JP2011520962A - 新規カチオン性脂質を含む方法及び組成物 - Google Patents

新規カチオン性脂質を含む方法及び組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、新規カチオン性脂質、カチオン性脂質を含む組成物、及びカチオン性脂質を使用する方法を提供する。幾つかの請求項において、カチオン性脂質は細胞毒性活性を有し、細胞を殺すために、単独に又は細胞毒性生物活性化合物と組み合わせて使用することができる。これらの請求項の幾つかにおいて、カチオン性脂質は、細胞毒性生物活性化合物の細胞毒性活性を亢進する。疾患又は迷惑な病態に悩む患者を治療する方法を提供するが、この方法は患者への新規カチオン性脂質を含む輸送システムの投与を含むことを特徴とする。本発明は更に、本発明の新規カチオン性脂質を含む輸送システムを作成する方法を提供する。
【選択図】 なし

Description

この発明は、カチオン性脂質及び医薬品等の治療薬を細胞へ輸送する（delivery）ための媒体（vehicle）としてのその使用に関する。
癌のような疾患の治療において、究極の治療上のゴールは、疾患状態にある細胞を殺すこと、又はこの増殖を抑制すること又は阻害することであるが、その一つに細胞毒性医薬品を投与することがある。細胞毒性医薬品としては、アルキル化剤、抗体謝剤及び毒素など、癌の治療のために用いられる多くの化学療法医薬品が含まれる。
しかし、大部分の細胞毒性医薬品は、これらの医薬品を全身的に輸送した場合、非選択的であって、疾患状態にある細胞だけではなく健康な細胞も殺すことになり、好ましくない副作用を引き起こす。
従って、健康な細胞と比べて、疾患状態の細胞に対して、より効果的で、より特異的な細胞毒性医薬品が必要とされている。
本発明は、下記化学式（Ｉ）で表されるカチオン性脂質、又はその医薬的に許容された塩を提供する。
Figure 2011520962
 式中、ｍ及びｎは、それぞれ独立して、１〜８の整数を表し、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、−（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ３（式中、ｐは８〜２４の整数を表す。）を表し、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基及び置換アルキル基から成る群から選択され、Ｑ１及びＱ２は、
Figure 2011520962
 から成る群から選択され、但し、少なくともＱ１及びＱ２のいずれかは
Figure 2011520962
 である。
ここでは、この新規カチオン性脂質から成る組成物及び化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を使用する方法もまた開示される。この組成物には、脂質媒体及び生物活性のある化合物を含む輸送システム（delivery system）が含まれ、この脂質媒体は、生物活性のある化合物を包み込み、この脂質媒体は、化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む。
本発明はまた、化学式（Ｉ）のカチオン性脂質から成る輸送システムを用いて、細胞に生物活性のある化合物を輸送する方法である。細胞を化学式（Ｉ）の細胞毒性のあるカチオン性脂質、又は細胞毒性のある輸送システムと接触させることにより、この細胞を殺す方法が提供される。
更に、本明細書において、（i）細胞毒性の生物活性化合物及び化学式（Ｉ）の細胞毒性のカチオン性脂質を投与すること、又は（ii）細胞毒性の生物活性化合物を包み込む化学式（Ｉ）の細胞毒性のカチオン性脂質から成る脂質媒体から成るカチオン性輸送システムを投与することから成る、患者において細胞毒性の生物活性化合物の細胞毒性活性を亢進する方法が提供される。
またここでは、輸送システム及び生物活性化合物を包み込む化学式（Ｉ）のカチオン性脂質から成る脂質媒体から成るカチオン性輸送システムを作成する方法が提供される。
脂質１〜３の化学構造を示す図である。 脂質１，２及び３を合成するために用いた反応機構を示す図である。 脂質Ｎ−メチル−Ｎ−［（２−（アルギノイルアミノ）エチル）−Ｎ，Ｎ，−ジオクタデシルアンモニウムクロリド又はジステアロイルアルギニルアンモニウムクロリド］（DSAA）を合成するための反応機構を示す図である。 コレステロールを共脂質（co-lipid）（脂質／コレステロールモル比を１：１で）として用いて、血清存在下で、H460細胞における脂質１〜３のin vitroトランスフェクション効率を表す。タンパク質のRLU/μｇ（RLU: relative Luciferase unit、相対的ルシフェラーゼ発光単位）をDNA（＋／−）に対する脂質の投入量比に対してプロットした。脂質のトランスフェクション効率は、市場で入手可能なＮ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（DOTAP）及びLipofectamine(TM)2000の効率と比較した。トランスフェクション値は、同日に行った３回反復実験の平均である。
図５Ａと図５Ｂは、H460細胞で行った生存率検定の結果を示す。図５Ａは、脂質１〜３又はDOTAPで４８時間処理した生存率検定の結果を示し、図５Ｂは、１０μＭ脂質１〜３又はDOPATと前処理し、その後１時間後に異なる濃度のシスプラチン処理を行った生存率検定の結果を示す。細胞生存率は、同日に行った３回反復実験の平均である。図５Ｃは、H460細胞を１μＭの脂質１〜３又はDOTAPと異なる時間インキュベートした後、H460細胞におけるリン酸化した細胞外シグナル調節性キナーゼ（pERK）及びERKを測定するWesternブロットを示す。データ＝平均、ｎ＝３． 図６Ａは、（Ｎ，Ｎ−ジステアロイル−Ｎ−メチル−Ｎ−２［Ｎ'−（Ｎ６−グアニジノ−Ｌ−リジニル）］アミノエチルアンモニウムクロリド）DSGLA又はDOTAPをカチオン性脂質として用いて脂質／ポリカチオン／DNA-ポリエチレングリコール（LPD-PEG）又は脂質／ポリカチオン／DNA-ポリエチレングリコール−アニサミド（LPD-PEG-AA）ナノ粒子において、４時間、（無関係の標的に対する）対照５'FAＭ−標識siRNA処理後のH460細胞のケイ光写真を示す。ケイ光性siRNAを細胞より抽出し、図６Ｂに、ケイ光定量結果を示す。図６Ｃは、異なる輸送システム中で、対照siRNAと４時間処理し、ヨウ化プロピジウム染色を行ったH460細胞の試料中のヨウ化プロピジウムポジティブ細胞の割合（パーセント）を示す。図６Ｄは、異なる輸送システム内で、対照siRNAと４時間処理して、Annexin-V-FITCで染色したH460細胞のフローサイトメトリー分析を示す。
アニサミドリガンド存在下（AA+）又は不在下（AA-）で、LPD-PEGナノ粒子処理したH460細胞中の表皮性成長因子受容体（EGFR）及びβ−アクチンのWesternブロット解析を示す図である。このナノ粒子はDOTAP又はDSGLAを用いて作製された。 図８Ａは、TUNEL染色を示し、及び図８Ｂは、アニサミドリガンド存在下（AA+）又は不在下（AA-）、７２時間、異なるLPDナノ粒子処理した細胞におけるアポトーシス誘導因子（AIF）の分布を示す。核AIFを持つ細胞を、矢印で示す。LPDナノ粒子を、DOTAP又はDSGLAを用いて調製した。 カチオン性脂質DSAA、DSGLA又はDOTAPを用いて処方したLPD-PEG又はLPD-PEG-AAナノ粒子において、（無関係な標的に対する）対照3'CY3−標識siRNAと４時間処理後のB16F10細胞のケイ光写真を示す図である。 安定的にルシフェラーゼを発現し、異なるsiRNA処方物と、３７℃、２４時間インキュベートし、その後、細胞（2x105）のルシフェラーゼ活性を解析した、B16F10細胞のルシフェラーゼレポーター活性を示す図である。データ＝平均±SD（n=5）。
本発明を、本発明の幾つかの、必ずしも全てではないが、実施態様を添付した図と共により詳しく、本明細書の以下に記載するであろう。実際、これらの発明は多くの異なる形で具現化することができるので、本明細書に示した実施態様に制限すると解釈すべきではない；むしろ、これらの実施態様は、この開示を申請できる法律的要求を満たす様に提供する。全体を通して、同様の数字は、同様の要素を表す。
既述の及び関連する図で表現する本発明に関わる当業者には、本明細書に示される、本発明の多くの修正、及び他の実施態様が思い浮かぶであろう。従って、本発明は、開示した特定の実施態様に制限されず、及び修正及び他の実施態様は、添付した請求項の範囲内に含まれる様に意図されていることを理解すべきである。本明細書において、特定の用語が用いられるが、これらは、包括的及び記述的意味においてのみ用いられ、制限する目的で用いられているのではない。
用語"ａ（１つの、ある）"又は"ａｎ"は、１以上の実在物に対して用いられ、例えば、"あるカチオン性脂質"は１以上のカチオン性脂質を表すと理解すべきである。従って、用語"ａ"（又は"ａｎ"）"１以上"、及び"少なくとも１"は本明細書において互換的に使われる。
本明細書及び請求の範囲を通して、語"comprise（から成る）"、"comprises"及び"comprising"は、内容が他の意味を要求する時以外は、非排他的に用いられる。
本明細書で用いるように、用語"約"は、値に関して用いられた時、下記のばらつきは、開示した方法を行う上で、又は開示した組成物を使用する上で適切であるので、特定の量から幾つかの実施態様では±５０％、幾つかの実施態様では±２０％、幾つかの実施態様では±１０％、幾つかの実施態様では±５％、幾つかの実施態様では±１％、幾つかの実施態様では±０．５％、幾つかの実施態様では±０．１％、のばらつきを包含する。
Ｉ．組成物
本明細書に、新規カチオン性脂質及びこれを含む医薬組成物を提供する。更に、本発明のカチオン性脂質を含む輸送システムを提供する。
Ｉ−Ａ．カチオン性脂質
本発明は、単一又は２個のグアニジニウムヘッド基を持つ、グアニジニウムを含むカチオン性、両親媒性脂質を提供する。グアニジニウム基は、高いｐＫａ値（１３．５）により、他の塩基性置換基と比べて、より広いｐＨ範囲においてプロトン化したままである。この性質は、この脂質のカチオン性の性質に寄与する。
新規カチオン性脂質は、下記化学式（Ｉ）で表されるカチオン性脂質、又はその医薬的に許容された塩である。
Figure 2011520962
 式中、ｍ及びｎは、それぞれ独立して、１〜８の整数を表し、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、−（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ３（式中、ｐは８〜２４の整数を表す。）を表し、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基及び置換アルキル基から成る群から選択され、Ｑ１及びＱ２は、
Figure 2011520962
 から成る群から選択され、但し、少なくともＱ１及びＱ２のいずれかは
Figure 2011520962
 である。
化学式（Ｉ）のカチオン性脂質の幾つかの実施態様において、ｍは２であり、ｎは４であり、ｐは１３であり、Ｒ３及びＲ４は、それぞれメチル基であり、及びこのカチオン性脂質を、下記の
Figure 2011520962
 ；Ｎ，Ｎ−ジミリストイル−Ｎ−メチル−Ｎ−２［Ｎ'−（Ｎ６−グアニジノ−Ｌ−リジニル）］アミノエチルアンモニウムクロリド（DMGLA）（以下「脂質１」という。図１参照）、
Figure 2011520962
 ；Ｎ，Ｎ−ジミリストイル−Ｎ−メチル−Ｎ−２［Ｎ２−グアニジノ−Ｌ−リジニル］アミノエチルアンモニウムクロリド（以下「脂質２」という。図１参照）、及び
Figure 2011520962
 ；Ｎ，Ｎ−ジミリストイル−Ｎ−メチル−Ｎ−２［Ｎ'−（Ｎ２，Ｎ６−ジグアニジノ−Ｌ−リジニル）］アミノエチルアンモニウムクロリド（以下「脂質３」という。図１参照）からなる群から選択することができる。
化学式（Ｉ）のカチオン性脂質のある実施態様において、ｍは２であり、ｎは３であり、ｐは１７であり、Ｒ３は水素原子であり、Ｒ４はメチル基であり、
Ｑ１及びＱ２は
Figure 2011520962
 であり、脂質は下記の化学構造：
Figure 2011520962
 （以下「N-メチル-N-(2-（アルギノイルアミノ）エチル)-N,N-ジオクタデシルアンモニウムクロリド又はジステアロイルアルギニルアンモニウムクロリド］（DSAA）」という。）を有する。
化学式（Ｉ）のカチオン性脂質の他の実施態様において、ｍは２であり、ｎは４であり、ｐは１７であり、Ｒ３及びＲ４の各々は、メチル基であり、Ｑ１及びＱ２は
Figure 2011520962
 であり、化学式（Ｉ）のカチオン性脂質は、以下の化学構造：
Figure 2011520962
 N,N-ジステアロイル-N-メチル-N-2[N'-(N6-グアニジノ-L-リジニル）］アミノエチルアンモニウムクロリド（以下「DSGLA」という。）を有する。本発明の目的のために、DSAA及びDSGLAを脂質１（DMGLA）の誘導体という。
本明細書で用いるように、"誘導体"は、親化合物由来の、又は親子合物から得られた化学化合物を表し、親化合物の重要な要素を含むが、一般的に１以上の異なる官能基を有する。このような官能基は、例えば、分子の溶解度、吸収、生物的半減期、ケイ光特性等々を改善するために、又は分子の毒性を減少させるために、及び分子のどのような期待しない副作用をも除去又は弱める、等々のために、親化合物に添加することができる。用語"誘導体"は、本明細書に記載するように、医薬的に許容された塩を包括すると言うことを理解するべきである。"活性のある誘導体"は、本明細書において列挙した活性を維持する誘導体である（例えば、細胞に生物活性のある化合物の輸送能、細胞毒性活性）。
ヒトは、本明細書に記載した方法を始め、化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を調製するための当業者に既知のどのような方法をも用いることができる。カチオン性脂質の合成のための非限定性の合成法を実施例１及び９に要約し、図２及び図３に描写する。
化学式（Ｉ）のカチオン性脂質は、当業者にはよく知られた方法を用いてその構成物質から単離され、又は精製されることができる。従って、本発明は、化学式（Ｉ）の単離したカチオン性脂質を具現化し、ここで用語"単離"は、脂質種に関係する時、脂質が、全ての他の物質から、完全に又は部分的に、分離されることを意味する。単離した脂質はまた、溶媒に溶かした脂質を表すことができる。
Ｉ−Ａ−１．医薬的に許容された塩
本明細書で記載した、カチオン性脂質を、医薬的に許容された塩として処方することができる。本明細書で用いたように、成句"医薬的に許容された塩（複数）"は、（i）本発明の化合物の塩は安全であり、及び（ii）患者における使用のために効果的であり、及び（iii）所望の生物活性を有することを意味する。医薬的に許容された塩は、本発明の化合物にある酸性置換基又は塩基性置換基の塩を含む。医薬的に許容された付加塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、過リン酸塩、ホウ酸塩、イソニコチン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルカル酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、パモ酸塩（即ち、１，１'−メチレンビス（２−ヒドロキシー３−ナフチン酸塩））、メシル酸塩、があるが、これらに制限されない。本明細書に開示した化合物は、様々なアミノ酸と共に、医薬的に許容された塩を作製することができる。適切な、塩基塩としては、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛、及びジエタノールアミン塩があるが、これらに制限されない。医薬的に許容される塩の総説には、本明細書の参考文献に取り込んでいる、Berge et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19。本明細書に記載した脂質の塩を、例えば、化合物の適切な相当物と、溶液中の所望の酸又は塩基との反応により、調製することができる。反応完了後、適切量の、塩が不溶な溶媒を添加することにより、溶液から再結晶する。
Ｉ−Ａ−２．細胞毒性脂質
幾つかの実施態様において、化学式（Ｉ）のカチオン性脂質は、細胞毒性活性を有する。本明細書で使用するように、"細胞毒性活性"を有する化合物は、細胞と接触する、又は細胞中に入ると、細胞の増殖、細胞分裂又は、成長速度を抑制又は減少をもたらす化合物（即ち、カチオン性脂質又は薬剤）を含む。細胞毒性分子はまた、ネクローシス又はアポトーシスによる、細胞死を誘導することができる。
細胞毒性活性について分子を検査する方法は、当業者によく知られ、以下のin vitro検定：（i）テトラゾリウム塩３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミドを用いたミトコンドリア還元酵素の活性を測定する、比色活性である、MTT検定；（ii） XTT及びWST検定のような他のテトラゾリウム塩及びホルマザン色素を用いる同様な検定；（iii）トリパンブルー（TB）検定；（iv）スルホローダミンＢ（SRB）検定；及び（v）クローン原性検定を含むが、これらに制限されない。更に、細胞のネクローシス及びアポトーシスのレベルを測定するための、当業者に既知の方法を、カチオン性脂質又は薬剤が細胞毒性活性を持つかどうか決定するために用いることができる。アポトーシスを測定するためのこのような方法としては、TUNEL検定、カスパーゼ活性の測定、DNA断片化、ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ（PARP）活性化、ミトコンドリアチトクロームＣ流出、アポトーシス誘発性因子（AIF）移行、及びAnnexin-V染色が含まれるが、これらに制限されない。幾つかの実施態様において細胞毒性分子と接触後、死んだ、又は増殖、細胞分裂、又は細胞成長速度の低下を示す細胞の割合（パーセンテージ）は、約１％から約１００％の範囲内にあり、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％，及び約１％及び約１００％のどのような他の値をも含む。
作用のどのような理論又はメカニズムに囚われることなく、電子を容易に供与する化学式（Ｉ）のカチオン性脂質のグアニジニウム基は、この化合物の細胞毒性に寄与する可能性のあるヒドロキシルラジカルを作成しつつスーパーオキシドを産生することができると信じられている（Hiramatsu (2003) Mol. Cell. Biochem. 244:57-62）。更に、脂質１の誘導体であるDSGLAは、活性酸素種（ROS）を誘導することができる（データ非表示）。作用のどのような理論又はメカニズムに囚われることなく、DSGLA誘発性ROSは、（i）ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼー１（PARP-1）活性化を亢進し、及び（ii）アポトーシス誘導の重要事項である（Fleury, Mignotte,及び Vayssiere (2002) Biochimie 84:131-141; Zorov, Juhaszova, 及び Sollott (2006) Biochim. Biophys. Acta 1757:509-517）ミトコンドリアから核へのAIF移行の引き金となり、膜障害及びＤＮＡ損傷をもたらすことができる。DSGLAはまた、ERKの活性化を阻害し（図５Ｃ及び実験的実施例４）、これもまたアポトーシスの引き金となることができるであろう（Liu et al. (2006) Oncogene 25:5640-5647）。
Ｉ−Ａ−３．向標的リガンド
更に、化学式（Ｉ）のカチオン性脂質、及びカチオン性脂質と物理的に会合する向標的リガンド（標的を狙うリガンド（配位子）（targeting ligand）を"向標的リガンド"と訳す）を含む組成物を提供する。幾つかの実施態様において、向標的リガンドと物理的に会合する化学式（Ｉ）のカチオン性脂質は、細胞毒性活性を有する。
"向標的リガンド"により、カチオン性脂質、又は物理的な会合分子をして、標的細胞又は標的組織を標的として狙わせる分子を意図する。向標的リガンドは、小分子、ペプチド、脂質、糖、オリゴヌクレオチド、ホルモン、ビタミン、抗原、抗体又はこの断片、特定の膜受容体リガンド、抗リガンドと反応性のあるリガンド、融合誘導ペプチド、核局在化ペプチド、又はこれらの化合物の組合せを含むことができるが、これらに制限されない。向標的リガンドの非限定例としては、アシアロ糖タンパク質、インシュリン、低密度リポタンパク質（LDL）、葉酸塩、ベンズアミド誘導体、及び細胞表面分子に対するモノクローナル及びポリクローナル抗体がある。幾つかの実施例において、小分子は、ベンズアミド誘導体を含む。幾つかの実施態様において、ベンズアミド誘導体は、アニサミドを含む。
"標的細胞"と言う用語で、向標的リガンドが細胞を標的として物理的な会合分子を補充する、その標的となる細胞を意図する。向標的リガンドは、標的細胞の１以上の構成要素と相互作用することができる。標的細胞は、様々な表現形質を発現する、どのような細胞型又はどのような発生段階であることもできて、様々な病理状態（即ち、異常及び正常状態）にあることができる。例えば、向標的リガンドは、正常、異常、及び／又は微生物上、又は真核細胞（即ち、表皮細胞、筋肉細胞、神経細胞、感覚細胞、癌細胞、分泌細胞、悪性細胞、赤血球及び白血球細胞、幹細胞）上のユニークな構成要素（即ち、原核細胞（バクテリア）、ウィルス、菌類、原生動物、又は寄生動物）と会合することができる。従って、向標的リガンドは、例えば、腫瘍関連抗原、及び自己免疫疾患関連抗原を含む疾患関連の抗原である、標的細胞の構成要素と会合することができる。このような、疾患関連抗原としては、成長因子受容体、細胞周期調節因子、血管由来因子、及びシグナリング因子を含む。
幾つかの実施態様において、向標的リガンドは、標的細胞上の細胞表面タンパク質と相互作用する。幾つかの実施態様において、向標的リガンドと結合できる細胞表面タンパク質の発現レベルは、他の細胞と比較して標的細胞において高い。例えば、癌細胞は、HER2受容体（乳癌）又はシグマ受容体のような、ある種の細胞表面分子を過剰発現する。向標的リガンドがアニサミドのようなベンズアミド誘導体を含む、ある実施態様において、向標的リガンドは、シグマ受容体過剰発現細胞に会合する分子を標的とする（Aydar, Palmer, and Djamgoz (2004) Cancer Res. 64:5029-5035）が、このシグマ受容体過剰発現細胞には、小及び非小細胞肺癌細胞、腎臓癌、直腸癌、肉腫、乳癌、メラノーマ、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、及び前立腺癌のような、癌細胞を含めることができるが、それに制限されない。
従って、幾つかの実施態様において、標的細胞は癌細胞を含む。用語"癌"又は"癌性の"は、一般的に調節から外れた細胞増殖で特徴付けられる、哺乳動物の生理的状態を表す、又は記載する。本明細書で用いるように、"癌細胞"又は"腫瘍細胞"は、この調節から外れた細胞増殖により特徴付けられる細胞を表す。用語"癌"は、あらゆる種類の癌を包含し、全ての種類の癌腫、メラノーマ、肉腫、リンパ腫及び白血病を含むが、これらに制限されず、制限付け無しに、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、子宮内膜癌、肝臓癌、咽頭癌、肺癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、及び甲状腺癌を含む。幾つかの実施態様において、標的癌細胞は、肺癌細胞を含む。用語"肺癌"は、全ての種類の肺癌を含み、小細胞肺癌（SCLC）、非小細胞肺癌（NSCLC,
これは、大細胞肺癌、扁平上皮肺癌、及び肺の腺癌を含む）及び小細胞／大細胞混合肺癌におよぶが、これらに制限されない。
向標的リガンドは、物理的に化学式（Ｉ）のカチオン性脂質と会合することができる。本明細書で用いるように、用語"物理的に会合"は、２つの分子間の共有結合又は非共有結合による相互作用のいずれかを表す。本明細書で用いるように、用語"共有結合"又は"共有結合による相互作用"は、１対の電子を２個の原子が共有する化学結合を表す。分子が少なくとも１化学結合を（分子を作る）２個の原子間に有する時、２個の分子は、互いに化学的に結合すると言える。従って、２個の分子間の１化学結合は、１方の分子内の１原子と他方の分子の１原子との間で、１対の電子の共有を含む。例えば、向標的リガンドは、カチオン性脂質の窒素原子の１個、又はＲ基の１個を介して、本発明の脂質と共有結合することができる。"接合体"は、互いに共有結合する分子の複合体を表す。例えば、向標的リガンドに共有結合する脂質の複合体は、脂質向標的リガンド接合体と表すことができる。
あるいは、向標的リガンドは、化学式（Ｉ）の脂質、又はこの活性な誘導体と非共有的に結合することができる。"非共有結合"又は"非共有結合的相互作用"は、電子対の共有を伴わないが、より多くの分散変形した電磁場相互作用を伴い、水素結合、イオン性相互作用、Van der Waals相互作用及び疎水結合を含むことができる。このような脂質向標的リガンド接合体は、広く文献に記載されている技術に従い直ちに得ることができる。
Ｉ−Ｂ．輸送システム
本発明は、更に、輸送システムを提供する。本明細書で用いるように、"輸送システム"又は"輸送システム複合体"は、脂質媒体、及び生物活性化合物を含むが、ここで脂質媒体は、生物活性化合物を包み込む。本明細書で用いるように、"脂質媒体"は、生物活性化合物を生理的部位又は細胞に運搬できる脂質組成物を表す。脂質媒体は、ミセル、ミクロ乳濁液、マクロ乳濁液、及びリポソームを含むことができるが、これらに制限されない。脂質媒体は、化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む。この脂質媒体は、更に、少なくとも１種の付加的種類の脂質を含むことができて、本明細書に記載する他のカチオン性脂質、及び共脂質にを含むが、これらに限らない。
本明細書で用いるように、用語"脂質"は、親油性又は両親媒性特性を持つ有機化合物の１群を表し、脂肪、脂肪油、精油、ワックス、ステロイド、ステロール、リン脂質、糖脂質、スルホ脂質、アミノ脂質、色素脂質（脂肪色素）、及び脂肪酸が含まれる、これらに制限されない。用語"脂質"は、天然脂質及び合成脂質の両者を包含する。"親油性"は、脂肪、油、脂質、及び有機溶媒のような非極性溶媒に可溶な有機化合物を表す。親油性化合物は、水に殆ど、又は全く溶けない。従って、親油性化合物は、疎水性である。"両親媒性脂質（アムフィパティックリピド）"は、また本明細書において、"両親媒性脂質（アムフィフィリックリピド）"と表され、親水性及び疎水性特徴の両者を持つ脂質を表す。両親媒性脂質の疎水基は、以下により詳細に記載するように、長鎖の炭化水素基であることができる。両親媒性脂質の親水基は、例えばアニオン性又はカチオン性基のような荷電置換基、又は極性のある非荷電置換基を含むことができる。両親媒性脂質は、多数の疎水基、多数の親水基、及びこれらの組合せを持つことができる。疎水基及び親水基を有するために、両親媒性脂質は、水に可溶であり、及びある程度まで、非極性有機溶媒に可溶であることができる。
本明細書で用いるように、"親水性"は、水分子（H2O）と水素結合ができる分子の物理的特性であり、及び水及び他の極性溶媒に可溶である。用語"親水性"及び"極性"は、互換的に用いられる。親水性の特徴は、炭水化物、リン酸塩、カルボキシル基、硫酸基、アミノ基、スルフヒドリル基、ニトロ基、ヒドロキシ基、等々のような極性又は荷電置換基の存在に帰因する。
逆に、用語"疎水性"は、大部分の水から反撥される分子の物理的特性であり、"疎水性"と互換的に用いられる用語である"非極性"又は"無極性"とも表すことができる。疎水性は、無極性置換基を含ませることにより与えることができて、無極性置換基としては、長鎖飽和及び不飽和脂肪族炭化水素基、及び、１以上の芳香族、環状脂肪族、又は複素環式置換基により置き換えられた置換基が含まれるが、これにより制限されない。
脂質媒体は、リン脂質、アミノ脂質、及びスフィンゴ脂質を含むが、これらに制限されない、両親媒性脂質を含む。リン脂質の代表例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、及び
ジリノレオイルホスファチジルコリンがあるが、これらに制限されない。スフィンゴ脂質、グリコスフィンゴ脂質族、ジアシルグリセロール及びβアシロキシ酸のような、リンを欠く他の化合物もまた、両親媒性脂質と表される群に属する。両親媒性脂質は、カチオン性、アニオン性、両性イオン性、又は中性両親媒性脂質を含む。
輸送システムの脂質媒体は、化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含み、及び他のカチオン性脂質を含むことができる。本明細書で用いるように、"カチオン性脂質"は、当業者に既知のどのような方法を用いても測定できる、生理的ｐＨにおいて、正味の正荷電を持つ多数の脂質種のいずれも包含する。このような脂質として、本明細書に記載した脂質、及び他の以前に記載されたカチオン性脂質を含み、これらに制限されないが、以前に記載された脂質としては、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウム クロリド ("DODAC"); N-(2,3-ジオレオイルオキシ) プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド ("DOTAP"); N-(2,3-ジオレイルオキシ) プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド ("DOTMA") 又は他の N-(N,N-1-ジアルコキシ)-アルキル-N,N,N-トリ置換アンモニウム界面活性剤; N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムブロミド("DDAB"); 3-(N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル) コレステロール ("DC-Chol") 及びN-(1,2-ジミリスチルオキシプロプ-3-イル)-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド ("DMRIE")；1,3-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン, N-(1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N-(2-(スペルミンカルボクスアミド)エチル)-N,N-ジメチル- l アンモニウムトリフルオロ-アセテート (DOSPA)； GAP-DLRIE; DMDHP; 3-β[4N-(1N,8N-ジグアニジノスペルミジン)-カルバモイル] コレステロール (BGSC)； 3-β[N,N-ジグアニジノエチル-アミノエタン]-カルバモイル] コレステロール(BGTC); N,N1,N2,N3 テトラ-メチルテトラパルミチルスペルミン(セルフェクチン)；N-t-ブチル-N'-テトラデシル-3-テトラデシル-アミノプロピオン-アミジン (CLONfectin)；ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド (DDAB)；1,3-ジオレオイルオキシ-2-(6-カルボキシスペルミル)-プロピルアミド (DOSPER)；4-(2,3-ビス−パルミトイルオキシプロピル)-1-メチル-1H-イミダゾール(DPIM) N,N,N',N'-テトラメチル-N,N'-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2,3ジオレオイルオキシ-1,4-ブタンジアンモニウムイオディド) (Tfx-50)； 1,2 ジオレオイル-3-(4'-トリメチルアンモニオ) ブタノール-sn-グリセロール (DOBT) 又は コレステリル (4'トリメチルアンモニア) ブタノエート (ChOTB)ここで、トリメチルアンモニウム基は、ブタノールスペーサーアームを介して２重鎖 (DOTBに対して) 又はコレステリル基に結合する(ChOTBに対して)； DORI (DL-1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアミノプロピル-β-ヒドロキシエチルアンモニウム) 又は DORIE (DL-1,2-O-ジオレオイル-3-ジメチルアミノプロピル-β-ヒドロキシアンモニウム) (DORIE)又はWO 93/03709に開示した上記の類似体； 1,2-ジオレオイル-3-スクシニル-sn-グリセロール コリンエステル(DOSC)；コレステリル ヘミスクシネートエステル(ChOSC)；ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン (DOGS)及びジパルミトイルホスファチジルエタノールアミルスペルミン(DPPES) 又は米国特許No.5,283,185に開示されたカチオン性脂質 のようなリポポリアミン；コレステリル-3β-カルボキシル-アミド-エチレントリメチルアンモニウム イオディド； 1-ジメチルアミノ-3-トリメチルアンモニオ-DL-2-プロピルコレステリル カルボキシレートイオディド； コレステリル-3-β-カルボキシアミドエチレンアミン； コレステリル-3-β-オキシスクシンアミド-エチレントリメチルアンモニウム イオディド；1-ジメチルアミノ-3-トリメチルアンモニオ-DL-2-プロピル-コレステリル-3-β-オキシスクシネートイオディド； 2-(2-トリメチルアンモニオ)-エチルメチルアミノエチルコレステリル -3-β-オキシスクシネートイオディド; 及び3-β-N-(ポリエチレンイミン)-カルバモイルコレステロール。
