JP5734949B2 - 遺伝子療法に使用される組成物 - Google Patents
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Description
本発明は、遺伝子療法に有用な組成物および遺伝子療法を実施するための治療方法に関する。
遺伝子療法は、機能しているヒトの身体またはヒト以外の動物の身体中の内因性細胞に遺伝物質を送り込むことにより、付加的なＤＮＡ駆動能を前記細胞に追加するための、つまりたとえば、新たな遺伝子を導入したり、既存の遺伝子の複製物をさらに導入したり、現存する遺伝子の機能を損なったり、または現存しているが機能していない遺伝子を修復したりするための技術である。この技術は、ある程度、細胞培養における細胞のトランスフェクションと似ているが、しかし、治療される細胞が動物の身体の複合的な全体の一部であって、その身体の全体的な機能が維持されなければならないため、遺伝子療法は、治療される細胞へ遺伝物質を送達するメカニズムの点で特に問題に直面する。このため、遺伝物質を劣化から守り、その細胞取り込みを容易にするために、担体が使用されてきた。
解決法の一つとして、ウイルスのライフサイクルを利用することが挙げられる。ウイルスは、その遺伝物質を宿主細胞へ移し、宿主細胞（またはその子孫）の機能を用いて当該ウイルスの複製を作り放出する。そのため、所望の遺伝物質を動物の宿主細胞へと移すために、ウイルスベクターが使用されてきた。しかしながら、大きなＤＮＡを運ぶには、ウイルスベクターの容量には限界があり、その上、遺伝子治療、特にヒトの遺伝子治療におけるウイルスベクターの使用は、安全性が懸念されている（例えば、Danielsen et al., Biochimica et Biophysica Acta 1721: 44-54 (2005)（非特許文献１）を参照）。例えば、１９９９年、オルニチントランスカルボキシラーゼ損症の遺伝子治療の治験に参加した１８歳のジェシー・ゲルシンガー（Jesse Gelsinger）が、当時使用されていたアデノウイルスベクターに対する免疫反応により引き起こされたと考えられる多臓器不全により死亡した。
治療対象の細胞への直接注入、および局所注入と標的細胞のエレクトロポレーションとの組み合わせは、どちらも使用が制限されているが、これら以外に、遺伝子療法のための遺伝物質の非ウイルス送達システムとしては、二つの主要な分類がある。すなわち、リポプレックスとポリプレックスである。リポプレックスは、カチオン性脂質をアニオン性ＤＮＡと混合することによって形成されたリポソームであり、前記ＤＮＡを保護脂質外殻の中に含んでいる（例えば、Torchilin, Nature Reviews Drug Discovery 4: 145-160 (2005）（非特許文献２）参照）。ポリプレックスは、ポリカチオン性ポリマーとアニオン性ＤＮＡを含む、ナノメータサイズの自己組織化粒子である−前記ポリカチオン性ポリマーは前記ＤＮＡを取り込んで、ＤＮＡを劣化させる細胞外ヌクレアーゼなどの酵素から少なくとも部分的にＤＮＡが保護されたナノ粒子を形成しているものである（例えば、De Smet et al., Pharmaceutical Research 17: 113-126 (2000)（非特許文献３）参照）。
リポプレックスとポリプレックスはどちらも静電相互作用により形成され、表面に網状に正電荷を帯びている。この網状の電荷は、粒子が付着し合って塊状になるのを防ぎ、細胞取り込みを促進するのを助けるという利点があるが、内因性アニオン性細胞外生体分子との望ましくない静電相互作用に対して前記粒子が脆弱であるという欠点がある（Remaut et al., Materials Science and Engineering 58: 117-161 (2007)参照（非特許文献４）)。
