는 (a) RNA dependent RNA polymerase(RdRp)를 발현시키기 위한 mRNA 구조; 및 (b) 상기 RdRp에 의해 복제될 수 있고 상기 관심 대상 폴리펩타이드를 코딩하는 ORF를 포함하는 mRNA 레플리콘(replicon)을 포함하며, 여기서, 상기 두 종류의 구성요소가 동일한 한 개의 RNA에 있는 시스-레플리콘 RNA 구조체 또는 각각 상이한 두 개의 RNA에 있는 트렌스 레플리콘 RNA 구조체를 포함한다.
본 발명에서 상기 관심 mRNA에서 효율적으로 단백질을 합성하는 구조체를 mRNA 발현 카세트라고 하였다.
본 발명의 관심 mRNA을 제조하기 위해, 관심 ORF를 제조할 수 있는 T7 프로모터가 있는 관심 DNA를 설계하고 제작하여 pUC19 클로닝 벡터에 재조합하고, 재조합 pUC19 벡터에서 얻은 T7 프로모터가 있는 관심 DNA를 주형으로 체외전사한 후, 5′Cap 구조를 전사체에 부가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 관심 DNA는 관심 mRNA를 효율적으로 합성할 수 있는 DNA 절편으로 <T7 promoter - 5'UTR - 관심 DNA - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL> 순서로 제조하였다.
본 발명의 관심 DNA는 관심 orf를 효율적으로 합성할 수 있는 DNA 절편으로 <T7 프로모터 다음에 5'UTR, 관심 mRNA를 코딩하는 ORF, 3'UTR>로 구성된 DNA 절편을 설계하였다.
본 발명의 관심 DNA는 pUC19 벡터에서 T7 promoter와 5'UTR의 하류에 위치하면서, muag (mutated alpha-globin-3′UTR), A64 폴리(A) 서열, 폴리(C) 서열(C30) 및 히스톤 스템-루프 서열(히스톤-SL)서열의 상류에 위치하게 하였다.
상기 관심 DNA 절편을 구성하는 단위 요소들은 <표 2>에 일부 제시하였다.
관심 DNA 절편을 구성하는 염기서열
Backbone DNA or amino acid sequences
T7 promoter TAATACGACT CACTATAGGG (서열번호 1)
hAg-Kozak ATTCTTCTGG TCCCCACAGA CTCAGAGAGA ACCCGCCACC(서열번호 2)
Sec ATGAGAGTGA CCGCCCCCAG AACCCTGATC CTGCTGCTGT CTGGCGCCCT GGCCCTGACA GAGACATGGG CCGGAAGCGG ATCC (서열번호 3)
(M R V T A P R T L I L L L S G A L A L T E T W A G S G S (서열번호 4)
muag - A64 - C30 - 히스톤SL GCCCGATGGG CCTCCCAACG GGCCCTCCTC CCCTCCTTGC ACCGAGATTA ATAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAATGCA TCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CCAAAGGCTC TTTTCAGAGC CACCA (서열번호 5)
2 BgUTR CCGAGAGCTC GUCGGCCAAC AAAAGGTTCU TGCCCAAGTC CAACA CAAAC TGGGGGATAT TATGAAGGGC CTTGAGCATC TGGATTCTGC CTAATAAAAA ACATTTACAT TGCTGCGTCG AGAGCTCGCT TCTTGCTGTC CAATTTCTAT TAAAGGTTCC TTTGTTCCCT AAGTCCAACT ACTAAACTGG GGGATATTAT GAAGGGCCTT GAGCATCTGG ATTCTGCCTA ATAAAAAACA TTTACATTGC TGCGTC (서열번호 6)
A30LA70 GAGACCTGGT CCAGAGTCGC TAGCAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAGCATAT GACTAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA(서열번호 7)
(G4S)3-linker GGAGGCGGTG GTAGTGGAGG TGGCGGGTCC GGTGGAGGTG GAAGC(서열번호 8)
(G G G G S G G G G S G G G G S (서열번호 9)
본 발명의 5'UTR는 마우스 리보솜 단백질 라지 35A (mRPL35A)일 수 있으며, 그 염기서열은 서열번호 10이다.
GGGCCATCTT GGCGCCTGTG GAGGCCTGCT GGGAACAGGA CTTCTAACAG CAAGTAAGCT TGAGGATG (서열번호 10)
5'UTR 요소는 5' 말단 올리고피리미딘관이 결여된 인간 리보솜 단백질 라지(Large) 32의 5'-UTR: human ribosamal protein Large 32 lacking the 5' terminal oligopyrimidine tract GGCGCTGCCTACGGAGGTGGCAGCCATCTCCTTCTCGGCATC (서열번호 11)
바람직하게는 인간 하이드록시스테로이드 (17-베타) 디하이드로게나아제 4 유전자(HSD17B4)로부터 유래된 관심 mRNA 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
GGGTCCCGCA GTCGGCGTCC AGCGGCTCTG CTTGTTCGTG TGTGTGTCGT TGCAGGCCTT ATTCAAGCTT ACCATG (서열번호 12)
바람직하게, 상기 5'UTR는 hAg-Kozak로 서열번호 2이다
상기 5'UTR는 Kozak 컨센서스를 포함하며, Kozak 컨센서스 서열은 ACCAUGG (서열번호 13) 일 수도 있다.
3'UTR는 muag - A64 - C30 - 히스톤-SL 및 2 BgUTR-A30LA70을 포함하는 구조에서 선택되어진 어느 하나일 수 있다.
관심단백질이 융합단백질인 경우는 링커는 (G4S)3-linker 그리고. 관심단백질을 세포외부로 분비하는 목적으로 Sec을 사용할 수 있다.
여기에서 3'UTR은 서열 5'-GCCCGaTGGG CCTCCCAACG GGCCCTCCTC CCCTCCTTGC ACCG-3'[서열번호 14; muag; 밑줄 친 뉴클레오타이드는 야생형 서열과 비교하여 돌연변이임; (알파-)글로빈의 돌연변이된 UTR]일 수 있다.
폴리(A) 꼬리는 64개의 아데닌 뉴클레오타이드, 폴리(C) 서열은 30개의 사이토신 뉴클레오타이드, 히스톤 스템-루프는로 이루어진 RNA 서열이다.
A64: GGACTAGTAG ATCTAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA (서열번호 15)
C30: TGCATCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCTCTA G (서열번호 16)
히스톤 스템-루프: (5'-CAAAGGCUCU UUUCAGAGCC ACCA-3' 서열번호 17)
본 발명의 mRNA 발현 카세트는 한 종류 또는 두 종류 이상의 mRNA를 단리된 mRNA 발현카세트에 있을 수 있다.
본 발명의 단리된 mRNA 발현카세트에 IRES, 서열번호 18를 경계로 두 종류 이상의 mRNA가 있을 수 있다.
IRES
GCCCCTCTCC CTCCCCCCCC CCTAACGTTA CTGGCCGAAG CCGCTTGGAA TAAGGCCGGT 60
GTGCGTTTGT CTATATGTTA TTTTCCACCA TATTGCCGTC TTTTGGCAAT GTGAGGGCCC 120
GGAAACCTGG CCCTGTCTTC TTGACGAGCA TTCCTAGGGG TCTTTCCCCT CTCGCCAAAG 180
GAATGCAAGG TCTGTTGAAT GTCGTGAAGG AAGCAGTTCC TCTGGAAGCT TCTTGAAGAC 240
AAACAACGTC TGTAGCGACC CTTTGCAGGC AGCGGAACCC CCCACCTGGC GACAGGTGCC 300
TCTGCGGCCA AAAGCCACGT GTATAAGATA CACCTGCAAA GGCGGCACAA CCCCAGTGCC 360
ACGTTGTGAG TTGGATAGTT GTGGAAAGAG TCAAATGGCT CACCTCAAGC GTATTCAACA 420
AGGGGCTGAA GGATGCCCAG AAGGTACCCC ATTGTATGGG ATCTGATCTG GGGCCTCGGT 480
GCACATGCTT TACATGTGTT TAGTCGAGGT TAAAAAACGT CTAGGCCCCC CGAACCACGG 540
GGACGTGGTT TTCCTTTGAA AAACACGATG ATAAT 575 (서열번호 18)
본 발명의 mRNA 발현 카세트는 한 종류 또는 두 종류 이상의 단백질을 단리된 mRNA 발현카세트에서 제조할 수 있다.
본 발명에서 단리된 mRNA 발현카세트에서 두 종류 이상의 단백질을 단백질 분해 효소를 갖는 도메인(펩티드)를 이용할 수 있다.
2A 펩티드는, 바이러스 유래의 자기 절단형 펩티드이며, 서열 번호 23으로 표현되는 아미노산 서열 중의 G-P 사이(C 말단에서 1 잔기의 위치)가 소포체로 절단되는 특징을 갖는다(Szymczak et al., Expert Opin. Biol. Ther. 5(5):627-638(2005)). 그러므로, 2A 펩티드를 통해 그 전후에 삽입된 핵산은, 세포 내에서 서로 독립적으로 발현하게 된다.
2A peptide cleavage region;
Asp Xaa Glu Xaa Asn Pro Gly Pro (서열번호 19)
상기 2A 펩티드로서는, 피코나 바이러스, 로타 바이러스, 곤충 바이러스, 애프도 바이러스 또는 트리파노소마바이러스 유래의 2A 펩티드인 것이 바람직하고, 서열 번호 24로 표현되는 피코나 바이러스 유래의 2A 펩티드(F2A)인 것이 보다 바람직하다.
2A peptide(F2A);
Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro (서열번호 20)
본 발명의 관심 DNA는 관심 mRNA를 효율적으로 합성할 수 있는 mRNA 발현카세트 주형 DNA 절편으로 <T7 promoter - 5'UTR - 관심 DNA - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL> 순서로 제조할 수 있으며 관심 단백질이 CAR의 경우는 DNA 절편은 하기와 같다.
1) 키메릭 항원 수용체(CAR)
가장 먼저, 본 발명의 관심 DNA은 키메릭 항원 수용체(CAR)로 암세포 특이적 항원을 인식하는 역할을 하며 이를 포함하는 mRNA 발현 카세트를 제공한다.
상기 암세포 특이적 항원은 LILRB4, EGP2(Epithelial glycoprotein 2), EGP40(Epithelial glycoprotein 40), TAG72(Tumor associated glycoprotein 72), IL13Rα2(Interleukin 13 receptor alpha-2 subunit), CA IX(Carbonic anhydrase IX), CD19, CD52, CD33, CD20, TSLPR, CD22, CD30, GD3, CD171, ALK(Anaplastic lymphoma kinas), CD47, EGFRvIII, NCAM(Neural cell adhesion molecule), FBP(Folate binding protein), Le(Y)(Lewis-Y antigen), MUC1(Mucin 1), PSCA(Prostate stem cell antigen), PSMA(Prostate-specific membrane antigen), FGFR4(Fibroblast growth factor receptor 4), FAR(Fetal acetylcholine receptor), CEA(Carcinoembryonic antigen), HER2(Human epidermal growth factor receptor 2), Mesothelin, CD44v6(Hyaluronate receptor variant 6), B7-H3, Glypican-3,5, ROR1, Survivin, FOLR1(folate receptor), WT1(Wilm's tumor antigen), CD70 및 VEGFR2(Vascular endothelial growth factor 2)을 포함하는 군으로부터 선택된 것이다.
본 발명은 CAR을 코딩하는 mRNA 카세트를 봉입한 면역세포 표적화 구조체로 체내에서 일시적으로 유전적으로 변형된 면역세포의 제조 방법의 개발에 초점을 맞춘다. 본 발명의 제조 방법은 면역세포와 관심 mRNA의 치료 효과 간의 효과적인 상승작용을 특징으로 하는 체내에서 CAR 단백질을 갖는 세포 집단을 제조할 수 있도록 한다.
"키메라 항원 수용체" (CAR)는 항원에 대한 원하는 특이성을 면역 이펙터 세포, 예컨대 T 세포 및 NK 세포로 형질도입할 수 있는 조작된 수용체를 지칭한다. 전형적으로, CAR 단백질은 원하는 특이성을 도입하는 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 면역 이펙터 세포가 항원에 결합할 때 면역 이펙터 세포에 신호를 전달하는 세포내 도메인을 포함한다. 세포외 도메인은 리더 펩티드, 항원 인식 영역 및 스페이서 영역을 포함한다. 항원 인식 영역은 항원에 특이적으로 결합하는 항체로부터 유래된다. 항원 인식 영역은 항체로부터 유래된 단일-쇄 가변 단편(scFv)이다. 단일-쇄 가변 단편(scFv)은 인간화 항체(HuCAR scFv)로부터 유래된다. 단일-쇄 가변 단편은 가요성 링커를 통해 경쇄 가변 영역에 융합된 중쇄 가변 영역을 포함한다.
(항 LILRB4 CAR mRNA 카세트 주형 DNA)
본 발명의 mRNA 발현 카세트는 LILRB4에 결합하는 항체로부터 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인을 코딩한다.
백혈구 면역 글로불린-유사 수용체 서브 패밀리 B 구성원 4는 인간에서 LILRB4 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. 이 유전자는 19q13.4 염색체 영역의 유전자 클러스터에서 발견되는 백혈구 면역 글로불린 유사 수용체 (LIR) 패밀리의 구성원이다. 암호화된 단백질은 2개 또는 4개의 세포 외 면역 글로불린 도메인, 막 관통 도메인 및 2개 내지 4개의 세포질 면역 수용체 티로신 기반 억제 모티프 (ITIM)를 포함하는 LIR 수용체의 서브 패밀리 B 클래스에 속한다. 수용체는 단핵구 세포에서 발현되고 면역 반응의 자극을 억제하는 음성 신호를 전달한다. 수용체는 항원 포획 및 제시에서도 기능 할 수 있다. 면역 반응에 집중하고자가 반응을 제한하기 위해 염증 반응과 세포 독성을 조절한다. 단핵구 골수성 백혈병 세포에서 LILRB4의 발현은 침윤을 지원하고 T 세포 증식을 억제한다. 이 유전자에 대해 서로 다른 이소 형을 암호화하는 여러 전사체 변이체가 발견되었다.
mRNA 발현 카세트는 그의 구성성분을 포함하여 제공된다. mRNA 발현 카세트를 포함하는 T 림프구가 그의 구성 성분을 포함하여 제공된다. mRNA 발현 카세트를 포함하는 포유동물 세포가 그의 구성 성분을 포함하여 제공된다. 재조합 단백질을 코딩하는 ORF(open reading frame)이 제공된다. 재조합 단백질은 (i) 중쇄 가변 (VH) 영역 및 경쇄 가변 (VL) 영역에 의해 형성된 중심 공동을 포함하는 항체 영역 (여기서 중심 공동은 골격 영역 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 결합부위를 형성한다); 및 (ii) 막관통 도메인을 포함한다.
재조합 단백질은 항체 중쇄 가변 도메인을 포함하는 제1 부분 및 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 불변 도메인을 포함하는 제2 부분을 포함하고, 여기서 제1 부분은 막관통 도메인을 추가로 포함하며, 여기서 항체 중쇄 가변 도메인, 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 불변 도메인이 함께 항체 영역을 형성한다.
재조합 단백질은 항체 중쇄 가변 도메인을 포함하는 제1 부분 및 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 불변 도메인을 포함하는 제2 부분을 포함하며, 여기서 제1 부분은 막관통 도메인을 추가로 포함하고, 여기서 항체 중쇄 가변 도메인, 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 불변 도메인이 함께 항체 영역을 형성한다.
재조합 단백질은 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는 제1 부분, 및 항체 경쇄 가변 도메인을 포함하는 제2 부분을 포함하며, 여기서 제1 부분은 막관통 도메인을 추가로 포함하고, 여기서 항체 중쇄 가변 도메인, 항체 중쇄 불변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이 함께 항체 영역을 형성한다.
재조합 단백질은 항체 중쇄 가변 도메인을 포함하는 제1 부분 및 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 불변 도메인을 포함하는 제2 부분을 포함하며, 여기서 제2 부분은 막관통 도메인을 추가로 포함하고, 여기서 항체 중쇄 가변 도메인, 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 불변 도메인이 함께 항체 영역을 형성한다.
재조합 단백질은 항체 중쇄 가변 도메인을 포함하는 제1 부분 및 항체 경쇄 가변 도메인을 포함하는 제2 부분을 포함하며, 여기서 제2 부분은 막관통 도메인을 추가로 포함하고, 여기서 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이 함께 항체 영역을 형성한다.
재조합 단백질을 포함하는 포유동물 세포가 그의 구성 성분을 포함하여 제공되며, 여기서 막관통 도메인은 포유동물 세포의 세포막 내에 있다.
막관통 도메인은 CD8α 막관통 도메인이다. 본발명에 제공된 바와 같은 용어 "CD8α 막관통 도메인"은 CD8α의 막관통 도메인의 재조합 또는 자연-발생 형태 중 임의의 것을 포함한다. 일부 측면에서, 변이체 또는 상동체는 자연 발생 CD8α 막관통 도메인 폴리펩티드와 비교하여 전체 서열 또는 서열의 일부에 걸쳐 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
CD8α 막관통 도메인은 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT (서열번호 21)의 폴리펩티드 서열을 갖는다. CD8 α 막관통 도메인은 ATCTACATCTGGGCTCCACTGGCAGGAACCTGTGGCGTGCTGCTGCTGTCCCTGGTCATCACA (서열번호 22)의 핵산 서열에 의해 코딩된 단백질이다.
막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인이다. 본발명에 제공된 바와 같은 용어 "CD28 막관통 도메인"은 CD28의 막관통 도메인의 재조합 또는 자연-발생 형태, 또는 CD28 막관통 도메인 활성을 유지하는 그의 변이체 또는 상동체 중 임의의 것을 포함한다. 일부 측면에서, 변이체 또는 상동체는 자연 발생 CD28 막관통 도메인 폴리펩티드와 비교하여 전체 서열 또는 서열의 일부에 걸쳐 적어도 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
CD28 막관통 도메인은 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (서열번호 23)의 폴리펩티드 서열을 갖는다. CD28 막관통 도메인은 TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG (서열번호24)의 핵산 서열에 의해 코딩된 단백질이다.
세포내 T 세포 신호전달 도메인은 CD3-ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인이다. 일부 실시 양태에서, 세포내 T 세포 신호전달 도메인은 인간 CD3 복합체의 제타 (ζ) 쇄의 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구성 성분에서, 세포내 T 세포 신호전달 도메인은 CD3-ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인이다.
세포내 T 세포 신호전달 도메인은 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (서열번호 25)의 아미노산 서열을 가진 단백질 CD3zIso1이다.
세포내 T 세포신호전달 도메인은 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (서열번호 26)의 아미노산 서열을 가지며, AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA (서열번호 27)의 핵산 서열에 의해 코딩된 단백질 CD3zIso3이다.
단리된 mRNA 발현 카세트는 세포내 공동-자극 신호전달 도메인을 코딩하는 세포내 공동자극 신호전달 서열을 포함한다. "세포내 공동-자극 신호전달 도메인"은 그의 구성 성분을 포함하여 항체 영역에 항원의 결합에 반응하여 공동-자극 신호전달을 제공할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 공동-자극 신호전달 도메인의 신호 전달은 시토카인의 생성 및 이를 발현하는 T 세포의 증식을 결과한다. 세포내 공동-자극 신호전달 도메인은 CD28 세포내 공동-자극 신호전달 도메인, 4-1BB 세포내 공동-자극 신호전달 도메인이다. 세포내 공동자극 신호전달 도메인은 CD28 세포내 공동-자극 신호전달 도메인, 4-1BB 세포내 공동-자극 신호전달 도메인, ICOS 세포내 공동-자극 신호전달 도메인, OX-40 세포내 공동-자극 신호전달 도메인 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
CD28 공동-자극 도메인은 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(서열번호 28)의 폴리펩티드 서열을 갖는다. CD28 세포내 공동-자극 신호전달 도메인은 AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC (서열번호 29)의 핵산 서열에 의해 코딩된 단백질이다.
4-1BB 세포내 공동-자극 신호전달 도메인은 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (서열번호 30)의 폴리펩티드 서열을 갖는다. 4-1BB 세포내 공동-자극 신호전달 도메인은 AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG (서열번호 31)의 핵산 서열에 의해 코딩된 단백질이다.
단리된 mRNA 발현 카세트는 스페이서 영역을 코딩하는 스페이서 서열을 포함한다. "스페이서 영역"은 항체 영역을 막관통 도메인과 연결하거나, 항체 영역의 다양한 성분을 연결하는 폴리펩티드이다. 일부 구성 성분에서, 스페이서 영역은 항체 영역과 막관통 도메인 사이에 있다. 일부 구성 성분에서, 스페이서 영역은 중쇄 가변 영역을 막관통 도메인과 연결한다. 일부 구성 성분에서, 스페이서 영역은 중쇄 불변 영역을 막관통 도메인과 연결한다. 일부 구성 성분에서, 스페이서 영역은 경쇄 가변 영역을 막관통 도메인과 연결한다. 일부 구성 성분에서, 스페이서 영역은 경쇄 불변 영역을 막관통 도메인과 연결한다.
항원에 대한 항체 영역의 결합 친화도는 스페이서 영역의 부재와 비교하여 증가된다. 일부 구성 성분에서, 항체 영역과 항원 사이의 입체 장애는 스페이서 영역의 존재하에 감소된다.
스페이서 영역은 힌지 영역을 포함한다. 힌지 영역은 CD8α 힌지 영역이다. 힌지 영역은 CD28 힌지 영역이다.
스페이서 영역은 Fc 영역을 포함한다. 본발명에 제공된 조성물 및 방법에 대해 고려되는 스페이서 영역의 예는 면역글로불린 분자 또는 그의 단편 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) 및 Fc 수용체 결합에 영향을 미치는 돌연변이를 포함하는 면역글로불린 분자 또는 그의 단편 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)을 제한 없이 포함한다. 일부 구성 성분에서, 스페이서 영역은 IgG의 단편 (예를 들어, IgG4)이며, 여기서 상기 단편은 CH2 도메인의 결실을 포함한다. 스페이서 영역은 펩티드 링커일 수 있다. 일부 구성 성분에서, mRNA 발현 카세트는 스페이서 영역을 코딩하는 스페이서 서열을 포함하지 않는다.
스페이서 영역은 항체 영역의 다양한 성분을 연결한다. 일부 구성 성분에서, 스페이서 영역은 중쇄 가변 영역을 경쇄 가변 영역과 연결한다.
단리된 mRNA 발현 카세트는 링커 도메인을 코딩하는 링커 서열을 포함한다. 링커 도메인은 scFv의 VH 및 VL 사이에 삽입된다. 링커 도메인은 막관통 도메인과 세포내 T 세포 신호전달 도메인 사이에 있다. 일부 구성 성분에서, 링커 도메인은 세포내 T 세포 신호전달 도메인과 세포내 공동-자극 신호전달 도메인 사이에 있다. 일부 구성 성분에서, 링커 도메인은 서열 GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 32)을 포함한다.
단리된 mRNA 발현 카세트는 링커 도메인을 코딩하는 링커 서열을 포함하지 않는다.
mRNA 발현 카세트는 (i) 단백질의 중쇄 도메인을 코딩하는 중쇄 서열 (여기서 중쇄 도메인은 가변 중쇄 도메인 및 막관통 도메인을 포함한다); 및 (ii) 단백질의 경쇄 도메인을 코딩하는 경쇄 서열 (여기서 경쇄 도메인은 가변 경쇄 도메인을 포함한다)을 포함하며, 여기서 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인이 함께 항체 영역의 적어도 일부를 형성한다.
mRNA 발현 카세트는 (i) 단백질의 중쇄 도메인을 코딩하는 중쇄 서열 (여기서 중쇄 도메인은 가변 중쇄 도메인을 포함한다); 및 (ii) 단백질의 경쇄 도메인을 코딩하는 경쇄 서열 (여기서 경쇄 도메인은 가변 경쇄 도메인 및 막관통 도메인을 포함한다)을 포함하며, 여기서 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인이 함께 항체 영역의 적어도 일부를 형성한다.
"중쇄 서열"은 본발명에 제공된 중쇄 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 지칭한다. 중쇄 도메인은 중쇄 가변 (VH) 영역 및/또는 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함할 수 있다. "경쇄 서열"은 본발명에 제공된 경쇄 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 지칭한다. 경쇄 도메인은 경쇄 가변 (VL) 영역 및/또는 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함할 수 있다. "중쇄 도메인"은 관련 기술분야의 그의 통상적인 의미에 따라 사용되고 중쇄 가변 (VH) 영역 및 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. "경쇄 도메인"은 관련 기술분야의 그의 통상적인 의미에 따라 사용되고 경쇄 가변 (VL) 영역 및 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구성 성분에서, 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인은 인간화된다.
단백질 또는 항체 영역은 그의 구성 성분을 포함하여, 예를 들어 LILRB4에 결합하는 항체의, 중쇄 CDR 1, 2, 및/또는 3 및/또는 경쇄 CDR1, 2, 및/또는 3을 포함하여, 하나 이상의, 또는 모든 CDR (또는 상기 CDR과 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성으로 또는 적어도 약 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 포함하는 CDR)과 항원 결합에 대해 경쟁하고, 구체적으로 상기 하나 이상의, 또는 모든 CDR과 동일한 항원 또는 에피토프에 결합하고/거나 상기 하나 이상의, 또는 모든 CDR을 함유한다.
mRNA 발현 카세트는 LILRB4에 결합하는 항체로부터 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인을 코딩한다. 일부 구성 성분에서, 항체 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산은 서열번호 33 또는 서열번호 34에 있다. 항체 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산은 서열번호 35 또는 서열번호 36에 있다.
LILRB4 항체 중쇄 가변 도메인 1
GAGGTGCAGC TGCTGGAGAG CGGAGGAGGC CTGGTGCAGC CTGGAGGATC CCTGAGGCTG 60
TCCTGTGCCG CCTCCGGCAT CGACTTCTCC AACCACTACT ACATCTACTG GGTGAGGCAG 120
GCTCCCGGCA AGGGACTGGA GTGGATCGGC TGTATCTTCT CCGGCGACTC CGCCTCCACC 180
TACTACGCCT CCTGGGCCAA GGGCAGGTTT ACCATCTCCC GGGACAACTC CAAGAACACC 240
CTGTACCTGC AGATGAACTC CCTGAGGGCC GAGGACACCG CTGTGTACTA CTGCGCCAGG 300
GGCATGTCCA CCAACGACTG GGCTTCCGAT CTGTGGGGCC AGGGCACACT GGTGACCGTG 360
TCCAGC 366 (서열번호 33)
LILRB4 항체 중쇄 가변 도메인 2
GAGGTGCAGC TGCTGGAATC CGGAGGAGGA CTGGTGCAGC CTGGCGGATC CCTGAGGCTG 60
TCCTGCGCTG CTTCCGGCTT CTCCCTGATC AGCTACGACA TGTACTGGGT GAGGCAGGCT 120
CCTGGCAAGG GCCTGGAGTA CATCGGCATC ATCTACTCCG ACGGCTACAC CTTCTACGCC 180
ACCGGCGCCA AGGGCAGGTT CACCATCTCC AGGGACAACT CCAAGAACAC CCTGTACCTG 240
CAGATGAACT CCCTGAGGGC CGAGGACACC GCCGTGTACT ACTGCGCCAC CAACGCCTTC 300
GCTCTGTGGG GCAGGGGCAC ACTGGTGACC GTCTCCTCC 339 (서열번호 34)
LILRB4 항체 경쇄 가변 도메인 1
GACATCCAGA TGACCCAGTC CCCTTCCTCC CTGTCCGCTT CCGTGGGCGA TAGGGTGACC 60
ATCACCTGCC AGGCCTCCGA GTCCATCAAC AGCATCTACC TGGCCTGGTA CCAGCAGAAG 120
CCCGGCAAGG CCCCCAAGCT GCTGATCTAT CGGGCTTCCA CACTGGCCTC CGGAGTGCCT 180
TCCAGGTTTT CCGGCTCCGG CTCCGGCACC GACTTCACCC TGACCATCTC CAGCCTGCAG 240
CCCGAGGACT TCGCCACCTA CTACTGCCAG CAGTCCTACG ACTGGGGCGA CGTGGAGAAC 300
ACCTTTGGCG GCGGCACCAA GGTGGAGATC AAG 333 9서열번호 35)
LILRB4 항체 경쇄 가변 도메인 2
GCCATCCAGC TGACCCAGTC CCCTTCCTCC CTGTCCGCTT CCGTGGGCGA CAGGGTGACC 60
ATCACCTGCC AGTCCTCCCA GAACGTGTAC AACAACAACT GGCTGGTCTG GCTGCAGCAG 120
AAGCCCGGCA AGGCCCCTAA GAGGCTGATC TACACCGCTT CCTCCCTGGC TTCCGGAGTG 180
CCCTCCAGGT TTTCCGGCTC CGGCTCCGGC ACCGATTTCA CCCTGACCAT CTCCTCCCTG 240
CAGCCCGAGG ACTTCGCCAC CTACTACTGC GCCGGCGGCT ACTCCGGCCC TATCTACACC 300
TTCGGCGGCG GCACCAAGGT GGAGATCAAG 330 (서열번호 36)
단리된 mRNA 발현 카세트는 N-말단으로부터 C-말단으로 단백질: 리더 펩티드, 항-LILRB4 중쇄 가변 도메인, 링커 도메인, 항-LILRB4 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1-CH2-CH3 도메인, 스페이서 영역, CD28 막관통 도메인, 4-1BB 세포내 공동-자극 신호전달 도메인 및 CD3-ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 코딩한다.
단리된 mRNA 발현 카세트는 N-말단으로부터 C-말단으로 단백질: 리더 펩티드, 항-LILRB4 중쇄 가변 도메인, 링커 도메인, 항-LILRB4 경쇄 가변 도메인, 스페이서 영역, CD28 막관통 도메인, 4-1BB 세포내 공동-자극 신호전달 도메인 및 CD3-ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 코딩한다.
단리된 mRNA 발현 카세트는 N-말단으로부터 C-말단으로 단백질: 리더 펩티드, 항-LILRB4 중쇄 가변 도메인, 링커 도메인, 항-LILRB4 경쇄 가변 도메인, 스페이서 영역, CD28 막관통 및 공동-자극 도메인, 및 CD3-ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 코딩한다.
단리된 mRNA 발현 카세트는 N-말단으로부터 C-말단으로 단백질: 리더 펩티드, 항-LILRB4 중쇄 가변 도메 인, 링커 도메인, 항-LILRB4 경쇄 가변 도메인, 스페이서 영역, CD8α 막관통 도메인 (또는 CD28 막관통 도메인), 4-1BB 세포내 공동-자극 신호전달 도메인 (또는 CD28 세포내 공동-자극 신호전달 도메인) 및 CD3-ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 코딩한다.
단백질은 N-말단으로부터 C-말단으로 다음을 포함한다: ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG (서열번호 37)의 핵산에 의해 코딩된 리더 펩티드, 서열번호 33 또는 서열번호 34의 핵산에 의해 코딩된 항-LILRB4 중쇄 가변 도메인, GGTGGAGGCGGTTCAGGTGGCGGCGGTTCGGGCGGTGGCGGCTCT (서열번호 38)의 핵산에 의해 코딩된 링커 도메인, 서열번호 35 또는 서열번호 36의 핵산에 의해 코딩된 항-LILRB4 경쇄 가변 도메인, ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT (서열번호 39)의 핵산에 의해 코딩된 힌지 영역, 서열번호 21의 핵산에 의해 코딩된 CD8α 막관통 도메인 (또는 CD28 막관통 도메인), 서열번호 28의 핵산에 의해 코딩된 CD28 세포내 공동-자극 신호전달 도메인; 서열번호 29의 핵산에 의해 코딩된 4-1BB 세포내 공동자극 신호전달 도메인 및 서열번호 30의 핵산에 의해 코딩된 CD3-ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인.
제공된 단리된 mRNA 발현 카세트는 리더 펩티드를 코딩하는 서열번호 35, 항-LILRB4 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 서열번호 33 또는 서열번호 34, 링커 도메인을 코딩하는 서열번호 38, 항LILRB4 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 서열번호 35 또는 서열번호 36, 힌지 영역을 코딩하는 서열 번호 39, CD8α 막관통 도메인 (또는 CD28 막관통 도메인)을 코딩하는 서열번호 22, CD28 세포내 공동-자극 신호전달 도메인을 코딩하는 서열번호 30, 4-1BB 세포내 공동-자극 신호전달 도메인을 코딩하는 서열번호 31, 및 CD3-ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 코딩하는 서열번호 25를 포함한다.
(항 HLA-G CAR mRNA 카세트 주형 DNA)
본 발명의 mRNA 발현 카세트는 HLA-G에 결합하는 항체로부터 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인을 코딩한다.
인간 백혈구 항원 G (HLA-G)로도 알려진 HLA-G 조직 적합성 항원, 클래스 I, G는 인간에서 HLA-G 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. HLA-G는 융모암 세포에서 처음 확인된 비고전적인 HLA 클래스 I 분자이다. 고전적인 HLA 클래스 I 분자와는 달리, HLA-G는 제한된 다형성을 특징으로 하며 그 발현, 구조 및 기능도 상이하다. HLAG의 1차 전사체는 교대로 스플라이싱되어 7개의 동형이 발현되는데, 여기서 4개는 막 결합 (HLA-G1, HLA G2, HLA-G3 및 HLA-G4)이고 나머지 3개는 가용성 (HLA-G5, HLA-G6 및 HLA-G7)이다. HLA-G1 및 HLA-G5는 가장 많이 연구된 동형체이며 고전적인 HLA 클래스 I 분자의 전형적인 구조를 나타낸다. B2-마이크로 글로불린 (B2M)과 펩타이드에 비공유 결합된 세 개의 구형 도메인으로 구성된 중쇄, 반면 다른 동형은 더 짧고 중쇄의 하나 또는 두 개의 도메인이 결여되어 있으며 B2M에 결합하지 아니한다.
CAR 면역 요법을 개발하기 위한 기본 기준은 적절한 TAA의 식별, 형질 전환 이펙터 세포의 접근성 및 면역 억제성 종양 미세 환경의 가역성이며, 또한 종양 세포에 의한 HLA-G의 신발현 및 그에 대한 기여도 고려한다. 종양 미세 환경의 면역 억제 효과와 immune checkpoint(ICP)로서의 역할과 면역 탈출 메커니즘에서 HLA-G는 이 분자를 차단할 수있는 새로운 면역 요법을 개발할 수있는 탁월한 후보이다. 더욱이 동종 HLA-G에 대한 자극 기능이나 세포 반응이 보고되지 않았고 HLA-G 발현이 조직 제한이라는 점을 감안할 때 HLA-G에 대한 세포 용해 CAR 세포의 생성은 분야에서 새로운 가능성을 열 암 면역 요법이다.
CAR mRNA 발현 카세트는 그의 구성성분을 포함하여 제공된다. mRNA 발현 카세트를 포함하는 림프구가 그의 구성 성분을 포함하여 제공된다. mRNA 발현 카세트를 포함하는 포유동물 세포가 그의 구성 성분을 포함하여 제공된다. 재조합 단백질을 코딩하는 ORF(open reading frame)이 제공된다. 재조합 단백질은 (i) 중쇄 가변 (VH) 영역 및 경쇄 가변 (VL) 영역에 의해 형성된 중심 공동을 포함하는 항체 영역 (여기서 중심 공동은 골격 영역 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 결합부위를 형성한다); 및 (ii) 막관통 도메인을 포함한다.
mRNA 발현 카세트는 (i) 단백질의 중쇄 도메인을 코딩하는 중쇄 서열 (여기서 중쇄 도메인은 가변 중쇄 도메인 및 막관통 도메인을 포함한다); 및 (ii) 단백질의 경쇄 도메인을 코딩하는 경쇄 서열 (여기서 경쇄 도메인은 가변 경쇄 도메인을 포함한다)을 포함하며, 여기서 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인이 함께 항체 영역의 적어도 일부를 형성한다.
mRNA 발현 카세트는 (i) 단백질의 중쇄 도메인을 코딩하는 중쇄 서열 (여기서 중쇄 도메인은 가변 중쇄 도메인을 포함한다); 및 (ii) 단백질의 경쇄 도메인을 코딩하는 경쇄 서열 (여기서 경쇄 도메인은 가변 경쇄 도메인 및 막관통 도메인을 포함한다)을 포함하며, 여기서 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인이 함께 항체 영역의 적어도 일부를 형성한다.
본 발명은 항 HLA-G 항체의 항원 결합 도메인, 막 관통 도메인 및 세포 내 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 제공하며, 여기서 상기 CAR은 1개 내지 6개의 HLA-G 동형 (들), 바람직하게는 2개 내지 5개에 특이적으로 결합한다. HLA-G 동형, 바람직하게는 그러한 CAR은 HLA-G 동형의 구별을 허용한다. 즉, CAR은 7 개의 HLA-G 동형 모두를 인식하거나 결합하지 않는다.
한 측면에서, CAR은 B2M-프리 HLA-G 또는 B2M-관련 HLA-G 동형에 특이적으로 결합한다. 대안적으로, CAR은 HLA-G1, HLA-G2, HLA-G5 및 HLA-G6로 구성된 그룹에서 선택된 HLA-G 이소형에 특이적으로 결합한다. 또 다른 측면에서, CAR은 HLA-G1 및 HLA-G5 둘 다, 또는 HLA-G2 및 HLA G6 둘 다 및/또는 HLA-G1/B2M-유리 및 HLA-G5/62M 자유 동형 모두에 특이적으로 결합한다.
본 발명은 특히 N 내지 C 말단을 순차적으로 포함하는 항 HLA-G 키메라 항원 수용체 (CAR)를 제공한다: (a) 펩티드 신호 서열, b) 항-HLA-G 항체 또는 이의 항원 결합 단편, c) 선택적으로 스페이서 도메인, d) 막 관통 도메인, e) 세포 내 도메인, 및 선택적으로 f) 절단 가능한 링커 및 선택적으로 g) 절단된 인간 CD19 도메인.
한 측면에서, 스페이서 도메인은 (i) 인간 IgG4 힌지 도메인, (ii) 인간 IgG4 힌지 도메인 및 CH3 인간 IgG4 도메인 또는 (iii) 돌연변이된 CH2 인간 IgG4 도메인, 인간 IgG4 힌지 도메인 및 CH3 인간 IgG4 힌지 도메인을 포함하거나 그로 구성된다. 바람직하게는, 스페이서 도메인은 (i) 서열 번호 : 25, (ii) 서열 번호 : 25 및 서열 번호 : 27, 또는 (iii) 서열 번호 : 25, 서열 번호에 제시된 서열을 포함하거나 그로 구성된다. No : 26 및 SEQ ID No : 27, 또는 80 % 초과, 바람직하게는 90 % 초과, 더욱 바람직하게는 95 % 초과의 동일성을 나타내는 상 동성 서열.
특정 측면에서, 막 횡단 도메인은 CD28, CD3 및 CD8 막 횡단 도메인으로부터 선택되고, 바람직하게 막 횡단 도메인은 CD28 막 횡단 도메인이다.
바람직하게는, 본 발명의 항 HLA-G CAR은 CD3 제타 신호 전달 도메인 및 CD28, 41BB, CD28, CD134, ICOS, OX40, CD149, DAP10, CD30으로부터 선택된 적어도 하나의 공동 자극 도메인 (들)을 포함하는 세포 내 도메인을 포함한다. IL2-R, IL7r6, IL21-R, NKp30, NKp44, CD27, CD137 및 DNAM-1 공동 자극 도메인, 바람직하게 두 공동 자극 도메인은 41BB 및 CD28 공동 자극 도메인이다.
한 측면에서, 절단 가능한 링커는 P2A, T2A, E2A, B2A 및 F2A로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 측면에서, 절단된 인간 CD19 도메인은 서열 번호 : 29에 제시된 서열로 구성된다. 특히, CAR, 항-HLA-G 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 바람직하게는 scFV는 B2M-유리 HLA-G에 선택적으로 결합한다. 또는 B2M 관련 HLA-G 동형에 대한 것이지만 모든 HLA-G 동형에 결합하지는 않는다.
다른 측면에서, CAR, 항-HLA-G 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 바람직하게는 scFV, 또는 CAR을 발현하는 세포는 HLA-G의 알파 도메인에 결합하지 않는다. 바람직하게는, 항-HLA-G 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함하는 항-HLA-G scFv이다:
(a) (i) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 1 또는 서열 번호 1과 80 % 초과, 바람직하게는 90 % 초과, 더욱 바람직하게는 95 % 초과의 동일성을 나타내는 상동 서열을 포함하고; (ii) 경쇄 가변 영역은 서열 번호 2 또는 서열 번호 2와 80 % 초과, 바람직하게는 90 % 초과, 더욱 바람직하게는 95 % 이상의 동일성을 나타내는 상 동성 서열을 포함하고; 또는
(b) (i) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 3 또는 서열 번호 3과 80 % 이상, 바람직하게는 90 % 이상, 더욱 바람직하게는 95 % 이상의 동일성을 나타내는 상동 서열을 포함하고; (ii) 경쇄 가변 영역은 서열 번호 4 또는 서열 번호 4와 80 % 초과, 바람직하게는 90 % 초과, 더욱 바람직하게는 95 % 초과의 동일성을 나타내는 상동 서열을 포함한다.
바람직하게는 CAR의 항원 결합 도메인은 B2M 관련 HLA-G에 특이적으로 결합하는 scFv이고; 바람직하게는 HLA-G1 및 HLA-G5 모두에 대해, scFv는 다음을 포함한다:
(a) (i) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 1 또는 서열 번호 1과 80 % 초과, 바람직하게는 90 % 초과, 더욱 바람직하게는 95 % 초과의 동일성을 나타내는 상동 서열을 포함하고; (ii) 경쇄 가변 영역은 서열 번호 2 또는 서열 번호 2와 80 % 초과, 바람직하게는 90 % 초과, 더욱 바람직하게는 95 % 이상의 동일성을 나타내는 상 동성 서열을 포함하고; 또는 (b) (i) 중쇄 가변 영역의 CDR (상보성 결정 영역) 1, CDR2 및 CDR3은 서열 번호 1을 포함하고; 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 서열 번호 2를 포함한다.
대안적으로, CAR의 항원 결합 도메인은 B2M-프리 HLA-G, 바람직하게는 HLA-G2 및 HLA-G6 둘 다 및/또는 HLA-G1/B2M- 프리 및 HLA-G5/B2M 둘 다에 특이적으로 결합하는 scFv-자유 동형이다. scFv는 다음을 포함합니다.
(a) (i) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 3 또는 서열 번호 3과 80 % 초과, 바람직하게는 90 % 초과, 더욱 바람직하게는 95 % 초과의 동일성을 나타내는 상동 서열을 포함하고; (ii) 경쇄 가변 영역은 서열 번호 4 또는 서열 번호 4와 80 % 초과, 바람직하게는 90 % 초과, 더욱 바람직하게는 95 % 이상의 동일성을 나타내는 상동성 서열을 포함하고; 또는
(b) (i) 중쇄 가변 영역의 CDR (상보성 결정 영역) 1, CDR2 및 CDR3은 서열 번호 3을 포함하고; 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 서열 번호 4를 포함한다.
바람직하게는, CAR의 세포 내 도메인은 CD3 제타 신호 전달 도메인 및 선택적으로 CD28, 4166, CD28, CD134, ICOS, OX40, CD149, DAP10, CD30, IL2-R, IL7r6로부터 선택된 적어도 하나의 공동 자극 도메인 (들)을 포함하고, IL21-R, NKP30, NKP44, CD27, CD137 및 DNAM-1 공동 자극 도메인, 바람직하게는 두 공동 자극 도메인은 4166 및 CD28 공동 자극 도메인입니다. 바람직하게는, CAR의 막 횡단 도메인은 CD28, CD3 및 CD8 막 횡단 도메인으로부터 선택되고, 바람직하게 막 횡단 도메인은 CD28 막 횡단 도메인이다.
바람직하게는, CAR은 항원 결합 도메인을 막 관통 도메인에 연결하는 힌지 영역, 바람직하게는 (i) CD28 힌지, (ii) CD8 알파 힌지, (iii) 인간 IgG4 힌지 도메인으로 구성된 군에서 선택되는 힌지 영역을 추가로 포함합니다. , (iv) 인간 IgG4 힌지 도메인 및 CH3 인간 IgG4 도메인 및 (v) 돌연변이 된 CH2 인간 IgG4 도메인, 인간 IgG4 힌지 도메인 및 CH3 인간 IgG4 힌지 도메인.
본 발명은 또한 적어도 2 개의 상이한 항원 결합 도메인, 막 관통 도메인 및 세포 내 도메인을 포함하는 다중 특이 적 CAR 구축물에 관한 것이며, 여기서 항원 결합 도메인 중 적어도 하나는 B2M 도메인과 관련된 HLA-G 이소 형에 특이 적으로 결합한다. HLA-G의; 항원 결합 도메인 중 적어도 다른 하나는 HLA-G의 B2M 도메인과 연관되지 않은 HLA-G 동형에 특이적으로 결합한다.
바람직하게는, 다중 특이적 CAR 구축물은 (i) 각각 서열 번호 11, 12 및 13의 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3)을 포함하는 도메인을 포함하는 이중 특이적 CAR 구축물이다, (ii) 각각 SEQ ID NO : 14, 15 및 16의 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3)을 포함하는 도메인, (iii) CDR 1, 2 및 3을 포함하는 도메인 (HCDR1) , HCDR2, HCDR3) 각각 서열 번호 : 5, 6 및 7의 서열을 포함하고, (iv) CDR 1, 2 및 3을 포함하는 도메인 (LCDR1, LCDR2, LCDR3)은 서열 번호 8, 9 및 10의 서열을 포함한다. 선택적으로 각 CDR은 선택 적으로 1, 2, 3 또는 4 개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함할 수 있습니다.
본 발명은 또한 본 발명의 CAR을 코딩하는 핵산 분자, 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터 및 본 발명의 CAR 또는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 세포 또는 발현을 구상한다. 본 발명의 벡터, 바람직하게는 세포는 T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, B 세포, NK 세포, NKT 세포, 단핵구 및 수지상 세포로 구성된 군에서 선택되며, 바람직하게는 세포는 T세포, B 세포 또는 NK 세포이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산 분자, 발현 벡터 또는 세포 및 임의로 제약 상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 세포 또는 본 발명의 약제학적 조성물은 암 치료에 사용하거나 바이러스 감염 치료에 사용하기위한 것이다. 이러한 용도를위한 세포 또는 약제학적 조성물은 HLA-G를 표적으로 하지 않는 CAR 요법과 조합하여 투여될 수 있다.
한 측면에서, 제약 조성물은 (i) B2M- 연관 HLA-G와 특이적으로 결합하는 CAR을 포함하는 세포; 바람직하게는 HLA-G1 및 HLA-G5 둘 다, 및 B2M-유리 HLA-G, 바람직하게는 HLA-G2 및 HLA-G6 둘 다 및 / 또는 HLA-G1/B2M-유리 및 HLA 둘 다에 특이적으로 결합하는 CAR을 포함하는 세포-G5/B2M-free isoforms; 또는 (ii) HLA-G1 및 HLA-G5 또는 B2M- 유리 HLA-G 이소형 둘 다에 특이적으로 결합하는 CAR, 및 HLA-G2 및 HLA-G6 또는 B2M- 관련 HLA-G 둘 다에 특이적으로 결합하는 CAR을 포함하는 세포 isoforms.
본 발명은 마지막으로 HLA-G B2M-연관 이소형, 바람직하게는 HLA-G1 및 HLA-G5 둘 다에 특이적으로 결합하는 항-HLA-G 항체에 관한 것이다. 이러한 항체는 다음을 포함한다:
(a) (i) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 1 또는 서열 번호 1과 80 % 이상, 바람직하게는 90 % 이상, 더욱 바람직하게는 95 % 이상의 동일성을 나타내는 상동 서열을 포함하고; (ii) 경쇄 가변 영역은 서열 번호 2 또는 서열 번호 2와 80 % 초과, 바람직하게는 90 % 초과, 더욱 바람직하게는 95 % 이상의 동일성을 나타내는 상동성 서열을 포함하고; 또는
(b) (i) 중쇄 가변 영역의 CDR (상보성 결정 영역) 1, CDR2 및 CDR3은 서열 번호 40을 포함하고; 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 서열 번호 41를 포함한다.
mRNA 발현 카세트는 HLA-G에 결합하는 항체로부터 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인을 코딩한다. 일부 구성 성분에서, 항체 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산은 서열번호 40 또는 서열번호 42에 있다. 항체 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산은 서열번호 41 또는 서열번호 43에 있다.
Mab의 scFv의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 아미노산 서열은 LFTT-1의 경우 서열 번호 40 (VH), 41 (VL) 및 44 (scFV) 및 그리고 15E7의 경우 서열 번호 42 (VH), 43 (VL) 및 45 (scFV)에 있다.
LFFT - 1 VH
Gln Ile Gin Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
Gly Met Ser Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
Gly Trp Ile Tyr Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Leu
Glu Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
Leu Gin Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
Ala Arg Val Arg Asp Gly Tyr Tyr Arg Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Cys
LFFT - 1 VL
Asp Ile His Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Ile Asn Arg Tyr
Ile Ala Trp Tyr Gin His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile
His Phe Thr Ser Thr Leu Gin Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Tyr Asp Asp Leu Arg Thr
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1E57 VH
Gin Val Gln Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
Trp Met Asp Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile
Gly Thr Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Ser Thr His Tyr Asn Gin Glu Phe
Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Tyr Tyr Cys Ala
Arg Glu Gly Leu Ala Gly Val Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
1E57 VL
Asp Asp Val Leu Met Thr Gin Ile Pro Phe Ser Leu Pro Val Ser Leu
Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Ile Val His
Arg Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gln
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin
Gly Ser His Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile
Lys
CAR 서열은 LFTT-1 CAR 아미노산 서열 및 핵산의 경우 서열 번호 : 44 및 46에, 15E7 CAR (각각 아미노산 서열 및 핵산 코딩 서열)의 경우 서열 번호 : 45 및 47에 개시되어있다. 인코딩 시퀀스, 각각).
ScFV LFTT1
Asp Ile His Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Ile Asn Arg Tyr
Ile Ala Trp Tyr Gin His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile
His Phe Thr Ser Thr Leu Gin Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Tyr Asp Asp Leu Arg Thr
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gin Ile Gin Leu Val Gin Ser
Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys
Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Gly Met Ser Trp Val Lys Gin
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Tyr Thr Tyr Ser
Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Leu Glu Gly Arg Phe Ala Phe Ser
Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys
Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Val Arg Asp Gly Tyr
Tyr Arg Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val
Ser Ser
ScFV 15E7
Asp Val Leu Met Thr Gln Ile Pro Phe Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
Asp Gin Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Ile Val His Arg
Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly
Ser His Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gin
Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser
Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Trp
Met Asp Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile Gly
Thr Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Ser Thr His Tyr Asn Gin Glu Phe Lys
Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met
His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
Arg Glu Gly Leu Ala Gly Val Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
ScFV LFTT1
gatattcaca tgactcagag coctagttca ctgtccgcct cactgggggg gaaagtcacc 60
atcacctgta aagcatctca ggacatcaac aggtacatcg cctggtatca gcacaagcca 120
ggcaagggac ctaggctgct gatccacttc acctctacac tgcagagcgg catcccctcc 180
cggttcagcg gctccggctc tggaagagac tacagctttt ccatctctaa tctggagcct 240
gaggatatcg ccacctacta ttgcctgcag tatgacgatc tgcggacctt tggcggcggc 300
acaaagctgg agatcaaggg aggaggaggc tccggcggag gaggctctgg cggcggcggc 360
agccagatcc agctggtgca gagoggccca gagctgaaga agcccggcga gacagtgaag 420
atctcttgta aggccagcgg ctacacattc accacatatg gcatgtcctg ggtgaagcag 480
gcacctggca agggcctgaa gtggatgggc tggatctaca cctattccgg cgtgccaaca 540
tacgccgacg atctggaggg ccggttcgcc ttttctctgg agacaagcgc cagcaccgcc 600
tacctgcaga tcaacaatct gaagaacgag gacaccgcca catatttttg cgccagggtg 660
cgggatggct attacagata cgctatggac tattggggac aggggacctc agtgactgtc 720
tcgagc 726
ScFV 15 E7
gatgtgctga tgacccagat tccctttagc ctgccagtga gcctgggcga ccaggcctcc 60
atctcttgca gaagctccca gtccatcgtg cacaggtctg gcaacaccta cctggagtgg 120
tatctgcaga agcctggcca gtccccaaag ctgctgatct acaaggtgag caatagatto 180
tccggagtgc cagacaggtt tagcggctcc ggctctggca ccgatttcac actgaagato 240
tcccgcgtgg aggcagagga tctgggcgtg tactattgct tccagggctc tcacctgccc 300
cctacatttg goggcggcac cacactggag atcaagggag gaggaggcag cggcggagga 360
ggctccggcg goggcggctc tcaggtgcag ctgcagcagc ctggagcaga gctggtgcgg 420
cccggctcta gcgtgaagct gtcttgtaag gccagcggct acaccttcac agactattgg 480
atggattggg tgaagcagag gcctggacag ggcctggagt ggatcggcac catctaccca 540
agcgactcct ctacacacta taaccaggag tttaagggca aggccaccat gacagtggac 600
aagagctcct ctaccgccta tatgcacctg agctccctga catctgagga tagcgccgtg 660
tactattgcg cocgcgaggg cctggccggc gtgttctact ttgattattg gggccagggc 720
accacactga ccgtctcgag c 741
단리된 mRNA 발현 카세트는 N-말단으로부터 C-말단으로 단백질: 리더 펩티드, 항-HLA-G 중쇄 가변 도메인, 링커 도메인, 항-HLA-G 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1-CH2-CH3 도메인, 스페이서 영역, CD28 막관통 도메인, 4-1BB 세포내 공동-자극 신호전달 도메인 및 CD3-ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 코딩한다.