幾つかの実施態様において、カチオン性脂質に加えて、輸送システムに用いられる脂質媒体は、共脂質を含む。本明細書で用いるように、"共脂質"は、中性の（非荷電）、両性の、又はアニオン性脂質を含む、非カチオン性脂質を表す。用語、"中性脂質"は、生理的ｐＨにおいて、非荷電又は中性の両性型のいずれか一方で存在する、どのような数の脂質種をも表わす。用語"アニオン性脂質"は、生理的ｐＨにおいて、正味負荷電を担う多数の脂質種のいずれかを包含する。共脂質としては、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシド及び ジアシルグリセロール、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、ホスファチジン酸、ジセチルリン酸塩、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジオレオオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール(POPG)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、パルミトイルオレイルホスファチジルコリン(POPC)、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン(POPE)、及びジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシレート (DOPE-mal)、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、 アセチルパルミチン酸塩、グリセロールリシノール酸塩、ヘキサデシルステアリン酸塩、イソプロピルミリスチン酸塩、両性のアクリルポリマー、 トリエタノールアミンラウリル硫酸塩、アルキル−アリール硫酸塩ポリエチルオキシル化した脂肪酸アミド、リゾホスファチジルコリン、及びジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド等々のようなリン脂質関連薬剤を含むことができるが、これらに制限されない。共脂質はまた、米国特許No.5,820,873に記載され、その全体が本明細書の参考文献に取り込まれている、PEG2000、PEG5000のようなポリエチレングリコールをベースとしたポリマー 及びリン脂質又はセラミドと接合したポリエチレングリコールを含む。
化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む輸送システムの脂質媒体は、ミセル、ミクロ乳濁液、マクロ乳濁液及びリポソームを含むことができるが、これらに制限されない。
用語"ミセル"は、臨界ミセル濃度として知られる良く定義された濃度で形成された、化学式（Ｉ）の新規カチオン性脂質のような、両親媒性分子のコロイド状集合体を表す。ミセルは、脂質分子の非極性部分をミセルの内部に、及び極性部分を水に曝される外部表面に配向する。ミセルにおける集合体分子の一般的数（凝集数）は、約５０から約１００の範囲である。用語"ミセル"はまた、逆又は反転ミセルを表し、これらは非極性溶媒で形成し、ここでは、非極性部分は、非極性溶媒に曝される外部表面にあり、極性部分は、ミセルの内部に配向する。
本明細書に記載したように、全てのミセル溶液が膨張してミクロ乳濁液を作製できるとは限らないが、ミクロ乳濁液は実質的に膨張したミセルである。ミクロ乳濁液は、熱力学的に安定であり、自発的に形成し、極端に小さい粒子を含む。ミクロ乳濁液の粒子の直径は一般的に約１０から約１００ｎｍである。対照的に、用語マクロ乳濁液は、直径が１００ｎｍ以上の粒子を表す。
リポソームは、水溶性内部又はコアを包み込む脂質２重層を含む、自己集合性のある、実質的に球体の媒体であり、ここで脂質２重層は、親水性ヘッド基及び疎水性尾部を有する両親媒性脂質を含み、ここで両親媒性脂質分子の親水性ヘッド基は、水溶液の方向に配向し、他方疎水性尾部は２重層の内部方向へ配向する。従って、脂質２重層構造は、"内部リーフレット（層）"及び"外部リーフレット"と表わされる、２種の相反する単層を含み、ここで疎水性尾部は、周囲の溶液との接触から遮蔽されている。"内部リーフレット"は、親水性ヘッド基がリポソームの水溶性コアに向かって配向する単層である。"外部リーフレット"は、両親媒性脂質を含む単層であり、ここで親水性ヘッド基は、リポソームの外部表面に向かって配向する。リポソームは、一般的に、約２５ｎｍから約１μｍの範囲の直径を持つ。（Shah (編.) (1998) Micelles, Microemulsions, and Monolayers: Science and Technology, Marcel Dekker; Janoff (ed.) (1998) Liposomes: Rational Design, Marcel Dekkerを参照）。用語"リポソーム"は、どこでも水相の層と交互に２から数百の同心の脂質２重層を含む多層状リポソーム、及び単一脂質２重層を含む単層状小胞の両者を含む。リポソーム作成法は、当業者によく知られており、本明細書の他の所に記載する。化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含むリポソームは、リポソームの脂質層に取り込まれたカチオン性脂質を有する。
本明細書で用いるように、用語"外部表面"は、通常の意味を有し、媒体の内部コアと反対の、脂質媒体の外部表面を表す。
輸送システムの脂質媒体は、生物活性化合物を包み込む。用語"包み込む"及び"封入する"は、本明細書において、互換的に用いられ、及び脂質媒体の中又は共に、薬物又は分子（例えば、生物活性分子）の取り込み、又は会合を表す。例えば、脂質媒体が、リポソームであるこれらの実施態様において、薬物又は分子は、脂質２重層と会合できる（例えば、もし薬物又は分子が疎水性であるならば）、又はリポソームの水溶性内部に存在することができる（例えば、もし薬物又は分子が親水性であるならば）、又は両者であることができる。疎水性薬物はまた、ミセル、ミクロ乳濁液、又はマクロ乳濁液内に包み込まれることができる。
Ｉ−Ｂ−１．カチオン性リポソーム
本発明に従い、輸送システムの脂質媒体は、カチオン性リポソームであることができる。本明細書で用いる、用語"カチオン性リポソーム"は、正味の正荷電又は生理的ｐＨで、０ｍＶ以上のツェーター電位を有する前述の様に定義したどのようなリポソームをも包含することを意図する。リポソームのツェーター電位又は電荷は、当業者に既知のどのような方法によってでも測定できる。リポソーム自体は、カチオン性と決められた実体であり、生理的ｐＨにおいて、測定しうる正荷電を有するリポソームは、in vivo環境において、他の薬物に付着することができることを意味することに注意すべきである。これらの他の薬物は、負荷電であることができて、従って正荷電を持たない構造の形成をもたらす。カチオン性リポソームを含む輸送システムが作られた後、脂質−PEG接合体のような分子は、本明細書の他の所で記載するリポソーム２重層に挿入できて、従って、表面荷電を遮蔽し、及び輸送システムのツェーター電位を減少させる。
輸送システムの脂質媒体がカチオン性リポソームであるこれらの実施態様において、カチオン性リポソームは、化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含み、及び任意に、本明細書の他の所で記載したが、それに制限されない、付加的なカチオン性脂質を含む。カチオン性リポソームは、完全にカチオン性脂質を含む必要はないが、リポソームは生理的ｐＨで正荷電を有する十分な量のカチオン性脂質を含まなければならない。リポソームの正味の荷電が正であり、及び／又はリポソームの表面が生理的ｐＨで正荷電である限り、カチオン性リポソームはまた、負荷電の、又は中性荷電の共脂質を含むことができる。
これらの実施態様において、共脂質に対するカチオン性脂質の比は、生理的ｐＨにおいて得られたリポソームの全体としての荷電が正であるような割合である。例えば、カチオン性脂質は、リポソームにおいて、全リポソーム脂質中、約１０モル％から約１００モル％、幾つかの実施態様において、約２０モル％から約８０モル％、及び他の実施態様において、約２０モル％から約６０モル％において存在する。リポソームに含まれた、中性脂質は、全リポソーム脂質の中、約０モル％から約９０モル％、幾つかの実施態様では、約２０モル％から約８０モル％、及び他の実施態様において、約４０モル％から約８０モル％の濃度で存在することができる。リポソ−ムに取り込まれた時、負荷電の脂質は、全リポソーム脂質の中、約０モル％から約４９モル％、及びある実施態様において、約０モル％から約４０モル％の範囲の濃度で存在することができる。
幾つかの実施態様において、本輸送システムのカチオン性リポソームは、化学式（Ｉ）のカチオン性脂質及び中性共脂質コレステロールを１：１モル比で含む。
輸送システムの脂質媒体がカチオン性リポソームである幾つかの実施態様において、カチオン性リポソームは、アニオン生物活性化合物（即ち、生理的ｐＨにおいて、負荷電である生物活性化合物）を包み込む。これらの実施態様において、カチオン性リポソームを含む正荷電のカチオン性脂質は、対立する分子荷電の間の引力により負荷電のアニオン性生物活性化合物と物理的に会合する。
脂質媒体がカチオン性リポソームであり、及び生物活性化合物がアニオン性である、幾つかの実施態様において、その全体が本明細書の参考文献に取り込まれている米国特許No.6,008,202記載されているように、輸送システムは、正味正荷電を有する。"正味正荷電"はカチオン性脂質（及び、本明細書の他の所に記載したように、任意にポリカチオン）の正荷電が、アニオン性生物活性化合物の負荷電を越えることを意味する。しかしながら、本発明はまた、複合体の正味の荷電が正、中性、又は負であっても、関係なく正に荷電した表面を有する脂質媒体を含む輸送システムを包含することを理解すべきである。輸送システムのカチオン性リポソームの表面荷電は、ゼーターポテンシャルの測定（Martin, Swarick, 及び Cammarata (1983) "物理的製薬学及び薬学における物理的化学的原理（Physical Pharmacy & Physical Chemical Principles in the Pharmaceutical Sciences）"第３版. Lea and Febiger）、又は輸送システム複合体の細胞表面への結合親和性の測定のような、当業者に既知の方法により、電場における複合体の移動により測定することができる。正に荷電した表面を示す複合体は、中性、又は負に荷電した表面を持つ複合体より細胞表面に対してより大きな結合親和性を有する。更に、正に荷電した表面は、本明細書の他の所で記載するように、例えば、ポリエチレングリコールのような、非イオン的極性化合物の添加により、立体的に遮蔽することができることが理解される。
Ｉ−Ｂ−２．生物活性化合物
"生物活性化合物"により、生きている細胞、組織、又は組織体に効果を持つどのような薬剤又は生きている細胞、組織、又は組織体の構成成分（例えば、酵素）と相互作用できる薬剤をも意図し、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリサッカライド、有機又は無機小分子を含むが、これらに限らない。用語"生物活性化合物"は、天然に生ずる生物活性化合物及び合成生物活性化合物の両者を包含する。用語"生物活性化合物"は、また生物分子と相互作用する検出薬剤又は診断薬剤を表し、特定の生理的又は病理的事象を反映する検出可能な読み出し情報を提供することができる。
輸送システムの生物活性化合物は、薬物であることができて、抗菌薬、抗生物質、抗微生物薬、抗真菌剤、抗ウィルス薬、抗腫瘍剤、免疫応答に影響を与える薬剤、血液カルシウム調整剤、糖調節に有用な薬剤、抗凝血薬、抗血栓剤、抗高脂血剤、心臓病の薬、甲状腺ホルモン受容体アゴニスト及び抗甲状腺剤、アドレナリン作用薬、抗高血圧薬剤、コリン作動薬、抗コリン作動薬、鎮痙薬、抗潰瘍薬、骨格筋及び平滑筋弛緩剤、プロスタグランジン、アレルギー応答の一般的阻害剤、抗ヒスタミン剤、局所的麻酔剤、鎮痛薬、麻薬拮抗薬、鎮咳薬、催眠鎮静薬、抗痙攣薬、抗精神薬、抗不安薬、抗鬱剤、食欲抑制剤、非ステロイド抗炎症剤、ステロイド性抗炎症剤、抗酸化剤、血管作用薬、骨活性剤、抗関節炎剤、及び診断用薬を含むが、これらに限らない。
ある実施態様において、生物活性化合物は、癌治療にしばしば用いられる薬剤を含む、化学療法剤のような細胞毒性生物活性化合物であることもできる。本明細書で用いるように、"細胞毒性生物活性化合物"は、本明細書に記載した様な細胞毒性活性を持つ化合物である。化学療法剤は当業者によく知られており（例えば、Gilman A. G., 他., The Pharmacological Basis of Therapeutics, 第８版, Sec 12:1202-1263 (1990)を参照）、アルキル化剤、抗代謝剤、天然産物及びその誘導体、ホルモン、ステロイド（合成類似体も含む）、毒素、及び合成薬を含むが、これらに限らない。アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホン酸塩、ニトロソウレア及びトリアゼン）の例としては、ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド（cytoxan(R)）、イホスファミド、メルファラン、クロランブシル、ピポブロマン、トリエチレン−メラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、及びテモゾロミドを含むが、これらに限らない。抗代謝剤（葉酸拮抗剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、及びアデノシンデアミナーゼ阻害剤を含む）としては、例えば、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、フルダラビンリン酸塩、ペントスタチン、及びゲムシタビンを含むことができる。天然産物及びその誘導体（ビンカアルカロイド、抗腫瘍抗生物質、酵素、リンフォカイン、及びエピポドフィロトキシンを含む）もまた用いることができて、例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドクソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、パクリタクセル（パクリタクセルは、市場で一般的にタキソールとして入手できる）、ミスラマイシン、デオキシコホルマイシン、マイトマイシンＣ，Ｌ−アスパラギナーゼ、インターフェロン（特にIFN−アルファ）、エトポシド、及びテニポシドが含まれる。ホルモン及びステロイド（合成類似体を含む）としては、例えば、１７−アルファ−エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニソン、フルオキシムエステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、酢酸メゲストロール、タモキシフェン、メチルプレドニソロン、メチルテストステロン、プレドニソロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、ロイプロリド、フルタミド、トレミフェン、又はゾラデクスが含まれる。毒素の非制限的例としては、リシンＡ，ジフテリア毒素がある。合成薬剤（白金配位複合体のような無機複合体を含む）としては、シスプラチン、カルボプラチン、ヒドロキシウレア、アムサクリン、プロカルバジン、ミトタン、ミトクサントロン、レバミソール、及びヘキサメチルメラミンがある。
本明細書で用いるように、用語"輸送"は薬物又は分子（例えば、生物活性化合物）の生理学的部位、組織、細胞への移動を表す。これは、細胞の細胞内部分又は細胞外空間への輸送を含む。
本明細書で用いるように、用語"細胞内の"又は"細胞内に"は、当業者が理解する通常の意味を有する。一般的に、膜に取り囲まれた細胞内の空間は、"細胞内"空間と定義される。同様に、本明細書で用いるように、用語"細胞外の"又は"細胞外に"は、当業者が通常理解する意味を有する。一般的に、細胞膜の外部の空間は、"細胞外"空間である。
ある実施態様において、輸送システムは、細胞毒性輸送システムを含む。本明細書で用いるように、"細胞毒性輸送システム"は、本明細書の他の場所で記載するように、細胞毒性活性を有する輸送システムである。細胞毒性輸送システムの脂質媒体は、化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む。細胞毒性輸送システムの細胞毒性活性は、化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質、細胞毒性生物活性化合物、又は両者から与えられることができる。従って、幾つかの実施態様において、細胞毒性輸送システムは、細胞毒性生物活性化合物を包み込む脂質媒体を含むが、ここで脂質媒体は、化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質を含む。
Ｉ−Ｂ−２−ａ．興味の対象のポリヌクレオチド
幾つかの実施態様において、化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む輸送システムの生物活性化合物は、ポリヌクレオチドを含む。作用についてのどのような理論又はメカニズムに囚われることなく、化学式（Ｉ）のカチオン性脂質内のグアニジニウムヘッド基は、機能的に、ヒストン及びプロタミンのようなDNA結合タンパク質のアルギニル残基に似る、及びポリヌクレオチドの凝縮を助ける。グアニジニウムヘッド基はまた、核酸骨格に見られる様な、特徴的な並列両性イオン的なリン酸イオンとの水素結合形成し、及び核酸塩基と水素結合を形成することができて、ポリヌクレオチド輸送システムの安定性に貢献する（Vigneron 他(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9682-9686）。
用語"ポリヌクレオチド"は単一核酸及び複数核酸を包含することを意図し、及び核酸分子又は構築物、例えば、メッセンジャーRNA（mRNA）、プラスミドDNA
（pDNA）、又は短い干渉RNA（siRNA）を表わす。ポリヌクレオチドは、１本鎖又は２本鎖、線状又は環状であることができる。ポリヌクレオチドは、通常のホスホジエステル結合又は通常でない結合（例えば、ペプチド核酸（PNA）に於いて見られる様なアミド結合）を含むことができる。用語"核酸"は、どのようなものでもポリヌクレオチドに存在する１以上の核酸部分、例えば、DNA又は RNA断片、を表わす。用語"ポリヌクレオチド"は、単離した核酸又はポリヌクレオチドを表し、ここで"単離した"核酸又はポリヌクレオチドはその本来の環境から取り出された、核酸分子、DNA 又はRNAを意図する。単離したポリヌクレオチドの例としては、異種の宿主細胞に維持される組み換えポリヌクレオチド、又は溶液中の精製した（部分的又は十分に）ポリヌクレオチドを含む。本発明に従う単離したポリヌクレオチド又は核酸は更に、合成により作成されたこのような分子を含む。単離したポリヌクレオチドはまた、単離した発現ベクター、発現構築体、又はこの集団を含むことができる。"ポリヌクレオチド"はまた、ポリメラーゼ連鎖反応のような、それ自身の増幅産物を表すことができる。この"ポリヌクレオチド"は、ホスホロチオエート、リン酸塩、環原子修飾誘導体等々のような、修飾核酸を含むことができる。この"ポリヌクレオチド"はまた、天然に産するポリヌクレオチド（即ち、ヒトによる侵襲なしに自然に存在するポリヌクレオチド）又は組み換えポリヌクレオチド（即ち、人工的にのみ存在するポリヌクレオチド）であることができる。用語"ポリヌクレオチド"及び"オリゴヌクレオチド"の両者は、本明細書で用いるように、ヌクレオチドのポリマーを表すが、オリゴヌクレオチドは、一般的に１００ヌクレオチド以下の長さである。
本明細書で用いるように、用語"ポリヌクレオチド"は、細胞内に所望の効果（例えば、治療効果、遺伝子発現の変化）を引き出すために細胞に輸送されるポリヌクレオチドを表す。興味の対象のポリヌクレオチドは、どのような長さでもあることができて、及び興味の対象のポリペプチドのためのコード配列を含むポリヌクレオチド、又はサイレンサー配列を含むポリヌクレオチドを含むことができるが、これに限らない。ある実施態様において、ポリヌクレオチドが、細胞内で発現又は細胞内に導入された時、興味の対象のポリヌクレオチド又はそれがコードしたポリペプチドは、治療上の活性を有する。
用語"ポリヌクレオチド輸送システム"は、生物活性化合物がポリヌクレオチドを含む輸送システムを表す。本発明のポリヌクレオチド輸送システムは、本明細書の他の場所に記載した、化学式（Ｉ）の新規カチオン性脂質を含む。一般的に、ポリヌクレオチド輸送システムの脂質媒体は、カチオン性リポソームである。これらの実施態様において、カチオン性リポソームは、正反対の分子荷電間の引力により、物理的に、負に帯電したポリヌクレオチドと会合する。
脂質媒体がカチオン性リポソームを含む、特別の非制限的実施態様においてポリヌクレオチド輸送システムは、約０．５：１，約１：１，約２：１，約３：１，約４：１，約５：１，約６：１，約７：１，約８：１，約９：１，約１０：１，約１５：１，約２０：１，約４０：１，又は約１００：１を含むが、これらに限らない、０．５：１から１００：１の間の＋：−荷電比を持つ。幾つかの実施態様において、この荷電比は、約０．５：１から約４０：１の間、約０．５：１から約２０：１の間，約０．５：１から約１０：１の間、約２：１から約４０：１の間、約２：１から約２０：１の間、約２：１から約１５：１の間、又は約３：１から約９：１の間である。特別な非制限的実施態様において、＋：−荷電比は、約５：１である。正荷電は、カチオン性リポソームから与えられ、及び幾つかの実施態様において、ポリカチオンから同様に与えられる。負荷電は、ポリヌクレオチドにより与えられ、及び幾つかの実施態様において、ポリアニオン性担体巨大分子から同様に与えられる。従って、幾つかの実施態様において、リポソーム（＋）：ポリカチオン（＋）：ポリヌクレオチド／ポリアニオン性担体巨大分子（−）荷電比は、約４：１：１である。
脂質媒体としてリポソームを含むポリヌクレオチド輸送システムを産生する方法は、当業者には既知であり、及び、Li 及びSzoka (2007) Pharm. Res. 24:438-449. の総説がある。
ｉ ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド
幾つかの実施態様において、ポリヌクレオチド輸送システムは、興味の対象のポリペプチドに対するコード配列を含むポリヌクレオチドを含む。
本発明の目的のために、"興味の対象のポリペプチドに対するコード配列"又は"興味の対象のポリペプチドに対するコード領域"は、ポリペプチドをコード化したポリヌクレオチド配列を表す。本明細書で用いるように、特定の核酸の文脈で用いられる時、用語"コード化する"又は"コード化された"は、核酸は、特定のポリペプチドにヌクレオチド配列を直接飜訳するための、必要とされる情報を含むことを意味する。ポリペプチドがコード化された情報は、コドン（遺伝暗号）の使用により特定される。"コード領域"又は"コード配列"は、アミノ酸に飜訳することができるコドンを含む核酸部分である。"停止コドン"又は"飜訳終止コドン"（TAG、TGA又はTAA）は、アミノ酸に飜訳されないが、これは、コード領域の一部と考えることができる。同様に、転写開始コドン（ATG）は、コード領域の部分と考えることができる、又はできない。しかしながら、コード領域に隣接したどのような配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写終止、イントロン等々は、コード領域の部分とは考えられない。しかしながら、幾つかの実施態様において、コード領域自体（per se）の部分とは考えられないが、これらの調節配列及びどのような他の調節配列でも、特にシグナル配列又はペプチドタグをコード化する配列は、興味の対象のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列の部分であることができる。従って、興味の対象のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列は、コード配列及び任意に興味の対象のポリペプチドの発現、分泌、及び／又は単離に寄与するコード領域に隣接するどのような配列をも含む。
用語"発現"は当技術分野で理解される様な意味を持ち、及び（i）遺伝子にコード化されている遺伝情報又はコード配列を、ポリヌクレオチドの"転写"を介して（例えば、RNAポリメラーゼの酵素作用を介して）RNA（例えば、mRNA、rRNA、tRNA、又はsnRNA）への転換過程、及び（ii）ポリペプチドをコード化しているポリヌクレオチドを、mRNAの"飜訳"を介してポリペプチドへ転換過程を表す。従って、"発現産物"は、一般的に、i）遺伝子から転写されたRNA（例えば、プロセシング前又は後の）、又は（ii）ポリヌクレオチド又は遺伝子（例えば、修飾前又は後の）から転写されたRNAがコードするポリペプチドである。
本明細書で用いるように、用語"ポリペプチド"又は"タンパク質"は、単一の"ポリペプチド"及び複数の"ポリペプチド"を包含することを意図し、及びアミド結合（ペプチド結合としても知られている）により直線的に連結されたモノマー（アミノ酸）からなる分子を表す。用語"ポリペプチド"は、２以上のアミノ酸のどのようなものでも鎖を表し、及び特定の長さの産物を表さない。従って、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、"タンパク質"、アミノ酸鎖、又は２以上のアミノ酸の鎖を表わすに用いるどのような他の用語も、"ポリペプチド"の定義の範囲内に含まれ、及び用語"ポリペプチド"は、これらの用語のいずれの代わりにも、又は互換的に用いられる。
用語"興味の対象のポリペプチド"は、（i）細胞に輸送されるべきポリペプチド、又は（ii）細胞に所望の効果を導き出すために（例えば、治療活性）、細胞に輸送されるポリヌクレオチドによりコード化されているポリペプチドを表す。興味の対象となるポリペプチドは、どのような種類及びどのようなサイズでもあることができる。しかしながら、ある実施態様において、興味の対象となるタンパク質又はポリペプチドは、治療上有用なタンパク質又はポリペプチドである。幾つかの実施態様において、タンパク質は、哺乳動物タンパク質、例えばヒトタンパク質であることができる。ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、腫瘍抑制因子又は細胞毒性（例えば、ジフテリア毒素（DT）、シュードモナス細菌外毒素Ａ（PE）、Pertussis毒素（PT）、及びPertussisアデニルシクラーゼ（CYA））に対するコード配列を含む。
用語"腫瘍抑制因子"は、（i）癌の進行、増殖、又は発達を阻害することができるポリペプチド、又は（ii）このポリペプチドをコード化する遺伝子を表す。腫瘍抑制ポリペプチドは、細胞増殖を調節するタンパク質、細胞及び遺伝子損傷に応答するタンパク質、又はアポトーシスを誘導するタンパク質を含む。腫瘍抑制遺伝子の非限定的実施例としては、p53, p110Rb, 及びp72がある。従って、幾つかの実施態様において、本発明の脂質／ポリヌクレオチド輸送システムは、腫瘍抑制因子のためのコード配列を含むポリヌクレオチドを含む。
分子遺伝学及び遺伝子工学のために要求される広範囲の配列情報は広く一般的に入手可能である。（i）哺乳動物、ヒト、遺伝子、cDNA配列、アミノ酸配列及びゲノムの完全ヌクレオチド配列への接近は、ウェブサイトwww.ncbi.nlm.nih.gov/EntrezのGenbankから入手できる。（ii）更なる情報は、GeneCardsから得ることができるが、GeneCardsはWeizmann Institute of Science Genome and Bioinformatics (bioinformatics.weizmann.ac.il/cards) から出ている遺伝子及びこれらの産物及び生物医学応用についての集積情報の電子的百科事典であり、（iii）ヌクレオチド配列情報はthe EMBL Nucleotide Sequence Database (www.ebi.ac.uk/embl) 又は the DNA Databank of Japan (DDBJ, www.ddbi.nig.ac.jp)から得ることができる。（iv）アミノ酸配列上の情報に関する更なるサイトは、Georgetown's protein information resource website (www.pir.georgetown.edu) 及び Swiss-Prot (au.expasy.org/sprot/sprot-top.html)がある。
ｉｉ．サイレンサー配列
幾つかの実施態様において、本発明のポリヌクレオチド輸送システムのポリヌクレオチドは、サイレンサー配列を含み、ここで細胞の中へのサイレンサー配列の発現又は導入により、標的ポリヌクレオチド又はこれがコードするポリペプチドの発現が減少する。
本明細書で用いるように、用語"導入"及び"導入する"は、ポリヌクレオチド又はサイレンサー配列に関する場合、ポリヌクレオチド又はサイレンサー配列が、細胞の細胞内領域に接近できるように、ポリヌクレオチド又はサイレンサー配列が細胞内に存在することを表す。
本明細書で用いるように、用語"サイレンサー配列"は、細胞内で発現した又は導入された時、標的ポリヌクレオチド配列又はこれがコードするポリペプチドの発現レベルを減少させるポリヌクレオチド、又は除くことができるポリヌクレオチドを表す。サイレンサー配列は、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は干渉RNA（RNAi）を含む、又はこれらをコードすることができる。用語"干渉RNA"又は"RNAi"は、RNAi経路に入ることができて、及びそれにより、興味の対象となる標的ポリヌクレオチドの発現を減少させることができるような、どのようなRNA分子をも表わす。このRNAi経路は、（i）Dicerヌクレアーゼ酵素、及び（ii）標的mRNAを分解、又は標的RNAの飜訳を阻止する機能があるRNA誘発サイレンサー複合体（RISC）を特徴とする。RNAiは、一般的にRNase H−が媒介する経路を介して単鎖オリゴヌクレオチドによる標的転写の阻害が関与する"アンチセンス"メカニズムにより機能するアンチセンスオリゴヌクレオチドとは異なる。Crooke (編.) (2001) "Antisense Drug Technology: Principles, Strategies, and Applications" (1st ed), Marcel Dekker; ISBN: 0824705661; 初版を参照。
本明細書で用いるように、"標的ポリヌクレオチド"は、ヒトが発現レベルを低下させたいと望むどのようなポリヌクレオチド配列をも含む。"減少"又は"減少させる"により、ポリヌクレオチド又はそれがコードするポリペプチドの発現レベルが、サイレンサー配列に曝されてない適切な対照における標的ポリヌクレオチドレベル又はコードされているポリペプチドの発現レベルより統計的に低いことを意味しようとする。特定の実施態様において、本発明に従い、標的ポリヌクレオチドレベル及び／又はコードされているポリペプチドレベルの減少は、適切な対照における標的ポリヌクレオチドのレベル又はこれがコードするポリペプチドのレベルより、９５％以下、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、又は５％以下の結果となる。RNA転写物のレベル、コードされたポリペプチドレベル、又はポリヌクレオチド又はポリペプチド活性の検定法は、本明細書の他の所で考察する。