確かに、概して、遺伝物質を標的細胞に直接注入することは、上述のように遺伝子療法において実現性が限られており、それができなければ、遺伝物質は投与から細胞取り込みまでに多くの障壁に阻まれる。単独で投与された場合は、取り込まれる前に、例えば細胞外ヌクレアーゼによって破壊される可能性が高く、一方で、複合体として投与されるならば、その複合体は遺伝物質の取り込みが起こる以前に血液、間質、粘膜層などの障壁を克服しなければならない。これら障壁を克服するためのシステムをウイルスは元来有している一方、前述のようにウイルスベクターに関連する深刻な問題がある。これら障壁、すなわち「細胞外基質」、およびその成分がＤＮＡ複合体の表面特性を劇的に変化させるかもしれず、その凝集や破壊を誘発したり、その固定化を引き起こしたり、標的細胞に到達した時に細胞に取り込まれるという能力を変化させたりする可能性がある。かかる相互作用はさらに、補体系や免疫反応を活性化させて、遺伝物質を標的細胞までうまく副作用を起こさずに送達する確率をさらに減少させるかもしれない。
その結果、応答をほとんど、または全く引き起こさないＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などの偽装物質（camouflaging materials）で、前記複合体の表面を被覆することが提案されている。しかしこれもまた問題がある。たとえば、ＰＥＧ化（ポリエチレングリコール化）された脂質によって調製されたリポプレックスは、内部ではなく表面に、ＤＮＡを保護されていない状態で担持しやすいので、ＰＥＧ化されるのはむしろリポソームでなければならない。加えて、ＰＥＧ化はリポプレックスからのＤＮＡ放出を阻害し、抗ＰＥＧ抗体を生成させるかもしれず、これにより療法が１クールの治療のみに制限されてしまう。
Danielsen et al., Biochimica et Biophysica Acta 1721: 44-54 (2005)
Torchilin, Nature Reviews Drug Discovery 4: 145-160 (2005）
De Smet et al., Pharmaceutical Research 17: 113-126 (2000)
Remaut et al., Materials Science and Engineering 58: 117-161 (2007)
このように、遺伝子療法用の遺伝物質の送達方法には依然として改善が必要である。
リポプレックスやポリプレックスのようなＤＮＡ複合体の偽装被覆（camouflage coating）のためのＰＥＧ化に代わるものが、網状ポリアニオン性オリゴ糖を使用することによって提供されること、特に、オリゴウロン酸塩、またはヘパリノイドなどの抗凝固性オリゴ糖や、その他の非免疫性網状ポリアニオン性オリゴ糖を使用することによって提供されることを本発明者らは見出した。
このように、一態様から見ると、本発明は、アニオン性核酸物質とカチオン性高分子(macromolecule)との粒子複合体と付随若しくは結合(associate)した非免疫性網状ポリアニオン性オリゴ糖を、必要に応じて少なくとも一つの医薬担体または賦形剤と共に含む、非経口遺伝子療法医薬組成物を提供する。
さらなる態様から見ると、本発明は、ヒトまたはヒト以外の脊椎動物（特に哺乳類）を対象とする非経口遺伝子療法に使用される本発明の組成物の製造のための、非免疫性網状ポリアニオン性オリゴ糖の使用を提供する。
別の態様から見ると、本発明は、ヒトまたはヒト以外の脊椎動物（特に哺乳類）を対象とする遺伝子療法の方法であって、本発明の組成物の有効量を前記対象に非経口で投与する工程を含む方法を提供する。