단리된 mRNA 발현 카세트는 N-말단으로부터 C-말단으로 단백질: 리더 펩티드, 항-HLA-G 중쇄 가변 도메인, 링커 도메인, 항-HLA-G 경쇄 가변 도메인, 스페이서 영역, CD28 막관통 도메인, 4-1BB 세포내 공동-자극 신호전달 도메인 및 CD3-ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 코딩한다.
단리된 mRNA 발현 카세트는 N-말단으로부터 C-말단으로 단백질: 리더 펩티드, 항-HLA-G 중쇄 가변 도메인, 링커 도메인, 항-HLA-G 경쇄 가변 도메인, 스페이서 영역, CD28 막관통 및 공동-자극 도메인, 및 CD3-ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 코딩한다.
단리된 mRNA 발현 카세트는 N-말단으로부터 C-말단으로 단백질: 리더 펩티드, HLA G ScFV, 스페이서 영역, CD8α 막관통 도메인 (또는 CD28 막관통 도메인), 4-1BB 세포내 공동-자극 신호전달 도메인 (또는 CD28 세포내 공동-자극 신호전달 도메인) 및 CD3-ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 코딩한다.
단백질은 N-말단으로부터 C-말단으로 다음을 포함한다: ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG (서열번호 37)의 핵산에 의해 코딩된 리더 펩티드, ScFV LFTT1 서열번호 46, ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT (서열번호 39)의 핵산에 의해 코딩된 힌지 영역, 서열번호 21의 핵산에 의해 코딩된 CD8α 막관통 도메인 (또는 CD28 막관통 도메인), 서열번호 28의 핵산에 의해 코딩된 CD28 세포내 공동-자극 신호전달 도메인; 서열번호 29의 핵산에 의해 코딩된 4-1BB 세포내 공동자극 신호전달 도메인 및 서열번호 30의 핵산에 의해 코딩된 CD3-ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인.
제공된 단리된 mRNA 발현 카세트는 리더 펩티드를 코딩하는 서열번호 35, ScFV 15 E7 서열번호 47, 힌지 영역을 코딩하는 서열 번호 39, CD8α 막관통 도메인 (또는 CD28 막관통 도메인)을 코딩하는 서열번호 22, CD28 세포내 공동-자극 신호전달 도메인을 코딩하는 서열번호 30, 4-1BB 세포내 공동-자극 신호전달 도메인을 코딩하는 서열번호 31, 및 CD3-ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 코딩하는 서열번호 25를 포함한다.
효소에 절단될 수 있는 기능 촉진 인자를 포함하는 CAR
(T 세포의 재프로그램을 위한 항 FITC CAR-F2A-IL-7-F2A-CCL19 mRNA 카세트 주형 DNA의 설계)
본 발명에서 제조하는 T 세포의 재프로그램을 위한 항 FITC CAR-F2A-IL-7-F2A-CCL19 mRNA 카세트 주형 DNA를 'T1 mRNA 카세트 주형 DNA 또는 T1 DNA'이라고 그 전사체를 'T1 mRNA 카세트 또는 T1 mRNA'라 명명하였다.
키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산은, CD8α 리더 펩티드, 암세포의 세포 표면 항원에 대한 단일사슬 항체, 세포막 관통 영역, 및 T 세포 활성화 신호 전달 영역의 폴리펩티드를 코딩하는 염기 서열을 바탕으로, 화학 합성하는 방법이나, PCR에 의해 증폭하는 방법 등의 공지된 기술에 의해 제작할 수 있다. 그리고, 아미노산을 코딩하기 위한 선택되는 코돈은, 목적의 숙주 세포에서의 핵산의 발현을 최적화하기 위해 개편될 수도 있다.
CD8α 리더 펩티드, 암세포의 세포 표면 항원에 대한 단일사슬 항체, 세포막 관통 영역, 및 T 세포 활성화 신호 전달 영역의 폴리펩티드를 코딩하는 염기 서열의 정보는, 공지된 문헌이나 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/) 등의 데이터베이스를 검색하여 적절하게 입수할 수 있다.
CD8α 리더 펩티드, 항 FITC　scFv, 마우스 CD8 막 관통 영역, 마우스 CD28-4-1BB-CD3ζ 세포 내 신호 모티프로 구성된 항 FITC　CAR을 코딩하는 항 FITC　CAR　DNA 단편(서열 번호 48), 서열 번호 21로 표현되는 2A 펩티드(F2A)와 그 펩티드에 계속되는 제한 효소 사이트(MCS)를 코딩하는 F2A-MCS　DNA 단편(서열 번호 49), 마우스 IL-7(종결 코돈 없음)과 거기에 계속되는 F2A와 마우스 CCL19를 코딩하는 IL-7-F2A-CCL19　DNA 단편(서열 번호 50)을 인공 합성하였다.
서열 번호 40에서, 1~819번째가 항 FITC　scFv, 829~1074번째가 마우스 CD8 막 관통 영역, 1075~1197번째가 마우스 CD28의 세포 내 영역, 1198~1332번째가 4-1BB의 세포 내 영역, 1333~1674번째가 CD3ζ의 세포 내 영역의 폴리펩티드를 코딩하는 서열이다. 또한, 서열 번호 42에서, 1~462번째가 IL-7, 463~537번째가 F2A, 538~864 번째가 CCL19를 코딩하는 서열이다.
상기 IL-7은 T 세포의 생존에 필수적인 사이토카인으로, 골수, 흉선, 림프 기관ㅠ조직의 스트로마 세포 등의 비조혈 세포에 의해 생산된다. 한편, T 세포 자체의 산생 능력은 거의 확인되지 않는다.
또한, 상기 CCL19는 주로 림프절의 수지상 세포나 대식세포로부터 생산되고, 그 수용체인 CCR7을 통해 T 세포나 B 세포, 성숙한 수지상 세포의 이동을 야기하는 기능을 갖는다.
본 발명의 T1 mRNA 카세트 주형 DNA를 제작하기 위해서, 상기 항 FITC CAR DNA 단편 서열번호 48, F2A DNA 단편 서열번호 49, IL-7 DNA 절편- F2A DNA 단편-CCL19 DNA 절편 서열번호 50을 연결한 구조체를 설계하였다.
본 발명에서 "리더 펩티드"는 관련 기술분야에서의 통상적인 의미에 따라 사용되며, 약 5-30 개의 아미노산 길이를 갖는 펩티드를 지칭한다. 리더 펩티드는 분비 경로의 일부를 형성하는 새로 합성된 단백질의 N-말단에 존재한다. 분비 경로의 단백질은 특정 소기관 (소포체, 골지 또는 엔도솜) 내에 존재하는 세포, 세포로부터 분비되거나, 세포막에 삽입된 단백질을 포함하나, 이에 제한되지는 않다. 일부 구성 성분에서, 리더 펩티드는 단백질의 막관통 도메인의 일부를 형성한다.
예를 들어, T 세포 활성화 신호 전달 영역에서의 CD28, 4-1BB, 및 CD3ζ의 세포막 관통 영역의 폴리펩티드를 코딩하는 염기 서열의 정보는, NCBI 등의 데이터베이스를 검색하여 적절하게 입수할 수 있고, 사람 CD28에 대해서는, Genbank 번호：NM＿006139. 2(갱신일：2014년 5월 10일), 사람 4-1BB에 대해서는, Genbank 번호：NM＿001561. 5(갱신일：2014년 3월 16일), 사람 CD3ζ에 대해서는, Genbank 번호：NM＿000734. 3(갱신일：2014년8월 12일)으로서 등록된 것을 사용할 수 있다.
또한, 사람 CD8의 세포막 관통 영역의 폴리펩티드를 코딩하는 염기서열의 정보는, NCBI 등의 데이터베이스를 검색하여 적절하게 입수할 수 있고, Genbank 번호：NM＿001768. 6(갱신일：2014년 5월 10일)으로서 등록된 것을 사용할 수 있다.
또한, 단일사슬 항체의 폴리펩티드를 코딩하는 염기서열의 정보에 대해서는, 관심으로 하는 세포 표면 항원을 인식하는 단일 클론 항체를 제작하고, 이러한 단일 클론 항체의 아미노산 서열을 에드만법 등의 공지된 방법으로 결정하고, 이러한 아미노산 서열을 바탕으로 입수할 수도 있다. 단일 클론 항체의 제작 방법으로서는, 혼성 세포를 이용하여 제작하는 방법이나, 유전자 공학적 수법에 의해 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터로 숙주를 형질 도입하여 제작하는 방법이나, 형질도입 동물을 원하는 항원으로 면역함으로써 제작하는 방법을 들 수 있다.
anti-FITC CAR
ATGGAGTTGC CTGTTAGGTT GTTGGTGCTG ATGTTCTGGA TTCCTGCTTC CAGCAGTGAT 60
GTCGTGATGA CCCAAACTCC ACTCTCCCTG CCTGTCAGTC TTGGAGATCA AGCCTCCATC 120
TCTTGCAGAT CTAGTCAGAG CCTTGTACAC AGTAATGGAA ACACCTATTT ACGTTGGTAC 180
CTGCAGAAGC CAGGCCAGTC TCCAAAGGTC CTGATCTACA AAGTTTCCAA CCGATTTTCT 240
GGGGTCCCAG ACAGGTTCAG TGGCAGTGGA TCAGGGACAG ATTTCACACT CAAGATCAGC 300
AGAGTGGAGG CTGAGGATCT GGGAGTTTAT TTCTGCTCTC AAAGTACACA TGTTCCGTGG 360
ACGTTCGGTG GAGGCACCAA GCTGGAAATC AAAAGTAGTG CTGATGATGC TAAGAAGGAT 420
GCTGCTAAGA AGGATGATGC TAAGAAGGAT GATGCTAAGA AGGATGGTGA GGTGAAGCTG 480
GATGAGACTG GAGGAGGCTT GGTGCAACCT GGGAGGCCCA TGAAACTCTC CTGTGTTGCC 540
TCTGGATTCA CTTTTAGTGA CTACTGGATG AACTGGGTCC GCCAGTCTCC AGAGAAAGGA 600
CTGGAGTGGG TAGCACAAAT TAGAAACAAA CCTTATAATT ATGAAACATA TTATTCAGAT 660
TCTGTGAAAG GCAGATTCAC CATCTCAAGA GATGATTCCA AAAGTAGTGT CTACCTGCAA 720
ATGAACAACT TAAGAGTTGA AGACATGGGT ATCTATTACT GTACGGGTTC TTACTATGGT 780
ATGGACTACT GGGGTCAAGG AACCTCAGTC ACCGTCTCCG CGGCCGCAGT CGTGCCAGTC 840
CTTCAGAAAG TGAACTCTAC TACTACCAAG CCAGTGCTGC GAACTCCCTC ACCTGTGCAC 900
CCTACCGGGA CATCTCAGCC CCAGAGACCA GAAGATTGTC GGCCCCGTGG CTCAGTGAAG 960
GGGACCGGAT TGGACTTCGC CTGTGATATT TACATCTGGG CACCCTTGGC CGGAATCTGC 1020
GTGGCCCCTC TGCTGTCCTT GATCATCACT CTCATCTGCT ACCACAGGAG CCGAAATAGT 1080
AGAAGGAACA GACTCCTTCA AAGTGACTAC ATGAACATGA CTCCCCGGAG GCCTGGGCTC 1140
ACTCGAAAGC CTTACCAGCC CTACGCCCCT GCCAGAGACT TTGCAGCGTA CCGCCCCAAA 1200
TGGATCAGGA AAAAATTCCC CCACATATTC AAGCAACCAT TTAAGAAGAC CACTGGAGCA 1260
GCTCAAGAGG AAGATGCTTG TAGCTGCCGA TGTCCACAGG AAGAAGAAGG AGGAGGAGGA 1320
GGCTATGAGC TGAGAGCAAA ATTCAGCAGG AGTGCAGAGA CTGCTGCCAA CCTGCAGGAC 1380
CCCAACCAGC TCTACAATGA GCTCAATCTA GGGCGAAGAG AGGAATATGA CGTCTTGGAG 1440
AAGAAGCGGG CTCGGGATCC AGAGATGGGA GGCAAACAGC AGAGGAGGAG GAACCCCCAG 1500
GAAGGCGTAT ACAATGCACT GCAGAAAGAC AAGATGGCAG AAGCCTACAG TGAGATCGGC 1560
ACAAAAGGCG AGAGGCGGAG AGGCAAGGGG CACGATGGCC TTTACCAGGG TCTCAGCACT 1620
GCCACCAAGG ACACCTATGA TGCCCTGCAT ATGCAGACCC TGGCCCCTCG CTAA 1674 (서열번호 48)
F2A
GGAAGCGGAG TGAAACAGAC TTTGAATTTT GACCTTCTCA AGTTGGCGGG AGACGTGGAG 60
TCCAACCCTG GACCA 75 (서열번호 49)
mouse IL-7-F2A-mouse CCL19
ATGTTCCATG TTTCTTTTAG ATATATCTTT GGAATTCCTC CACTGATCCT TGTTCTGCTG 60
CCTGTCACAT CATCTGAGTG CCACATTAAA GACAAAGAAG GTAAAGCATA TGAGAGTGTA 120
CTGATGATCA GCATCGATGA ATTGGACAAA ATGACAGGAA CTGATAGTAA TTGCCCGAAT 180
AATGAACCAA ACTTTTTTAG AAAACATGTA TGTGATGATA CAAAGGAAGC TGCTTTTCTA 240
AATCGTGCTG CTCGCAAGTT GAAGCAATTT CTTAAAATGA ATATCAGTGA AGAATTCAAT 300
GTCCACTTAC TAACAGTATC ACAAGGCACA CAAACACTGG TGAACTGCAC AAGTAAGGAA 360
GAAAAAAACG TAAAGGAACA GAAAAAGAAT GACGCATGTT TCCTAAAGAG ACTACTGAGA 420
GAAATAAAAA CTTGTTGGAA TAAAATTTTG AAGGGCAGTA TAGGAAGCGG AGTGAAACAG 480
ACTTTGAATT TTGACCTTCT CAAGTTGGCG GGAGACGTGG AGTCCAACCC TGGACCTATG 540
GCCCCCCGTG TGACCCCACT CCTGGCCTTC AGCCTGCTGG TTCTCTGGAC CTTCCCAGCC 600
CCAACTCTGG GGGGTGCTAA TGATGCGGAA GACTGCTGCC TGTCTGTGAC CCAGCGCCCC 660
ATCCCTGGGA ACATCGTGAA AGCCTTCCGC TACCTTCTTA ATGAAGATGG CTGCAGGGTG 720
CCTGCTGTTG TGTTCACCAC ACTAAGGGGC TATCAGCTCT GTGCACCTCC AGACCAGCCC 780
TGGGTGGATC GCATCATCCG AAGACTGAAG AAGTCTTCTG CCAAGAACAA AGGCAACAGC 840
ACCAGAAGGA GCCCTGTGTC TTGA 864 (서열번호 50)
(T 세포의 재프로그램을 위한 IL-7 및 CCL19를 발현하는 항 CD20 CAR mRNA 카세트 주형 DNA의 제작)
본 발명에서 제조하는 T 세포의 재프로그램을 위한 항 사람 CD20 CAR-F2A-IL-7-F2A-CCL19 mRNA 카세트 주형 DNA를 'T2 mRNA 카세트 주형 DNA 또는 T2 DNA'이라고 그 전사체를 'T2 mRNA 카세트 또는 T2 mRNA'라 명명하였다.
상기에서의 T1 mRNA 카세트 주형 DNA에서, 서열 번호 48로 표현되는 서열에 포함되는 항 FITC scFv영역의 서열을, 리툭시맙의 서열을 바탕으로 라이프 테크놀로지사가 합성한 항 사람 CD20　scFv(서열 번호 51)의 서열로 치환된 것 외에는 동일한 방법으로, 인간 IL7 서열번호 52 및 인간 CCL19 서열번호 53을 포함하는 T2 mRNA 카세트 주형 DNA (IL-7/CCL19 발현-항 사람 CD20 CAR mRNA 카세트 주형 DNA)를 설계하였다.
동일하게, 상기에서의 대조구 항 FITC CAR mRNA 카세트 주형 DNA의 제작에서, 서열 번호 40로 표현하는 서열에 포함되는 항 FITC　sCFv영역의 서열을, 상기 항 사람 CD20 scFv(서열 번호 51)의 서열로 치환된 것 외에는 동일한 방법으로, 항 사람 CD20　CAR을 포함하는 mRNA 카세트 주형 DNA(대조구 항사람 CD20 CAR mRNA 카세트 주형 DNA)를 설계하였다.
Anti-humAn CD20 scFv
ATGGACTGGA CCTGGCGGAT CCTGTTCCTG GTGGCTGCTG CTACAGGCGC CCACAGCCAG 60 ATCGTGCTGT CTCAGTCTCC CGCCATCCTG TCTGCTAGCC CTGGCGAGAA AGTGACCATG 120 ACCTGCAGAG CCAGCAGCAG CGTGTCCTAC ATCCACTGGT TCCAGCAGAA GCCCGGCAGC 180 AGCCCCAAGC CTTGGATCTA CGCCACAAGC AACCTGGCCT CTGGCGTGCC AGTGCGGTTT 240 AGCGGCTCTG GCTCTGGCAC CAGCTACAGC CTGACCATCA GCAGAGTGGA AGCCGAGGAC 300 GCCGCCACCT ACTACTGTCA GCAGTGGACC AGCAACCCCC CCACATTCGG CGGAGGCACC 360 AAGCTGGAAA TCAAGGGCGG AGGCGGATCT GGCGGCGGAG GATCTGGGGG AGGCGGCTCT 420 CAGGTGCAGC TGCAGCAGCC TGGCGCTGAG CTCGTGAAAC CTGGCGCCTC CGTGAAGATG 480 AGCTGCAAGG CCAGCGGCTA CACCTTCACA AGCTACAACA TGCACTGGGT CAAGCAGACC 540 CCTGGCAGAG GCCTGGAATG GATCGGCGCT ATCTACCCCG GCAACGGCGA CACCTCCTAC 600 AACCAGAAGT TCAAGGGCAA GGCCACCCTG ACCGCCGACA AGAGCAGCAG CACAGCCTAC 660 ATGCAGCTGT CCTCCCTGAC CAGCGAGGAC AGCGCCGTGT ACTACTGCGC CAGATCTACC 720 TACTACGGCG GCGACTGGTA CTTCAACGTG TGGGGCGCTG GCACCACCGT GACCGTGTCT 780 GCT 783 (서열번호 51)
human IL-7 ACCESSION AB102879
ATGTTCCATG TTTCTTTTAG GTATATCTTT GGACTTCCTC CCCTGATCCT TGTTCTGTTG 60
CCAGTAGCAT CATCTGATTG TGATATTGAA GGTAAAGATG GCAAACAATA TGAGAGTGTT 120
CTAATGGTCA GCATCGATCA ATTATTGGAC AGCATGAAAG AAATTGGTAG CAATTGCCTG 180
AATAATGAAT TTAACTTTTT TAAAAGACAT ATCTGTGATG CTAATAAGGT TAAAGGAAGA 240
AAACCAGCTG CCCTGGGTGA AGCCCAACCA ACAAAGAGTT TGGAAGAAAA TAAATCTTTA 300
AAGGAACAGA AAAAACTGAA TGACTTGTGT TTCCTAAAGA GACTATTACA AGAGATAAAA 360
ACTTGTTGGA ATAAAATTTT GATGGGCACT AAAGAACACT GA 392 (서열번호 52)
human CCL19 ACCESSION AB000887
ATGGCCCTGC TACTGGCCCT CAGCCTGCTG GTTCTCTGGA CTTCCCCAGC CCCAACTCTG 60 AGTGGCACCA ATGATGCTGA AGACTGCTGC CTGTCTGTGA CCCAGAAACC CATCCCTGGG 120 TACATCGTGA GGAACTTCCA CTACCTTCTC ATCAAGGATG GCTGCAGGGT G CTGCTGTA 180 GTGTTCACCA CACTGAGGGG CCGCCAGCTC TGTGCACCCC CAGACCAGCC CTGGGTAGAA 240 CGCATCATCC AGAGACTGCA GAGGACCTCA GCCAAGATGA AGCGCCGCAG CAGT 284 (서열번호 53)
이중 시스트론를 포함하는 CAR
(NK 세포용 CAR mRNA 카세트 주형 DNA의 제작)
CAR(Chimeric Antigen Receptor)를 코딩하는 이중 시스트론 mRNA 카세트 주형 DNA를 제작하기 위해, 대조구, CD19, HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) 또는 MSLN(Mesothelin)에 각각 결합하는 4종의 CAR 유전자를 제작하였다. 상기 각 CAR 유전자는 항체 도메인(scFv)을 포함하는 세포 바깥 도메인, 세포막 관통 도메인 및 세포내 도메인을 코딩하는 유전자를 포함하여 구성되었다. 구체적으로, 상기 각 CAR 유전자는 하기와 같이 구성되었다.
i) CD8 리더(leader)(서열번호 37), CD19 sCFv(서열번호 54), CD8 힌지(Hinge)(서열번호 39), CD8 막 관통(Transmembrane, TM) 도메인(Domain)(서열번호 22), FC-γ(GAmmA) 수용체(서열번호 57) 및 GFP(Green Fluorescent Protein)(서열번호 58)를 포함하는 CD19-CAR1 유전자;
ii) CD8 리더(서열번호 37), CD19 scFv(서열번호 54), CD8 힌지(서열번호 39), CD8 막 관통 도메인)(서열번호 22), CD28 세포내(Intracellular) 도메인(서열번호 30), CD3ζ(Zetta)(서열번호 25), IRES(Internal Ribosome Entry Site)(서열번호 18) 및 GFP(서열번호 58)를 포함하는 CD19-CAR2 유전자;
iii) CD8 리더(서열번호 37), MSLN(Mesothelin) sCFv(서열번호 55), CD8 힌지(서열번호 39), CD8 막 관통 도메인(서열번호 22), CD28 세포내 도메인(서열번호 30), CD3ζ(서열번호 25), IRES(서열번호 18) 및 GFP(서열번호 58)를 포함하는 MSLN-CAR 유전자; 및
iV) CD8 리더(서열번호 37), HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) sCFv(서열번호 56), CD8 힌지(서열번호 39), CD8 막 관통 도메인(서열번호 22), CD28 세포내 도메인(서열번호 30), CD3ζ(서열번호 25), IRES(서열번호 18) 및 GFP(서열번호 58)를 포함하는 HER2-CAR 유전자.
상기 IRES는 CAR 유전자를 이중 시스트론을 구성하는 mRNA 카세트 주형 DNA에 클로닝하기 위해 삽입하였다. 상기 4종의 CAR 유전자를 포함하는 CAR mRNA 카세트 주형 DNA를 각각 설계하였다. 이들을 각각 NK1, NK2, NK3 및 NK4라 명명하였다.
CD19 sCFv
ATGGCCTTAC CAGTGACCGC CTTGCTCCTG CCGCTGGCCT TGCTGCTCCA CGCCGCCAGG 60
CCGGACATCC AGATGACACA GACTACATCC TCCCTGTCTG CCTCTCTGGG AGACAGAGTC 120
ACCATCAGTT GCAGGGCAAG TCAGGACATT AGTAAATATT TAAATTGGTA TCAGCAGAAA 180
CCAGATGGAA CTGTTAAACT CCTGATCTAC CATACATCAA GATTACACTC AGGAGTCCCA 240
TCAAGGTTCA GTGGCAGTGG GTCTGGAACA GATTATTCTC TCACCATTAG CAACCTGGAG 300
CAAGAAGATA TTGCCACTTA CTTTTGCCAA CAGGGTAATA CGCTTCCGTA CACGTTCGGA 360
GGGGGGACCA AGCTGGAGAT CACAGGTGGC GGTGGCTCGG GCGGTGGTGG GTCGGGTGGC 420
GGCGGATCTG AGGTGAAACT GCAGGAGTCA GGACCTGGCC TGGTGGCGCC CTCACAGAGC 480
CTGTCCGTCA CATGCACTGT CTCAGGGGTC TCATTACCCG ACTATGGTGT AAGCTGGATT 540
CGCCAGCCTC CACGAAAGGG TCTGGAGTGG CTGGGAGTAA TATGGGGTAG TGAAACCACA 600
TACTATAATT CAGCTCTCAA ATCCAGACTG ACCATCATCA AGGACAACTC CAAGAGCCAA 660
GTTTTCTTAA AAATGAACAG TCTGCAAACT GATGACACAG CCATTTACTA CTGTGCCAAA 720
CATTATTACT ACGGTGGTAG CTATGCTATG GACTACTGGG GCCAAGGAAC CTCAGTCACC 780
GTCTCCTCA 789 (서열번호 54)
Mesothelin sCFv
CAAGTCCAAC TCGTTCAATC AGGCGCAGAA GTCGAAAAGC CCGGAGCATC AGTCAAAGTC 60
TCTTGCAAGG CTTCCGGCTA CACCTTCACG GACTACTACA TGCACTGGGT GCGCCAGGCT 120
CCAGGCCAGG GACTGGAGTG GATGGGATGG ATCAACCCGA ATTCCGGGGG AACTAACTAC 180
GCCCAGAAGT TTCAGGGCCG GGTGACTATG ACTCGCGATA CCTCGATCTC GACTGCGTAC 240
ATGGAGCTCA GCCGCCTCCG GTCGGACGAT ACCGCCGTGT ACTATTGTGC GTCGGGATGG 300
GACTTCGACT ACTGGGGGCA GGGCACTCTG GTCACTGTGT CAAGCGGAGG AGGTGGATCA 360
GGTGGAGGTG GAAGCGGGGG AGGAGGTTCC GGCGGCGGAG GATCAGATAT CGTGATGACG 420
CAATCGCCTT CCTCGTTGTC CGCATCCGTG GGAGACAGGG TGACCATTAC TTGCAGAGCG 480
TCCCAGTCCA TTCGGTACTA CCTGTCGTGG TACCAGCAGA AGCCGGGGAA AGCCCCAAAA 540
CTGCTTATCT ATACTGCCTC GATCCTCCAA AACGGCGTGC CATCAAGATT CAGCGGTTCG 600
GGCAGCGGGA CCGACTTTAC CCTGACTATC AGCAGCCTGC AGCCGGAAGA TTTCGCCACG 660
TACTACTGCC TGCAAACCTA CACCACCCCG GACTTCGGAC CTGGAACCAA GGTGGAGATC 720
AAG 723 (서열번호 55)
HER2 scFv
CAGGTGCAGC TGCAGCAGAG CGGCCCTGAG CTGAAGAAGC CCGGCGAGAC AGTCAAGATC 60
AGCTGCAAGG CCAGCGGCTA CCCCTTCACC AACTACGGCA TGAACTGGGT GAAACAGGCC 120
CCAGGCCAGG GACTGAAGTG GATGGGCTGG ATCAACACCA GCACCGGCGA GAGCACCTTC 180
GCCGACGACT TCAAGGGCAG ATTCGACTTC AGCCTGGAAA CCAGCGCCAA CACCGCCTAC 240
CTGCAGATCA ACAACCTGAA GAGCGAGGAC AGCGCCACCT ACTTTTGCGC CAGATGGGAG 300
GTGTACCACG GCTACGTGCC CTACTGGGGC CAGGGCACCA CCGTGACCGT GTCCAGCGGC 360
GGAGGGGGCT CTGGCGGCGG AGGATCTGGG GGAGGGGGCA GCGACATCCA GCTGACCCAG 420
AGCCACAAGT TTCTGAGCAC CAGCGTGGGC GACCGGGTGT CCATCACCTG CAAAGCCAGC 480
CAGGACGTGT ACAACGCCGT GGCCTGGTAT CAGCAGAAGC CTGGCCAGAG CCCCAAGCTG 540
CTGATCTACA GCGCCAGCAG CCGGTACACC GGCGTGCCCA GCAGGTTCAC CGGCAGCGGC 600
AGCGGCCCAG ACTTCACCTT CACCATCAGC AGCGTGCAGG CCGAGGACCT GGCCGTGTAC 660
TTCTGCCAGC AGCACTTCCG GACCCCCTTC ACCTTCGGCT CCGGCACCAA GCTGGAAATC 720
AAG 723 (서열번호 56)
FC Gamma receptor
AGACGACTCA AGATCCAGGT CCGAAAGGCA GCTATAGCCA GCCGTGAGAA AGCAGATGCT 60
GTCTACACGG GCCTGAACAC CCGGAGCCAG GAGACATATG AGACTCTGAA GCATGAGAAA 120
CCACCCCAGG GATCCGGAAG T 141 (서열번호 57)
GPF
ATGGTGAGCA AGGGCGAGGA GCTGTTCACC GGGGTGGTGC CCATCCTGGT CGAGCTGGAC 60
GGCGACGTAA ACGGCCACAA GTTCAGCGTG TCCGGCGAGG GCGAGGGCGA TGCCACCTAC 120
GGCAAGCTGA CCCTGAAGTT CATCTGCACC ACCGGCAAGC TGCCCGTGCC CTGGCCCACC 180
CTCGTGACCA CCCTGACCTA CGGCGTGCAG TGCTTCAGCC GCTACCCCGA CCACATGAAG 240
CAGCACGACT TCTTCAAGTC CGCCATGCCC GAAGGCTACG TCCAGGAGCG CACCATCTTC 300
TTCAAGGACG ACGGCAACTA CAAGACCCGC GCCGAGGTGA AGTTCGAGGG CGACACCCTG 360
GTGAACCGCA TCGAGCTGAA GGGCATCGAC TTCAAGGAGG ACGGCAACAT CCTGGGGCAC 420
AAGCTGGAGT ACAACTACAA CAGCCACAAC GTCTATATCA TGGCCGACAA GCAGAAGAAC 480
GGCATCAAGG TGAACTTCAA GATCCGCCAC AACATCGAGG ACGGCAGCGT GCAGCTCGCC 540
GACCACTACC AGCAGAACAC CCCCATCGGC GACGGCCCCG TGCTGCTGCC CGACAACCAC 600
TACCTGAGCA CCCAGTCCGC CCTGAGCAAA GACCCCAACG AGAAGCGCGA TCACATGGTC 660
CTGCTGGAGT TCGTGACCGC CGCCGGGATC ACTCTCGGCA TGGACGAGCT GTACAAG 717 (서열번호 58)
CD19 CAR_F
GAGAATTCTC ACGCGTGCCA C 21 (서열번호 59)
CD19 CAR_R
GGAGAGGGGC TTAGCGAGGG GGCAGGGCCT 30 (서열번호 60)
MSLN CAR_F
TGGAGCTCTC GAGAATTCTC ACGCGTGCCA CCATGGCCCT CCCTGTCA 48 (서열번호 61)
MSLN CAR_R
GCGGCGCTGG CGTCGTGGTC TTGATCTCCA CCTTG 35 (서열번호 62)
HER2 CAR_F
TGGAGCTCTC GAGAATTCTC ACGCGTGCCA CCATGGACTG GATCTGGCGG ATTC 54 (서열번호 63)
HER2 CAR_R
GCGTCGTGGT CTTGATTTCC AGCTTGGTGC 30 (서열번호 64)
본 발명의 관심 DNA는 관심 mRNA를 효율적으로 합성할 수 있는 mRNA 발현카세트 주형 DNA 절편으로 <T7 promoter - 5'UTR - 관심 DNA - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL> 순서로 제조할 수 있으며 관심 단백질이 세포외 기질 분해 효소의 경우는 DNA 절편은 하기와 같다.
2) 세포외기질 분해 효소
고형암의 종양 미세환경을 구성하는 세포외 기질을 분해하는 효소를 코딩하는 mRNA 발현 카세트를 제조할 수 있으며 관련 효소는 아래와 같다.
히알루로니다제
히알루로니다제(HA를 분해하는 효소)는 HYAL1 (NM_153281), HYAL2 (NM_033158), HYAL3 (NM_003549), HYAL4 (NM_012269) 및 Hyaluronidase PH20 (SPAM1) (NM_001174044), sPH20 등이 있다.
PH20 CDNA 서열번호 65은 개시 코돈(ATG)에서 1467번 위치까지의 단백질 Hyaluronidase PH20 (SPAM1) (NM_001174044)에 대한 코딩 뉴클레오티드 서열이다.
Hyaluronidase PH20 (SPAM1) cDNA (NM_001174044)
ATGGGAGTGC TAAAATTCAA GCACATCTTT TTCAGAAGCT TTGTTAAATC AAGTGGAGTA TCCCAGATAG TTTTCACCTT CCTTCTGATT CCATGTTGCT TGACTCTGAA TTTCAGAGCA CCTCCTGTTA TTCCAAATGT GCCTTTCCTC TGGGCCTGGA ATGCCCCAAG TGAATTTTGT CTTGGAAAAT TTGATGAGCC ACTAGATATG AGCCTCTTCT CTTTCATAGG AAGCCCCCGA ATAAACGCCA CCGGGCAAGG TGTTACAATA TTTTATGTTG ATAGACTTGG CTACTATCCT TACATAGATT CAATCACAGG AGTAACTGTG AATGGAGGAA TCCCCCAGAA GATTTCCTTA CAAGACCATC TGGACAAAGC TAAGAAAGAC ATTACATTTT ATATGCCAGT AGACAATTTG GGAATGGCTG TTATTGACTG GGAAGAATGG AGACCCACTT GGGCAAGAAA CTGGAAACCT AAAGATGTTT ACAAGAATAG GTCTATTGAA TTGGTTCAGC AACAAAATGT ACAACTTAGT CTCACAGAGG CCACTGAGAA AGCAAAACAA GAATTTGAAA AGGCAGGGAA GGATTTCCTG GTAGAGACTA TAAAATTGGG AAAATTACTT CGGCCAAATC ACTTGTGGGG TTATTATCTT TTTCCGGATT GTTACAACCA TCACTATAAG AAACCCGGTT ACAATGGAAG TTGCTTCAAT GTAGAAATAA AAAGAAATGA TGATCTCAGC TGGTTGTGGA ATGAAAGCAC TGCTCTTTAC CCATCCATTT ATTTGAACAC TCAGCAGTCT CCTGTAGCTG CTACACTCTA TGTGCGCAAT CGAGTTCGGG AAGCCATCAG AGTTTCCAAA ATACCTGATG CAAAAAGTCC ACTTCCGGTT TTTGCATATA CCCGCATAGT TTTTACTGAT CAAGTTTTGA AATTCCTTTC TCAAGATGAA CTTGTGTATA CATTTGGCGA AACTGTTGCT CTGGGTGCTT CTGGAATTGT AATATGGGGA ACCCTCAGTA TAATGCGAAG TATGAAATCT TGCTTGCTCC TAGACAATTA CATGGAGACT ATACTGAATC CTTACATAAT CAACGTCACA CTAGCAGCCA AAATGTGTAG CCAAGTGCTT TGCCAGGAGC AAGGAGTGTG TATAAGGAAA AACTGGAATT CAAGTGACTA TCTTCACCTC AACCCAGATA ATTTTGCTAT TCAACTTGAG AAAGGTGGAA AGTTCACAGT ACGTGGAAAA CCGACACTTG AAGACCTGGA GCAATTTTCT GAAAAATTTT ATTGCAGCTG TTATAGCACC TTGAGTTGTA AGGAGAAAGC TGATGTAAAA GACACTGATG CTGTTGATGT GTGTATTGCT GATGGTGTCT GTATAGATGC TTTTCTAAAA CCTCCCATGG AGACAGAAGA ACCTCAAATT TTCTACAATG CTTCACCCTC CACACTATCT GCCACAATGT TCATTGTTAG TATTTTGTTT CTTATCATTT CTTCTGTAGC GAGTTTGTGA (서열번호 65)
sPH20
sPH20 cDNA 서열번호 66은 PH20 cDNA 서열번호 65의 전사 시작 (ATG)에서 위치 1467까지의 염기서열로 PH20 단백질의 소수성 꼬리 (뉴클레오타이드 1468-1527)가 결여되고 마지막에 정지 코돈 (TAA)이 추가된 염기서열 형태로 세포에서 분비하는 단백질이다.
sPH20 cDNA
ATGGGAGTGC TAAAATTCAA GCACATCTTT TTCAGAAGCT TTGTTAAATC AAGTGGAGTA TCCCAGATAG TTTTCACCTT CCTTCTGATT CCATGTTGCT TGACTCTGAA TTTCAGAGCA CCTCCTGTTA TTCCAAATGT GCCTTTCCTC TGGGCCTGGA ATGCCCCAAG TGAATTTTGT CTTGGAAAAT TTGATGAGCC ACTAGATATG AGCCTCTTCT CTTTCATAGG AAGCCCCCGA ATAAACGCCA CCGGGCAAGG TGTTACAATA TTTTATGTTG ATAGACTTGG CTACTATCCT TACATAGATT CAATCACAGG AGTAACTGTG AATGGAGGAA TCCCCCAGAA GATTTCCTTA CAAGACCATC TGGACAAAGC TAAGAAAGAC ATTACATTTT ATATGCCAGT AGACAATTTG GGAATGGCTG TTATTGACTG GGAAGAATGG AGACCCACTT GGGCAAGAAA CTGGAAACCT AAAGATGTTT ACAAGAATAG GTCTATTGAA TTGGTTCAGC AACAAAATGT ACAACTTAGT CTCACAGAGG CCACTGAGAA AGCAAAACAA GAATTTGAAA AGGCAGGGAA GGATTTCCTG GTAGAGACTA TAAAATTGGG AAAATTACTT CGGCCAAATC ACTTGTGGGG TTATTATCTT TTTCCGGATT GTTACAACCA TCACTATAAG AAACCCGGTT ACAATGGAAG TTGCTTCAAT GTAGAAATAA AAAGAAATGA TGATCTCAGC TGGTTGTGGA ATGAAAGCAC TGCTCTTTAC CCATCCATTT ATTTGAACAC TCAGCAGTCT CCTGTAGCTG CTACACTCTA TGTGCGCAAT CGAGTTCGGG AAGCCATCAG AGTTTCCAAA ATACCTGATG CAAAAAGTCC ACTTCCGGTT TTTGCATATA CCCGCATAGT TTTTACTGAT CAAGTTTTGA AATTCCTTTC TCAAGATGAA CTTGTGTATA CATTTGGCGA AACTGTTGCT CTGGGTGCTT CTGGAATTGT AATATGGGGA ACCCTCAGTA TAATGCGAAG TATGAAATCT TGCTTGCTCC TAGACAATTA CATGGAGACT ATACTGAATC CTTACATAAT CAACGTCACA CTAGCAGCCA AAATGTGTAG CCAAGTGCTT TGCCAGGAGC AAGGAGTGTG TATAAGGAAA AACTGGAATT CAAGTGACTA TCTTCACCTC AACCCAGATA ATTTTGCTAT TCAACTTGAG AAAGGTGGAA AGTTCACAGT ACGTGGAAAA CCGACACTTG AAGACCTGGA GCAATTTTCT GAAAAATTTT ATTGCAGCTG TTATAGCACC TTGAGTTGTA AGGAGAAAGC TGATGTAAAA GACACTGATG CTGTTGATGT GTGTATTGCT GATGGTGTCT GTATAGATGC TTTTCTAAAA CCTCCCATGG AGACAGAAGA ACCTCAAATT TTCTACAATG CTTCACCCTC CACACTATCT TAA (서열번호 66)
HYAL1 cDNA(NM_153281)
ATGGCAGCCC ACCTGCTTCC CATCTGCGCC CTCTTCCTGA CCTTACTCGA TATGGCCCAA GGCTTTAGGG GCCCCTTGCT ACCCAACCGG CCCTTCACCA CCGTCTGGAA TGCAAACACC CAGTGGTGCC TGGAGAGGCA CGGTGTGGAC GTGGATGTCA GTGTCTTCGA TGTGGTAGCC AACCCAGGGC AGACCTTCCG CGGCCCTGAC ATGACAATTT TCTATAGCTC CCAGCTGGGC ACCTACCCCT ACTACACGCC CACTGGGGAG CCTGTGTTTG GTGGTCTGCC CCAGAATGCC AGCCTGATTG CCCACCTGGC CCGCACATTC CAGGACATCC TGGCTGCCAT ACCTGCTCCT GACTTCTCAG GGCTGGCAGT CATCGACTGG GAGGCATGGC GCCCACGCTG GGCCTTCAAC TGGGACACCA AGGACATTTA CCGGCAGCGC TCACGGGCAC TGGTACAGGC ACAGCACCCT GATTGGCCAG CTCCTCAGGT GGAGGCAGTA GCCCAGGACC AGTTCCAGGG AGCTGCACGG GCCTGGATGG CAGGCACCCT CCAGCTGGGG CGGGCACTGC GTCCTCGCGG CCTCTGGGGC TTCTATGGCT TCCCTGACTG CTACAACTAT GACTTTCTAA GCCCCAACTA CACCGGCCAG TGCCCATCAG GCATCCGTGC CCAAAATGAC CAGCTAGGGT GGCTGTGGGG CCAGAGCCGT GCCCTCTATC CCAGCATCTA CATGCCCGCA GTGCTGGAGG GCACAGGGAA GTCACAGATG TATGTGCAAC ACCGTGTGGC CGAGGCATTC CGTGTGGCTG TGGCTGCTGG TGACCCCAAT CTGCCGGTGC TGCCCTATGT CCAGATCTTC TATGACACGA CAAACCACTT TCTGCCCCTG GATGAGCTGG AGCACAGCCT GGGGGAGAGT GCGGCCCAGG GGGCAGCTGG AGTGGTGCTC TGGGTGAGCT GGGAAAATAC AAGAACCAAG GAATCATGTC AGGCCATCAA GGAGTATATG GACACTACAC TGGGGCCCTT CATCCTGAAC GTGACCAGTG GGGCCCTTCT CTGCAGTCAA GCCCTGTGCT CCGGCCATGG CCGCTGTGTC CGCCGCACCA GCCACCCCAA AGCCCTCCTC CTCCTTAACC CTGCCAGTTT CTCCATCCAG CTCACGCCTG GTGGTGGGCC CCTGAGCCTG CGGGGTGCCC TCTCACTTGA AGATCAGGCA CAGATGGCTG TGGAGTTCAA ATGTCGATGC TACCCTGGCT GGCAGGCACC GTGGTGTGAG CGGAAGAGCA TGTGGTGA (서열번호 67)
MMP는 콜라게나제 (MMP-1, MMP-8, MMP-13 및 MMP-18) 젤라티나제 (MMP-2 및 MMP-9), 스트로멜리신 (MMP-3, MMP-10, MMP-11 및 MMP-17), matrilysins (MMP-7 및 MMP-26), 멤브레인 유형 (MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-24 및 MMP-25) 및 기타 유형 (MMP -12, MMP-19, MMP-20, MMP-21, MMP-22, MMP-28, MMP-29) 등을 포함한다.
본 발명의 MMP RNA 발현카세트의 제조를 위하여, 여러 종류의 MMP에서 선정된 MMP1 (NM_002421) 및 MMP9 (NM_004994)의 염기서열은 아래와 같다.
MMP1 cDNA(NM_002421)
ATGCACAGCT TTCCTCCACT GCTGCTGCTG CTGTTCTGGG GTGTGGTGTC TCACAGCTTC CCAGCGACTC TAGAAACACA AGAGCAAGAT GTGGACTTAG TCCAGAAATA CCTGGAAAAA TACTACAACC TGAAGAATGA TGGGAGGCAA GTTGAAAAGC GGAGAAATAG TGGCCCAGTG GTTGAAAAAT TGAAGCAAAT GCAGGAATTC TTTGGGCTGA AAGTGACTGG GAAACCAGAT GCTGAAACCC TGAAGGTGAT GAAGCAGCCC AGATGTGGAG TGCCTGATGT GGCTCAGTTT GTCCTCACTG AGGGGAACCC TCGCTGGGAG CAAACACATC TGACCTACAG GATTGAAAAT TACACGCCAG ATTTGCCAAG AGCAGATGTG GACCATGCCA TTGAGAAAGC CTTCCAACTC TGGAGTAATG TCACACCTCT GACATTCACC AAGGTCTCTG AGGGTCAAGC AGACATCATG ATATCTTTTG TCAGGGGAGA TCATCGGGAC AACTCTCCTT TTGATGGACC TGGAGGAAAT CTTGCTCATG CTTTTCAACC AGGCCCAGGT ATTGGAGGGG ATGCTCATTT TGATGAAGAT GAAAGGTGGA CCAACAATTT CAGAGAGTAC AACTTACATC GTGTTGCGGC TCATGAACTC GGCCATTCTC TTGGACTCTC CCATTCTACT GATATCGGGG CTTTGATGTA CCCTAGCTAC ACCTTCAGTG GTGATGTTCA GCTAGCTCAG GATGACATTG ATGGCATCCA AGCCATATAT GGACGTTCCC AAAATCCTGT CCAGCCCATC GGCCCACAAA CCCCAAAAGC GTGTGACAGT AAGCTAACCT TTGATGCTAT AACTACGATT CGGGGAGAAG TGATGTTCTT TAAAGACAGA TTCTACATGC GCACAAATCC CTTCTACCCG GAAGTTGAGC TCAATTTCAT TTCTGTTTTC TGGCCACAAC TGCCAAATGG GCTTGAAGCT GCTTACGAAT TTGCCGACAG AGATGAAGTC CGGTTTTTCA AAGGGAATAA GTACTGGGCT GTTCAGGGAC AGAATGTGCT ACACGGATAC CCCAAGGACA TCTACAGCTC CTTTGGCTTC CCTAGAACTG TGAAGCATAT CGATGCTGCT CTTTCTGAGG AAAACACTGG AAAAACCTAC TTCTTTGTTG CTAACAAATA CTGGAGGTAT GATGAATATA AACGATCTAT GGATCCAGGT TATCCCAAAA TGATAGCACA TGACTTTCCT GGAATTGGCC ACAAAGTTGA TGCAGTTTTC ATGAAAGATG GATTTTTCTA TTTCTTTCAT GGAACAAGAC AATACAAATT TGATCCTAAA ACGAAGAGAA TTTTGACTCT CCAGAAAGCT AATAGCTGGT TCAACTGCAG GAAAAATTGA (서열번호 68)
MMP9 cDNA(NM_004994)
ATGAGCCTCT GGCAGCCCCT GGTCCTGGTG CTCCTGGTGC TGGGCTGCTG CTTTGCTGCC CCCAGACAGC GCCAGTCCAC CCTTGTGCTC TTCCCTGGAG ACCTGAGAAC CAATCTCACC GACAGGCAGC TGGCAGAGGA ATACCTGTAC CGCTATGGTT ACACTCGGGT GGCAGAGATG CGTGGAGAGT CGAAATCTCT GGGGCCTGCG CTGCTGCTTC TCCAGAAGCA ACTGTCCCTG CCCGAGACCG GTGAGCTGGA TAGCGCCACG CTGAAGGCCA TGCGAACCCC ACGGTGCGGG GTCCCAGACC TGGGCAGATT CCAAACCTTT GAGGGCGACC TCAAGTGGCA CCACCACAAC ATCACCTATT GGATCCAAAA CTACTCGGAA GACTTGCCGC GGGCGGTGAT TGACGACGCC TTTGCCCGCG CCTTCGCACT GTGGAGCGCG GTGACGCCGC TCACCTTCAC TCGCGTGTAC AGCCGGGACG CAGACATCGT CATCCAGTTT GGTGTCGCGG AGCACGGAGA CGGGTATCCC TTCGACGGGA AGGACGGGCT CCTGGCACAC GCCTTTCCTC CTGGCCCCGG CATTCAGGGA GACGCCCATT TCGACGATGA CGAGTTGTGG TCCCTGGGCA AGGGCGTCGT GGTTCCAACT CGGTTTGGAA ACGCAGATGG CGCGGCCTGC CACTTCCCCT TCATCTTCGA GGGCCGCTCC TACTCTGCCT GCACCACCGA CGGTCGCTCC GACGGCTTGC CCTGGTGCAG TACCACGGCC AACTACGACA CCGACGACCG GTTTGGCTTC TGCCCCAGCG AGAGACTCTA CACCCGGGAC GGCAATGCTG ATGGGAAACC CTGCCAGTTT CCATTCATCT TCCAAGGCCA ATCCTACTCC GCCTGCACCA CGGACGGTCG CTCCGACGGC TACCGCTGGT GCGCCACCAC CGCCAACTAC GACCGGGACA AGCTCTTCGG CTTCTGCCCG ACCCGAGCTG ACTCGACGGT GATGGGGGGC AACTCGGCGG GGGAGCTGTG CGTCTTCCCC TTCACTTTCC TGGGTAAGGA GTACTCGACC TGTACCAGCG AGGGCCGCGG AGATGGGCGC CTCTGGTGCG CTACCACCTC GAACTTTGAC AGCGACAAGA AGTGGGGCTT CTGCCCGGAC CAAGGATACA GTTTGTTCCT CGTGGCGGCG CATGAGTTCG GCCACGCGCT GGGCTTAGAT CATTCCTCAG TGCCGGAGGC GCTCATGTAC CCTATGTACC GCTTCACTGA GGGGCCCCCC TTGCATAAGG ACGACGTGAA TGGCATCCGG CACCTCTATG GTCCTCGCCC TGAACCTGAG CCACGGCCTC CAACCACCAC CACACCGCAG CCCACGGCTC CCCCGACGGT CTGCCCCACC GGACCCCCCA CTGTCCACCC CTCAGAGCGC CCCACAGCTG GCCCCACAGG TCCCCCCTCA GCTGGCCCCA CAGGTCCCCC CACTGCTGGC CCTTCTACGG CCACTACTGT GCCTTTGAGT CCGGTGGACG ATGCCTGCAA CGTGAACATC TTCGACGCCA TCGCGGAGAT TGGGAACCAG CTGTATTTGT TCAAGGATGG GAAGTACTGG CGATTCTCTG AGGGCAGGGG GAGCCGGCCG CAGGGCCCCT TCCTTATCGC CGACAAGTGG CCCGCGCTGC CCCGCAAGCT GGACTCGGTC TTTGAGGAGC CGCTCTCCAA GAAGCTTTTC TTCTTCTCTG GGCGCCAGGT GTGGGTGTAC ACAGGCGCGT CGGTGCTGGG CCCGAGGCGT CTGGACAAGC TGGGCCTGGG AGCCGACGTG GCCCAGGTGA CCGGGGCCCT CCGGAGTGGC AGGGGGAAGA TGCTGCTGTT CAGCGGGCGG CGCCTCTGGA GGTTCGACGT GAAGGCGCAG ATGGTGGATC CCCGGAGCGC CAGCGAGGTG GACCGGATGT TCCCCGGGGT GCCTTTGGAC ACGCACGACG TCTTCCAGTA CCGAGAGAAA GCCTATTTCT GCCAGGACCG CTTCTACCGG CGCGTGAGTT CCCGGAGTGA GTTGAACCAG GTGGACCAAG TGGGCTACGT GACCTATGAC ATCCTGCAGT GCCCTGAGGA CTGA (서열번호 69)
본 발명의 관심 DNA는 관심 mRNA를 효율적으로 합성할 수 있는 mRNA 발현카세트 주형 DNA 절편으로 <T7 promoter - 5'UTR - 관심 DNA - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL> 순서로 제조할 수 있으며 관심 단백질이 TCR의 경우는 DNA 절편은 하기와 같다.
3) TCR
T 세포 수용체(TCR)는 인간은 적응 면역 체계의 주요 구성 요소를 제공하는 수천 종의 T 세포 수용체를 가지고 있으며, T 세포 수용체 반응은 바이러스 감염, 암 및 자가면역을 포함한 질환으로부터 보호하는데 중요한 기여를 한다.
TCR은 통상적으로 불변성 CD3 쇄 분자와 결합하여 완전한 기능성 TCR을 형성하는 고 가변성 알파(α) 및 베타(β) 쇄로 이루어진 디설파이드-결합된 막-고정된 이종 이량체성 단백질이다. 상기 수용체를 발현하는 T 세포를 α:β(또는 αβ) T 세포라 칭한다.
상기 α 및 베타 β 쇄는 불변(C) 영역 및 가변(V) 영역을 포함하는 세포외 도메인으로 구성된다. 상기 불변 영역은 세포막에 근접하고, 이어서 막관통 영역 및 짧은 세포질 꼬리가 있는 반면, 가변 영역은 상기 리간드에 결합한다. 대부분의 αβ T 세포에 대한 리간드는 MHC 분자에 결합된 펩티드이다.
TCR α-쇄 및 β-쇄 모두의 가변 도메인은 각각 상보성 결정 영역(CDR)이라 칭하는 3개의 가변 영역을 갖는다. 또한 통상적으로 항원과 접촉하지 않고 따라서 CDR로 간주되지 않는 β-쇄상의 추가적인 가변성 영역(HV4)이 존재한다. 일반적으로, 상기 항원-결합 부위는 TCR α-쇄 및 β-쇄의 CDR 루프에 의해 형성된다. CDR1α 및 CDR2α는 개별적인 Vα 유전자에 의해 암호화되는 반면, CDR1β 및 CDR2β는 개별적인 Vβ 유전자에 의해 암호화된다. 상기 TCR α-쇄의 CDR3는 V 영역 및 결합 영역의 결합 부근의 뉴클레오티드 부가 및 제거에 대한 가능성으로 인해 고가변성이다. 상기 TCR β-쇄 CDR3는 다양성(D) 유전자를 추가로 포함할 수 있으므로 훨씬 더 큰 변화 능력을 갖는다.