幾つかの実施態様において、標的ポリヌクレオチドは、腫瘍遺伝子又は原始（プロト）腫瘍遺伝子である。この技術分野で受け入れられている意味に従って本明細書で用いる用語"腫瘍遺伝子"は、癌のイニシエーション（開始）又はプログレッション（進行）に寄与する遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列を表す。用語"腫瘍遺伝子"は、正常の環境では発癌に寄与しないが、腫瘍遺伝子として機能する様に突然変異、過剰発現、又は活性化した原始腫瘍遺伝子を包含する。腫瘍遺伝子の非制限的例としては、成長因子又は分裂促進因子（例えば、c-Sis）、受容体チロシンキナーゼ（例えば、表皮成長因子受容体（EGFR）、血小板由来成長因子受容体（PDGFR）、血管内皮成長因子受容体（VEGFR）、HER2/neu)、細胞質チロシンキナーゼ（例えば、src, Abl）、細胞質セリン／スレオニンキナーゼ（例えば、rafキナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ）、調節GTPase（例えば、ras）、及び転写因子（例えば、myc）が含まれる。幾つかの実施態様において、標的ポリヌクレオチドは、EGFRである。
この技術分野で受け入れられている意味に従って本明細書で用いる用語"相補的"は、２個のヌクレオシド、ヌクレオチド、又は核酸等々の間を水素結合（例えば、Watson-Crick塩基対合又はHoogsteen塩基対合）を介して正確に対合する能力を表す。例えば、第１の核酸のある位置のヌクレオチドが、第２の核酸中のヌクレオチドと反対に位置するヌクレオチドとの間に安定して水素結合をすることができるならば、この核酸は、５'から３'方向とは逆に配列し（即ち、逆平行配向）、核酸はこの位置（位置を、どれかの核酸のどちらかの末端に相対的に定義することができて、一般的には５'末端に関して定義する）で相補的と考えられる。互いに逆方向に位置するヌクレオチドは、"塩基対"と表すことができる。相補的塩基対は、２個の相補的ヌクレオチドを含む、例えば、Ａ及びＵ，Ａ及びＴ，Ｇ及びＣ，等々で、ここで非相補的塩基対は、２個の非相補的ヌクレオチドを含む（ミスマッチとして表される）。２つのポリヌクレオチドは、十分な数の各分子内の対応する位置が、互いに水素結合するヌクレオチドで占められる時、互いに相補的であると言われる、即ち、十分な数の塩基対が相補的である。
本明細書で用いるように、用語"遺伝子"は、この技術分野で理解されている意味を有する。一般的に、遺伝子は、コード配列（オープンリーディングフレーム（読み取り枠））に加えて、遺伝子調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、等々）及び／又はイントロン配列含む。"遺伝子"の定義は、タンパク質をコード化してないが、機能性RNA分子、又はミクロRNA又はsiRNA前駆体、tRNA等々のような、その前駆体をコード化する核酸を参照することが更に評価されるであろう。
本明細書で用いる、用語"ハイブリダイズ"は、２種の配列が、適切な条件下で、互いに会合を維持する２種の相補的核酸配列間の相互作用を表す。
サイレンサー配列は、干渉RNA又はアンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉RNA又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの前駆体、干渉RNA又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの転写のための鋳型、又は前駆体干渉RNA又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの転写のための鋳型を含むことができて、ここで前駆体は、細胞内で処理されて、干渉RNA又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを産生する。従って、例えば、dsRNAサイレンサー配列は、（i）dsRNA分子、（ii）dsRNAを形成できる転写体又はポリリボヌクレオチド、（iii）dsRNAを形成できる１以上の転写体又はオリゴヌクレオチド、（iv）dsRNA分子をコードするDNA、又は（v）dsRNA分子の１本鎖をコードするDNAを含む。サイレンサー配列が、干渉RNAをコードするDNA分子を含む場合、DNAは一時的に細胞内で発現することができる、又は細胞のゲノム内に安定的に取り込まれることができる。このような方法は、本明細書の他の場所で詳細に考察する。
このサイレンサー配列は、（i）標的RNA転写体の発現レベルに影響を与えることにより、又は飜訳に影響を与えることにより、又は（ii）前転写レベルの発現に影響を与えることにより（即ち、クロマチン構造の変化、メチル化パターンその他を介して遺伝子発現を変えること）、標的ポリヌクレオチド又はこれにコード化されたポリペプチドの発現レベルを減少又は除去することができる。例えば、Verdel 他 (2004) Science 303:672-676; Pal-Bhadra 他(2004) Science 303:669-672; Allshire (2002) Science 297:1818-1819; Volpe 他 (2002) Science 297:1833-1837; Jenuwein (2002) Science 297:2215-2218; 及び Hall 他(2002) Science 297:2232-2237を参照。興味の対象となる配列のレベルを減少させる又は排除することができる、機能的干渉RNAを検定する方法は、本明細書の他の場所に開示する。
標的ポリヌクレオチドのどのような領域を用いても、サイレンサー配列が標的ポリヌクレオチド又はこれにコード化されたポリペプチドのレベルを減少させることを可能にするために十分な配列特性を共有するサイレンサー配列のドメインを設計するために用いることができる。例えば、サイレンサー配列は、（i）標的ポリヌクレオチドの５'非飜訳領域、（ii）標的ポリヌクレオチドの３'非飜訳領域、（iii）標的ポリヌクレオチドのエキソン領域、（iv）標的ポリヌクレオチドのイントロン領域、及び（v）これらのどのような組合せとも配列特性を共有するように設計することができる。
サイレンサー配列が、標的ポリヌクレオチドのレベルを減少させる能力は、例えば、Northernブロット、ヌクレアーゼプロテクション検定、逆転写(RT)-PCR、リアルタイムRT-PCR、 マイクロアレイ分析等々を用いて、直接に、標的転写体量を測定することにより検定できる。あるいは、サイレンサー配列が、標的ポリヌクレオチドのレベルを減少させる能力は、Westernブロット、免疫検定、ELISA、フローサイトメトリー、タンパク質ミクロ検定、等々を含むが、これらに限らない、様々な親和性をベースとした方法（例えば、標的ポリペプチドに特異的に結合するリガンド又は抗体を用いて）を用いて直接測定できる。更に他の方法として、サイレンサー配列が、標的ポリヌクレオチドのレベルを減少させる能力は、間接的に、例えば、（i）転写物によりコード化されるポリペプチドの機能的活性の測定、又は（ii）転写物によりコード化されるポリペプチドにより産生されるシグナルを測定することにより、検定できる。
様々な種類のサイレンサー配列を、更に以下で考察する。
１）２重鎖RNAサイレンサー配列
１つの実施態様において、サイレンサー配列は、２重鎖RNA分子を含む、又は２重鎖RNAをコード化する。本明細書で用いるように、"２重鎖RNA"又は"dsRNA"は、単一自己相補的RNA分子、又は少なくとも２種の別個のRNA鎖の発現によって作られるポリリボヌクレオチド構造を表わす。従って、本明細書で用いるように、用語"dsRNA"は、例えば、小RNA（sRNA）、短干渉RNA（siRNA）、２重鎖RNA（dsRNA）、ミクロRNA（miRNA）,ヘアピンRNA、短ヘアピンRNA（shRNA）他を含む、RNA干渉又は遺伝子抑制を媒介できる核酸分子を記載するために用いる他の用語を包含する。例えば、Meister 及び Tuschl (2004) Nature 431:343-349 及び Bonetta 他(2004) Nature Methods 1:79-86を参照。
特定の実施態様において、dsRNAの２重鎖又は２重鎖領域の少なくとも１鎖は標的ポリヌクレオチドと十分な配列同一性又は配列相補性を共有し、dsRNAが標的ヌクレオチド又はコード化されたポリペプチドの発現レベルを減少させることを可能にする。本明細書で用いるように、標的ポリヌクレオチドに対して相補的な鎖は、"アンチセンス鎖"であり、及び標的ポリヌクレオチドと相同な鎖は"センス鎖"である。
１つの実施態様において、dsRNAはヘアピンRNAを含む。ヘアピンRNAは、自己に対して折りたたんで、２重鎖構造を形成できるRNA分子を含む。多数の構造を、ヘアピン配列として使うことができる。例えば、それ自身とハイブリダイズして、ヘアピン構造を作るヘアピンRNA分子は、１本鎖ループ領域及び塩基対ステム（基部）を含むことができる。塩基対ステム領域は、（i）標的ポリヌクレオチドの全て又は部分に対応するセンス配列を含むことができて、及び更に、（ii）センス配列に完全に又は部分的に相補的なアンチセンス配列を含むことができる。従って、サイレンサー配列の塩基対ステム領域は、サイレンサーの特異性を決めることができる。例えば、本明細書の参考文献に取り込まれているChuang 及びMyerowitz (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:4985-4990を参照。in vivoサイレンス遺伝子発現に対するhpRNA構築物の効率に対する一過性検定は、本明細書の参考文献に取り込まれているPanstruga 他(2003) Mol. Biol. Rep. 30:135-140に記載されている。
２）siRNAサイレンサー配列
"短干渉RNA"又は"siRNA"は、RNA２重鎖（２本鎖RNA領域）を含み、及び１又は２個の単鎖オーバーハング、例えば、３'又は５'オーバーハングを含む。１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，及び２９ヌクレオチドを含む１７から２９ヌクレオチドの間の長さが用いられるが、２重鎖は、凡そ１９塩基対（bp）長であることができる。siRNAは、互いにハイブリダイズする２個のRNA分子から作成することができて、もしくは、自己ハイブリダイズ部分を含む単一RNA分子から産生することができる。siRNAの２重鎖部分は、２重鎖の単鎖又は両鎖の１以上の不対の及び／又はミスマッチしたヌクレオチドを含む１以上の突出部（バルジ）を含むことができる、又は１以上の非相補的ヌクレオチド対を含むことができる。siRNAの１本鎖（以下アンチセンス鎖と呼ぶ）は、標的転写物とハイブリダイズする部分を含む。ある実施態様において、siRNAの１本鎖（アンチセンス鎖）は、少なくとも約１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド又はそれ以上の標的転写物の領域と正確に相補的であり、これは、siRNAアンチセンス鎖は標的転写物とその長さを超えて１個のミスマッチなしに（即ち、１個の非相補的塩基対無しに）ハイブリダイズすることを意味する。他の実施態様において、siRNAアンチセンス鎖及び標的転写物の標的部分との間の１以上のミスマッチは存在することができる。完全な相補性が得られない実施態様において、siRNAアンチセンス鎖と標的転写物の間のどのようなミスマッチも、siRNAアンチセンス鎖の３'末端、又はその近くに位置する。例えば、ある実施態様において、アンチセンス鎖のヌクレオチド１〜９，２〜９，２〜１０，及び／又は１〜１０は、標的と完全に相補的である。
有効なsiRNA分子の設計に対する考察を、McManus 他(2002) Nature Reviews Genetics 3: 737-747 及びDykxhoorn 他 (2003) Nature Reviews Molecular Cell Biology 4: 457-467において討議している。このような考察は、siRNAの塩基組成、及び転写物の５'及び３'末端に相対的な（siRNAのアンチセンス鎖に相補的な）標的転写物の部分の位置等々を含む。siRNA配列の選択を補助するために、様々な計算機プログラムもまた入手可能である、例えば、下記
Figure 2011520962
ウェブサイトのAmbion（下記
Figure 2011520962
ウェブサイト）から入手可能である。用いることができるさらなる設計の考察は、Semizarov 他 Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 6347-6352に記載されている。
３）短ヘアピンRNAサイレンサー配列
用語"短ヘアピンRNA"又は"shRNA"は、（i）RNAi（１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８及び２９ヌクレオチド長を含む約１７から２９ヌクレオチドの間、及び幾つかの実施態様において、一般的に少なくとも１９塩基対長）を媒介するに十分な長さの２本鎖（２重鎖）構造を形成するためにハイブリダイズした又はハイブリダイズし得る少なくとも２個の相補的部分、及び（ii）少なくとも１個の１本鎖部分（２重鎖部分の１末端に塩基対を形成する２個のヌクレオチドに接続するループを形成する、一般的に約１及び２０ヌクレオチド長又は１から１０ヌクレオチド長）を含むRNA分子を表す。この２重鎖部分は、１以上の不対ヌクレオチドを含む１以上の突出部（バルジ）を含むことができるが、要求はされない。特定の実施態様において、shRNAは、３'オーバーハングを含む。従って、shRNAはsiRNAの前駆体であり、及び一般的に、標的転写物の発現を同様に阻害できる。
特に、ヘアピン（ステム（基部）−ループ、）構造を持つRNA分子は、細胞内でDicerにより処理を受けることができて、短ヘアピンRNA（shRNA）と表されるsiRNA構造を産出することができて、これは（i）互いにハイブリダイズ（自己ハイブリダイズ）して、ステム（基部）と表される２本鎖（２重鎖）領域を形成する２個の相補的領域、及び（ii）２重鎖の１末端で塩基対を形成するヌクレオチドと結合する１本鎖ループ、及び（iii）任意にオーバーハング例えば、３'オーバーハングを含む。このステムはより短い、及びより長いステム（例えば、約２９ｎｔまで）も用いることはできるが、約１９，２０又は２１ｂｐ長を含むことができる。ループは、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０ｎｔ、約４〜１０，又は約６〜９ｎｔを含めて、約１〜２０ｎｔを含むことができる。オーバーハングは、もし存在するならば、約１〜２０ｎｔ、又は約２〜１０ｎｔを含むことができる。このループは、その阻害が望まれる標的転写物に相補的（即ちshRNAのアンチセンス部分）領域の５'又は３'末端に位置することができる。
shRNAは自己ハイブリダイズする単鎖RNA分子を含むが、得られた２重鎖構造は、標的mRNAに対してセンス及びアンチセンス鎖又はアンチセンス部分を含むと考えることができて、及び得られた２本鎖構造は２重鎖と考えることができる。従って、本明細書において、shRNAのセンス及びアンチセンス鎖、又はセンス及びアンチセンス部分を表すことは好都合であろうが、ここで（i）アンチセンス鎖又はアンチセンス部分は、標的ポリヌクレオチドの標的部分と２本鎖を形成することができる、又はこの標的部分に相補的である分子の断片であり、及び（ii）センス鎖又はセンス部分は、アンチセンス鎖又は部分と２本鎖を形成することができる、又は２本鎖を形成することができる分子の断片であり、及び（iii）このセンス鎖又はセンス部分は、標的転写物の標的部分の配列と実質的に同一であるである。一般的に、shRNA分子のアンチセンス鎖の配列の選択の考察は、同じ転写物を標的とするsiRNA分子のアンチセンス鎖の配列選択の考察と同様である。
４）ミクロRNAサイレンサー配列
ある実施態様において、サイレンサー配列は、miRNA又はmiRNA前駆体を含む又はコード化する。"ミクロRNA"又は"miRNA"は、非常に高効率で標的ポリヌクレオチドの発現を阻害する約１９リボヌクレオチドを含む調節作用物である。例えば、Saetrom et al. (2006) Oligonucleotides 16:115-144, Wang et al. (2006) Mol. Cell 22:553-60, Davis et al. (2006) Nucleic Acid Research 34:2294-304, Pasquinelli (2006) Dev. Cell 10:419-24を参照、これらの全ては本明細書に参考文献として取り込まれている。miRNA干渉のために、サイレンサー配列の設計は、興味の対象となる標的ポリヌクレオチドに対して相補的な１９ヌクレオチド配列を含むヘアピン構造を形成するdsRNA分子を発現するようにすることができる。後に切断されて活性なmiRNAを作り出すより長いRNAとして、このmiRNAを合成的に作る、又は転写して作ることができる。特に、このmiRNAは、センス配向で標的ポリヌクレオチドと相同性を持つ配列の１９ヌクレオチド、及びセンス配列に対して相補的なアンチセンスに対応する１９ヌクレオチドを含むことができる。
以下のような様々な形のmiRNAを転写することができることが認められる：即ち、例えば、（i）最初の転写物（"プリmiRNA"と呼ばれる）：様々な核酸分解段階を経てより短い前駆体miRNA（"プレmiRNA"と呼ばれる）に加工される；（ii）プレmiRNA；又は（iii）最終（成熟）miRNA：２本鎖として存在し、２本鎖はmiRNA（最終的に標的と塩基対を形成する鎖）及びmiRNA*と表される。このプレmiRNAは、前駆体からmiRNA/miRNA*２本鎖を取り出す１つのダイサー形のための基質であり、その後、siRNAと同じように、この２本鎖はRISC複合体に取り込まれる。miRNAは、導入遺伝子的に発現することができて、最初の転写物の形よりむしろ前駆体形の発現を通して有効であることが示された（McManus et al. (2002) RNA 8:842-50）。特定の実施態様において、miRNAの２〜８ヌクレオチドは標的に対して完全に相補的である。多数の内因性ヒトmiRNAが、同定されている。様々な生物からの多くの内因性miRNA前駆体の構造については、Lagos-Quintana 他(2003) RNA 9(2):175-9; また Bartel (2004) Cell 116:281-297を参照のこと。
miRNA又はmiRNA前駆体は、標的転写物と少なくとも約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９又は３０ヌクレオチドの長さに対して少なくとも約、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列相補性を共有することができる。特定の実施態様において、正確な配列相補性の領域は、バルジ（突出部）により中断される。Ruvkun (2001) Science 294: 797-799, Zeng 他 (2002) Molecular Cell 9:1-20, 及び Mourelatos 他(2002) Genes Dev 16:720-728を参照。
５）アンチセンスサイレンサー配列
幾つかの実施態様において、サイレンサー配列は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む又はコード化する。"アンチセンスオリゴヌクレオチド"は、標的ポリヌクレオチドに対して、全体的に、又は部分的に相補的である１本鎖核酸配列であり、及びDNA又はそのRNA対応物（即ち、ここでDNAのＴ残基は、RNAではＵ残基である）であることができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的RNA（例えば、mRNA）又はDNAとハイブリダイズできるように設計されている。例えば、mRNA分子とハイブリダイズするあるオリゴヌクレオチド（例えば、DNAオリゴヌクレオチド）を、mRNAを標的としたRNaseH消化を行って用いることができる。あるいは、mRNA分子の飜訳開始部位にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、このmRNAの飜訳を阻害するために使うことができる。他の方法において、２重鎖DNAに結合するオリゴヌクレオチドを、投与することができる。そのようなオリゴヌクレオチドは、３重鎖構築体を作ることができて、及びDNAの転写を阻害する。３重らせん対合は、２重ラセンが十分開くことを阻害し、ポリメラーゼ、転写因子又は調節分子の結合を不可能にする。最近の、３重鎖DNAを用いた治療上の進歩は、記載されている（例えば、J. E. Gee 他., 1994, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y.を参照）。本発明のようなオリゴヌクレオチドは、３重らせん形成の塩基対合規則、及び標的遺伝子の塩基配列を用いて構築することができる。
非制限的例として、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の領域に対してハイブリダイズする様な標的となることができる、即ち：mRNAキャップ領域；飜訳開始部位；翻訳終止部位；転写開始部位；転写終止部位；ポリアデニル化シグナル；３'非飜訳領域；５'非飜訳領域；５'コード領域；中央コード領域；及び３'コード領域。 幾つかの実施態様において、相補的オリゴヌクレオチドは、５'コード配列にかかる約１５〜３５ヌクレオチドのいずれかをはじめとして、遺伝子の最も独自の５'配列とハイブリダイズする様に設計される。
従って、本発明に従うアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，又は約１００ヌクレオチドを含むが、これらに限らず、約１０から約１００ヌクレオチドを含むことができる。
アンチセンス核酸は、標準的技術（例えば、Shewmaker 他, U.S. Pat. No. 5,107,065を参照）で作製することができる。適切なオリゴヌクレオチドを、OLIGOソフトウェア（Molecular Biology Insights, Inc., Cascade, Colo.; http://www.oligo.net）を用いて、設計することができる。
６）サイレンサー配列の調製
サイレンサー配列を、化学合成、in vivo 又はin vitro酵素による又は化学的切断、in vivo又はin vitro鋳型転写、又はこれらの組合せを含めるが、これに限らず、どのような入手可能な技術に従い調製できることを、当業者は十分に理解する。
iii. 組み換え発現ベクター及び宿主細胞
前記の考察のように、本発明の方法及び組成物において用いたサイレンサー配列は、転写された際、干渉RNAを産生する、又は、その前駆体、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを産生する、DNA分子を含む。そのような実施態様において、このサイレンサー配列をコード化するDNA分子を、発現カセットにおいて見出すことができる。更に、興味の対象となるポリペプチドのためのコード配列を含むポリヌクレオチドは、発現カセット中に見出される。
この発現カセットは、サイレンサー配列をコードするポリヌクレオチド又は興味の対象となるポリペプチドに動作可能に連結した１以上の調節配列を含むが、この調節配列については、発現のために用いる細胞を基に選ぶ。"動作可能に連結"とは、興味の対象となるヌクレオチド配列（即ち、サイレンサー配列をコードするDNA、又は興味の対象となるポリペプチドのためのコード配列）と調節配列とを、このヌクレオチド配列の発現が可能な様に（例えば、発現カセット又はベクターが細胞内に導入された時、in vitro転写／飜訳システム又は細胞内において）連結することを意味しようとする。"調節配列"は、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現コントロール配列（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。例えば、Goeddel (1990) in Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, California)を参照。調節配列は、多くの種類の宿主細胞において（i）ヌクレオチド配列の構成的発現に向けられた配列、及び（ii）ある種の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現に向けられた（例えば、組織特異的調節配列）配列を含む。発現カセットの設計が、（i）形質転換する宿主細胞の選択、及び（ii）サイレンサー配列又は所望の関心の対象となるポリペプチドの発現レベル（iii）その他のような、因子に依存することができることは当業者には理解されるであろう。このような発現カセットは、ベクターへの核酸の導入を容易にするために、一般的に、制限酵素の適切な位置を示す１以上の部位を含む。
興味の対象となる細胞において関係する転写単位／サイレンサー配列の発現を可能にするために、適切なプロモーター及び／又は調節配列を、直ちに選ぶことができることは、当業者に更に理解されているであろう。ある実施態様において、サイレンサー配列の細胞内発現のために用いるプロモーターは、RNAポリメラーゼIII（Pol III）に対するプロモーターである。様々なPol IIIプロモーターを考察する引例としては、例えば、Yu 他(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99(9), 6047-6052; Sui 他(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99(8), 5515-5520 (2002); Paddison 他 (2002) Genes and Dev. 16, 948-958; Brummelkamp他(2002) Science 296, 550-553; Miyagashi (2002) Biotech. 20, 497-500; Paul 他(2002) Nat. Biotech. 20, 505-508; Tuschl 他(2002) Nat. Biotech. 20, 446-448が含まれる。他の実施態様によると、RNAポリメラーゼＩに対するプロモーター、例えば、tRNAプロモーターを用いることができる。McCown 他(2003) Virology 313(2):514-24; Kawasaki (2003) Nucleic Acids Res. 31 (2):700-7。ポリヌクレオチドが、興味の対象となるポリペプチドに対するコード配列を含む、幾つかの実施態様において、RNAポリメラーゼIIに対するプロモーターを用いることができる。
調節配列はまた、ウィルス調節配列によっても提供される。例えば、通常用いられるプロモーターは、ポリオーマ、Adenovirus 2，サイトメガロウィルス、及びSimian Virus ４０由来である。原核及び真核両細胞に対する他の適切な発現システムに対しては、Sambrook 他 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)の第１６及び１７章を参照。Goeddel (1990) in Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, California)を参照。
In vitro 転写はT7、SP6、及びT3プロモーター／ポリメラーゼ系（例えば、Promega, Clontech, New England Biolabs,等々から商品として入手可能）を含む様々な入手可能な系を用いて行うことができる。T7, SP6又はT3プロモーターを含むベクターは、当技術分野で既知であり、及びサイレンサー配列の転写に向けて直ちに改変することができる。サイレンサー配列がin vitroで合成される場合、この鎖を細胞に導入する前、又は患者に投与する前に、ハイブリダイズさせることができる。上記のように、サイレンサー配列は、（i）自己相補領域を含む単一RNA分子として（例えば、shRNAは細胞内で処理され、siRNAを産出することができる）、又は（ii）互いにハイブリダイズした２本鎖として、細胞内に輸送され又は導入されることができる。他の実施態様において、用いられるサイレンサー配列は、in vivoで転写される。本明細書他の場所で考察したように、サイレンサー配列がin vivo又はin vitroで転写されるかに関わらず、どちらのシナリオでも、最初の転写物が、形成され、これは加工され（例えば、１以上の細胞酵素により）、その結果干渉RNAが産生され、遺伝子阻害を行うことができる。
サイレンサー配列が干渉RNAであるこれらの実施態様において、干渉RNAを、in vitro又はin vivoどちらかにおいて、プロモーターからの転写により産生することができる。例えば、互いに相補的であり、それぞれが19nt領域を持つ21nt転写物を産生する、２個の分離した転写可能領域を含む構築物を提供可能である。あるいは、それぞれが少なくとも部分的に互いに相補的である、２個の異なる転写物を産生するように、位置づけられた、反対方向のプロモーター及びターミネーター（転写終結区）を含む単一構築物を用いることもできる。あるいは、例えば、自己相補的領域をコードする単一転写単位の転写により、単一転写物としてRNA誘導試薬を産生することができる。第１及び第２相補領域を含み、任意に、両部分を連結するループ領域を含む鋳型を用いることができる。プロモーターを適切に選択し、及び、任意に、他の調節配列、例えば、ターミネーターを持つ、このような鋳型を、in vitro 転写又はin vivo転写のために用いることができる。
幾つかの実施態様において、ポリヌクレオチド輸送システムは、細胞毒性ポリヌクレオチド輸送システムを含む。本明細書で用いるように、"細胞毒性ポリヌクレオチド輸送システム"は、本明細書に定義した、細胞毒性活性を持つ。細胞毒性ポリヌクレオチド輸送システム、の脂質媒体は、化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む。細胞毒性ポリヌクレオチド輸送システムの細胞毒性活性を、（i）化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質、（ii）細胞毒性ポリヌクレオチド又は（iii）両者が与えることができる。"細胞毒性ポリヌクレオチド"は、細胞内で発現した時、又は細胞内に導入された時、細胞毒性活性を持つ。細胞毒性ポリヌクレオチドの非制限的例としては、アポトーシス誘導遺伝子のような、細胞死を誘導することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがある。他の細胞毒性ポリヌクレオチドとしては、細胞内で発現、又は細胞内に導入された時、細胞生存又は増殖に重要な標的ポリヌクレオチドの発現を減少させるサイレンサー配列を含むポリヌクレオチドがある。例えば、表皮性増殖因子受容体を標的とするサイレンサー配列は、細胞毒性活性を有する。従って、幾つかの実施態様において、細胞毒性脂質／ポリヌクレオチド輸送システムは細胞毒性ポリヌクレオチドを包み込む脂質媒体を含み、ここでこの脂質媒体は、化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質を含む。
Ｉ−Ｂ−２−ｂ．興味の対象となるポリペプチド
幾つかの実施態様において、本発明の輸送システムは、細胞に輸送される興味の対象の、ポリペプチドを包み込む脂質媒体を含む。本明細書で開示したこの輸送システムは、ポリペプチドを細胞の細胞内領域に導入することができる。重要なことに、ポリペプチドを包み込む脂質媒体を含む標的輸送システムは、与えられたポリペプチドを細胞内に特異的に輸送することができる。
幾つかの実施態様において、細胞内に興味の対象となるポリペプチドを輸送できる、この輸送システムは、ポリペプチドを包み込むカチオン性リポソームを含む。ある実施態様において、カチオン性リポソームは、カチオン性脂質DOTAP及び共脂質コレステロールを１：１モル比で含む。これらの実施態様の幾つかにおいて、細胞内に輸送されたポリペプチドは、アニオン性ポリペプチドを含む。本明細書で用いるように、"アニオン性ポリペプチド"は本明細書に記載したように、生理的ｐＨにおいて、正味負荷電を持つポリペプチドである。アニオン性ポリペプチドは、生理的ｐＨで負荷電を持つ少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％アミノ酸残基を含むことができる。これらは、アスパラギン酸（Ｄ），アスパラギン（Ｎ），グルタミン酸（Ｅ），及びグルタミン（Ｑ）を含む。特別の実施態様において、興味の対象となるポリペプチドは、アミノ末端及び／又はカルボキシル末端において、ポリペプチドの負荷電を増強させるために、アセチル化させる。