本発明の組成物において、前記粒子複合体は、機能性アニオン性核酸物質と高分子カチオン性保護物質との従来の組み合わせのいずれであってもよい。機能性アニオン性核酸物質とは、例えば、作動性遺伝子（operative gene）を含むかまたは内因性遺伝子の修復（correction）のために機能するＤＮＡなどであり、高分子カチオン性保護物質（macromolecular cationic protective martial）とは、たとえばリポソーム形成脂質、または核酸物質でポリプレックスを形成することができるポリカチオン性物質などである。文献に記載されているようなリポプレックスおよびポリプレックス、ならびに、その類似物であって異なる遺伝物質または脂質またはポリカチオンを含むものが、本発明の組成物の調製のための出発材料として使用されてもよい。本発明の使用に適した核酸としては、ＤＮＡや、例えばｓｉＲＮＡなどのＲＮＡがある。
本発明の組成物は、滅菌水溶液中で、遺伝物質／カチオン性薬剤粒子と過剰の網状ポリアニオン性オリゴ糖とを接触させ、前記オリゴ糖結合粒子を回収し、必要に応じてそれを洗浄し、乾燥させ、成形することにより調製してもよい。
「網状ポリアニオン性（net polyanionic）」とは、オリゴ糖が複数のアニオン性基を有し、網状の負の電荷を帯びていることを意味する。このように、静電相互作用により、オリゴ糖と、例えばリポプレックスまたはポリプレックスとの自然な付随若しくは結合（association）が起こる。
オリゴ糖の電荷は、帯電細胞外生体分子との望ましくない相互作用を減少させる。オリゴウロン酸塩やヘパリノイドなど、多くのオリゴ糖が基本的に非免疫性であり血液の凝固を起こさないため、従来のまたはＰＥＧ化されたリポプレックスおよびポリプレックスのその他の望ましくない効果が減少するか、または回避される。その上、特にオリゴ糖がオリゴウロン酸塩であるか、またはオリゴウロン酸塩を含む混合物である場合、前記オリゴウロン酸塩が粘膜関門と作用して、粒子の捕捉を防ぎ、粒子が粘膜層を透過するのを助ける。
多糖ではなくオリゴ糖を使用することにより、ポリプレックス／リポプレックスの安定性が損なわれることが無く、オリゴウロン酸塩の場合には、粘膜レオロジーを変更する能力が改善される。使用されるオリゴ糖は、好ましくは３-mer〜５０-mer、特に３-mer〜２８-merである。
オリゴ糖は好ましくは直鎖であり、合成物質であってもよいが、好ましくは天然の多糖からの誘導体であって重量平均分子量が１００,０００Ｄａより小さいものである。好ましくは、例えば分子量が３５０Ｄａ〜６０００Ｄａ、特に７５０Ｄａ〜４５００Ｄａの範囲の、３-mer〜２８-merのもの（例えば２０-merなど）、特に４-mer〜２５-mer、とりわけ６-mer〜２２-mer、特に８-mer〜１５-mer、とりわけ１０-merのものである。それは、単一の化合物であってもよく、またはオリゴ糖の混合物であってもよい。前記オリゴ糖は、オリゴウロン酸塩（例えばある範囲の重合度のもの）を主体としたもの、またはそのようなオリゴウロン酸塩単独のものであってもよい。さらに、オリゴ糖中の単量体残基、すなわち単糖基は一種類でも異なる種類であってもよい。
好適な実施形態においては、使用されるオリゴ糖は、溶媒の粘度より高い粘度を有しておらず、たとえば、標準的な条件（Ｃ＝１％，Ｈ2Ｏ）下で測定した場合に前記オリゴ糖の粘度は２０ｃＰより小さく、好適には１５ｃＰより小さい。
低分子量のヘパリンおよびヘパリノイド、および非常に分子量の低いヘパリンおよびヘパリノイドは市販されている。
天然の多糖の多くはグルロン酸残基やガラクツロン酸残基などのウロン酸残基を含むため、オリゴウロン酸塩は天然源から得ることができる。
多糖からオリゴ糖への切断により本発明により使用可能なオリゴウロン酸塩を生成することは、酵素消化法や酸加水分解法などの従来の多糖溶解技術を使用して行われてもよい。オリゴウロン酸塩はその後、多糖分解生成物から、イオン交換樹脂を使用してクロマトグラフィにより分離されるか、または分画沈殿法、分画可溶化法により分離されてもよい。