CDR3는 가공된 항원 인식을 담당하는 주요 CDR이지만, 알파쇄의 CDR1은 또한 항원 펩티드의 N-말단 부분과 상호작용하고 β-쇄의 CDR1은 상기 펩티드의 C-말단 부분과 상호작용하는 것으로 나타났다.
Ⅲ. 면역세포 표적화를 위한 최외각층 폴리머
본 발명에서 제공하는 면역세포 표적화 구조체의 최외각 층을 구성하는 폴리머에는 면역세포에 특이적으로 결합하는 리간드가 있어, 본 발명의 구조체는 특정 면역세포와 특이적인 결합을 할 수 있다. 이런 구조체를 면역세포 표적화 구조체라고 하였다.
면역세포는 면역 체계의 일부이며 신체가 감염 및 기타 질병과 싸우는 데 도움이 되는 세포이다. 면역세포는 골수에 있는 줄기세포에서 발생하며 호중구, 호산구, 호염기구, 비만 세포, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 자연 살해(NK) 세포 및 림프구 (B 세포 및 T 세포)가 포함된다.
일반적으로 면역표현형에서 세포표면항원무리(cluster of differentiation, CD)로 이용되어 세포의 표면에 있는 분자에 따라 세포를 정의할 수 있게 한다. 세포 표지자는 특정한 면역 기능과 세포를 연관지을 때 사용한다. 단 하나의 CD를 이용하여 세포 집단을 정의하는 것은 드물다(그러한 예시가 아예 없지는 않음). 여러 표지자를 결합하여 세포 유형을 나타냄으로써 면역계 내에서 매우 구체적으로 세포를 정의할 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 면역세포는 T 세포, NKT 세포 및 NK 세포를 의미할 수도 있다.
본 발명은 면역세포를 표적화하기 위해, 최외각 층에 면역세포에 특이적 결합을 하는 리간드를 포함하는 면역세포 표적화 구조체를 제공하는 것이다.
바람직하게, 본 발명에서 면역세포가 T 세포 경우는 예시적으로 CD8, NK 세포 경우는 예시적으로 CD56 또는 CD16에 특이적으로 결합하는 리간드를 사용하는 방법을 제공한다.
상기 리간드는 면역세포의 세포막의 외부 표면에 특이적 결합하는 항체, 압타머 및 펩타이드를 포함한다.
본 발명에서 면역세포 표적화 구조체의 최외각 층을 구성하는 폴리머와 리간드의 결합은 하기와 같다. 본 발명에서 면역세포 표적화 PEMN의 최외각 층을 구성하는 폴리머는 양이온성 또는 음이온성 폴리머일 수 있다.
본 발명의 면역세포 표적화 구조체의 제조방법 또한 제공된다. 하나의 예로 (a) 음이온성 폴리머-링커 화합물과 리간드-링커 화합물을 포함하는 군을 각각 준비하는 단계; (b) 상기 (a) 군에서 선택된 두 개의 화합물에 의해 형성된 음이온성 폴리머-링커-리간드 화합물들의 군을 준비하는 단계; 및 (c) 상기 (b)군으로부터 준비된 한 종류의 음이온성 폴리머-리간드 화합물과 양이온성는 폴리머 군에서 선택된 폴리머, 관심 mRNA를 준비하는 단계로 이루어진 방법이다.
본 발명의 면역세포 표적화 구조체의 제조방법 또한 제공된다. 하나의 예로 (a) 양이온성 폴리머-링커 화합물과 리간드-링커 화합물을 포함하는 군을 각각 준비하는 단계; (b) 상기 (a) 군에서 선택된 두 개의 화합물에 의해 형성된 양이온성 폴리머-링커-리간드 화합물들의 군을 준비하는 단계; 및 (c) 상기 (b)군으로부터 준비된 한 종류의 폴리머-리간드 화합물과 관심 mRNA를 준비하는 단계로 이루어진 방법이다.
1. 연결
본 발명의 면역세포 표적화 구조체는 관심 mRNA, 양이온성 폴리머와 양이온성 폴리머에서 선택된 방법으로 구성될 수 있으며 선택된 폴리머와 리간드가 결합될 수도 있다.
바람직하게, 선택된 폴리머와 리간드는 다양한 형태로 구성될 수 있다. 구성단위 사이에 링커(linker) 또는 스페이서(spacer)가 삽입될 수도 있다.
본 발명의 면역세포 표적화 구조체는 폴리머에 공유 또는 비공유 결합된 리간드와 관심 mRNA를 포함할 수 있다. 선형 또는 분지형 링커가 공유 및 비-공유 결합에 바람직하게 사용된다.
통상적으로, 면역세포 표적화 구조체를 구성하는 폴리머 부위와 리간드 부위 사이의 결합은 비공유결합 또는 공유결합을 통해 연결되어 구성될 수 있다.
예를 들어, 폴리머 부위와 리간드 부위 사이의 결합은 화학적 교차-연결(cross-linking)을 통해 공유결합 면역세포 표적화 구조체를 형성하는 것일 수 있다. 본 발명의 폴리머 부위와 리간드 부위로 이루어진 최외각층은 공유결합 또는 비공유 결합적으로 연결되어 특정 면역세포 내로 전달시키는 기능을 할 수 있다.
본 발명의 면역세포 표적화 구조체를 제조할 목적으로 공유 결합될 수 있는 폴리머-링커 화합물과 리간드-링커 화합물이 또한 제공된다. 링커는 면역세포 표적화 구조체의 구성성분의 결합 부위에 공유 결합시키기 위한 반응성 그룹을 포함한다. 폴리머 결합 부위에의 결합은 결합 부위 내의 반응성 그룹에 의해 수행될 수 있다. 링커 반응성 그룹은 케톤, 디케톤, 베타 락탐, 석신이미드 활성에스테르, 할로케톤, 락톤, 무수물, 에폭사이드, 알데하이드, 할라이드, 설포네이트, 포스포네이트, 구아니딘, 아미딘, 이민, 엔아민, 케탈, 아세탈 또는 말레이미드이다.
링커 화합물의 다양한 화학적 특징이 기술된다. 링커는 화학식 X-Y-Z를 갖고, 여기서, X는 C, H, N, O, P, S, Si, F, Cl, Br 및 I 중 임의의 원자를 포함하는 원자들의 선형 또는 분지형 연결쇄 또는 이의 염이고, 2 내지 100 단위의 반복 에테르 단위를 포함하며; Y는 임의적이고 Z의 1 내지 20개 원자 내에 위치된 단일 또는 융합된 5원 또는 6원 호모- 또는 헤테로카보사이클릭 포화 또는 불포화 환이며; Z는 하나 이상의 폴리머 및 리간드의 결합 부위내 반응성 아미노산의 측쇄에 공유 결합시키기 위한 반응성 그룹이다. 하나 이상의 링커 화합물에 포함될 경우에 링커 화합물은 X 또는 Y에 또는 X와 Y에 결합될 수 있다.
본 발명에 따른 구성 단위체는 서로 다른 종류의 리간드를 붙일 수 있고, 여러 종류의 리간드를 붙여 세포내 도입 효율을 높일 수 있다. 폴리머에 아민기, 카르복실기, 티올기, 알데하이드기, 아크릴로일기, 아지드기 등과 같은 관능기를 도입하여 리간드를 도입하며, 선별적으로 관능기를 도입하고 가교제의 종류를 다르게 하여 서로 다른 종류의 리간드를 선별적으로 양쪽 말단에 접합시킬 수 있다. 또한, 상기 관능기의 종류에 따라 가교제 없이 화학적 공유 결합을 만드는 카르보디이미드 커플링 반응(carbodiimide coupling reaction), 마이클 첨가 반응(micheal addition reaction), 클릭 화학(click chemistry) 등과 같은 화학 반응을 통해 리간드를 접합시킬 수 있다.
상기 링커는 본 발명의 면역세포 표적화 구조체의 세포관심 또는 면역세포 표적화 구조체의 약물방출 기능을 최대화하기 위하여 특별하게 선택된 길이 및/또는 서열, 구체적으로는 복수의 아미노산 잔기로 이루어진 링커일 수 있다. 상기 아미노산 서열로 이루어진 링커는 Huston, et al., Methods in Enzymology, 203: 46-88(1991), 및 Whitlow, et al., Protein Eng., 6: 989(1993)에 공지되어 있다.
주위 환경에 따라, 면역세포 표적화 구조체의 관심 특이성은 리간드와의 공유 또는 비공유 결합 뒤에 변형되거나 제거될 수도 있다. 결합 전 면역세포 표적화 구조체의 관심 특이성이 공유 결합 후에도 실질적으로 보유될 수 있다.
본 발명의 면역세포 표적화 구조체는 성분 그 자신들 이상의 다양한 장점을 제공한다. 예를 들면, 면역세포 표적화 구조체의 폴리머과 리간드 부분은 보편적으로 생체 내에서 약물의 반감기를 연장시킬 수 있다. 또한, 면역세포 표적화 구조체의 생물학적 효능이나 다른 생물학적 특징도 면역세포 표적화 구조체의 폴리머와 리간드에 의해 제공되는 이펙터 기능 (예를 들면, 보체 매개된 이펙터 기능)의 부가에 의하여 변형시킬 수 있다. 그 밖에도, 면역세포 표적화 구조체는 폴리머와 리간드와의 결합에 의해 증가된 크기를 통해 면역세포 표적화 구조체으로 하여금 새로운 역량으로 기능할 수 있게 한다.
추가로, 면역세포 표적화 구조체의 적어도 하나의 물리적 또는 생물학적 특징을 변경하는 방법이 또한 제공된다. 면역세포 표적화 구조체를 생성하기 위하여 폴리머 또는 리간드의 결합 부위에 비공유 결합이나 공유 결합을 한다. 또한, 링커의 하나 이상의 화학적 특징을 변형시킴으로써 면역세포 표적화 구조체의 하나 이상의 물리적 또는 생물학적 성질을 변형시키는 방법이 제공된다. 변형되는 물리적 또는 생물학적 성질에는 약동학, 약력학, 면역원성, 결합 친화성, 분해 감수성, 용해도, 친지성, 친수성, 소수성, 안정성 및 강도가 포함된다.
2. 불안정한 연결(Labile Linkage)
결합 또는 연결기(linker)는 하나 이상의 공유결합을 통해 관심 있는 하나의 화학적 그룹 또는 조각을 관심 있는 다른 화학적 그룹 또는 조각에 결합한 2개의 원자 사이의 연결이다. 예를 들어, 결합은 면역세포 표적화 구조체에 폴리머와 리간드를 연결할 수 있다. 결합의 형성은 2개의 별도의 분자를 단일 분자로 연결할 수 있거나 또는 동일한 분자에서 2개의 원자를 연결할 수 있다. 결합은 중성 전하일 수 있거나 또는 양전하 또는 음전하를 가질 수 있다.
가역적인 또는 불안정한 연결은 가역적인 또는 불안정한 결합(bond)을 함유한다. 결합은 2개의 연결된 원자 사이의 거리를 증가시키는 스페이서(spacer)를 임의로 포함할 수 있다. 스페이서는 유연성 및/또는 결합 길이를 더 가할 수 있다. 스페이서는 알킬기, 알케닐(alkenyl)기, 알키닐기(alkynyl), 아릴(aryl)기, 아르알킬(aralkyl)기, 아르알케닐(aralkenyl)기, 아르알키닐(aralkynyl)기를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않으며 각각은 하나 이상의 헤테로원자, 헤테로고리, 아미노산, 뉴클레오티드, 및 당류를 함유할 수 있다. 스페이서 기는 해당 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 선행 목록이 발명의 범위를 한정하는 것으로 의미하지 않는다.
불안정한 결합은 동일한 분자에서 다른 공유결합을 파괴 또는 절단하지 않을 조건하에 선택적으로 파괴 또는 절단될 수 있는 수소 원자의 공유결합 외의 공유결합이다. 더 상세하게는, 불안정한 결합은 동일한 분자에서 다른 불안정하지 않은 공유결합보다 적당한 조건하에 덜 안정하고(열역학적으로) 또는 더 빠르게 파손된(동력학적으로) 공유결합이다. 분자 내 불안정한 결합의 절단은 2개의 분자를 형성할 수 있다. 해당 기술분야의 숙련된 자의 경우, 결합의 절단 또는 불안정성은 일반적으로 결합 절단의 반감기(t½절단하는데 결합의 반이 필요한 시간) 면에서 검토한다. 따라서, 불안정한 결합은 분자에서 다른 결합보다 더 빠르게 선택적으로 절단될 수 있는 결합을 포함한다.
적당한 조건은 불안정한 결합의 유형에 의해 결정되고 유기화학에서 잘 알려져 있다. 불안정한 결합은 pH, 산화 또는 환원조건 또는 시약, 온도, 염 농도, 효소의 존재(뉴클레아제 및 프로테아제를 포함하는 에스터라아제와 같은), 또는 가해진 시약의 존재에 민감할 수 있다. 예를 들어, 증가 또는 감소된 pH는 pH-불안정한 결합에 적당한 조건이다.
불안정한 기가 변형을 수행할 비율은 불안정한 기를 포함하는 분자의 화학적 성분을 변경함으로써 조절될 수 있다. 예를 들어, 불안정한 기 근처의 특정 화학적 부분(예를 들어, 전자 받개 또는 주개)의 추가는 화학적 변형이 일어날 조건하에 특정 조건(예를 들어 pH)에 영향을 미칠 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 생리적으로 불안정한 결합은 일반적으로 접하는 조건 또는 포유동물 신체 내에서 접하는 조건과 유사한 조건하에 절단될 수 있는 불안정한 결합이다. 생리적으로 불안정한 연결 그룹은 이들이 특정 생리적 조건에 존재할 때 화학적 변형(예를 들어, 절단)을 수행하도록 선택된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 세포의 생리적으로 불안정한 결합은 포유동물 세포 내 조건하에서 절단될 수 있는 불안정한 결합이다. 포유동물 세포 내 조건은 포유동물 세포에서 확인된 pH, 온도, 산화 또는 환원조건 또는 시약, 그리고 염 농도와 같은 화학적 조건 또는 포유동물 세포에서 접하는 것과 유사한 것을 포함한다. 포유동물 세포 내 조건은 또한 단백질 가수분해 또는 가수분해 효소와 같은 포유동물 세포에 일반적으로 존재하는 효소 활성의 존재를 포함한다. 세포의 생리적으로 불안정한 결합은 또한 약학적으로 허용가능한 외인성 물질의 투여에 반응하여 절단될 수 있다. 45분 미만의 반감기를 갖는 적당한 조건하에 절단되는 생리적으로 불안정한 결합은 매우 불안정하다고 간주된다. 15분 미만의 반감기를 갖는 적당한 조간 하에 절단되는 생리적으로 불안정한 결합은 극도로 불안정하다고 간주된다.
화학적 변형(불안정한 결합의 절단)은 약학적으로 허용가능한 물질을 세포에 첨가하여 개시될 수 있거나 또는 불안정한 결합을 함유하는 분자가 적당한 세포 내 및/또는 세포 외 환경에 도달할 때 자발적으로 발생할 수 있다. 예를 들어, pH 불안정한 결합은 분자가 산성화된 엔도좀으로 들어갈 때 절단될 수 있다. 따라서, pH 불안정한 결합은 엔도좀 절단 가능한 결합(endosomal cleavable bond)으로 고려될 수 있다. 효소 절단성 결합은 엔도좀 또는 리소좀에서 또는 세포질에서 존재하는 것과 같은 효소에 노출되었을 때 절단될 수 있다. 디설파이드 결합(disulfide bond)은 분자가 세포질의 더 환원성 환경에 들어갈 때 절단될 수 있다. 따라서, 디설파이드는 세포질 절단 가능한 결합(cytoplasmic cleavable bond)으로 고려될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, pH-불안정한 결합은 산성 조건(pH<7) 하에 선택적으로 파괴된 불안정한 결합이다. 또한 세포 엔도좀 및 리소좀은 7 미만의 pH를 가지기 때문에, 이러한 결합은 엔도좀에서 불안정한 결합으로 일컫을 수 있다. 용어 pH-불안정한(pH-labile)은 pH-불안정한, 매우 pH-불안정한, 그리고 극도의 pH-불안정한 결합을 포함한다.
매우 pH-불안정한 결합: 매우 pH-불안정한 결합은 pH 5에서 절단에 대해 45분 미만의 반감기를 가진다. 매우 pH-불안정한 결합의 구성은 화학 기술분야에 잘 알려져 있다.
극도로 pH-불안정한 결합: 극도로 pH-불안정 결합은 pH 5에서 절단에 대해 15분 미만의 반감기를 가진다. 극도로 pH-불안정한 결합의 구성은 화학 기술분야에 잘 알려져 있다.
이치환된(Disubstituted) 고리형 무수물은 본 발명의 펩타이드에 관심약물의 결합에 특히 유용하다. 이들은 생리적으로 pH-불안정한 결합을 제공하고, 즉시 아민을 변형시키며, 세포의 엔도좀과 리소좀에서 확인된 감소된 pH에서 절단하여 아민을 회복시킨다. 두 번째, 아민과 반응하여 생성되는, 아민과 반응하여 생성되는 α 또는 β 카복실산기는 중합체에 예상되는 음전하의 약 1/20만 기여하는 것으로 나타난다(Rozema et al. Bioconjugate Chemistry 2003). 따라서, 펩티드와 이치환된 말레익 무수물의 변형은 높은 음전하를 갖는 펩티드를 생성하기보다는 다소 펩티드의 양전하를 효과적으로 중화한다. 중성에 가까운 전달 펩티드는 생체 내 전달에 적합하다.
Ⅳ. mRNA 운반시스템, 지질 구조체
상기 관심 mRNA은 선형(linear) 단일가닥 RNA일 수 있고, mRNA일 수 있다. mRNA는 일반적으로 몇 가지 구조적 요소(structural elememt), 예를 들면, 코딩 지역에 뒤따르는 상부에 위치한 리보좀 바인딩 사이트, 선택적 5'-UTR, 폴리-A-꼬리(및/또는 폴리-C-꼬리) 뒤에 있을 수 있는 선택적 3'-UTR를 포함하는 RNA이다. mRNA는 모노(mono-), 다이(di-), 또는 심지어 멀티시스트로닉 RNA(multicistronic RNA)로 나타날 수 있으며, 즉 본발명에서 정의된 바와 같이 하나, 둘 또는 더 많은(동일하거나 다른) 단백질 또는 펩타이드의 코딩 서열(coding sequence)을 운반하는 RNA이다. 다이(di-), 또는 심지어 멀티시스트로닉 mRNA(multicistronic mRNA)에서 그러한 코딩 서열은 적어도 하나의 내부 리보좀 유입점(internal ribosome entry site, IRES)서열에 의해 분리될 수 있다.
게다가, 상기 생분해성 고분자 담체 전달물 복합체의 관심 mRNA은 단일가닥 또는 이중가닥 관심 mRNA은 두개의 단일가닥 관심 mRNA들(분자들)의 비공유 결합 때문일 수 있다.
또는 부분적으로 이중가닥 또는 부분적으로 단일가닥 관심 mRNA일 수 있고, 적어도 부분적으로 상보적으로 이들 모두 다 부분적으로 이중가닥이거나 부분적으로 단일가닥인 관심 mRNA은 일반적으로 더 길고 더 짧은 단일가닥 관심 mRNA에 의해 만들어지거나 길이가 같은 두개의 단일가닥 관심 mRNA에 의해 만들어지고, 하나의 단일가닥 관심 mRNA은 다른 단일가닥 관심 mRNA에 부분적으로 상보적이며 따라서 둘은 이 부분에서 이중가닥 관심 mRNA 분자를 형성한다. 즉, 부분적으로 이중가닥 또는 부분적으로 단일가닥 관심 mRNA (분자)를 형성한다.
관심 mRNA 전달체의 형질도입은 세포 외 및 세포 내 장벽에 직면한다. 관심 mRNA 전달체는 혈청 관심 mRNA분해 효소 및 식세포 흡수에 노출되어 생물학적 반감기를 현저하게 감소시킨다. 또한, 세포외 기질(ECM) 뿐만 아니라 세포막의 음전하는 관심 mRNA 전달체가 관심에 도달하고 작용을 하는 것을 방해한다.
기능에 대한 많은 장벽 중 관심 mRNA은 세포질에 도달하기 위해 세포막을 가로 질러야한다. 세포막은 세포 내 전달에 대한 역동적이고 강력한 장벽이다. 다양한 이온 펌프 및 이온 채널이 음전위를 유지하는 데 도움이 된다. 세포막을 가로 질러 -40 ~ -80 mV), 대부분의 필수 금속 이온(예:K+, Na+, Ca2+ 및 Mg2+)의 균형을 조절하여 세포질 공간에 음전하를 유지한다.
세포막은 매우 음으로 하전된 관심 mRNA 분자에 대한 강력한 장벽을 생성한다. 불포화 지질, 특히 시스-이중 결합된 지질은 막 구조에 결함을 도입함으로써 세포막 유동성을 증가시킨다. 이중층의 다른 주요 성분은 스테롤(총 지질의 약 30%)을 포함한다. 지질 이중층의 주요 스테롤인 콜레스테롤은 이중층 결함을 생성하여 지질 이중층의 유동화와 응축 사이의 균형을 유지하는 데 도움이 된다.
비록 기초과학분야와 다양한 비바이러스 유전자 운반 시스템에서 중요한 발전이 있지만 비바이러스 접근법의 대다수는 여전히 바이러스 벡터들보다 덜 효율적이고, 특히나 생체내 유전자 운반에서 더욱 그러하다.
본 발명의 관심 mRNA의 입체적 안정성을 달성하고 담체의 BD/PK 특성을 향상시키기 위해 다른 약제에서 FDA가 인간에게 사용하도록 승인한 폴리에틸렌글리콜 접합(PEGylated) 지질을 사용할 수 있다. 가능한 모든 면역 반응과 보체 시스템의 활성화가 최소화되도록 입자 표면 전체가 PEG로 덮여 있을 수도 있다.
유전자 치료법에서 한 가지 특이한 접근법은 양이온 지질(cationic lipids)을 사용한다는 것이다. 그러나, 비록 많은 양이온 지질들이 세포 배양에서 우수한 형질도입 활성을 나타내지만, 대부분은 혈청의 존재 하에서는 잘 수행되지 않고 몇몇만이 생체 내에서 활성을 가진다. 리포플렉스(lipoplexes)가 압도적으로 많은 양의 음전하 및 혈액, 점액 상피 라이닝 유체(mucus epithelial lining fluid) 또는 조직 매트릭스(tissue matrix)에 존재하는 양친매성 단백질과 다당류에 노출될 때 사이즈, 표면 전하 그리고 지질 구조에서 현저한 변화가 일어난다.
생체 내로 일단 투여된 리포플렉스(lipoplexes)는 음전하로 하전된 혈액 성분과 반응하고, 큰 집합체(aggregates)를 형성하는 경향이 있으며, 이러한 큰 집합체는 순환하는 적혈구 세포의 표면에 흡착되거나, 두꺼운 점액층에 붙잡히게 되거나, 미소혈관계에 색전증(embolize)을 발생하게 하여, 리포플렉스가 먼 거리(distal location)에 있는 계획된 타겟 세포에 도달하는데 방해가 되게 한다.
게다가, 리포플렉스에 의한 유전자 도입(gene transfer)과 관련된 독성은 특히 염증성 사이토카인(inflammatory cytokines)의 유발을 포함한다. 사람에게서, 리포플렉스를 받은 환자들 사이에서 독감-유사 증상들을 포함한 다양한 정도의 부정적인 염증성 반응들이 보고되었다. 따라서, 리포플렉스가 모든 사람에게 안전하게 이용될 수 있는지는 여전히 의문이 남는다.
게다가, 비록 높은 분자량을 갖는 폴리머에 의해 만들어진 폴리플렉스는 생리학적 조건하에서 향상된 안정성을 나타내지만, 그러한 폴리머들은 벡터 언팩킹(vector unpacking)을 방해할 수 있다. 예를 들어, poly L-lysine(PLL)로 형성된 복합체에서 매우 빠르게 DNA가 해리된 명백히 향상된 단기 유전자 발현(short-term gene expression)이 생긴다. 수용체 매개 유전자 운반에 활성된 구조 안으로 DNA를 채워 넣기 위해서는 최소한 6에서 8의 양이온 아미노산 길이가 필요하다. 그러나, 짧은 다양이온으로 만들어진 폴리플렉스는 생리학적 조건하에서 안정하지 않고 일반적으로 생리 식염수 내에서 빠르게 응집체(aggregate)가 형성된다.
이러한 부정적인 면을 극복하기 위하여 관심 mRNA의 방출을 촉진하기 위하여 세포내 환경에 의해 절단될 수 있는 Cys-Lys10-Cys 펩타이드의 산화 중축합(oxidative polycondensation)에 의해 만들어진 선형의(linear) 환원성 다양이온(reducible polycation, RPC)에 기초를 둔 새로운 형태의 합성 벡터도 개발하였다. RPC에 의해 만들어지는 폴리플렉스들은 DNA와 mRNA의 효과적인 방출을 가능하게 하는 환원 상태에 의해 불안정해질 수 있다는 것을 보여주었다.
또 다른 바람직한 mRNA 운반 시스템 구체예에서, 본 발명의 조성물내 mRNA 운반 시스템은 리포좀 운반 시스템, 가령 지질 나노입자이다. 한 가지 구체예에서, mRNA 운반 시스템은 표적 세포에 mRNA의 전달을 최적화하도록 선택 및/또는 제조될 수 있다. 예를 들어, 표적 세포가 면역세포라면, 운반 시스템의 특성 (가령, 크기, 전하 및/또는 pH)은 표적 세포에 이러한 mRNA 운반 시스템을 효과적으로 전달하기 위해, 면역 클리어런스(immune clearance)를 감소시키기 위해 및/또는 그 표적 세포에서의 잔류를 촉진시키기 위해 최적화될 수 있다. 대안으로, 표적 세포가 중추 신경계라면 (가령, 신경퇴행성 질병의 치료를 위해 투여된 mRNA는 뇌 또는 척추 신경을 특이적으로 표적할 수 있음), mRNA 운반 시스템의 선택 및 제조는 혈액 뇌 장벽(blood brain barrier)의 침투 및 혈액 뇌 장벽 내에서의 잔류 및/또는 이러한 표적 세포에 이러한 운반 시스템을 직접적으로 전달하는 대안적인 수단의 용도를 고려해야 한다. 한 가지 구체예에서, 본 발명의 조성물은 외인성 mRNA의 수송을 촉진시키는 물질 (가령, 혈관 뇌 장벽의 투과성을 방해하거나 개선하고 그렇게 함으로써 표적 세포로 외인성 mRNA의 수송을 증진시키는 물질)과 결합될 수 있다.
표적 세포에 핵산의 전달을 촉진시키기 위한 리포좀 mRNA 운반 시스템의 용도가 본 발명에 의해 고려된다. 리포좀(가령, 리포좀 지질 나노입자)은 연구, 산업 및 의약내 여러 가지 적용에서, 특히 생체내 진단적 또는 치료학적 화합물의 수송 비히클로서 그들의 용도를 위해 일반적으로 유용하고 그리고 하나 이상의 이중층의 막에 의해 바깥쪽 배지로부터 격리된 내부 아쿠아(aqua) 공간을 가진 미시적인 소포체로서 주로 특징된다. 리포좀의 이중층 막은 공간적으로 분리된 친수성 및 소수성 도메인을 포함하는 양쪽친매성 분자, 가령 합성 또는 천연 기원의 지질에 의해 전형적으로 형성된다. 리포좀의 이중층 막은 양쪽친매성 폴리머 및 계면활성제 (가령, 폴리머로좀, 니오좀 등)에 의해 또한 형성될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 리포좀 mRNA 운반 시스템은 전형적으로 표적 세포에 mRNA를 수송하는 역할을 한다. 본 발명의 목적을 위하여, 리포좀 mRNA 운반 시스템은 바람직한 핵산을 함유하도록 제조된다. 리포좀 내로 바람직한 실체(entity) (가령, 핵산)의 편입 공정은 종종 "로딩"으로서 언급된다. 리포좀-편입 mRNA는 리포좀의 내부 공간 안에, 리포좀의 이중층 막 내에, 또는 리포좀 막의 외부 표면과 연관되어 완전하게 또는 부분적으로 위치될 수 있다. 리포좀 내로 mRNA의 봉입은 "캡슐화"로서 본 명세서에서 또한 언급되며 여기서 mRNA는 리포좀의 내부 공간 내에 완전히 함유된다. mRNA 운반 시스템, 가령 리포좀 내로 mRNA를 봉입시키는 목적은 종종, 핵산을 분해하는 효소 또는 화학 물질 및/또는 핵산의 빠른 배출을 야기하는 시스템 또는 수용체를 함유할 수 있는 환경으로부터 핵산을 보호하기 위함이다. 이에 따라, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 선택된 mRNA 운반 시스템은 그 안에 함유된 mRNA의 안정도를 증진시킬 수 있다. 리포좀은 캡슐화 mRNA를 표적 세포에 도달하도록 할 수 있고 및/또는 캡슐화 mRNA가 표적 세포에 도달하도록 바람직하게 할 수 있고, 또는 대안으로, 투여된 mRNA의 존재가 쓸모 없거나 바람직하지 않을 수 있는 다른 부위 또는 세포로의 이러한 mRNA의 전달을 제한할 수 있다. 추가적으로, 수송 비히클, 가령 양이온 리포좀 내로 mRNA를 봉입시키는 것은 표적 세포 내로 이러한 mRNA의 전달을 또한 촉진시킨다.
이상적으로, 리포좀 mRNA 운반 시스템은 조성물이 높은 형질감염 효능과 증진된 안정도를 입증하도록 하나 이상의 바람직한 mRNA를 캡슐화하기 위해 제조된다. 리포좀은 표적 세포 내로 핵산의 도입을 촉진시킬 수 있으며 한편으로, 코폴리머(copolymer)로서, 폴리양이온 (가령, 폴리 L-리신 및 프로타민)의 첨가는 시험관내 및 생체내 둘 모두의 많은 세포주에서 2-28배까지 여러 가지 유형의 양이온 리포좀의 형질감염 효능을 촉진시키고, 그리고 예를 들어 상기 효능을 두드러지게 증진시킬 수 있다.
지질 나노입자
본 발명의 바람직한 구체예에서, mRNA 운반 시스템은 지질 나노입자로서 조제된다. "지질 나노입자"는 하나 이상의 지질 (가령, 양이온 지질, 비-양이온 지질, 및 PEG-변형 지질)을 포함한 운반 시스템을 나타낸다. 바람직하게, 지질 나노입자는 하나 이상의 표적 세포에 하나 이상의 mRNA를 전달하도록 조제된다. 적합한 지질의 예시는 예를 들어, 포스파티딜 화합물 (가령, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 스핑고지질, 세레브로사이드, 및 갱글리오사이드)을 포함한다. 단독으로 또는 다른 수송 비히클과 조합할지에 대해, 수송 비히클로서 폴리머의 용도가 또한 고려된다. 적합한 폴리머는 예를 들어, 폴리아크릴레이트, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리락타이드, 폴리락타이드폴리글리콜라이드 코폴리머, 폴리카프로락톤, 덱스트란, 알부민, 젤라틴, 알기네이트, 콜라겐, 키토산, 사이클로덱스트린, 덴드리머 및 폴리에틸렌이민을 포함할 수 있다. 한 가지 구체예에서, 수송 비히클은 표적 세포에 mRNA의 형질감염을 촉진시키는 이의 능력에 기반하여 선택된다.
본 발명은 단백질 생산을 위한 저장고로서 작용할 표적 세포 내로 mRNA의 전달을 캡슐화 및/또는 증진시키기 위해 양이온 지질을 포함하는 운반 시스템로서 지질 나노입자의 용도를 고려한다. "양이온 지질"은 선택된 pH, 가령 생리학적 pH에서 순 양전하(net positive charge)를 지니는 다수의 지질 종류 중 어느 하나를 나타낸다. 고려되는 지질 나노 입자는 하나 이상의 양이온 지질, 비-양이온 지질 및 PEG-변형 지질을 이용하여 가변비 (varying ratio)의 다수-성분 지질 혼합물을 포함함으로써 제조될 수 있다. 여러 가지 양이온 지질은 문헌에서 설명되었으며, 이들 중 다수는 상업적으로 이용가능하다.
양이온 지질은 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 또는 "DOTMA"가 이용된다. DOTMA는 단독으로 제조될 수 있거나 리포좀 수송 비히클 또는 지질 나노입자 내로 중성 지질, 디올레오일포스파티딜-에탄올아민 또는 "DOPE" 또는 다른 양이온 또는 비-양이온 지질과 조합될 수 있고, 그리고 이러한 리포좀은 표적 세포 내로 핵산의 전달을 증진시키는 데에 이용될 수 있다. 다른 적합한 양이온 지질은 예를 들어, 5-카르복시스페르밀글리신디옥타데실아미드 또는 "DOGS", 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민-카르복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 또는 "DOSPA", 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판 또는 "DODAP", 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 또는 "DOTAP"를 포함한다.
고려되는 양이온 지질은 또한, 1,2-디스테아릴옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 또는 "DSDMA", 1,2-디올레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 또는 "DODMA", 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 또는 "DLinDMA", 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸3-아미노프로판 또는 "DLenDMA", N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드 또는 "DODAC", N,N-디스테아릴N,N-디메틸암모늄 브로마이드 또는 "DDAB", N-(1,2-디미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸암모늄 브로마이드 또는 "DMRIE", 3-디메틸아미노-2-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시부탄-4-옥시)-1-(시스,시스9,12-옥타데카디엔옥시)프로판 또는 "CLinDMA", 2-[5'-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시)-3'-옥사펜톡시)-3-디메틸1-(시스,시스-9', 1-2'-옥타데카디엔옥시)프로판 또는 "CpLinDMA", N,N-디메틸-3,4-디올레일옥시벤질아민 또는 "DMOBA", 1,2-N,N'-디올레일카르바밀-3-디메틸아미노프로판 또는 "DOcarbDAP", 2,3-디리놀레오일옥시-N,N-디메틸프로필아민 또는 "DLinDAP", 1,2-N,N'-디리놀레일카르바밀-3-디메틸아미노프로판 또는 "DLincarbDAP", 1,2-디리놀레오일카르바밀-3-디메틸아미노프로판 또는 "DLinCDAP", 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란 또는 "DLin-K-DMA", 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란 또는 "DLin-K-XTC2-DMA", 및 2-(2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸에탄아민 (DLin-KC2-DMA)), 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
본 발명에 의해 콜레스테롤-기반 양이온 지질의 용도가 또한 고려된다. 이러한 콜레스테롤-기반 양이온 지질은 단독으로 또는 다른 양이온 또는 비-양이온 지질과 조합하여 이용될 수 있다. 적합한 콜레스테롤-기반 양이온 지질은 예를 들어, DC-Chol (N,N-디메틸-N-에틸카르복사미도콜레스테롤), 1,4-비스(3-N-올레일아미노-프로필)피페라진, 또는 ICE를 포함한다.
추가적으로, 여러 가지 시약은 형질감염 효능을 증진시키기 위해 상업적으로 이용가능하다. 적합한 예시는 LIPOFECTIN (DOTMA:DOPE) (Invitrogen, Carlsbad, Calif.), LIPOFECTAMINE (DOSPA:DOPE) (Invitrogen), LIPOFECTAMINE2000. (Invitrogen), FUGENE, TRANSFECTAM (DOGS), 및 EFFECTENE을 포함한다.
또한 고려되는 것은 양이온 지질, 가령 디알킬아미노-기반, 이미다졸-기반, 및 구아니디니움-기반 지질이다. 예를 들어, 특정한 구체예는 하나 이상의 이미다졸-기반 양이온 지질, 예를 들어, 이미다졸 콜레스테롤 에스테르 또는 "ICE" 지질 (3S, 10R, 13R, 17R)-10, 13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌3-일 3-(1H-이미다졸-4-일)프로파노에이트를 포함하는 조성물에 대한 것이다. 바람직한 구체예에서, mRNA의 전달을 위한 수송 비히클은 하나 이상의 이미다졸-기반 양이온 지질, 예를 들어, 구조 (I)로 나타난 바와 같이, 이미다졸 콜레스테롤 에스테르 또는 "ICE" 지질 (3S, 10R, 13R, 17R)-10, 13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일3-(1H-이미다졸-4-일)프로파노에이트를 포함할 수 있다.
이미다졸-기반 양이온 지질 ICE의 융합생성 유발성(fusogenicity)은 종래의 양이온 지질에 비해 더 낮은 pKa를 갖는 이미다졸 기에 의해 촉진되는 엔도좀 파괴와 관련된다. 엔도좀 파괴는 차례로 삼투성 팽윤 및 리포좀 막의 파괴, 그 다음 표적 세포 내로 그 안에 로딩된 핵산(들) 함유물의 형질감염 또는 세포내 방출을 촉진한다.
이미다졸-기반 양이온 지질은 다른 양이온 지질에 비해 그들의 감소된 독성으로 또한 특징된다. 이미다졸-기반 양이온 지질 (가령, ICE)은 지질 나노입자내 유일한 양이온 지질로서 이용될 수 있거나, 대안으로 종래의 양이온 지질, 비-양이온 지질, 및 PEG-변형 지질과 조합될 수 있다. 양이온 지질은 수송 비히클내 존재하는 총 지질의 약 1% 내지 약 90%, 약 2% 내지 약 70%, 약 5% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 또는 바람직하게는 수송 비히클내 존재하는 총 지질의 약 20% 내지 약 70%의 분자비를 포함할 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-변형 인지질 및 유도체화 지질, 가령 N-옥타노일-스핑고신-1-[석시닐(메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-2000] (C8 PEG-2000 세라미드)을 포함하는 유도체화 세라미드 (PEG-CER)의 용도가 단독으로 또는 바람직하게는 유전자 운반 시스템 (가령, 지질 나노입자)을 포함하는 다른 지질과 함께 조합하여, 본 발명에 의해 또한 고려된다. 고려되는 PEG-변형 지질은 C6-C20 길이의 알킬 사슬(들)을 가진 지질과 공유결합으로 부착된 길이 최대 5 kDa까지의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 성분의 첨가는 복합체 응집을 방지할 수 있고 그리고 순환 수명을 증가시키고 표적 세포에 지질-핵산 조성물의 전달을 증가시키기 위한 수단을 또한 제공할 수 있고, 또는 그들은 생체내 제제 밖으로 신속하게 교환시키기 위해 선택될 수 있다. 특히 유용하고 교환가능한 지질은 더 짧은 아실 사슬 (가령, C14 또는 C18)을 갖는 PEG-세라미드이다. 본 발명의 PEG-변형 인지질 및 유도체화 지질은 리포좀 수송 비히클내 존재하는 총 지질의 약 0% 내지 약 20%, 약 0.5% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 15%, 약 4% 내지 약 10%, 또는 약 2%의 분자비를 포함할 수 있다.
본 발명은 비-양이온 지질의 용도를 또한 고려한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 구절 "비-양이온 지질"은 임의의 중성, 쌍성 이온 또는 음이온 지질을 나타낸다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 구절 "음이온 지질"은 선택된 pH, 가령 생리학적 pH에서 순 음전하(net negative charge)를 지니는 다수의 지질 종류 중 어느 하나를 나타낸다. 비-양이온 지질은 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린 (DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤 (DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤 (DPPG), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린 (POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민 (POPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카르복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민 (DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민 (DMPE), 디스테아로일포스파티딜-에탄올아민 (DSPE), 16-O-모노메틸 PE, 16-O-디메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민 (SOPE), 콜레스테롤, 또는 이들의 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 비-양이온 지질은 단독으로 이용될 수 있지만, 바람직하게는 다른 부형제, 가령 양이온 지질과 조합하여 이용된다. 양이온 지질과 조합하여 이용될 때, 비-양이온 지질은 수송 비히클내 존재하는 총 지질의 5% 내지 약 90%, 또는 바람직하게 약 10% 내지 약 70%의 분자비를 포함할 수 있다.
바람직하게, mRNA 운반 시스템 (가령, 지질 나노입자)는 다수의 지질 및/또는 폴리머 성분을 조합함으로써 제조된다. 예를 들어, mRNA 운반 시스템은 40:30:25:5의 분자비로 C12-200, DOPE, chol, DMG-PEG2K, 또는 18:56:20:6의 분자비로 DODAP, DOPE, 콜레스테롤, DMG-PEG2K, 또는 40:20:35:5의 분자비로 HGT5000, DOPE, chol, DMG-PEG2K, 또는 40:20:35:5의 분자비로 HGT5001, DOPE, chol, DMG-PEG2K를 이용하여 제조될 수 있다. 지질 나노입자를 포함하는 양이온 지질, 비-양이온 지질 및/또는 PEG-변형 지질의 선택, 그리고 이러한 지질 대 서로 간의 상대적인 분자비는 선택된 지질(들)의 특성, 의도된 표적 세포의 성질, 전달되어야 할 mRNA의 특성에 기반한다. 추가적인 고려사항은 예를 들어, 알킬 사슬의 포화, 그리고 선택된 지질(들)의 크기, 전하, pH, pKa, 융합생성 유발성 및 독성을 포함한다. 따라서 분자비는 이에 따라 조정될 수 있다. 예를 들어, 구체예에서, 지질 나노입자내 양이온 지질의 퍼센트는 10% 초과, 20% 초과, 30% 초과, 40% 초과, 50% 초과, 60% 초과, 또는 70% 초과일 수 있다. 지질 나노입자내 비-양이온 지질의 퍼센트는 5% 초과, 10% 초과, 20% 초과, 30% 초과, 또는 40% 초과일 수 있다. 지질 나노입자내 콜레스테롤 퍼센트는 10% 초과, 20% 초과, 30% 초과, 또는 40% 초과일 수 있다. 지질 나노입자내 PEG-변형 지질의 퍼센트는 1% 초과, 2% 초과, 5% 초과, 10% 초과, 또는 20% 초과일 수 있다.
특정한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 지질 나노입자는 다음 양이온 지질 중 적어도 하나를 포함한다: C12-200, DLin-KC2-DMA, DODAP, HGT4003, ICE, HGT5000, 또는 HGT5001. 구체예에서, mRNA 운반 시스템은 콜레스테롤 및/또는 PEG-변형 지질을 포함한다. 몇몇 구체예에서, mRNA 운반 시스템은 DMG-PEG2K를 포함한다. 특정한 구체예에서, mRNA 운반 시스템은 다음 지질 제제 중 하나를 포함한다: C12-200, DOPE, chol, DMG-PEG2K; DODAP, DOPE, 콜레스테롤, DMG-PEG2K; HGT5000, DOPE, chol, DMG-PEG2K, HGT5001, DOPE, chol, DMG-PEG2K.
본 발명의 조성물에서 이용하기 위한 리포좀 mRNA 운반 시스템은 당분야에 현재 공지된 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 다중-라멜라 소포체(Multi-lamellar vesicle) (MLV)는 기존의 기술로, 예를 들어 적절한 용매에서 지질을 용해시켜 적합한 컨테이너(container) 또는 용기(vessel)의 안쪽 벽에 선택된 지질을 퇴적시킴으로써, 그리고 이후 용기의 안쪽에 얇은 필름을 남기도록 용매를 증발시키거나 분무 건조시킴으로써 제조될 수 있다. 이후 MLV의 형성을 야기하는 와동 운동(vortexing motion)을 하면서 용기에 수성상이 첨가될 수 있다. 이후 단일라멜라 소포체 (Uni-lamellar vesicle) (ULV)가 다중-라멜라 소포체의 균질화, 초음파처리 또는 압출에 의해 형성될 수 있다. 추가적으로, 단일라멜라 소포체는 세제 제거 기술에 의해 형성될 수 있다.
본 발명의 특정한 실시례에서, 본 발명의 조성물은 mRNA 운반 시스템을 포함하며 여기서 mRNA는 운반 시스템의 표면 및 동일한 운반 시스템 내에 캡슐화된 표면 둘 모두와 연관된다. 예를 들어, 본 발명의 조성물의 제조 동안에, 양이온 리포좀 운반 시스템은 정전기 상호작용을 통해 mRNA와 연관시킬 수 있다.
특정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 진단 방사성핵종, 형광 물질 또는 시험관내 및 생체내 적용 둘 모두에서 탐지가능한 다른 물질을 이용하여 로딩된다. 예를 들어, 본 발명에서 이용하기 위해 적합한 진단 물질은 로다민-디올레오일포스파티딜에탄올아민(Rh-PE), 녹색 형광 단백질 mRNA (GFP mRNA), 레닐라 루시퍼라아제 mRNA 및 반딧불이 루시퍼라아제 mRNA를 포함할 수 있다.
리포좀 mRNA 운반 시스템의 적절한 크기 선택은 표적 세포 또는 조직의 부위를 고려해야하고 그리고 리포좀이 만들어지기 위한 적용을 어느 정도까지 고려해야한다. 몇몇 구체예에서, 특정한 세포 또는 조직에 mRNA의 형질감염을 제한하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 표적 간세포에 대해 리포좀 mRNA 운반 시스템은 이의 치수가 간내 내피층 내벽 간 동양혈관(endothelial layer lining hepatic sinusoid)의 천공보다 더 작도록 크기를 바꿀 수 있고; 이에 따라서 리포좀 mRNA 운반 시스템은 표적 간세포에 도달하기 위해 이러한 내피 천공을 쉽게 관통할 수 있다. 대안으로, 리포좀 mRNA 운반 시스템은 리포좀의 치수가 특정한 세포 또는 조직 내로 제한하거나 또는 명확하게 분포를 피하는 데에 충분한 지름이 되도록 크기를 바꿀 수 있다. 예를 들어, 리포좀 mRNA 운반 시스템은 이의 치수가 내피 층 내벽 간 동양혈관의 천공보다 더 크도록 크기를 바꾸어 그렇게 함으로써 간세포에 대한 리포좀 mRNA 운반 시스템의 분포를 제한할 수 있다. 일반적으로 mRNA 운반 시스템의 크기는 약 25 내지 250 nm의 범위 내에 있고, 바람직하게는 약 250nm, 175nm, 150nm, 125nm, 100nm, 75nm, 50nm, 25nm 또는 10nm 미만이다.
당분야에 공지된 다양한 대안적인 방법은 리포좀 mRNA 운반 시스템의 모집단의 크기순 배열을 위해 이용가능하다. 이러한 크기순 배열 방법 하나는 아래에서 설명된다. 리포좀 현탁액을 욕조(bath) 또는 프로브(probe) 초음파처리 중 하나로 초음파 처리하는 것은 지름 약 0.05 미만 마이크론의 작은 ULV에 이르기까지 점진적인 크기 감소를 초래한다. 균질화는 거대 리포좀을 더 작은 것으로 분열시키기 위해 에너지를 전단하는 것에 의존하는 또 다른 방법이다. 전형적인 균질화 절차에서, MLV는 선택된 리포좀 크기가 전형적으로 약 0.1 내지 0.5 마이크론에서 관찰될 때까지 표준 에멀젼 균질기를 통해 재순환된다. 리포좀 소포체의 크기는 준-전광 산란(quasi-electric light scattering) (QELS)에 의해 측정될 수 있다. 평균 리포좀 지름은 형성된 리포좀의 초음파처리에 의해 감소될 수 있다. 간헐적인 초음파처리 주기는 효율적인 리포좀 합성을 유도하기 위해 QELS 평가와 번갈아가며 나타날 수 있다.
Ⅲ. 고분자 전해질 복합체(Polyelectrolyte Complex, PEC)
고분자 전해질 복합체(Polyelectrolyte Complex, PEC)는 반대 전하의 두 중합체가 혼합될 때 자발적으로 형성되어 거대 분자가 주로 정전기적 상호작용에 의해 함께 결합되는 복합체이다. 또한, "나노 플렉스"는 양으로 하전된 나노 입자와 관심 mRNA, DNA 또는 RNA 사이에 형성된 복합체를 나타내기 위해 문헌에서 널리 사용된다. 양으로 하전된 성분이 키토산과 같은 양이온성 폴리펩타이드를 기반으로 하는 경우, 나노 플렉스는 폴리 플렉스로도 정의될 수 있다.
PEC는 주로 구형이며, 양이온 및 음이온성 중합체의 화학량론적 혼합물을 함유하고, 하전 안정화 쉘의 형성을 허용하는 과량의 고분자 전해질에 의해 둘러싸인 중성 코어로 구성된다.
PEC의 자체 조립은 가역적인 과정이므로 PEC와 매체 사이의 정전기 차폐 및 폴리 이온 교환으로 인해 다른 하전된 종의 존재 하에서 무결성이 손상될 수 있다. 따라서, PEC의 안정성은 하전된 단백질 및 고농도의 작은 전해질이 존재하는 생물학적 매질에서 심각한 영향을 받을 수 있다. 이 문제를 극복하기 위한 전략은 복합 다가 전해질을 공유 가교 결합하여 PEM로부터 폴리머 사슬의 분리를 방지함으로써 PEM의 안정성을 향상시키는 것이다. PEM 기반 나노 입자는 제조가 쉽고 비용 효율적이기 때문에 매력적이며, 정전기 상호작용의 가역성은 적절한 조건하에서 복합체의 무결성을 유지하면서 담체의 거동에 특별한 조정성을 제공하기 때문에 매력적이다.
관심 mRNA 전달을 위해 가장 많이 개발된 방법 중 하나는 지질 나노 입자(LNP)의 복합제제이다. LNP 제제는 일반적으로 (1) 폴리 음이온성 관심 mRNA을 캡슐화하기 위해 이온화 가능 또는 양이온성 지질 또는 3 차 또는 4 차 아민을 보유하는 고분자 재료; (2) 세포막의 지질과 유사한 양 이온성 지질(예를 들어, 1,2- 디오레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올 아민 [DOPE]); (3) LNP의 지질 이중층을 안정화시키는 콜레스테롤; 및 (4) 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-지질로 나노 입자에 수화층을 형성하여 콜로이드 안정성을 개선하며 단백질 흡수를 감소시킨다.
상기 캡슐화하여 제조하는 가장 대관심인 입자는 지질 나노 입자로 인지질은 생체 적합성, 대규모 생산의 상대적 용이성 및 임상 시험에서 사용되는 최근 승인으로 인해 관심 mRNA의 가장 유망한 전달체 중 하나로 인식되고 있다.
인지질은 물에 분산되면 자발적인 이중층 구조를 형성하는 양친매성 분자이며 분산된 친수성 하중을 성형 구조물의 수성 코어 내에 포집한다. 따라서 양이온성 폴리펩타이드로 이들 분자의 헤드 그룹을 화학적으로 변형시키면 정전기적 상호 작용을 통한 음으로 하전된 본 발명에서 제조하는 관심 mRNA의 포획이 촉진되어 전달체의 유망한 구성 요소가 된다.
본 발명의 관심 mRNA 전달체는 혈장 안정성 및 순환 시간 정도뿐 아니라 세포의 유입 측면에서 관심 mRNA 전달체의 약물 동태의 향상에 두고 있다.
본 발명의 관심 mRNA을 구성하는 관심 mRNA은 강력하게 음으로 하전된 폴리머로 입자를 제조하는 과정에서 양이온 폴리머가 매우 중요한 역할을 한다. 양이온성 폴리펩타이드는 정전기 상호작용, 세포 흡수, 양성자 스폰지 매개 엔도솜 탈출을 통해 음으로 하전된 관심 mRNA과의 복잡한 형성을 촉진하는 능력을 포함하는 몇 가지 이점을 제공한다. 그러나 양이온 폴리머의 단점은 세포막의 무결성 변화와 높은 면역원성 때문에 높은 독성이 있다는 것이다.
더 나아가 유전자 치료에서 더 전도유망한 접근법은 양이온 폴리머(cationic polymers)를 사용하는 것이다. 양이온 폴리머는 단단히 복합체를 형성하고 음전하를 띈 관심 mRNA을 응축하기 때문에 관심 mRNA의 형질도입에서 효용성이 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 많은 양이온 폴리머가 시험관 내 및 생체 내 유전자 운반을 위한 담체로써 연구되고 있다.
양이온성 생체적합성 폴리머는 일반적으로 전하를 띤 분자를 말하며, 이는 일반적으로 1 ~ 9, 9 미만(예를 들어 5 ~ 9), 또는 8 미만(예를 들어 5 ~ 8), 또는 7 미만(예를 들어, 5 ~ 7)의, 예를 들어 7.3 ~ 7.4의 생리학적 pH 값의 양전하를(양이온) 띤다. 따라서, 양이온성 성분은 임의의 양전하를 띤 생체적합성 폴리머 또는 폴리머, 생리학적 조건하에서, 특히 생체 내 생리학적 조건 하에서 양전하를 띤, 양이온성 펩타이드 또는 단백질일 수 있다. '양이온성 펩타이드 또는 단백질'은 적어도 하나의 양전하를 띤 아미노산 또는 하나 이상의 양전하를 띤 아미노산, 예를 들어 Arg, His, Lys 또는 Orn 로부터 선택된 것을 함유할 수 있다. 따라서, '다중양이온성' 생체적합성 폴리머 또한 주어진 조건하에서 하나 이상의 양전하를 보이는 범위 내이다.