幾つかの実施態様において、更に輸送システムは、本明細書他の場所で記載したように、ポリカチオンを含む。他の実施態様において、輸送システムは、ヘパリン硫酸のような、ポリアニオン性担体巨大分子を含む。特別の実施態様において、この輸送システムは、興味の対象となるポリペプチドを包み込むカチオン性リポソーム、ヘパリン硫酸及びポリカチオン（例えば、プロタミン）を含む、LPHナノ粒子を含む。これらの実施態様の幾つかにおいて、このポリペプチドは、アニオン性ポリペプチドを含む。ある実施態様において、この輸送システムは、アニオン性ポリペプチドを包み込むカチオン性リポソーム及び任意に、ポリアニオン性担体巨大分子（例えば、ヘパリン硫酸）及びポリカチオン（例えば、プロタミン）を含み、及びカチオン性リポソームの表面荷電は、リポソームの脂質２重層に後から挿入（以後、 "後挿入"と訳す）した脂質−ポリエチレングリコール結合物により遮蔽される。これらの実施態様の幾つかにおいて、この輸送システムは、ステルス（内密の）輸送システムである。標的細胞又は組織に対する特異的標的化を提供するために、輸送システムのリポソームの脂質２重層の外部リーフレットは更に向標的リガンドを含むことができる。
幾つかの実施態様において、興味の対象となるポリペプチドを含む輸送ステムは、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００，又はそれ以上のアミノ酸残基を有する興味の対象となるポリペプチドを含む。幾つかの実施態様において、興味の対象となるポリペプチドは、約５から約５０アミノ酸残基の間を含む。
幾つかの実施態様において、興味の対象となるポリペプチドは、細胞毒性がある。これらの実施態様の幾つかにおいて、興味の対象となるポリペプチドは、細胞に輸送時に、重要な細胞内シグナルを阻害することができる。
Ｉ−Ｂ−３．ポリカチオン
幾つかの実施態様において、輸送システムは更に、脂質媒体が包み込むポリカチオンを含む。ポリカチオンは、ポリヌクレオチドのようなアニオン性の生物活性化合物と、反対荷電の間の引力により、物理的に会合することができる。従って、輸送システムがポリカチオンを含む、幾つかの実施態様において、アニオン性生物活性化合物はポリヌクレオチドである。輸送システムの脂質媒体がカチオン性リポソームを含み、及び生物活性化合物がポリヌクレオチドであり、及びその輸送システムが更にカチオン性リポソームのコア内でポリヌクレオチドと物理的に会合するポリカチオンを含む、実施態様において、得られた複合体は、"脂質／ポリカチオン／ポリヌクレオチドナノ粒子"又は"LPP"と表すことができる。"脂質／ポリカチオン／ポリヌクレオチドナノ粒子"又は"LPP"のポリヌクレオチド構成成分は、DNA又はRNAであることができる（例えば、本明細書の引例に取り込まれている、米国特許No.5,795,587 及び米国特許No.6,008,202を参照）。LPPナノ粒子のポリアニオン性担体巨大分子がヒアルロン酸又はヘパリン硫酸を含む実施態様において、この複合体は、"脂質／ポリカチオン／ヒアルロン酸（又はヘパリン硫酸）ナノ粒子"又は"LPHナノ粒子"又は"LPH-NP"と表される。ある実施態様において、脂質／ポリカチオン／ポリヌクレオチドナノ粒子の全体的正味荷電は、生理的ｐＨにおいて正である。
作用のどのような理論又はメカニズムに囚われることなく、ポリカチオンはポリヌクレオチドを濃縮する働きがあり、ポリカチオンを欠くポリヌクレオチド輸送システム複合体のサイズと比較して、輸送システム複合体のサイズを小さくさせ、かつ全体としての複合体を安定化させることに寄与すると信じられている。同様に、ポリカチオンは、他のアニオン性生物活性化合物と、会合し及び濃縮する働きがある。一般的に、LPPナノ粒子は、約１００ｎｍの直径である。特別の非制限的実施態様において、LPPナノ粒子は、約５０ｎｍ、約６０ｎｍ、約７０ｎｍ、約８０ｎｍ、約９０ｎｍ、約１００ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１５０ｎｍ、約１７５ｎｍ、約２００ｎｍ、約２２５ｎｍ、又は約２５０ｎｍの直径である。
本明細書で用いたように、"ポリカチオン"は、生理的ｐＨで正荷電である多くの正に荷電した置換基を持つ巨大分子を表す。ポリカチオンは、約３００から約２００，０００の間の分子量を持つ有機ポリカチオンから選択される。幾つかの実施態様において、これらのポリカチオンは、ｐＨ７．０において、約３から約１０００の間の原子価を持つ。ポリカチオンは、天然又は合成のアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、ポリアミン、炭化水素及びどのような合成カチオン性ポリマーをも含む、がこれらに限らない。ポリカチオンの非制限的例としては、ポリアルギニン、ポリオルニチン、プロタミン及びポリリジン、ポリブレン（臭化ヘキサジメトリン）、ヒストン、カチオン性デンドリマー、スペルミン、スペルミジン及び過剰の正荷電を有し、及び核局在シグナルを表現するSV40ラージＴ抗原由来の合成ポリペプチドがある。
幾つかの実施態様において、ポリカチオンは、アルギニン残基がポリペプチドのアミノ酸残基の少なくとも３０％を構成し、及びリジン残基がポリペプチドのアミノ酸残基の５％以下を構成する、アミノ酸組成を有するポリカチオン性ポリペプチドである。ある実施態様において、ヒスチジン、リジン、及びアルギニン全体で、ポリペプチドのアミノ酸残基の約４５％から約８５％を構成し、及びセリン、スレオニン、及びグリシンがポリペプチドのアミノ酸残基の約１０％から約２５％を構成する。尚、他の実施態様において、アルギニン残基が、ポリペプチドのアミノ酸残基の約６５％から約７５％を構成し、及びリジン残基がポリペプチドのアミノ酸残基の約０％から約３％を構成する。
上記のアルギニン及びリジン残基の列挙した割合に加えて、ポリカチオン性ポリペプチドはまた、約２０％から約３０％疎水性残基、又は約２５％疎水性残基を含むことができる。ポリヌクレオチド輸送システム複合体を作製するために用いるポリカチオン性ポリペプチドは、５００アミノ酸長まで、約２０から約１００アミノ酸長、又は約２５から約５０アミノ酸長、及び、他の実施態様において、約２５から約３５アミノ酸長であることができる。
ある実施態様において、ポリカチオン性ポリペプチドに存在するアルギニン残基は３〜８連続したアルギニン残基のクラスター又は４〜６連続したアルギニン残基のクラスターとして見出される。
他の実施態様において、ポリカチオン性ポリペプチドは、約２５から約３５アミノ酸長であり、その残基約６５から約７０％は、アルギニン残基であり、及びその残基の０から３％は、リジン残基である。
本発明の複合体を処方するために用いるポリカチオン性ポリペプチドは、特に上記の様にリジンに対して高比率のアルギニンを有するある種のプロタミンのように、天然に生ずるタンパク質として、又は、化学合成のポリペプチドとして、ポリペプチドをコード化する核酸配列から発現した組み換えポリペプチドとして、又は塩がリン酸塩、塩化物、及び硫酸塩を含むが、これらに限らない、上記のどのようなポリペプチドの塩としてでも、提供することができる。ある実施態様において、ポリカチオンは、プロタミン硫酸を含む。
幾つかの実施態様において、脂質／ポリカチオン／ポリヌクレオチドナノ粒子は、細胞毒性脂質／ポリカチオン／ポリヌクレオチドナノ粒子を含む。本明細書で用いるように、"細胞毒性脂質／ポリカチオン／ポリヌクレオチドナノ粒子"は、本明細書の他の所で記載したように、細胞毒性活性を有するものである。細胞毒性脂質／ポリカチオン／ポリヌクレオチドナノ粒子の脂質媒体は、化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む。細胞毒性LPPナノ粒子の細胞毒性活性は、化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質又は、細胞毒性ポリヌクレオチド、又は両者から与えられることができる。従って、幾つかの実施態様において、細胞毒性脂質／ポリカチオン／ポリヌクレオチドナノ粒子は、脂肪媒体が化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質を含むことを特徴とする、ポリカチオン及び細胞毒性ポリヌクレオチドを包み込んだ脂肪媒体を含む。LPPナノ粒子及び細胞毒性LPPナノ粒子の産生方法は、本明細書他の所で記載する。
Ｉ−Ｂ−４．ポリアニオン性担体巨大分子
本発明は化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む輸送システムを具体化する。輸送システムの脂質媒体がカチオン性リポソームを含む幾つかの実施態様において、この複合体は更に、ポリアニオン性担体巨大分子がポリヌクレオチドの輸送に役立つことを特徴とする、脂質媒体に包み込まれたポリアニオン性担体巨大分子を含む。"ポリアニオン性担体巨大分子"は、輸送システムが、in vitro又はin vivoシステムのどちらかにおいて、細胞に包み込んだ生物活性化合物を輸送できるように、輸送システムのカチオン性リポソームのカチオン性脂質と電荷−電荷相互作用を介した相互作用ができる、生理的ｐＨで１以上の負電荷を帯びた（例えば、多原子価）どのような分子をも表わす。包み込んだ生物活性化合物を細胞に輸送する、輸送システムの能力を、本明細書の他の所（例えば、実験的実施例２及び３）に記載する検定を用いて測定することができる。幾つかの実施態様において、ポリアニオン性担体巨大分子は、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約６０ｋＤａ、約７０ｋＤａ、約８０ｋＤａ、約９０ｋＤａ、約１００ｋＤａ、約２００ｋＤａ、約３００ｋＤａ、約４００ｋＤａ、約５００ｋＤａ、約６００ｋＤａ、約７００ｋＤａ、約８００ｋＤａ、約９００ｋＤａ、約１，０００ｋＤａ、約５，０００ｋＤａ、約１０，０００ｋＤａ，及び約２０，０００ｋＤａにおよぶ、がこれらに限らない、約５から約２０，０００ｋＤａの間の分子量を有する。幾つかの実施態様において、ポリアニオン性担体巨大分子は、生理的ｐＨにおいて、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約５００、約１，０００、約１０，０００，及び約１００，０００を含むが、これらに限らない、約２０及び約１００，０００の原子価を有する。ポリアニオン性担体巨大分子の非制限的例としては、ポリアニオン性多糖類、ポリアニオン性ポリペプチド、及びこれらの組合せ（例えば、糖タンパク質、ムコ多糖タンパク質）、及びポリアニオン性ポリヌクレオチドのような、ポリマーを含む。ポリアニオン性担体巨大分子は、天然物（即ち人手を介さず自然に産生される）、化学合成、であることができて、又はポリヌクレオチドの場合、組み換えポリヌクレオチド（即ち、人手を介さないと存在しない）であることができる。
いくつかの実施態様において、ポリアニオン性担体巨大分子は、担体ポリヌクレオチドを含むが、ここで担体ポリヌクレオチドは、興味の対象となるポリヌクレオチドの細胞への輸送を亢進するために、ポリヌクレオチド輸送システムにおいて用いることができるポリヌクレオチドである。一般的に、興味の対象となるポリヌクレオチドとは異なり、一度細胞に輸送されると、担体ポリヌクレオチドは、細胞内で望みの発現形質変化（例えば、治療活性、興味の対象となるポリペプチドの発現、in vitro又はin vivoで細胞内に輸送された時の内因性遺伝子の発現レベルの変化）を起こさない。担体ポリヌクレオチドの非制限的例としては、ゲノムDNA（例えば、仔牛胸腺DNA）及びバクテリアが産生したプラスミドDNAがある。幾つかの実施態様において、ポリアニオン性担体巨大分子は、仔牛胸腺DNAである。
幾つかの実施態様において、ポリアニオン性担体巨大分子は、ポリアニオン性担体多糖を含む。用語"多糖"は、グリコシド結合により結合する２以上の単体（単糖）を含む炭化水素分子を表す。従って、二糖、三糖、オリゴサッカライド、又はグリコシド結合により結合する１以上の単糖を含む炭化水素分子を表すために用いるどのような他の用語も"多糖"の定義の範囲に含まれ、及び用語"多糖"を、これらの用語の代わりに、又は互換的に用いることができる。用語"多糖"は、ホモ多糖（唯一種類の単糖を含む多糖）及びヘテロ多糖（１以上の種類の単糖を含む多糖）の両者を包含する。ヘテロ多糖は、繰り返しのある二糖単位、三糖単位、四糖単位、又はどのような長さのでも繰り返し単位を含む多糖を含むことができる。"ポリアニオン性多糖"は、生理的ｐＨで多数の負電荷を含む多糖である。幾つかの実施態様において、ポリアニオン性多糖は、約２、約５、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、及び約２００単糖単位を含む、がこれらに限らず、２から２０００単糖単位を含む。幾つかの実施態様において、ポリアニオン性巨大分子を構成する、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％の単糖単位が少なくとも１個の負電荷を有する。
幾つかの実施態様において、ポリアニオン性担体多糖は、ポリアニオン性グリコサミノグリカンを含む。グリコサミノグリカンは、繰り返し二糖単位を含む非分枝状多糖であり、ここで二糖の単糖単位の一つは、Ｄ−ガラクトサミン又はＤ−グルコサミンを含むが、これらに限らない、アミノ糖を含む。幾つかの実施態様において、繰り返し二糖の他の単糖単位は、Ｄ−グルクロン酸（GlcA）又はＬ−イズロン酸（IdoA）を含むが、これらに限らない、ウロン酸を含む。一般的に、二糖単位の少なくとも一方の単糖モノマーは、負に荷電した側鎖置換基（例えば、カルボン酸塩、硫酸基）を有する。幾つかの実施態様において、グリコサミノグリカンは、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマチン硫酸、及びデキストラン硫酸を含む。ある実施態様において、グリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸を含む。幾つかの実施態様において、グリコサミノグリカンは、ヘパリン又はヘパリン硫酸ではない。
他の実施態様において、ポリアニオン性担体巨大分子は、ポリアニオン性担体ペプチドを含む。"ポリアニオン性ポリペプチド"は、本明細書他の場所で定義したように、生理的ｐＨにおいて、多数の負電荷を含むポリペプチドである。興味の対象となるポリペプチドとは異なり、ポリアニオン性担体ポリペプチドは、細胞に輸送された際、細胞内の望みの表現型質変化をもたらさない。ポリアニオン性担体ポリペプチドは、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基又は両者を含むことができる。幾つかの実施態様において、ポリアニオン性担体ポリペプチドは、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、又は両残基が、ポリペプチドのアミノ酸残基の少なくとも３０％、ポリペプチドのアミノ酸残基の少なくとも４０％、ポリペプチドのアミノ酸残基の少なくとも５０％、ポリペプチドのアミノ酸残基の少なくとも６０％、ポリペプチドのアミノ酸残基の少なくとも７０％、ポリペプチドのアミノ酸残基の少なくとも８０％、ポリペプチドのアミノ酸残基の少なくとも９０％、ポリペプチドのアミノ酸残基の少なくとも９５％、ポリペプチドのアミノ酸残基の少なくとも９６％、ポリペプチドのアミノ酸残基の少なくとも９７％、ポリペプチドのアミノ酸残基の少なくとも９８％、ポリペプチドのアミノ酸残基の少なくとも９９％、又はポリペプチドのアミノ酸残基の少なくとも１００％を構成するアミノ酸組成を有する。
幾つかの実施態様において、ポリアニオン性担体ポリペプチドは、約２、約５、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約２００、約５００、約１，０００、約１０，０００、約５０，０００、及び約１００，０００アミノ酸長を含め、しかしこれらに限らず、約２アミノ酸から約１００，０００アミノ酸長である。
本発明の複合体を処方する上で用いるポリアニオン性担体ポリペプチドを、（i）天然物タンパク質として、（ii）化学合成ポリペプチドとして、（iii）ポリペプチドをコード化する核酸配列から発現した組み換えポリペプチドとして、又は（iv）リン酸塩、塩化物及び硫酸塩を含む、がこれらに限らない、塩に特徴のある、いずれかの上記ポリペプチドの塩として、提供することができる。
ある実施態様において、ポリアニオン性担体巨大分子は、ポリアニオン性ムコ多糖タンパク質又はポリアニオン性グリコペプチドを含む。ムコ多糖タンパク質はポリペプチドに共有結合したグリコサミノグリカンを含む。ポリアニオン性ムコ多糖タンパク質は、非ポリアニオン性（例えば、中性、カチオン性）又はポリアニオン性ポリペプチドに結合したポリアニオン性グリコサミノグリカンを含むことができる。グリコペプチドは、ポリペプチドに共有結合した単糖又は多糖を含む。ポリアニオン性グリコペプチドは、（i）非ポリアニオン性ポリペプチドに結合したポリアニオン性多糖、又は（ii）ポリアニオン性ポリペプチドに結合した非ポリアニオン性多糖、又は（iii）ポリアニオン性ポリペプチドに結合したポリアニオン性多糖を含むことができる。
幾つかの実施態様において、興味の対象となるポリヌクレオチドに対するポリアニオン性担体巨大分子のモル比（ポリアニオン性担体巨大分子：興味の対象となるポリヌクレオチド）は、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約２０：１、約３０：１、約４０：１、約５０：１、約６０：１、約７０：１、約８０：１、約９０：１、及び約１００：１を含め、しかしこれらに限らず、約１：１から、約１００：１を含む。
Ｉ−Ｂ−５．PEG化した（ポリエチレングリコールと結合した）輸送システム
幾つかの実施態様において、輸送システムの脂質媒体の表面荷電は、ポリエチレングリコール（PEG）分子部分を含む脂質を脂質媒体に取り込ませることにより最小化できる。輸送システムの脂質媒体の表面荷電の減少により、（i）輸送システム複合体及び血清蛋白質間の凝集量を減らすことができて、及び（ii）複合体の循環半減期を長くすることができる（Yan, Scherphof, 及びKamps (2005) J Liposome Res 15:109-139）。従って、幾つかの実施態様において、輸送システムの脂質媒体の外部表面は、PEG分子を含む。本明細書において、このような複合体を、PEG化輸送システムと表わす。当技術分野において既知であり、本明細書の他の場所で記載したように、輸送システムを脂質−PEG接合体を含むミセルとインキュベートすることにより、輸送システムの脂質媒体に、脂質−PEG接合体を後挿入することにより、PEG化した輸送システムを、産生することができる（Ishida 他 (1999) FEBS Lett. 460:129-133; Perouzel 他(2003) Bioconjug. Chem. 14:884-898; 実験セクションを参照）。"脂質−ポリエチレングリコール結合体"又は"脂質−PEG接合体"により、少なくとも一個のポリエチレングリコール分子と共有結合した脂質分子を意図する。幾つかの実施態様において、脂質−PEGは、１，２−ジステアロイル−sn-グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−カルボキシ−ポリエチレングリコール（DSPE-PEG）を含む。直ぐ次に述べるように、これらの脂質−PEG接合体は、更に改変されて、向標的リガンド（例えば、DSPE-PEG-AA）を含むことができる。用語"脂質−PEG接合体"はまた、これらの脂質−PEG-向標的リガンド接合体を表し、及び、脂質−PEG-向標的リガンド接合体を含む輸送システムは、以下直ちに述べるように、PEG化標的輸送システムと考えることができる。
脂質媒体のPEG化は、網内系（RES）システムによる輸送システム複合体の捕捉を減らすことにより、輸送システムの循環半減期を長くする。作用の特別な理論、メカニズムに囚われることなく、PEG化した脂質媒体は、粒子のオプソニン化を立体的に阻害することにより、RESシステムから逃れると信じられる（Owens 及びPeppas (2006) Int J Pharm 307:93-102）。オプソニン化を避けるために十分な立体障害を与えるために、脂質媒体の外表面は、"ブラシ"配置により、PEG分子で完全に覆われなければならない。表面覆いが低いと、PEG鎖は、一般的に、"マッシュルーム"配置を持ち、ここでPEG分子は、脂質媒体の表面近くに位置する。"ブラシ"配置において、PEG分子は、粒子表面から遠くに伸びて立体障害効果を高める。しかしながら、表面にPEGが過密になると、ポリマー鎖の易動度が低下し、従って立体障害効果が減少する可能性がある（Owens 及びPeppas (2006) Int J Pharm 307:93-102）。PEGのコンホメーションは、脂質媒体表面上のPEG密度及びPEGの分子量に依存する。調節因子は、Flory寸法、RF、に相対的な媒体表面上のPEG鎖間の距離（Ｄ）であり、ここでRFは、aN3/5と定義され、ここでaはモノマー間の持続長であり、Ｎは、PEGにおけるモノマー単位の数である（Nicholas 他 (2000) Biochim Biophys Acta 1463:167-178）。３個の領域を定義する：（１）D>2RFのとき、（指状間マッシュルーム）；（２）D<2RFのとき（マッシュルーム）；及び（３）D<RFのとき、（ブラシ）（Nicholas他）。
ある実施態様において、PEG化輸送システムは、ステルス輸送システムを含む。"ステルス輸送システム"により、輸送システムが次のような輸送システムを含むことを意図する、即ち脂質媒体の外部表面が、患者に投与された時、PEG化してない輸送システムと比較して、肝臓においてRESシステムによる輸送システムの捕捉を減らすことを可能にする配置で、十分な数のPEG分子を含む輸送システムである。RES捕捉は、本明細書他の場所に記載した（実験的実施例４を参照）肝臓潅流検定を含め、しかしこれに限らず、当技術分野で既知の検定を用いて測定することができる。幾つかの実施態様において、ステルス輸送システムは、脂質媒体の外部表面が、D<RFである、PEG分子を含む様な、脂質媒体を含む。
PEG化輸送システムがステルス輸送システムであるこれらの実施態様において、カチオン性リポソームの脂質２重層の外部リーフレットは、約４モル％、約５モル％、約６モル％、約７モル％、８モル％、約９モル％、約１０モル％、約１１モル％、約１２モル％、約１３モル％、約１４モルｌ％，及び約１５モル％PEGを含むが、これらに限らない、外部リーフレット脂質の約４モル％から約１５モル％の濃度の脂質−PEG接合体を含む。ある実施態様において、ステルスポリヌクレオチド輸送システムのカチオン性リポソームの脂質２重層の外部リーフレットは、約１０．６モル％PEGを含む。脂質−PEG接合体のポリエチレングリコール分子部分は、約１００ｇ／ｍｏｌ、約２００ｇ／ｍｏｌ、約３００ｇ／ｍｏｌ、約４００ｇ／ｍｏｌ、約５００ｇ／ｍｏｌ、約６００ｇ／ｍｏｌ、約７００ｇ／ｍｏｌ、約８００ｇ／ｍｏｌ、約９００ｇ／ｍｏｌ、約１０００ｇ／ｍｏｌ、約５０００ｇ／ｍｏｌ、約１０，０００ｇ／ｍｏｌ、約１５，０００ｇ／ｍｏｌ、及び約２０，０００ｇ／ｍｏｌを含む、がそれに限らず、約１００から約２０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を持つことができる。これらの実施態様において、脂質−PEG接合体は、約２０００ｇ／ｍｏｌの分子量を持つPEG分子を含む。ある実施態様において、脂質−PEG接合体は、DSPE-PEG2000を含む。
Ｉ−Ｂ−６．担持２重層を伴う輸送システム
本発明の輸送システムは、担持２重層（supported bilayer（支えられた２重層）を担持２重層と訳す）を含むことができる。担持２重層を含む輸送システムは、例えば、表面荷電を中和させ、及びRES捕捉を減らすために、後挿入工程によりPEG化されることができて、非特異的結合を制限し、及び輸送システムの薬学動態特性を高める。輸送システムに関して記載すると、"担持２重層"は以下の特徴のある２重層であり、即ち、２重層のリーフレットの１層又は両層（例えば、内部リーフレット、外部リーフレット）は、静電気力又は共有結合により十分安定化し、その結果、（i）表面電荷を完全に遮蔽する（例えば、リポソームのツェーターポテンシャルは約０ツェーターポテンシャルである）ために、高い、十分な割合の脂質−PEG接合体を取り込んで、２重層が無傷のままであることを可能にする、又は、（ii）PEGを欠く輸送システムと比較した時、RESによるPEG化輸送システムの捕捉を減少させることを可能にする。（i）当技術分野で既知の技術を用いて測定できる（例えば、Nicholas et al. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1463:167-178）脂質２重層の透過性の実質的増加がない時、又は（ii）当技術分野で既知の技術を用いて測定できる、小粒子集合（例えば、脂質−PEGミセルを含まず、５０ｎｍ以下）の実質的増加がない時、２重層は、"無傷のまま"と言われる。
幾つかの実施態様において、担持２重層は、"コア担持２重層"を含む。"コア担持２重層"により、２重層構成員と脂質媒体の内部コアの内容物との間の静電気的、又は共有結合相互作用により安定化される２重層を意図する。コア担持２重層を含む脂質媒体を含む輸送システムの非制限的例としては、本明細書で記載したLPPナノ粒子があり、ここでリポソームコアの負荷電の構成成分（例えば、興味の対象となるポリヌクレオチド、ポリアニオン性担体巨大分子）は、電荷−電荷相互作用により、カチオン性リポソームのカチオン性脂質と相互作用する。
他の実施態様において、担持２重層は、２重層に担持されたリーフレット（層）を含む。本明細書で用いる様に、"リーフレット担持２重層"は、２重層を含むリーフレット（例えば、内部リーフレット、外部リーフレット）の構成要素間の静電気的又は共有相互作用により安定化した２重層を含む。共有結合リーフレット担持２重層は、本明細書にファイルされ、その全体が引例として取り込まれた "Methods and Compositions for Stabilizing Delivery System Complexes,"と言う標題のInternational Application No. ________に記載された共有結合２重層を表し、これは、（１）内部リーフレット内の少なくとも２個の脂肪族分子間の、（２）外部リーフレット内の少なくとも２個の脂肪族分子間の、又は（３）内部リーフレット内の少なくとも２個の脂肪族分子間の、及び（４）外部リーフレット内の少なくとも２個の脂肪族分子間の共有結合により十分安定化して、（i）高い十分な割合の脂質−PEG接合体を取り込んで、無傷のままである事を可能にし、（ii）２重層が、表面荷電を完全に被覆し、又はPEGを欠く輸送システムと比較して、RESによるPEG化輸送システムの捕捉を減らすことを可能にする。安定化が２重層の構成要素間の相互作用により与えられるリーフレット担持２重層は、安定性が２重層の構成要素及び媒体コアの成分との間の相互作用により与えられるコア担持２重層とは異なる。しかしながら、輸送システムは、支持が２重層の成分（リーフレット担持２重層）間の相互作用から与えられる、及びコア成分と２重層（コア担持２重層）の間の相互作用から与えられる、担持２重層を含むことができる。このような輸送システムの例は、本明細書に記載した様に、共有結合リーフレット担持２重層であり、ここで２重層の内部リーフレット内の親水的ヘッド置換基又は側鎖は、カチオン性であり、及び内部リーフレットのこれ等のカチオン性脂肪族分子及び脂質媒体のコア内に存在するアニオン性生物活性薬剤間の電荷−電荷相互作用が存在する。
本発明の幾つかの実施態様において、リーフレット担持２重層を含む輸送システムは、２重層の内部リーフレットの構成要素が２重層の外部リーフレットの構成要素と相互作用するシステムであることができる。
２重層の構成要素及び脂質媒体の内部コアの内容物との間の共有結合、又は２重層のリーフレット内の脂肪族分子間の共有結合によって担持２重層が安定化しているこれらの幾つかの実施態様において、共有結合は、生物的切断可能な共有結合である。生物的切断可能な共有結合は、細胞内、有機体内に入って切断される、又は壊されることができる結合である。生物的切断可能共有結合は、包み込んだ生物活性化合物の放出に役立つ。
幾つかの実施態様において、生物的切断可能共有結合は、細胞に入った後より特異的に切断される（細胞内切断）結合である。幾つかの実施態様において、生物的切断可能共有結合は、リソゾームに見られる様な酸性条件下で切断可能である。ある非制限的例は、その全体が本明細書の引例に取り込まれている、Greenfield 他(1990) Cancer Res. 50, 6600-6607に記載されているアシルヒドラゾン結合のような、酸感受性（又は酸脆弱性）ヒドラゾン連結である。他の、非制限的例は、アミノ基又はスルフヒドリル基との様々なアルデヒド結合を含む加水分解酵素の対象となるある連結又は結合である。また、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（NHSエステル）がアミンと反応するときのようなアミド結合が含まれる。他の、非制限的例は、酸脆弱性maleamate（マレアメート）結合である（その全体が、本明細書引例に取り込まれている、Rozema 他 (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104:12982-12987参照）。ある実施態様において、生物的切断可能共有結合は、リソゾーム酸加水分解のようなエンドソーム又はリソゾームにもっと普通に見出される酵素により生物的に切断可能である。
本発明は、生物活性化合物（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、小分子、薬剤）を包み込む脂質媒体を含み、及び細胞又は組織に生物活性化合物を輸送しうる、どのような輸送システムをも包含し、ここで脂質媒体は、担持２重層及び化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む。幾つかの実施態様において、この輸送システムは、本明細書に記載したように、LPP又はLPHナノ粒子を含むが、これに限らない、ポリヌクレオチド輸送システムを含む。
Ｉ−Ｂ−７．標的輸送システム
幾つかの実施態様において、この輸送システムは、脂質媒体の外部表面が向標的リガンドを含み、標的輸送システムを形成する、脂質媒体を含む。本明細書で考察したように、向標的リガンドは、標的細胞又は組織を標的として、物理的に会合する分子又は複合体をして狙わせる分子である。従って、"標的輸送システム"は、輸送システムの脂質媒体の外部表面が、標的細胞又は組織を標的として、標的輸送システムをして狙わせる向標的リガンドを含む。ある実施態様において、向標的リガンドは、ベンズアミド誘導体を含む。これらの実施態様の幾つかにおいて、ベンズアミド誘導体は、アニサミドを含む。
向標的リガンドは、本明細書で記載した化学式（Ｉ）のカチオン性脂質、他のカチオン性脂質、又は輸送システムの脂質媒体を含む共脂質と共有結合して、脂質向標的リガンド接合体を形成することができる。幾つかの脂質向標的リガンド接合体は、脂質及び向標的リガンド間に介入する分子を含み、これは、脂質及び向標的リガンドの両者に共有結合する。これらの実施態様の幾つかにおいて、この介入分子は、ポリエチレングリコール（PEG）であり、脂質−PEG向標的リガンド接合体を形成する。このような脂質−標的接合体の例は、DSPE-PEG-AAであり、ここで脂質１，２−ジステアロイル−sn-グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−カルボキシル（DSPE）はポリエチレングリコール（PEG）と結合し、これは向標的リガンドアニサミド（AA）と結合する。従って、幾つかの実施態様において、標的輸送システムの脂質媒体は、脂質−向標的リガンド接合体DSPE-PEG-AAを含む。
ある実施態様において、向標的リガンドは、標的細胞が癌細胞の場合、標的細胞を標的として、標的輸送システムをして狙わせる。これらの幾つかの実施態様において、向標的リガンドはアニサミドであり、癌細胞は肺癌細胞であることを含む。
Ｉ−Ｃ．医薬組成物
本発明の脂質及び輸送システムは、哺乳動物組織培養システム、動物研究及び治療目的のために有用である。（i）化学式（Ｉ）のカチオン性脂質は細胞毒性活性を含むことを特徴とする、化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質、及び（ii）化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む輸送システム、（iii）生物活性化合物が治療活性を有することを特徴とする、化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む輸送システム、及び（iv）化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質及び治療活性を持つ生物活性化合物を含む輸送システムは、治療上の応用に使用できる。従って、本発明は化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質を含む医薬組成物又は化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む輸送システムを提供する。
