JP2018150327A - ビス−ポリマー脂質−ペプチド複合体及びそのナノ粒子 - Google Patents

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Abstract

【課題】ｉｎ ｖｉｖｏでの薬物及び他の積荷の送達のためのミセルナノキャリアの提供。【解決手段】約１０〜約１００個のアミノ酸を有する第一のペプチド、ここで、前記ペプチドが、らせん構造をとり；前記ペプチドのＮ末端及びＣ末端アミノ酸残基以外のアミノ酸残基に共有結合した第一のポリマー；前記ペプチドのＣ−末端アミノ酸残基に共有結合した少なくとも１つの第二のポリマー；並びに前記ペプチドのＮ−末端に共有結合した疎水性部分、ここで、前記疎水性部分が、第三のポリマーまたは脂質部分を含む、複合体。【選択図】図１

Description

関連出願に対する相互参照
本願は、２０１２年４月１０日に出願された米国特許仮出願第６１／６２２，３３０号、及び２０１２年７月６日に出願された米国特許仮出願第６１／６６８，９２３号に対する優先権を主張し、それらの出願の全体は、参照によりそれらの全体において組み込まれている。
連邦支援の研究開発下で成された発明の権利に関する声明
本願は、米国国防総省の陸軍局により与えられた認可番号第Ｗ９１ＮＦ−０９−１−０３７４号、米国エネルギー省の科学局、基礎エネルギー科学局により与えられた認可番号第ＤＥ−ＡＣ０２−０５ＣＨ１１２３１号下で、政府支援により成された。政府は、本発明において一定の権利を有する。
〜４０％の新生小分子薬物は、水溶解度が乏しく、また血中半減期が短いとされてきたので、それらの薬物動態、生体内分布、毒性プロファイル及び有効性を改良する有効な薬物製剤の開発が要求される。静脈内に投与される場合に、ナノスケールキャリアは、一般に固形腫瘍において見られる漏れのある血管系及び不十分なリンパ排液により定義される高められた浸透及び保持（ＥＰＲ）効果を介して、腫瘍組織における濃縮という追加の利点を与える。研究は、腫瘍間質への溢出を受けて、薬物または薬物−カプセル封入賦形剤が、腫瘍内の全ての細胞に到達するために、腫瘍血管系から離れて１００μｍまでの輸送能を有するだろうということを示した。悪性細胞の不十分な排出をもたらす腫瘍内での薬物の制限された浸透及び分布は、処置後の腫瘍再生に寄与し得るという証拠が増えている。現在ＦＤＡに認可されているＤｏｘｉｌ（〜１００ｎｍ）及びＡｂｒａｘａｎｅ（〜１３０ｎｍ）は、非常に期待できるものであるにもかかわらず、わずかな生存利益しか提供していない。これは、それらの比較的に大きなサイズ、及び血液循環中の薬物漏れに起因する、腫瘍内への化学療法剤の不十分な輸送による。腫瘍部位での密度及び血管系の不均一性、間質液圧、並びに腫瘍間質におけるキャリアの輸送を含む生理学的な要因は、腫瘍内へのナノキャリアの溢出の範囲に影響を及ぼす。さらに腫瘍浸透に効率的なナノキャリア直径の範囲がキャリアの外形、硬度及び構造によって決まる場合、ナノキャリアは、有意な浸透を達成するために、一定のサイズを下回ることが必要とされる。マウスにおいてヒトメラノーマ異種移植モデルを用いる近年の研究では、より小さな粒子、すなわち１０〜１２ｎｍ量子ドットが、６０ｎｍのナノ粒子よりも効率的に異常な腫瘍血管系及び高密度の間質マトリクスにより課せられる生理学的な障壁に浸透し得ることが示された。デンドリマーを用いる場合の悪性固形腫瘍微小血管系の血液腫瘍障壁における生理学的な上限の孔サイズは、約１２ｎｍである。〜２５ｎｍのサイズにあるエラスチン様ペプチドに基づく有機ナノ粒子は、ネズミ科のがんモデルにおいてほぼ完全な腫瘍退縮を生み出した。
さらに薬物キャリアの有効性は、ｉｎ ｖｉｖｏでのその安定性及び薬物保持によって決まる。薬物の毒性プロファイルにおける改善を確実にするためには、薬物は、標的部位に到達するまで、ミセル内に保持される必要がある。高められた積荷安定性及び腫瘍浸透性に加えて、有効なナノキャリアに等しく重要とされる要求は、安定した循環とナノキャリアクリアランスのバランスである。ナノキャリアは、延長した循環寿命を達成するために初めは６ｎｍよりも大きくなければならず、そしてその後は、腎臓における糸球体ろ過により循環から排泄されるために、〜６ｎｍ、または５０ＫＤａの分子量よりも小さな材料に分解される必要がある。長い循環半減期、有効な腫瘍組織浸透、最小の積荷漏れ、及び効率的なサブユニットクリアランスを組み合わせる１０〜３０ｎｍの範囲のサイズにある有機ナノキャリアの創出は、なお意義深い挑戦のままである。
熱力学的に粒子径は、粒子表面・局所媒質間での界面相互作用と粒子中にたまった凝集エネルギーの間でのバランスにより決定される。体積に対する表面積の比率は、粒子径に反比例する。粒子径がナノスケールにまで減少する際に、個々のナノ粒子を安定させるには、粒子表面の低い表面張力及び／またはナノ粒子内の高い凝集エネルギー密度が必要とされる。ナノ粒子の構成及び安定性に関わる化学エネルギーの量に応じて、現在の有機ナノ粒子は、２つに分類され得る。デンドリマーを含むナノ粒子の１つのファミリーでは、サブユニットは、共有結合を介して一緒になって、１モルあたり数１０ｋｃａｌの典型的なエネルギーにより結合される。有機ナノ粒子の２番目のファミリーは、非共有結合、典型的に１モルあたり数ｋｃａｌを介して安定化される。これらのナノ粒子は、粒子中にためられたエネルギーが比較的に低いために、しばしば非常に低い界面相互作用を有する。