이런 양이온 폴리머는 폴리에틸렌이민(polyethylenimine (PEI)), 폴리아미도아민 덴드리머(polyamidoamine dendrimers) 폴리프로필아민 덴드리머(polypropylamine dendrimers), 폴리아릴아민(polyallylamine), 양이온 덱스트란(cationic dextran), 키토산(chitosan), 양이온 단백질(cationic proteins) 및 양이온 펩타이드(cationic peptides)를 포함한다.
비록 대부분의 양이온 폴리머는 작은 입자 안에 DNA를 응축하고 세포 표면의 음이온 위치와 전하-전하 반응을 통한 엔도시토시스(endocytosis)에 의해 세포 흡수를 촉진하는 기능을 갖지만, 형질도입 활성과 독성은 현저히 차이가 난다.
양이온 폴리머는 음전하를 띄는 관심 mRNA 전달물의 더 강력한 복합체화 때문에 분자량이 커질수록 더 나은 형질도입 능력을 보인다. 그러나, 분자량이 증가할수록 양이온 폴리머의 독성이 더욱 증가한다. 폴리에틸렌이민(PEI)는 아마 가장 활성이 좋고, 유전자 운반 분야에서 가장 많이 연구된 폴리머이지만, 형질도입 시약으로서 폴리에틸렌이민의 가장 큰 약점은 생물 분해성이 없는 성질 및 독성과 관련이 있다.
양이온성 펩타이드 프로타민은 혈청 RNases에 의한 분해로부터 mRNA를 보호하는 것으로 나타났다. 그러나 프로타민과 복합체를 형성한 mRNA만으로는 프로타민과 mRNA 사이의 강력한 결합력 때문에 암 백신 모델에서 제한된 단백질 발현과 효능을 보여주었다. 이 문제는 프로타민 제형 RNA가 발현 벡터가 아닌 면역 활성제로만 작용하는 RNAtive 백신 플랫폼을 개발하였다. CureVac은 Th1 T 세포 반응을 유도하는 TLR 7/8 작용제 역할을 하는 프로타민-제조된 RNA 복합체에 기반한 RNActive 백신 플랫폼을 개발하였으며, 뉴클레오티드-개질된 mRNA는 항원 생산자로서 기능하였다. 이 백신 플랫폼은 전임상 동물 모델과 환자 모두에서 암과 전염병에 대해 유리한 면역 활성화를 일으켰다.
관심 mRNA의 세포 운반은 또한 단백질 형질도입 도메인(protein-transduction domains, PTDs)으로 표현하기도 하는 세포 투과 펩타이드(cell penetrating peptides, CPPs)의 물리적 조립(assembly) 또는 화학적 결합(ligation)으로 가능하다. CPP는 약 10에서 30개의 아미노산 서열을 가지고 있는 짧은 펩타이드에 해당하고 이것은 포유류 세포의 원형질막을 통과할 수 있고 따라서 세포의 약물 운반에 대해 전례가 없는 가능성을 제공하고 있다.
이러한 펩타이드들의 거의 대부분은 낮은 pH에서 알파-헬릭스(α-helix)형태인 서열들의 조합에서 양이온 아미노산 시리즈를 포함한다. pH가 생체 내(in vivo)에서 양성자 펌프로 인하여 계속적으로 더욱 낮아질 때, 펩타이드의 형태적 변화는 보통 빠르게 개시된다.
이러한 헬릭스 모티브(helix motif)는 세포질(cytoplaa) 안으로 내용물의 방출을 유도하는 엔도좀의 막 안으로 삽입을 매개한다. 절단된 HIV-1 Tat 단백질(HIV-1 Tat protein) 기본 도메인은 원형질막을 통과하고 세포 핵에 축적된다. 이러한 장점에도 불구하고, CPP로 매개된 약물 운반에 대한 주요 장애물은 종종 상피(epithelia)와 내피(endothelia)의 효소 장벽에 부딪히거나 통과할 때, 펩타이드의 빠른 대사 제거(metabolic clearance)를 포함하는 것으로 생각한다.
세포 전달 펩티드(CPP)는 관심 mRNA 전달의 세포내 전달을 위한 벡터로서의 잠재력에 대해 연구되었다. 그들의 내재화 메카니즘은 완전히 이해되지는 않지만, CPP는 세포 표면에서 음으로 하전된 글리코사미노 글리칸의 클러스터링을 촉진할 수 있다고 가정된다. 이는 거시 피노사이토시스 및 측면 확산을 유발하거나 지질 이중층을 직접 방해한다. 아르기닌이 풍부한 양친 매성 RALA 서열 반복을 갖는 CPP는 수지상 세포에 대한 mRNA 벡터로서 기능하고 T 세포 면역을 유발하는 것으로 보고되었다.
결론적으로, CPPs의 대사 안정성(metabolic stability)은 그들의 세포 생물학적 이용가능성(bioavailability)을 위한 중요한 생물약제학(biopharmaceutical)의 요인을 나타낸다. 그러나, 한편으로는 그들이 대사적으로(metabolically) 절단되기 전에 그들의 전달물을 타깃으로 운반할 만큼 충분히 안정한 반면, 다른 한편으로는 그들이 독성수준을 축적하고 도달할 수 있기 전에 조직에서 완전히 없어질 수 있는 CPPs를 종래에는 이용할 수 없었다.
세포막의 장벽 외에도, 관심 mRNA은 피부 및 혈액에 풍부하게 존재하는 세포 외 리보뉴클레아제에 의해 분해에 직면한다. 뉴클레아제에 의한 분해로부터 관심 mRNA을 보호하고 그것의 음전하를 보호하기 위해, 아민-함유 물질은 일반적으로 비바이러스성 벡터로서 사용된다.
관심 mRNA 복합입자는 관심 mRNA을 효소 분해로부터 완전히 보호할 수 있는 능력이 있어야 하며, 신장 제거를 방지하면서 관심 부위의 혈관 외 유출 및 체류를 허용하는 적절한 크기를 가져야 한다. 그것은 또한 혈청 단백질 상호 작용을 방지하고 phagolysosomes을 회피하면서 세포에 의해 효율적인 유입을 허용하는 적절한 표면 특성을 소유해야 한다. 임상 적용을 용이하게 하는 다른 바람직한 특성은 조직 특이성, 생체 적합성을 향상시키고 독성을 감소시키기 위해 리간드를 관심으로 하는 용이한 기능화이다. 또한 관심 mRNA 전달체는 세포질에 위치한 단백질 합성 장소에 관심 mRNA을 전달하기 위해 적시에 엔도솜을 벗어나는 문제에 직면한다.
본 발명의 관심 mRNA 복합입자를 구성하는 관심 mRNA의 골격은 관심 mRNA으로 관심 mRNA 분해 효소들로부터 보호를 받아 혈액내에서 안정성이 확보되어야 하며, 본 발명의 이상적인 전달체는 상기 목적을 달성할 수 있어야 한다.
본 발명에서는 관심 mRNA의 화학적 변형, 관심 mRNA 말단의 보호 등을 실시할 수 있으며, 상기 관심 mRNA을 고분자 물질로 캡슐화하여 입자를 제조하는 방법을 제공할 수 있다.
RPC(reducible polycation)는 적은 분자량을 갖는 펩타이드와 비교할 수 있는 수준으로 다양이온의 독성을 감소시켰다. 이러한 접근법은 적절한 수준의 형질도입 효율을 향상시키기 위해 엔도좀 붕괴능(endosomolytic)약품 클로로퀸(chloroquine) 또는 양이온 지질 DOTAP가 추가적으로 필요하다는 것이다. 결과적으로 환원성 다양이온(RPCs)에 엔도좀의 완충 능력이 있는 것으로 알려진 히시티딘 잔기를 포함할 수 있다.
히스티딘이 많은 환원성 다양이온은 엔도좀 붕괴능 약품 클로로퀸 없이 플라스미드 DNA, mRNA, 그리고 siRNA 분자를 포함하는 다양한 관심 mRNA의 충분한 세포질 운반이 가능하도록 할 수 있다. 그러나, 히스티딘이 많은 환원성 다양이온을 바로 생체 내에 적용하는 것이 가능한 지에 대해 많은 연구가 필요하다. 폴리플렉스에 혈청 단백질이 결합되어 세포 흡수를 제한하기때문에 형질도입은 유전자 도입을 향상시킬 수 있는 히스티딘 잔기의 능력이 저해되는 것을 피하기 위해 혈청이 없이 수행되었다.
세포 안으로 전달물 분자를 운반하는 기술에 대한 다른 접근법, 예를 들면, 유전자 치료법은 펩타이드 리간드(ligands)를 포함한다. 펩타이드 리간드는 타겟 암세포(target cancer cell)에 사용되는 EGF 펩타이드와 같은 수용체 인식에 필요한 필수아미노산을 대표하는 더 큰 단백질로부터 떨어져 나온 짧은 서열일 수 있다. 다른 펩타이드 리간드는 렉틴 유사 산화 LDL 수용체(lectin-like oxidized LDL receptor (LOX-1))를 타겟으로 하는데 사용되는 리간드를 포함할 수도 있다.
상피 세포에서 LOX-1의 상향조절은 고혈압 및 아테롬성 동맥 경화증(atherosclerosis)과 같은 장애 상태와 관련이 있다. 그러나, 펩타이드 리간드들은 복합체화나 부착에 의해 그들의 전달물 분자에 연결될 수 없고 공유결합을 필요로 하기 때문에 많은 유전자 치료학적 접근법에 적합하지 않으며, 일반적으로 세포 내에서 세포독성효과를 갖는 가교제(crosslinkers)를 예로들 수 있다.
유전자 치료와 다른 치료학적 응용의 목적을 위하여 관심 mRNA을 응집화하고 안정화할 수 있고, 특히 생체내에서 관심 mRNA 전달물의 효과적인 방출 및 낮거나 전혀 없는 독성의 조합 측면에서, 효과적인 형질도입 활성을 보일 수 있는 적절한 방법이나 담체를 개발해야 한다.
유전자 운반의 목적을 위한 담체를 제공하기 위한 기술분야에서 여전히 강력한 요구가 있고, 이러한 강력한 요구는 그들이 대사적으로 절단되기 이전에 그들의 전달물을 타깃에 운반할 만큼 충분히 안정적이며, 다른 한편으로는 그들이 유독한 수준에까지 축적되거나 도달하기 이전에 조직으로부터 제거되어야 한다는 것이다.
관심 mRNA-기반 제제의 치료적 성공은 생체 내에서 관심 mRNA 전달과 관련된 많은 도전을 극복하는데 달려있다. 안전하고 효과적인 관심 mRNA의 개발은 관심 mRNA 기반 요법의 성공적인 적용을 위해 결정적이다. 나노 구조화된 전달체는 조기 분해로부터의 보호 및 생물학적 환경과의 개선된 상호 작용과 같은 고유한 장점을 제공한다. 또한 조직 흡수를 향상시키고 관심 mRNA 체류 시간을 연장하며 세포 내재화를 향상시키며 관심 mRNA이 관심 세포의 세포질로 이동하는 것을 가능하게 한다.
관심 mRNA을 전달하는 전신적으로 전달된 LNP는 전달에 대한 다중 장벽에 직면한다. 특히 간과 비장에 있는 단핵식 포식작용 시스템 (MPS)은 나노 크기의 감염원에 대한 신체의 보호기능의 본래의 역할 때문에 주입된 나노 입자의 빈번한 목적지이다. 신장은 naked 관심 mRNA 또는 5.5 nm 미만의 유체 역학적 직경을 갖는 임의의 나노 입자를 걸러낸다.
대부분의 LNP는 직경이 약 100nm이고 MPS를 빠져 나가서 다른 관심 기관에 도달하지 못할 만큼 충분히 크다. MPS의 주요 기관인 간은 작은 구멍이 있는 혈관 구조를 가지며 양이온성 LNP를 보유하는 쿠퍼 세포와 같은 식세포가 있다. 또한, 큰 양이온성 LNP는 폐에 있는 모세혈관에서 유출되지 않고 신장에 의해 혈류로 여과될 수도 없다. 간, 폐 또는 다른 기관에 전달 물질이 축적될 수 있다. 따라서, 전달체 구성 요소의 클리어런스 및 생분해성은 관심 mRNA 전달 물질을 개발할 때 한 가지 고려 사항이다.
에스테르 그룹은 생체 물질의 생분해성을 향상시키기 위해 가장 일반적으로 사용되는 기능 그룹이지만 다른 에스테르 결합의 생체내 분해는 분자 및 제형의 전체 화학에 따라 달라질 수 있다. 특정 조직에서, 에스테르 작용기의 존재는 LNP의 분해를 가속화시켜 잠재적으로 단백질 발현을 제한할 수 있다. 예를 들어, OF-Deg-Lin은 간 세포에 도달할 수 있었지만 비장에서 단백질 발현을 선택적으로 유도하였다. 간 효소에 의한 LNP의 급속한 분해 때문일 수 있다고 가정하였다. 폴리 에스테르 또는 폴리 카보네이트에 기초한 분해성 지질 또는 중합체의 합리적인 설계는 전달체의 분해를 보다 잘 제어할 수 있다.
LNP로 간 이외의 특정 장기 또는 조직을 관심으로 하는 것이 더 어려운 것으로 입증되었다. 일부 LNP는 아포지 단백질 E-의존적 방식을 통해 간에서 축적되거나 흡수된다. APE의 경우, 중합체의 3 차 아미노 알코올의 핵심 구조가 특정 장기를 관심으로 하는 데 중요한 역할을 할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이러한 표적화 전략에는 한계가 있으며 일반적으로 특정 조직에 대한 성공적인 관심 솔루션을 찾기 위한 처리량이 많은 스크리닝으로 얻은 리간드를 조직-특이적 수용체에 포함시키는 것과 같이 합리적으로 설계된 표적화 접근법은 대안적인 전략이다.
최근 수지상 세포 표면에서 시알 산-말단 당 단백질의 시험관내 활성 표적화를 보고하였다. 글루탐산-알라닌-류신-알라닌 (GALA)을 갖는 30- 아미노산 합성 펩티드는 EGFP-관심 mRNA을 운반하는 폴리 플렉스에 접합된 복합체이다. 그러나, 단백질 코로나를 형성하는 LNP의 임의의 옵소닌화는 표적화 리간드의 마스킹으로 인해 활성 표적화 전략에 해로울 수 있다. 따라서, 특정 조직을 표적화하는 새로운 전략이 임상적 과제를 해결하기 위해 연구될 필요가 있다.
관심 mRNA 기반 치료제를 세포에 전달하는 분야에서, 그 최종 종점에는 엔도좀 탈출이 자리하고 있다. 간으로의 ASO 및 siRNA 전달은 ASGPR 관심 GalNAc-siRNA 접합체에 의해 해결될 수 있고, LNP에 의한 mRNA 및 CRISPR 전달은 확실해 보이지만, 효과적이고 임상적으로 준비된 관심 mRNA 기반 치료제를 간 이외의 전신에 전달하기 위한 접근은 아직 최종 종점 단계에 머물러 있다.
정확한 이유는 알려져 있지 않지만, ASGPR은 거대 분자 약물이 간세포로 전달되는 데 매우 적합한 특성을 가지고 있다. ASGPR은 혈중 asialoglycoproteins에 결합하여 그들을 clathrin-coated endosome으로 끌어 들여 분해를 위해 리소좀에 유입시킨다. ASGPR 결합된 asi-aloglycoproteins은 세포질로 빠져 나가는 것으로는 생각되지 않는다.
그러나 간세포는 수많은 ASGPR를 세포 표면에 발현하는데, 이것들은 매 10~15분의 속도로 놀랄만큼 빠르게 순환한다. 최대의 RNAi 반응을 위해서는 최소 5,000개의 siRNA가 필요하다. ASGPR의 GalNAc 결합은 아주 드물게 막의 불안정성을 유발하며, 이는 수백만의 siRNA 분자가 ASGPR 엔도좀으로 매 15분 마다 들어가고, 0.01%보다 낮은 탈출 효율을 가짐으로써, GalNAc 전달을 통해 하루 동안 5,000개가 넘는 분자를 전달할 수 있다. 불행히도, 이렇게 빠른 속도로 수용체를 발현시키거나 엔도좀으로 빠르게 순환시킬 수 있는 다른 리간드-수용체 시스템은 존재하지 않는다.
사실, 대부분의 세포 표면 수용체는 10,000-100,000 범위(또는 그 이하)로 발현되며, 카베올린 및 클라트린 매개 세포막 포집은 일반적으로 90분 단위로 회전된다. 이론적으로, 수용체를 관심으로 하는 전달법은 매 2시간마다 세포의 엔도좀에 ~ 100,000개 이상의 siRNA를 가져올 수 있다. 그러나 엔도좀 탈출 효율이 0.01% 미만으로 추정되는 경우 최소 5,000개인 필요 임계점에 도달하기가 어렵게 된다. 현재 여러 연구 그룹이 엔도좀 탈출 문제에 대한 해결책을 연구하고 있다.
고전적인 접근법은 저분자성 엔도좀 분해 인자인 클로로퀸을 사용하는 것이다. 클로로퀸(chloroquine)은 세포막을 통해 수동적으로 확산하여 pH가 떨어지면 양성자가 되어 엔도좀 내부에 갇히게 되어 엔도좀 내 농도가 급격히 증가한다. 클로로퀸은 소수성 모티프를 지질 이중층에 삽입하고 일정 농도에서 엔도좀을 용해시킨다. 그러나 효과를 나타내는 농도에서 이러한 엔도좀 분해 인자들은 비 특이적으로 siRNA 생체적합성 폴리머를 포함하는 엔도좀 뿐만 아니라 다른 세포 내 엔도좀을 용해시켜 독성을 일으킨다. 결과적으로, 이러한 저분자 엔도좀 분해 인자들은 개발 단계에서 주목을 받았지만, 현재 임상 용도로 쓰기에는 잠재적 독성 위험이 있다.
대안적인 엔도좀 탈출 접근법은 관심 mRNA에 직접적으로 엔도좀 분해성 펩타이드 또는 분자를 접합시켜 관심 mRNA 치료제를 함유하는 엔도좀에 대해 분해 작용을 제한시키는 방법으로 two-molecule dynamic polyconjugate(DPC) 시스템을 개발하였다. siRNA는 콜레스테롤과 결합하여 혈액으로 큰 골재구조(저밀도 지단백질)를 형성하여 간으로 이동하여 간세포로 세포막 포집에 의해 흡수된다. 두 번째 분자는 막을 용해하는 구멍형성 멜리틴 펩타이드 (벌독에서 유래)의 유도체이다. pH 민감성으로 멜리틴을 합성하고 이를 GalNAc에 접합시켰다. 간세포 엔도좀의 낮은 pH에서 멜리틴은 활성화되고 엔도좀을 분해하여 siRNA를 세포질로 방출하도록 한다. 하지만, 멜리틴으로 인한 독성으로 인해 FDA와 진행하던 멜리틴에 의존하는 세 가지 임상 프로그램을 모두 중단하기로 결정하였다. 이런 점은 엔도좀 탈출 문제를 해결하는 것이 어려운 과제이다.
<고분자 전해질 복합체의 제조>
일반 모델로 Polyelectrolyte complex(PEC)은 주로 반대로 하전된 폴리 이온 사이의 정전기적 인력에 기반을 하여 형성된다. 그러나 고분자 전해질에서 반대 이온이 방출될 때 엔트로피가 증가하는 것이 PEC 입자 자체 조립의 주요 원동력이다.
PEC 입자는 종종 직경이 10nm에서 1μm 사이인 다분산 시스템이다. 입자 크기는 일반적으로 용액에서 나노 입자의 무결성을 유지하는 간접적 기술, 주로 정적 및 동적 광산란으로 측정된다. 이미징 기술은 광산란의 결과를 지원하는 데 자주 사용되지만 이 경우 PEC 입자의 크기는 샘플 준비 및 분석 중에 영향을 받을 수 있다.
PEC 입자의 자기 조립은 나노 입자가 용액에서 자유 다중 이온과 평형 상태로 공존하는 가역적 과정이다. PEC 입자의 이러한 동적 특성은 본질적으로 희석 및 다른 하전된 생체적합성 폴리머의 추가시 무결성을 손상시켜 이러한 나노 물질로부터 정전기 차폐 및 다중 이온 교환을 유발할 수 있다. 결과적으로 PEC 입자의 안정성은 고농도의 작은 전해질과 하전된 단백질이 발견되는 생물학적 환경에서 심각하게 손상될 수도 있다. 그러나 PEC 입자는 고분자 전해질 성분의 가교를 통해 쉽게 안정화 될 수 있으며, 이러한 방식으로 용액에서 자유 중합체와의 교환을 최소화할 수 있다. 다른 한편으로, PEC 입자에 대한 생리적 전해질로 인한 구조적 손상은 예를 들어 이러한 나노 물질의 투과성을 증가시켜 사전 적재된 화물의 방출을 유발함으로써 유익할 수 있다.
마지막으로, 적절한 조건에서 혼합된 특정 고분자 전해질만이 분산되고 안정적인 PEC 입자를 형성한다. 이러한 나노 물질을 만드는 동안 몇 가지 요인, 특히 고분자 전해질의 분자량, 농도 및 전하 밀도, (수성) 매체의 pH 및 이온 강도 또는 두 고분자 전해질의 상대 비율 및 혼합 순서를 최적화해야 한다. 이러한 매개 변수는 일반적으로 상호 의존적이며 병렬로 최적화되어야 한다. 종종 안정한 콜로이드 PEC 입자는 높은 희석도와 낮은 이온 강도로 제조되며, 폴리 이온 중 하나를 초과하여, 이상적으로는 중합체 중 하나에 약한 이온 그룹과 그 분자량의 상당한 불일치로 제조ㅍㅕㅇ 수 있다. 서로 다른 조건에서 코아세르베이트는 용액에서 분리되어 콤팩트한 고분자 전해질 복합체로 알려진 고밀도 물질로 합쳐지며 합성 연골 및 효소 활성 생체 복합체와 같은 일부 생의학 응용 분야에서도 큰 잠재력을 보여주었다.
① 전하 밀도, 분자량 및 토폴로지
하전된 생체적합성 폴리머에 대한 다중 이온의 결합 특성은 고분자 전해질 구조에서 하전된 그룹의 밀도와 수에 대한 강한 의존성이 있다. 고분자 전해질 결합의 협력적 특성으로 인해 전하 밀도가 높은 폴리머는 하전된 생체적합성 폴리머에 대해 더 강한 결합력을 보여준다.
전하 밀도를 높이는 가장 간단한 방법은 고분자 전해질의 분자량을 높이는 것이다. 용액에서 중합체의 부분적으로 얽힌 형태를 감안할 때 분자량이 높을수록 고분자 전해질 코어가 커진다. PEC 입자의 안정성은 폴리머 사슬 당 하전된 기의 수 (즉, 다중가)에 의해 영향을 받으며 '상위 임계 길이' 폴리 이온 이상으로 안정적인 복합체를 형성할 수 있다. 그럼에도 불구하고 PEC 입자의 콜로이드 안정성을 위해 폴리 이온의 분자량에 상당한 차이가 필요한 경우가 많다.
대안으로, 전하 밀도는 고분자 전해질에 중성 단량체를 첨가하여 "희석"할 수 있다. PEC 입자에 대한 NaCl의 불안정화 효과는 고분자 전해질 함량이 높을수록 크게 감소한다. 순수한 고분자 전해질로 제조된 나노 입자는 전하 밀도가 약한 입자가 팽창하는 원인보다 두 배 더 높은 NaCl 농도에 영향을 받지 않는다. 이러한 결과는 전하 밀도와 고분자 전해질의 결합력 사이의 직접적인 상관관계를 강화시켰기 때문이다.
고분자 전해질의 토폴로지는 전하 밀도에 큰 영향을 미칠 수 있다. 분지형 및 수지상 고분자 전해질은 선형 유사체에 비해 하전된 표면에 대한 결합 친화력이 증가하는 것으로 알려져 있다. 이 효과는 분지 구조에서 단량체의 공간 밀도가 높기 때문에 결합력이 증가한다. 이와 같이 분지형 고분자 전해질은 여러 개의 반대-폴리 이온 사슬을 정전기적으로 교차 연결하여 보다 단단한 고분자 네트워크를 생성할 수 있다. 동일한 조건에서 선형 폴리 (에틸렌 이민) (PEI)은 20-50nm의 폴리플렉스를 형성하고 복잡하지 않은 DNA 조각을 남겼고, 유사한 분자량의 분지형 PEI는 완전히 응축된 DNA를 형성하고 훨씬 더 큰 복합체 (100-200nm)를 형성한다. 아마도 선형 PEI보다 더 높은 결합력으로 인한 응축 때문일 수 있다.
낮은 전하 밀도로 인해 도전적이지만 PEC 입자는 핵 생성 과정을 돕는 특정 모티프를 포함하는 작은 분자로 성공적으로 준비할 수 있다. DNA와 함께 작은 양이온성 세제를 지질 폴리플렉스 또는 리포플렉스로 자기 조립한다. 지방족 사슬 사이의 소수성 상호 작용을 통해 낮은 전하 밀도에도 불구하고 DNA를 응축할 수 있는 이량체성 세제가 있다. 플라스미드 DNA와 C14CO의 초기 응집 후, 이 세제의 (C14CO)2로의 산화적 이량체화로 인해 임계 미셀 농도가 감소하여 복합체의 패킹과 안정성이 증가한다.
② 고분자 전해질 농도
PEC 입자 자가 조립의 메커니즘을 1차 분자 복합체로 폴리 이온의 순차적 핵 형성으로 합리화한 다음 콜로이드 복합체로 응집한다. 나노 입자가 커질수록 Debye 길이가 증가하여 이 동작을 설명하여 "2 차" 복합체 사이에 더 강한 반발성 정전기를 생성한다. PEC 입자의 크기는 폴리 이온 길이와 농도의 조합으로 미세 조정할 수 있다.
종종 PEC 입자를 조립하는 동안 고농도의 시작 고분자 전해질은 콜로이드 안정성이 좋지 않은 미크론 크기의 복합체를 형성한다. 결과적으로 분산된 PEC 나노 입자는 임계 농도 미만의 고분자 전해질 혼합물에서만 형성될 수 있으며 그 이상에서는 시스템이 응집되거나 침전된다(ca. <1 mg/mL). PEC 입자 준비 중 농도 제한은 이러한 복합체의 농축 분산액을 준비해야 할 때 제한이 될 수 있다. 그럼에도 불구하고 PEC 입자를 원심 분리하고 재분산할 수 있으며 연속적인 원심 분리주기를 통해 복합체의 다분산성을 정제하여 궁극적으로 초기 크기에 영향을 주지 않고 단일 모드 크기 분포를 달성할 수 있다.
③ pH
생물 의학적인 관점에서 고분자 전해질은 생리학적 pH에서 부분적 또는 완전 이온화를 하든 약하거나 강한 것으로 분류될 수 있다. 결과적으로 강한 고분자 전해질과 달리 약한 다중 이온의 전하 밀도는 체내 조직과 세포 기관의 pH (4.5-7.4)에 크게 좌우된다. 이 pH 범위내의 변화는 원자가의 손실 또는 증가 (즉, 분자 당 전하)로 인해 고분자 전해질 결합 및 PEC 입자 안정성에 상당한 변화를 초래할 수 있다. 다중 이온 복합체의 pH 반응 거동에 대한 좋은 예는 낮은 pH (2.0-2.5)에서 PAA는 소량만 탈 양성자화되어 낮은 전하 밀도의 결과로 더 부풀고 느슨한 복합체가 형성된다. 그러나 더 높은 pH (3.5-5.5)에서는 PAA 사슬이 더 이온화되어 정전기 교차 결합 수가 증가하여 PAH와 함께 더 많은 복합체가 형성된다.
따라서 약한 다중 이온은 생물학적 pH의 변화에 따라 (탈) 양성자화 정도와 전하 밀도를 변경할 수 있다. 또한, 다른 화학적 환경과 입체는 고분자 전해질의 다른 위치에서 동일한 단량체에 대해 다양한 pKa 값을 초래한다. 이것은 특히 분지형 폴리머의 경우이며 넓은 버퍼링 용량으로 해석된다. 이와 같이, 다양한 생리학적 설정에서 발견되는 pH의 변화는 복합 폴리 이온의 이온화 변화에 의해 PEC 입자에서 약물과 DNA의 방출을 유발하는 데 이용되었다. 이 행동의 고전적인 예는 PEI에 의해 표시되는 소위 '양성자 스폰지'효과로, 이는 세포 흡수 후 폴리플렉스가 산성 엔도솜을 빠져 나갈 수 있도록 한다). 예를 들어, 분지형 PEI (B-PEI)는 분자량에 관계없이 약 pH 2 ~ 10의 넓은 버퍼링 범위가 있다. 따라서 양성자가 엔도솜으로 유입되는 것을 완충할 수 있다, 궁극적으로 세포 기관이 파열되어 폴리플렉스를 세포질로 방출하는 삼투압을 증가시킨다.
pH- 반응성 PEC 입자의 다른 관련 예는 효소 및 항균 전달을 포함하며, 이는 각각 나노 입자 분해 또는 다중 이온 (탈) 양성자 화시 팽윤을 기반으로 한다. 가역성 pH 반응성 PEC 입자는 약한 다산 (PAA)과 강한 다 염기 (PDADMA)를 PDADMA-co-PAA에 혼합하여 제조할 수 있다. 이 공중 합체를 pH 4.1에서 PSS와 혼합하면 PEC 입자가 형성되었으며, 이는 공중 합체에서 PAA의 탈 양성자화 및 PSS와이 부분 음이온성 공중 합체 사이의 후속 반발로 인해 pH> 5.7에서 용해되었다. 용액이 다시 산성화되었을 때 PIC 입자는 pH 4.5-5.5에서 개질되어 공정의 가역성을 보여주었다.
유사하게, 두 폴리 이온을 자기 조립하기 위해 선택한 pH는 전하 밀도에 영향을 미치므로 결과 나노 입자의 최종 특성에 영향을 미칠 수 있다. 각각 더 산성 또는 염기성 pH에서 더 많은 양성 또는 음성 PEC 입자를 발생시키는 혼합 비율 의존적 효과가 있다. 이 결과는 더 높은 pH 값에서 폴리 이온의 더 높은 (탈) 양성자 화와 일치하는 것이다.
④ 이온 강도
작은 전해질의 추가는 다중 이온의 분자 내 전하 반발을 차폐함으로써 PEC 입자의자가 조립을 도울 수 있으며, 따라서 고분자의 유연성과자가 조립 능력을 증가시킨다. 반면에 높은 염 농도는 고분자 전해질 사이의 강력한 정전기 스크리닝으로 이어질 수 있으며 PEC 입자의 핵 생성을 억제할 수 있다]. 따라서 PEC 입자를 성공적으로 조립하려면 매체의 이온 강도를 신중하게 선택해야한다.
일반적으로 PIC 입자의 크기는 폴리 이온이 더 높은 농도의 NaCl 존재하에 혼합될 때 감소했는데, 아마도 더 유연한 고분자 전해질의 더 나은 패킹 때문일 것이다. 물의 공중 합체 사이에서 발견된 크기의 차이는 10mM NaCl에서 감소하여 궁극적으로 100mM NaCl에서 동일한 크기의 입자를 형성한다. 전반적으로, 더 강한 전하 밀도 (즉, 더 낮은 NMVA 함량)를 갖는 폴리 이온은 PEC 입자 준비 동안 NaCl에 더 내성이 있었다. 또한 순수한 물에서 준비된 입자가 조립 된 후 NaCl에 노출되었을 때 직경이 100nm에서 최대 1μm까지 팽창한다. NaCl의 이러한 조립 후 효과는 복합체의 코어 내부에 침투하여 고분자 전해질 사이의 정전기 가교를 중화시키고 이후에 미리 형성된 복합체가 팽창하도록 한다. 팽창과 이후 팽창된 복합체의 응집의 조합으로 NaCl (약 10 분 미만)을 첨가한 후 크기가 빠르게 증가한다. 다시 한 번, 더 높은 전하 밀도 (즉, PDADMA 함량)를 가진 공중 합체는 더 높은 결합력으로 인해 NaCl로 인한 팽윤 효과에 대한 개선 된 내성을 보였으며, 경우에 따라 덜 하전된 공중 합체에 비해 팽창하는 데 NaCl 농도의 두 배가 필요할 수 있다.
생리적 전해질은 또한 부기를 유발하고 생물학적 환경에서 PEC 입자의 기능과 안정성을 손상시킬 수 있다. 내염성 입자가 필요한 경우, 결합된 고분자 전해질 사슬은 약한 정전기력이 염으로 스크리닝 된 후에도 복합체를 함께 유지하기 위해 공유 가교 될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 작은 전해질을 가진 PEC 입자의 팽창은 증가된 투과성의 결과로 복합체 내에서 포획 된 약물을 방출하기 위해 이용되었다.
⑤ 혼합 비율
이것은 혼합된 고분자 전해질에서 양전하와 음전하의 비율이다. 혼합 비율은 PEC 입자의 최종 크기와 전하뿐만 아니라 생물학적 활성에도 영향을 미친다. 고분자 전해질의 이온화 정도는 pH에 따라 다르므로 '유효' 혼합 비율은 서로 다른 pH 값에서 동일한 다중 이온 혼합물에 대해 달라진다. 혼합 비율은 pH에 관계없이 용액 내 산성 및 염기성 단량체의 비율 또는 비율로 표시된다(예:'N:P'비율은 일반적으로 'P' 인산염과 복합된 아민 단량체의 'N' 수를 나타내기 위해 폴리 플렉스 제형에서 사용된다).
콜로이드 PEC 입자에 폴리 이온의 안정화 쉘을 과도하게 제공하려면 비 화학 양론적 혼합 비율이 필요하다. 이를 바탕으로 pH, 이온 강도 및 폴리 이온 구조와 같은 다른 변수가 일정하게 유지되는 한 PEC 입자의 ζ 전위의 절대값 및 변동은 혼합 비율의 변화로부터 예측할 수 있다.
혼합 비율에 대한 수많은 PEC 입자 시스템의 강한 의존성을 감안할 때, PEC 입자 거동의 일관되고 대관심인 결론을 도출하기 위해 항상 비율 범위를 평가해야 한다. 일반적으로 평가되는 혼합 비율의 범위는 폴리플렉스의 양전하가 매우 풍부한 혼합물 (N:P에서 최대 50 개까지)에서는 다양하지만, 달리 다른 시스템은 등몰도, equimolarity에 더 가까운 값을 갖는다(예:0.2-1.8 또는 0.5-2.0 in n-/n +).
키토산과 덱스트란 설페이트의 혼합물로부터 PEC 입자의 형성을 등몰도의 상하에서 2 배 크기이다. 첫째, 복합체의 절대 전하가 과잉 폴리 이온의 전하이다. 둘째, 나노 입자의 크기는 [NH3 +]/[SO4-] 비율의 세 가지 범위로 분포되어 있다:10 이상 (420nm), 10 ~ 1 (250nm), 1 미만 (200nm). 이 세 가지 입자 크기는 두 중합체를 초과하여 발생하는 서로 다른 핵 형성 메커니즘에 기인한다. 중성에 가까운 혼합 비율에서 불안정한 복합체가 형성되고 응집된다. 또한 폴리 이온 (5 배 이상)의 과잉에서 이 폴리머의 70 % 이상이 용액에서 복잡하지 않은 상태로 남아 있다. 이를 다른 예와 비교하면 혼합 비율은 다른 PEC 입자의 ζ 전위에 동일한 영향을 미치지만 크기에 대한 영향은 일관되지 않으며 다른 변수 (예:분자량 및 폴리 이온의 강도)에 의해 영향을 받는다.
⑥ 혼합 순서
고분자 전해질이 함께 혼합되는 순서는 조립 과정의 시작 부분에서 과잉 이온이 무엇인지를 나타냈다. 예를 들어 [n +/n-] = 2에서 비화학양론적 PEC 입자의 제조를 위해 폴리 음이온이 폴리 양이온에 추가되면 복합체에 항상 과잉의 양전하가 있음을 알아 두는 것이 매우 중요하다. 그들 사이의 반발력은 콜로이드 안정성을 유지하는 데 도움이 된다. 그러나, 폴리 음이온에 폴리 양이온 (과량)을 첨가하여 동일한 중합체 혼합물을 제조하는 경우, 초기 코아세르베이트의 음전하는 폴리 양이온의 첨가를 통해 중간 값에 도달할 것이다. 결과적으로 고분자 전해질이 잘못된 순서로 혼합되면 중성 입자가 응집될 수 있다. 따라서 부족한 폴리 이온이 과잉 이온에 추가되어 고분자 전해질의 특성에 따라 다른 핵 생성 역학이 발생할 수 있다.
첨가 순서의 효과는 고분자 전해질의 혼합 비율을 적정할 때 분명해진다. 예를 들어, 고분자 전해질의 혼합 순서는 나노 입자의 크기에 영향을 미칠 뿐만 아니라 크기가 최대 2 배까지 변화할 뿐만 아니라 이러한 복합체의 NaCl에 대한 안정성에도 영향을 미친다. 이는 아마도 고분자의 다른 패킹 때문이다. 복합체의 최종 형태에 대한 강한 의존성 또는 거의 무시할 수 있는 효과를 발견하는 다소 다른 결과를 보여주었다. 연구 간의 불일치는 다른 변수 (예:분자량 및 다중 이온 강도)의 영향에 기인해야하므로 각 사례를 개별적으로 평가해야 한다.
⑦ PEC 입자 가교
PEC 나노 입자, 특히 저 분자량 폴리머, 부분적으로 이온화된 폴리 이온 또는 높은 염 농도에 노출되었을 때 제조된 나노 입자는 용액에서 유리 폴리 이온과 평형을 이룬다. 이 평형은 정전기적 결합을 약화시키는 상황에서 나노 입자로부터 폴리 이온이 방출되는 쪽으로 변위 될 수 있다. 결과적으로 PEC 입자는 희석되거나 다른 하전된 생체적합성 폴리머에 노출될 때 분해 될 수 있다.
대안으로, PEC 입자의 안정성은 복합 폴리 이온을 공유적으로 가교하여 나노 입자로부터 폴리머 사슬이 분리되는 것을 방지함으로써 크게 향상 될 수 있다. 본질적으로 가교는 고분자 전해질 사슬을 '중합'하여 작동하여 폴리머의 전체 분자량을 크게 증가시켜 결과적으로 결합 친화성을 증가시킨다. 이를 위해 고분자 전해질은 고분자 전해질이 구조에 가교 그룹을 가지고 있는지 또는 사전 조립된 복합체를 가교하는 세 번째 구성 요소가 시스템에 추가되는지 여부에 따라 입자 자체 조립 중 또는 후에 가교 될 수 있다.
가교 후 PEC 입자의 예시적인 예는 그들의 코어 및/또는 가교된 poly(acrylic acid) (PAA) 및 poly(l-lysine) (PLL)로부터 나노 입자이다. 이러한 PEC 입자의 껍질에서 발견되는 아민 또는 카르복실 산은 각각 genipin 또는 cystamine을 사용하여 가교 결합되었다. 코어의 PLL 사슬은 orthosilicic acid를 전구체로 사용하여 실리카 증착에 의해 가교 역할을 한다. 이러한 가교 결합된 입자는 최대 150 배 희석까지 견딜 수 있다.
PEC 입자의 조립 후 가교는 가교기를 갖는 중합체의 기능화를 필요로 하지 않는다는 이점이 있으므로, 적합한 작용기를 갖는 거의 모든 고분자 전해질에 적용할 수 있다(예:설명된 경우 아민 또는 카르복실 산). 유전자 전달에서 폴리아민의 광범위한 적용을 감안할 때, glutaraldehyde, citric acid, carboximidates 및 N-hydroxysuccinimide esters를 포함한 다른 아민 가교 결합제가 폴리 플렉스 제조에 적용할 수 있다.
대안으로, 기능화된 고분자 전해질은 PEC 입자가 형성될 때 가교 결합을 한다. 지금까지 PEC 입자에서 폴리 이온을 기능화하고 교차 결합하는 데 가장 많이 사용되는 그룹은 온화한 반응 조건과 이황화 다리로의 가역적 교차 결합을 하는 티올이다. 예를 들어, 플라스미드 DNA와 시스테인 잔기로 장식된 PLL로부터 이황화 가교 폴리플렉스의 제조를 할 수 있다. 환원 조건에 노출되면 이러한 폴리 플렉스의 이황화 가교가 끊어져 PLL의 겉보기 분자량이 갑자기 감소하여 나노 입자의 분해와 DNA 방출이 시작된다.
불안정한 가교 결합제를 통해 짧은 다중 이온을 교차 결합하면 자극에 반응하는 PEC 입자를 제조할 수 있으며, 이는 이러한 불안정한 링커를 분해하는 제제의 존재하에서 분해될 수 있으며, 따라서 폴리 이온 간의 갑작스러운 전하 밀도 및 결합 친화도 손실을 유발할 수 있다. 따라서 세포질에서 발견되는 환원 조건은 이황화 가교 비히클의 감소를 통해 세포 내 약물 및 관심 mRNA 전달을 유발하는 데 이용되었다.
두 개의 서로 다른 불안정한 링커를 결합하여 효소와 환원제의 존재 하에서 분해되는 이중 자극 반응 PEC 입자를 개발하였다. 이 시스템에서 PEI는 두 개의 시스테인 잔기를 포함하는 짧은 음이온성 펩타이드와 복합체를 형성하여 산화적 가교 결합 (P1SH, 그림 10)을 허용하여 PEC 입자에 이전 예와 같은 산화 환원 반응 특성을 부여하였다. 또한, 이러한 펩티드의 아미노산 서열은 박테리아 엘라스타제 (LasB)에 의해 특이적으로 분해 될 수 있으므로 교차 연결된 펩티드 사슬과 궁극적으로 PEC 입자 자체를 절단하는 또 다른 지점을 제공한다.
이러한 입자의 교차 연결 무결성은 입자 안정성을 보장하는 데 가장 중요하지만 동시에 불안정한 교차 연결은 입자 분해 및 절단시화물의 방출을 유발하는 희생 그룹으로 설계될 수 있다.
Ⅳ. 고분자 전해질 복합 미셀 (PCM, 고분자 전해질과 고분자 전해질-친수성 중성 블록 공중 합체의 복합화에 의해 형성된 코어-쉘 나노 입자)
폴리 양이온이 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG)와 같은 중성 친수성 폴리머에 접합되면 거대 상 분리 대신 나노 입자가 생성된다. 친수성 중성 블록은 중화된 폴리 이온 코어 주위에 코로나를 형성한다. 이것은 시각적으로 계면 활성제 미셀화를 연상시키며, 자기 조립을 추진하는 힘은 소수성보다는 이온성이지만, 생성된 나노 입자는 고분자 전해질 복합 미셀 (PCM, 다이온 복합 미셀, 블록 이오노머 복합체 및 코아세르베이트 코어 미셀이라고도 함)이라고 한다. 개념적으로 폴리 음이온 관심 mRNA으로 조립된 PCM은 매력적인 전달 수단이다. 폴리 이온 코어에 의해 제공되는 뉴클레아제로부터 입체 보호 및 전하 중화 외에도 중성 코로나는 콜로이드 안정성 및 크기 제어를 제공하여 순환 특성의 최적화하도록 한다. 생체 분포를 더욱 향상시키기 위해 관심 리간드를 부착하기 위한 플랫폼으로 사용될 수 있다. 각 PCM에서 다중 올리고 뉴클레오타이드의 조립은 또한 각 세포 내재화 이벤트의 효능을 증가시키며, PCM 형성은 생물학적 기능을 보존하면서 관심 mRNA의 광범위한 화학적 변형을 필요로 하지 않다. 시험관 내 및 작은 동물 모델에서 몇 가지 유망한 결과가 이 전략의 잠재력을 확인하지만, PCM을 안전하고 효과적인 관심 mRNA 전달 수단으로 최적화하고 다음에 대한 이해를 향상시키기 위한 PCM 자체 조립의 물리학은 많은 연구가 남아 있다.
Ⅴ. 다층 고분자 전해질(Polyelectrolyte Multilayer, PEM)
합성 및 천연 고분자 전해질 모두 layer by layer(LbL) 기반 나노 및 미세물체의 빌딩 블록으로 사용되었다. 합성 폴리머 사용의 주요 장점은 더 넓은 범위 (예: 이온 강도 및 조립 pH)에 걸쳐 여러 매개 변수를 조정할 수 있고 더 많은 물리적 및 화학적 응력에 대한 저항성을 조정할 수 있다는 것이다. 또한 화학적으로 쉽게 수정할 수 있다.
생체 내에서 자연 조직은 단백질, 다당류 및 성장 인자와 같은 기타 생리 활성 분자로 구성된 세포 외 기질에 내장된 세포로 구성된다. 따라서 세포가 생체 내에서 상호 작용하는 원래 조직을 재현하는 더 가까운 단계는 세포 외 기질 구성 요소를 필름의 구성 요소로 사용하는 것이다. 천연 고분자는 천연 세포 외 기질과의 구조적 유사성 및 생분해성 특성을 고려하여 생물 의학 분야에서 큰 잠재력을 보여주었다. 다당류는 수화가 높고 생체 적합성이 높으며 종종 생분해되기 때문에 특히 흥미롭다. 또한 PEM 필름으로 쉽게 가공할 수 있다.
LbL PEM은 바이오센서, 약물 전달, 생체 재료 코팅 및 조직 공학을 포함한 생체 의학 응용 분야에서 사용하고 있다. 또한 콜로이드 템플릿 또는 지지 재료를 사용하여 개별 코팅된 세포, 캡슐화된 세포 응집체, 중공 캡슐 또는 독립형 멤브레인을 포함한 다양한 유형의 LbL 기반 물체를 준비할 수 있다. 후자의 경우, 기본 기판 (콜로이드 템플릿 또는 지지 재료)을 제거해야하는데, 이는 결함이 도입되거나 거칠기가 변경될 수 있으므로 어려운 단계이다.
반대로 하전된 고분자 전해질을 연속적으로 증착하여 다층 고분자 전해질 (PEM)을 준비하는 방법은 주변 환경과 생리적 조건에서 사용자 친화적인 준비, 다양한 생체 분자를 통합할 수 있는 가능성, PEM 구조에 대한 미세 제어 및 생산의 견고성으로 인해 높은 관심을 받고 있다. 이 나노 스케일 제어는 pH, 이온 강도, 폴리머 기능성 및 전하 밀도와 같은 증착 조건을 변경하여 간단히 얻을 수 있다. 또한 폴리머 농도는 필름 성장에 중요한 역할을 한다. 특히, pH 증폭 성장과 고분자 전해질 농도의 변화를 결합하면 최소한의 증착 단계에서 매우 두꺼운 어셈블리를 만들 수도 있다.
더 나은 안정성을 위해 관심 mRNA과 형질도입 시약의 복합화는 기질 매개 형질도입의 접근 방식에 도움이 된다. 이러한 복합체는 코팅으로 대량으로 제조할 수 있어 유효성분 관심 mRNA의 운반 역할을 한다. PEM의 사용은 기질 매개 활성 물질 전달 분야에서 유망한 접근 방식이다. 약물을 PEM에 통합하는 능력은 이 시스템을 관심 mRNA 방출과 원하는 기능에 관련이 있다. PEM 증착을 위한 간단한 기술은 layer by layer (LbL) 기술로, 고분자 전해질이 기판에 교대로 증착할 수 있다. 양전하와 음전하를 띤 물질의 교대로 구조를 안정시키는 정전기 상호 작용으로 이루어진다.
폴리 (L- 라이신), 키토산, poly (ethylenimine) (PEI)과 같은 양이온성 고분자 전해질과 알긴산, 히알루 론산, 폴리 아크릴산과 같은 음이온성 고분자 전해질과 같은 많은 PEM 작업에서 세포 생체 물질 상호 작용을 위한 좋은 생체적합성 폴리머다 양이온성 폴리머 중 PEI는 강한 양이온성 전하 밀도와 함께 비공유 결합을 형성하기 때문에 음으로 하전된 관심 mRNA의 복합체화에 많이 사용한다. 관심 mRNA을 복합체화 함으로써 뉴클레아제에 의한 분해, 음전하에 의한 면역계 자극과 같은 관심 mRNA 형질도입의 제한인자를 피할 수 있다. PEI는 모든 세 번째 원자에 질소를 가지고 있어 엔도솜에서 양성자를 방출할 수 있다. 완충 능력으로 인해 염화 음이온이 엔도솜으로 흘러 들어가 물의 유입과 결과적으로 삼투압 팽창을 일으킨다. 이것은 소위 양성자 스폰지 효과로 인해 엔도솜이 파열되어 PEI-관심 mRNA 복합체를 세포질로 방출된다.
성공적인 형질도입을 위해서는 분자량, 화학 구조 및 인산/질소 (N/P) 비율을 선택하는 것이 중요하다. N/P 비율은 양이온성 폴리머의 아민 그룹과 DNA 또는 RNA의 인산염 그룹의 몰 비율로 정의되며 효율적인 유전자 전달에 중요하다. 비율은 형질 감염을 위한 입자의 크기를 결정하므로 세포 실험에 중요한 척도이다.
히알루론산 (HA)은 음전하를 띤 글리코사미노글리칸으로 세포 외 기질, 활액, 탯줄 및 혈액에서와 같이 자연적으로 발생한다. 생체 적합성, 생분해성 및 면역원성 없음과 같은 생체 고분자 특성은 히알루론산을 상처 치유, 무릎 골관절염 치료 또는 조직 공학 스캐폴드에 적합한 재료로 만든다. 이를 위해 중요한 것은 폴리머의 특성을 담당하는 히알루론산의 분자량이다. 고 분자량 히알루론산은 조직 손상시 항염증 효과가 있는 반면, 저 분자량 히알루론산은 전 염증성 케모카인과 사이토카인의 활성화를 시킨다. HA는 음전하로 인해 전형적인 형질도입 시약은 아니지만 키토산 또는 폴리-L-아르기닌과 함께 관심 mRNA 전달에 자주 사용된다. HA를 형질도입 시약 PEI와 병용하면 HA가 PEI의 세포 독성 효과를 줄일 수 있다는 큰 이점이 있다.
1. LbL 조립 중공캡슐
다층 고분자 전해질(PEM)로 만든 마이크로 미터 및 나노 미터 크기의 캡슐은 화학, 물리학, 생물학 및 의학 분야의 응용 분야에서 생명 공학 및 나노 기술 분야의 중요성 때문에 집중적인 연구의 대상이 되었다. 다층 캡슐은 희생 콜로이드 주형에 음이온성 및 양이온성 PE를 교대로 증착한 다음 코어를 용해시켜 제조한다. 콜로이드 템플릿에 LbL의 증착, 코어 용해 및 LbL 조립 캡슐로의 약물 캡슐화로 LbL 어셈블리를 통해 코어-쉘 입자 및 다층 중공 캡슐을 제조하는 방법은 체계적이고 광범위한 연구되었다.
LbL 조립 캡슐의 장점은 캡슐 제조에 사용되는 고분자 전해질(PE)와 그 특성 사이의 상호 작용 (예:공유 및 비공유)의 다양성에 있다. 다층은 저 분자량 생체적합성 폴리머에 대해서는 투과성이고 더 큰 거대 분자에는 투과성이 없기 때문에 선택적 투과성을 보여주었다. 다층 중공 캡슐의 크기는 희생 템플릿의 크기를 변경하여 쉽게 제어할 수 있다. 쉘 두께는 층 수와 준비 조건에 따라 변경될 수 있으므로 두께와 형태를 제어할 수 있다. 특히, 이러한 캡슐은 주로 사용되는 폴리머의 화학적 특성과 조립 조건으로 인해 더 나은 캡슐화 효율과 안정적인 제타 전위를 가진다. 약한 PE 시스템의 pH 또는 이온 강도의 변화를 통해 캡슐화 및 방출에 대한 성공적인 투과성 변화가 나타난다. 코어 구성의 유형과 함께 사용되는 폴리머의 화학적 특성은 중공 캡슐의 탄성 계수, 인성, 강도 및 견고성과 같은 기계적 특성을 정의한다. 중합체 유형 (예:더 두꺼운 층은 전하 밀도가 낮은 PE에 의해 형성됨), 중합체 용액의 농도 (높은 농도는 벽이 두꺼워 짐), 이온 강도 및 pH와 같은 제조 조건 또한 캡슐의 상호 작용 유형, 껍질 두께 및 투과성에 영향을 미친다.
중공 캡슐 내부의 다양한 거대 분자의 캡슐화는 쉘 투과성을 조작하기 위해 폴리머의 물리 화학적 특성을 조정하여 수행된다. 그러나 대부분의 작업은 폴리머 중 하나로 폴리스티렌 설포네이트(polystyrene sulfonate, PSS)와 같은 강력한 PE를 사용하므로 페이로드를 방출하기 위해 분자간 힘의 교란 (예:공유 결합, 수소 결합 및 정전기 상호 작용)이 발생한다. 캡슐 안정성을 보호하는 것이 반드시 필요하다. 이로 인해 pH, 이온 강도, 극성 및 온도와 같은 다양한 환경 유발 요인이 관찰되어 껍질 상호 작용력을 조절하여 캡슐 투과성을 조작하는 데 중요한 역할을 하였다.