ウロン酸塩を含む多糖としては、例えば、天然に産する多糖（キサンタン、ペクチン、アルギン酸塩、ヒアルロナン、ヘパリン、およびコンドロイチン硫酸塩など）や、化学修飾された多糖があり、化学修飾された多糖としては、帯電基を付加するよう修飾された多糖（カルボキシル化グリカンやカルボキシメチル化グリカンなど）や、（例えば、過ヨウ素酸塩酸化によって）可撓性を変えるよう修飾された多糖があるが、これに限らない。適切な多糖は、たとえば「Handbook of Hydrocollids」Phillips and Williams編、CRC, Boca Raton, Florida, USA, 2000に論じられている。しかし、アルギン酸塩は、マンヌロン酸（Ｍ）とグルロン酸（Ｇ）とのブロック共重合体として天然に産生され、かつＧブロックオリゴマーはアルギン酸塩源物質から生成されうるので、アルギン酸塩の使用が特に好ましい。概して、オリゴウロン酸塩はオリゴグルロン酸であることが好ましく、次いで好ましいのはオリゴガラクツロン酸である。
アルギン酸塩がオリゴウロン酸塩の調製のための出発材料として使用される場合、グルロン酸含有量は、必要に応じて、アゾトバクター・ビネランジー（A. vinelandii）からのマンヌロン酸Ｃ−５エピメラーゼによるエピマー化によって増やしてもよい。
本発明の使用に適したオリゴグルロン酸は、ラミナリア・ハイパーボレア（Laminaria hyperborea）からのアルギン酸の酸加水分解、中性ｐＨでの溶解、鉱酸を添加してｐＨを３．４に低下させ、オリゴウロン酸を沈殿させ、弱酸によって洗浄し、中性ｐＨに件濁させて凍結乾燥させることにより、適切に生成されてもよい。
ＷＯ２００８／１２５８２８に記載されている種類のオリゴウロン酸塩の使用が特に好ましい。前記文献の内容はこの参照によりここに包含される。
オリゴウロン酸塩の対イオンは、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、塩化物、メシル酸塩、メグルミンなど、帯電薬物に通常使用される、生理学的に許容されるイオンのいずれかであればよい。例えば第２族の金属など、アルギン酸のゲル化を促進するイオンは、しかし、好適には用いられない。かかる第２族のイオンは、本発明の組成物のその他の成分にもほぼ含まれないことが望ましい。
Ｇ−ブロックオリゴウロン酸塩などのオリゴ糖の存在が遺伝物質の細胞取り込みを減少させることはないことは、実験によって示されている。
本発明の方法を使用して治療される病状は、遺伝子療法による治療をすることのできる病状であればよく、使用される遺伝物質の選択は、明らかに前記特定の病状に依存する。
治療されうる病状の例としては、癌（たとえば、骨髄疾患など）、サラセミア、嚢胞性線維症、難聴、視覚障害（たとえば、レーバー先天性黒内障）、糖尿病、ハンチントン病、Ｘ連鎖重症複合免疫不全、心臓病、および、オルニチントランスカルボキシラーゼ損症などがある。または、たとえば生物発光の遺伝子などの非内因性遺伝子を導入したり、また、たとえば内因性のｍＲＮＡに結合してその転写を阻むｍＲＮＡの断片をコードする遺伝子など、内因性遺伝子をノックアウトする遺伝子を導入するために、遺伝子療法が使用されてもよく、それにより、たとえば特定の感染性を有する実験動物を作ったり、過剰に発現する遺伝子の発現を単に減少させたりする。
本発明の組成物の投与の方式は、たとえば肺内投与や鼻腔投与、注射、点滴またはデポー配置（depot placement）、一般的には、吸入、皮下注射、筋肉注射などによって、または静脈注射、もしくは対象の臓器への直接注射による、いかなる非経口の経路であってもよい。範囲や投薬の計画は、前記特定遺伝子療法のための従来のものであればよい。
本発明の組成物は、概して、乾燥粉末状であるか、または、たとえば（滅菌）水を用いた噴霧用または注射用の懸濁液状である。前記組成物は、生理学的に許容される担体または賦形剤、たとえば担体、溶媒、分散剤、酸化防止剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、粘度調整剤などをさらに含んでいてもよい。