有機ナノ粒子の動力学的安定性は、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性、循環半減期及びクリアランス経路を決定する。共有結合性のナノ粒子は、共有結合の化学分解が、ｐＨ、温度、光及び酵素等の外部刺激を介して生じるまで、一般の生物学的条件下においてしばしば安定である。しかしながら非共有結合性のナノ粒子については、サブユニットは、局所媒質と、または粒子間で交換され得る。交換の動力学的エネルギー障壁は、ミセルサイズが小さくなるにつれて、特にサイズが２０ｎｍを下回るような場合に減少する。小さなミセルは、サブユニット両親媒性物質が、周囲の媒体及び他のミセルと絶えず交換され続けている場合に、一般に流体で、動的な集合である。個々の両親媒性物質を安定化させるｉｎ ｖｉｖｏでの化学的捕捉の存在は、さらにミセルの安定性を減少させ、そして所望されない積荷漏れ及び分解を導く。頭部基を化学的に架橋させること、及び／または頭部基間での分子内相互作用の多重対を操作することは、安定なミセルを得るために有効であり得る。しかしながら生体内分布研究は、肝臓及び脾臓における蓄積を示し、そして潜在的な長期間の毒性への懸念を掲げた。
したがって、満たされていない必要性は、都合のよい材料から集められ、且つｉｎ ｖｉｖｏでの薬物及び他の積荷の送達のために使用され得る、小さく（すなわち数１０ナノメートル程度）、安定したミセルに存在する。驚くべきことに本発明は、本必要性及び他の必要性に対処する。
いくつかの実施態様では、本発明は、約１０〜約１００個のアミノ酸を有するペプチドを含む複合体を提供し、ここでのペプチドは、らせん構造を用いる。さらに複合体は、Ｎ−末端及びＣ−末端アミノ酸残基以外のペプチドのアミノ酸残基に共有結合した第一のポリマー、ペプチドのＣ−末端アミノ酸残基に共有結合した少なくとも１つの第二のポリマー、並びにペプチドのＮ−末端に共有結合した疎水性部分を含め、ここでの疎水性部分は、第三のポリマーまたは脂質部分を含む。
いくつかの実施態様では、本発明は、本発明の２〜６個の複合体を有するらせん束を提供する。いくつかの態様では、本発明は、本発明の約２０〜約２００個の複合体を有する粒子を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、本発明の約２０〜約２００個の複合体を有する粒子を提供する。それぞれの複合体は、配列番号１を有する第一のペプチド、約２０００Ｄａの分子量を有するポチエチレングリコールを含む第一のポリマー、ペプチドのＣ−末端残基に共有結合し、且つ約７５０Ｄａの分子量を有するポチエチレングリコールを含む第二のポリマー、並びにリシン及び２つのＣ18アシル鎖を含む脂質部分を有する疎水性部分を含む。さらに粒子は、ドキソルビシン及びラパマイシンから選定される治療用薬剤を含む。
いくつかの実施態様では、本発明は、本発明の粒子を形成するための方法を提供する。方法は、粒子を形成するために複合体が自己集合するように、複数の本発明の複合体を接触させることを含む。
いくつかの実施態様では、本発明は、さらに対象に粒子を投与することを含む、診断用薬剤または治療用薬剤を対象に送達するための方法を提供する。したがって粒子は、本発明の約２０〜約２００個の複合体、及び治療用薬剤を含む。
いくつかの実施態様では、本発明は、疾患を伴う対象を処置するための方法を提供する。方法は、治療有効量の粒子を対象に投与することを含み、ここでの粒子は、本発明の約２０〜約２００個の複合体、及び治療用薬剤を含む。これにより疾患が処置される。
図１は、（ｂ）３−らせん束サブユニット、並びに（Ｃ）３−らせん束から成るシェル及び脂肪族鎖から成るコアを有するミセルを形成するための（ａ）ビス−ポリマー脂質−ペプチド複合体の図式の集合を示す。 図２は、（ａ）両親媒性ビス−ポリマー脂質ペプチド複合体を調製するための合成スキーム、及び（ｂ）複合体ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。 図３は、（ａ）円偏光二色性、（ｂ）動的光散乱、及び（Ｃ）透過電子顕微鏡法を用いるｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセルの物理的特徴化を示す。 図４は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセル安定性の評価を示す。時間分解ＦＲＥＴデータは、図４（ａ）ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセル、及び図４（ｂ）ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋミセルについて比較した。標準化ＦＲＥＴデータは、図４（Ｃ）にプロットする。 図５（図５ａ）は、円偏光二色性によるｄＣ１６−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０及びｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセルの分析を示す。図５（図５ｂ）は、一定の温度範囲に渡り記録されたｄＣ１６−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０及びｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセルのペプチドヘリシティを示す。 図６（図６ａ）は、示差走査熱量測定法によるｄＣ１６−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０及びｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセルの分析を示す。