本発明の組成物を、輸送のために処方する、即ち非経口（例えば、経静脈）、皮内、皮下、経口、経鼻、気管支内、眼用剤、経皮的（局所的）、経粘膜、経肛門、及び膣経路を含むが、これらに限らない、どのような可能な経路にもよる、患者への投与に対して処方することができる。幾つかの実施態様において、輸送の経路は、静脈内、非経口、経粘膜、経鼻、気管支内、膣経路、及び経口である。
本発明の医薬組成物はまた、化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質又は医薬的に許容される担体と組み合わせた化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む輸送システムを含むことができる。本明細書で用いるように、用語"医薬的に許容される担体"は、医薬又は表面的投与と整合する溶媒、懸濁媒体、被覆剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等脹及び吸収遅延剤、等々を含む。また、補足的活性化合物を組成物に取り込むことができる。
当業者が理解するように、本発明の医薬組成物は、所期の投与経路に合わせられる。非経口（例えば静脈内）、筋肉内、皮内、又は皮下使用のために用いる溶液又は懸濁液は以下の成分を含むことができる：注射のための水のような滅菌した稀釈液、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒；ベンジルアルコール又はメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムのような、抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸のようなキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩のような緩衝剤；及び塩化ナトリウム、又はグルコースのような張性の調節試薬。ｐＨは塩酸又は水酸化ナトリウムのような酸又は塩基により調節できる。非経口調整品は、アンプル、ディスポーザブルシリンジ、又はガラス又はプラスチック製の多数回投与バイアルに封入される。
注射可能な使用に適した医薬組成物は、一般的に、滅菌した注射可能な溶液又は分散剤の即席の調製品のための、滅菌水溶液（水溶性の場合）又は分散剤及び滅菌した粉末を含む。静脈注射投与に対して、適切な担体としては、生理的食塩水、靜菌的水、Cremophor EL(tm) (BASF, Parsippany, N.J.)、又はリン酸緩衝食塩水（PBS）がある。組成物は、滅菌性であるべきであり、及び容易に注射可能な程度流体性であるべきである。幾つかの実施態様において、医薬組成物は、製造及び貯蔵の条件下で安定であり、バクテリア又は菌類のような微生物のコンタミ作用に抗して保存されるべきである。一般的に、関係する担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール、等々）及びこれらの適切な混合物を含む溶媒又は分散媒体であることができる。（i）例えば、レシチンのような被覆の使用により、（ii）分散剤の場合,、必要な粒子サイズを保持することにより、及び（iii）界面活性剤の使用により、適切な流体性を保つことができる。微生物作用の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等々のような様々な抗菌剤及び抗真菌剤により行うことができる。幾つかの実施態様において、例えば、砂糖、マニトール又はソルビトールのようなポリアルコール、又は塩化ナトリウム等張剤を、処方物に含める。注射可能な処方物の長期にわたる吸収を、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、及びゼラチンのような、吸収を遅らす試薬を処方物に加えることにより行うことができる。
滅菌した注射可能な溶液は、活性化合物（例えば、化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質又は化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む輸送システム）を、（i）必要量、（ii）適切な溶媒中に、（iii）必要に応じて、上記の様に列挙した１以上の成分と共に、取り込み、その後（iv）濾過滅菌することにより調製することができる。ある実施態様において、注射のための溶液は、内毒素フリーである。一般的に、分散剤を、活性化合物を基本的な分散媒体及び上記に列挙した中から必要な成分を含む、滅菌した媒体に取り込むことにより調製する。滅菌した粉末を滅菌した注射可能な溶液の調製品のために用いるこれらの実施態様において、この溶液を、真空乾燥及び凍結乾燥により調製することができるが、この真空乾燥及び凍結乾燥により前述の滅菌濾過溶液から活性成分、プラス付加的などんな所望の成分の粉末をも産出する。
経口組成物は、一般的に、不活性な稀釈剤又は食用の担体を含む。経口治療上の投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤と共に取り込まれることができて、及び錠剤、トローチ、又は例えば、ゼラチンカプセルのようなカプセルの形で使用される。また、経口組成物を、口腔洗浄液としての使用のための液体担体を用いて調製することができる。調合薬又は美容に合う結合剤及び／又は補助素材を組成物の一部として含むことができる。錠剤、ピル、カプセル、トローチ、等々は、以下の成分又は同様の性質の化合物のいずれかを含むことができる：ミクロクリスタル状のセルローズ、ゴム、トラガカント又はゼラチンのような結合剤；澱粉又はラクトースのような賦形剤；アルギニン酸、プリモゲル（Primogel）又はトウモロコシ澱粉のような粉砕剤；ステアリン酸マグネシウム又はステロート（Sterote）のような潤滑剤；コロイド状二酸化シリコンのような滑走剤；砂糖又はサッカリンのような甘味剤；ペパーミント、サリチル酸メチル又はオレンジ芳香剤のような芳香剤。経口輸送に対する組成物は、胃腸内の安定性の改善のための薬剤、及び／又は吸収の亢進のための薬剤を、有利に取り込むことができる。
吸入による取り込みのために、本発明の組成物を、例えば、２酸化炭素又はネブライザーのような適切な非経口剤を含む加圧容器又は取りだし容器から気体アエロゾール噴霧剤の形で輸送することができる。液体アエロゾール、乾燥粉末等々もまた、用いることができる。
本発明の化合物の全身投与もまた、経粘膜又は経皮的手段により使用できる。経粘膜又は経皮投与のために、障壁にしみ通る適切な浸透剤を処方物に使用する。そのような浸透剤は、一般的に、当技術分野で既知であり、経粘膜投与のために、例えば、界面活性剤、胆汁酸塩、フシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻噴霧剤又は座薬に使用により、行うことができる。経皮投与のために、活性化合物は、当技術分野で既知のように、軟膏、膏薬、ゲル、又はクリームとして処方される。
この化合物を、直腸輸送のために座薬（例えば、ココアバター及び多くのグリセリドのような従来の座薬ベースと共に）又は滞留浣腸の形に調製することができる。
経口又は非経口の組成物を、容易な投与及び一定の投与量のために投与単位形態で処方することは利点がある。本明細書で用いる投与単位形態は、治療を受ける患者に単位用量に適した物理的に離散的な単位を表し；各単位は、必要とされる調合薬上の又は美容上の担体と組み合わせて、所望の治療活性を作り出すために計算した活性化合物の所定の量を含む。本発明の単位用量形態に対する仕様書は、（ａ）活性化合物の独自の特徴及び得られる特定の治療活性及び（ｂ）個人の治療のためにこのような活性化合物を作る技術に特有の制限、を指示し、及び直接これらに依存する。投与量に関する手引きを本明細書の他の所で提供する。
Ｉ−Ｃ−１．製造品
本発明はまた、化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質又は化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む輸送システムを提供する製造品を含む。
製造品は、乾燥又は液体状であっても、どのようなものでも担体を伴う本方法に適した組成物を含むバイアル又は他の容器を含むことができる。更に、製造品においては、容器のラベルの形態及び／又は本発明の方法を行うために、容器を含む包装された箱の挿入物の形で指示書を含む。指示書をまた、バイアルを包装する箱の上に印刷することもできる。指示書は、患者又は投与の分野での投薬者が医薬組成物を投与可能にするために、十分な投与量及び投薬情報のような情報を含む。この分野の作業者は、どのような医師、看護士、技師、配偶者、又は組成物を投与するかも知れない介護人を包含することが予想されている。医薬組成物はまた、患者により自己投与可能である。
ＩＩ．方法
本発明は、（i）薬剤を細胞に輸送するための、（ii）細胞を殺すための、及び（iii）病気の患者を化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質又は化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む輸送システムで治療するための、方法を提供する。本明細書には、更に、化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む輸送システムを作成する方法を提供する。
ＩＩ−Ａ．輸送方法
化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む脂質媒体を含む輸送システムを、細胞に生物活性化合物を輸送するために用いることができる。このような方法は、細胞と、輸送システムとを接触させる工程を含むが、この輸送システムは、生物活性化合物を包み込む脂質媒体を含み、ここで脂質媒体は、化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む。本明細書の他の所で記載したように、本発明の組成物を表す時（例えば、生物活性化合物、細胞毒性脂質）、用語"輸送"は、結果として、細胞の細胞内空間内、又は細胞を囲む細胞外空間に組成物を届ける過程を表わす。用語"細胞"は、培養中の細胞及び患者内の細胞を包含する。生物活性化合物がポリヌクレオチドである、これらの実施態様において、ポリヌクレオチドの細胞内空間への輸送は、"トランスフェクション"と表わされる。
細胞へのポリヌクレオチドの輸送は、in vitro方法、ex vivo方法（ここで細胞内へのポリヌクレオチドのトランスフェクションは、患者の外で生じ（トランスフェクトした細胞は患者に移植することができる））及びin vivo方法（ここでトランスフェクションは、患者内で生ずる）を含むことができる。
幾つかの実施態様において、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド輸送システムにより輸送され、ここで輸送システムの脂質媒体は、化学式（Ｉ）のカチオン性脂質及び共脂質を含む。ある実施態様において、共脂質は、コレステロールである。
ＩＩ−Ｂ．輸送システムを作る方法
本発明は、輸送システムの脂質媒体が化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む輸送システムを作成する方法を提供する。生物活性化合物を包み込む脂質媒体、及び生物活性化合物を含む、輸送システムを作成する方法は、（i）化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む脂質媒体を生物活性化合物との混合工程、（ii）それによる輸送システムの作製工程を含む。幾つかの実施態様において、この混合工程は、コア担持２重層を含む脂質媒体を作成する。
幾つかの実施態様において、脂質媒体は、化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質を含む。従って、本明細書において、化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質を含む細胞毒性輸送システム作成方法が提供される。幾つかのこれらの実施態様において、細胞毒性輸送システムの生物活性化合物は、細胞毒性生物活性化合物を含む。細胞毒性輸送システムが作られるある実施態様において、細胞毒性輸送システムは、細胞毒性生物活性化合物を包み込む化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性を含む脂質媒体を含む。
また、ポリカチオン及びポリヌクレオチドを包み込む脂質媒体を含むポリヌクレオチド輸送システムを作る方法を提供し、この方法は以下の２工程を含む：
ａ）ポリヌクレオチド及びポリカチオンを混合し、それによるポリヌクレオチド／ポリカチオン溶液を作成する工程；及び
ｂ）化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む脂質媒体と、ポリヌクレオチド／ポリカチオン溶液を混合し、それにより輸送システムを作成する工程。
あるいは、幾つかの実施態様において、ポリカチオン及びポリヌクレオチドを包み込む脂質媒体を含むポリヌクレオチド輸送システムを作成する方法は、以下の工程を含む：
ａ）化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む脂質媒体及びポリカチオンを混合し、それによる脂質媒体／ポリカチオン溶液を作成する工程；及び
ｂ）脂質媒体／ポリカチオン溶液と、ポリヌクレオチドを混合し、それにより輸送システムを作成する工程。
ポリヌクレオチド輸送システムを作るこれら幾つかの実施態様において、この輸送システムは更に、ポリアニオン性担体巨大分子を含む。これらの実施態様において、ポリアニオン性担体巨大分子を、ポリカチオンの添加前にポリヌクレオチドと混合することができる。他の実施態様において、ポリヌクレオチド、ポリアニオン性担体巨大分子、及びポリカチオンは、同時に混合することができる。
ポリヌクレオチド輸送システムを作るある実施態様において工程ｂ）はコア担持２重層を含む脂質媒体を作成する。
幾つかの実施態様において、脂質媒体はリポソームを含む。これらの幾つかの実施態様において、リポソームは、カチオン性リポソームを含む。脂質媒体がリポソームを含むこれらの実施態様において、ポリヌクレオチドを、リポソーム又はリポソームプラスポリカチオン溶液にゆっくり加えることができて、攪拌子により混合することができて、ここで混合を、ポリヌクレオチド添加後２番目に行うことができる。あるいは、リポソーム又はリポソーム／ポリカチオン溶液を、単一反応槽の第１注入口から、ポリヌクレオチドを第２注入口から、同時に加えることができる。その後、共通の反応槽において、構成成分を同時に機械的に混合する。また、最初にポリヌクレオチドとポリカチオンを混合し、その後調製済みのリポソームを加えて、複合体を作製することができる。
リポソーム作製法は、技術分野で既知である。例えば、リポソーム作製の方法論の総説は、Liposome Technology (CFC Press NY 1984); Liposomes by Ostro (Marcel Dekker, 1987); Lichtenberg and Barenholz (1988) Methods Biochem Anal. 33:337-462及び米国特許No.5,283,185に見出すことができる。例えば、化学式（Ｉ）のカチオン性脂質及び任意に付加的なカチオン性脂質及び／又は共脂質の混合については、これから溶媒を除き、ホモジナイザーを利用して乳化し、凍結乾燥し、融解して、多層膜リポソームを得ることができる。あるいは、逆相蒸発法（(Szoka and Papahadjopoulos (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:4194-4198)を用いて、単層膜リポソームを作製することができる。幾つかの実施態様において、リポソームを本明細書の他の所（実験項；Bangham 他 (1965) J. Mol. Biol. 13:238-252）に記載した様に薄膜水和法を用いて作製することができる。ある実施態様において、リポソーム処方物を、サイズ処理前（Templeton 他 (1997) Nature Biotechnology 15:647-652）に、簡単に音波処理をし、短時間（例えば約１０分間）５０℃でインキュベートすることができる。
幾つかの実施態様において、輸送システムを作成する方法は、更に、リポソームが調製された後サイズ処理工程を含むことができて、ここでサイズ処理工程は、リポソームのサイズ（例えば、直径）に基づくリポソームの集団の選択を含む。リポソームは、超音波、高速均質化及び加圧濾過（Hope 他 (1985) Biochimica et Biophysica Acta 812:55; 米国特許Nos.4,529,561及び4,737,323）のような技術を用いて、サイズ処理することができる。リポソーム懸濁物の浴槽又は探針による音波処理は、約０．０５ミクロン以下のサイズの小単層膜小胞までの、段階的サイズ減少をもたらす。多層膜小胞は、標準的乳化ホモジナイザーにより所望のリポソームサイズまで、一般的に約０．１ミクロンから約０．５ミクロンの間に、再循環することができる。リポソーム小胞のサイズは、準弾性光散乱（QELS）により測定できる（Bloomfield (1981) Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 10:421-450）。平均リポソーム直径を、形成されたリポソームを音波処理することにより減らすことができる。断続的な音波処理サイクルを、QELS評価で変えて、有効なリポソーム合成を導くことができる。あるいは、リポソームを、微細孔ポリカーボネート膜又は非対称セラミック膜を通して押し出して、明確なサイズ分布を産出することができる。一般的に、所望のサイズ分布が得られるまで、膜を通して懸濁物を１回以上循環させることができる。リポソームを、連続的に微細孔膜を通して押し出し、リポソームサイズを次第に減少させることができる。
ある実施態様において、輸送システムを作成する方法は、更に、最終工程の後の精製工程を含むことができて、ここで輸送システム複合体を、過剰の遊離した生物活性試薬、遊離した脂質媒体、及び、幾つかの実施態様においては、遊離したポリカチオンから精製する。精製は、サッカロース密度勾配、又は密度勾配の作製に適した他の媒体を通した遠心を含め、しかしながらこれらに限らない、この技術分野の既知のどのような方法でも行うことができる。しかしながら、クロマトグラフィー、濾過、相分離、沈殿、又は吸着のような他の精製方法をもまた利用することができる。ある方法において、サッカロース密度勾配を通した遠心による精製が用いられる。サッカロース勾配の範囲は、約０％サッカロースから約６０％サッカロース、又は約５％サッカロースから約３０％サッカロースである。サッカロース勾配を作製する緩衝液は、複合体を含む分画を貯蔵するに適したどのような水溶性緩衝液でもあることができて、及び幾つかの実施態様において、細胞又は組織に複合体を投与するに適した緩衝液であることができる。
幾つかの実施態様において、標的輸送システム又はPEG化輸送システムを作製するが、ここでこの方法は、脂質媒体の作成後、又は方法の最終工程に続いて、更に後挿入工程を含み、ここで脂質向標的リガンド接合体及びPEG化脂質の中の少なくとも１つが脂質媒体（例えば、リポソーム）に後挿入される。脂質向標的リガンド接合体又はPEG化脂質を含む脂質媒体を、本明細書に示した技術（実験項；Ishida 他 (1999) FEBS Lett. 460:129-133; Perouzel 他(2003) Bioconjug. Chem. 14:884-898参照）を含むが、これに限らない、当技術分野で既知の技術により調製することができる。後挿入工程は、脂質媒体と脂質向標的リガンド接合体又はPEG化脂質との混合工程、及び粒子を約５０℃から約６０℃、短時間（例えば、約５分間、約１０分間）インキュベートする工程を含む。
幾つかの実施態様において、ポリヌクレオチド輸送システムは、約５モル％、約６モル％、約７モル％、約８モル％、約９モル％、約１０モル％、約１１モル％、約１２モル％、約１３モル％、約１４モル％、約１５モル％、約１６モル％、約１７モル％、約１８モル％、約１９モル％、及び約２０モル％を含むが、これらに限らない、約５から約２０モル％の濃度の脂質−PEG接合体とインキュベートして、ステルスポリヌクレオチド輸送システムを作製する。これらの幾つかの実施態様において、脂質−PEG接合体の濃度は、約１０モル％である。脂質−PEG接合体のポリエチレングリコール分子部分は、約１００ｇ／ｍｏｌ、約２００ｇ／ｍｏｌ、約３００ｇ／ｍｏｌ、約４００ｇ／ｍｏｌ、約５００ｇ／ｍｏｌ、約６００ｇ／ｍｏｌ、約７００ｇ／ｍｏｌ、約８００ｇ／ｍｏｌ、約９００ｇ／ｍｏｌ、約１０００ｇ／ｍｏｌ、約５０００ｇ／ｍｏｌ、約１０，０００ｇ／ｍｏｌ、約１５，０００ｇ／ｍｏｌ，及び約２０，０００ｇ／ｍｏｌを含むが、これに限らない、約１００から約２０，０００ｇ／ｍｏｌの分子量範囲を持つことができる。ある実施態様において、脂質−PEG接合体は、約２０００ｇ／ｍｏｌの分子量を持つPEG分子を含む。幾つかの実施態様において、脂質−PEG接合体は、DSPE-PEG2000を含む。
（i）輸送システム複合体が正味正電荷及び／又は（ii）輸送システムの脂質媒体が生理的ｐＨにおいて正に荷電した表面を持つ、ある実施態様において；混合する（i）化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質に対する（ii）ポリカチオン及びポリヌクレオチドの量及び比は、（i）脂質に対する（ii）ポリヌクレオチドの比が、輸送システム複合体が生理的ｐＨにおいて、正味正電荷を持つことを可能にする様な値である（本明細書の引例に取り込まれている、米国特許No.7,335,509を参照）。
ポリカチオン及びポリヌクレオチドを包み込む脂質媒体を含むポリヌクレオチド輸送システムを作った、幾つかの実施態様において、脂質媒体は、化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質を含む。幾つかの実施態様において、細胞毒性輸送システムの生物活性化合物は、細胞毒性ポリヌクレオチドを含む。更に他の実施態様において、ポリカチオン及び細胞毒性ポリヌクレオチドを包み込む化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質を含む脂質媒体を含む、細胞毒性ポリヌクレオチド輸送システムを作る。
ＩＩ−Ｃ．殺細胞の方法
本発明は、細胞を（i）化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質又は（ii）細胞毒性輸送システムと接触させて、殺細胞する方法を包含する。細胞毒性輸送システムは、化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含み、及び細胞毒性活性は、細胞毒性生物活性化合物、化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質、又は両者により与えられることができる。
本明細書で用いたように、細胞に関して用語"殺"は、もはや増殖できない、もはや代謝活性がない、又はアポトーシス又はネクローシスのいずれかの段階にある（例えば、初期段階、後期段階）細胞をもたらす過程を表す。これらの方法をin vitroで用いて培養細胞を殺すことができて、又はin vivoで接触させて、患者内の細胞を殺す。細胞死を測定する方法は、当技術分野で既知であり、及び本明細書他の所に示す。
細胞が培養中に、又は細胞が患者の一部であり、in vivo環境内で、他の種類の細胞と組み合わせられた時、特定の種類の細胞を標的とすることができて、及び脂質が化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質である、脂質向標的リガンド接合体の使用により選択的に殺すことができる。従って、本発明は、標的細胞を選択的に殺す方法を提供するが、この方法は、標的細胞と脂質−向標的リガンド接合体との接触を含むことを特徴とし、この脂質は化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質であることを特徴とする。更に、本発明は、標的細胞の選択的殺細胞を行う方法を示し、この方法は、標的細胞と標的細胞毒性輸送システムとの接触を含み、標的輸送システムの脂質媒体の外部表面は、化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含むことを特徴とする。これらの実施態様の幾つかにおいて、化学式（Ｉ）のカチオン性脂質は細胞毒活性を有する。他の実施態様において、生物活性化合物は、細胞毒性活性を持つ。更に他の実施態様において、カチオン性脂質及び生物活性化合物の両者は、細胞毒性活性を持つ。
これらの実施態様において、標的細胞は、対照細胞と比べて選択的に殺される。対照細胞は、当業者に既知のどのような種類の細胞でも適切な対照細胞であることができる。例えば、対照細胞は、向標的リガンドと相互作用することができない細胞（例えば、向標的リガンドと相互作用する細胞表面タンパク質を発現しない）であることができる、又は対照細胞は、標的細胞よりも向標的リガンドと僅かに相互作用する可能性がある（例えば、対照細胞は、向標的リガンドと僅かに相互作用する細胞表面タンパク質を発現する）。幾つかの実施態様において、対照細胞の数の、約２、約３、約４、約５、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約５００、又は約１０００倍の数の標的細胞が殺される。
本発明の方法の使用により、標的細胞が選択的に殺される、幾つかの実施態様において、標的細胞は癌細胞である。従って、本発明は、癌細胞を脂質向標的リガンド接合体又は化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質を含む標的輸送システムと接触させることにより、選択的に癌細胞を殺す方法を提供する。標的輸送システムは、任意に、細胞毒性化合物を含むことができる。
癌細胞が選択的に殺され、及び標的輸送システムの生物活性化合物が細胞毒性ポリヌクレオチドを含む、幾つかの実施態様において、ポリヌクレオチドは、細胞内に導入される、又は細胞内で発現した時、腫瘍遺伝子の発現を減少させるサイレンサー配列を含む。ある実施態様において、腫瘍遺伝子は、EGFRを含む。
ＩＩ−Ｄ．治療又は防止の方法
（i）化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質；（ii）化学式（Ｉ）のカチオン性脂質が細胞毒性活性を持つことを特徴とする、化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む輸送システム；（iii）化学式（Ｉ）のカチオン性脂質及び治療活性を有する生物活性化合物を含む輸送システム；及び（iv）化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質及び治療活性を持つ生物活性化合物を含む輸送システムを、疾患又は迷惑な病態に苦しむ患者の治療のために用いることができる。
本明細書で用いるように、生物活性化合物を表す時、"治療活性"は、必要とする患者に投与した時、所望の薬学的及び／又は生理学的効果を引き出すことができることを意図した活性である。
従って、疾患又は迷惑な病態に苦しむ患者の治療のための方法は、（i）化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質を含む医薬組成物；（ii）化学式（Ｉ）のカチオン性脂質が細胞毒性活性を有する化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む輸送システムを含む医薬的組成物；（iii）化学式（Ｉ）のカチオン性脂質及び疾患又は迷惑な病態に抗する治療活性（例えば、疾患又は迷惑な病態を治療できる）を有する生物活性化合物を含む輸送システムを含む医薬組成物；の患者への投与を含む。幾つかの実施態様において、治療活性を持つ生物活性化合物は、細胞毒性化合物を含む。
本明細書で用いるように、用語"治療"又は"防止"は、所望の薬学的及び／又は生理学的効果を得ることを表す。この効果は、特定の感染又は疾患又は徴候又はその症候を完全に又は部分的に防止すると言う見地では、予防的であること；及び／又は感染又は疾患及び／又は感染又は疾患に帰因する不都合な効果を完全に又は部分的に治療すると言う見地では治療的であることができる。従って、この方法は、本発明の組成物を受けとる患者の疾患又は病気の有害な効果を、"防止する"（例えば、遅らす又は阻害する）及び／又は"減ずる"（例えば、減少、減速、又は寛解）。患者は、ヒトのような哺乳動物のみならず、及びネコ、イヌのような家畜動物、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、のような農場動物、ブタ、野生動物（自然界、動物園に拘わらず）、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコその他、のような実験動物、獣医学使用のためのニワトリ、シチメンチョウ、鳴禽のようなトリ類を含め、がそれに限らず、どのような動物でもあることができる。
どのような種類の迷惑な病態又は疾患も、本発明の組成物を伴って、治療的に処置することができる。幾つかの実施態様において、治療される疾患又は迷惑な病態は、癌である。本明細書他の所で記載したように、用語"癌"は、どのような種類の増殖でも、調節から逃れた細胞増殖を包含し、及び全ての種類の癌を含む。幾つかの実施態様において、治療される癌は、肺癌である。癌増殖又は癌進行の阻害を検出する方法は、当技術分野で既知であり、及びサイズの減少を検知するために初期腫瘍のサイズの測定、二次的腫瘍の遅れた出現、二次腫瘍の進行の低下、二次腫瘍の発生の減少、及び疾患の２次的効果の重篤性出現の遅延又は重篤性の減少を含むが、これらに限らない。
本発明の、化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質及び輸送システムの投与を（i）単独で、又は、（ii）外科的療法、放射線治療、又は薬剤のようなどのような種類の治療薬による治療をも含む（が、これらに限らない、）他の治療方法と組み合わせて、行うことができることを、当業者は理解する。患者が癌に苦しむこれらの実施態様において、化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質及び輸送システムを、（本明細書の他の所で記載した、）化学療法薬剤又は（本明細書の他の所で記載した、）どのような細胞毒性薬剤、又は免疫療法をも含む（がこれに限らない、当技術分野でよく知られている）どのような化学療法薬剤とも組み合わせて輸送できる。
ある実施態様において、患者に細胞毒性生物活性化合物及び化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質を投与することにより、細胞毒性生物活性化合物の細胞毒性活性は、この化合物を必要とする患者において亢進する。本明細書で用いるように、用語"亢進する"、"亢進した"、又は"亢進"は、加算的又は相乗的増加を表す。従って、細胞毒性生物活性化合物又は細胞毒性カチオン性脂質単独の投与と比較して、化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質又は細胞毒性輸送システムの投与によって、細胞毒性生物活性化合物の細胞毒性活性が亢進する時、細胞毒性活性は、加算的に又は相乗的に増加する。
幾つかの実施態様において、細胞毒性生物活性化合物及び細胞毒性カチオン性脂質の両者が患者に投与される単一組成物に存在するように、細胞毒性生物活性化合物及び細胞毒性カチオン性脂質は患者に対して同時に投与することができる。あるいは、他の実施態様において、細胞毒性生物活性化合物及び細胞毒性カチオン性脂質は、別の組成物として順次に投与される。"順次に"により、２種の別個の組成物として、２種の化合物が患者に対して相次いで投与されることを意図するが、ここで一方の組成物は、細胞毒性生物活性化合物を含み、及び他方の組成物は、細胞毒性カチオン性脂質を含む。細胞毒性生物活性化合物及び細胞毒性カチオン性脂質が順次に投与される幾つかの実施態様において、細胞毒性生物活性化合物が最初に投与され、その後細胞毒性カチオン性脂質が投与される。他の実施態様において、細胞毒性カチオン性脂質は、細胞毒性生物活性化合物の投与前に、その化合物を必要とする患者に投与される。ある実施態様において、細胞毒性生物活性化合物はシスプラチンを含む。