遺伝物質を含むリポソーム及び粒子複合体の他に、リポソームや、粒子複合体や、その他のベシクル、たとえばパクリタキセルやアンフォテリシンＢなどのその他の薬物を担持する表面正電荷を有するその他のベシクルにも、本発明を適用できる。パクリタキセルについては、特に、オリゴ糖に付随若しくは結合したカチオン性表面帯電ベシクルの非経口投与用の担体として使用すると、現在使用されている、用量に制限があるクレモフォールの使用を避けることができる。かかるその他の組成物およびその使用は、本発明のさらなる態様を構成する。この態様から見ると、本発明は、薬物を含有し、かつカチオン性シェル材料を有するベシクル（たとえばリポソーム）と、前記ベシクルの外側に非免疫性網状ポリアニオン性オリゴ糖とを含み、必要に応じてさらに医薬担体または賦形剤を含む、非経口医薬組成物を提供する。
かかるベシクルは、従来のカチオン性外殻形成剤、たとえば１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（EDOPC）などのリン脂質を使用する従来の方法で調製してもよい。一般的に、オリゴ糖は外殻形成剤に対して０．１：１〜１０：１、たとえば０．５：１〜２：１の重量比で使用される。
本発明は、下記の実施例および図面を参照して説明されるが、前記実施例および図面は本発明を制限するものではない。
図１Ａ〜１Ｃは、連続した粘液層の有る場合とない場合での粘液分泌細胞へのマイクロビーズの取り込みと、ポリアニオン性オリゴ糖処理の効果を示す。
図２Ａ〜２Ｂは、ｓｉＲＮＡリポプレックスのＨＥＫ細胞およびＨｅＬａ細胞への細胞取り込みにおけるポリアニオン性オリゴ糖の効果をそれぞれ示す。
図２Ａ〜２Ｂは、ｓｉＲＮＡリポプレックスのＨＥＫ細胞およびＨｅＬａ細胞への細胞取り込みにおけるポリアニオン性オリゴ糖の効果をそれぞれ示す。
実施例１
懸濁注射液(Injection suspension)
所望のタンパク質用の作動コーディング（operative coding）を含む核酸、すなわち細胞取り込みでタンパク質の発現をもたらすことができる核酸（たとえば、ＲＮＡやＤＮＡ、必要に応じてプラスミドの形態のＲＮＡやＤＮＡ）が、滅菌された生理的緩衝水溶液中で、１：５の重量比で錯化剤または遺伝子導入剤（たとえば、Lipofectamine（商標）、SuperFect、またはEDOPCなど）と複合体化され、従来の方式でポリプレックスまたはリポプレックスを形成する。投与前に、重合度ＤＰが１０であるグルロン酸ナトリウム（ＷＯ２００８/１２５８２８に記載のように調製）が、錯化剤／遺伝子導入剤に対する重量比１：１で添加される。
懸濁注射液(Injection suspension)
所望のタンパク質用の作動コーディング（operative coding）を含む核酸、すなわち細胞取り込みでタンパク質の発現をもたらすことができる核酸（たとえば、ＲＮＡやＤＮＡ、必要に応じてプラスミドの形態のＲＮＡやＤＮＡ）が、滅菌された生理的緩衝水溶液中で、１：５の重量比で錯化剤または遺伝子導入剤（たとえば、Lipofectamine（商標）、SuperFect、またはEDOPCなど）と複合体化され、従来の方式でポリプレックスまたはリポプレックスを形成する。投与前に、重合度ＤＰが１０であるグルロン酸ナトリウム（ＷＯ２００８/１２５８２８に記載のように調製）が、錯化剤／遺伝子導入剤に対する重量比１：１で添加される。
実施例２
懸濁注射液
所望のタンパク質用の作動コーディング（operative coding）を含む核酸、すなわち細胞取り込みでタンパク質の発現をもたらすことができる核酸（たとえば、ＲＮＡやＤＮＡ、必要に応じてプラスミドの形態のＲＮＡやＤＮＡ）が、滅菌された生理的緩衝水溶液中で、核酸塩基単位でのキトサンアミンに対する比が１：１０になるよう、キトサンと複合体化される。投与前に、重合度ＤＰが１０であるグルロン酸ナトリウム（ＷＯ２００８/１２５８２８に記載のように調製）が、前記キトサンに対する重量比１：５で添加される。
懸濁注射液