図６（図６ｂ）は、ＦＲＥＴにより評価したｄＣ１６−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０及びｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセルの安定性を示す。 図７は、（ａ）サイズ排除クロマトグラフィー、（ｂ）動的光散乱、及び（Ｃ）蛍光分光分析法を介するＤＯＸ−充填ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセルに関する構造特徴化及び熱安定性測定を示す。 図８（図８ａ）は、示差走査熱量測定法によるラパマイシン−充填ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセルの特徴化を示す。図８（図８ｂ）は、充填ミセルからのラパマイシン放出速度論を示す。 図９は、サイズ排除クロマトグラフィーによるパクリタキセル−充填ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセルの分析を示す（パクリタキセル充填＝１．５重量％）。 図１０は、示差走査熱量測定法によるパクリタキセル−充填ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセルの分析を示す。 図１１は、５０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ中、３７℃で、経時的に蛍光分光法により評価したパクリタキセル−充填ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセルの安定性を示す。 図１２は、（ａ）ドキソルビシン及び（ｂ）ラパマイシンで充填されたｄＣ１６−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０及びｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセルについての薬物放出測定を示す。 図１３は、（ａ）ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）を用いたｉｎ ｖｉｖｏでの64Ｃｕ−ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセル循環及び安定性の評価、（ｂ）ミセル投与に伴う経時的な血液放射活性プロファイル、並びに（ｃ）血漿及び血液細胞中の放射活性分布を示す。 図１４（図１４（ａ））は、長循環リポソームと比較した64Ｃｕ−ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセルの生体内分布を示す。図１４（図１４（ｂ））は、超循環リポソーム及び従来型のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋミセルと比較した64Ｃｕ−ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセルの生体内分布を示す。 図１５は、２５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４に溶けたｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０の濃度関数として観測したピレン蛍光を示す。 図１６は、２５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４に溶けた６０μＭのｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０の円偏光二色性スペクトルを示す。 図１７は、２５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４に溶けた２００μＭのｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０の示差走査熱量測定法サーモグラムを示す。 図１８は、２５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４に溶けた６０μＭのｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０の動的光散乱痕跡を示す。 図１９は、薬物積荷を伴う複合体ミセルの充填に使用される方法を示す。 図２０は、２５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４に溶けたドキソルビシン充填ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０の動的光散乱痕跡を示す。 図２１は、２５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４に溶けたドキソルビシン充填ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセルのサイズ排除クロマトグラムを示す。 図２２は、２５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４に溶けたドキソルビシン充填ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセルの蛍光スペクトルを示す。 