다른 분자/생체적합성 폴리머를 캡슐에 더 쉽고 성공적으로 캡슐화하는 것은 약물 전달 매개체로서 다층 캡슐의 잠재력을 보여준다. 이들은 효소, 관심 mRNA, 펩타이드, 단백질, 치료제, 생체 분자, 형광 분자 및 나노 입자에 이르는 모든 종류의 물질 및/또는 분자를 속이 빈 구멍에 캡슐화할 수 있다. 이는 재료 자체를 템플릿으로 사용하거나, 재료를 코어 템플릿에 통합하거나, 환경 트리거를 사용하여 캡슐의 투과성을 제어하여 미리 형성된 캡슐에 약물을 캡슐화하여 여러 가지 방법으로 달성할 수 있다. 이러한 요소는 셸에 도입된 여러 기능과 함께 캡슐화된 페이로드를 제어된 방식으로 해제하는데도 사용된다. 제조 중에 유기 분자, NP, 형광 염료, 폴리머, 나노 튜브 및 기타 생체 분자와 같은 기능을 PE 다층에 통합하면 쉘의 내부 구조, 기계적 특성 및 투과성을 쉽게 제어하여 외부 트리거에 노출된 상태에서 적재된 화물 방출을 유도할 수 있다.
그 후, 레이저 광, 초음파, 자기장, 효소 변형 및 기계적 변형과 같은 외부 트리거의 노출 하에서 페이로드를 해제할 수도 있다. 후자의 경우 캡슐은 비가역적으로 파열되어 폭발 또는 지속 방식으로 로드된 분자를 방출한다. 약한 PE는 특정 범위의 pH 또는 이온 강도에서만 이온화된 형태로 존재하므로 다층 캡슐의 개방 및 폐쇄 상태는 다양한 pH 또는 이온 강도로 쉽게 제어할 수 있으며, 이는 생체 내 응용 프로그램에서 널리 사용되는 개념으로 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 지질 및 다당류와 같은 천연 바이오폴리머는 효소 및 pH 유도 분해를 통해 일반적인 생리적 조건에서 생분해되기 때문에 많이 연구되고 있다.
현재까지 강력한 PE 캡슐은 환경적 특성의 사소한 변화에 따른 치료제의 로딩 및 제어 방출, 사슬간 상호 작용의 억제, 물리적 요인의 작용 하에 있는 LbL films의 분해/재배열에 이르기까지 다양한 실제 응용 분야에서 광범위하게 사용되고 있다. 약한 PE 시스템이 이러한 많은 이점을 제공할 수 있다는 사실에도 불구하고 몇 종류의 사례만이다. 예를 들어, 즉각적인 환경 변화 (예:pH, 이온 강도 및 온도)에 대한 반응성은 약 하전된 그룹이 서로 물리적으로 근접해 있기 때문에 발생한다. PE 밀도의 효과는 시스템에 많은 하전 그룹이 있을 때 특히 두드러질 수 있다. LbL 어셈블리에 서로 다른 하전 그룹을 사용하면 다층 필름의 잔류 전하가 폴리머/폴리머 상호 작용을 조작하는 데 중요한 역할을 하여 LbL 시스템에 고유한 반응성을 부여할 수 있어 속성을 쉽게 엔지니어링할 수 있다.
2. LBL 기반 필름
현재 나노 두께의 다층 박막을 제조하기 위한 Chemical Vapor Deposition(CVD), Atomic layer deposition, colloidal assembly, molecular beam epitaxy 등등 많은 기술이 개발되어 있다. 그러나, 나노 스케일에서 자유롭게 조절이 가능하고 여러 가지의 재료들의 특성에 제한을 주지 않으며 열 처리나 강한 자극이 필요 없이 간단하게 만들 수 있는 기술은 층과층 적층법(Layer-by-Layer Assembly)이 유일하다. 층과층 적층법은 정전기적 인력, 수소결합, 반 데르 발스 힘, 소수성 결합 등의 상호 인력이 작용하는 물질들이 한 단계씩 쌓여 가는 과정을 통하여 나도 두께의 박막을 형성한다. 층과층 적층법으로 제조된 나노 박막은 재료 제한이 없고 세포 배양, 약물전달, 촉매, 감지 등등 다양한 분야에서 활발하게 연구되고 있다.
일반적으로 층과층 적층법을 실행하기 위한 Dip-coating 방법, Spin-coating 방법, Spray-coating 방법이 있다. Dip-coating 방법은 순차적으로 대상체를 용액에 담아 대상체의 표면에 기능성 물질을 코팅하는 방법이며 맨 처음으로 개발된 방법이다. Spin-coating 방법은 일정한 속도로 회전하는 힘에 의하여 용액에 녹아 있는 물질이 대상체의 표면에 흡착되어 나노 박막을 만든다. Spray-coating 방법은 노즐에서 용액을 분사하여 액적을 대상체의 표면에 붙어 코팅하는 방법이다.
기능성 나노 박막기술을 제조하기 위한 이와 같은 기존의 기술들은 장*?*단점이 있다. Dip-coating 방법의 경우 대상체와 재료의 제한이 거의 없고 특별한 장비가 필요하지도 않아서 비용적으로 굉장히 저렴하다. 하지만 시간이 오래 걸리고 제조가 끝난 후에 대상체와 용액은 집적적인 접촉에 의해 사용한 용액이나 재료가 오염이 될 가능성이 높기에 재료의 특성을 보존하기가 쉽지 않아 재사용에 어려움이 있다. Spin-coating 방법은 원심력에 의해 용액을 고르게 분포시키고 보다 빠른 속도로 나노 박막을 제조할 수 있다. 단점으로는 원심력으로 발생시킬 장비가 필요하며 대면적이나 대량으로 나노 박막 제조 어렵고 대량으로 제조하기 위해서는 더 큰 원심력을 발생시킬 고가의 장비가 필요하다. Spray-coating 방법은 용액을 분사할 수 있는 장비를 이용하여 대면적까지 분사할 수 있다. 그러나 노즐에서 분사 될 때의 압력이 분산되어 액적의 크기가 일정하지 않고 고른 코팅이 되지 않을 수 있다. 또한 이 대관심인 기존의 방법들은 나노 단위에서 수직적으로 두께나 재료, 거칠기 등의 다양한 기능성을 제공할 수는 있지만 수평적으로 다양한 기능성을 부여하기 어렵다는 공통적인 단점을 가지고 있다.
본 발명은 기존의 방법들의 장점은 유지하고 긴 제조 시간, 재료의 낭비, 수평적인 기능성 부여의 어려움 등의 단점들을 최소화하기 위하여 층과층 적층법을 잉크젯 프린팅 기술과 융합하여 2차원 대상체의 표면에 빠른 시간, 재료 사용의 최소화, 수평적 기능성 부여 등이 가능한 나노 박막을 제조할 수 있다.
LBL 어셈블리는 1990 년대 Decher에 의해 박막 제조를 위한 LB (Langmuir-Blodgett) 어셈블리의 대체 방법으로 처음 설명되었다. LB 어셈블리는 헤드-투-헤드/테일-테일 배열이 번갈아 가며 주로 양친매성 분자를 사용하는 다층의 제조를 허용하며 광범위하게 검토되었다. 다층 필름을 생산할 수 있음에도 불구하고 이 기술 자체는 시간이 많이 걸리고 수행하는 데 값 비싼 장비가 필요하며 사용할 수 있는 분자 유형에 따라 제한되었다. LBL 어셈블리의 출현으로 이러한 많은 한계를 극복할 수 있었으며 그 결과 다층 어셈블리에 대한 대중적인 접근 방식이 되었다.
이 방법을 사용하여 다층 고분자 전해질(PEM)은 하전된 기판에 음전하와 양전하를 띠는 고분자 (폴리 전해질, PE)를 순차적으로 교대로 흡착하여 제작된다. PE의 각 모노머 단위는 전하를 가지고 있어 정전기 상호 작용이 가능한 다중 하전 분자를 생성한다. 덜 일반적이기는 하지만 다른 상호 작용은 수소 결합, 배위 화학, 소수성 상호 작용을 포함한 PEM 형성을 유도할 수도 있다. 따라서 LBL 어셈블리는 LB 어셈블리와 동일한 재료 제한없이 PEM 준비의 간단한 방법을 제공하므로 필름 준비에 대한 나노 스케일 제어를 유지하면서 최소한의 장비만으로도 수행할 수 있다.
PE는 용액에 영구적인 전하가 있는 그룹 (강한 PE)과 전하가 pH에 크게 의존하는 그룹 (약한 PE)으로 분류할 수 있다. 반복되는 모노머 단위를 구성하는 그룹의 수에 기반한 전하 밀도는 또한 PE 간의 가능한 상호 작용에 영향을 미친다. PE의 특성 (즉, 전하 밀도, 분자량, 약함 대 강함)은 제조되는 필름의 거동에 큰 영향을 미친다. LBL 필름은 주로 정전기 상호 작용에 의해 함께 고정된다. 필름 내의 전하는 본질적으로 또는 외부적으로 중화된다. 고유 전하 보상은 PE 간의 전하 쌍을 의미하며, 외부 보상에 의해 중화되는 전하는 주변 솔루션의 반대 이온과 쌍을 이룬다. 고정 전하는 필름 구조 (즉, 스테레오)에 부과 된 제약으로 인해 다른 PE의 전하와 짝을 이룰 수없는 필름 내 전하이다. 이들은 외부 보상을 통한 중화에 의존한다.
PEM 성장의 초기 모델은 질량 및 필름 두께의 증가가 증착된 이중층 (증착 단계) 수에 비례하는 선형 성장 시스템을 보여준다. 실제로, 폴리 (나트륨스티렌설포네이트) (PSS)/폴리 (알리아민염산염) (PAH) 및 키토산 (CHI)/셀룰로오스 나노 위스커 필름을 포함하여 합성 및 천연 PE를 포함하는 선형 성장 필름은 많은 예가 있다. 이 필름에서 각 이중층은 상호 침투가 거의없이 직접 인접하는 이중층(위 또는 아래)만 상호 작용하므로 필름 내에서 뚜렷한 층상 형태가 보인다. 그러나 PLL과 히알루로난 (HA)을 사용한 PEM은 선형 성장 메커니즘을 하지 않는 입증된 필름 시스템으로 오히려 이 시스템은 각 증착주기에 따라 막 두께가 기하급수적으로 증가하였다. 이러한 유형의 성장은 적어도 하나의 PE가 빌드 업 중에 필름 안팎으로 이동할 수 있는 확산 모델에 기인한다.
일반적으로 이 메커니즘에 의해 성장하는 필름은 천연 고분자로 구성된다. 그러나 선형 및 기하급수적으로 성장하는 필름은 서로 관련되어 있다. 필름이 구성되는 실험 조건 (즉, 온도, pH, 이온 농도)은 관련 PE 사이의 결과적인 상호 작용 강도에 큰 역할을 하며, 결과적으로 주어진 필름의 성장 메커니즘, 밀도 및 강도에 영향을 미친다. 이러한 매개 변수는 필름 거동을 결정하기 위해 PE 자체의 특성 (즉, 약한 대 강함, 분자 질량, 2° 상호 작용)만큼 중요하다. 선형 성장 필름은 고유 전하 보상이 우세한 고하전 PE 및 낮은 이온 강도 조건을 선호하여 고밀도 필름 구조를 형성하는 경향이 있다. 그러나 이온 강도가 증가하면 성장 메커니즘이 기하급수적 거동을 나타내도록 변경될 수 있다. 이것은 1M NaCl로 구성된 PSS/PAH 필름이 기하급수적으로 성장하는 반면 0.15M NaCl로 구성된 필름은 선형적으로 성장한다. 반대로도 관찰되었다. 이온 강도를 감소시킴으로써 특징적인 지수 성장을 선형 성장으로 되돌릴 수 있다. 예를 들어, CHI/HA 필름은 10-4 M NaCl에서 선형으로 성장했지만 0.15 M NaCl의 농도에서 기하급수적으로 성장하였다. 그러나 기하급수적인 성장을 보이는 필름은 낮은 이온 강도에서 불안정한 경향이 있으며 이러한 조건에서 증착에 대한 구조적 영향이 있다. 예를 들어, 10-4 M NaCl에 증착된 CHI/HA 필름은 연속 필름을 형성할 수 없으며 섬 형태로 남아 있다.
높은 pH에서 PEI와 낮은 pH에서 폴리 (아크릴산) (PAA)를 번갈아 증착하여 다층의 기하급수적 성장을 크게 증폭하는 직접적인 방법이 있다. 교번하는 pH는 다층에서 고분자 전해질의 이온화 정도를 도입하여 PEI의 필름 안팎으로 확산을 향상시켜 주기 당 증착된 질량을 증가시킨다. pH 조정 가능한 전하 밀도와 약한 고분자 전해질의 확산성의 시너지 작용은 계층적 마이크로 및 나노 구조 표면을 가진 다층의 향상된 성장을 위한 새로운 방법을 제공한다.
고분자 전해질 다층은 높은 pH에서 PEI와 낮은 pH에서 PAA를 번갈아 증착하여 구성하였다. 다층의 성장 속도에 대한 pH의 영향을 정량화하기 위해 필름 질량 및 두께의 증가를 서로 다른 pH 값에서 측정한 결과는 다중 전해질 용액의 pH 차이가 증가함에 따라 필름 성장의 증폭을 보여준다. PEI 및 PAA 모두에 대해 pH 7.2에서 준비된 필름은 예상대로 증착 횟수에 따라 선형적으로 성장한다. 다층이 PEI 8.0/PAA 5.0에서 준비될 때 질량과 두께는 비선형 증가한다. 필름 성장의 비선형성은 pH 차이가 증가함에 따라 더욱 두드러진다.
또한, 다층 필름의 지수 성장 메커니즘은 각 증착주기 동안 다층 필름 안팎으로 PEI 분자의 확산에 의존한다. 폴리에틸렌 이민 (PEI)과 폴리 (아크릴산) (PAA)는 모두 용액의 pH에 따라 전하 밀도가 변할 수 있는 약한 고분자 전해질이다. 전체 필름 구조를 높은 pH (PEI 용액에서)와 낮은 pH (PAA 용액에서)에 번갈아 노출하면 다층 내에서 다중 양이온/다가 음이온에 대해 보상되지 않은 농도가 향상된다. 따라서 고 pH 전해질 용액의 PEI는 표면층의 역전을 보상할뿐만 아니라 벌크 전하를 보상하기 위해 필름으로 확산된다. 다층이 낮은 pH에서 PAA와 추가로 접촉하면 보상되지 않은 벌크 전하를 가진 양성자화된 PEI가 계면으로 확산되어 중화된다. pH가 전체 필름 구조의 전하 밀도에 영향을 미치기 때문에 고분자 전해질에 대해 보상되지 않은 양은 필름의 총 두께에 비례하는 벌크 전하에 대해 보상되지 않은 농도에 의해 제어된다. pH 조정 가능한 전하 밀도와 약한 고분자 전해질의 확산성의 시너지 작용으로 인해 다층 성장이 가속화된다.
높은 pH에서 PEI와 낮은 pH에서 PAA를 번갈아 증착하여 PAA/PEI 다층 필름의 pH 증폭된 성장은 (a) PAA/PEI의 pH 증폭 지수 성장은 음으로 하전된 PAA 종료 필름 negatively charged, PAA-terminated film으로 시작된다. (b) 필름을 높은 pH PEI 용액에 담그면 다층 필름을 탈 양성자화하여 전하를 음전하로 만든다. 이것은 PEI를 필름으로 확산시키고 (c) 헹굼 후 필름에 남아있는 폴리 양이온에 대해 보상되지 않는다. (d) 다층 필름을 낮은 pH의 PAA 용액에 담그면 다층을 양성자화한다. 이로 인해 PEI가 필름 밖으로 확산되고 필름/용액 계면에서 PAA와 반응하도록 보정되지 않은 PEI가 발생한다. (e) 마지막으로 음으로 하전된 PAA 종단 표면 negatively charged PAA-terminated surface이 생성된다. 높은 pH (PEI 용액에서)와 낮은 pH (PAA 용액에서)에서 완전한 필름 구조를 번갈아 노출하면 다층 내의 다중 양이온/다가 음이온에 대해 보상되지 않은 농도가 향상되어 증착주기 당 성장이 증폭된다.
LBL 필름은 용액 간의 교차 오염을 방지하기 위해 중간 헹굼 단계를 통해 기판을 반대 전하의 고분자 전해질 용액에 담그는 반복적인 절차를 통해 생성된다. 많은 연구가 pH, 온도 및 이온 강도와 같은 다양한 조건부 매개 변수의 영향에 초점을 맞추었지만 효과를 결정하기 위한 작업은 수행되지 않았다. 필름 성장에 대한 중간 헹굼 단계 외에도 실험 조건의 결과로 선형에서 지수로의 전이가 많은 경우가 있지만 증착 초기 단계 (처음 10-15 층 내)에서 반대되는 사례는 거의 보고되지 않았다. 필름의 무결성과 연속성은 영향을 받지 않는다.
다른 양이온을 가진 다층 DNA 코팅을 개발하여 생체 의학 응용을 위한 임플란트 코팅으로 사용하기 위한 폴리머로 사용하고 있다. 300-bp DNA는 poly (allylamine hydrochloride) (PAH; MW ~ 70 000 D) 또는 poly-D-lysine (PDL; MW 30,000-70 000 D)과 결합하여 기질 [PDL/DNA] 5 또는 기질 [PAH/DNA] 5 층을 형성한다. 즉, 코팅은 항상 기질과 접촉하는 다중 양이온성 폴리머로 시작하여 DNA 최상층으로 끝난다. 코팅의 DNA 함량은 이중층 당 약 3μg/cm2이고 기질 (석영, 실리콘, 티타늄)과는 무관하다. 이러한 티타늄 코팅은 Simulated Body Fluid (SBF)에서 탄산 하이드록시아파타이트의 침전 형성을 향상시킨다. PAH 함유 코팅은 완전한 hydroxyapatite 커버리지를 제공하는 반면, 코팅되지 않은 기판과 PDL 함유 코팅은 점과 같은 침전물만 발생시킨다. 두 가지 모두, hydroxyapatite로부터 미리 형성된 코팅과 생리적 조건에서 hydroxyapatite 증착을 향상시키기 위한 임플란트 표면 처리는 뼈 접촉을 위한 임플란트 표면의 생물학적 성능을 향상시키는 데 널리 사용된다. 이러한 코팅이 뼈 결합 능력을 가지고 있다. 유사하게, 생물의학에 널리 사용되는 초고 분자량 폴리에틸렌과 폴리 카프로락톤 위에 비스우레이도 계면 활성제를 기본 층으로 하고 300bp DNA를 최상층으로 사용하는 이중층 시스템은 결정화를 증가시킨다.
생의학 응용을 위해 cp-티타늄은 양이온 고분자와 어류 정자 DNA인 폴리 -L- 라이신 (PLL)의 다층 필름으로 코팅되었다. 상부 코팅으로 PLL을 사용하는 시스템은 소 혈청 알부민 (BSA) 흡착을 향상시키고 SBF에 노출되었을 때 hydroxyapatite 결정의 입자 크기를 줄이는 것으로 밝혀졌다. 모든 코팅 시스템은 SBF 노출 동안 칼슘 포스페이트상의 침착을 향상시켰다.
연어 고환 DNA 300bp 또는 7000bp와 프로타민 설페이트가 티타늄 표면에 결합되어 프로타민이 Ti에 고정된 것으로 시작하여 DNA가 최상층으로 끝나는 10층 코팅으로 결합되었으며 표면 분석 데이터에서 더 두꺼운 코팅이 300bp DNA에서 확인하였다. 2000bp 연어 DNA와 키토산을 음이온성 및 양이온성 고분자로 사용하는 폴리 (D, L- 젖산) 필름의 표면 공학에 LbL 접근법을 적용하였다. 커플링을 위한 초기 PEI 층부터 시작하여 전체 기판 커버리지를 위해 최소 5개의 이중층이 필요하였다. 이러한 5겹 층은 ~ 30시간 내에 37℃에서 5000 U/mL의 리소자임 용액에서 완전히 분해되었다.
다중 음이온성 성분으로 DNA를 사용한 LbL 다층 코팅은 생물학적 활성 분자의 고정화를 허용할 뿐만 아니라 생체 물질 표면의 표면 전하 및 표면 에너지를 조정할 수 있다. 이것은 음으로 하전된 표면과 다른 접근법에 의해 생성된 향상된 표면 에너지를 가진 표면이 치유 과정과 골 유착을 개선하는 것으로 나타났기 때문에 높은 관심을 끌고 있다. 다가 양이온 성분이 주로 DNA 고정화 수단으로 사용된다는 점을 언급할 가치가 있다.
3. 독립형 필름(Free standing film)
LbL PEM은 바이오센서, 약물 전달, 생체 재료 코팅 및 조직 공학을 포함한 생체 의학 응용 분야에서 사용하고 있다. 또한 콜로이드 템플릿 또는 지지 재료를 사용하여 개별 코팅된 세포, 캡슐화된 세포 응집체, 중공 캡슐 또는 독립형 멤브레인을 포함한 다양한 유형의 LbL 기반 물체를 준비할 수 있다. 후자의 경우, 기본 기판 (콜로이드 템플릿 또는 지지 재료)을 제거해야하는데, 이는 결함이 도입되거나 거칠기가 변경될 수 있으므로 어려운 단계이다.
지금까지 독립형 필름(Free standing film)의 개발은 대부분 투명하고 기계적으로 견고하며/또는 전기 전도성인 합성 또는 나노 복합 필름에 중점을 두었다. 열적 특성도 연구되었다.
현재까지 전적으로 다당류로 만든 독립형(FS) 필름에 대한 연구는 아직 부족하다. 분리 단계의 어려움은 이러한 막의 응집력 부족 및 조작에서 생긴다. 조작을 위해 수용성 폴리 (비닐 알코올) 막에 의해 지지되어야하는 층 쌍 당 2.9 nm의 초박형 FS 키토산/알지네이트 (CHI/ALG) 막을 제조하는 데 성공하였으며 그것을 사용하여 개의 내장 흉막 결손을 복구하였다. 다당류 막의 분리 단계를 위해 그들은 층 쌍의 수, 증착 시간 및 폴리머 농도를 변경하여 다양한 실험 조건을 연구하고 저에너지 기판에 CHI/Hyaluronan (CHI/HA) 필름을 구축하였다. 단 하나의 실험 조건에서만 분리 가능하고 견고한 ~ 3.5μm 두께의 멤브레인을 생성할 수 있었다. 이 막을 생리학적 완충액에서 안정하게 만들기 위해 추가적인 가교 단계가 필요하였다.
약물 전달 및 조직 공학에 사용할 수 있는 두꺼운 다당류 막 (수십 μm 범위)을 생산하는 것이다. 25 ~ 200 개의 층 쌍으로 만들어진 생체 적합성 (CHI/ALG) FS 막은 4 ~ 35μm의 해당 건조 두께로, 어떠한 후 처리 단계없이 기본 불활성 기질로부터 분리하여 준비하였다. CHI와 ALG는 풍부함과 다양성을 위해 선택되었다. CHI는 갑각류 껍질에서 발견되는 풍부한 다당류인 키틴의 N- 탈 아세틸화에서 얻은 양이온성 다당류입니다. ALG는 조류에서 추출된다. 그것은 조정 가능한 물리 화학적 특성을 가진 매우 다재다능하고 적응 가능한 재료이다. CHI와 ALG는 이미 생물 의학 응용 분야에서 널리 사용되고 있으며 상처 드레싱 재료의 전형적인 구성 요소입니다. ALG는 세포 캡슐화에도 사용된다.
PEM 필름으로 만들어진 FS 멤브레인은 기본 비활성 기질에서 분리되었으며 후 처리 단계없이 생리학적 완충액에서 안정적이었다. 또한 모델 약물의 침투를 가능하게 하였다.
Ⅵ. 다층 고분자 전해질 나노입자
본 발명은 유효성분, 양이온성 생체적합성 폴리머 및 음이온성 생체적합성 폴리머를 포함하고 이들 간의 정전기적 상호 작용으로 형성되는 고분자 전해질 목합체(polyelectrolyte complex, PEC) 및 다층 고분자 전해질(polyelectrolyte Multilayer, PEM)을 균질화하며 상기 유효성분이 봉입된 다층 전해질 나노입자(Polyelectrolyte multilayer nanoparticles: PEMN)에 관한 것이다.
상기 약리적 유효성분은 금속, 소분자 약물, 단백질, 성장인자, 펩타이드, 항체, 나노입자 및 관심 mRNA에서 선택될 수 있다. 바람직하게 약리적 유효성분은 음이온성 관심 mRNA일 수 있다.
지난 10년 동안 의료 분야에 적용되는 나노입자(NP) 관련 연구는 무기에서 유기 시스템에 이르기까지 크게 증가하였다. 무기 나노 입자의 경우, 일반적으로 보고되는 시스템은 금속 나노 입자 (은, 금, 산화 아연, 산화철 등)에 해당한다. (I) 금속 나노 구조 (II) 금속 산화물 나노 구조와 (III) 금속 나노 합금은 화학적, 물리적, 생합성 방법으로 생산할 수 있는 세 그룹으로 분류된다. 반면에 유기 NP는 덴드리머, 자가 조립 시스템 (미셀 및 리포솜) 및 고분자 나노 입자가 가장 많이 사용되고 보고된 시스템인 다양한 종류가 있다.
고분자 NP와 관련하여 이들은 상용성, 생분해성 및 낮은 세포 독성이라는 특성으로 인해 생의학 분야에서 일반적으로 사용되며 키토산, 변형 전분 및 천연 검과 같은 천연 고분자가 매우 일반적이다. 그러나 고분자 NP의 개발은 생체적합성 합성 물질로도 얻을 수 있기 때문에 생체 고분자 시스템에만 국한되지 않는다. 이는 주로 polylactide (PLA), polycaprolactone (PCL), 폴리 글리콜 산 (PGA) 및 아크릴 레이트 기반 폴리머 등도 사용된다. 마찬가지로 고분자 NP는 구조에 따라 분류되며, 가장 일반적인 것은 나노 구, 나노 캡슐, 고분자 나노 접합체 및 고분자 전해질 복합체(polyelectrolyte complex, PEC) 등이다.
PEC과 관련하여, 이들은 여러 방법으로 얻을 수 있는데, 이는 가장 많이 사용되는 것 중 하나는 전통적인 고분자 전해질 착물화(polyelectrolytic complexation) 프로세스 (bottom-up method, 상향식 방법)이다. 이 기술은 양이온성 및 음이온성 고분자 전해질이 수용액에 혼합될 때 정전기 인력에 의해 주어진 자발적인 혼성 중합체 응집(spontaneous interpolymeric aggregation)을 기반으로 한다. 이 고분자 전해 복합체 제조는 원칙적으로 수행하기 쉬운 방법론이다. 그러나 그것은 여러 내부 및 외부 변수에 의존하기 때문에 그 반대일 수도 있다. 내부 변수는 폴리머의 화학적 특성, 분자량 및 분율 전하이다. 외부 변수는 여러 용해 매체 조건(온도, pH, 또는 이온 강도) 뿐만 아니라 고분자 전해질 비, 혼합물 부피, 속도 및 첨가 순서 및 고분자 전해질 복합체화 중 교반 속도와 같은 많은 공정 조건에 따라 달라진다. 이러한 요인들은 특히 나노 미터 크기로 고분자 전해질 복합체를 얻기 어렵다는 사실로 이어진다. 따라서 상향식 방법을 통해 얻은 PEC의 표준화 및 확장은 어려운 실험을 수행하는 큰 도전이다.
다른 한편으로, 다층 고분자 전해질 나노입자(Polyelectrolyte multilayer nanoparticles, PEMN)을 얻기 위해 사용될 수 있는 다른 방법(top-down method, 하향식 방법)은 초음파(sonication) 처리, 압출(extrusion) 및 고압 균질화(HPH: High Pressure Homogenization) 및 초고압 균질화(UHPH: Ultra High Pressure Homogenization)에 의한 고 에너지를 적용하여 PEC 및 PEM을 균질하게 하는 수단이다.
그러나, 이러한 하향식 방법은 균질화 과정 중에 적용되는 과잉 에너지에 의한 물질의 화학적 분해가 이러한 방법의 몇 가지 단점중 하나이다. 그럼에도 불구하고 이 기술의 가장 큰 장점은 구현된 조건을 산업 수준에서 쉽게 재현하고 확장할 수 있다는 것이다. 따라서 이러한 방법으로 개발된 NP 기술은 산업현장에 손쉽게 기술 이전을 할 수 있다. 또한, 전통적인 상향식 고분자 전해 복합화 과정(polyelectrolytic complexation)에서 발생하는 주요 문제 중 하나는 큰 입자 크기와 높은 다분산성(polydispersity)이 있는 PEC 시스템이다. 이는 초음파(sonication) 처리, 압출(extrusion), 고압(HPH) 및 초고압 (UHPH)을 포함하는 고 에너지를 이용한 하향식 균질화 방법으로 기존 상◎식 PEMN 제조 방법을 보완하면 개선될 수 있다.
본 발명에서 제조된 PEC 및 PEM으로부터 균질한 PEMN 현탁액을 생산하기 위하여 초음파 처리 및/또는 고압에서 스크린 막을 통하는 압출, 고압 및 초압력을 사용할 수 있다. 하였다. PEMN 형성에 초음파 처리로 커다란 PEM은 부서지며, PEM들은 얽힘 및/또는 분산할 수 있으며, 표면은 활성화되거나 기능화될 수 있으며, PEM은 유화될 수 있다.
이러한 처리 단계에서 고출력 초음파는 강렬한 효과를 준다. 높은 강도로 현탁액을 초음파 처리할 때, 액체 매체로 전파되는 음파는 빈번하게 주파수에 따라 고압 (압축) 및 저압 (희박) 사이클을 번갈아 발생시킨다. 저압 사이클 동안, 고강도 초음파는 액체 내에 작은 진공 기포 또는 공극을 생성한다. 기포가 더 이상 에너지를 흡수할 수 없는 부피에 도달하면 고압 사이클 중에 격렬하게 붕괴된다. 큰 입자는 표면 침식 (주변 액체의 캐비테이션 붕괴를 통해) 또는 입자 크기 감소 (입자 간 충돌 또는 표면에 형성된 캐비테이션 기포의 붕괴로 인해 분열될 수 있음). 이것은 결정체 크기 및 구조 변화로 인한 확산, 물질 전달 공정 및 고상 반응의 급격한 촉진을 가져온다.
본 발명에 의한 유효성분, 양이온성 생체적합성 폴리머 및 음이온성 생체적합성 폴리머를 포함하는 Polyelectrolyte multilayer nanoparticels, PEMN)로, 바람직하게, 음전하를 갖는 관심 mRNA과 양이온성 생체적합성 폴리머가 정전기적 상호작용으로 구성하는 복합체의 층과 음이온 폴리머 외곽층을 포함하는 복합입자이다.
본 발명에서 PEMN은 (a) 유효성분인 음이온성 관심 mRNA, 양이온성 생체적합성 폴리머 및 음이온성 생체적합성 폴리머를 포함하고 이들 간의 정전기적 상호작용으로 PEC 및 PEM을 제조하는 단계; 및
(b) 상기 제조된 PEM을 균질화하여 상기 관심 mRNA이 봉입된 PEMN을 제조하는 단계를 포함하여 제조할 수 있다.
본 발명의 PEC와 PEM의 제조는 음이온성 관심 mRNA 및 양이온성 생체적합성 폴리머를 반응용액 내에서 30초간 연속적으로 와동(vortexing)하면서 혼합한 현탁용액에 음이온성 생체적합성 폴리머를 첨가하여 30초간 연속적으로 와동 또는/및 초음파 처리를 하여 반응이 끝난 후, 상온에서 1시간 동안 안정화시키는 제1 방법을 사용하였다.
상기 선택된 관심 mRNA, 양이온성 생체적합성 폴리머와 음이온성 생체적합성 폴리머를 혼합하여 자기조립으로 제조되는 입자를 PEM라고 지칭하였다. 상기 관심 mRNA, 양이온성 생체적합성 폴리머 및 음이온성 생체적합성 폴리머는 각각에 1종류 이상을 선택할 수 있으며, 선택되어진 생체적합성 폴리머를 혼합하여 PEM을 제조할 수 있다.
음이온성 관심 mRNA, 양이온성 생체적합성 폴리머 및 음이온성 생체적합성 폴리머를 반응용액 내에 30초간 연속적으로 와동 또는/및 초음파 처리를 하여 반응이 끝난 후, 상온에서 1시간 동안 안정화시키는 제2 방법을 사용하였다.
본 발명에 있어서, 고분자 전해질(Polyelectrolyte)은 용매에 녹아 해리할 수 있는 고분자, 구체적으로 물에 용해되어 양전하 또는 음전화를 띨 수 있는 고분자를 의미하며, 상기 고분자 전해질에는 양이온성 고분자 전해질(polyanion)과 음이온성 고분자 전해질(polycation)이 포함될 수 있다.
상기 양이온성 고분자 전해질은 수용액 상태에서 고분자 사슬의 화학적 작용기가 음이온을 잃거나 수소이온을 얻어서 양전하를 띌 수 있는 고분자 전해질을 의미할 수 있고, 주위환경의 산도 또는 염기도의 영향을 받아 이온화의 정도가 다양하게 나타나는 약전해질 양이온성 고분자뿐만 아니라, 중성 수용성 고분자 중 일반적인 물의 pH 범위에서는 이온화가 잘 되지 않고, 주변의 산도가 매우 높아진 경우에 양전하를 띠는 폴리아크릴 아미드와 같은 중성 수용성 고분자도 포함된다.
상기 음이온성 고분자 전해질은 고분자 사슬의 화학적 작용기가 양이온을 잃거나 수소이온을 잃어서 음전하를 띌 수 있는 고분자 전해질을 의미할 수 있고, 주위환경의 산도 또는 염기도의 영향을 받아 이온화의 정도가 다양하게 나타나는 약전해질 음이온성 고분자가 포함된다.
선택된 기판에 유효성분(D), 양이온성 생체적합성 폴리머(C) 및 음이온성 생체적합성 폴리머(A)을 교대로 층적하는 layer by layer 층적 기술로 제조되고 용출되는 막을 제조하는 방법을 사용하였다.
본 발명의 PEMN에서 층의 배열은 유효성분(D)의 이온화 정도에 따라 하기와 같이 결정할 수 있다.
바람직하게, 유효성분(D)이 음이온성 경우, 예시적으로 음이온성 관심 mRNA(D)은 일반식 1 및 일반식 2를 포함하는 일반식에서 선택되어진 어느 하나와 같은 층의 배열을 할 수 있다. 여기서 n은 층 수를 의미하며 자연수이다.
A(CD)nCA (일반식 1)
A(CDCA)n (일반식 2)
바람직하게, 유효성분(D)이 양이온성 경우, 예시적으로 양이온성 단백질(D)은 일반식 3을 포함하는 일반식에서 선택되어진 어느 하나와 같은 층의 배열을 할 수 있다. 여기서 n은 층 수를 의미하며 자연수이다.
A(DACA)n (일반식 3)
바람직하게, 유효성분(D)이 중성 생체적합성 폴리머 경우, 예시적으로 중성 단백질은 일반식 1 및 일반식 2를 포함하는 일반식에서 선택되어진 어느 하나와 같은 층의 배열을 할 수 있다.
본 발명에서 제조하는 PEMN은 폴리머기반 나노입자 또는 하이드로 겔일 수 있다. 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명에서 (a) 유효성분인 음이온성 관심 mRNA과 양이온 생체적합성 폴리머를 혼합한 현탁용액에서 이들 간의 정전기적 상호 작용으로 제조된 코어입자를 포함하는 현탁용액 및 상기 현탁용액에 음이온성 생체적합성 폴리머를 혼합하여 상기 코어입자와 상기 음이온성 생체적합성 폴리머 간의 정전기적 상호작용으로 형성되는 PEM;
(b) 유효성분인 음이온성 관심 mRNA, 양이온 생체적합성 폴리머 및 음이온성 생체적합성 폴리머를 혼합한 현탁용액에서 이들 간의 정전기적 상호작용으로 형성되는 PEM; 및
(c) 유효성분 음이온성 관심 mRNA, 양이온성 생체적합성 폴리머 및 음이온성 생체적합성 폴리머를 기판에 교대로 증착하는 layer by layer 방법으로 제조되고 용출되는 PEM;을 포함할 수 있다.
상기 PEM은 고분자 전해질 복합체, 다층 고분자 전해질, 나노 겔, 하이드로 젤 및 중합체 미셀을 포함할 수 있다.
상기 PEM 제조 단계에서 진탕 및 초음파 처리를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 실시할 수도 있다.
여기서, 관심 mRNA, 양이온성 생체적합성 폴리머 또는 음이온성 생체적합성 폴리머는 각각에서 선택되어진 한 종류 또는 그 이상일 수도 있다. 목적에 따라 각각의 비율을 달리할 수 있다.
본 발명은 먼저, 유효성분으로 관심 mRNA과 양이온성 생체적합성 폴리머로 핵, 코어입자를 제조한다.
본 발명에서, 양이온성 생체적합성 폴리머는 폴리펩티드, 펩티드. 알릴계 아민 폴리머, 또는 양이온성 다당류이다. 이들 양이온성 생체적합성 폴리머를 사용하는 것에 의해, 코어입자의 안정성을 향상시킬 수 있다.
본 발명은 양이온성 생체적합성 폴리머는 관심 mRNA과 코어입자를 형성한다. 본 발명은 또한 상기 서술한 복합입자의 제조 방법에 관한 것이다. 즉, 본 발명의 제조 방법은, 수성 용매 중에서, 관심 mRNA과 양이온화도가 0.2이상인 양이온성 생체적합성 폴리머를 혼합하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따르면, 상기 서술한 코어입자를 용이하게 제조할 수 있다.
본 발명은 관심 mRNA 수용액 (A), 및 양이온성 생체적합성 폴리머의 수용액 (B)를 별도로 제조하고, 이들 수용액을 서로와 혼합하는 것을 특징으로 한다. 이로써, (A) 및 (B)의 수용액을 별도로 제조하여 코어입자의 응집을 방지할 수 있다.
또한, 상기 기재된 수용액 (A)에 있어서의 관심 mRNA의 농도는 바람직하게는 1.7 mM 이하이다. 또한, 상기 기재된 수용액 (B)에 있어서의 전체 양이온성 생체적합성 폴리머의 농도는 바람직하게는 1.7 mM 이하이다. 수용액 (A) 및 (B)에 있어서의 폴리머의 농도를 상기 기재된 범위로 설정함으로써, 응집하기 어려운 코어입자를 제조할 수 있다.
본 발명에 의한 상기 관심 mRNA을 포함하는 PEM을 제조하는 방법은 관심 mRNA 자체가 음이온을 띄고 있다는 특성에 착안하여 양전하를 띄는 분자로 상기 관심 mRNA을 코팅하여 코어입자를 제조하고 추가적으로 음이온성 다당류를 2차 코팅하여 PEM을 제조하는 방법을 제공한다.
바람직하게, 본 발명의 관심 mRNA PEM은 관심 mRNA, 양이온성 생체적합성 폴리머와 음이온성 생체적합성 폴리머의 혼합에 의한 복합입자일 수 있다.
좀 더 구체적으로 살펴보면, 상기 양이온성 생체적합성 폴리머는 상기 관심 mRNA과 정전기적 상호작용으로 응축된 PEM을 형성한다.
상기 관심 mRNA은 n개의 뉴클레오티드로 구성되어 있으며 분자당 n-1개의 음전하이고 또는 1 몰당 1.8 × 1025 음전하이다.
상기 양이온성 생체적합성 폴리머에서 대관심인 물질인, 프로타민(PS) 분자량이 5.8 kDa이고 염기성 아미노산, 특히 아르기닌(70~80 %)이 풍부하므로 몰당 양이온이 1.26 ± 1025이다. 따라서 복합체와 복합체를 형성하면 PS는 복합체 인산염 그룹의 음전하를 중성화시킨다. 일반적으로 코어입자라고 불리는 이 물질은 물에서 해리될 수 있는 그룹을 포함하고 있는 생물학적 거대 분자의 고분자로 구성되어 상호 작용하여 전하를 띤 구성 요소를 만든다.
본 발명의 관심 mRNA과 양이온성 생체적합성 폴리머의 전하 비율(charge ratio)이 1:0.4 이상 즉 관심 mRNA은 1이고 PS는 0.4 이상으로 하는 방법을 제공할 수도 있다.
상기 관심 mRNA과 PS의 정전기적 상호 작용으로 응집하는 코어입자의 상호간의 결합은 관심 mRNA과 PS 각각의 전하(charge)에 따라 결정되며 본 발명의 입자에서는 상기 관심 mRNA과 PS (㎍/mL)의 중량비는 30:15~150, 바람직하게는 30:15~90, 더욱 바람직하게는 30:75일 수 있다.
상기 코어 입자를 구성하는 관심 mRNA과 양이온성 생체적합성 폴리머의 정전기적 상호작용으로 관심 mRNA의 원만한 방출을 위해 인간혈청알부민(HSA), 히알루론산, 양치매성 생체 고분자, 음전하를 띤 나노입자 또는 관심 mRNA 및 CaCl2을 포함하는 염에서 선택된 어느 하나를 사용할 수도 있다.
본 발명에서 제시하는 코어 입자에 있어서, 관심 mRNA은 이온 복합체를 형성하기 위하여 반드시 양이온성 생체적합성 폴리머를 더 포함한다. 즉 양이온성 생체적합성 폴리머와 정전기적 상호작용으로 인해 양이온성 생체적합성 폴리머 내부에 봉입된 음전하의 관심 mRNA은 형성된 이온 복합체는 입자의 코어 부분에 위치한다. 상기 관심 mRNA과 양이온성 생체적합성 폴리머의 접촉으로 형성되는 코어입자의 층은 강한 양전하를 띠고 있어 세포에 부착력이 증가하고 조직 장벽을 통과하기 힘들다는 문제가 있다.
본 발명에서는 이러한 문제점을 해결하고자 생체적합성이 좋으며 음전하를 띄고 있는 음이온성 생체적합성 폴리머를 사용하여 2차로 상기 양이온성 생체적합성 폴리머층 외면에 코팅하여 음이온성 생체적합성 폴리머 층을 형성하여 PEM을 제조할 수 있다.
상기 음이온성 생체적합성 폴리머 층 코팅단계는 음이온성 생체적합성 폴리머를 넣어 상기 양이온 분자층 외면에 상기 음이온성 생체적합성 폴리머 층을 정전기적 인력으로 코팅하는 단계이다.
또한, 상기 관심 mRNA의 하나 이상의 말단은 콜레스테롤, 토코페롤 및 탄소수 10 내지 24개의 지방산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 수식될 수 있다. 상기 콜레스테롤, 토코페롤 및 탄소수 10 내지 24개의 지방산에는 콜레스테롤, 토코페롤 및 지방산의 각 유사체, 유도체, 및 대사체가 포함된다.
본 발명에서, 관심 mRNA은 전체 조성물의 중량을 기준으로, 0.05 내지 10 중량%로 포함될 수 있고, 보다 구체적으로는 0.1 내지 5중량%, 보다 더 구체적으로는 0.5 내지 3 중량%로 포함될 수 있다. 상기 관심 mRNA의 함량이 전체 조성물의 중량을 기준으로 0.05 중량% 미만이면 약물에 비하여 사용되는 전달체의 양이 너무 많아서 전달체에 의한 부작용이 있을 수 있고, 10 중량%를 초과하면, 나노입자의 크기가 너무 커져 나노입자의 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있다.
상기 양이온성 생체적합성 폴리머은, 관심 mRNA과 정전기적 상호작용에 의해 결합되어 복합체를 형성하고, 상기 복합체는 음이온성 생체적합성 폴리머의 나노입자 구조 내부에 봉입된다. 따라서, 상기 양이온성 생체적합성 폴리머는, 관심 mRNA과 정전기적 상호작용에 의해 복합체를 형성할 수 있는 모든 형태의 생체적합성 폴리머를 포함하며, 예를 들어, 양이온성 지질 또는 양이온성 고분자 종류일 수 있다.
상기 PEM 제조는 관심 mRNA을 포함하는 수용액, 양이온성 생체적합성 폴리머를 포함하는 수용액 및 음이온성 생체적합성 폴리머를 포함하는 수용액을 별도로 제조하고 이들 수용액을 서로와 혼합하는 것을 특징으로 하며 상기 혼합물을 초음파분쇄기(ultrasonicator)로 분산시키는 것을 포함할 수도 있다.
상기 초음파분쇄기로는 배쓰 타입 초음파분쇄기(bath type ultrasonicator)를 사용하는 것이 바람직하다. 배쓰타입 초음파분쇄기는 20 내지 40 W/L(Watt/Liter)의 약한 초음파분쇄를 제공하고 매우 불균일한 분포를 제공하는 것으로 알려져 있는 반면, 프로브 타입 초음파분쇄기(probe type ultrasonicator)는 대략 20,000 W/L을 가할 수 있다. 프로브 타입의 초음파분쇄기가 집중되고 균일한 초음파 강도 투입으로 인해 배쓰형 타입 초음파분쇄기 보다 약 1,000배 우수함을 의미하는 것이다.
일반적으로, 관심 mRNA은 그 불안정성으로 인해, 초음파 분쇄가 불가능하거나 곤란한 것으로 알려져 있었으나, 본 발명과 같이 관심 mRNA을 고분자 나노입자 내에 봉입시킴으로써 비로소 초음파분쇄기를 사용하는 것이 가능해져 전달체 제조 시 보다 편리하고 효율적인 제조가 가능하다.
본 발명은 또한 상기 서술한 제조 방법에 의해 제조한 유효성분을 함유하는 PEM-함유 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 즉, 본 발명의 PEM 함유 조성물의 제조 방법은, 제1 또는 제2 방법의 혼합 단계를 포함하고, 혼합 이후 조성물의 pH가 수성 용매의 pH와 상이할 수 있음을 특징으로 한다.
상기 서술한 제조 방법에 의해 제조된 PEM은, 이후 pH가 변화되는 경우에도 사라지지 않는다. 따라서, 본 발명에 따르면, PEM 함유 조성물을 용이하게 제조할 수 있다.
또한, 상기 음이온 분자에 표적화 분자를 공유결합으로 연결할 수도 있다. 상기 복합체 입자를 능동적 운반체로 사용할 수 있다. 상기 표적화 분자는 세포표면에 결합하는 생체적합성 폴리머, 항체 또는 펩티드, 압타머 또는 이들의 조합일 수 있다.
또한, 본 발명은 또한 양이온성 생체적합성 폴리머 및 관심 mRNA을 포함하는 PEM에 관한 것이며, PEM은 관심 mRNA가 비증폭 RNA, 자가 증폭 mRNA(Self-amplifying mRNA)를 포함하는 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상으로 제조할 수도 있다.
본 발명의 복합입자의 입자 직경이 500 nm 이하임을 특징으로 한다.
상기 수혼화성 유기용매를 제거하는 단계 이후에, 동결건조 보조제를 가하여 동결건조 하는 공정을 더 포함할 수 있다.
상기 제조방법은, 상기 동결 건조 전에 고분자 나노입자 수용액을 멸균필터로 멸균하는 공정을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 동결건조 보조제는 동결건조된 조성물이 케이크 형태를 유지할 수 있도록 하거나, 음이온성 생체적합성 폴리머 조성물을 동결건조 후, 재건(reconstitution)하는 과정에서 빠른 시간 내에 균일하게 녹는 것을 도와주기 위해 첨가하는 것으로, 구체적으로, 락토스, 만니톨, 솔비톨 및 슈크로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 동결건조 보조제의 함량은, 동결건조 조성물 전체 건조중량을 기준으로, 1 내지 90 중량%일 수 있고, 더 구체적으로는 10 내지 60 중량%일 수 있다.
이러한 본 발명에 따른 제조방법을 통해 제조된, 관심 mRNA과 양이온성 생체적합성 폴리머 복합체가 음이온성 생체적합성 폴리머 나노입자 구조체에 봉입된 형태의 조성물 내의 나노입자는 혈중에서 안정하며, 그 크기는 구체적으로 10 내지 200 nm일수 있고, 더욱 구체적으로는 10 내지 150 nm일 수 있다.
다른 실시예에 따르면, 본 발명은 또한 약학적 조성물을 제공하며, 상기 약학 조성물은 본발명에 정의된 관심 mRNA 전달물 및 일반식 생분해성 고분자 담체 전달물 복합체와 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 비히클(vehicle)을 포함한다.
첫 번째 중요한 요소로서, 생분해성 약학적 조성물은 관심 mRNA 전달물 및 생분해성 고분자 담체 분자에 의해 만들어진 고분자 담체 전달물 복합체를 포함한다.
두번째 중요한 요소로서, 생분해성 약학적 조성물은 적어도 하나의 추가적인 약학적 활성 구성요소를 포함할 수 있다. 이와 관련하여 약학적 활성 구성요소는 특정한 증상을 낫게(heal)하거나 개선(ameliorate)하거나 예방(prevent)하는데 치료상 효과가 있는 생체적합성 폴리머이며, 바람직하게는 암질환, 자가면역 질환, 알러지 또는 전염병에 효과가 있는 생체적합성 폴리머이다.
상기 생분해성 약학적 조성물은 인간을 위해 그리고 또한 수의학적인 목적을 위해 사용될 수 있고, 바람직하게는 인간을 위해 사용할 수 있고, 일반적인 약학적 조성물로서 또는 백신으로서 사용될 수 있다.
상기 정의된 것처럼, 상기 생분해성 고분자 담체 전달물 복합체는 그 자체로 생분해성 고분자 담체 전달물 복합체가 (다른 약학적으로 활성인 구성요소를 추가하지 않고) 면역자극 약품으로 사용되도록 하는 비특이적 선천성 면역 반응을 유발한다. 만약 다른 약학적으로 활성인 구성요소, 바람직하게는 특히 면역성 구성요소, 바람직하게는 항원과 함께 처리되면, 상기 본 발명의 관심 mRNA은 다른 약학적 활성 구성요소에 의해 유발되는 특이적 후천성 면역 반응을 도와주는 애쥬번트로서 역할을 한다.
다른 특히 바람직한 실시예에 따르면, 생분해성 약학적 조성물(또는 생분해성 고분자 담체 전달물 복합체)은 백신으로 제공되거나 사용될 수 있다.
만약 mRNA가 관심 mRNA 전달물 및 생분해성 고분자 담체 전달물 복합체의 관심 mRNA분자로 사용된다면, 생분해성 백신은 일반적으로 생분해성 약학적 조성물처럼 구성되고 바람직하게는 치료할 환자의 면역계의 면역 반응, 예를 들면, 선천성 면역 반응을 돕거나 이끌어낸다. 더구나 또는 대체적으로, 바람직하게는 만약 관심 mRNA 전달물 및 생분해성 고분자 담체 전달물 복합체의 관심 mRNA이 후천성 면역 반응을 이끌어내는 상기 언급된 항원이나 단백질 중 어떤 것을 암호화한다면, 상기 생분해성 백신은 후천성 면역반응을 유발할 수 있다.
상기 생분해성 백신에 포함될 수 있는 다른 첨가물들은 유화제(emulsifiers), 가령, 트윈(Tween); 습윤제(wetting agents), 가령, 라우릴황산나트륨(sodium lauryl sulfate); 착색제(colouring agents); 풍미제(taste-imparting agents), 약학적 담체(pharmaceutical carriers); 정제형성제(tablet-forming agents); 안정제(stabilizers); 산화 방지제(antioxidants); 방부제(preservatives)를 포함할 수 있다.
게다가 본 발명은 생분해성 고분자 담체 분자의 몇가지 응용 및 용도를 제공하고, 관심 mRNA 전달물 및 생분해성 고분자 담체 분자에 의해 만들어진 생분해성 담체 전달물 복합체, 이들을 포함하는 약학적 조성물 또는 이들을 포함하는 키트(kits)를 제공한다.
한 가지 실시예에 따르면, 본 발명은 바람직하게는 유전자 치료법이나 본발명에서 정의된 질환의 치료를 위한 의약품(medicament)로서, 생분해성 고분자 담체분자, 관심 mRNA 전달물 및 생분해성 고분자 담체 분자에 의해 만들어진 생분해성 고분자 담체 운반물 복합체의, 또는 이들을 포함하는 키트의 첫번째 의학적 용도에 관한 것이다.
상기 의약품은 약학적 조성물의 형태로 또는 약학적 조성물의 구체적인 형태인 애쥬번트나 백신의 형태로 존재할 수 있다. 본 발명과 관련하여 약학적 조성물은 일반적으로 생분해성 고분자 담체 분자 또는 관심 mRNA 전달물 및 생분해성 고분자 담체 분자에 의해 만들어진 생분해성 고분자 담체 전달물 복합체를 포함하며, 선택적으로 다른 성분들(ingredients) 예를 들어, 바람직하게는 본발명에 정의된 바와 같은 생분해성 관심 mRNA 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 비히클을 포함한다.
상기 음이온성 관심 mRNA 그룹, 양이온성 생체적합성 폴리머 그룹 및 음이온성 생체적합성 폴리머 그룹은 각각 단일 종류일 수도 있지만 이에 제한하는 것은 아니다. 각 그룹에서 2종류의 생체적합성 폴리머가 선정되어 본 발명의 목적을 달성할 수도 있다.
바람직하게, 본 발명의 관심 mRNA PEM은 관심 mRNA, 양이온성 생체적합성 폴리머와 음이온성 생체적합성 폴리머의 혼합에 의한 복합입자일 수 있다.