所望のタンパク質用の作動コーディング（operative coding）を含む核酸、すなわち細胞取り込みでタンパク質の発現をもたらすことができる核酸（たとえば、ＲＮＡやＤＮＡ、必要に応じてプラスミドの形態のＲＮＡやＤＮＡ）が、滅菌された生理的緩衝水溶液中で、核酸塩基単位でのキトサンアミンに対する比が１：１０になるよう、キトサンと複合体化される。投与前に、重合度ＤＰが１０であるグルロン酸ナトリウム（ＷＯ２００８/１２５８２８に記載のように調製）が、前記キトサンに対する重量比１：５で添加される。
実施例３
粘液層のある場合の細胞へのマイクロビーズの取り込み
粘液分泌ＨＴ２９−ＭＴＸ細胞のマイクロビーズを取り込む能力を評価する。不連続の粘液層を有する細胞と、連続する粘液層を有する細胞とについて下記のように調べた。
粘液層のある場合の細胞へのマイクロビーズの取り込み
粘液分泌ＨＴ２９−ＭＴＸ細胞のマイクロビーズを取り込む能力を評価する。不連続の粘液層を有する細胞と、連続する粘液層を有する細胞とについて下記のように調べた。
ＴＨ２９−ＭＴＸ細胞（Clin. Otolaryngol. Allied Sci. (2003) 28(1): P.39-42）を、２４穴プレートでコンフルエントになるまで成長させた。ダルベッコ変法イーグル培地、すなわちDMEM（GIBCO）が使用された。コンフルエントと認定されたウェルについては、細孔サイズ３μｍのTranswell（商標）フィルタ（コーニング社）下で粘液層細胞を成長させ、下の粘液層を保護するために培地の交換はすべて前記フィルタ膜を介して行った。
成長培地を除去し、７５０μｌの新鮮培地と、２５０μｌのポリアニオン性オリゴ糖（重合度ＤＰ＝２０のＧ−ブロック）または食塩（対照実験）とに変えた。
マイクロビーズ（FluoSpheres（商標）、カルボキシレート変性マイクロスフィア、０．０２μｍ、黄緑色蛍光；インビトロジェン社）４０μｌを試験ウェルに加え、０．０２％懸濁液とした。
３７℃で２時間培養し、冷ＰＢＳ（２ｍｌ）で細胞を洗浄する（ｘ２）ことにより、培養を停止した。冷トリプシン／ＥＤＴＡを使用して細胞を分離し（２ｍｌ）、培地を加え（２ｍｌ）、前記細胞を遠沈させた。冷却ＰＢＳ（２ｍｌ）中で細胞を洗浄し（ｘ２）、ＰＢＳ（０．５ｍｌ）中に懸濁させた。
蛍光色素分子に対して最適化された検出器を用い、４８８ｎｍのアルゴンレーザー光線を使用した蛍光励起によってフローサイトメトリを行った。
この実験の結果を図１Ａ、１Ｂ、１Ｃに示す。図１Ａは、不連続の粘液層がある（ポリアニオン性オリゴ糖の無い）場合のマイクロビーズの細胞への取り込みを示している。左側のピークは自家蛍光の曲線、右側のピークは蛍光ビーズを使って培養されたサンプルの結果である。図１Ｂは、連続した粘液層がある（ポリアニオン性オリゴ糖を使用しない）場合のマイクロビーズの細胞への取り込みを示している。左側のピークは自家蛍光の曲線、右側のピークは蛍光ビーズを使って培養されたサンプルの結果である。図１Ｃは、ポリアニオン性オリゴ糖で処理された連続した粘液層がある場合のマイクロビーズの細胞への取り込みを示している。左側のピークは自家蛍光の曲線、右側のピークは蛍光ビーズとポリアニオン性オリゴ糖を使って培養されたサンプルの結果である。
これらデータは、連続した粘液層がマイクロビーズの細胞取り込みに対する障壁であることを示している。ポリアニオン性オリゴ糖の添加によって、連続した粘液層のある場合のマイクロビーズの細胞への取り込みが著しく向上する。
実施例４
ｓｉＲＮＡリポプレックスの細胞取り込みに対するポリアニオン性オリゴ糖の効果
ＨｅＬａ細胞またはＨＥＫ細胞（市販）を、optiMEM（商標）成長培地（インビトロジェン社）を使用して６穴プレートでコンフルエントになるまで成長させた。
ｓｉＲＮＡリポプレックスの細胞取り込みに対するポリアニオン性オリゴ糖の効果
ＨｅＬａ細胞またはＨＥＫ細胞（市販）を、optiMEM（商標）成長培地（インビトロジェン社）を使用して６穴プレートでコンフルエントになるまで成長させた。
成長培地を除去し、７５０μｌの新鮮培地と、２５０μｌのポリアニオン性オリゴ糖（重合度ＤＰ＝２０のＧ−ブロック）または食塩（対照実験）とに変えた。