本発明の他の実施態様において、この細胞毒性生物活性化合物を包み込む脂質媒体を含む輸送システムを投与することにより、患者において、細胞毒性生物活性化合物の細胞毒性活性は亢進するが、上記脂質媒体は、細胞毒性活性を持つ化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む。これらの実施態様の幾つかにおいて、細胞毒性生物活性化合物は、細胞毒性ポリヌクレオチドを含む。
その輸送システムを必要とする患者に投与する時、化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質又は化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む輸送システムは、本明細書の他の所で考察したように、向標的リガンドを含む。これらの実施態様において、向標的リガンドは、患者の標的細胞又は組織を標的として、物理的に会合したリガンド又は複合体をして狙わせるであろう。幾つかの実施態様において、標的輸送システムは、細胞毒性である。ある実施態様において、標的細胞又は組織は、病気、又は不快な病態として特徴付けられる。
ＩＩ−Ｄ−１．投与量
化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質又は化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む輸送システムの治療上有効量の輸送は、この試薬の治療上有効投与量を含む医薬組成物の投与を通して行うことができる。"治療上有効量"又は"投与量"は、（i）所望の治療効果を引き出すに十分な化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質又は（ii）化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む輸送システム複合体の濃度を意味する。
本明細書で用いるように、"有効量"は、有益な、又は所望の臨床的又は生化学的結果をもたらすに十分な量である。有効量は、１以上の回数で投与することができる。
化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質又は化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む輸送システム複合体の有効量は、体重、性、年齢、及び患者の病歴により変わるであろう。有効量に影響を与える他の因子は、（i）患者の病状の重篤度、（ii）治療を受けている病気、（iii）化合物又は複合体の安定性、及び、もし所望するならば、（iv）脂質又は脂質を含む複合体と共に投与される補助治療薬剤の安定性、を含むが、これらに限らない。有効性及び投薬量を測定する方法は、当業者に既知である。例えば、本明細書引例に取り込まれている、Isselbacher 他 (1996) Harrison's Principles of Internal Medicine 13 ed., 1814-1882を参照。
医薬組成物を様々な間隔で、及び必要に従い異なる期間にわたり投与することができる、例えば、毎日、又は１日おきに毎日多数回；約１から１０週の間、２から８週間の間、約３から７週間の間、約４，５又は６週間の間、毎週１回；等々。本分野の技術者は、疾患、病気、又は迷惑な病態の重篤度、以前の治療、患者の一般的健康状態及び／又は年齢、及び現在の他の疾患又は迷惑な病態を含むが、これらに限らない、ある因子が、患者を有効に治療するに必要な投薬量及び適時性に影響を与えることができることを理解する。一般的に、患者の治療は一回の治療を含み、又は、多くの場合一連の治療を含む。
化合物の適切な投与量は、その効能に依存し、及び特定の受容者に対して、例えば、あらかじめ選んだ所望の応答を得るまで投与量を増加させて投与することにより、任意に特別に処方することができることを理解すべきである。どのような特定の動物に対しても、特定の投与レベルは、使用する特定の化合物の活性、患者の年齢、体重、一般的健康、性、食習慣、投与の時間、投与経路、排出速度、どのような薬剤でもこの組合せ、及び発現の程度又は変化させる活性を含む様々な因子に依存することができることは理解される。
本発明の他の実施態様において、化学式（Ｉ）の細胞毒性カチオン性脂質又は化学式（Ｉ）のカチオン性脂質を含む輸送システムの治療上有効投与量は、断続的に投与される。"断続的投与"により、脂質又は脂質を含む複合体の治療上有効投与量の投与、その後の中断期間、及びその後の治療上有効投与量の他の投与、等々を意図する。治療上有効投与量の投与は、例えば、持続する放出のような連続した方法で行うことができる、又は例えば、１日１，２，３，又はより多数回の投与のような所望の毎日の投与計画に従って行うことができる。"中断期間"により、連続した持続する放出又は毎日の脂質又は脂質を含む複合体の投与の中断を意図する。中断期間は、連続した持続する放出又は毎日の投与の期間より長期又は短期であることができる。中断の期間中に、関係する組織中の本発明のカチオン性脂質又は脂質を含む複合体のレベルは治療の間得られる最大レベルより十分低い。幾つかの実施態様において、中断期間は、有効投与量の濃度による。中断期間は、少なくとも２日間、少なくとも４日間、少なくとも１週間であることができる。他の実施態様において、中断期間は、少なくとも１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、又はそれ以上である。持続する放出処方を用いる場合、中断期間を延長して、治療部位における脂質又は脂質を含む複合体のより長い滞留時間を配慮しなければならない。あるいは、持続した放出処方の有効投与量の投与の頻度は、減らすことができる。脂質又は脂質を含む複合体の投与の断続的スケジュールは、所望の治療効果まで持続することができる、及び最終的に疾患又は迷惑な病態の治療が行われる。
本発明を一覧した当業者は、医薬的に許容される塩及びこの医薬組成物を含め、本発明の化合物を、直接、細胞に、細胞培養に、細胞培養培地に、組織に、組織培養に、組織培養培地等々に投与することができる。本発明の新規カチオン性脂質又は本発明の輸送システムを表す場合、用語"投与"及びこの類語は、この化合物を細胞と接触させるどのような方法をも含む。本発明の化合物、又は医薬的に許容される塩、又はこの医薬的組成物を、in vitro又はex vivoの細胞又は組織に投与することができる。本発明の化合物、又は医薬的に許容される塩、又はこの医薬的組成物を、全身的投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、又は頭蓋内投与）又は本明細書他の所で記載した、局所への適用による、個々の患者、例えば病人、に投与することにより、in vivoの細胞又は組織に投与する（又は、接触させる）ことができる。
III. 化学用語の定義
以下の用語は、当業者により良く理解されていると信ずるが、本発明の説明に役立てるために、以下の定義を述べる。
明細書及び請求の範囲を通して、与えられた化学式又は名前は、そのような異性体又は混合物が存在する場合、あらゆる光学的及び立体異性体、及びラセミ混合物を包含する。
用語"独立して選択"を用いた場合、参照する物質（例えば、R1基、R2基等々のようなR基、又はQ1基、Q2基等々の置換基）は、同一又は異なる。例えば、Ｒ１及びＲ２の両者は、置換アルキル基であり、又はＲ１は水素原子であり、及びＲ２は、置換アルキル基等々である。
もし他の様に特定化しなければ、名前"Ｒ"又は"Ｑ"基は、一般的に、その名前を持つ置換基と当技術分野で認められている構造を有する。例証のために、上記の様に示した、ある代表的"Ｒ"又は"Ｑ"置換基は以下の様に定義される。これらの定義は、本発明を一覧した当業者に自明な定義を補充し、例証し排除しないことを意図する。
本明細書で用いるように、用語"アルキル基"は、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、エテニル基、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、オクテニル基、ブタジエニル基、プロピニル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基、ヘプチニル基、及びアレニル基を含む、線状、（即ち、"直鎖"）、分枝状、又は環状、飽和又は少なくとも部分的に、及びある場合には完全に不飽和な（即ち、アルケニル基、及びアルキニル基）炭化水素鎖を含むＣ１〜２０を表わす。"分枝状"は、メチル基、エチル基、又はプロピル基のような低級アルキル基が、線状アルキル鎖に付加したアルキル基を表す。"低級アルキル基"は、１から約８炭素原子（即ち、Ｃ１〜８アルキル基）例えば、１，２，３，４，５，６，７又は８炭素原子、を持つアルキル基を表す。"高級アルキル基"は、約１０から約２０炭素原子、例えば、１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９又は２０炭素原子、を持つアルキル基を表す。ある実施態様において、"アルキル基"は特にＣ１〜８直鎖アルキル基を表す。他の実施態様において、"アルキル基"は特に、Ｃ１〜８分枝鎖アルキル基を表わす。
アルキル基を、任意に同一又は異なる１以上のアルキル置換基により置換することができる（"置換アルキル基"）。用語"アルキル置換基"は、アルキル基、置換アルキル基、ハロ基、アリールアミノ基、アシル基、ヒドロキシル基、アリールオキシル基、アルコキシル基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アラルキルオキシル基、アラルキルチオ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、オキソ基、及びシクロアルキル基を含むが、これらに限らない。任意に、アルキル鎖に沿って、１以上の、酸素、イオウ又は置換又は非置換窒素原子を挿入することができるが、ここで窒素置換体は、水素原子、低級アルキル基（本明細書ではまた、"アルキルアミノアルキル基"と表わす）又はアリール基である。
従って、本明細書で用いたように、用語"置換アルキル基"は、本明細書で定義したように、アルキル基の１以上の原子又は官能基が、例えば、アルキル基、置換アルキル基、ハロゲン原子、アリール基、置換アリール基、アルコキシル基、ヒドロキシル基、ニトロ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、硫酸基、及びメルカプト基を含む、他の原子又は官能基に置換されたアルキル基を含む。
"環状"及び"シクロアルキル基"は、例えば、３，４，５，６，７，８，９，又は１０炭素原子のような、約３から約１０炭素原子の非芳香族単環又は多環システムを表わす。シクロアルキル基は、任意に部分的に不飽和である。また、シクロアルキル基は、任意に、本明細書で定義した様なアルキル置換基、オキソ基、及び／又はアルキレン基で置換することができる。環状アルキル鎖に沿って、１以上の酸素、イオウ、又は置換又は非置換窒素原子を挿入することができるが、ここで窒素置換基は、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、又は置換アリール基であり、この様にして複素環式基を提供する。代表的単環シクロアルキル環は、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、及びシクロヘプチル基を含む。多環シクロアルキル環は、アダマンチル基、オクタヒドロナフチル基、デカリン基、カンファー（ショウノウ）、カンファン、及びノラダマンチル基を含む。
本明細書で用いるように、用語"シクロアルキルアルキル基"は、前述の様に定義したアルキル基によって親分子部分に付加した、上記で定義したシクロアルキル基を表す。シクロアルキルアルキル基の例としては、シクロプロピルメチル基、及びシクロペンチルエチル基がある。
用語"シクロヘテロアルキル環"又は"複素環式基"は、同一又は異なることができる、及びＮ，Ｏ及びＳを含む群から選択される１以上のヘテロ原子を含み、及び任意に１以上の二重結合を含むことができる、３〜７員置換又は非置換シクロアルキル環システムのような、非芳香族環システムを表わす。このシクロヘテロアルキル環は任意に融合又は他のシクロヘテロアルキル環及び／又は非芳香族炭化水素環に付加することができる。代表的シクロヘテロアルキル環システムは、ピロリジニル基、ピロリニル基、イミダゾリジニル基、イミダゾリニル基、ピラゾリジニル基、ピラゾリニル基、ピペリジル基、ピペラジニル基、インドリニル基、キヌクリジニル基、モルホリニル基、チオモルホリニル基、チアジアジナニル基、テトラヒドロフラニル基、等々が含まれるが、これらに限らない。
本明細書で用いるように、用語"アルケニル基"は、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含む設計した数の炭素原子の直鎖又は分枝状の炭化水素を表す。"アルケニル基"の例は、ビニル基、アリル基、２−メチル−３−ヘプテン基、等々を含む。
本明細書で用いるように、用語"シクロアルケニル基"は、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含む環状炭化水素を表す。シクロアルケニル基の例としては、シクロプロペニル基、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロペンタジエン基、シクロヘキセニル基、１，３−シクロヘキサジエン基、シクロヘプテニル基、シクロヘプタトリエニル基、及びシクロオクテニル基が含まれる。
本明細書で用いるように、用語"アルキニル基"は、少なくとも１個の炭素−炭素３重結合を含む設計した数の炭素原子の直鎖又は分枝状炭化水素を表す。"アルキニル基"の例は、プロパルギル基、プロピン基、及び３−ヘキシン基を含む。
"アルキレン基"は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９又は２０炭素原子のような、１から約２０炭素原子を持つ直鎖又は分枝状の２価脂肪族炭化水素基を表す。アルキレン基は、直鎖、分枝状又は環状である。アルキレン基はまた、任意に不飽和及び／又は１以上の"アルキル置換基"で置換されることができる。アルキレン基に沿って、１以上の酸素、イオウ、又は置換又は非置換窒素原子（本明細書において、"アルキルアミノアルキル基"とも表される）を任意に挿入することができるが、ここで窒素置換基は既に記載の様にアルキル基である。アルキレン基の例としては、メチレン基 (-CH2-); エチレン基(-CH2-CH2-); プロピレン基 (-(CH2)3-); シクロヘキシレン基 (-C6H10-); -CH=CH-CH=CH-; -CH=CH-CH2-; -(CH2)q-N(R)-(CH2)r-を含み、ここで各q及びrは独立して０から約２０までの整数であり、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９，又は２０であり、ここでＲは、水素原子又は低級アルキル基；メチレンジオキシル基(-O-CH2-O-); 及びエチレンジオキシル基(-O-(CH2)2-O-)である。アルキレン基は、約２から約３炭素原子を持つことができて、及び更に６〜２０炭素を持つことができる。
本明細書で用いるように、用語"アシル基"は、有機酸基を表し、ここでカルボキシル基の-OHは、他の置換基で置き換えられる（例えば、RCO-により表され、ここでRは、アルキル基又は、本明細書で定義した様にアリール基である）。従って、用語"アシル基"は、特に、アセチルフラン基及びフェナシル基のような、アリールアシル基を含む。アシル基の特別の例としては、アセチル基及びベンゾイル基がある。
"アルコキシル基"は、アルキル−Ｏ−基を表し、ここでアルキル基は、既に記載した。本明細書で用いるように、用語"アルコキシル基"は、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシル基、イソプロポキシル基、ブトキシル基、t-ブトキシル基、及びペントキシル基を含み、線状、分枝状又は環状、飽和又は不飽和オキソ炭化水素鎖を含むＣ１〜２０を表わす。
本明細書で用いるように、用語"アルコキシアルキル基"は、例えば、メトキシエチル基又はエトキシメチル基のように、アルキル-Ｏ-アルキルエーテル基を表わす。
"アリールオキシル基"はアリール-Ｏ-基を表し、ここでアリール基は前述の様に置換アリール基を含む。本明細書で用いるように、用語"アリールオキシル基"は、フェニルオキシル基又はヘキシルオキシル基、及びアルキル基、置換アルキル基、ハロ基、又はアルコキシル置換フェニルオキシル基又はヘキシルオキシル基を表すことができる。
本明細書で用いるように、用語"アルキル−チオ−アルキル基"は、例えば、メチルチオメチル基又はメチルチオエチル基のような、アルキル-Ｓ-アルキルチオエーテル基を表す。
"アラルキル基"は、アリール−アルキル基を表し、ここで、アリール基及びアルキル基は、前述の通りであり、置換アリール基及び置換アルキル基を含む。アラルキル基の例としては、ベンジル基、フェニルエチル基、及びナフチルメチル基を含む。
"アラルキルオキシル基"はアラルキル-Ｏ-基を表し、ここで、アラルキル基は前述の通りである。アラルキルオキシル基の例は、ベンジルオキシル基である。
"アルコキシカルボニル基"はアルキル-O-CO-基を表す。アルコキシカルボニル基の例としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ブチルオキシカルボニル基、及びt-ブチルオキシカルボニル基を含む。"アリールオキシカルボニル基"は、アリール-O-CO-基を表わす。アリールオキシカルボニル基の例としては、フェノキシ−及びナフトキシ−カルボニル基がある。
"アラルキルオキシカルボニル基"は、アラルキル-O-CO-基を表す。アラルコキシカルボニル基の例としては、ベンジルオキシカルボニル基である。
"カルバモイル基"は、H2N-CO-基を表わす。"アルキルカルバモイル基"は、R'RN-CO-基を表し、ここでＲ及びＲ'の１方は、水素原子であり、及びＲ及びＲ'の他方は、前述の様にアルキル基及び／又は置換アルキル基である。"ジアルキルカルバモイル基"は、R'RN-CO-基を表し、ここで前述のように、Ｒ及びＲ'は、独立してアルキル基及び／又は置換アルキル基である。
"アシルオキシル基"は、アシル-O-基を表し、ここでアシル基は前述の様である。
用語"アミノ基"は-NH2基を表し、及びまた、当技術分野で既知のように、１以上の水素ラジカルを有機ラジカルで置き換えることにより、アンモニアから誘導される含窒素置換基を表す。例えば、用語"アシルアミノ基"及び"アルキルアミノ基"は、それぞれ、アシル及びアルキル置換基で置き換えられた特別なＮ-置換有機ラジカルである。
用語"アルキルアミノ基"は、-NHR基を表し、ここでＲはアルキル基及び／又は前述の様に置換アルキル基である。アルキルアミノ基の例としては、メチルアミノ基、エチルアミノ基等々がある。
"ジアルキルアミノ基"は、-NRR'-基を表し、ここで各Ｒ及びＲ'は、独立してアルキル基及び／又は前述のような置換アルキル基である。ジアルキルアミノ基の例としては、エチルメチルアミノ基、ジメチルアミノ基、及びジエチルアミノ基がある。
"アシルアミノ基"は、アシル-NH-基を表し、ここで、アシル基は、前述の通りである。"アロイルアミノ基"は、アロイル-NH-基を表し、ここでアロイル基は前述の通りである。
用語"カルボニル基"は-(C=O)-基を表す。
用語"カルボキシル基"は、-COOH基を表わす。
本明細書で用いるように、用語"ハロ基""ハロゲン化物"又は"ハロゲン原子"は、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基、及びヨード基を表す。
用語"ヒドロキシル基"は-OH基を表す。
用語"ヒドロキシアルキル基"は、-OH基で置換されたアルキル基を表す。
用語"メルカプト基"は、-SH基を表す。
用語"オキソ基"は、炭素原子が酸素原子で置換された本明細書に既述の化合物を表す。
用語"ニトロ基"は-NO2基を表わす。
用語"チオ基"は、炭素又は酸素原子がイオウ原子で置き換えられた、本明細書既述の化合物である。
用語"硫酸基"は、-SO4基を表す。
用語"グアニジノ基"は、一般的化学構造：
Figure 2011520962
 を持つラジカルを表し、式中、各Ｒは独立して例えば、水素原子又はアルキル基であることができる。
用語"グアニジニウム基"は、一般的化学構造：
Figure 2011520962
 を持つカチオン基を表す。
当業者は、グアニジニウムカチオンは、次の共鳴カチオン型で存在すると認識するであろう：
Figure 2011520962
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。
実施例１〜８の材料及び方法
高速原子衝撃質量分析法（FABMS）データを、マトリクスとしてメタニトロベンジルアルコールを用いた液体二次イオン質量分析法（LSIMS）技術により得た。LSIMS分析は、走査速度３スキャン／ｓで、走査範囲１００〜１０００amuで行った。1HNMRスペクトルをGemini300Mhzスペクトロメーターを用いて記録した。テトラデシルアミン、ブロモテトラデカン、Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルドジイミド、Ｎ−エプシロン−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン、Ｎ−アルファ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン、ブロモエチルアミン臭化水素酸塩、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド、アンバーライトClイオン交換樹脂、トリフルオロ酢酸、氷酢酸、１０％Pd-C、ギ酸アンモニウム、セライト、ヨウ化メチル、チオウレア、塩化水銀、Boc-無水、水酸化ナトリウム、及びブロモエチルアミン臭化水素酸塩、をSigma Aldrichより入手した。ジクロロメタン、クロロホルム、メタノール、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、及び石油エーテルのような溶媒を、Acros Organicsより購入した。DOTAP及びコレステロールは、Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AL)から購入した。硫酸プロタミン、（サケより分画Ｘ）及び仔牛胸腺DNA（ハイブリダイゼーション用、フェノールクロロホルム抽出及びエタノール沈殿）は、Sigma-Aldrich(St. Lous, MO)から購入した。
反応の進行は、Sigma-Aldrichより購入した０．２５ｍｍシリカゲル板上の薄層クロマトグラフィーによりモニターした。カラムクロマトグラフィーはシリカゲル（Sigma Aldrich, grade62, 60〜200メッシュ、１５０Å）で行った。
EGFR及び対照siRNA配列は、以前の研究より借用した（Banerjee 他 (2004) Int. J. Cancer 112:693-700）。合成siRNAを、Dharmacon(Lafayett, CO)から購入した。EGFR siRNAのセンス鎖の配列は5'-AACACAGUGGAGCGAAUUCCU-3'（配列番号１）であり、及び高度に精製した対照siRNAのセンス鎖の配列は5'-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3'（配列番号２）である。定量的研究のために、FAMをセンス配列の５'−末端に接合した。５'FAM−標識siRNAを、また総合DNA技術から得た。
脂質１〜３の合成
図２の反応機構に従って脂質１〜３（図１）を合成した。以下、代表的脂質である脂質２の合成過程を詳述し、他の２種の脂質についてはTLC, 1H NMR及び質量分析データのみ示す。最終的に脱保護基した脂質の1H NMRスペクトルは広範囲にわたる線幅拡大を示すので（特にδ／ｐｐｍ＝３〜５の領域において）、全ての採取脂質は、LSIMSにより特徴付けた。
Ｎ，Ｎ−ジミリストイル−Ｎ−メチル−Ｎ−２［Ｎ'−（Ｎ２−グアニジノ−Ｌ−リジニル）アミノエチルアンモニウムクロリド（脂質２）の合成：
ステップ（ａ）： Ｎε,-tert-ブチルオキシカルボニル−Ｎα−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジンを、前述の様にＮα−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン、及びジ−tert-ブチルジカルボネートから調製した（Bodanszky and Bodanszky (1984) Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, p. 20）。乾燥DCM／乾燥DMF（９：１，ｖ／ｖ）中にこのＮε,-tert-ブチルオキシカルボニル−Ｎα−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジンを氷冷・攪拌した溶液（0.48g、1.3mmol）に、固体HOSu（0.15g、1.3mmol）及びDCC（0.29g、1.4mmol）を、順次加えた。３０分間後、乾燥DCMに溶かしたＮ−アミノエチル−Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−テトラデシルアミン（0.57g、1.3mmol、前述の様に調製）（Kumar 他(2003) Gene Ther. 10:1206-1215）及びDMAP（触媒）を反応混合液に加えた。得られた溶液を室温で２４時間攪拌し、固体DCUを濾過して除き、及び濾過液から溶媒を蒸発させた。残渣を酢酸エチル（100mL）にとかし、順次、氷冷１Ｎ HCL（3x100mL）飽和重炭酸ナトリウム（3x100mL）及び水（3x100mL）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濾液から溶媒を回転蒸発器により取り除いた。６０〜１２０メッシュサイズのシリカゲルを充填したクロマトグラフィー精製カラムに、溶出液として２−２．５％メタノール−ジクロロメタン（ｖ／ｖ）を用いて、残渣を載せ、これにより０．６１２ｇ（５８％）の精製した中間体、Ｎ−２−［Ｎ'−（Ｎε−BOC、Ｎα−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジニル）］アミノエチル−Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−テトラデシルアミンを得た。（Ｒｆ＝0.6,10%メタノール−ジクロロメタン、ｖ／ｖ）。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ/ppm =0.9 [t, 6H, CH 3-(CH2)11-]; 1.2-1.4 [m, 44H, -(CH 2)11-]; 1.3-1.6 [m, 4H, LysCγ H 2+ LysCδ H 2]; 1.4 [s, 9H, -CO-O-C(CH 3)3]; 1.5 [m, 4H, -N(-CH2-CH 2-)2 ]; 1.8[m, 2H, LysCβ H 2]; 2.4-2.6 [bm, 6H, -N(-CH 2-CH2-)2 + -N-CH 2-CH2-NH-CO-O-]; 3.1 [m, 2H, LysωCH 2]; 3.3 [m, 2H,-N-CH2-CH 2-NH-CO-]; 4.0-4.2 [2 m, 2H, LysCα H + - CH2-CH2-NH-CO-]; 4.6 [m, 1H, BOC -NH]; 5.1 (s, 2H ,Z-CH 2); 5.5 (m, 1H, Z-NH); 7.3 (m, 5H, Ar-H)。
ステップ（ｂ）： ステップ（ａ）で得た中間体（0.62g、0.76mmol）を、数滴の氷酢酸を含む乾燥メタノール（10mL）に溶かした。ギ酸アンモニウム（0.38g、6.0mmol）＆１０％Pd/C（0.25g）を加え、及び反応混合物を６時間、窒素気流中で攪拌させた。触媒をセライトを用いた濾過で除き、その後濾液を蒸発により乾燥させた。残渣を酢酸エチル（50mL）に溶かし、順次３０％炭酸カリウム水溶液（3x50mL）、飽和塩化ナトリウム（3x50mL）及び水（3x50mL）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濾液から溶媒を回転蒸発させて、０．５１ｇ（６９％）の中間体Ｎ−２−［Ｎ'−（Ｎε-BOC-L-リジニル）］アミノエチル−Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−テトラデシルアミン（反応機構Ｉ）（Ｒｆ＝０．２，ジクロロメタン中１０％メタノール、ｖ／ｖ）を得た。この中間体を、更に精製せず、直ちにステップ（ｃ）に用いた。
ステップ（ｃ）： 塩化水銀（0.16g、0.57mmol）を乾燥DMF（5mL）及び乾燥DCM（2mL）に溶かしたＮ−２−［Ｎ'−（Ｎε-BOC-L-リジニル）］アミノエチル−Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−テトラデシルアミン（0.35g、0.5mmol）、ビス-BOCチオウレア（0.15g、0.5mmol）及びトリエチルアミン（0.11g、1.1mmol）の混合物に、０℃で、連続して攪拌しながら加えた。得られた混合物を、０℃、窒素下で、４０分間攪拌し、酢酸エチル（20mL）で稀釈し、セライトパッドを通して濾過した。濾液を水（2x20mL）、その後ブライン溶液（塩水；2x20mL）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、濾液から溶媒を回転蒸発器により除いた。６０〜１２０メッシュサイズのシリカゲルを充填したクロマトグラフィー精製カラムに、溶出液として２−２．５％メタノール−ジクロロメタン（ｖ／ｖ）を用いて、残渣を載せ、精製した０．２５ｇ（５３％）の中間体Ｎ−２−［Ｎ'−（Ｎε-BOC、Ｎα−（ジベンジルオキシカルボニル グアニジノ−Ｌ−リジニル））アミノエチル−Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−テトラデシルアミンを得た。（Ｒｆ＝０．８，１０％メタノール−ジクロロメタン、（ｖ／ｖ））。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ/ppm =0.9 [t, 6H, CH 3-(CH2) 11-]; 1.2-1.4 [m, 44H, -(CH 2)11-]; 1.3-1.6 [m, 4 H, LysCγ H 2+ LysCδ H 2]; 1.4-1.6 [3s, 27H, CO-O-C(CH 3)3]; 1.5 [m, 4H, -N(-CH2-CH 2-)2 ]; 1.75 [m, 2H, LysCβ H 2]; 2.4 [t, 4H, -N(-CH 2-CH2-)2]; 2.5 [t, 2 H,-N-CH 2-CH2- NH-CO]; 3.1 (m, 2H, LysωCH 2); 3.3 [m, 2H, -N-CH2-CH 2-NH-CO]; 4.6 [m,1H, LysCα H]; 6.7 [m, 1H, BOC -NH-CH2]; 7.9 [m, 1H, -CH2-NH-CO-]; 8.8 [d, 1H, -CH2-NH-]; 11.4[s, 1H, C -NHBOC]。
ステップ（ｄ）： ステップ（ｃ）で得た中間体（０．２５ｇ）を３ｍＬジクロロメタン／メタノール（２：１，ｖ／ｖ）に溶かし、及び３ｍＬヨウ化メチルを加えた。室温で溶液を一晩攪拌し、回転蒸発器により溶媒を除いた。６０〜１２０メッシュサイズのシリカゲルを充填したクロマトグラフィー精製カラムに、溶出液としてクロロホルム中３−４％メタノールを用いて、残渣を載せ、０．１６ｇ（５６％収率）の四級化した中間体を得た（Ｒｆ＝０．６，クロロホルム中１０％メタノール、ｖ／ｖ）。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ/ppm =0.9 [t, 6H, CH 3-(CH2) 11-]; 1.2-1.4 [m, 44H, -(CH 2)11-]; 1.3-1.6 [m, 4 H, LysCγ H 2+ LysCδ H 2]; 1.4-1.6 [3s, 27H, CO-O-C(CH 3)3]; 1.5 [m, 4H, -N+(-CH2-CH 2-)2 ]; 1.7 [m, 2H, LysCβ H 2]; 3.1[m, 2H, LysωCH 2]; 3.2[s, 3H, (-N+-CH3)]; 3.3 [m, 4H, -N(-CH 2-CH2-)2]; 3.7 [m, 2H, -N+-CH2-CH 2- NH-CO]; 3.8 [m, 2H, -N+-CH 2-CH2- NH-CO]; 4.5[m,1H, LysCα H]; 4.7 [m, 1H, BOC -NH]; 8.2 [t, 1H, -CH2-NH-CO-]; 8.7[d, 1H, -CH-NH-C-]; 11.3[s, 1H, -NHBOC].