관심 mRNA 대 양이온성 생체적합성 폴리머의 비율, 즉 입자의 순 전하가 중요하다. 따라서, 본 발명에서 양이온성 생체적합성 폴리머와 음이온성 생체적합성 폴리머류를 이용한 관심 mRNA 복합입자 기반 전달 플랫폼을 개발하였다,
본 발명에서 관심 mRNA 전달을 촉진하고, 단백질 번역을 증가시키고 RNases으로부터 관심 mRNA을 보호하기 위해 다수의 새로운 관심 mRNA 복합입자를 개발하였다. 본 발명은 급속한 세포외 관심 mRNA 분해 및 혈청 단백질과의 응집에 대한 우려를 극복하여 관심 mRNA의 전신 투여를 위한 가능성을 제시하고자한다.
또 다른 중요한 문제는 전신 전달 후 관심 mRNA 전달체의 생체 분포이다. 주로 수지상 세포 활성화에 이상적이지 않은 간(liver)으로 특정 양이온성 지방 나노입자는 정맥 내 주사를 통해 전달되었다. 즉, 양전하를 띤 입자가 주로 폐를 관심으로 하는 반면, 음전하를 띤 입자는 이차 림프 조직 및 골수를 관심으로 전달되어 면역반응을 활성화시킨다.
본 발명에서 다중 음이온성 관심 mRNA을 양이온성 폴리머로 기본입자를 제조하고 이를 음이온성 폴리머로 코팅하여 궁극적으로 음전하로 하전된 PEM을 제조하였다.
본 발명의 PEM은 영상소재 및 중성 또는 양이온성 폴리펩타이드로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 또는 관심 mRNA에 영상 소재와 중성 분자인 콜레스테롤이 부착될 수 있다. 복합입자는 단백질의 암호화와 내포한 약학적 유효성분에 의한 약학적 기능, 영상 소재에 의한 영상화 기능 그리고 콜레스테롤에 의한 관심 mRNA의약품의 보호 기능을 동시에 함께 보유할 수 있다.
상기 관심 mRNA은 그 자체로는 인체 내 뉴클레오티드로 구성된 관심 mRNA을 분해시키는 효소에 대해 무방비 상태이기 때문에 그 효능을 온전히 관심 조직 내부로 전달하기 힘들고 신장 여과 기능에 의해 배출되는 문제점이 있다. 따라서 본 발명은 복합체를 우수한 약물로 개발하기 위해, 상기 문제점을 극복하는 방법을 하기와 같이 제공하고 있다.
상기 발명의 PEMN의 조성물 및 제조방법을 자세히 살펴보면 하기와 같다.
양이온성 생체적합성 폴리머
본 발명의 코어입자는 상기 관심 mRNA과 상기 양이온성 생체적합성 폴리머는 정전기적 상호 작용에 의해 응축되는 복합체이다. (-) 전하를 띄는 상기 관심 mRNA과 (+) 전하를 띄는 양이온성 생체적합성 폴리머가 서로 혼합되면 응축될 수 있다. 좀 더 구체적으로, 강한 양전하를 가지는 분자는 이 음전하의 관심 mRNA을 둘러싸면서 응축 또는 압축하여 입자 크기를 줄일 수 있다.
본 발명에 있어서, 표현 "양이온성 생체적합성 폴리머"는 적어도 수중에서의 양이온성을 나타내는 폴리머를 나타내고, 전체로서 양이온성을 나타내는 양쪽성 폴리머를 또한 포함한다.
본 발명에 있어서, 양이온화도가 0.2 이상인 폴리머를 사용한다. 상기 양이온성 생체적합성 폴리머를 사용함으로써, 음이온성 생체적합성 폴리머와 복합입자를 용이하게 형성할 수 있다.
다른 한편으로는, 음이온성 생체적합성 폴리머와 복합입자를 형성하는 관점에서, 양이온성 생체적합성 폴리머의 양이온화도에 대한 특정한 상한은 없다. 기준으로서, 양이온화도가 2 이하인 양이온성 생체적합성 폴리머를 사용할 수 있다.
이와 관련하여, 표현 "양이온화도"는 이하의 식에 따른 계산에 의해 얻을 수 있는 값을 나타낸다.
｛(폴리머에 함유되는 양이온성 관능기의 수) - (폴리머에 함유되는 음이온성 관능기의 수)｝/ 폴리머를 구성하는 모노머의 총량
본 발명에서 사용되는 양이온성 생체적합성 폴리머는, 이것이 양이온성 관능기를 갖는 한, 천연물 또는 합성물일 수 있다.
양이온성 생체적합성 폴리머에 함유되는 양이온성 관능기의 예는, 아미노 기, 구아니디노 기 및 이미노 기를 포함한다. 본 발명의 양이온성 생체적합성 폴리머는, 이들 기를 폴리머의 측쇄 또는 주쇄에 함유한다.
상기 양이온성 생체적합성 폴리머는 양이온성 폴리펩티드, 양이온성 다당류, 양이온성 지질, 양이온성 표면활성제, 답즙산 또는 답즙산 유도체가 공유결합한 양이온성 분자 및 합성 중합체 등을 포함할 수 있다.
바람직한 양이온성 폴리펩타이드는 프로타민, 폴리라이신(polylysine) 및 폴리아르기닌(polyarinine)이고;
양이온성 다당류, 예를 들어 키토산, 폴리벤, 글라이콜 키토산(glycol chitosan)이고;
양이온성 폴리머, 예를 들어 폴리에틸렌이민(PEI)이고;
양이온성 지질, 예를 들어 DOTMA: [1-(2,3-시오레일옥시)프로필)]-N,N,N-트리메틸암모니움 클로라이트([1-(2,3-sioleyloxy)propyl)]-N,N,N-trimethylammonium chloride), DMRIE, 디-C14-아미딘, DOTIM, SAINT, DC-Chol, BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE: 디올레일 포스파티딜에탄올-아민(Dioleyl phosphatidylethanol-amine), DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS: 디옥타데실아미도글리실스페르민(Dioctadecylamidoglicylspermin), DIMRI: 디미리스토-옥시프로필 디메틸 히드록시에틸 암모늄 브로마이드(Dimyristo-oxypropyl dimethyl hydroxyethyl ammonium bromide), DOTAP: 디올레오일옥시-3-(트리메틸암모니오)프로판(dioleoyloxy-3-(trimethylammonio)propane), DC-6-14: O,O-디테트라데카노일-N-(α-트리메틸암모니오아세틸)디에타놀아민 클로라이드(O,O-ditetradecanoyl-N-(α-trimethylammonioacetyl)diethanolamine chloride), CLIP1: rac-[(2,3-디옥타데실옥시프로필)(2-히드록시에틸)]-디메틸암모니움 클로라이드, CLIP6: rac-[2(2,3-디헥사데실옥시프로필-옥시메틸옥시)에틸]트리메틸암모니움, CLIP9: rac-[2(2,3-디헥사데실옥시프로필-옥시석시닐옥시)에틸]-트리메틸암모니움, 올리고펙타민 등이고, 또는
양이온성 또는 다중 양이온성 생체적합성 폴리머, 예를 들어 β-아미노산-폴리머 또는 역(reversed) 폴리아미드 등과 같은 변형된 폴리아미노산, PVP (폴리(N-에틸-4-비닐피리디니움 브로마이드)), 등과 같은 변형된 폴리에틸렌, pDMAEMA (폴리(디메틸아미노에틸 메틸아크릴레이트)), 등과 같은 변형된 아크릴레이트, pAMAM (폴리(아미도아민)), 등과 같은 변형된 아미도아민, 디아민 및 변형된 1,4 부탄디올 디아크릴레이트-코-5-아미노-1-펜타놀 폴리머, 등과 같은 변형된 폴리베타아미노에스터(PBAE), 폴리프로필아민 덴드리머 또는 pAMAM 기초의 덴드리머 등과 같은 덴드리머, PEI:폴리(에틸렌이민), 폴리(프로필렌이민) 등과 같은 폴리이민(들), 폴리알릴아민, 사이클로덱스트린 기초의 폴리머, 덱스트란 기초의 폴리머, 키토산 등과 같은 당백본 기초의 폴리머, PMOXA-PDMS 코폴리머 등과 같은 실란 백본 기초의 폴리머, 하나 또는 그 이상의 양이온성 블록(예를 들어 상기 언급된 양이온성 생체적합성 폴리머로부터 선택된 것)의 조합 및 하나 또는 그 이상의 친수성 또는 소수성 블록(예를 들어 폴리에틸렌글리콜); 등으로 이루어진 블록폴리머를 포함할 수 있다.
양이온성 생체적합성 폴리머를 포함하는 복합입자는 더 작은 균일한 입자 크기를 공식화하여 형질도입 효율을 향상시키는 추가 이점을 가지고 있다. 양이온성 생체적합성 폴리머는 음전하를 띤 관심 mRNA을 응축하고 포장하는 경향이 있다. Poly-L-lysine (PLL)은 DNA 형질도입을 위해 조사된 최초의 양이온성 폴리머이다. 또한 가장 높은 양이온 전하 밀도를 갖는 새로운 분지형 양이온 폴리머인 PEI (poly-ethylenimine)를 합성하였다. PEI는 하전된 아미노 그룹으로 인해 양성자화를 겪을 수 있는 고도로 분지된 폴리머이다. PEI의 더 높은 형질도입 효율은 엔도좀에 존재하는 소포 ATPase 양성자 펌프에 의해 펌핑된 양성자를 소멸시킬 수 있는 PEI상의 여러 아미노 그룹의 완충 능력에 기인한다. PEI의 이러한 '양성자-스펀지 효과'는 엔도솜에 염화물 이온과 물이 유입되어 결국 삼투압 팽창과 엔도좀 파괴로 이어진다. 그러나 PEI 기반 제제는 높은 양전하로 인해 혈청 단백질과 적혈구에 결합하기 때문에 세포 독성을 나타내어 원형질막 파괴를 일으킨다. 더욱이, PEI 폴리머로 처리된 세포주가 자가 포식, 괴사 및 세포 사멸을 보인다.
앞서 언급한 문제를 해결하기 위해 차세대 양이온 기반 폴리머인 폴리 [(2- 디메틸아미노) 에틸메타크릴레이트] (pDMAEMA), 폴리아미도아민 (PAMAM) 덴드리머, 생분해성 폴리 (β-아미노 에스테르) (PBAE) 폴리머가 개발되었다. 3차 아민 말단기 때문에 pDMAEMA 및 PBAE는 엔도좀 탈출을 돕고 우수한 형질도입 효율이 있다. PBAE는 PEI에 비해 독성이 적지만 표면 전하 밀도를 고려하여 여전히 주의해야 한다. 따라서 형질도입 효율을 높이고 비특이적 결합을 줄이기 위해 새로운 세대의 poly (amino-co-ester) (PACE) 기반 폴리머가 개발되어 관심 mRNA 전달에 최적화되었다.
PACE 폴리머의 기본 토대는 엔도좀 파괴를 돕고 생물학적 조건에서 쉽게 가수 분해될 수 있는 절단 가능한 에스테르 모이어티를 갖는 분지형 아미노 그룹의 존재에 기반한다. PACE 기반 양이온성 고분자는 다른 종류의 양이온성 고분자에 비해 최소한의 세포 독성을 나타낸다. 고 분자량 (MW) PACE 폴리머는 더 많은 소수성 모이어티를 사용하여 합성되어 양이온 전하를 줄이고 전신 세포 독성을 줄였다. High MW PACE는 DNA의 상당한 축합과 안정적인 DNA 복합체 형성으로 인해 우수한 형질도입 효율이 있다.
본 발명에서 양이온성 폴리펩타이드의 종류는 특별히 한정되지는 않고, 전체 아미노산 잔기에 대한 염기성 아미노산 잔기의 비율이, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상인 염기성 RNA가 바람직하게는 사용된다.
특히, 염기성 아미노산 잔기만으로 구성되는 염기성 양이온성 폴리펩타이드가 바람직하게는 언급될 수 있다.
염기성 양이온성 폴리펩타이드로서, 아르기닌 및 라이신으로 구성되는 RNA가 특히 적합하게 언급될 수 있다.
구체적으로는, 폴리라이신, 또는 폴리아르기닌이 바람직하게는 사용된다.
또한, 양이온성 폴리펩타이드로서, 단일 아미노산 잔기로 구성되는 양이온성 폴리펩타이드, 또는 2종 이상의 아미노산 잔기로 구성된 양이온성 폴리펩타이드를 사용할 수 있다.
본 발명의 양이온성 생체적합성 폴리머는 중량 평균 분자량은 100 내지 100,000인 분자로, 예를 들면 양이온성 폴리펩티드, 양이온성 다당류, 양이온성 지질, 양이온성 표면활성제 및 합성 중합체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 양이온성 폴리펩티드는 프로타민(Protamine, PS), 세포 침투성 펩티드(CPP), 폴리-L-라이신(PLL: poly-L-lysine) 및 폴리아미도아민 (PAMAM: polyamidoamine)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 PS일 수 있다.
상기 양이온성 폴리펩타이드에 대한 후보자는 다양한 응용을 갖는 폴리 양이온성 펩티드인 프로타민(protamine)이다. 특히 약물 전달에 사용되며 주입된 인슐린 현탁액의 흡수를 지연시키는 효과가 보고되었다. 프로타민은 분자량이 5.8 kDa이고 염기성 아미노산, 특히 아르기닌 (70~80 %)이 풍부하므로 몰당 양이온이 1.26 ± 1025이다. 따라서 DNA와 복합체를 형성하면 프로타민은 DNA 인산염 그룹의 음전하를 중성화시킨다. 일반적으로 PEC(Poly-Electrolyte Complex)라고 불리는 이 물질은 물에서 해리될 수 있는 그룹을 포함하고 있는 생물학적 거대 분자의 고분자로 구성되어 상호 작용하여 전하를 띤 구성 요소를 만든다. PS는 동물의 정소 중에서 특히 연어를 포함한 어류의 정자 핵에 많이 존재하며, 히스톤과 같이 DNA와 회합 또는 해리를 통하여 유전정보 발현에 관여하는 단백질로 알려져 있다. 통상, 어류의 정자핵으로부터 추출되는 PS의 분자량은 약 4,000 내지 10,000이며, 구성 아미노산의 70% 이상이 아르기닌으로 존재하나 본 발명이 여기에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 PS는 프로타민 P1(Protamine P1), 프로타민 1(Protamine 1) 및 프로타민 2(Protamine 2)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 두 가지 이상의 단백질일 수 있다.
본 발명의 PS는 PS 자체 및 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 모두 포함한다. 구체적으로 본 발명의 PS의 염은 염산염 또는 황산염을 포함한 산성 물질에 의한 염 형태를 포괄한다. PS은 염 형성 없이도 물에 용해가 가능하며 염 형태 또한 물에 용해가 가능하므로 어떤 형태로든 사용 가능하다.
더 치밀한 '입자' 구조를 얻기 위해, PS에 acrylamide를 처리하여 변형된 형태(mPS로 표시)과 HA에 acrylate 그룹을 처리하여 변형된 형태(mHA로 표시)를 사용할 수도 있으며, 이 경우 최종 겔은 UV 조사를 통해 광 가교 결합에 의해 구축할 수도 있다.
폴리-L-라이신(PLL: poly-L-lysine)은 생분해설인 펩티드 결합으로 연결되어 있어 복합체와 이온복합체를 형성해서 세포 내로 전달될 수 있으나, 다소 독성을 나타내므로 단독으로 높은 전달효율을 나타내는 데에는 한계가 있어 CPP와 pH 의존성 CPP를 포함하는 엔도좀 파괴 물질이나 엔도좀 융합 펩티드 등을 부착시켜 사용할 수 있다.
현재 가장 흔히 사용되는 관심 mRNA의 안정화 물질은 양전하를 띠는 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI)이나 체내 독성이 있어 사용에 제한이 있는 단점이 있다. 이에 반하여 PS는 세포독성이 없으며 음전하를 띠는 세포막(엔도솜의 막)으로의 투과와 관심 mRNA의 엔도솜 탈출(endosomal escape)을 증진시켜 관심 mRNA가 안전하게 세포질로 방출될 수 있도록 하는 장점이 있다.
세포 침투성 펩티드(CPP)는 관심 mRNA을 세포로 운반하는 데 광범위하게 사용된다. CPP는 세포 내에서 관심 mRNA의 안정성과 생체 이용률을 증가시킨다. 따라서, 관심 mRNA을 전달하기 위한 CPP의 사용은 상당한 치료 이점을 가질 수 있다. 음으로 하전된 관심 mRNA을 양전하를 띤 펩티드에 결합시키는 일반적인 방법은 비공유 정전기 상호 작용이다.
상기 세포투과성 펩타이드(Cell Penetrating Peptides, CPP)에서 pH에 의해 세포투과성을 활성화하는 펩타이드는 (a) 유효농도(EC)이상의 높은 펩타이드 농도와 생리학적 pH 범위(pH 7.0)에서 막 투과성이 거의 없으며, (b) 엔도좀의 산성 pH 범위(pH5.5)와 유효농도(EC)이하 낮은 펩타이드 농도에서 막에 거대 분자 크기의 결함을 효율적으로 형성할 수 있으며 는 세포막투과를 증가시키는 도메인과 pH 의존성 막활성 도메인으로 구성된 펩타이드로 <표 3>에 제시하였다.
pH에 의해 세포투과성을 활성화하는 세포투과성 펩타이드(Cell Penetrating Peptides, CPP)
종류 아미노산서열 비고
Melittin GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ (서열번호 1) 넓은 pH 범위에서 막 활성화
LP GWWLALALALALALALASWIKRKRQQ (서열번호 2) 상동
Hylin a1 IFGAILPLALGALKNLIK (서열번호 3) 상동
LPE3-1 GWWLALAEAEAEALALASWIKRKRQQ (서열번호 4) 산성 pH에서 막 활성
pHD24 GIGAVLKVLATGLPALISWIKAAQQL (서열번호 5) 상동
본 발명에 따르면, 본 발명은 DNA와 RNA를 포함하는 관심 mRNA/PS 코어입자를 제공한다.
본 발명에 따르면, 상기 관심 mRNA/PS 코어입자는 관심 mRNA과 PS이 1:0.4 ~ 1:5 범위의 질량비로 혼합되어 제조되며 200 nm이하의 크기를 가지고 있고 양전하 특성을 보이는 특징이 있다.
상기 관심 mRNA 및 PS의 중량비는 1:0.2~5, 바람직하게는 1:0.4~3.0일 수 있다. w/w의 비가 1:2.5 이하의 환경에서는 더욱 응축되다가 1:5 이상으로 PS가 추가될 경우 입자가 마이크로 이상의 크기가 될 수 있다.
본 발명의 입자는 물리 화학적 안정성으로 고순도의 물에서 안정적으로 유지되지만, 콜로이드 시스템에 염을 첨가하면 입자는 빠르게 응집될 수 있다. 소위 '입자'라고 불리는 이들 1세대 관심 mRNA/PS 입자의 또 다른 단점은 입자에서부터 관심 mRNA의 낮은 방출일 수도 있다.
두 가지 문제를 극복하기 위해, 코어입자의 응집을 방지하기 위해 생분해성, 무독성 거대 분자, 음전하를 띤 나노입자 또는 염을 조사하였다. 또한, 관심 mRNA과 PS 사이의 세포 내 해리(dissociation)는 양친매성 생체 고분자, 음전하를 띤 나노입자 및 염으로 강화될 수 있다.
상기 음전하를 띤 나노입자는 은(Ag), 금(Au), 백금(Pt), 구리(Cu), 주석(Sn), 철(Fe), 니켈(Ni), 루테늄(Ru), 타이타늄 (Ti), 탄탈럼(Ta), 니오비움(Nb), 지르코늄(Zr), 알루미늄(Al) 등과 같은 전도성 금속원소 또는 이들의 금속산화물이 하나 또는 그 이상의 배합으로 합성된 그룹으로부터 선택되는 나노입자일 수 있다.
사람 혈청 알부민 (HSA)은 이러한 문제들을 해결할 수 있는 유망한 후보자일 수 있다. 약 65,000Da의 분자량과 생리 조건에서 약간 음의 표면 전하를 갖는 HSA는 및 미립자 제제 및 다른 의약품에서 널리 사용되는 무독성 거대 분자로 HSA는 보호 콜로이드이다. 이 콜로이드는 입자 매트릭스에만 작은 양으로 포획된다. 대부분의 거대 분자는 주변 매질에 남겨져 입자의 2차 응집을 억제한다. 높은 HSA 농도 (1000 ㎍/ml)에서 입자가 완전히 HSA로 코팅되어 이 보호 콜로이드에 의해 코어입자의 안정성이 연장될 수 있다.
양이온성 다당류의 예는 키토산(chitosan), 글리코키토산, 양이온성 셀룰로오스, 양이온화 구아 검 및 양이온화 전분을 포함한다.
본 발명은 양이온성 생체적합성 폴리머로 관심 mRNA 기반 요법에 사용된 모든 다당류 중에서, 관심 mRNA 전달에 매우 적합한 적용 가능한 특성 및 특징적인 특징을 강조하기 위해 키토산을 구체적으로 선택하였다. 키토산의 글루코사민 단량체에서 양으로 하전된 아미노 그룹 또는 히알루론산의 글루쿠론산 단위에서 음으로 하전된 카복실 그룹을 제공한다.
키토산과 같은 양이온성 다당류는 관심 mRNA과 정전기적으로 상호 작용하여 안정적으로 양으로 하전된 폴리플렉스를 형성할 수 있으며, 관심 mRNA의 가장 효율적인 세포내 전달은 양으로 하전된 나노 담체에 의해 명백히 달성된다. 이것은 두 가지 요소로 설명할 수 있다. 첫째, 음으로 하전된 관심 mRNA과의 효율적인 물리적 상호 작용은 뉴클레아제 분해로부터 이들을 보호한다. 둘째, 이들은 순 양전하를 제공하여 복합체의 세포의 음이온 표면과의 상호 작용을 향상시킨다.
발명에서 사용되는 양이온성 생체적합성 폴리머는, 전체 조성물의 중량을 기준으로, 1 내지 50중량%로 포함될 수 있고, 보다 구체적으로는 2 내지 40중량%, 보다 더 구체적으로는 3 내지 30중량%로 포함될 수 있다. 상기 양이온성 지질의 함량이 전체 조성물의 중량을 기준으로 1중량% 미만이면 관심 mRNA과 복합체를 형성할 수 있는 충분한 양이 되지 못하고, 50중량%를 초과하면, 나노입자의 크기가 너무 커져 나노입자의 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있다.
상기 양이온성 생체적합성 폴리머와 관심 mRNA은, 정전기적 상호작용을 통해 결합하여, 복합체를 형성한다. 구체적인 실시례으로서, 상기 관심 mRNA(P)과 양이온성 생체적합성 폴리머(N)의 전하량의 비율(N/P; 관심 mRNA의 음이온 전하에 대한 양이온성 생체적합성 폴리머의 양이온 전하 비율)은, 0.5 내지 100일 수 있고, 보다 구체적으로는 1 내지 50, 보다 더 구체적으로는 2 내지 20일 수 있다. 상기 비율(N/P)이 0.5 미만인 경우에는 충분한 양의 관심 mRNA을 포함하는 복합체를 형성하기 어렵기 때문에, 0.5 이상이어야 충분한 양의 음이온 약물을 포함하는 복합체를 형성할 수 있어서 유리하다. 반면, 비율(N/P)이 100을 초과할 시에는 독성을 유발할 우려가 있으므로, 100 이하로 하는 것이 좋다.
음이온성 생체적합성 폴리머
본 발명의 PEM은 상기 양이온성 생체적합성 폴리머층 외면에 코팅된 음이온성 생체적합성 폴리머 층을 포함한다.
상기 관심 mRNA로 이루어진 코어입자 입자 외면을 코팅하고 있는 양이온성 생체적합성 폴리머 층은 강한 양전하를 띠고 있어 조직 장벽을 통과하기 힘들다는 문제가 있다. 본 발명에서는 이러한 문제점을 해결하고자 생체 적합성이 좋으며 음전하를 띄고 있는 음이온성 생체적합성 폴리머를 사용하여 2차로 상기 양이온성 생체적합성 폴리머층 외면에 코팅하였다.
본 발명은 관심 mRNA, 양이온성 생체적합성 폴리머와 음이온성 생체적합성 폴리머를 혼합하여 입자를 제조할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 관심 mRNA과 이온 복합체를 형성하기 위하여 반드시 양이온성 생체적합성 폴리머를 더 포함한다. 즉 음전하의 관심 mRNA은 양이온성 생체적합성 폴리머와 정전기적 상호작용으로 인해 양이온성 생체적합성 폴리머 내부에 봉입된 이온 복합체를 형성하고, 형성된 이온 복합체는 음이온성 생체적합성 폴리머가 코팅하여 음이온성 생체적합성 폴리머층이 형성된 복합입자의 코어 부분에 위치한다.
상기 음이온성 생체적합성 폴리머 층 코팅단계는 음이온성 생체적합성 폴리머를 넣어 상기 입자 외면에 상기 음이온성 생체적합성 폴리머 층을 정전기적 인력으로 코팅하는 단계이다.
본 발명에 따른 복합입자는 필수 요소로서 음이온성 생체적합성 폴리머를 함유한다. 음이온성 생체적합성 폴리머는 인체에 대해 해가 없는 한 제한되지는 않고, 음이온성 생체적합성 폴리머의 예는 적합하게는 실크 단백질 피브로인, 혈청알부민을 포함하는 음이온성 단백질, 폴리글루타민산 및 폴리아스파르트산을 포함하는 음이온성 폴리아미노산, 한천, 히알루로난, 콘드로이틴 설페이트, 덱스트란 설페이트, 헤파란 설페이트, 데르마탄 설페이트, 푸코이단, 케라탄 설페이트, 헤파린, 카라기난, 석시노글루칸, 아라비아 고무, 잔탄 검, 알긴산, 펙틴 및 카르복시메틸 셀룰로오스 등의 음이온성 다당류, 폴리아크릴산 및 이의 염을 포함한다. 특히, 히알루로난, 폴리글루타민산 및 이의 염이 적합하게는 언급될 수 있다.
음이온성 생체적합성 폴리머로서, 시판 제품을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 음이온성 생체적합성 폴리머의 분자량은 제한되지 않고, 바람직하게는 100~100000 kDa, 보다 바람직하게는 200~50000 kDa 이다.
구체적으로, 음이온성 폴리펩타이드로서 실크 단백질 피브로인 (Silk protein fibroin), 글라이아딘 (Gliadin), 알부민를 포함하는 단백질은(체내에서 발견되는 pH 7.4의 물에서 이온화되었을 때)은 음전하를 띤다.
알부민은 Abraxane과 다른 유형의 나노 의학의 향후 개발에서 성공을 보장하는 몇 가지 이점을 제공한다. 1) 알부민은 인간 혈액의 구성 요소이다. 내인성 단백질 (인간 혈청 35-50g/L)로 면역 원성이 없으며 알부민 기반 나노 입자에 대한 생체 적합성을 보장한다. 2) 인간 혈액에서 알부민의 반감기는 평균 약 19 일이다. 유리 약물과 달리 알부민은 혈장 곡선하 면적 (AUC) 값을 개선하는 데 도움이 되는 긴 반감기를 제공하여 상대적으로 긴 시간에 약물 농도를 유지한다. 3) 알부민은 고체 형태의 나노 의약품에 대한 우수한 동결 보호제이며 건조된 나노 입자를 주사 용액에 즉시 재분산할 수 있다. 이러한 장점은 임상 번역 가능한 나노 의약 개발에서 일반적인 문제인 약물 방출 및 침전물 형성을 피함으로써 상온 안정성 나노 의약 개발에 유리하다.
일반적으로 나노 입자를 구성하는 데 사용되는 알부민에는 인간 혈청 알부민 (HSA)과 소 혈청 알부민 (BSA)의 두 가지 유형이 있다. 두 종류의 알부민 모두 혈청 알부민 단백질 (각각 사람 혈청 및 소 혈청)이며 물에 대한 높은 용해도, 혈액 내 긴 반감기, 유사한 분자량 (65-70 kDa), 유사한 수 등 많은 특성을 공유한다. 아미노산 잔기의 수 (HSA의 경우 585 개 아미노산, BSA의 경우 583 개 아미노산). 나노 의약을 구성하는 데있어 눈에 띄는 특성 차이는 없다. 따라서 두 종류의 알부민은 다기능 나노 입자를 설계하는 데 널리 사용되었다. 대체 알부민으로 개발된 기술은 쉽게 대체 될 수 있다.
생체내 고분자 물질중 하나인 혈청 알부민은 생체 적합성이 우수할 뿐 아니라, 혈액 내에서 반감기가 19일에 이르는 매우 안정한 단백질로서 암조직과의 친화성이 우수하여 효과적인 암 축적능을 보인다. 따라서, 혈청 알부민은 다양한 저분자량 화학 약물, 단백질, 항체 등과 화학적으로 결합되어, 여러 약물의 생체 내에서의 안정성을 향상시키고 관심 암부위로 그 약물을 효과적으로 전달하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 대관심 소수성 항암제인 독소루비신이나 메토트렉세이트 등을 화학적으로 알부민에 결합시켜 암 관심성을 향상시키고, 약물의 혈액내 안정성을 향상시킨 연구가 보고된 바 있다. 또한, 알부민의 약물 전달체로서의 이용에 관하여는, 알부민의 암 조직에 대한 높은 관심성에 기초하여 암이 이식된 소동물에 알부민에 형광체를 붙이거나 방사선 동위원소로 표지하여 주입한 뒤 이를 영상화했을 때 많은 양의 알부민이 암 조직에 선택적으로 축적되는 것이 보고되었으며, 이는 암 조직 주변의 느슨한 혈관에서 발생하는 증가된 침투 지연 (The Enhanced Permeability and Retention; EPR) 효과에 의해서 나타나는 것임을 알 수가 있다. 이와 같이 항암제 전달체로서의 알부민의 우수함은 알려진 바 있으나, 알부민 자체만으로는 강한 음전하를 띠는 siRNA 전달체로서 사용하기에는 결합력이 부족하다. 따라서 알부민의 고유한 특성은 유지하되 결합력을 증가시킬 수 있도록 변형이 필요하다.
히알루로난 염 및 폴리글루타메이트 염을 형성하는 염으로서, 소듐, 포타슘, 칼슘, 암모늄, 마그네슘, 염기성 아미노산 염 등이 언급될 수 있다.
보다 구체적으로는, 음이온성 다당류로서 히알루로난 또는 이의 염을 사용하는 경우, 분자량이 바람직하게는 100~2000 kDa, 더욱 바람직하게는 200~1500 kDa인 히알루로난 또는 이의 염을 사용할 수 있다.
또한, 음이온성 생체적합성 폴리머로서 폴리글루타민산 또는 이의 염을 사용하는 경우, 분자량이 바람직하게는 500~30000kDa, 보다 바람직하게는 1000~20000 kDa, 더욱 바람직하게는 1500~15000 kDa 인 폴리글루탐산 또는 이의 염을 사용할 수 있다.
음이온성 생체적합성 폴리머의 음이온화도는 특별히 한정되지는 않고, 양이온성 폴리펩타이드와의 복합입자의 형성을 촉진하는 관점에서, 하한은 바람직하게는 0.1 이상, 보다 바람직하게는 0.2 이상이다.
다른 한편으로, 양이온성 폴리펩타이드와 복합입자를 형성하는 관점에서, 음이온성 다당류의 음이온화도에 대한 특별한 상한은 없다. 기준으로서, 음이온화도가 2 이하인 음이온성 다당류를 사용할 수 있다.
이와 관련하여, 표현 "음이온화도" 는 이하의 식에 따른 계산에 의해 얻어질 수 있는 값을 나타낸다.
{(폴리머에 함유되는 음이온성 관능기의 수) - (폴리머에 함유되는 양이온성 관능기의 수)｝/ 폴리머를 구성하는 모노머의 총량
본 발명의 음이온성 다당류는 헤파린(heparin), 히알루론산(hyaluronic acid), 콘드로이틴황산(chondroitin sulfate), 카복시 메틸 셀룰로스(Carboxy methyl cellulose), 펙틴(Pectin), 카보폴스(Carbopols), 폴리아크릴레이츠(Polyacrylates) 및 음이온성 지질에서 선택될 수 있다.
상기 음이온성 지질은 포스파티딜세린, 포스파티드산, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜 글리세롤로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
상기 음이온성 다당류는 음전하를 띄며 생체적 합성이 있는 분자를 제한없이 사용할 수 있다.
헤파린은 히드록시기, 카복실기 및 아미노기를 포함하는 구조로, 비분획 헤파린, 분자량 헤파린, 저분자량 헤파린, 헤파린 단편, 재조합 헤파린, 헤파린 유사체, 헤파란 설페이트, 헤파린 활성을 갖는 설폰화된 다당류 등을 사용할 수 있다.
상기 히알루론산(HA)은 기본단위로 디사카라이드 글루쿠로닌산-β(1-3) N-아세틸글루코즈-아민β(1-4)이 최고 50,000쌍으로 구성된 큰 복합 올리고사카라이드이다. 이는 세포외 매트릭스의 주요 성분으로써 생체내에서 발견된다. 이의 3차 구조는 직경이 약 50㎚인 무작위(random) 코일 형태이다.
히알루론산(HA)은 전신 또는 국소적으로 인체의 질병과 질환을 치료하는데 사용되어 왔는 데 그 이유는 질병 또는 질환이 있는 부위로 활성물질을 관심 제공하는 능력이 있기 때문이다. 실험동물에서 손상된 경동맥(손상이 안 된 대측 동맥에 대해)과 대장암에서 HA가 형성됨을 볼 수 있고 이와 같은 실험동물의 피부에 유지된다는 것이 알려져 있다. 본 발명에서 사용 가능한 상기 음이온성 다당류로의 중량 평균 분자량은 5 ~ 90 K 범위일 수 있다.
히알루론산 등의 상기 음이온성 다당류층은 상기 양이온성 폴리펩타이드층 외면에 정전기적 인력으로 코팅된다. 상기 코어입자와 상기 히알루론산의 중량비가 1:0.5~2(코어입자:HA) 범위일 수 있다.
본 발명의 히알루론산(hyaluronic acid)은 아미노산과 우론산으로 이루어지는 복잡한 다당류의 하나로 세포독성이 없는 천연 분자 물질이며 체내 안정성이 뛰어나고 상기 히알루론산을 흡수할 수 있는 다양한 수용체가 존재하는 장점이 있다. 체내에 존재하는 히알루론산 수용체 중 CD44 수용체는 대부분의 암세포에 과발현되는 수용체로서 암을 선택적으로 관심하는 치료제의 타겟으로 사용될 수 있다.
상기 음이온성 생체적합성 폴리머 층은 최외곽층을 형성하고, 따라서, 상기 복합입자도 그 외부가 (-)전하를 나타낸다. 정상 피부의 경우에는 입자 표면의 정전기적 성질이 피부의 투과에 영향을 약간 미치긴 하는데, 양이온성 성질이 이를 더 높인다고 알려져 있다. 하지만, 피부 같은 경우에는 피지 지질(sebaceous lipid)과 상피 인지질(epidermal phospholipid)에서의 지방산의 구조가 손상되며, 이러한 결과로 인한 피부의 산성도(acidity)의 감소는 본 발명과 같이 (-) 성질을 띤 음이온성 복합입자의 침투를 용이하게 만든다.
본 발명의 약물 조성물은 약학적 유효성분인 관심 mRNA(코어), 양이온성 생체적합성 폴리머층(중간층) 및 음이온성 생체적합성 폴리머층(최외각층)로 구성되며, 입자 크기는 50~500nm, 바람직하게는 100~400nm, 더욱 바람직하게는 150~300nm 일 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 코어로 제공되는 약학적 유효성분으로 복합체 하이드로겔보다 입자 사이즈가 감소되었다.
본 발명은 상기 관심 mRNA과 양이온성 폴리펩타이드로 이루어진 코어입자의 외면층과 히알루론산 층을 더 포함하므로 생체 내 관심 mRNA을 분해시키는 효소로부터 관심 mRNA을 보호할 수 있다.
또한, 본 발명은 마이크로 사이즈 또는 이에 준하는 나노 사이즈의 크기를 갖는 약학적 유효성분으로 하는 관심 mRNA을 응축시켜 나노 사이즈로 입자 크기를 줄이고, 또한, 최외곽층을 (-) 전하를 띄는 히알루론산으로 코팅함에 따라 피부 장벽 통과가 용이한 입자를 제공할 수 있다.
천연 다당류
천연 다당류는 <표 4>에 제시하였으며, 동물 (예: 키토산, 히알루론산), 식물 (예:전분, 셀룰로오스, 시클로 덱스트린, 펙틴), 조류 (예:알기네이트) 또는 박테리아 (예:덱스트란)에서 얻을 수 있다. 농업 및 식품 산업에서 화장품, 제약 및 생의학 분야에 이르기까지 광범위한 응용 분야가 있다. 다당류는 중성 또는 하전, 선형 또는 분지형 및 다양한 정도의 친수성을 갖는 탄수화물 구조를 형성하는 단당류에 의해 형성된다.
다당류의 종류
Animal Polysaccharides
Chitin
Chitosan
Glycosamminoglycans
Vegetal Polysaccharides
Land Vegetal Marine Vegetal
Cellulose
Pectins
Galactomannans
Acacia gum
Starch 		Alginate (Phaeophyceae brown seaweed)
Agar (Rhodophyceae red seaweed)
Carragenans (Rhodophyceae red seaweed)
-
-
Microorganis/Fungi
Alginate (Pseudomonas aeruginosa and Azotobacter vinelandii)
Dextran (Leuconostoc spp. and Lactobacillus spp.)
Gellan (Pseudomonas elodea)
Pullulan (Aureobasidium pullulans)
Scleroglucan (Sclerotium glucanicum) Xanthomonas campestris
Xanthan (Xanthomonas campestris)
약물 전달을 위한 의약품에 천연 다당류가 널리 사용되는 것은 생체 적합성, 생분해 성 및 저독성이다. 또한 후자의 독성을 완화하기 위한 전략으로서 합성 재료와 조합하여 사용되어왔다. 이들의 구조적 다양성은 최종 적용의 필요에 따라 각 경우에 가장 적합한 다당류를 선택할 수 있게 하며, 더욱 중요한 것은 그들의 기능적 그룹에 대한 화학적 변형에 의해 기능적 특성이 조정되고 최적화 될 수 있다는 점이다.
많은 천연 다당류는 특정 작용기의 존재로 인해 생물학적 접착 특성을 가지므로 체류 시간이 개선된 나노 캐리어 디자인, 특히 장 및 폐 응용 분야에 유용한 출발 물질이 된다. 이러한 기의 존재는 또한 그의 전달 또는 표적화 능력을 향상시키기 위한 중합체 구조의 특정 변형을 허용한다. 또한, 천연 다당류는 중성 (예를 들어, 셀룰로오스, 풀루란, 전분, 덱스트란), 음으로 (예를 들어, 히알루론산, 알기네이트, 콘드로이틴 설페이트), 또는 양으로 하전된 (예를 들어, 키토산) 일 수 있다.
관심 mRNA 기반 요법에 사용된 모든 다당류 중에서, 본 발명자들은 관심 mRNA 전달에 매우 적합한 적용 가능한 특성 및 특징적인 특징을 강조하기 위해 히알루론산을 구체적으로 선택하였다. 히알루론산은 점막 점착성 폴리머이지만, 반대 전하를 가지고 있어 관심 mRNA 전달에 그 사용에 크게 영향을 미친다. 이러한 중요한 차이는 화학적 구조로부터 유래하는데, 이는 히알루론산의 글루쿠론산 단위에서 음으로 하전된 카복실 그룹을 제공한다.
한편, 관심 mRNA 발현카세트와 히알루론산과 같은 음이온성 다당류와의 회합은 사구체 모세관 벽을 통한 관심 mRNA 배출을 피함으로써 생체 이용률을 향상시킬 수 있다. 실제로, 음으로 하전된 종은 사구체 막의 음전하로 확립된 반발력으로 인해 "필터링이 불가능하다".
변형된 이온성 분자
<변형된 양이온 분자>
본 발명에 따르면, 상기 관심 mRNA과 양이온성 폴리펩타이드는 정전기적 상호작용으로 결합되어 있으며, 상기 양이온성 폴리펩타이드에 공유결합된 담즙산 또는 그의 유도체는 친수성의 이온성 기를 가진 형태로 입자의 표면에 위치하게 할 수도 있다.
담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 1종 이상의 양이온성 폴리펩타이드 및 복합체를 포함하고, 상기 공유결합된 담즙산 또는 담즙산 유도체는 이온성 기를 가지고 있는 입자를 제공한다.
본 발명의 입자는 담즙산 또는 이의 유도체가 공유결합된 양이온성 폴리펩타이드 및 복합체 간의 정전기적 상호작용으로 형성되거나, 담즙산 또는 이의 유도체가 공유결합된 음이온성 다당류, 양이온성 폴리펩타이드 및 관심 mRNA 간의 정전기적 상호작용으로 형성된 것으로, 보다 안전하게 관심 mRNA의 세포 내재화를 유도할 수 있다.
즉, 본 발명의 코어입자는 양이온성 폴리펩타이드와 관심 mRNA가 입자의 코어에 존재하며, 친수성의 이온성 기를 가지는 담즙산이 입자의 표면에 위치하는, 담즙산이 표면 수식된 형태의 입자이다.
상기 관심 mRNA을 관심 세포로 전달하기 위하여 본 발명의 담즙산이 표면 위치하는 입자를 사용하는 경우 장 점막을 통해 복합체를 잘 전달함과 동시에 입자의 코어에 존재하는 이온 복합체로 인하여 위장관에서 매우 안전하였다. 이로부터 본 발명에 따른 복합체 전달용 입자는 경구 투여용으로 매우 적합함을 알 수 있다.
본 발명에서 상기 담즙산 또는 이의 유도체는 이온성 분자와 공유결합될 수 있는 작용기 이외에 친수성의 이온성 기를 가지고 있다. 상기 이온성 분자는 디옥시콜린산 (DCA: deoxycholic acid), 우로디옥시콜린산 (taurodeoxycholic acid), 타우로콜린산 (TCA: taurocholic acid), 글리코콜린산(glycocholic acid) 및 글리코케노디옥시콜린산(glycochenodeoxycholic acid)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 담즙산은 소장의 회장 부분을 통해 95%이상의 높은 효율로 흡수가 되어 간으로 흡수되는데 이를 '장간 순환(enterohepatic circulation)'이라 하며, 이러한 장간 순환으로 지질 이동에 중요한 역할을 하는 생물학적 계면활성제로, 말단 장 부분에 존재하는 ASBT(apical sodium-dependent bile acid transporter)에 의해 특이적으로 인식되므로, 경구 전달에 있어서 관심 리간드로 작용할 수 있다.
즉, 회장 부분을 통해 흡수가 이루어지는 답즙산은 상기 관심 mRNA 전달용 입자의 표면에 위치함으로써 ASBT를 통하여 기존의 경구 투여 방식의 가장 큰 문제점인 장 내벽을 통한 상기 관심 mRNA 전달용 입자의 타겟 세포내 흡수를 증대시키는 역할을 한다. 이로 인하여 본 발명의 관심 mRNA 전달용 입자는 담즙산을 흡수하는 회장 부분을 통해 흡수가 용이하므로 경구용으로 사용될 수 있으며, 이로 인하여 약물의 생체내 이용률을 증대시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 담즙산 또는 이의 유도체는 이온성 분자의 작용기 수에 따라 공유결합되는 정도가 달라질 수 있다. 바람직하게 상기 담즙산 또는 이의 유도체 및 이온성 분자는 1:1 내지 1:300의 몰비로 공유결합될 수 있다.
바람직하게, 상기 담즙산 또는 이의 유도체 및 키토산의 경우 1:1 내지 1:100의 몰비로 공유결합될 수 있다.
바람직하게, 상기 담즙산 또는 이의 유도체 및 헤파린의 경우 1:1 내지 1:30의 몰비로 공유결합될 수 있다.
바람직하게, 상기 담즙산 또는 이의 유도체 및 히알루론산의 경우에는 1:1 내지 1:200의 몰비로 공유결합될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 관심 mRNA 입자는 입자 크기에 관계없이 흡수가 가능하나, 바람직하게는 500 nm 이하일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 100 내지 300 nm이다.
본 발명에 있어서, 관심 mRNA과 상기 담즙산 또는 담즙산 유도체가 이온결합된 이온성 분자는 1:0.5 내지 1:70의 질량비, 바람직하게는 1:0.5 내지 1:5의 질량비로 결합될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 담즙산 또는 담즙산 유도체가 이온결합된 복합체 및 양이온성 폴리펩타이드는 1:0.5 내지 1:10, 바람직하게는 1:0.5 내지 1:5 질량비로 혼합될 수 있다. 양이온성 폴리펩타이드가 결합할 수 있는 한계가 있고 최적의 강한 결합능력을 가질 수 있는 범위에서만 전달이 가능하기 때문에 상기 범위 내에서 양이온성 폴리펩타이드와 관심 mRNA의 정전기적 상호작용에 따른 이온복합체의 형성이 잘 이루어진다.
<변형된 음이온 분자>
또한, 본 발명은 담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 1종 이상의 음이온성 다당류, 관심 mRNA을 포함하는 관심 mRNA/양이온성 폴리펩타이드 입자를 포함하고, 상기 공유결합된 담즙산 또는 담즙산 유도체는 이온성 기를 가지고 있는 관심 mRNA 입자를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 타우로콜린산은 담즙산의 일종으로 체내에서 분비되어 소화과정 중 지질 또는 비타민의 흡수를 돕는 물질로 알려져 있으며 장간 순환을 통해 90%이상 재흡수되는 특징이 있다. 상기 타우로콜린산은 소화과정에서 소장 말단에서 ASBT(Apical Sodium dependent Bile acid Transporter)에 의하여 대부분이 흡수된다. 따라서 타우로콜린산을 히알루론산에 결합하여 입자를 제조하면 소장에서의 경구 흡수율을 향상시킬 수 있으며 장간 순환을 통한 전달성이 향상되는 장점이 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 히알루론산(hyaluronic acid)-타우로콜린산(taurocholic acid) 결합체를 제공한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 히알루론산-타우로콜린산 결합체는 히알루론산과 타우로콜린산이 1:1~1:100 범위의 첨가몰비(feed mole ratio, 히알루론산:타우로콜린산)로 혼합되어 제조되며 음전하를 띠는 특징이 있다.
상기 히알루론산-타우로콜린산 결합체가 양전하의 특성을 띠면 양전하의 특성을 가지는 관심 mRNA/PS 결합체와 결합할 수 없는 단점이 있다.
본 발명에 따르면, 상기 히알루론산-타우로콜린산 결합체는 히알루론산과 타우로콜린산이 1:1~1:100 범위의 첨가몰비(feed mole ratio, 히알루론산:타우로콜린산)로 혼합하여 제조할 수 있다. 바람직하게는 상기 히알루론산-타우로콜린산 결합체는 히알루론산과 타우로콜린산이 1:1~1:50 범위의 첨가몰비로 혼합하여 제조할 수 있으며 보다 바람직하게는 1:10 범위의 첨가몰비로 혼합하여 제조할 수 있다.
상기 히알루론산과 타우로콜린산을 1:1 범위 미만의 첨가몰비로 혼합하여 제조하면 복합체/PS를 코팅하는데 효율적이지 않으며 상기 히알루론산과 타우로콜린산을 1:100 범위를 초과한 첨가몰비로 혼합하여 제조하면 결합비율이 유사한 히알루론산-타우로콜린산 결합체만이 만들어지므로 경제적으로 효율적이지 않다.
본 발명의 경구투여용 복합체 입자는 상기 관심 mRNA/PS가 히알루론산-타우로콜린산 결합체에 의해 코팅된 형태를 가진다.
상세하게는 본 발명의 경구투여용 복합체 입자는 내부에 상기 관심 mRNA/PS가 위치하고 상기 관심 mRNA/PS의 표면에 상기 히알루론산-타우로콜린산 결합체가 코팅된 형태를 가지며 음전하의 특성을 가지고 입자의 직경이 250nm 이하이며 상기 관심 mRNA/PS 단백질의 봉입률이 90% 이상인 특징이 있다.
상기 관심 mRNA/PS 입자의 직경이 100nm를 초과하면 하기 HA-TCA 결합체의 코팅으로 제조된 관심 mRNA/PS/HA-TCA 복합입자의 크기가 250nm를 초과하여 입자로서의 장점이 사라질 수 있으므로 이를 고려하여 상기 관심 mRNA/PS 코어입자의 직경이 100nm 이하가 되도록 제조하는 것이 바람직하다. 또한 상기 관심 mRNAPS 코어입자의 전하특성이 음전하를 띠게 되면 음전하를 띠는 HA-TCA 결합체와의 결합(코팅)이 어려운 단점이 있으므로 상기 관심 mRNAPS 코어입자가 양전하를 띠도록 제조하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 관심 mRNAPS/HA-TCA 복합입자의 약제학적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
PEGylated Hyaluronic Acid (HA)은 주요 히알루로난 중합체 사슬에 부착된 다중 PEG 중합체 측쇄가 있는 그래프트 공중 합체이다. Hyaluronic Acid는 폴리에틸렌 글리콜 모노메틸에테르 중합체로 작용화되며 PEGylated HA는 고급 하이드로 겔 및 제어된 약물 전달에 사용될 수 있다.
Ⅷ. PEMN 제조
상기 발명의 PEMN의 제조방법을 자세히 살펴보면 하기와 같다.
상기 PEMN을 제조하는 단계는 압출 균질화, 상류 압력(upstream pressure) 균질화, 고압(high pressure) 균질화, 초고압(ultra-high pressure) 균질화 및 나노구조체를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
상기 상류 압력은 20 ~ 60 MPa이고, 고압은 최대 150 ~ 200 MPa이며, 초고압은 최대 350 ~ 400 MPa일 수 있다.
1) 압출 균질화
본 발명은 높은 압출 압력을 이용하여 실시한다. 더 높은 압력하에서 행해진 압출은, 더 낮은 압력하에서 행해진 다른 동일한 압출보다 높은 유속을 가질 것이고, 막힘과 오염이 덜 이루어지며, 막이 생산 공정 동안 고도의 오염이나 막힘을 견뎌내고, 보다 작은 크기의 PEM을 생산한다. 사용될 수 있는 압력은 사용된 압출 장치와 막의 내성에 의해서만 제한된다. 약 400psi보다 큰 압력이 사용된다.
본 발명에서의 방법과 장치들은 어떠한 원하는 평균 직경의 PEM이라도 만드는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 상기에 설명한 대로, 막은 원하는 평균 PEM 직경과 비슷한 평균 구멍 직경을 가진 것이 선택된다. 평균 PEM 크기는 본 명세서에서 기술한 바와 같이, 예를 들면 압출된 PEM을 추가적으로 한번 이상 더 압출하거나, 여러 겹의 막을 사용하거나, 더 얇은 막을 사용하거나, 압출 압력을 증가시키거나 PEM을 처리함으로써 감소시킬 수 있다. PEM의 크기는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려진 어떠한 기술을 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 방법이나 장치들을 이용하여 생산된 PEM은 어떠한 공정 기술이라도 이용하여 더 처리되어질 수 있다. 오염 정도를 감소시키기 위해서 앞쪽과 뒤쪽 방향으로 번갈아 가면서 막을 통과시킨다. 압출된 PEM의 평균직경은 고주파를 이용한 파쇄(sonication)에 의해 더 감소시킬 수 있다. 간헐적인 고주파를 이용한 파쇄 순환수는 효율적인 PEM 합성으로 유도하는 조건은 Dynamic Light Scattering(DLS) 평가로 스크리닝할 수 있다.
본 발명의 방법과 장치들은 어떠한 수로 겹쳐 쌓인 막을 이용하여 실시할 수 있다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 기술 중 하나는 더 많은 수의 쌓인 막들을 통한 압출은 더 적은 수의 쌓인 막들을 통한 다른 유사한 압출보다 더 낮은 유속을 나타내고, 더 작은 평균 직경을 가진 PEM을 생산하게 된다. 겹쳐 쌓이는데 사용되는 막의 수는 단지 압출 장치의 내성에 의해서만 제한된다. 바람직한 실시예로, 쌓여진 더미(stack)는 2 내지 10개 사이의 막으로 이루어진다. 가장 바람직한 실시예로, 쌓여진 더미는 2 내지 5개 사이의 막으로 이루어진다. 다른 바람직한 실시예로, 쌓여진 막들은 사실상 동일하다. 다른 바람직한 실시예로, 쌓여진 더미에서 적어도 하나의 막은 더미 속 다른 막들 중 적어도 하나와 다르다. 차이점은 압출에 영향을 주는 어떤 성질에 있다고 할 수 있다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 예를 들면 막의 조성, 코팅, 구멍크기, 구멍밀도, 구멍각, 구멍모양 또는 막 크기에 차이점이 있다고 할 수 있다.
압출은 단일막이나 쌓여진 막들을 통하여 여러번 통과시켜 실행될 수 있다. 만일 쌓여진 막을 이용한 실시예가 압출에 사용된다면, 원하는 직경의 PEM을 얻기 위하여 여러 번 통과시키는 것은 불필요할 수 있다. 특히, 단계적으로 감소하는 방법이 사용된다. 단계적으로 감소하는 방법에서, 현탁액을 여러 번 통과시키는 것은 구멍직경이 줄어드는 막을 통해 이루어진다. 단계적으로 감소하는 방법의 특히 바람직한 실시예로, 첫째로 약 0.4㎛의 구멍 직경을 가진 막을 통하여 수행하고, 둘째로 약 0.2㎛의 구멍직경을 가진 막을 통하여 하며, 필요하다면 세 번째, 네 번째, 다섯 번째, 여섯 번째로 약 0.1㎛의 구멍직경을 갖는 막을 통하여 수행한다.