蛍光ｓｉＲＮＡ／lipofectamine（商標） RNAiMAXリポプレックス（インビトロジェン社）を、製造者推奨プロトコルにしたがって試験ウェルに加え、３７℃で２時間培養した。トランスフェクション試薬は、対照実験ウェルには加えなかった。
冷ＰＢＳ（２ｍｌ）中で細胞を洗浄する（ｘ２）ことにより培養を停止した。冷トリプシン／ＥＤＴＡを使用して細胞を分離し（２ｍｌ）、培地を加え（２ｍｌ）、前記細胞を遠沈させ、冷却ＰＢＳ（２ｍｌ）中で細胞を洗浄した（ｘ２）。細胞はＰＢＳ（０．５ｍｌ）中に懸濁させた。
蛍光色素分子に対して最適化された検出器を用い、４８８ｎｍのアルゴンレーザー光線を使用した蛍光励起によってフローサイトメトリを行った。
この実験の結果を図２Ａおよび２Ｂに示す。図２Ａは、ＨＥＫ細胞のトランスフェクションに対するポリアニオン性オリゴ糖の効果を示す−オリゴ糖が無い場合に核酸の取り込みはある程度見られる（濃い灰色の線）が、オリゴ糖存在下でより大きい取り込みが観察される（薄い灰色の線）。図２Ｂは、ＨｅＬa細胞のトランスフェクションに対するポリアニオン性オリゴ糖の効果を示す−オリゴ糖が無ければ核酸の取り込みは全く観察されない（濃い灰色の線）が、オリゴ糖存在下では顕著な取り込みが観察される（薄い灰色の線）。
これらデータは、ポリアニオン性オリゴ糖による処理が、核酸の細胞へのトランスフェクションの効率を向上させることを示している。
Claims (17)
- アニオン性核酸物質とカチオン性高分子との粒子複合体と付随若しくは結合した非免疫性網状ポリアニオン性の３-mer〜２８-merのオリゴウロン酸塩を、必要に応じて少なくとも一つの医薬担体または賦形剤と共に含む、非経口遺伝子療法医薬組成物。
- 前記粒子複合体はリポプレックスである、請求項１に記載の組成物。
- 前記粒子複合体はポリプレックスである、請求項１に記載の組成物。
- 前記オリゴウロン酸塩が、直鎖オリゴ糖である、請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
- 前記オリゴウロン酸塩が、４-mer〜２５-merである、請求項１から４のいずれかに記載の組成物。
- 前記オリゴウロン酸塩が、３５０Ｄａ〜６０００Ｄａである、請求項１から５のいずれかに記載の組成物。
- 前記オリゴウロン酸塩は、標準的な条件（Ｃ＝１％，Ｈ 2 Ｏ）下で測定する粘度が２０ｃＰより小さい、請求項１から６のいずれかに記載の組成物。
- 前記オリゴウロン酸塩が、アルギン酸のオリゴウロン酸塩である、請求項１から７のいずれかに記載の組成物。
- 前記オリゴウロン酸塩が、オリゴグルロン酸塩である、請求項１から８のいずれかに記載の組成物。
- ヒトまたはヒト以外の脊椎動物を対象とする非経口遺伝子療法に使用される請求項１から９のいずれかに記載の組成物の製造のための、オリゴウロン酸塩を含む非免疫性網状ポリアニオン性の３-mer〜２８-merのオリゴ糖の使用。
- ヒトまたはヒト以外の脊椎動物への非経口投与による遺伝子療法に使用するための、請求項１から９のいずれかに記載の組成物。
- 薬物を含有し、かつカチオン性シェル材料を有するベシクルと、前記ベシクルの外側に非免疫性網状ポリアニオン性の３-mer〜２８-merのオリゴウロン酸塩とを含む非経口医薬組成物であって、必要に応じてさらに医薬担体または賦形剤を含む、非経口医薬組成物。
- 前記ベシクルはリポソームである、請求項１２に記載の組成物。
- 前記薬物はパクリタキセルまたはアンフォテリシンＢである、請求項１２または１３に記載の組成物。
- 治療に使用するための、請求項１から９および１２から１４のいずれかに記載の組成物。
- 遺伝子療法に使用するための、請求項１５に記載の組成物。
- 癌、サラセミア、嚢胞性線維症、難聴、視覚障害、糖尿病、ハンチントン病、Ｘ連鎖重症複合免疫不全、心臓病、または、オルニチントランスカルボキシラーゼ損症の治療に使用するための、請求項１５又は１６に記載の組成物。
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