ステップ（ｅ）：ステップ（ｄ）で得た中間体（０．１６ｇ）を乾燥DCM（２ｍＬ）に溶かし、及び０℃でTFA（２ｍＬ）を加えた。得られた溶液を室温で一晩攪拌し、脱保護基を完全に確かなものにした。過剰なTFAを窒素をフラッシュさせて除き、トリフルオロ酢酸塩として標題の化合物を得た。６０〜１２０メッシュサイズのシリカゲル、溶出液として１２−１５％（ｖ／ｖ）メタノール−クロロホルムを用いた標準的クロマトグラフィー精製の後、塩素イオン交換クロマトグラフィー（AmberlystＡ−２６塩素イオン交換樹脂を用いる）により、０．０８ｇ（６９％、収率）の精製した標題化合物（Ｒｆ＝０．３，クロロホルム中２０％メタノール（ｖ／ｖ））を得た。LSIMS（脂質２）：ｍ／ｚ：６３７．８［ＭＨ＋］（Ｃ３８Ｈ８１ＯＮ６，に対して計算、７４％）。
脂質１＆３を、上記の脂質２（図２）に対してと同じステップに従い合成した。残された最終脂質の中間前駆体に対するTLC特性、1H NMRスペクトルデータ、及び残された最終脂質に対するLSIMSデータを以下に提供する。
脂質１：
N,N-ジ-ミリストイル-N-メチル-N-2[N'-(N6-グアニジノ-L-リジニル)]アミノエチルアンモニウムクロリド (脂質１, DMGLA), (Rf = 0.6, ジクロロメタン中10 %メタノール, v/v:)の直近の中間前駆体の1H NMR (300 MHz, CDCl3)
1H NMR (200 MHz, CDCl3): δ/ppm =0.9 [t, 6H, CH 3-(CH2) 13-]; 1.2-1.4 [m, 44H, -(CH 2)13-]; 1.3-1.6 [m, 4 H, LysCγ H 2+ LysCδ H 2]; 1.4-1.6 [3s, 27H, CO-O-C(CH 3)3]; 1.5 [m, 4H, -N+(-CH2-CH 2-)2 ]; 1.7 [m, 2H, LysCβ H 2]; 3.2[s, 3H, -N+-CH3]; 3.3 [t, 6H, -N(-CH 2-CH2-)2 ; LysωCH 2]; 3.7 [m, 4H, -N+-CH 2-CH 2- NH-CO]; 4.1[m,1H, LysCα H]; 5.2[m, 1H, BOC -NH]; 8.1-8.3 [2t, 2H, -CH2-NH-CO-; -CH2-NH-C-]; 11.45[s, 1H, -NHBOC].
LSIMS (脂質 1): m/z: 637.9 [MH+] (C38H81ON6に対して計算, 57%).
脂質３:
N,N-ジミリストイル-N-メチル-N-2[N'-( N2 , N6-ジ -グアニジノ-L-リジニル)]アミノエチルアンモニウムクロリド (脂質３), (Rf = 0.6, ジクロロメタン中10 % メタノール, v/v)の直近の前駆体の1H NMR (300 MHz, CDCl3)
1H NMR (200 MHz, CDCl3): δ/ppm =0.9 [t, 6H, CH 3-(CH2) 15-]; 1.2-1.4 [m, 44H, -(CH 2)15-]; 1.3-1.6 [m, 4 H, LysCγ H 2+ LysCδ H 2]; 1.4 [m, 36H, CO-O-C(CH 3)3]; 1.5-1.7 [m, 6H, -N+(-CH2-CH 2-)2 + LysCβ H 2]; 3.25 [s, 3H, -N+-CH3]; 3.3 [t, 6H, -N(-CH 2-CH2-)2 ; LysωCH 2]; 3.7 [m, 2H, -N+-CH2-CH 2- NH-CO]; 3.8 [m, 2H, -N+-CH 2-CH2- NH-CO]; 4.5 [m,1H, LysCα H]; 8.1-8.3[2t, 2H, -CH2-NH-CO-; -CH2-NH-C-]; 8.7[d, 1H, CH-NH-C-]; 11.3-11.5[2s, 2H, -NHBOC].
LSIMS (脂質 3): m/z: 679.8 [MH+] (C39H83ON8に対して計算, 36%).
N,N-ジ-ステアロイル-N-メチル-N-2[N'-(N6グアニジノ-L-リジニル)]アミノエチルアンモニウムクロリド(脂質1, DSGLA), (Rf = 0.6, ジクロロメタン中10 %メタノール, v/v:)の直近の前駆体の1H NMR (300 MHz, CDCl3)
1H NMR (200 MHz, CDCl3): δ/ppm =0.9 [t, 6H, CH 3-(CH2) 13-]; 1.2-1.4 [m, 60H, -(CH 2)13-]; 1.3-1.6 [m, 4 H, LysCγ H 2+ LysCδ H 2]; 1.4-1.6 [3s, 27H, CO-O-C(CH 3)3]; 1.5 [m, 4H, -N+(-CH2-CH 2-)2 ]; 1.7 [m, 2H, LysCβ H 2]; 3.2[s, 3H, -N+-CH3]; 3.3 [t, 6H, -N(-CH 2-CH2-)2 ; LysωCH 2]; 3.7 [m, 4H, -N+-CH 2-CH 2- NH-CO]; 4.1[m,1H, LysCα H]; 5.2[m, 1H, BOC -NH]; 8.1-8.3 [2t, 2H, -CH2-NH-CO-; -CH2-NH-C-]; 11.45[s, 1H, -NHBOC].
LSIMS (脂質 1): m/z: 749.8 [MH+] (C46H97ON6に対して計算, 47%).
モノアルギニル化カチオン性脂質DSAAの合成
ステップ（ａ）：N-[2-tert-ブチルオキシカルボニルアミノエチル]-N,N-ジ-n-オクタデシルアミン：０．６ｇ（4.13mmol）のN-Boc-エチレンジアミン（Ｉ）及び４．１２７ｇ（12.39mmol）の臭化オクタデシルの混合物をEtoAc中で、無水炭酸カリウム（2.2g;16.52mmol）存在下に、２４時間、還流した。反応混合物を１００ｍＬ酢酸エチルで稀釈し、水（2x100mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム存在下に乾燥し、及び濾過した。回転蒸発器を用いて、濾液から酢酸エチルを除いた。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製（溶出液として、ヘキサン中１０％酢酸エチル、ｖ／ｖ）により、１．７８ｇ（淡黄色固体、６５％収量）の標題化合物（ＴＬＣ展開液：ヘキサン中３０％酢酸エチル、ｖ／ｖ；Ｒｆ＝０．４）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCI3): δ/ ppm=0.9 [t, 6H, CH3- (CH2)16-]; 1.2-1.4 [m, 64H, -(CH2)16-CH3]; 1.5 [s, 9H, -OCO- C(CH3)3]; 2.4 [t, 4H, -N(CH2-(CH2-)16]; 2.5 [t, 2H, - N(CH2-CH2-NHBoc); 3.1 [m, 2H, N(CH2-CH2-NHBoc)]; 4.9 [bm, 1H, NHBoc].
ステップ（ｂ）：N-2-アミノエチル-N,N-ジ-n-オクタデシルアミン：上記で得た産物（1.7g、2,85mmol）を１０ｍＬ無水ジクロロメタン（DCM）に溶かし、４ｍＬの純トリフルオロ酢酸（TFA）を加えた。反応混合物を室温で一晩攪拌した。TFAを窒素のフラッシュにより除き、残渣を真空下に１５分間置いた。得られた標題化合物のトリフルオロ酢酸塩を、２５ｍＬDCMに溶かし、及び２５ｍＬの1N NaOH水溶液を加えた。得られた二相性の混合物を室温で、２時間、攪拌した。有機層を水で洗浄し（3x50mL）、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、濾過液から溶媒を回転蒸発器により蒸発させた。残渣のカラムクロマトグラフィーによる精製（溶出液：クロロホルム中２−３％メタノール、ｖ／ｖ）により、１．０６８ｇの標題化合物を得た（７４％収率；TLC展開液：１０％メタノールを含有するクロロホルム、ｖ／ｖ；Ｒｆ＝０．４）。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ/ ppm=0.9[t, 6H, CH3- (CH2)15-]; 1.2-1.4 [m,60-(CH2)15-]; 1.5 [m, 4H, N(-CH2- CH2-)2]; 2.5 [m, 4H, N(CH2-CH2-)2]; 2.6 [t, 2H, -N(CH2- CH2-NH2)]; 2.9 [t, 2H, -N(CH2-CH2-NH2)]; 3.5-3.7 [bm, 2H, NH2]。
ステップ（ｃ）：トリ-Boc-アルギニン(N,N-ジ-n-オクタデシルアミン) エチルアミド：１０ｍＬ乾燥DCM及び５ｍＬ乾燥DMFの混合液に溶かした、 N-2-アミノエチル-N,N-ジ-n-オクタデシルアミン (1.05 g; 1.94 mmol), N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N′-エチルカルボジイミド 塩化水素 (0.372 g; 1.94 mmol), N-ヒドロキシスクシニミド (0.223 g; 1.9 mmol) 及び トリ-Boc-アルギニン(0.92g, 1.944 mmol)の混合物を１６時間攪拌した。全部で、５０ｍＬのDCMを反応混合物に加え、混合物を水で洗浄し（３ｘ１００ｍＬ）、及び無水硫酸ナトリウムで乾燥した。残渣のシリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製（溶出液：ヘキサン中１０％アセトン、ｖ／ｖ）により、１．１７ｇの純粋カップル産物を得た（収率＝６２％、Ｒｆ＝０．５、TLC展開液：ヘキサン中４０％アセトン、ｖ／ｖ）。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ/ppm=0.9[t, 6H, CH3- (CH2)16-]; 1.2-1.3 [m, 64H, CH3-(CH2)16]; 1.4-1.6 [2s, 27H, -CO-O-(CH3)3, ]; 1.6-1.8 [m,4H, CH2-CH2- Arg] 2.4-2.5 [m, 6H, -N-CH2-(CH2)16-CH3; -NCH2- CH2-NH-CO-]; 3.2-3.3 [2 dd, 2H, -CH2-CH2-NH-CO- ]; 3.9 [m, 2H, Arg CH2-N]; 4.2 [m, 1H, -CH (NHBoc)-CO-]; 5.7 [m, 3H, -NH-CO-O-(CH3)3]。
ステップ（ｄ）：Tri-Boc-アルギニン(N,N-ジ-n-オクタデシルアミン,Ｎ-メチル)エチルアミド：ステップ（c）で得た、化合物IV（1.1g、1.0772mmol）を５ｍＬDCMに溶かし、及び３ｍＬヨウ化メチルを加えた。溶液を一晩攪拌した。回転蒸発器により、溶媒を除き、及び残渣のシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：２％メタノールを含むクロロホルム、ｖ／ｖ）により、０．９６４ｇの標題化合物を得た（８９％収率）。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ/ ppm = 0.9 [t, 6H, CH3- (CH2)16 ]; 1.2-1.3 [m, 64H, CH3-(CH2)16-]; 1.4-1.6 [2s, 27H, CO-O-C(CH3)3]; 1.6-1.8 [m, 8H, -CH2-CH2-N+-, -CH2-CH2- Arg]; 3.9 [2H, Arg CH2-N]; 3.2 [S, 3H, CH3-N+-]; 3.4 [m, 4H,-N+-CH2-(CH2)16-CH3];3.6-3.7 [bm, 4H, -N+-CH2- CH2-NHCO-];4.19[m,1H, -CH(NHBoc)CO-]; 5.7 [s, 3H, - NH-CO-O-(CH3)3]。
ステップ（ｅ）：L- アルギニン(N,N-ジ-n-オクタデシルアミン, N-メチル)エチルアミド (DASS)：ステップ（ｄ）で得た化合物Ｖ（0.9g、0.868mmol）を５ｍＬのジオキサン中の3N HClに溶かし、この溶液を１２時間攪拌した。溶媒を窒素フラッシュで除き、残渣を真空中に更に１時間置いた。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：１２％メタノノールの溶けたクロロホルム、ｖ／ｖ）、その後乾燥した残渣の塩素イオン−交換クロマトグラフィー（Amberlyst-A26塩素イオン−交換樹脂）により、４５０ｍｇの精製した標題化合物を得た（７１％収率）。
1H NMR (CD3OD, 300 MHz): δ/ ppm = 0.9 [s, 6H, CH3- (CH2)15-]; 1.2-1.3 [m, 60H, CH3-(CH2)15-]; 1.6-1.7 [m, 4H, CH3-(CH2)15-CH2-CH2-N+-]; 3.4-3.7 [2 m, 6H, Arg]; 3.1 [S, 3H, CH3-N+-CH2-CH2-]; 3.2-3.4 [m, 8H, (CH3-(CH2)16-CH2)2-N+(CH3)-CH2-CH2-NHCO- ]; 3.9 [t, 1H, -CH(NH3 +)CO-]。
リポソームの調製
１：１分子比のカチオン性脂質及び共脂質（コレステロール又はDOPE）をガラスバイアル中のクロロホルム及びメタノール（３：１，ｖ／ｖ）の混合物に溶かした。溶媒を、乾燥した窒素気体の希薄な流れの中で除き、及び乾燥脂質フィルムを高真空の下で、８時間置いた。滅菌した脱イオン水（５ｍＬ）を真空乾燥脂質フィルムに加えて、この混合物を一晩膨張させた。その後、バイアルを室温で２〜３分ボルテックスし、及び、時折、浴槽型音波処理器中で、音波処理して、多層小胞を得た（MLV）。その後、MLVを氷槽中で透明になるまで、Branson４５０超音波装置を用いて、１００％衝撃周波及び２５Ｗ外出力で音波処理した。得られた透明感のある水溶性リポソームをLPDナノ粒子を作成するために用いた。
トランスフェクション
H460ヒト大細胞肺癌細胞をトランスフェクションの１８〜２４時間前に、９６ウェルプレートにウェル当たり２０，０００細胞の密度で蒔種した。プラスミドDNA（０．３μｇ）を、手を加えてないRPMI培地（全量１００μＬ）中で、様々な量の脂質（０．９〜７．２ｎｍｏｌ）と、２０分間複合化させた。分量比はこれらの脂質の範囲で、１：１から８：１（＋／−）と変化した。その後、この複合体を細胞に加えた。３時間のインキュベーション後、２０％FBSを含む１００μＬのRPMIを細胞に加えた。レポーター遺伝子活性を２４時間後に見積もった。細胞を２回リン酸緩衝食塩水（PBS、各１００μＬ）で洗浄し、１００μＬの溶解緩衝液（0.1 M Tris-HCl, 2mM EDTA, 0.5% Triton X100, pH 7.8）で、溶解した。完全な溶解を確認する必要がある。細胞溶解液を５分間、１４，０００rpmで遠心した。上清の１０μＬ部分をルシフェラーゼ検定のために取り上げた。細胞溶解液中のタンパク質濃度を、Pierce Chemical Company (Rockford, IL)から提供されるMicro BSATM タンパク質検定キットからBSAを標準として定量した。各検定に対するルシフェラーゼ活性を、可溶性タンパク質μｇ当たりの相対的ルシフェラーゼ発光単位として表わす（RLU／μｇタンパク質）（図４）。トランスフェクション実験を３回反復し、図４に示したトランスフェクション効率は同日に行った、３回反復実験の平均である。各トランスフェクション実験を３回反復した。異なる日に行った、トランスフェクションの性質は同一であった。
PEG化LPD組成物の調製
脂質／ポリカチオン／DNA（LPD）ナノ粒子を、前述したものを僅かに、改変して調製したた（Cui 他 (2005) Mol. Pharm. 2:22-28）。簡単に、DOTAP（又はDSGLA）及びコレステロール（１：１モル比）を含む小さな単層のリポソームを、薄膜フィルムの水和、その後の膜押し出しにより調製した。リポソームの全脂質濃度は、１０ｍＭと固定した。LPDは、DOTAP（又は、DSGLA）／コレステロールリポソーム、プロタミン、及びオリゴヌクレオチド及び仔牛胸腺DNA（１：１重量比）の混合物から構成される。LPDの調整のために、６μＬのプロタミン（２ｍｇ／ｍＬ）、４７μＬの脱イオン水及び８μＬのDOTAP（又は、DSGLA）／コレステロールリポソーム（全脂質濃度＝１０ｍＭ）を混合した。LPDナノ粒子を、更なる応用前に、更に１０分間、室温に置いた。PEG化LPD組成物を、後挿入法で調製した（Ishida 他(1999) FEBS Lett. 460:129-133; Perouzel 他(2003) Bioconjug. Chem. 14:884-898）。簡単に、１００μＬの予備作製したLPDを０．６３〜１６μＬのDSPE-PEG又はDSPE-PEG-AA（２０ｍｇ／ｍＬ）と混合し、その後１０分間、５０〜６０℃でインキュベートした。得られた組成物を、使用前に、室温まで冷却した。粒子を、１．５ｍＬチューブ中で、オリゴヌクレオチド及び仔牛胸腺DNA（２ｍｇ／ｍＬ）と混合した。この複合体を室温で１０分間放置し、その後Coulter N4 Plus 粒子計測器 (Beckman Coulter, San Francisco, CA)を用いて、LPD及びPEG化LPDを測定した。粒子サイズを平均値±標準偏差で報告した。
細胞増殖阻害研究
H460細胞（ウェル当たり１ｘ１０４）を、１２ウェルプレートに蒔種した。細胞を３７℃、７２時間、血清を含む培地中で、異なる濃度の、異なる脂質で処理した。その後、細胞生存率をMTT検定により測定した。簡単に、１００μＬのMTT溶液（５０ｍＬのPBS中に１５ｍｇ）を各ウェルに加え、細胞を３７℃で、４時間インキュベートした。培地を除き、細胞内に形成したホルマザン結晶をDMSOに溶かした。５７０ｎｍでの吸収をUltramark Microplate Imaging Systemで測定した。データを無処理の対照細胞と比べた生存細胞の割合（％）で表した。
化学感受性増強作用研究
H460細胞（ウェル当たり１ｘ１０４）を、１２ウェルプレートに蒔種した。細胞を、３７℃で、１０μＭの異なる脂質及び異なる濃度のシスプラチン（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）と、血清を含む培地中で、インキュベートした。細胞生存率を４８時間後MTT検定で測定した。
細胞取り込み研究
H460細胞（ウェル当たり１ｘ１０５）を、実験１２時間前に、１２ウェルプレート（Corning Inc., Corning, NY）に蒔種した。細胞を、血清を含む培地中で、５'FAM標識siRNAに対して１００ｎＭの濃度で、３７℃、４時間、異なる組成物で処理した。細胞を２回PBSで洗い、室温で、１時間、溶解緩衝液（PBS中０．３％TritonX-100）と共にインキュベートした。細胞溶解液のケイ光強度をPerkin-Elmer LS 50Bケイ光スペクトロメーター(Norwalk, CT) (λex, 494 nm; λem, 519 nm)で測定した。
Annexin V及びヨウ化プロピジウム（PI）染色及び定量
H460細胞（ウェル当たり５ｘ１０４）を、６ウェルプレートに蒔種した。細胞を、血清を含む培地中で、siRNAに対して５００ｎＭの濃度で、３７℃、７２時間、異なる組成物で処理した。細胞を１回PBSで洗浄し、トリプシン処理し、PBSに１ｘ１０６細胞／ｍＬの濃度に懸濁した。その後、細胞を、キット（BD Biosciences Pharmingen, San Jose, CA）を用いて、Annexin V-FITCと、及び１．２５μｇ／ｍＬ PIで染色した。AnnexinV-FITC及びPIで染色した細胞をフローサイトメトリー（(Becton-Dickinson, Heidelberg, Germany)で検出し、定量した。結果をCellquest ソフトウェア(Becton-Dickinson)を用いて処理した。
TUNEL染色によるアポトーシスの検定
TUNEL検定をTACSTM TdT Kit (R&D Systems, Minneapolis, MN)を用いて行った。H460細胞（ウェル当たり５ｘ１０４）を、２４ウェルプレートに蒔種した。細胞を、血清を含む培地中で、siRNAに対して５００ｎＭの濃度で、３７℃、７２時間、異なる組成物で処理した。細胞を１度PBSで洗浄し、室温で３０分間、４％緩衝作用のあるパラホルムアルデヒド−PBS（ｐＨ７．４）で固定した。内因性ペルオキシダーゼを、室温１５分間、０．３％Ｈ２Ｏ２メタノールで不活性化した。その後、プレートをPBSですすぎ、及び透過化緩衝液で処理後、末端デオキシヌクレオチジル トランスフェラーゼを含む標識緩衝液及びフルオレセインイソチオシアナート−デオキシウリジン５−３リン酸をプレートに加えた。プレートを３７℃、６０分間、加湿条件下でインキュベートした。反応を停止液により終結させ、製造者の指針に基づきDABで発色させた。Nikon Microphot SA 顕微鏡を用いて、試料を画像化した。
Western ブロット解析
細胞を氷上で、２０分間、溶解緩衝液を用いて溶解させ、溶解抽出物を遠心により回収した。抽出物を１０％アクリルアミドゲルで分離し、PVDF膜に移行させた。膜を１時間５％スキムミルクでブロックし、更に１時間、pERK（Santa Cruz Biotechnology, Inc.）に対するモノクローナル抗体、又はEGFR（BD Transduction Labs）に対するポリクローナル抗体とインキュベートした。膜をまた、標準化のために、ERK2及びアクチン（Santa Cruz Biotechnology, Inc.）を認識する抗体とインキュベートした。膜をPBST（PBS, 0.1% Tween-20）で洗浄し、その後１時間、適切な２次抗体とインキュベートした。その後、膜を再び洗浄し、製造者の指針（PerkinElmer）に従い増感した化学発光システムにより発色させた。
免疫ケイ光顕微鏡
H460細胞を洗い、メタノール／アセトン（１：１）で固定し、及びTriton X100（１％）で、透過化させた。細胞を抗アポトーシス誘導因子（AIF）ウサギポリクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc.）（１：１００）と１時間インキュベートした。PBSで洗浄後、ケイ光標識した２次抗体を加え、１時間インキュベートした。核をDAPIを含むVectashield(R)マウント溶液（Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA）で、対比染色を行った。
統計解析
ステューデントｔ検定を用いて全ての統計解析を行った。ｐ値が０．０５以下の時、データは統計的に有意と考えた。
実施例１ 新規脂質１〜３の設計及び合成
脂質１＆２を、適切な３級−１級混合アミン中間体のDCCカップリングにより合成した（図２）が、この混合アミン中間体の調製のために、従来の方法により、酢酸エチル中で、無水炭酸カリウム存在下に、対応するN,N-ジ-n-アルキルアミンを ２−ブロモエチルアミンで保護されたN-tert-ブチルオキシカルボニルと反応させ、その後、 N?, -tert-ブチルオキシカルボニル- N?-ベンジルオキシカルボニル-L-リジン、及び N?-ベンジルオキシカルボニル- N?, -tert-ブチルオキシカルボニル-L-リジン誘導体それぞれによる、脱保護基及び中和を行い、その後、ギ酸アンモニウム及び１０％Pd-Cによるベンジルオキシカルボニル脱保護基反応を行った。
脂質３を同一の３級−１級混合アミン中間体とNα, Nε-ジ-tert-ブチルオキシカルボニル- L-リジン誘導体とのDCCカップリング反応により合成し、その後トリフルオロ酢酸とのtert-ブチルオキシカルボニル脱保護基反応を行い、中和した。得られた脂質の中間体アミン類を、個別に所望量のN,N-ジ-tert-ブチルオキシカルボニルチオウレアと反応させた（図２）が、後者は、無水テトラヒドロフラン中の２当量の水酸化ナトリウム（Iwanowicz 他 (1993) Synth. Commun. 23:1443-1445）、塩化水銀、無水N,N-ジメチルホルムアミド/ジクロロメタン中のトリエチルアミン、存在下で、０℃、窒素気流中で、チオウレアと、２当量のBOC無水物とを反応させて、その後通常の工程で、調製した。得られた３級アミン中間体は（図２）は、過剰量のヨウ化メチルとの４級アンモニウム化後、酸脱保護基反応、塩素イオン交換クロマトグラフィーにより、脂質１，２及び３を得た（図２）。図２に示した全ての合成中間体の構造を、1H NMRにより確認した。しかしながら、最終脂質（１〜３）のヘッドグループ領域に非常に交換性の高いプロトン化した１級アミン官能基が存在するために、1H NMRスペクトルのピークにひどい線幅拡大（特にδ３〜５ppmの領域）が起こる。従って、最終脂質は、LSIMSの分子イオンピークにより特徴付けた。代表的脂質、脂質２及び全てのその中間体（図２）の合成及びスペクトルの特徴付けを材料と方法項に記載した。脂質１及び３は、脂質２の合成に用いたプロトコールと実質的に同じプロトコールに従って合成した。
実施例２ 脂質１〜３によるIn vitro遺伝子輸送
図４は、仔牛胎児血清存在下に、H460細胞のトランスフェクションにおける、脂質１〜３のin vtro遺伝子輸送効率の要約である。これらのin vitroトランスフェクション実験において、脂質１〜３のカチオン性リポソームは、共脂質として当量のコレステロールの組合せで調製し、及び様々な脂質／DNA分量比８：１から１：１で、pCMV-LucプラスミドDNAをレポーター遺伝子として用いた。脂質１（Ｎ６位置にグアニジン基）及び脂質３（Ｎ６及びＮ２位置に２個のグアニジン基）のトランスフェクション効率は、DOTAP及びLipofectamine 2000の値に匹敵する（図４）。Ｎ２位置にグアニジン基を持つ脂質２のトランスフェクション効率は、H460細胞において、低分量比で、厳しく低くなる。興味あることに、コレステロールは、1,2-ジオレイルsn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)より効率がよいことが分かった（データ非表示）。これらの実施例は脂質の遺伝子輸送活性を示す。
実施例３ 脂質１〜３は細胞毒性活性を示す
上記脂質がトランスフェクション実験において細胞毒性活性を示すことが分かったので、より詳しく研究した。