막은 수세식 약품(flushing agent)으로 처리될 수 있다. 막은 압출보다 선행하여 수세식 약품으로 처리될 수 있다. 막은 적어도 한번의 통과가 이루어진 후와 적어도 막을 통하여 이루어진 한번 이상의 통과보다 선행하여 수세식 약품로 처리될 수 있다. 수세식 약품은 막히거나 오염된 막구멍으로부터 물질을 제거하거나 막힘, 오염이나 '체가름효과(sieving effect)'를 생기게 하는 것을 예방하는 어떠한 종류의 물질이나 조성물도 가능하다. 수세식 약품은 유기알콜로 이루어진다. 수세식 약품은 에탄올로 이루어진다.
적합한 막을 수용하고 높은 압출 압력을 견뎌낼 수 있는 어떠한 압출 장치라도 본 청구된 발명의 방법과 장치를 실시하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 압출장치와 본 발명의 방법을 실시하는데 유용한 장치들은 친수성, 구부러진 구멍이나 친수성이고 구부러진 구멍을 가진 스크린 막으로 이루어져 있다. 막은 폴리에스테르(PETE) 막이다.
압출 장치는 그 위에 덮개와 수집 용기로 구성되어있는데, 덮개는 압력과 액체에 내성이 있는 밀봉에 의해 막의 첫 면에 조작 가능하게 붙어있으며, 수집 용기는 압출된 현탁액이 생성되면 이를 받기 위해 막의 두 번째 면에 배치된다. 장치는 추가적으로 막 받침대나 기구로 구성된다. 압출장치는 수용성 현탁액이 번갈아 가며 앞쪽과 뒤쪽 방향으로 막을 통하여 압출될 수 있도록 배치되어진다. 압출 장치는 접선의 흐름을 이용한다.
적절한 막에 적합하고 본 발명에 사용될 수 있는 상업적으로 구입 가능한 장치들은 THE MINI-EXTRUDERTM(Cat. No.610000, AVANTI R Polar Lipids,Inc., 미국), Liposome Extruder(Part No.ER-1, Eastern Scientific, 미국), EMULSIFLEX R-C50 Extruder(Cat. No. EFC50EX, Avestin,Inc., 케나다), LIPOSOFASTTM (Avestin,Inc. 케나다), LIPEX TM Extruders (Northern Lipids Inc., 케나다)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
압출 장치는 높은 압출 압력을 견디는 능력이 있어야 한다. 일반적인 규칙으로, 보다 큰 압력은 향상된 성능을 가져오는데, 예를 들면 증가된 유속, 줄어든 막 오염과 막힘, 압출된 PEM의 크기에 있어서 더 빠른 감소를 나타낸다. 최소한으로, 압출장치는 약 400psi보다 큰 압출압력을 견딜 수 있어야 한다. 또한 유효한 표면적을 최적화시켜주는 막 받침대 홀더나 덮개가 그것이 받는 압출압력을 견딜 수 있다면 사용될 수 있다. 카트리지 홀더 장치는 막의 조작을 최소화시켜주는 장점과 막을 쌓는데 더 큰 효율을 제공한다. 게다가, 카트리지 홀더 장치는 생산에서 전체적으로 향상된 효율을 제공하는데, 예를 들면 막히거나 오염된 카트리지 홀더 장치를 교환하는 중에 생산물 흐름이 새로운 카트리지 홀더 장치 쪽으로 바뀌는 동안 막히거나 오염된 막이 교환될 수 있기 때문이다.
2) 압력 균질화
식품 및 유제품 에멀젼의 안정화를 위한 균질화는 1900년 최대 30MPa의 압력을 사용한 "밀크 혼합" 제품이 시초이다. 그 이후로 기존의 균질화는 압력 범위를 50MPa까지 확장하였다. 동적 HPH라고도 하는 HPH는 식품 저온 살균에 대한 잠재력으로 자주 강조되었다. 최신 초고압 균질화기는 기존 압력보다 10-15 배 높은 압력을 가능하게 하며 300~400MPa의 압력 범위를 구현하며, 이러한 범위를 UHPH라고 한다. UHPH 기술은 종래의 균질화와 동일한 원리에 기초하나, 그 작용이 동적 고압의 적용으로 인해 야기된 압력 강하, 비틀림 및 전단(shear stress), 난류(turbulent flow), 캐비테이션(cavitation), 충격파, 온도 증가와 같은 여러 메커니즘의 결과로 신생 물리적 기술과 연관될 수 있다.
균질화 처리, 특히 동적 고압이라고도 하는 초고압 균질화 (UHPH)를 사용할 수 있다. UHPH는 최근 식품, 화장품 및 제약 분야에서 연구된 새로운 기술로 분산액 또는 에멀젼의 입자를 조각화하고, 미세하고 안정적인 에멀젼을 생성하고, 입자 크기 감소로 인한 유체의 점성 특성을 수정하고, 대사산물 추출도 용이하게 하고 있다. 미생물, 효소 또는 일부 바이러스의 불활성화를 달성하기 위해. 실제로 UHPH는 최소한 저온 살균과 동등한 수준에서 미생물 부하를 현저하게 감소시키는 추가 이점을 제공하는 연속 공정이다. 압력 수준에 따라 이 기술을 고압 균질화 (HPH, 최대 150 ~ 200 MPa) 또는 초고압 균질화 (UHPH, 최대 350 ~ 400 MPa)라고 한다. 비교를 위해 표준 균질화는 낙농 산업에서와 같이 20 ~ 60 MPa의 상류 압력으로 작동한다. UHPH는 고압 (HP) 기술의 최신 개발, 즉 HP 강화제 개발, 고압에 강한 재료 (스테인레스 스틸, 세라믹, 씰)의 개념을 통해 이점을 얻었다. UHPH 장비를 위해 특별히 개발된 세라믹으로 제작되거나 인조 다이아몬드로 코팅된 시트와 바늘이 있는 정교한 균질화 밸브가 350 ~ 400 MPa까지의 압력을 견딜 수 있는 밸브가 현재 연구되고 있다.
본 발명에서 제조된 PEMN은, Dynamic Light Scattering(DLS)라고도 알려진 quasi-electric light scattering(QELS)은 Bloomfield, 1981, A nn. Rev. Biophys. Bioeng. 10: 421-50에서 기술된 바와 같이 이용될 수 있다. 바람직한 실시예로, PEM은 약 50 내지 400nm 사이의 평균 직경을 갖는다. 보다 바람직한 실시예로, 평균 직경은 약 50 내지 150nm 사이이다. 보다 더 바람직한 실시예로, 평균 직경은 약 100 내지 150nm 사이이다.
본 발명에서 제조된 PEMN의 다분산 지수(polydispersity index)는 0.01 내지 0.5일 수 있다. 예를 들어, PEMN의 다분산 지수는 0.01 내지 0.45, 0.01 내지 0.4, 0.01 내지 0.35, 0.01 내지 0.3, 0.01 내지 0.2, 0.01 내지 0.19일 수 있다. 본 명세서에서 다분산 지수는 다분산 정도를 나타내는 것으로, 수치가 작을수록 단분산을 나타낸다. 단분산성은 입자의 크기가 균일함을 의미한다.
본 발명에서 제조된 PEMN은 입자 크기가 50 ~ 400 나노미터이고 다분산지수 (PDI)는 0.3 이하일 수 있다.
본 발명에서 제조된 PES은 유효성분 관심 mRNA이 일정한 속도를 방출될 수 있다.
본 발명에서 제조된 PEMN은 최외각층을 구성하는 생체적합성 폴리머 또는 그와 결합한 리간드에 의한 능동적 약물 전달체일 수 잇다.
본 발명에서 제조된 PES은 주사제, 크림 및 구강 점막 투여로 사용할 수 있다.
본 발명에서 제조된 PES은 이온성 염, 소분자 약물, 고분자 약물, 약물을 포함하는 고분자 약물 및 형광물질을 포함하는 고분자를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 고분자 약물은 단백질, 항체 및 관심 mRNA을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 PES의 치료적 유효량을 개체에게 투여하고, 이에 의해 질병을 치료하는 과정을 포함하는 이를 필요로 하는 개체에서 질병을 치료할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
실시례 1. 관심 mRNA 카세트의 제조
본 발명에서 관심 mRNA 발현 카세트에 대한 주형 DNA 절편은 먼저 관심 mRNA에 대한 주형 DNA(관심 ORF DNA)를 설계하고, 이어서 <T7 promoter(서열번호 1) - 5'UTR(서열번호 2) - 관심 ORF DNA - muag(서열번호 14) - A64(서열번호 15) - C30(서열번호 16) - 히스톤-SL(서열번호 17)> 순서로 설계한 mRNA 발현 카세트 주형 DNA를 합성하였다(TriLink Biotenologies 사, 미국).
본 발명에서 설계된 7종류의 CAR mRNA에 대한 주형 DNA은 하기와 같다
HLA-G에 대해 CAR DNA 설계는 HLA-G의 scFv는 15E7 또는 LFTT-1이며, <human IL7(서열번호 44) - F2A(서열번호 41) - human CCL19(서열번호 45)> DNA의 존재 유무를 고려하여 4종류를 제조하였다.
① 항 HLA G 15E7 CAR DNA는 <CD8 리더(서열번호 37) - 항 HLA G scFv 15E7(서열번호 46) - CD8 힌지(서열번호 39) - CD8 막 관통 도메인)(서열번호 22) - CD28 세포내 도메인(서열번호 29) - CD3ζ(서열번호 27)> 순서일 수 있다. 상기 항 HLA G scFv 15E7(서열번호 46)대신에 LFTT1(서열번호 47)를 사용할 수도 있다.
② 항 HLA G 15E7 CAR IL7/CCR19 DNA는 <CD8 리더(서열번호 37) - HLA G scFv 15E7(서열번호 46)- CD8 힌지(서열번호 39) - CD8 막 관통 도메인)(서열번호 22) - CD28 세포내 도메인(서열번호 29) - CD3ζ(서열번호 27) - F2A(서열번호 41)- human IL7(서열번호 44) - F2A(서열번호 41) - human CCL19(서열번호 45)> 순서일 수 있다. 상기 항 HLA G scFv 15E7(서열번호 46)대신에 LFTT1(서열번호 47)를 사용할 수도 있다.
③ 항 LILRB4 CAR DNA는 <CD8 리더(서열번호 37) - 항 LILRB4 scFv(서열번호 33 + 서열번호 38+ 서열번호 35) - CD8 힌지(서열번호 39) - CD8 막 관통 도메인)(서열번호 22) - CD28 세포내 도메인(서열번호 29) - CD3ζ(서열번호 27)> 순서일 수 있다. 서열번호 33은 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 하나 그리고 서열번호 35는 서열번호 35 및 서열번호 36로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 하나를 사용할 수도 있다.
④ 항 LILRB4 CAR IL7/CCR19 DNA는 <CD8 리더(서열번호 37) - 항 LILRB4 scFv(서열번호 33 + 서열번호 38+ 서열번호 35) - CD8 힌지(서열번호 39) - CD8 막 관통 도메인)(서열번호 22) - CD28 세포내 도메인(서열번호 29) - CD3ζ(서열번호 27) - F2A(서열번호 41)- human IL7(서열번호 44) - F2A(서열번호 41) - human CCL19(서열번호 45)> 순서일 수 있다.
⑤ 항 FITC CAR-IL7/CCL19 DNA는 <CD8 리더(서열번호 37) - 항 FITC scFv(서열번호 40) - CD8 힌지(서열번호 39) - CD8 막 관통 도메인(서열번호 22) - CD28 세포내 도메인(서열번호 29) - CD3ζ(서열번호 27) - F2A(서열번호 41) - [mouse IL7 - F2A - mouse CCL19](서열번호 42)> 순서일 수 있다.
⑥ 항 사람 CD20 CAR-IL7/CCL19 DNA는 <CD8 리더(서열번호 37) - 항 사람 CD20 scFv(서열번호 43) - CD8 힌지(서열번호 39) - CD8 막 관통 도메인(서열번호 22) - CD28 세포내 도메인(서열번호 29) - CD3ζ(서열번호 27) - F2A(서열번호 41)- human IL7(서열번호 44) - F2A(서열번호 41) - human CCL19(서열번호 45)> 순서일 수 있다.
⑦ CD19-CAR1 DNA는 <CD8 리더(leader)(서열번호 37) - CD19 sCFv(서열번호 46) - CD8 힌지(서열번호 39) - CD8 막 관통 도메인(서열번호 22) - FC-γ 수용체(서열번호 49) - GFP(서열번호 50)> 순서일 수 있다.
⑧ CD19-CAR2 DNA는 <CD8 리더(서열번호 37) - CD19 scFv(서열번호 46) - CD8 힌지(서열번호 39) - CD8 막 관통 도메인(서열번호 22) - CD28 세포내 도메인(서열번호 29) - CD3ζ(서열번호 27) - IRES(서열번호 18) - GFP(서열번호 50)> 순서일 수 있다.
⑨ MSLN-CAR DNA는 <CD8 리더(서열번호 37) - MSLN(Mesothelin) sCFv(서열번호 47) - CD8 힌지(서열번호 39) - CD8 막 관통 도메인(서열번호 22) - CD28 세포내 도메인(서열번호 29) - CD3ζ(서열번호 27) - IRES(서열번호 18) - GFP(서열번호 50)> 순서일 수 있다.
⑩ HER2-CAR DNA는 <CD8 리더(서열번호 37) - HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) sCFv(서열번호 48) - CD8 힌지(서열번호 39) - CD8 막 관통 도메인(서열번호 22) - CD28 세포내 도메인(서열번호 29) - CD3ζ(서열번호 27), IRES(서열번호 18) - GFP(서열번호 50)> 순서일 수 있다.
4종류의 세포외기질 분해 효소 mRNA에 대한 주형 DNA(관심 ORF DNA)는 Hyaluronidase PH20(서열번호 58), HYAL 1 (서열번호 59), MMP1 (서열번호 60) 및 MMP 9 (서열번호 61)이다.
상기에서 합성된 관심 mRNA 발현 카세트에 대한 주형 DNA 절편을 주형으로 정방향 플라이머 5'-GAATTCTAAT ACGACTCACT ATAGGGGAGA CCACAACGGT TTCCCTCTAG AAAGAACCAT GAACACGATT AACA-3' (서열번호 62) 및 역방향 프라이머 5'-GGATCCTGGTG GCTCTAAAA GAGCCTTTGG-3' (서열번호 63)을 사용하여 증폭하였다. 여기서 T7pol의 관심 서열에 밑줄이 그어져 있다. 사용된 프라이머의 양 말단은 EcoRI/BamHI 인식서열이 포함되어 있다.
증폭된 PCR 산물을 EcoRI/BamHI 효소를 사용하여 절단한 다음, EcoRI/BamHI 효소로 선형화된 pUC19 벡터와 T4 DNA ligase를 이용하여 클로닝하였다. 상기 반응용액을 대장균에 형질도입하고 선정된 균주에서 플라스미드를 분리하여 EcoRI/BamHI 제한효소를 처리한 후 전기영동을 하였다(도 2).
본 발명에서는 캡된 화학적 변형이 있는 뉴클레오타이드를 포함하는 관심단백질 ORF으로 이루어진 관심 mRNA를 아래와 같이 제작하였다.
캡된 관심단백질 mRNA을 합성하기 위하여, 먼저 <T7 promoter - 5'UTR - 관심단백질 ORF DNA - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL>을 가지는 DNA가 삽인된 pUC19 벡터를 주형으로 정방향 프라이머 서열번호 46 및 역방향 프라이머 서열번호 47을 사용하여 증폭하였다. 여기서 T7pol의 관심 서열에 밑줄이 그어져 있다. 상기 PCR 산물을 주형으로 체외전사하였다(도 3).
상기 PCR 산물, T7 promoter-관심 단백질 DNA를 주형으로 HighYield T7 ARCA mRNA Synthesis Kit (m5CTP/Ψ-UTP) (Jena BioSCienCe, 미국)를 이용하여 캡된 관심 단백질 변형 mRNA를 포함하는 발현카세트를 시험관 내에서 합성하였다.
구체적으로 살펴보면, anti-reverse Cap analog [(ARCA) (3′-O-Me-7mG(5′)ppp(5′)G Cap analog라고도 부름)] 및 화학적 변형된 뉴클레오타이드 포함하는 반응용액 (6 mM ARCA, 1.5 mM GTP, 7.5 mM 5-Methyl-CTP, 7.5 mM Pseudo-UTP, 7.5 mM ATP)에서 체외전사를 하였다. dsDNA 주형을를 제거하기 위해서 DNA nuClease를 첨가하였고, 남아있는 캡된 관심단백질 변형 mRNA는 에탄올 침전법 또는 spin Column membrane을 이용하여 정제하였다.
대조군으로 T7 promoter-관심 단백질 DNA 주형에서 얻은 RNA 전사체에 5′Cap 구조를 부가한 캡된 관심단백질 mRNA 합성은 Hiscribe™ T7 ARCA mRNA Kit(NEB, 미국)를 이용하여 실시하였는데, 천연 캡(m7G(5')ppp(5')G; m7GpppG)을 부가하여 제조하였다.
실시예 2. 고분자 전해질 구조체(PES)의 설계
상기 선택된 관심 mRNA과 양이온성 생체적합성 폴리머를 혼합하여 자기조립으로 제조되는 입자를 PEC(polyectrolyte complexes)라고 지칭하였다. 본 발명에서 하기 관심 mRNA과 한 종류의 양이온성 생체적합성 폴리머(Protamine, PS 또는 PBAE-447)으로 이루어진 PEC 1.0 및 관심 mRNA과 두 종류의 양이온성 생체적합성 폴리머(PS/양이온성 지질)로 이루어진 PEC 2.0로 구분하였다. 상기 관심 mRNA도 1종류 이상을 선택할 수 있으며, RNA에서 각각에서 선택되어진 하나 이상을 혼합하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 PEC 1.0 또는 2.0의 제조는 음이온성 관심 mRNA 및 양이온성 생체적합성 폴리머를 반응용액 내에서 30초간 연속적으로 와동(vortexing)하면서 혼합한 현탁용액에 음이온성 생체적합성 폴리머를 첨가하여 30초간 연속적으로 와동 또는/및 초음파 처리를 하여 반응이 끝난 후, 상온에서 1시간 동안 안정화시키는 제1 방법을 사용하였다.
상기 선택된 관심 mRNA, 양이온성 생체적합성 폴리머와 음이온성 생체적합성 폴리머를 혼합하여 자기조립으로 제조되는 입자를 'PEM'이라고 지칭하였다. 상기 관심 mRNA, 양이온성 생체적합성 폴리머 및 음이온성 생체적합성 폴리머는 각각에 1종류 이상을 선택할 수 있으며, 선택되어진 생체적합성 폴리머를 혼합하여 PEM(Polyelectrolyte multilayer)을 제조할 수 있다.
상기 제조한 PEC 코어입자에 음이온성 생체적합성 폴리머에서 선택되어진 1종류 이상을 첨가하여 PEM(Polyelectrolyte multilayer)을 제조할 수 있으며, 반응이 끝난 후, 상온에서 1시간 동안 안정화시키는 제2 방법을 사용하였다.
음이온성 관심 mRNA, 양이온성 생체적합성 폴리머 및 음이온성 생체적합성 폴리머를 반응용액 내에 30초간 연속적으로 와동 또는/및 초음파 처리를 하여 반응이 끝난 후, 상온에서 1시간 동안 안정화시키는 제3 방법을 사용하였다.
선택된 기판에 음이온성 관심 mRNA, 양이온성 생체적합성 폴리머 및 음이온성 생체적합성 폴리머를 교대로 층적하는 free standing layer by layer 층적 기술로 제조되고 용출되는 막을 제조하는 제4 방법을 사용하였다. 바람직하게, 기판에 처음 음이온성 생체적합성 폴리머를 적층하였다. 상기 적층된 음이온성 층에 양이온성 생체적합성 폴리머, 유효성분 음이온성 관심 mRNA, 양이온성 생체적합성 폴리머, 유효성분 음이온성 관심 mRNA을 적층하고 이를 한 단위체로 하여 반복적으로 증착하고 최외각 층은 양이온성 생체적합성 폴리머 또는 음이온성 생체적합성 폴리머를 선정하여 제조하였다. 이어서 다양한 방법으로 제조된 PEM을 용출하였다. 각각 층을 제조한 다음 세척용액에서 제조된 층이 있는 기판을 담구어 세척하였다.
실시례 3. 표적화 폴리머
본 발명에서 음이온성 mRNA 카세트는 양이온성 폴리머인 프로타민, PBAE-447, DOTAP 또는 키토산과 상호작용하여 고분자 전해질 복합체(polyelectrolyte complexes, PEC)를 제조할 수 있다. 여기서 양이온성 폴리머에 면역세포에 특이적인 결합을 하는 리간드를 포함시킬 수 있으며, 이를 '폴리머-리간드'라고 명명하였다. 예시적으로 PS인 경우 'PS-리간드'라고 하였다.
음이온성 mRNA 카세트는 양이온성 폴리머인 프로타민, PBAE-447, DOTAP 또는 키토산과 상호작용하여 코어입자를 형성하고 이어서, 음이온성 폴리머 인간혈청알부민(HSA), 폴리글루탐산(PGA) 또는 히알루론산(HA)으로 코팅하여 다층 고분자 전해질(polyelectrolyte multilayer, PEM)을 제조할 수 있다. 여기서 최외각 층을 구성하는 음이온성 폴리머에 면역세포에 특이적인 결합을 하는 리간드를 포함시킬 수 있으며, 이를 '폴리머-리간드'라고 명명하였다. 예시적으로 HA인 경우 'HA-리간드'라고 하였다.
상기 리간드는 암세포의 표면분자에 특이적으로 강력하게 결합하는 물질로 항체, 펩티드 및 압타머를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나일 수 있다.
본 발명에서 제조된 PEC 또는 PEM을 초음파 처리, 압출방법 및 고압 균질화에 의해 균질화한 나노입자를 제조할 수 있다.
3.1. 압타머 접합체
<표 1>에 제시한 면역세포 및 이들의 표면 단백질을 제시하고 있다. 본 발명에서는 면역세포에서 T 세포 및 NK 세포를 표적화하는 구조체를 제조하기 위해 최외각 층을 구성하는 폴리머에 이들의 특이 단백질에 결합하는 리간드를 선택하였다.
본 실시례에서 NK 세포를 표적화하기 위해 사용되는 리간드는 CD16 압타머(Plater B, Hock B, et al. (2011) Bi-specific Aptamers Mediating Tumour Cell Lysis. J Biol Chem 286: 21896-21905.)이며 서열번호 70이다.
5'-GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTC-3' (서열번호 70)
본 실시례에서 CD8+T 세포를 표적화하기 위해 사용되는 리간드는 CD8 압타머(Kacherovsky N, et al. (2019) Traceless aptamer-mediated isolation of CD8+ T cells for chimeric antigen receptor T-cell therapy. Nat Biomed Eng. 2019 Oct;3(10):783-795.)이며 서열번호 71이다
5‘-CCAGAGTGACGCAGCAACAGAGGTGTAGAAGTACACGTGAACAAGCTTGAAATTGTCTC TGACAGAGGTGGACACGGTGGCTTAGT-3’ (서열번호 71)
상기 압타머는 3‘말단에 아민기 또는 티올기(Thiol group)가 도입된 단일가닥 DNA 구조로 유기합성하였다(TriLink Biotechnologies 사, 미국).
3.1.1 HA-압타머 접합체
본 발명의 HA-압타머 접합체는 3'말단에 아민기가 있는 압타머를 EDC 화학을 사용하여 HA의 카르복실기와의 1단계 커플링 반응에 의해 제조하거나 EDC/NHS 화학을 사용하여 HA의 카르복실기와의 2단계 커플링 반응에 의해 제조할 수 있다.
일반적으로, 카르복실 산을 1차 아민에 표지하고 가교하기 위해서 폴리머의 카르복실 반응성 화학 그룹에는 카르보디이미드 화합물 EDC 및 DCC을 일반적으로 사용하여 1단계 또는 EDC/NHS를 이용하여 2단계로 할 수 있다. 바람직하게, 항체, 펩타이드 및 인간혈청알부민(HSA)의 카르복실기에 동일하게 적용할 수 있다.
간단히 말해서, 83 kDa HA (1g, 20μmol, Sigma Aldrich 사, 미국)를 질소하에서 5 시간 동안 200mL의 멸균증류수에 용해시켰다. EDC (100.4 mg, 0.52 mmol, Thermo Fisher, 미국)) 및 NHS (60.7 mg, 0.52 mmol; N-hydroxysuccinimide; Thermo Fisher, 미국)를 HA 용액에 첨가하였다. 20분 후, 제조된 압타머-아민기 (99.4 mg, 0.52 mmol)를 천천히 첨가하였다. 0.1 M HCl을 사용하여 pH를 5.5로 조정하고 용액을 실온에서 밤새 반응시켰다. 미 반응 잔류물 및 부산물은 증류수 (pH 5)에서 투석막 (MW Cut off = 100 kDa)으로 제거되었다. 최종 제품은 동결 건조하고 -20℃에서 보관하였다.
3.1.2. HA-DAB-압타머 접합체
1) HA-DAB-압타머 접합체 합성
3'말단에 티올기가 있는 압타머는 다음과 같이 HA-DAB-압타머를 제조하였다. HA, 프로타민 및 인간혈청알부민(HSA)의 카르복실기에 동일하게 적용할 수 있다.
먼저, HA-DAB(1,4-diaminobutane)는 분자량 100kDa인 HA(100g)의 카르복실기(Carboxyl group)를 pH 6.0에서 EDC 및 1-히드록시 벤트리아졸 모노하이드레이트(1-hydroxy bentriazole monohydrate, HOBt)로 활성화 시킨 다음, 1,4-디아미노부탄(1,4-diaminobutane, DAB)을 첨가하여 합성하였다. 이 때 반응 시간을 1시간, 6시간, 24시간으로 다양하게 하여 서로 다른 치환율을 가진 합성물을 수득하였다. 상기와 같이 수득된 합성물을 여과 튜브(Cut off 100kDa)를 이용하여 여과 정제하여 HA-DAB를 제조하였다.
이어서, 상기 제조된 HA-DAB에 이황화 결합을 도입된 HA-DAB-SPDP를 제조하였다. 구체적으로, 상기 합성된 HA-DAB (20 mg; 4.8 x 10-5몰)와 숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate; SPDP) (5.6 mg; 1.8 x 10-5몰) 를 섞고 반응시켜 HA 체인에 피리딜기(pyridyl group)를 도입하고 여과 튜브(MW Cut off = 100 kDa)를 이용해 여과 정제하였다.
정제된 HA-DAB-SPDP는 TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine)를 처리하고 343nm에서 흡광도를 측정하여 피리딜기의 농도를 계산하였다(피리미딜기 농도: 34 mM).
상기 제조된 HA-DAB-SPDP 용액에 3'말단에 티올기(Thiol group)가 도입된 EGFR 압타머를 상기 피리미딜기 농도의 0.2 몰 배에서 1배의 다양한 비율로 첨가하여 이황화 결합으로 HA-DAB-압타머 접합체를 합성하였다.
이 때 합성된 HA-DAB-압타머는 HA 100kDa 한 분자당 접합된 압타머의 개수를 2개에서 15개 사이로 조절할 수 있다.
2) HA-DAB-압타머 접합체 확인
상기 합성된 HA-DAB-압타머 접합체의 생성을 확인하기 위하여 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)를 이용하였다. 상기 HPLC 조건은 superdex 200 10/300 GL (GE Health) 컬럼을 사용하였고 이동상은 pH 7.0 50 mM 포스페이트 버퍼 (phosphate buffer), 흐름 속도는 0.5ml/min를 사용했고 210nm와 260nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과는 도 4이며, 이를 바탕으로 합성물을 분리 정제하였다. 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, HA-DAB-압타머 접합체 생성률(반응률)은 약 64%로 확인되었다.
상기 접합체 생성률(반응률)은 다음의 식으로 계산하였다:
반응률(%) = {(접합체 생성에 소요된 압타머 수준)/(반응 초기에 첨가한 압타머 수준)}X100
또한 분리 정제된 합성물은 아가로스 젤 전기영동을 통해 합성 여부 및 환원제(TCEP)에 의한 분해 여부를 확인하여, 그 결과를 도 5a 내지 5d에 기재하였다.
도 5a는 두 가지 다른 Cross linker로 합성된 HA-DAB-압타머 접합체를 아가로즈 전기영동을 통해 분석한 결과이다. 구체적으로, 도 5a에서, HA-ss-압타머는 HA와 압타머 사이에 이황화결합(-ss-)이 포함된 접합체를 의미하고, HA-압타머는 이황화결합이 아닌 일반적인 공유결합으로 연결되어 있는 접합체(대조군)를 의미한다. 오른쪽 두 컬럼에서 보는 바와 같이, 환원제인 TCEP를 처리했을 때 이황화결합이 포함된 접합체에서는 압타머가 분리되어 아래 부분에 밴드가 나타나는데 비하여, 대조군에서는 압타머가 분리되지 못하고 그대로 윗부분에 남아있는 것을 확인할 수 있다.
또한, 도 5b 내지 5d는 HA-DAB-압타머 접합체의 안전성을 평가하기 위하여 HA-DAB-압타머 접합체에 FBS를 첨가하여 시간별로 아가로즈 전기영동을 통해 남아있는 압타머의 양을 확인하였다(도 5b 및 도 5d에서 HA-압타머 Conjugate는 HA-DAB-압타머 접합체를 의미함). 그 결과 HA-DAB-압타머 접합체는 HA-DAB-압타머 접합하지 않은 압타머(naked 압타머)에 비해 오랜 시간 동안 분해되지 않고 남아있는 것을 확인할 수 있다.
3.2. 항체 접합체
<표 1>에 면역세포 및 이들의 표면 단백질을 제시하고 있어 이를 참조하여 면역세포에 대한 표적화 항체를 결정하였다. 본 발명에서는 면역세포에서 NK 세포 및 T 세포를 표적화하는 구조체를 제조하기 위해 최외각 층을 구성하는 폴리머에 이들의 특이 단백질에 결합하는 리간드를 결정하였다.
항 인간 CD8α 항체 및 항 인간 CD16 항체(Invitrogen 사, 미국)를 구입하였다. 15 kD의 폴리글루탐산(Alamanda Polymers, 미국)을 물에 용해시켜 20mg/mL를 형성하고 10분 동안 초음파 처리하였다. 물에 4mg/mL EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, Thermo Fisher, 미국)의 동일한 부피를 첨가하고, 용액을 실온에서 5분 동안 혼합하였다. 제조된 활성화된 PGA를 인산염 완충 식염수(PBS)에서 4:1 몰비로 항체와 결합하고 실온에서 4시간 동안 혼합하였다. 연결되지 않은 PGA를 제거하기 위해 용액을 Amicon Ultra Centrifugal Filters (50K MWCO)를 통해 정용 여과하였다. 항체 농도는 280nm에서의 흡광도에 의해 결정하였다.
카르복실 산을 1차 아민에 표지하고 가교하기 위해서 폴리머의 카르복실 반응성 화학 그룹에는 카르보디이미드 화합물 EDC 및 DCC을 일반적으로 사용하여 1단계 또는 EDC/NHS를 이용하여 2단계로 할 수 있다.
실시예 4. PEC 1.0
4.1. PEC 1.0의 제조
멸균 증류수(DW), PBS 완충액 (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1.8 mM; pH 7.4) 또는 페놀 레드가 없는 RPMI 1640 세포 배지를 사용하여 관심 mRNA 및 PS를 각각 2.5mg/mL 스톡 용액으로 준비하였다.
상기 선택된 관심 mRNA은 n개의 뉴클레오티드을 포함하고 있어 분자당 n-1개의 음전하이고 또는 1 몰당 1.8 × 1025 음전하이다. 상기 PS 분자량이 5.8 kDa이고 염기성 아미노산, 특히 아르기닌 (70~80 %)이 풍부하여 몰당 양이온이 1.26 × 1025이다. PS는 관심 mRNA 인산염 그룹의 음전하를 중성화시킨다. 따라서, 이론적으로는 상기 선택된 관심 mRNA과 PS의 전하 비율(Charge ratio)이 1:0.4 이상, 즉 관심 mRNA은 1이고 PS가 0.4이상으로 관심 mRNA PEC를 제조할 수 있다.
상기 양이온성 PS를 음이온성 관심 mRNA 용액에 첨가하며 PS와 관심 mRNA 사이의 상호작용이 일어났으며 PS와 관심 mRNA의 혼합물도 자발적으로 입자를 형성할 수 있다.
본 발명의 관심 mRNA 기반 PEC은 상기 관심 mRNA과 PS(Protamine) (㎍/mL)의 중량비는 30:15~150, 바람직하게는 30:15~90, 더욱 바람직하게는 30:75 조건으로 멸균증류수(DW) 또는 등장액(CM)에서 관심 mRNA/PS 입자로 이루어진 PEC을 제조하였다.
본 발명에서 PS로 구성된 수용액에 관심 mRNA을 첨가하여 입자를 제조하였으며, 이를 관심 mRNA/PS PEC 1.0 또는 PEC 1.0이라고 지칭하였다.
그런 다음, 반응물을 상온에서 1시간 동안 안정화하고 동결건조하여 제조한 관심 mRNA/PS PEC 1.0을 수득하였다.
상기 결과들은 선택된 관심 mRNA에만 한정된 것이 아니라 다른 관심 mRNA에도 일반적으로 관찰되었다.
입자는 Phoenix RS-VA10 Vortexer (Phoenix Instrument,독일) (10 초, 25W) 및 SpeedMixerTM DAC 150.1 CM 41 (HausChild & Co KG, 독일) (5 분, 3000rpm)을 사용할 수도 있다.
4.2. PEC 1.0의 평가
4.2.1. PS가 PEC 1.0의 크기에 미치는 영향
실시예 4.1항에서 제조된 PEC 1.0의 크기는 Malvern Zetasizer 3000 HSA(Malvern Panalytical technologies, 영국)로 광자 상관 분광법(Photon Correlation SPEMtroscopy, PCS)으로 결정하였다. PEC 1.0의 크기는 평균 유체 역학적 직경(mean hydrodynamic diameter, dh)으로, 크기 분포의 폭은 다분산 지수(polydispersity index, PDI)로 표현하였다. PEC 1.0의 크기 분포 계산을 위한 소프트웨어 데이터 분석은 비음수 제한 최소 제곱의 피팅 방법(Fitting method of non-negative constrained least-squares, NNLS)을 기반으로 하였다. 측정은 구성성분을 첨가한 혼합물의 배양 1시간 후 수행하였다.
본 발명의 연구결과에 따르면, Malvern Zetasizer 3000 HSA 로 측정한 PCS 결과, 첫 단계에서 관심 mRNA과 PS의 초기 복합입자가 형성되었고 강한 양으로 하전된 PS을 추가로 첨가하면 관심 mRNA/PS 입자는 자기조립으로 형성하였다.
도 6을 살펴보면, 상기 PEC 1.0-DW 시료는 관심 mRNA:PS-리간드(㎍/ml) 비율이 30:15에서 매우 큰 입자이고 큰 크기 분포(PDI >0.2)가 관찰되었다. 관심 mRNA:PS-리간드 비율이 약 30:45 질량비 이상에서부터 PS-리간드 농도를 증가시킴으로써 PEC 형성이 관찰되었다. 작은 크기 분포를 갖고 가장 적절한 크기로 안정된 복합입자는 관심 mRNA:PS (㎍/ml) 비율이 30:60 질량비보다 높은 PS-리간드 농도에서 제조할 수 있다.
도 6을 살펴보면, PEC 1.0-CM 시료는 낮은 PS 농도에서 작은 크기 분포(PDI ≤0.2) 및 약 50nm의 dh를 나타내었고 PS 농도가 증가하면서 증가하다가 안정화되었다. 관심 mRNA:PS 비율이 약 30:60 질량비보다 더 높은 PS 농도에서, PEC 1.0-CM은 PEC 1.0-DW 시료와 비교 가능한 dh 및 크기 분포 데이터를 나타내었다.
본 발명의 PEC 1.0은 상기 관심 mRNA과 PS (㎍/mL)의 중량비는 30:15~150, 바람직하게는 30:15~90, 더욱 바람직하게는 30:75 조건으로 증류수(DW)에서 이상적인 약물 전달체의 성질을 보유하고 있다.
PS-리간드 농도가 입자 크기에 미치는 영향을 연구한 결과, 등장액(CM)에서는 안정한 작은 monomodal size 분포를 갖는 관심 mRNA/PS PEC 1.0을 제조하기 위해서는 관심 mRNA:PS 비는 최소 30:60 질량비가 이상적이다.
상기 연구결과는 이론적인 예상과 유사하다. 양이온성 생체적합성 폴리머인 PS-리간드의 양으로 하전된 질소(N)와 mRNA의 음으로 하전된 인(P)사이의 비율에 의해 PEC 1.0의 물리 화학적 입자 특성과 생물학적 활성이 결정된다. 여기에 주어진 N/P 비율은 1mol 단위 전하를 운반하는 무게를 계산하여 얻을 수 있다.
2000개의 염기로 구성된 관심 mRNA은 약 340.5g/mol의 음전하이다. 따라서 1g 관심 mRNA은 2.94mmol 음전하와 같다. 생리학적 pH에서 RNA 백본에 있는 인산염 그룹은 인산염 그룹의 관련 pKa를 기반으로 음이온성이다. PS의 양전하 양은 제조업체가 제공한 황산염 농도에 따라 결정된다. PS은 물질 1g 당 3.6mmol의 양전하를 가지고 있다. 전위차 적정(보충)은 pH 7.2 (제조 조건)에서 0.35 mmol이 결합한다. 요약하면, 1g 물질은 2.94mmol 음전하 관심 mRNA 및 3.6mmol 양전하 PS에 해당한다.
상기 결과들은 선택된 mRNA에만 한정된 것이 아니라 다른 관심 mRNA에서도 일반적으로 관찰되었다.
4.2.2. 봉합 및 방출
PEC 1.0의 제조는 양전하의 PS와 음전하의 관심 mRNA을 혼합하여 정전기적 상호작용에 따라 입자 형태를 형성한다. 형성된 PEC 1.0는 안정화를 위해 30분간 상온에서 놓아두었다. PS와 관심 mRNA의 혼합을 위한 용매는 관심 mRNA의 분해를 방지하기 위해 DEPC 처리된 RNase-free 용매를 사용하였다.
관심 mRNA과 PS의 결합 확인은 2% agarose gel에서 전기영동을 수행하여 측정하였다. 관심 mRNA은 0.5 μg/ml의 EtBr로 염색하였으며, 1x TBE buffer를 이용해 80 Volt 조건에서 20분 동안 전기영동을 수행하였다.
PS에 의한 관심 mRNA 봉입 결과를 확인하기 위하여 관심 mRNA과 PS-리간드의 질량비에 따라 제조된 PEC 1.0의 전기영동상 밴드의 이동정도를 확인하였다. 관심 mRNA을 흡착하는데 필요한 관심 mRNA/PS (㎍/ml) 비율은 30:15, 30:30, 30:60, 30:75, 30:90 및 30:150으로 관심 mRNA를 PS와 혼합하여 반응시키고 1시간 동안 안정시키고 원심 분리하여 상징액(supernatant)을 전기영동하여 조사하였다.
<도 7>를 살펴보면, PEC 1.0의 관심 mRNA/PS (㎍/ml) 비율 30:15 질량비에서 82% 미결합 관심 mRNA가 발견되었다. 30:30의 질량비에서 40% 관심 mRNA은 용액에 남아있었다. 30:75, 30:90 및 30:150 질량비에서는 관심 mRNA은 정량적으로 입자 형태로 존재하였다. 이는 양전하를 띠는 PS의 영향으로 PS의 첨가량이 증가할수록 관심 mRNA과 강하게 반응하여 더욱 안정한 입자 형태를 형성한 것이다. PEC 1.0에서 관심 mRNA:PS (㎍/ml) 비율 1:1 이상에서 PS가 증가함에 따라 mRNA와 PS 복합체가 강력하게 형성함을 알 수 있다. 이는 기존 다른 보고와 유사한 경향이다.
PEC 1.0의 안정성과 관심 mRNA의 방출은 PBS에서 37℃에서 조사하였다. 24 시간 후, 관심 mRNA:PS 비율 30:90 및 30:150 조건에서 관심 mRNA 방출이 발생하지 않았다. 30:75 조건에서 관심 mRNA의 작은 방출을 보였으며 8.0 %의 미결합 관심 mRNA가 발견되었다. PEC의 관심 mRNA:PS (㎍/ml) 비율 30:15 질량비 비율 90.0 %, 30:30 질량비에서 63.0%의 관심 mRNA가 용액에서 발견되었다.
PEC 1.0에서 관심 mRNA:PS(㎍/ml) 비율 1:1 이상에서 PS가 증가함에 따라 mRNA는 PS-리간드과 강력하게 결합하여 방출정도가 매우 났다. 이는 기존 다른 보고와 유사한 경향이다.
상기 결과들은 선택된 관심 mRNA에만 한정된 것이 아니라 다른 관심 mRNA에서도 일반적으로 관찰되었다.
실시예 5. PEC 2.0
5.1. PEC 2.0의 제조
양이온성 생체적합성 폴리머인 PS와 DOTAP를 함께 사용하여 PEC 2.0을 제조할 때의 농도는 PS로부터 생기는 양전하의 비율은 15% (저), 45%/55% (중), 85% (고)로 다양하게 하였다.
세 가지 다른 조립 경로로 제조하였는데, PS/관심 mRNA 코어로 시작하여 DOTAP를 추가하는 공정(PS), 또는 그 반대로 DOTAP/관심 mRNA 코어로 시작하여 PS을 추가하는 공정(DC), 그리고 먼저 관심 mRNA, DOTAP와 PS를 혼합하는 공정(MP)으로 PEC 2.0을 제조하였다.
그런 다음, 반응물을 상온에서 1시간 동안 안정화하고 동결건조하여 제조된 관심 mRNA/PS/DOTAP PEC 2.0을 수득하였다.
입자는 Phoenix RS-VA10 Vortexer (Phoenix Instrument,독일) (10 초, 25W) 및 SpeedMixerTM DAC 150.1 CM 41 (HausChild & Co KG, 독일) (5 분, 3000rpm)을 사용할 수도 있다.
5.2. PEC 2.0의 평가
양이온성 생체적합성 폴리머인 PS와 DOTAP의 양으로 하전된 질소(N)와 mRNA의 음으로 하전된 인(P) 사이의 비율에 의해 PEC 2의 물리 화학적 입자 특성과 생물학적 활성이 결정된다. 여기에 주어진 N/P 비율은 1mol 단위 전하를 운반하는 무게를 계산하여 얻을 수 있다.
2,000개의 염기로 구성된 관심 mRNA은 약 340.5g/mol의 음전하이다. 따라서 1g 관심 mRNA은 2.94mmol 음전하와 같다. 생리학적 pH에서 RNA 백본에 있는 인산염 그룹은 인산염 그룹의 관련 pKa를 기반으로 음이온성이다. PS의 양전하 양은 제조업체가 제공한 황산염 농도에 따라 결정된다. PS은 물질 1g 당 3.6mmol의 양전하를 가지고 있다. 전위차 적정(보충)은 pH 7.2 (제조 조건)에서 0.35 mmol이 결합한다. DOTAP의 분자량은 698.5g/mol이고 분자 당 하나의 4차 아민 그룹이다. 따라서 pH 값과 관계없이 이온화된다. DOTAP g 당 양전하량은 1.43mmol이다. 요약하면, 1g 물질은 2.94mmol 음전하 관심 mRNA, 3.6mmol 양전하 PS 및 1.43mmol 양전하 DOTAP에 해당한다.
따라서, 모든 PEC 2.0은 최종 N/P 비율 2에서 이상적으로 제조할 수 있다. 이는 실시례 2.1항에서 PEC 1.0의 제조에서 PS 농도가 입자 크기에 미치는 영향을 연구한 결과와 유사하다. 실시례 2.1항의 결과로 등장액에서는 안정한 작은 monomodal size 분포를 갖는 관심 mRNA/PS PEC 1.0을 제조하기 위해서는 관심 mRNA:PS (㎍/ml) 비율은 최소 30:60 질량비가 이상적임을 확인하였다.
각 조립 경로에 대해 PS와 DOTAP의 세 가지 다른 N/P 비율 조성이 제조되었다. 0.3/1 중간체인 PS(저), DC(고)의 경우 mRNA는 양이온 생체적합성 폴리머에 부분적으로만 결합하였다. 따라서 최종 PS(저) 및 DC(고) 입자의 경우 두 번째로 추가되는 물질과 미리 형성된 입자 및 유리 RNA와의 상호작용을 고려해야 하며, 이는 더 복잡한 PEC 2.0 구성으로 이어질 수 있다.
제한된 크기 (입자 크기 <300 nm, PDI <0.3)를 갖는 PEC 2.0은 조립 경로 및 선택된 최종 N/P 비율 2에서 PS:DOTAP 비율에 관계없이 획득할 수 있다. 이러한 조건에서 모든 PEC 2.0은 양의 제타이고, 전위>20mV이다. PS (저< 중< 고)의 양이 증가함에 따라 MP PEC 2는 크기가 감소하는 반면 DC PEC 2.0은 크기가 증가하고 PS PEC 2.0은 크게 변하지 않는 경향이 있었다(자료 미제시).
PEC 2.0에 봉합된 RNA를 평가하기 위해 gel retardation assay를 실시하여 그 양을 평가하였다. 모든 PEC 2.0은 RNA 탑재를 확인하였다. MP(중)로 합성된 PEC 2.0에서 다른 조립 경로 PS(중)와 DC(중)에 비해 2배가 탑재된 RNA의 양이 측정되었다(도 8).
PEC 2.0을 더 차별화하기 위해 헤파린 트리거 RNA 방출을 조사하였다. 음이온성 헤파린은 DOTAP 및 PS의 양전하와 상호 작용하므로 헤파린은 상호작용 부위에서 음이온성 mRNA와 경쟁하여 양이온성 생체적합성 폴리머에서 RNA를 방출한다. 첨가된 헤파린 농도는 RNA 농도 (% w/w)에 비해 10배에서 100배 과잉으로 증가시켰다.
DOTAP/RNA 또는 PS/RNA로만 구성된 N/P 비율이 2인 입자는 유사한 DOTAP/PS/RNA 절대 비율을 갖지만 다른 조립 경로에서 얻은 PEC들와 비교하여 평가하였다. DOTAP/RNA 리포플렉스의 경우 100배 과량의 헤파린조차도 RNA 방출을 관찰할 수 없었던 반면, PS/RNA 폴리플렉스의 경우 10배 초과량은 RNA를 방출하기에 충분하였다.
PEC 2.0에서 결합된 RNA의 80% RNA의 방출은 PEC 2.0에서 제조 경로에 따라 명확하게 달라졌다. PS(중) PEC 2는 mRNA 방출이 거의 발생하지 않는 수준인 반면, DC(저)의 경우 중간 정도의 RNA 방출이 관찰되었으며 MP(중) PEC 2.0의 경우 RNA 방출이 가장 많이 일어났다(자료 미제시). MP(중) PEC에서 높은 RNA 방출은 더 많은 양의 RNA가 탑재했기 때문으로 생각이 되었다.
실시예 6. 면역세포 표적화 PBAE-PGA PEM
6.1. 양이온성 생체적합 폴리머 PBAE-447 합성
1,4-부탄디올디아크릴레이트 1,4-butanediol diacrylate (B4)와 4-아미노-1-부탄올 4-amino-1-butanol (S4)을 디아크릴레이트 대 아민 단량체의 1:1 몰비로 결합하였다. 아크릴레이트-말단 폴리 (4-아미노-1-부탄올-co-1,4-부탄디올디아크릴 레이트)는 혼합물을 24시간 동안 교반하면서 90℃로 가열함으로써 형성하였다. 2.3g의이 중합체를 2mL의 테트라히드로푸란(tetrahydrofuran, THF)에 용해시켰다. 피페라진으로 캡핑된 447 폴리머를 형성하기 위해 13mL THF에 녹인 1-(3-아미노프로필)-4-메틸피페라진 1-(3-aminopropyl)-4-methylpiperazine (E7) 786mg을 폴리머/THF 용액에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 캡핑된 중합체를 5부피의 디에틸에테르 diethyl ether로 침전시키고, 2 부피의 신선한 에테르로 세척하고, 진공하에 1일 동안 건조시켰다. 양이온성 생체적합 폴리머, 순수 PBAE[poly(beta-amino ester)]-447 폴리머를 디메틸설폭사이드 (DMSO)에 100mg/mL의 농도로 용해하고 -20℃에서 보관하였다.
6.2. PEM 제조
mRNA 스톡은 25mM 뉴클레아제가 없는 아세트산 나트륨 완충액, pH 5.2 (NaOAc)에서 100μg/mL로 희석하였다. DMSO의 양이온성 생체적합 폴리머 PBAE-447은 NaOAc에서 6mg/mL로 희석하고 60:1 (w:w) 비율로 mRNA에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 중간 속도로 15초 동안 볼텍싱한 후, 코어입자가 형성될 수 있도록 실온에서 5분 동안 배양하였다.
제조된 코어입자에 표적 리간드를 추가하기 위해 음이온성 생체적합 폴리머 PGA-Ab를 NaOAc에서 250μg/mL로 희석하고 mRNA에 2.5:1 (w:w) 비율로 추가하였다. 생성된 혼합물을 중간 속도로 15초 동안 볼텍싱한 다음 RT에서 5분 동안 배양하여 PGA-Ab가 NP에 결합하도록 하였다.
제조된 나노입자(NP)는 동결 방지제로서 D-sucrose 60mg/ml와 혼합하여 동결 건조하고, 동결 건조 시스템(Labconco)에서 처리하기 전에 액체 질소에서 급속 동결시켰다. 동결 건조된 NP는 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 적용을 위해, 동결 건조된 NP는 원래 농도를 복원하기 위해 대량의 멸균수에 재현탁하였다.
실시예 7. 면역세포 표적화 HSA PEM
본 발명에서 관심 mRNA/PS/HSA PEM 1.1, 관심 mRNA/PS-TCA/HSA PEM 1.2, 관심 mRNA/CS/HSA PEM 1.3 또는 관심 mRNA/CS-TCA/HSA PEM 1.4를 포함하여 'HSA PEM'라고 총칭하였다.
7.1. 면역세포 표적화 HSA PEM의 제조
상기 선택된 관심 mRNA, 양이온성 단백질 프로타민(PS) 및 음이온성 단백질 인간혈청알부민(HSA)-리간드 용액은 각각 증류수(DW), PBS 완충액 (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 10mM, KH2PO4 1.8mM; pH 7.4) 또는 페놀 레드가 없는 RPMI 1640 세포 배지를 사용하여 2.5mg/ml의 농도로 제조하였다. 상기 PEM에서 HSA, HSA-CD8 또는 HSA-CD16을 포함하였다.
상기 양이온성 단백질 프로타민 대신에 양이온성 생체적합성 폴리머에서 선택된 두 종류 이상, 예를 들면 프로타민(PS)과 DOTAP, 또는 프로타민(PS)과 PbAE를 사용할 수도 있다.
0~2000㎍의 HSA-리간드를 15~150㎍의 PS에 첨가한 다음 5초 동안 혼합하였다. 그 후, 상기 제조한 30㎍ 관심 mRNA을 1ml의 최종 용적에 도달시켜 첨가하고, 5초 동안 와동하여 입자를 제조하였다.
다른 방법은 3종류의 생체적합성 폴리머의 첨가 순서를 임의로 결정할 수도 있다.
또 다른 방법은 상기 3종류 생체적합성 폴리머를 혼합하여 제조할 수도 있다.
그런 다음, 반응물을 상온에서 1시간 동안 방치하고 2일 동안 동결건조하여 제조한 PEM을 수득하였으며 이를 '관심 mRNA/PS/HSA PEM 1.1 또는 HSA PEM 1.1'이라고 지칭하였다.
여기에서 관심 mRNA는 상기 여러 종류에서 선택되어진 어느 한 종류이거나 복수의 종류가 혼합물이 될 수도 있다.
상기 PS 대신에 PS과 DOTAP을 선정하여 제조할 수 있으며 이들의 농도는 PS로부터 생기는 양전하의 비율은 15% (저), 45%/55% (중) 및 85% (고)로 다양하게 하여 사용할 수도 있다.
7.2. 면역세포 표적화 HSA PEM의 평가
도 8를 살펴보면, HSA PEM 1.1-DW는 30㎍ 관심 mRNA, 90㎍ PS이 있는 1ml의 증류수에 100 ~500㎍의 HSA-리간드를 첨가하고 혼합하면 dh는 250~280nm의 범위이고 PDI가 ≤ 0.1이었다. 관심 mRNA/PS/HSA PEM 1.1-DW는 1000~2000㎍의 HSA-리간드를 증가시키면 dh가 커지고 PDI가 0.2 이상이 되었다(빨간색 막대 그래프). 상기 PEM에서 HSA, HSA-CD8 또는 HSA-CD16을 포함하였다.