これら３種の新規脂質の様々な濃度における細胞毒性効果を、MTT検定を用いて、４８時間、脂質１〜３及びDOTAPで処理したH460細胞において検定した（図５Ａ）。DOTAPは、調べた濃度において、殆ど細胞毒性を示さなかったが、脂質１〜３はより毒性を示した。図５Ａから、脂質１及び３のED50は、H460細胞株において、約１６μＭであり、他方、脂質２のED50は約２２μＭである。BL6細胞株においてこれらの脂質の細胞毒性を検査したところ、H460細胞の場合と同様のED50値を得た（データ非表示）。全体として、細胞毒性は、対応する脂質２０μＭ濃度において、脂質１＞脂質３＞脂質２＞DOTAPの順に小さい。
シスプラチンのような抗癌剤に対する、これらの脂質の化学感受性増強能を検定するために、H460細胞をこれらの物質で、単独又はシスプラチンと組み合わせて、４８時間処理した。図５Ｂに示すように、脂質１〜３（１０μＭ）は細胞のシスプラチンに対して感受性を補強したが、DOTAP（１０μＭ）はそうではなかった。シスプラチンのIC50は、脂質１〜３処理の後、約１２μＭから３．５μＭに減少した。
これらの結果は、これら新規脂質１〜３の細胞毒性を証明する。
実施例４ 脂質１〜３は、ERK1/2活性化を阻害する
脂質が示す細胞毒性の亢進の原因メカニズムを探るために、H460細胞を、異なる時間間隔で、脂質１〜３による処理を行い、Western ブロット解析によりERK1/2リン酸化を測定した。ERK1/2リン酸化はMAPキナーゼ活性の活性化を導く(McCubrey 他(2007) Biochim. Biophys. Acta 1773:1263-1284)。
図５Ｃに示すように、１μＭの脂質１〜３の単独処理は、ERK1/2活性化を減少させることができた。全ERK1/2発現は、全ての条件で妨害されなかった。しかしながら、我々の以前の知見（Yan 他(2007) Mol. Immunol. 44:3672-3681）と一致して、低濃度（１μＭ）でDOTAPは、樹状細胞においてERK1/2活性化を増した。これらの観察から、脂質１〜３によるMEK/ERKシグナル経路の遮断が、（i）細胞毒性効果において、及び（ii）シスプラチン処理と組み合わせた時の細胞死の相乗的誘導において、重要な機能的役割を果たすことができることが示唆される。
血清との高い相性のために、脂質１の類似体であるDSGLA（Ｒ１及びＲ２の両者＝Ｃ１８Ｈ３７）をさらなる処方研究のために用いた。
PI染色によるフローサイトメトリーは、１０μＭ DSGLA及び脂質１と３時間処理したH460細胞のアポトーシスの割合は、それぞれ、7.9±2.5 % 及び 10.4±3.0 % （n=6, p=0.13）であり、及びDOTAP処理の場合（4.7±0.5 %）（n=3, p<0.05）よりも有意に高かった。DSGLA及び脂質１の細胞毒性間では、統計的に有意な差異が無かった（データ非表示）。更に、DSGLA単独では、ERK1/2活性化を減少させることができた（図５Ｃ）。
実施例５ DSGLA-を含むリポソームは効率よくsiRNAを腫瘍細胞に輸送する
癌遺伝子療法における標的輸送を行うために、siRNA輸送のためのナノ担体として、我々の実験室で開発した非ウィルスベクターである、LPD（Li and Huang (2006) Mol. Pharm. 3:579-588）を用いた。血清安定性を増すために、LPD処方物にPEG化脂質を後挿入した。更に、向標的リガンド（Banerjee 他(2004) Int. J. Cancer 112:693-700）としてPEGの先端部に、シグマ受容体に特異的に結合する化合物である、アニサミドを繋いだ。
図６Ａに示すように、ケイ光標識siRNAの取り込みは、シグマ受容体を発現するH460細胞において、DSGLAで調製した処方物で処理した場合に、DOTAPで調製した処方物で処理した場合よりずっと高かった。更に、LPD-PEG-AA処理した細胞におけるケイ光シグナルは、LPD-PEG処理した細胞におけるシグナルよりずっと強かった。
定量的に、DSGLA を含むLPD-PEG-AAによるケイ光標識siRNAの取り込みは、DOTAP を含むLPD-PEG-AAによる取り込みより、約２倍高かった（図６Ｂ）。図６Ｂはまた、リガンド接合は、DSGLAで調製したPEG化LPDは、輸送効率を５倍高めたことを示す。
従って、これらの結果により、新規DSGLAで調製したLPD-PEG-AAは、siRNAを腫瘍細胞に効率よく輸送することができて、及びこの輸送がリガンド依存性であることが分かる。
実施例６ DSGLAはアポトーシスを誘導する
カチオン性脂質の細胞毒性が、siRNA非依存的であり、及び向標的リガンドに高く依存的であることを示すために、LPD-PEG-AAにおいて、DSGLAを（無関係な標的に対する）対照siRNAと共に処方した。これらの結果を、更にDOTAPを含むLPD-PEG-AAにおいて処方した同一対照siRNAと比較した。フローサイトメトリーを用いて、ヨウ化プロピジウム（PI）の取り込み、及びFITC標識Annexin-Ｖとアポトーシスを起こした細胞との結合を分析した。
図６Ｃに示すように、細胞をDSGLA を含むLPD-PEG-AAと処理した時、PI陽性細胞の割合は増加し、このことは、細胞は誘導されてアポトーシスを起こしたことを示唆する。
更に、細胞をDSGLA を含むLPD-PEG-AAと処理した時、またFITC-Annexin-Ｖシグナルの増加を観察した（図６Ｄ）。細胞を、DSGLAを含むLPD-PEG、又はDOTAPを含むLPD-PEG-AAと処理した時、そのような増加はなかった。DOTAPを含むLPD-PEG-AA又はLPD-PEGのいずれかと処理をした細胞は、FITC-Annexin-Ｖの僅かな増加を示した（図６Ｄ）。これらの結果は明らかに、DSGLAを含む処方物は、DOTAPを含む処方物より、より効率よくアポトーシスを増強することができること、及び誘導された細胞毒性は、リガンド依存的であることを示す。
実施例７ DSGLA LPD組成物によるH460細胞におけるEGFR発現の阻害
ナノ粒子処方物の生物活性を更に示すために、EGFRに対するsiRNAを、DSGLA又はDOTAPを含むLPD組成物により輸送した。得られたEGFRレベルへの効果を、Western ブロットにより測定した。AA向標的リガンド存在下又は非存在下で、異なる組成物を比較した。遊離した抗EGFR siRNAは、この負荷電のオリゴヌクレオチドの細胞への取り込みが低いので、殆ど効果がなかった（データ非表示）。DSGLA又はDOTAPと共に調製した抗EGFR siRNAを含むLPD-PEG-AAで、H460細胞を処理した。７２時間後、EGFRタンパク質発現は顕著に阻害された（図７）。DSGLA又はDOTAPのいずれかを伴うLPD-PEG-AA組成物は、H460細胞におけるEGFR発現を低下させる上で同等に有効であった。しかしながら、DSGLA又はDOTAPのいずれかと共に調製した抗EGFR siRNAを含むLPD-PEG（AAなし）は、僅かにEGFRを抑制することができた。このデータは、siRNAは有効にEGFR発現を抑制することができること、及びサイレンサー活性は処方物依存的であることを示す。
実施例８ DSGLA及び抗EGFR siRNAを含むLPDによる相乗的アポトーシス誘導
DSGLA及び抗EGFR siRNAの組合せの細胞毒性効果を更に研究した。EGFRの欠乏は腫瘍細胞死を促進することができるかどうか測定するために、抗EGFR siRNA又は対照siRNAのいずれかの処方物と処理後７２時間でTUNEL検定を行った。図８Ａは， DSGLAと共に調製した抗EGFR siRNAを含むLPD-PEG-AA処理したH460細胞の約１５±３％がアポトーシスすることを示す。（i）DSGLAと共に調製した抗EGFR siRNAを含むLPD-PEG（AAなし）、（ii）DOTAPと共に調製した抗EGFR siRNAを含むLPD-PEG-AA、又は（iii）DSGLAと共に調製した対照 siRNAを含むLPD-PEG-AA、で処理した細胞に比べて、この値は高かった（図８Ａ）。また、対照siRNA-及び抗EGFR siRNAを含むLPD-PEGにおけるアポトーシスの割合１％以下と比べて（データ非表示）、DOTAPと共に調製した抗EGFR siRNAを含むLPD-PEG-AAと処理したH460細胞の約４±１％がアポトーシスしたことが観察された（図８Ａ）。従って、siRNAが媒介する細胞毒性効果は、配列特異的であり、及び標的ナノ粒子ベクターによる有効な輸送に依存的である。更に、対照siRNA LPD-PEGにおける１％以下のアポトーシスと比較して、DSGLAと共に調製した対照siRNAを含むLPD-PEG-AAと処理したH460細胞の約２．５％がアポトーシスを受けた（図８Ａ）。このデータにより、DSGLAの細胞毒性は、siRNA非依存的であるが、リガンド依存的であり、図６Ｃ及び図６Ｄに示したデータと辻褄が合う。従って、細胞アポトーシスを促進する上での、EGFRに対するsiRNA及びDSGLA（但しDOTAPではない）の間の相乗的効果が観察され、及び相乗性はリガンド依存的であった。
チトクロムｃ及びアポトーシス誘導因子（AIF）の再分布は、アポトーシスプロセスの初期事象である（Daugas 他 (2000) FASEB J. 14:729-739; Fehlberg 他 (2003) Br. J. Pharmacol. 139:495-500）。抗EGFR siRNA 及びDSGLAの組合せによるH460細胞の細胞毒性促進を更に評価するために、免疫ケイ光顕微鏡でアポトーシス誘導因子（AIF）の関与を調べた（図８Ｂ）。無処理対照細胞におけるAIFの免疫ケイ光検出は、普通、ミトコンドリア局在に対する一般的パターンである（Lorenzo et al. (1999) Cell Death Differ. 6:516-524; Loeffler et al. (2001) FASEB J. 15:758-767; Modjtahedi et al. (2006) Trends Cell Biol. 16:264-272）核周辺領域への僅かな選択性を伴う小班点の細胞質染色パターンをもたらす。DSGLAと共に調製した抗EGFR siRNAを含むLPD-PEG-AAと処理した細胞は、細胞質から核へのAIFの移行の増加を示す（図８Ｂ）．他の処理群では、顕著な移行は観察されなかった。この結果は、抗EGFR siRNA及びDSGLAはH460細胞の細胞死を相乗的に促進すること、及びこの相乗効果はリガンド依存的であることを示す。
実施例９ モノアルギニル化カチオン性脂質DSAAの合成
DSAA、モノアルギニル化カチオン性脂質、を従来のEDCI (N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N′-エチルカルボジイミド 塩酸塩)-カップリング方法を用いて、１級−３級アミン（III）及びBoc-保護アルギニンを混合して合成した。カップリング産物のヨウ化メチルによる４級化及びBod脱保護基によりDSAA(VI)を産出した。混合３級−１級アミンIIIの調製は、無水炭酸カリウム存在下、酢酸エチル（EtoAc）中で、N-Boc-エチレンジアミンとオクタデシルブロミドを反応させ、その後脱保護基及び得られた中間体IIの中和によった。DSAA合成の図解による表示を図３に示す。
実施例１０ DSAAと共に処方されたLPDで輸送されたsi RNAの細胞内への取り込み
血清安定性を増すために、siRNA輸送のためのナノ担体として著者等の実験室で開発した非ウィルス性ベクターである、LPD処方物に著者等はPEG化脂質を後挿入した。更に、著者等は、シグマ受容体に特異的に結合する化合物であるアニサミドを、向標的リガンドとしてPEGの先端に繋げた。図９に示すように、シグマ受容体を発現するB16F10メラノーマ細胞において、ケイ光標識siRNAの取り込みは、DSAA又はDSGLAと共に調製した処方物で処理した場合では、DOTAPと共に調製した処方物処理した場合よりずっと大きかった。更に、LPD-PEG-AAで処理した細胞において、ケイ光シグナルはLPD-PEG処理した細胞の場合よりずっと強かった。
実施例１１ in vitroルシフェラーゼ遺伝子サイレンサー効果
異なる組成物において、siRNAによる遺伝子サイレンサー効果を調べた。図１０に示すように、（ルシフェラーゼを安定的に発現する）B16F10細胞において、DOTAPと共に調製した処方物処理した場合（DSGLAと共に作成した場合においてさえ）に比べて、DSAAと共に調製した処方物処理した場合に、抗ルシフェラーゼsiRNAのサイレンサー効果はより大きかった。更に、LPD-PEG処理した細胞の場合より、LPD-PEG-AAで処理した細胞において、サイレンサー効果はずっと強かった。
明細書で引用した全ての刊行物及び特許公報は、本発明が関係する当業者の技術レベルを示す。あたかも個々の刊行物及び特許公報を特異的に及び個別的に引例に取り込んだことを示す限り、全ての刊行物及び特許公報を、本明細書の引例に取り込んだ。
前述した発明を、理解を明白にする目的で説明及び実例の手段として、幾らか詳しく記載したが、ある種の変更及び改変は、本発明の請求の範囲の範囲内で行われることは明らかであろう。

Claims (69)

  1. 下記化学式（Ｉ）で表されるカチオン性脂質、又はその医薬的に許容された塩。
    Figure 2011520962
     式中、ｍ及びｎは、それぞれ独立して、１〜８の整数を表し、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、−（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ３（式中、ｐは８〜２４の整数を表す。）を表し、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基及び置換アルキル基から成る群から選択され、Ｑ１及びＱ２は、
    Figure 2011520962
     から成る群から選択され、但し、少なくともＱ１及びＱ２のいずれかは
    Figure 2011520962
     である。
  2. ｍが２であり、ｎが４であり、ｐが１３であり、Ｒ３及びＲ４が各々メチル基であり、かつ前記化学式（Ｉ）で表されるカチオン性脂質が
    Figure 2011520962
    Figure 2011520962
     及び
    Figure 2011520962
     から成る群から選択される請求項１に記載のカチオン性脂質。
  3. ｍが２であり、ｎが３であり、ｐが１７であり、Ｒ３が水素原子であり、Ｒ４がメチル基であり、Ｑ１及びＱ２が
    Figure 2011520962
     であり、かつ前記化学式（Ｉ）で表されるカチオン性脂質が下記化学構造
    Figure 2011520962
     を有する請求項１に記載のカチオン性脂質。
  4. ｍが２であり、ｎが４であり、ｐが１７であり、Ｒ３及びＲ４がそれぞれメチル基であり、Ｑ１及びＱ２が
    Figure 2011520962
     であり、かつ前記化学式（Ｉ）で表されるカチオン性脂質が下記化学構造
    Figure 2011520962
     を有する請求項１に記載のカチオン性脂質。
  5. 前記カチオン性脂質が細胞毒性活性を有する請求項１〜４のいずれか一項に記載のカチオン性脂質。
  6. 請求項５に記載のカチオン性脂質及び医薬的に許容された担体から成る医薬組成物。
  7. 脂質媒体及び生物活性化合物から成る輸送システムであって、該脂質媒体が該生物活性化合物を包み込み、該脂質媒体が請求項１〜５のいずれか一項に記載のカチオン性脂質から成る輸送システム。
  8. 前記脂質媒体が共脂質（co-lipid）を含む請求項７に記載の輸送システム。
  9. 前記共脂質がコレステロール又はジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（DOPE）から成る請求項８に記載の輸送システム。
  10. 前記脂質媒体がリポソームから成る請求項７に記載の輸送システム。
  11. 前記リポソームがカチオン性リポソームから成る請求項１０に記載の輸送システム。
  12. 更に、更にポリカチオンを含む請求項７〜１１のいずれか一項に記載の輸送システムであって、前記脂質媒体が該ポリカチオンを包み込む輸送システム。
  13. 前記ポリカチオンがポリカチオン性ポリペプチドから成る請求項１２に記載の輸送システム。
  14. 前記ポリカチオン性ポリペプチドがプロタミンから成る請求項１３に記載の輸送システム。
  15. 前記生物活性化合物が細胞毒性生物活性化合物から成る請求項７〜１４のいずれか一項に記載の輸送システム。
  16. 前記生物活性化合物がポリヌクレオチドから成る請求項７〜１４のいずれか一項に記載の輸送システム。
  17. 前記ポリヌクレオチドがサイレンサー配列を含み、このサイレンサー配列の細胞内での発現又は細胞内への導入が、標的ポリヌクレオチド又はそれにコード化されたポリペプチドの発現を減少させる請求項１６に記載の輸送システム。
  18. 前記サイレンサー配列が干渉ＲＮＡから成る請求項１７に記載の輸送システム。
  19. 前記干渉ＲＮＡがｓｉＲＮＡから成る請求項１８に記載の輸送システム。
  20. 前記標的ポリヌクレオチドが腫瘍遺伝子を含む請求項１７に記載の輸送システム。
  21. 前記腫瘍遺伝子が表皮成長因子受容体を含む請求項２０に記載の輸送システム。
  22. 前記ポリヌクレオチドが興味の対象となるポリペプチドのコード配列を含む請求項１６に記載の輸送システム。
  23. 前記興味の対象となるポリペプチドが腫瘍抑制因子を含む請求項２２に記載の輸送システム。
  24. 更にポリアニオン性担体巨大分子を含む請求項７〜２３のいずれか一項に記載の輸送システムであって、該ポリアニオン性担体巨大分子が前記脂質媒体に包み込まれる輸送システム。
  25. 前記ポリアニオン性担体巨大分子が担体ポリヌクレオチドから成る請求項２４に記載の輸送システム。
  26. 前記ポリアニオン性担体巨大分子がポリアニオン性担体ポリサッカライド、ポリアニオン性担体ポリペプチド又はこの組合せから成る請求項２４に記載の輸送システム。
  27. 前記ポリアニオン性担体ポリサッカライドがグリコサミノグリカンから成る請求項２６に記載の輸送システム。
  28. 前記グリコサミノグリカンが、ヘパリン硫酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマチン硫酸、ケラタン硫酸、及びデキストラン硫酸から成る群から選択される請求項２７に記載の輸送システム。
  29. 前記グリコサミノグリカンがヒアルロン酸から成る請求項２８に記載の輸送システム。
  30. 前記ポリアニオン性担体ポリペプチドが、ポリグルタミン酸又はポリアスパラギン酸から成る請求項２６に記載の輸送システム。
  31. 前記脂質媒体が外部表面を有し、該外部表面がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を含む請求項７〜３０のいずれか一項に記載の輸送システム。
  32. 前記脂質媒体が担持２重層を含む請求項７〜３１のいずれか一項に記載の輸送システム。
  33. 前記輸送システムがステルス輸送システムから成る請求項３１又は３２に記載の輸送システム。
  34. 前記輸送システムの前記脂質媒体が外部表面を有し、該外部表面が向標的リガンドを含み、それによって、前記向標的リガンドが、前記標的輸送システムをして標的細胞を標的として狙わせる標的輸送システムを形成する請求項７〜３３のいずれか一項に記載の輸送システム。
  35. 前記向標的リガンドがベンズアミド誘導体から成る請求項３５に記載の輸送システム。
  36. 前記ベンズアミド誘導体がアニサミドから成る請求項３５に記載の輸送システム。
  37. 前記アニサミド（AA）が、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-カルボキシ-ポリエチレングリコール（DSPE-PEG）と接合して、DSPE-PEG-AAを生成する請求項３６に記載の輸送システム。
  38. 前記標的細胞が癌細胞から成る請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の輸送システム。
  39. 前記癌細胞が膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、子宮内膜癌、肝臓癌、咽頭癌、肺癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、及び甲状腺癌から成る群から選択される請求項３８に記載の輸送システム。
  40. 前記癌細胞が肺癌から成る請求項３９に記載の輸送システム。
  41. 請求項７〜４０のいずれか一項に記載の輸送システム及び医薬的に許容される担体から成る医薬組成物。
  42. 細胞に生物活性化合物を輸送する方法であって、請求項７〜４０のいずれか一項に記載の輸送システムに細胞を接触させることから成る方法。
  43. 細胞を殺す方法であって、請求項５に記載のカチオン性脂質に細胞を接触させることから成る方法。
  44. 細胞を殺す方法であって、請求項７〜４０のいずれか一項に記載の輸送システムに細胞を接触させることから成り、前記カチオン性脂質が細胞毒性活性を有する方法。
  45. 選択的に細胞を殺す方法であって、細胞を脂質−向標的リガンド接合体に接触させることから成り、該脂質−向標的リガンド接合体が請求項５に記載のカチオン性脂質から成り、該カチオン性脂質が向標的リガンドと物理的に会合する方法。
  46. 選択的に細胞を殺す方法であって、細胞を標的輸送システムに接触させることから成り、該標的輸送システムが生物活性化合物を包み込む脂質媒体から成り、該脂質媒体が請求項５に記載のカチオン性脂質を含み、該脂質媒体が外部表面を有し、該外部表面が向標的リガンドを含む方法。
  47. 前記生物活性化合物が細胞毒性生物活性化合物を含む請求項４６に記載の方法。
  48. 前記向標的リガンドがベンズアミド誘導体を含む請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記ベンズアミド誘導体がアニサミドから成る請求項４８に記載の方法。
  50. 患者の癌を治療する方法であって、該患者に請求項６に記載の医薬組成物を投与することから成る方法。
  51. 患者の疾患又は迷惑な病態を治療する方法であって、該患者に請求項４１に記載の医薬組成物を投与することから成り、前記生物活性化合物が該疾患又は迷惑な病態に対して治療活性を持つ方法。
  52. 前記疾患が癌を含む請求項５１に記載の方法。
  53. 前記癌が肺癌から成る請求項５０又は５２に記載の方法。
  54. 患者における細胞毒性生物活性化合物の細胞毒性活性を亢進する方法であって、患者に請求項６に記載の医薬組成物及び該細胞毒性生物活性化合物を投与することから成る方法。
  55. 患者における細胞毒性生物活性化合物の細胞毒性活性を亢進する方法であって、患者に請求項４１に記載の医薬組成物を投与することから成り、患者への請求項４１に記載の医薬組成物の投与することから成り、該輸送システムの前記カチオン性脂質及び前記生物活性化合物が細胞毒性活性を有する方法。
  56. 脂質媒体及び生物活性化合物から成り、該脂質媒体が該生物活性化合物を包み込む細胞毒性輸送システムを作成する方法であって、請求項５に記載のカチオン性脂質を含む脂質媒体と生物活性化合物とを混合することから成り、それにより細胞毒性輸送システムが形成される方法。
  57. 前記生物活性化合物が細胞毒性生物活性化合物を含む請求項５６に記載の方法。
  58. ポリカチオン及びポリヌクレオチドを包み込む脂質媒体から成る細胞毒性ポリヌクレオチド輸送システムを作成する方法であって、
    ａ）ポリヌクレオチド及びポリカチオンを混合し、それによりポリヌクレオチド／ポリカチオン溶液を作成する工程、及び
    ｂ）請求項５の記載のカチオン性脂質から成る脂質媒体とこのポリヌクレオチド／ポリカチオン溶液とを混合し、それにより細胞毒性輸送システムを作成する工程、
    から成る方法。
  59. ポリカチオン及びポリヌクレオチドを包み込む脂質媒体から成る細胞毒性ポリヌクレオチド輸送システムを作成する方法であって、
    ａ）請求項５の記載のカチオン性脂質から成る脂質媒体とポリカチオンとを混合し、それにより脂質媒体／ポリカチオン溶液を作成する工程、及び
    ｂ）この脂質媒体／ポリカチオン溶液とポリヌクレオチドとを混合し、それにより細胞毒性輸送システムを作成する工程、
    から成る方法。
  60. 前記ポリヌクレオチドが細胞毒性ポリヌクレオチドから成る請求項５８又は５９に記載の方法。
  61. 前記工程ｂ）がコア担持２重層から成る含む脂質媒体を作成する工程を含む請求項５８又は５９に記載の方法。
  62. 前記脂質媒体がリポソームから成る請求項５６〜６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記リポソームがカチオン性リポソームから成る請求項６２に記載の方法。
  64. 更に、後挿入工程を含む請求項５６〜６３のいずれか一項に記載の方法であって、この後挿入工程において、脂質−向標的リガンド接合体及び脂質−PEG接合体の少なくとも１つが、前記脂質媒体に後挿入され、この後挿入工程が、前記輸送システム又は前記ポリヌクレオチド輸送システムを形成した後に行われる方法。
  65. 前記細胞毒性輸送システム又は前記細胞毒性ポリヌクレオチド輸送システムが、ステルス細胞毒性輸送システム、又はステルス細胞毒性ポリヌクレオチド輸送システムから成る請求項６４に記載の方法。
  66. 前記後挿入工程が、前記輸送システム又は前記ポリヌクレオチド輸送システムを約５〜約２０モル％の濃度の脂質−PEG接合体と共にインキュベートする工程から成る請求項６４又は６５に記載の方法。
  67. 前記脂質−PEG接合体の濃度が約１０モル％である請求項６６に記載の方法。
  68. 前記脂質−PEG接合体が、分子量が約２０００ｇ／ｍｏｌのPEG分子を含む請求項６４〜６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記脂質−PEG接合体が1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-カルボキシ−ポリエチレングリコール2000 （DSPE-PEG2000）を含む請求項６８に記載の方法。
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