상기 HSA PEM 1.1-DW는 소량의 HSA-리간드가 있는 경우 작은 입자를 형성하나 HSA-리간드가 증가함에 따라 입자는 큰 구조로 응집되었다. 이러한 결과는 고농도의 HSA-리간드가 DW에서의 제조 과정에 부정적인 영향을 미치므로 덜 안정한 입자를 형성한 것이다.
도 9를 살펴보면, HSA PEM 1.1-등장액은 30㎍ 관심 mRNA과 90㎍ PS이 있는 1ml 등장액에 첨가되는 100~2000㎍의 HSA-리간드를 첨가하고 혼합하면 안정성은 개선되었다. 이 입자의 dh는 사용된 등장액에 따라 1~2mm에서 250~400nm로 감소하였다. 페놀 레드가 없는 세포 배지 RPMI 1640 등장액에서 dh = 245nm 및 PDI ≤ 0.15를 갖는 입자를 형성하였다. 이를 관심 mRNA/PS/HSA PEM 1.1-RPMI이라고 지칭하였다.
도 9의 결과를 종합하면, HSA-리간드의 최적화 농도는 HSA PEM 1.1-DW에서 약 100㎍/ml이고 관심 mRNA/PS/HSA PEM 1.1-등장액에서 약 1000㎍/ml이며 PS의 최적화 농도는 15~150㎍ 범위로 평가되었다.
상기 HSA-리간드가 HSA PEM 1.1에 미치는 영향은 HSA PEM 1.2, 1.3. 및 1.4에서 유사하게 관찰되었다.
상기 결과들은 선택된 관심 mRNA에만 한정된 것이 아니라 다른 관심 mRNA에서도 일반적으로 관찰되었다.
실시예 8. 면역세포 표적화 HA PEMN
상기 PEC와 음이온성 다당류를 혼합하여 자기조립으로 형성되는 입자 또는 mRNA, 양이온성 폴리펩타이드 및 음이온성 다당류를 혼합하면서 초음파 분사하여 형성되는 입자를 PEM이라고 지칭하였다. 본 발명에서 하기 관심 mRNA/PS/HA PEM 1.1 및 관심 mRNA/PS/HA-TCA PEM 1.2를 포함하여 'HA PEM'이라고 지칭하였다. 상기 PEM에서 HA, HA-CD8 또는 HA-CD16을 포함하였다.
상기 관심 mRNA/PS/HA PEM의 제조는 먼저 제조한 코어입자 1.0을 다시 표면 개질을 위하여, 음이온성 다당류인 히알루론산(Hyaluronic acid, HA, 83 kDa)-리간드을 멸균증류수 또는 등장액에 1mg/mL 용해시켜 0.1% 스톡 용액으로 제조하였다.
상기 양이온성 단백질 프로타민 대신에 양이온성 생체적합성 폴리머에서 선택된 두 종류 이상, 예를 들면 프로타민(PS)과 DOTAP, 또는 프로타민(PS)과 PbAE를 사용할 수도 있다.
상기 관심 mRNA:PS (㎍/ml) 비율이 30:75 질량비에서 제조하여 동결건조한 코어입자 1.0을 멸균증류수 또는 등장액에 1mg/mL로 용해시켜 0.1% PEC 1.1 용액을 제조하였다.
상기 제조한 0.1% PEC 1.0 용액과 0.1% HA-리간드 용액을 1:0.5, 1:1, 1:1.5 또는 1:2 첨가몰비(feed mole ratio, nmol)로 섞어준 뒤 5분 정도 처리하여 동결건조하여 HA PEM-DW를 수득하였다.
하기에서 제조하는 면역세포를 표적화하는 PEMN 중에서 T 세포 표적화 PEMN은 “T-PEMN”, NK 세포 표적화 PEMN은 “NK-PEMN”이라고 하였다.
8.1. 압출기를 이용한 균질화
대조구는 일반적인 기존 방식(bottom-up method, 상향식)으로 얻은 수용액에 유효성분 관심 mRNA, 양이온성 생체적합성 폴리머 및 음이온성 생체적합성 폴리머를 혼합한 현탁용액에서 제조한 PEM이다.
상기 상향식으로 제조한 PEM을 포함하는 현탁용액을 LIPEXTM 압출기(Northern Lipids 사, 캐나다)로 다양한 조건에 따른 PEMN 제조 예비실험을 실시하였다.
상기 제조한 PEM 현탁용액을 상기 예비실험으로 설정된 LIPEXTM 압출기를 이용하여 200psi에서 5겹으로 쌓인 평균 구멍크기 0.1㎛인 PORETICSTM PETE 막(Cat.No.T01CP02500)를 왕복으로 5회 통과하여 얻은 용액을 상온에서 1시간 동안 안정시킨 후, 형성된 HA PEMN을 수확하여 분석하였다.
이어서, 상기 입자의 크기를 조절하기 위해 적절하게 초음파분석기(Sonicator) 또는 압출기(Extruder)를 사용할 수 있다. 동결건조하여 HA PEMN 1.1-DW를 수득하였다.
또는, 상기 HA PEMN 1.1의 다른 제조는 상기 관심 mRNA/PS]:HA 또는 [관심 mRNA/PS]:HA의 첨가몰비(feed mole ratio, nmol)는 상기 PEM와 HA 첨가몰비 1:0.5, 1:1, 1:1.5 또는 1:2에 준하여 관심 mRNA, PS 및 HA를 5분 정도 섞어준 후, 상기 입자의 크기를 조절하기 위해 적절하게 초음파분석기(sonicator) 또는 압출기(extruder)를 사용할 수 있으며 동결건조하여 HA PEMN 1.1을 수득하였다.
상기 PS 대신에 PS과 DOTAP의 농도는 PS로부터 원하는 양전하의 비율은 15% (저), 45%/55% (중), 85% (고)로 다양하게 하여 사용할 수도 있다.
8.2. 면역세포 표적화 HA PEMN의 평가
8.2.1. 형태학적 분석 및 봉입 확인
입자 크기, 다분산지수 (PDI) 및 제타 전위 분석은 적색 He/Ne 레이저 (633 nm)가 장착된 Zetasizer nano ZSP (Malvern Panalytical Ltd, 영국)를 사용하여 결정하였다. 입자 크기와 PDI는 20℃에서 산란각이 173°인 DLS (Dynamic Light Scattering)와 석영 유동 셀 (ZEN0023)을 사용하여 측정한 반면, 제타 전위는 일회용 접힌 모세관 셀 (DTS1070)을 사용하여 측정하였다. DLS는 Brownian 운동에 발생하는된 입자의 확산을 측정하고 Stokes-Einstein 관계에 해당하는 계측기에서 상관 함수를 사용하여 입자 크기 및 크기 분포 매개 변수를 얻을 수 있었다. 이러한 상관 함수는 누적 분석에 의해 획득되고 평균 크기 (z- 평균 직경) 및 분포 폭 추정치 (다 분산 지수)가 얻어지는 단순 지수에 적합하다. 마찬가지로 상관 함수는 입자 크기 분포가 음이 아닌 최소 제곱 (NNLS) 또는 제약 정규화 (CONTIN)로 획득되는 다중 지수에도 적합하다. 이 작업에서는 입자 크기를 z- 평균 직경으로 측정하고 PDI는 각각 단분산 및 매우 넓은 분포에 해당하는 0~1 범위이다. 모든 나노 입자는 ~ 1:100 v/v 희석 인자를 사용하여 멸균증류수에 분산하였다. 모든 측정은 3회 수행하였으며 평균 ± 표준 편차로 기록하였다.
다양한 비율로 제조한 면역세포 표적화 HA PEM 1.1의 사이즈 분포를 조사한 결과는 <표 5>이다. 이들 결과는 상기 면역세포 표적화 HA PEM 1.0의 크기가 200nm 범위인 경우 관심 mRNA/PS:HA의 비율은 1:0.5와 1:1임을 알 수 있다.
제조한 면역세포 표적화 HA PEM 1.1의 DLS 분석결과
첨가몰비
(feed mole ratio, nmol)		 RNA:PS 1 1 1 1
HA 1 1.5 2 2.5
관심 mRNAPS/HA
size(nm) 184.8±7.1 182.3±14.1 493.2±22.6 1259±147
PDI 0.30±0.07 0.34±0.04 0.30±0.02 0.35±0.09
Complex efficiency
(% vs RNA)		 80.9 71.7 100 100
상기 실시례에서 얻은, 관심 mRNA, PS 및 HA에 선택된 두 종류 물질을 반응 용액내에서 가열없이 얼음 팩 위에서 1시간 동안 sonication하면서 혼합하고 형성된 복합체 용액에 전단계에서 처리하지 못한 나머지 물질을 첨가하여 가열없이 얼음 팩 위에서 1시간 동안 sonication하여 반응이 끝난 후, 상온에서 1시간 동안 유지한 후 LIPEXTM 압출기(Northern Lipids 사, 캐나다)를 이용하여 형성된 HA PEMN 1.1를 Zetasizer를 이용하여 입자 분석을 하였으며 그 결과는 표 6과 같다.
상기 형성 면역세포 표적화 HA PEMN 1,1을 DLS 분석을 하였으며 그 분포 및 크기는 도 10과 같다.
면역세포 표적화 HA PEMN 1.1을 제조한 DLS 분석결과
구성성분 1 2 3 4
RNA(㎍) 1 1 1 1
PS(㎍) 0.5 0.5 1 2
HA(㎍) 0.5 1 0.5 1
Sonication SiZE(nm) 184.8±7.1 182.3±14.1 493.2±22.6 1259±147
PDI 0.30±0.07 0.34±0.04 0.30±0.02 0.35±0.09
Kcps 80.2 56.4 181.4 225.5
Complex efficiency
(% vs RNA)		 80.9 71.7 100 100
Extrusion Size 159.6±1.2 163.2±1.3 186.5±9.9 258.3±11.3
PDI 0.17±0.004 0.21±0.008 0.33±0.05 0.22±0.01
Zeta -23.3±0.9 -16.6±4.6 -18.3±3.4 -8.6±0.8
Kcps 40.5 32.6 22.9 39.7
상기 면역세포 표적화 HA PEMN 1.0를 관심 mRNA/PS];HA 첨가몰비를 1:1.5로제조하여 원심분리한 후, 동결건조하고 5% w/w Trehalose 용액으로 재수화하였으며 재수화전후의 전후의 입자 크기를 조사하였다.
<표 7>를 살펴보면, 동결건조하여 재수화 전후에 따라 입자 크기 변화는 거의 없으며 증류수(DW)보다 PBS에서 입자가 약 3~4% 정도 증가 현상이다.
면역세포 표적화 HA PEMN 1.1을 동결건조한 후 재수화하여 DLS 분석결과
관심 mRNA/PS/HA
Size(nm) 137.0±30.4
PDI 0.15±0.22
동결건조 및 재수화
DW PBS
Size(nm) 140.7±5.4 150.5±19.7
PDI 0.12±0.06 0.17±0.1
CE(%) 96.4 100
상기 결과들은 선택된 관심 mRNA에만 한정된 것이 아니라 다른 관심 mRNA에서도 일반적으로 관찰되었다.
8.2.2. 면역세포 표적화 HA PEMN 약물 방출 프로파일
면역세포 표적화 HA PEMN 1.1의 안정성과 관심 mRNA의 방출은 PBS에서 37℃에서 24시간 처리한 후 원심분리하여 얻은 상징액을 조사하였었다. 상기 HA PEMN 1.1에 의한 관심 mRNA 방출 프로파일은 다양한 조건에서 얻은 상징액을 2% agarose gel에서 1x TBE buffer를 이용해 80 Volt 조건에서 20분 동안 전기영동을 수행한 후, 관심 mRNA은 0.5 μg/ml의 EtBr(Ethidium bromide)을 이용해 염색하였다.
[관심 mRNA/PS]:HA-리간드 첨가몰비 1:1.5 및 1:2 조건에서 mRNA 방출이 거의 발생하지 않았다. [관심 mRNA/PS]:HA 첨가몰비 1;0.5에서 90.0 % 및 1:1에서 63.0 % mRNA가 용액에서 발견되었다. 1:1.5 조건에서 관심 mRNA의 작은 방출을 보였으며 8.0 %의 미결합 관심 mRNA가 발견되었다. 이는 양전하를 띠는 HA의 영향으로 HA의 첨가량이 증가할수록 관심 mRNA과 강하게 반응하여 더욱 안정한 입자 형태를 형성한 것으로 판단할 수 있다.
상기 면역세포 표적화 PEM의 [관심 mRNA/PS]:HA-리간드 첨가몰비 1:1.5 질량비에서 시간에 따른 약물 방출 프로파일을 조사하였다(도 11).
도 11의 밴드 강도를 판독한 결과는 <표 8>과 같으며, HA PEMN 1.1은 PBS 용액에서 120시간 동안에 누적된 관심 mRNA가 봉합된 수준의 100%를 방출하였으며 72~ 96시간 사이에 50%의 방출을 관찰하였다.
면역세포 표적화 HA PEMN 1.1로부터 시간대별 관심 mRNA의 방출 프로파일
Incubation Time (hours) 0 4 8 24 48 72 96 120
Band density(%) 20.0 27.9 25.5 36.0 48.0 42.7 41.2 50.2
Release of RNA
(%, normalization)		 0 7.9 5.5 17.0 33.8 43.6 65.3 104.9
상기에서 면역세포를 표적화하는 PEMN 중에서 T 세포 표적화 PEMN은 “T-PEMN”, NK 세포 표적화 PEMN은 “NK-PEMN”이라고 하였다.
실시례 9. FS_PEM을 이용한 면역세포 표적화 PEM의 균질화
9.1. FS_PEM의 생산
FS_PEM(Free standing LbL 기반 PEM)은 silicon wafers (Si), polystyrene (PS), polypropylene (PP) 및 Teflon (PTFE)의 네 가지 기판에서 제조하였다. 필름 증착 전에 에탄올로 세척하고 질소 흐름으로 건조하기 전에 물로 완전히 세척을 하였다.
선택된 기판에 유효성분(D), 양이온성 생체적합성 폴리머(C) 및 음이온성 생체적합성 폴리머(A)를 교대로 층적하는 layer by layer 층적 기술로 제조되고 용출되는 PEMN을 제조하였다.
상기 Layer by layer (LbL) 기술로 제조되는 면역세포 표적화 PEM의 최외각 층은 면역세포 표적화 생체적합성 폴리머(A)를 사용할 수 있으며, 예시적으로 HA-CD8 또는 HA-CD16을 사용할 수 있다.
다중 전해질 용액은 달리 언급하지 않는 한 0.15 M NaCl pH pH 7.4에서 다양한 농도 (1, 3 또는 5 mg/mL)로 준비하였다. HA는 pKa가 약 2.9이므로 음전하이고 PS는 pKa가 9.2~13.3이므로 양전하를 띠고 수용액에 용해되었다. pH 조정을 위해, pH 5.5 아세트산 나트륨 완충액 (0.1m)을 추가 염 (0.15m NaCl)의 존재하에서 제조하였다. HA 대신에 변형된 HA를 사용할 수도 있다.
모든 용액은 Milli-Q 물로 만들고 Corning 0.22 μm 셀룰로오스 아세테이트 필터 장치로 여과하였다. 희석된 아세트산으로 용액 pH 조정을 하였다. 유리 제품은 사용 전에 증류수로 5회, 탈이온수로 5회 세척하였다. 달리 명시되지 않는 한 탈이온수는 모든 실험에 사용하였다.
상기 세척된 슬라이드에 음이온성 HA, 양이온성 PS, 유효성분 관심 mRNA, PS, HA를 순서대로 증착하였으며, 이를 1 단위체로 하여 반복적으로 증착하여 PEM을 제조하였다. 세척된 슬라이드를 PS 및 HA (10 mL) 용액에 각각 15분 동안 연속적으로 담근 후 용액 사이에 0.15 M NaCl pH 4.5에서 2번 세척을 하였다.
또 다른 제조 방법은, FS_PEM은 먼저 에탄올과 물로 세척된 폴리프로필렌(polypropylene) 지지체를 사용하여 생산하였다. 다층 고분자 전해질의 자동 제조를 위해 특별히 설계된 침지 로봇(dipping robot)을 사용하여 PS 및 HA 이중층을 형성하기 위해 템플릿에 고분자 전해질 용액을 교대로 증착하였다.
각 고분자 전해질 용액 증착 단계 사이에 슬라이드를 아세테이트 완충 용액에 담근다. 증착이 종료되고 세척 처리 단계없이 기판에서 필름을 분리 여부를 실시하였다. 고분자 전해질과 기판 사이에 약한 van der Waals 상호 작용으로 기판에서 쉽게 벗겨지는 결함없는 FS PEM을 생산할 수 있었다.
Si로 제작된 (PS/HA) 다층 필름은 견고하지 않고 PTFE 기판으로 제작된 필름은 분리할 수 없었다. 반대로 PP 및 PS 기판에 구축된 PEM은 건조되도록 두는 것만으로도 잘 분리할 수 있었다. 핀셋으로 쉽게 다룰 수 있고 가위로 어떤 모양이라도 제조할 수 있다.
또 다른 LbL 기술은, 선정된 기판에 양이온성 생체적합성 폴리머, poly 4-vinylpyridiniomethanecarboxylate (PVPMC)을 증착한 다음, 특별히 설계된 침지 로봇(dipping robot)을 사용하여 음이온성 HA, 양이온성 PS, 유효성분 관심 mRNA, PS, HA를 순서대로 증착하였으며, 이를 1 단위체로 하여 반복적으로 증착하여 PEM을 제조하였다. LbL PEM의 층수가 증가함에 따라 선형적으로 성장하였다. PVPMC 기반 다층의 분해 속도는 수용액에서 염의 농도를 변경하여 잘 제어할 수 있습니다. PVPMC 기반 PEM은 0.9% 생리 식염수에서 15분 이내에 완전히 면역세포 표적화 PEM만 분리하였다.
상기 양이온성 단백질 프로타민 대신에 양이온성 생체적합성 폴리머에서 선택된 두 종류 이상, 예를 들면 프로타민과 DOTAP, 또는 프로타민과 PbAE를 사용할 수도 있다.
또 다른 LbL 기술은 셀룰로오스 섬유(Cellulose fiber)로 이루어진 종이 또는 폴리프로필렌(polypropylene)를 기판으로 하고 잉크젯 프린팅을 사용하며, 프린트 헤드에 있는 각각의 잉크 카트리지에 유효성분 관심 mRNA이 포함된 용액, 양이온성 전해질 용액, 음이온성 전해질을 포함하는 용액을 충진하고, 각각에 맞는 색상을 선택하여 종이에 인쇄하였다. 한 번의 인쇄와 한 번의 헹굼(과량의 PBS로 1회 세척)으로 하나의 층을 만들고 이를 반복하여 다층의 나노 박막을 형성하였다. 종이기반 면역세포 표적화 PEM은 0.9% 생리 식염수에서 조심스럽게 면역세포 표적화 PEM만 분리할 수 있다.
9.2. 초고압 균질화
대조구는 일반적인 기존 방식(bottom-up method, 상향식)으로 유효성분 관심 mRNA, 양이온성 생체적합성 폴리머 및 음이온성 생체적합성 폴리머를 혼합한 현탁용액에서 제조하는 PEM을 사용하였다.
상기 실시례 6.1항 및 7.1항에서 제조한 면역세포 표적화 PEM에서 면역세포 표적화 PEMN의 개발은 음이온성 관심 mRNA, 양이온성 폴리머와 음이온성 폴리머의 혼성화 순서 및 이들의 비율, 초고압 균질화(ultra-high pressure homogenization, UHPH) 적용 압력 및 재순환주기에 따라 여러 단계로 수행하였다.
상기 실시례 6.1항의 경우, 음이온성 관심 mRNA 용액과 양이온성 폴리머 용액을 진탕하면서(~ 300rpm, 25℃) 혼합하여 정전기적 상호작용에 의해 코어입자를 형성하는 현탁용액 A를 제조하였다. 이어서 현탁용액 A를 진탕하면서 음이온성 폴리머를 첨가하고 초음파 처리하여 코어입자와 음이온성 폴리머의 정전기적인 상호작용으로 형성되는 면역세포 표적화 PEM을 포함하는 현탁용액 B를 제조하였다.
상기 실시례 6.1항의 경우, 음이온성 관심 mRNA 용액, 양이온성 폴리머 용액과 음이온성 폴리머 용액을 진탕하면서 각각 첨가하고, 초음파 처리하여 이들간의 정전기적 상호작용으로 형성되는 PEM을 포함하는 현탁용액 C를 제조하였다.
상기 실시례 7.1항의 경우, 선정된 기판에 layer by layer 방식으로 제조되고 용출된 면역세포 표적화 PEM을 절단한 1x1 mm2 조각을 포함하는 용액 D를 제조하였다.
상기 제조된 현탁용액 B, C 그리고 용액 D를 Nano DeBEE 2000 Series Homogenizer(BEE International 사, 미국)를 사용한 UHPH로 균질화하여 PEMN을 제조하였다.
상기 균질화 장치는 지르코늄(zirconium) 노즐 (Z8, 직경:200μm) 및 6개의 지르코늄 반응기 (직경 0.95mm)가 병렬 배열된 구조이다. 사용된 작동 조건은 압력(68.9, 137.9, 172.4 및 2000 MPa) 및 재순환 사이클 수 (1 및 4회)이다.
상기 초고압 균질화에 의해 제조된 면역세포 표적화 PEMN을 DLS 분석을 하였으며 그 분포 및 크기는 도 12과 같다.
상기 제조한 면역세포 표적화 PEMN 현탁액을 정제 시스템 (Millipore Elix Essential, Merck KGraA, 독일)에서 얻은 명균증류수와 혼합하였다.
본 발명에서 약물 방출 분석 방법은 입자에 FBS 첨가하여 최종 50% FBS 농도의 반응액 제조하고 37˚C, CO2 incubator에서 시간대별 반응한 후, 원심분리하여 상징액을 Gel retardation 분석법으로 분석하였다.
본 발명에서 동결건조는 입자 용액을 -70℃에서 O/N 동안 처리하고 동결건조기를 미리 가동하여 압력과 온도를 최대치까지 가동한 후, 상기 처리된 입자(고체)를 동결건조기에 연결하여 동결건조를 진행하였다. 동결건조 시간은 양에 따라 결정하였으며 1시간/100μL로 하였다. 동결건조가 완료된 시료는 진공상태를 유지한 채 동결건조기에서 분리된 용기를 사용하여 상온 보관하는 방법을 사용하였다.
상기에서 면역세포를 표적화하는 PEMN 중에서 T 세포 표적화 PEMN은 “T-PEMN”, NK 세포 표적화 PEMN은 “NK-PEMN”이라고 하였다.
실시례 10. NK-PEMN 및 T-PEMN의 세포 평가
10.1. NK-PEMN의 세포 평가
NK-92 세포(ATCC® CRL-2407™)는 5% 인간 AB 혈청(Valley Biomedical, 미국) 및 500 IU/mL IL-2(Prospec, 이스라엘)로 보충된 엑스-비보10(X-Vivo10) 배지(Lonza, 스위스)에서 성장시켰다.
그 다음, 실시례 8항에서 HLA G 15E7-CAR mRNA 카세트를 봉입한 NK-PEMN (HLA-G 15E7 CAR-NK-PEMN이라고 함))을 배양한 NK-92 세포(1×106 cells/ml)와 혼합하여, 1500 rpm으로 2시간 원심 후, 6시간 배양하였다. 배양액으로부터 미결합 PEMN을 제거하기 위해, NK-92 세포를 회수하여, 새로운 증식 배양액으로 옮기고, 또 42시간 배양하여, 상기 HLA-G 15E7 NK-PEMN이 도입한 세포를 얻었으며, 이를 “HLA G 15E7-CAR NK-92 세포”이라고 하였다.
NK-92 세포주는 HLA G-LFTT-1 또는 HLA-G-15E7 CAR NK-PEMN으로 각각 형질도입하였다.
10.1.1. CD107a+ 세포 및 IFN-감마 세포의 빈도를 정량 분석.
제조된 HLA G 15E7 CAR-NK-92 세포의 암세포 살상 가능성을 검증하기 위해, CAR-NK-92 세포를 암세포와 공배양한 후 발현되는, 암세포 용해능을 갖는 CD107a+ 세포 및 IFN-감마 세포의 빈도를 정량 분석하였다.
구체적으로, HLA G 음성 대장암 세포주 LoVo, HLA G가 약하게 발현되는 난소암 세포주 A2780/ADR 그리고 HLA G가 많이 발현되는 대장암 세포주 COLO320, 간암세포주 HEPG2 및 삼중음성유방암 세포주 MDA-MB-231 각각 1x106 개 세포/ml와 CAR-NK-92 세포 1x106개 세포/ml를 6-웰 플레이트에 각각 1 ml씩 분주한 후, 400g로 1분간 원심분리하고, 이를 2시간 또는 16 시간 동안 37℃, 5% CO2 존재 하에서 세포 배양기에서 배양한 후, 유세포 분석기를 통해 CD107a+ 세포 및 IFN-감마 세포의 빈도를 확인하였다.
구체적으로, CD107a+ 세포의 빈도는 CAR-NK 92 세포를 형광이 부착된 CD56 및 CD107a에 대한 항체가 첨가된 FACS 완충액에서 20분 동안 상온에서 반응 후, 상기 세포를 원심분리기를 이용하여 세척 및 회수한 다음 FACS 분석하였다.
그 결과, HLA G 15E7-CAR 유전자가 도입되지 않은 NK-92 대조군 또는 공배양하지 않은 대조군(-)에 비하여, HLA G-CAR-NK-92 세포과 암세포를 공배양할 경우 CD107a+ NK-92 세포의 빈도(%)가 증가함을 확인하였다(도 13).
또한, 상기 회수한 세포를 형광이 부착된 CD56 및 IFN-감마에 대한 항체가 첨가된 FACS 완충액에서 20분 동안 상온에서 반응 후, 상기 세포를 원심분리기를 이용하여 세척 및 회수하고 FACS 분석하였다.
그 결과, CAR 유전자가 도입되지 않은 NK-92 대조군 또는 공배양하지 않은 대조군(-)에 비하여, HLA G-CAR-NK-92 세포와 암세포를 공배양할 경우 IFN-감마+NK 세포의 빈도(%)가 증가함을 확인하였다(도 13).
10.1.2. CAR-NK-92 세포의 암세포 살상능 측정
제조된 HLA G 15E7-CAR-NK-92 세포의 암세포 살상능을 측정하기 위해, Calcein AM Assay Kit (Fluorometric) (ab228556, abcam 사, 미국)을 사용한 세포 살상능 측정법을 실시하였다.
구체적으로, HLA G 음성 대장암 세포주 LoVo, HLA G가 약하게 발현되는 난소암 세포주 A2780/ADR 그리고 HLA G가 많이 발현되는 대장암 세포주 COLO320, 간암세포주 HEPG2 및 삼중음성유방암 세포주 MDA-MB-231를 10% 소태아 혈청을 포함하는 DMEM 배지에서 각각 1x105개 세포/ml이 되도록 희석한 후, 25 μM이 되도록 칼세인-AM을 첨가하고, 37℃에서 1시간 배양 후에 DMEM 배지로 세척하여, 칼세인 표지 관심 암세포를 제작하였다.
HLA G 15E7-CAR-NK-92 세포를 배양액을 이용하여 각각 0.25x105개 세포/ml와 1x105개 세포/ml의 밀도로 희석하여 준비한 후에 96-웰 플레이트에 각각 100 ml씩 분주하였다. 제작한 칼세인 표지 관심 암세포(1x105개 세포/ml)를 100 ul/well씩 96-웰 플레이트에 첨가한 후, 400g로 1분간 원심분리하고, 이를 4시간 동안 37℃, 5% CO2 존재 하에서 세포배양기에 배양한 후, 각 웰로부터 상층액 100ul를 취하여 형광 플레이터 리더(485 nm/535 nm)로 측정하였다. 세포 살상능(%)은 아래 수식에 따라서 산출하였다.　
암세포 살상능(%)= {(측정값-최소값)/(최대값-최소값) }x100
상기 식에서, 최소값은 칼세인 표지 관심 암세포만 존재하는 웰의 측정값이고, 최대값은 칼세인 표지 관심 암세포에 0.1% TritonX-100을 첨가해서 세포를 완전 용해한 웰의 측정값이다.
그 결과, NK-92 대조군 대비 HLA G 15E7-CAR-NK-92 세포가 높은 암세포 살상능을 보유함을 확인하였으며, 각 HLA G 15E7-CAR-NK-92 세포 수에 비례하게 암세포 살상능이 증가함을 확인하였다(도 14).
10.2. T-PEMN의 세포 평가
실시례 8에서 제작한 HLA G 15E7-CAR-IL-7/CCL19 발현 카세트를 봉입한 T-PEMN (HLA G 15E7-CAR-IL-7/CCL19 T-PEMN이라고 지칭함)을 준비하였다.
건강한 공여자 (CD3+, 냉동)로부터의 말초혈액(All Cells, 미국)으로부터 T Cell Isolation Kit(Miltenyi Biotec, 미국)를 사용하여 인간 T 세포를 분리하였다. CD3+CD28+ 코팅된 마이크로 비드(Miltenyi Biotec, 미국)로 활성화한 다음 RPMI 1640 Glutamax (Gibco, 미국)에서 10 % FCS, 1mg / ml 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco), 50M 베타-메르 캅토 에탄올 (Gibco), 비필수 아미노산, 10mM 헤페스 (Gibco) 및 1mM 피루브산 나트륨 (Gibco)인 배지에서 5 % CO2. 37℃에서 48 시간 배양하였다.
그 다음, 상기에서 제작한 HLA G 15E7-CAR-IL-7/CCL19 T-PEMN 또는 대조구 HLA G 15E7-CAR T-PEMN (HLA G-CAR 발현 카세트를 봉입한 T-PEMN)을, 활성화한 상기 T 세포(1×106 cells/ml)와 혼합하여, 1500 rpm으로 2시간 원심 후, IL-2(100 IU/ml)의 존재하에서 6시간 배양하였다. 2-3 일마다 세포를 계수하고 IL2가 포함된 완전 배지에서 1.10 세포/ml로 조정하였다. 8 일 후, 세포를 기능 분석을 하였다.
TALL-104 세포주(ATCC 1386™)는 IFN gamma, TNF alpha, GM-CSF, CD2 +; CD3 +; CD7 +; CD8 +; CD56 +; CD4 -; CD16 -, alpha/beta TCR이 양성(+)이고 gamma/delta TCR 음성(-) 세포이다.
TALL-104 세포주는 각각 HLA G-LFTT-1 또는 HLA-G-15E7 CAR T 세포 표적화 PEMN으로 형질도입하였다. TALL-104 wt 및 형질도입된 TALL-104 세포주는 2mM L- 글루타민, 1mg / ml 페니실린 및 스트렙토 마이신 (Gibco) 및 10 % 열 불활성화 FCS (Invitrogen, 미국)가 보충 된 RPMI 1640 (Invitrogen)에서 배양하였다.
배양액으로부터 미결합 PEMN을 제거하기 위해, T 세포를 회수하여, IL-2(100 IU/ml)를 함유하는 새로운 증식 배양액(RPMI)으로 옮기고, 또 42시간 배양하여, HLA G-CAR-IL-7/CCL19 T-PEMN를 도입한 T 세포(HLA G-CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포) 또는 HLA G-CAR T-PEMN를 도입한 T 세포(HLA G-CAR 발현 T 세포)를 얻었다.
10.2.1 HLA G 15E7-CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포에서의 배양 상청액 중의 IL-7, CCL19 농도의 측정
제작한 HLA G 15E7-CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포 또는 대조구 HLA G-CAR 발현 T 세포에 대해, 동일하게 마이토마이신 C로 처리한 HLA G 음성 대장암 세포주 LoVo, HLA G가 많이 발현되는 대장암 세포주 COLO320, 또는 항 CD3 단일 클론 항체에 의한 자극 유무에서 3일간 또는 5일간 배양 후의 IL-7 및 CCL-19의 농도를, ELISA 키트를 이용하여 측정하였다. 결과를 도 15에 나타낸다.
도 15에서, 백색 컬럼이 자극 없음, 사선 컬럼이 마이토마이신 C로 처리한 HLA G 음성 대장암 세포주 LoVo에 의한 자극 있음, 흑색 컬럼이 COLO320에 의한 자극있음, 회색 컬럼이 항 CD3 단일 클론 항체에 의한 자극이 있음을 나타낸다. 또한, 대조구는 HLA G-CAR 발현 T 세포, 실험구는 HLA G-CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포를 나타낸다.
그 결과, 도 15에서 HLA G-CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포에 대해서도 IL-7 및 CCL-19가 배지로 분비되는 것을 확인하였다.
10.2.2. HLA G 15E7-CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포의 세포 수
HLA G 15E7-CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포 (4×105개) 함유 샘플을, 쥐 IgG2a 이소 타입 대조구, 항 CD127 단일 클론 중화 항체, 또는 항 CCR7 단일 클론 중화 항체의 존재하에서 마이토마이신 C와 함께 HLA G가 많이 발현되는 대장암 세포주 COLO320으로 자극하였다. 5일간 배양하고, 트리판 블루에 의해 살아있는 세포의 절대 수를 조사하였다. 그리고, CD127은 IL-7의 수용체이며, CCR7은 CCL19의 수용체이다. 결과를 도 16에 나타낸다.
도 16은, 「Iso. Cntrl.」는 쥐 IgG2a 이소 타입 컨트롤, 「anti-CD127」은 항 CD127 단일 클론 중화 항체, 「anti-CCR7」은 항 CCR7 단일 클론 중화 항체, 의 각각 항체의 존재하에서 COLO 320으로 자극했을 경우이다.
그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, HLA G-CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포에서도 세포 수가 증가하고 있고, 세포 증식률의 증가 및 anti-CD127에 의해 세포 증식이 억제되고 있는 것으로부터, 세포 증식률의 항진은 IL-7의 수용체인 CD127를 통해 작용하고 있는 것을 확인하였다.
실시례 11. NK-PEMN 및 T-PEMN의 마우스 종양 모델 평가
11.1. NK-PEMN의 마우스 종양 모델 평가
면역세포를 대상으로 실시항 8항에서 제조한 HLA-G 15E7CAR NK-PEMN가 종양 퇴행을 일으킬 수 있을 만큼 충분한 양으로 순환하는 NK 세포를 재프로그래밍할 수 있는지 여부를 조사하였다.
동물은 사육 시설에 수용되었으며 IRB에서 승인한 동물 프로토콜에 따라 하였다. 14시간 빛/10시간 암흑주기와 온도가 18~23℃, 습도 40~60%가 사용하였다. 실험 동물과 대조 동물은 공동 사육하였다.
생후 8주차의 누드 마우스(Balb/c-nude Mouse, 평균무게 20-25g)의 등에 HLA G가 많이 발현되는 대장암 세포주 COLO320 1x107개 세포/ml 200 μl을 피하 주입(Subcutaneous Injection)하여, 대장암세포 이종이식 마우스 동물 모델을 제조하였다. 투여 후 종양의 긴 축 짧은 축을 측정하여, 종양의 부피(mm3)를 상기와 같은 방법으로 산출하였다.
종양 부피=(종양의 긴 축)×(종양의 짧은 축)2/2 (mm3)
이식 5일 후, 마우스를 10×106개의 NK 92 세포로 재구성하고, 재구성 3일 후, HLA-G 15E7 CAR NK-PEMN (50μg mRNA/용량)을 6일마다 주입하였다(도 17a). HLA-G CAR NK-PEMN 투여 프로토콜은 HLA-G 15E7 CAR NK-PEMN로 생체 외에서 측정한 HLA G-CAR 표면 발현의 동역학을 기반으로 선택되었으며, 이는 최대 8일 동안 관련 수용체 발현을 나타났다.
생체 내에서 동일한 HLA G 15E7-CAR을 림프구로 프로그래밍하는 HLA-G CAR NK-PEMN을 사용한 치료 10마리 중 7마리의 마우스에서 종양 박멸을 달성하였다(도 17b).
이는 일시적인 특성에도 불구하고 IVT mRNA가 숙주 림프구에서 지속적인 in situ CAR 발현을 달성하기 위한 플랫폼 역할을 할 수 있음을 알 수 있었다.
상기 결과들은 선택된 HLA G-CAR mRNA에만 한정된 것이 아니라 다른 mRNA에서도 일반적으로 관찰되었다.
11.2. T-PEMN의 마우스 종양 모델 평가
생후 8주차의 누드 마우스(Balb/c-nude Mouse, 평균무게 20-25g)의 등에 5×105개의 HLA G가 많이 발현되는 대장암 세포주 COLO320을 피하 접종하였다. 투여 후 종양의 긴 축 짧은 축을 측정하여, 종양의 부피(mm3)를 상기와 같은 방법으로 산출하였다.
종양 부피=(종양의 긴 축)×(종양의 짧은 축)2/2 (mm3)
이식 5일 후, 마우스를 10×106개의 인간 T 세포로 재구성하고, 재구성 후 3일째에, HLA G 15E7-CAR T-PEMN 또는 HLA G 15E7-CAR-IL-7/CCL19 T-PEMN를 정맥 내에 투여하였다.
도 18에서, 비처리구는 CAR T-PEMN를 투여하지 않음, HLA G 15E7-CAR T-PEMN 또는 HLA G 15E7-CAR-IL-7/CCL19 T-PEMN를 투여했을 경우를 나타낸다. 그 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이, HLA G 15E7-CAR T-PEMN를 투여했을 경우보다는 HLA G 15E7-CAR-IL-7/CCL19 T-PEMN를 투여하면 종양이 거의 소실되었다.
따라서, HLA G-CAR T-PEMN을 투여한 경우는 거의 종양 증식 억제 효과가 없음에도 HLA G-CAR-IL-7/CCL19 T-PEMN을 투여한 경우는 IL-7와 CCL19를 조합함으로써, 지극히 높은 종양 증식 억제 효과를 얻을 수 있는 것이 명백해졌다.
11.3. NK-PEMN 및 T-PEMN의 마우스 종양 모델 평가
면역세포 중 NK 세포 및 T 세포를 대상으로 실시례 8항에서 제조한 IVT mRNA 나노 입자가 종양 퇴행을 일으킬 수 있을 만큼 충분한 양으로 순환하는 T 세포와 NK 세포를 재프로그래밍할 수 있는지 여부를 조사하였다.
동물은 사육 시설에 수용되었으며 센터의 IRB에서 승인한 동물 프로토콜에 따라 하였다. 14시간 빛/10시간 암흑주기와 온도가 18~23℃, 습도 40~60%가 사용하였다. 실험 동물과 대조 동물은 공동 사육하였다.
생후 8주차의 누드 마우스(Balb/c-nude Mouse, 평균무게 20-25g)의 등에 HLA G가 많이 발현되는 대장암 세포주 COLO320 1x107개 세포/ml 200 μl을 피하 주입하여, 대장암세포 이종이식 마우스 동물 모델을 제조하였다.
이식 5 일 후, 마우스를 10×106개의 NK-92 세포 및 10×106개의 인간 T 세포로 재구성하고, 재구성 3일 후 HLA G 15E7-CAR NK-PEMN(50μg mRNA/용량) 및 HLA G 15E7-CAR-IL-7/CCL19 T-PEMN(50μg mRNA/용량)을 각각 6일마다 주입하였다(도 19a). HLA G 15E7-CAR-IL-7/CCL19 T-PEMN 투여 프로토콜은 HLA G 15E7-CAR T-PEMN로 생체 외에서 측정한 HLA G 15E7-CAR 표면 발현의 동역학을 기반으로 선택되었으며, 이는 최대 8일 동안 관련 수용체 발현을 나타났다.
생체 내에서 이식 8일후 고형암에 HLA G 15E7-CAR NK-PEMN 및 HLA G 15E7-CAR-IL-7/CCL19 T-PEMN을 사용한 치료 10마리 중 7마리의 마우스에서 종양 박멸을 달성하였다(도 19b).
이는 일시적인 특성에도 불구하고 HLA G-CAR mRNA가 숙주 림프구에서 지속적인 in situ CAR 발현을 달성하기 위한 플랫폼 역할을 할 수 있음을 알 수 있었다.
11.4. NK-PEMN, T-PEMN 및 ECM 분해 효소 PEMN의 마우스 종양 모델 평가
고형암에서 면역세포 중 NK 세포 및 T 세포를 대상으로 실시례 8항에서 제조한 IVT mRNA 나노 입자 및 ECM 분해 효소 PEMN 또는 ECM 분해효소가 종양 퇴행을 어느 정도 효율적으로 일으킬 수 있는지 여부를 조사하였다.
동물은 사육 시설에 수용되었으며 센터의 IRB에서 승인한 동물 프로토콜에 따라 하였다. 14시간 빛/10시간 암흑주기와 온도가 18~23℃, 습도 40~60%가 사용하였다. 실험 동물과 대조 동물은 공동 사육하였다.
생후 8주차의 누드 마우스(Balb/c-nude Mouse, 평균무게 20-25g)의 등에 HLA G가 많이 발현되는 대장암 세포주 COLO320 1x107개 세포/ml 200 μl을 피하 주입하여, 대장암세포 이종이식 마우스 동물 모델을 제조하였다.
이식 10일 후, 마우스를 10×106개의 NK 92 세포 및 10×106개의 인간 T 세포로 재구성하고, 재구성 5일 후 ECM 분해 효소 sPH20 PEMN (50μg mRNA/용량), HLA G 15E7-CAR NK-PEMN (50μg mRNA/용량) 및 HLA G 15E7-CAR-IL7/CCL19 T-PEMN (50μg mRNA/용량)를 각각 6일마다 주입하였다(도 20a). 본 발명에서 PEMN 투여 프로토콜은 HLA G 15E7-CAR 면역세포 표적화 PEMN로 생체 외에서 측정한 HLA G-CAR 표면 발현의 동역학을 기반으로 선택되었으며, 이는 최대 8일 동안 관련 수용체 발현을 나타났다.
생체 내에서 이식 15일 고형암에 대한 ECM 분해 효소 sPH20 PEMN, HLA G 15E7-CAR NK-PEMN 및 HLA G 15E7-CAR IL7/CCR19 T-PEMN을 투여한 치료로 10마리 중 7마리의 마우스에서 종양 박멸을 달성하였다(도 20b).
이는 일시적인 발현에도 불구하고 CAR mRNA가 숙주 림프구에서 지속적인 in situ CAR 발현을 달성하기 위한 플랫폼 역할을 할 수 있음을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (25)

  1. 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    (a) 상기 대상체에 투여한 후 선택된 순환하는 NK 세포 또는 NK 세포를 포함한 두 종류 이상의 면역세포에서 관심 mRNA의 일시적 발현을 하도록 하는 구조체를 선택하는 단계;
    (b) 선택된 구조체의 치료적 유효량을 상기 대상체에 투여하는 단계;
    (c) 상기 관심 mRNA의 발현에 대해 상기 대상체를 모니터링하는 단계; 및
    (d) 상기 관심 mRNA의 발현 수준이 역치 미만으로 떨어지는 경우 선택된 구조체의 제2 치료적 유효량을 상기 대상체에 투여하여, 치료를 필요로 하는 대상체에서 치료하는 단계를 포함하며;
    여기서, 상기 선택된 구조체는
    (i) 상기 구조체 내에 캡슐화된 관심 mRNA; 및
    (ii) 상기 구조체의 최외각에 결합되고 상기 코팅의 표면으로부터 연장되는 표적화 리간드;를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역세포 표적화 구조체, 이의 용도 및 이의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 면역세포는 줄기세포, 백혈구, 과립구, 단핵구, T 림프구, 보조 T 세포, 조절 T 세포, 세포독성 T 세포, B 림프구, NK 세포, 수지상세포, 혈소판 및 NKT 세포를 포함하는 군에서 선택되어지는 어느 하나를 특징으로 하는 면역세포 표적화 구조체, 이의 용도 및 이의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 구조체는 지질나노입자(Lipid Nanoparticles, LNP) 및 폴리머나노입자(Polymer Nanoparticles, PNP)를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나를 특징으로 하는 면역세포 표적화 구조체, 이의 용도 및 이의 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 PNP는
    (a) 유효성분으로 상기 관심 mRNA에서 선택되어진 어느 하나 이상;
    (b) 양이온성 화합물에서 선택되어진 1종류 이상; 및
    (c) 상기 PNP의 최외각에 결합되고 상기 코팅의 표면으로부터 연장되는 표적화 리간드;를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역세포 표적화 구조체, 이의 용도 및 이의 제조 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 PNP는
    (a) 유효성분으로 상기 관심 mRNA에서 선택되어진 어느 하나 이상;
    (b) 양이온성 생체적합성 폴리머에서 선택된 어느 한 종류 또는 두 종류 이상:
    (c) 음이온성 화합물에서 선택된 어느 한 종류 이상; 및
    (d) 상기 PNP의 최외각에 결합되고 상기 코팅의 표면으로부터 연장되는 표적화 리간드;를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역세포 표적화 구조체, 이의 용도 및 이의 제조 방법.
  6. 제1항 내지 제5항에 있어서, 상기 면역세포 표적화 구조체는 입자 형태이거나 막 형태인 것을 특징으로 하는 면역세포 표적화 구조체, 이의 용도 및 이의 제조 방법.
  7. 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    상기 대상체에 투여한 후 선택된 면역세포에 의한 관심 mRNA의 일시적 발현을 초래하는 구조체를 선택하는 단계; 및
    상기 대상체에 선택된 구조체의 치료적 유효량을 투여하여, 예방 및 치료를 필요로 하는 대상체를 예방 및 치료하는 단계;를 포함하며,
    여기서, 상기 구조체는 구성성분들로부터 일차 구조체를 제조 단계; 및
    상기 제조된 일차 구조체를 균질화하는 단계;를 포함하는 방법으로 균질화된 다분산도가 0.3 이하이고 50 ~ 300 나노미터 입자를 특징으로 하는 면역세포 표적화 구조체, 이의 용도 및 이의 제조 방법.
  8. 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    상기 대상체에 투여한 후 선택된 면역세포에 의한 관심 mRNA의 일시적 발현을 초래하는 구조체를 선택하는 단계; 및
    상기 대상체에 선택된 구조체의 치료적 유효량을 투여하여, 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 단계;를 포함하며,
    여기서, 상기 구조체는 유효성분 관심 mRNA 및 인간 유래 고분자 전해질(polyelectrolyte)을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역세포 표적화 구조체, 이의 용도 및 이의 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 인간 유래 고분자 전해질은 양이온성 고분자 전해질로 프로타민(protamine) 및 키토산을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상; 및
    상기 음이온성 고분자 전해질로 히알루론산(hyaluronic acid) 및 인간혈청알부민을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상;을 특징으로 하는 면역세포 표적화 구조체, 이의 용도 및 이의 제조 방법.
  10. 제1항 또는 제9항에 있어서, 상기 관심 mRNA는 mRNA 발현 카세트로 TCR, CAR 및 기능 촉진 인자를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 한 종류 또는 두 종류 이상을 포함하는 특징으로 하는 면역세포 표적화 구조체, 이의 용도 및 이의 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 TCR 및 CAR는 암세포 특이적 항원을 인식하는 것을 특징으로 하는 면역세포 표적화 구조체, 이의 용도 및 이의 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 암세포 특이적 항원은 EGP2(Epithelial glycoprotein 2), EGP40(Epithelial glycoprotein 40), TAG72(Tumor associated glycoprotein 72), IL13Rα2(Interleukin 13 receptor alpha-2 subunit), CA IX(Carbonic anhydrase IX), CD19, CD52, CD33, CD20, TSLPR, CD22, CD30, GD3, CD171, ALK(Anaplastic lymphoma kinas), CD47, EGFRvIII, NCAM(Neural cell adhesion molecule), FBP(Folate binding protein), Le(Y)(Lewis-Y antigen), MUC1(Mucin 1), PSCA(Prostate stem cell antigen), PSMA(Prostate-specific membrane antigen), FGFR4(Fibroblast growth factor receptor 4), FAR(Fetal acetylcholine receptor), CEA(Carcinoembryonic antigen), HER2(Human epidermal growth factor receptor 2), Mesothelin, CD44v6(Hyaluronate receptor variant 6), B7-H3, Glypican-3,5, ROR1, Survivin, FOLR1(folate receptor), WT1(Wilm's tumor antigen), CD70 및 VEGFR2(Vascular endothelial growth factor 2)으로 이루어진 군으로부터 선택되어진 것을 특징으로 하는 면역세포 표적화 구조체, 이의 용도 및 이의 제조 방법.
  13. 제1항 내지 제12항에 있어서, 상기 암은 폐암, 췌장암, 간암, 흑색종, 골암, 유방암, 대장암, 백혈병, 자궁암, 난소암, 림프종, 및 뇌암을 포함하는 군에서 선택되어진 것을 특징으로 하는 면역세포 표적화 구조체, 이의 용도 및 이의 제조 방법.
  14. 제10항에 있어서, 상기 기능 촉진 인자는 고형암의 종양 미세환경에 의한 암세포의 면역 회피에 관련 분자로 사이토카인, 키모카인, 항체, 이중 항체 및 효소를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 특징으로 하는 면역세포 표적화 구조체, 이의 용도 및 이의 제조 방법.
  15. 제10항에 있어서, 상기 TCR, CAR 및 기능 촉진 인자를 포함하는 군에서 선택되어진 두 종류 이상을 포함하는 관심 mRNA 발현 카세트는
    한 종류와 한 종류 단백질 사이에 절단될 수 있는 링커 도메인을 포함하는 구성; 및
    한 종류와 한 종류의 mRNA 사이에 IRES를 포함하는 구성;을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나를 특징으로 하는 면역세포 표적화 구조체, 이의 용도 및 이의 제조 방법.
  16. 제1항 내지 제15항에 있어서, 상기 표적화 리간드는 항체, 펩타이드 및 압타머를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나를 특징으로 하는 면역세포 표적화 구조체, 이의 용도 및 이의 제조 방법.
  17. 제1항 내지 제16항에 있어서, 상기 표적화 리간드는
    CD1, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD11b, CD15, CD16, CD19, CD20, CD22, CD24, CD25, CD34, CD38, CD45, CD91, CD114, CD117, CD182 및 Foxp3를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나와 특이적 결합을 하는 것을 특징으로 하는 면역세포 표적화 구조체, 이의 용도 및 이의 제조 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 표적화 리간드는 상기 면역세포 표적화 구조체의 최외각 층에 결합하는 것을 특징으로 하는 면역세포 표적화 구조체, 이의 용도 및 이의 제조 방법.
  19. 제1항 내지 제18항에 있어서, 상기 면역세포 표적화 구조체는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 특징으로 하는 면역세포 표적화 구조체, 이의 용도 및 이의 제조 방법.
  20. 제1항 내지 제19항에 있어서,
    (a) 상기 대상체에 투여한 후 ECM(고형암의 세포외 기질) 분해효소 또는 이를 코딩하는 발현카세트의 발현을 초래하는 제2 구조체를 선택하는 단계;
    (b) 상기 대상체에 상기 선택된 분해효소 또는 제2 구조체의 치료적 유효량을 투여하는 단계;
    (c) 상기 분해효소 또는 ECM 분해효소의 발현에 대해 상기 대상체를 모니터링하는 단계; 및
    (d) 상기 분해효소 또는 ECM 분해효소의 발현 수준이 역치 미만으로 떨어지는 경우 상기 대상체에 선택된 분해효소 또는 제2 구조체의 제2 치료적 유효량을 투여하는 단계를 추가로 포함하며;
    여기서 상기 선택된 제2 구조체는
    (i) 양이온성 생체적합성 폴리머 코어 내에 캡슐화된 ECM 분해효소를 코딩하는 mRNA 발현 카세트; 및
    (ii) ECM 분해효소를 봉입한 코어의 외부 표면 상을 코팅한 음이온성 생체적합성 폴리머;를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역세포 표적화 구조체, 이의 용도 및 이의 제조 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 ECM 분해 효소는 Matrix metalloproteinase, Hyaluronidase 및 Heparanase를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 특징으로 하는 면역세포 표적화 구조체, 이의 용도 및 이의 제조 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 제2 나노입자는 종양 특이적 세포 표면 수용체에 결합하는 리간드를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역세포 표적화 구조체, 이의 용도 및 이의 제조 방법.
  23. 제1항 내지 제22항에 있어서, 상기 투여가 전신 또는 국소 투여를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역세포 표적화 구조체, 이의 용도 및 이의 제조 방법.
  24. 제1항 내지 제23항에 있어서, 상기 투여가 종양 부위에서 국소 투여를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역세포 표적화 구조체, 이의 용도 및 이의 제조 방법.
  25. 제1항 내지 제24항에 있어서, 상기 투여가 카테터를 통한 (a) 종양으로 또는 그 근위의 (종양 내), (b) 정맥으로 (정맥 내), 또는 (c) 복막으로 (복막 내) 주사 또는 주입을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역세포 표적화 구조체, 이의 용도 및 이의 제조 방법.
KR1020210068834A 2021-04-05 2021-05-28 면역세포를 표적화하고 관심 mRNA가 봉입된 구조체, 이의 용도 및 이의 제조방법 KR20220138309A (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN116496417A (zh) * 2023-06-27 2023-07-28 北京市肿瘤防治研究所 含有膜型il7的融合蛋白及t细胞
CN116496417B (zh) * 2023-06-27 2023-10-10 北京市肿瘤防治研究所 含有膜型il7的融合蛋白及t细胞

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