図２３は、５０ｍｇ／ｍＬの血清アルブミンが経時的に記録されることを含む、２５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４に溶けたドキソルビシン充填ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセルの蛍光スペクトルを示す。 図２４は、２５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４に溶けたラパマイシン充填ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセルのサイズ排除クロマトグラムを示す。 図２５は、ｉｎ ｖｉｖｏでの（ａ）投与後３０分の64Ｃｕ−ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）ミセル、（ｂ）投与後２４時間の64Ｃｕ−ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）ミセル、（ｃ）投与後３０分の64Ｃｕ−ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセル、及び（ｄ）投与後２４時間の64Ｃｕ−ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセルについてのミセル局在化のＰＥＴ分析を示す。 図２６は、注入後４８時間での血液、肝臓、及び脾臓中の 64Ｃｕ−ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセル及び64Ｃｕ−ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）ミセルの放射活性（％ＩＤ／ｇ）の比較を示す。 図２７は、64Ｃｕ−ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）ミセル、64Ｃｕ−ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセル、及び64Ｃｕ−ｄＣ１６−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセルについての薬物動態測定及び生体内分布データを示し；図２７（図２７Ａ）は、64Ｃｕ−ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセルについてのより高い濃度を示し；図２７（図２７Ｂ）は、より高い血中濃度を有する64Ｃｕ−ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセルとの相対的な血中濃度を示し；図２７（図２７Ｃ）は、肝臓、脾臓及び腎臓中でのミセルの濃度を示し；そして図２７（図２７Ｄ）は、より高い濃度を示す64Ｃｕ−ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセルを伴う腫瘍中のミセルの濃度を示す。 図２８は、混合ミセル系の略図を示す。 図２９（図２９ａ）は、ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ混合ミセルについての臨界ミセル濃度の決定を示す。図２９（図２９ｂ）は、混合ミセルのＳＥＣ分析を示す。 図３０は、（ａ）円偏光二色性、及び（ｂ）示差走査熱量測定法のよる、ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ 混合ミセルの分析を示す。 図３１は、（ａ）動的光散乱、及び（ｂ）サイズ排除クロマトグラフィーによる、ラパマイシン−充填ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ混合ミセルの分析を示す。 図３２（図３２ａ）は、充填ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセル及びｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ混合ミセルからのラパマイシンの放出を示す。図３２（図３２ｂ）は、Ｈｉｇｕｃｈｉモデルに従ってプロットした放出データ（Ｒ＝ｋｔ0.5）を示す。 図３３は、（ａ）蛍光分光法、及び（ｂ）ＦＲＥＴにより評価したｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ混合ミセルの安定性を示す。
発明の詳細な説明
Ｉ．概要
本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏでの薬物及び他の積荷の送達のためのミセルナノキャリアを提供する。ナノ粒子は、標的化または非標的化され得る。本発明のナノキャリアにより送達され得る適切な積荷は、これらに限定されないが、ワクチン、ＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸、ペプチド、タンパク質、造影剤、及び薬物を含む。さらに本発明のナノ粒子は、遺伝子治療、発現された核酸、または発現可能な核酸の対象への投与に有用である。
ナノキャリアは、自己集合してミセルを形成するビス−ポリマー脂質−ペプチド複合体から成る。複合体は、疎水性ブロック、並びにらせんペプチド及び２つのポリマーブロックを含む頭部基を含む。ペプチドによるらせん束形成は、ペプチドの長さに沿ってペプチドに共有結合した１つのポリマーブロック、及びペプチドのＣ−末端に共有結合した他のポリマーブロックと共に、ペプチド束のＮ−末端で疎水性ブロックのアラインメントをもたらす。複合体から集合的に得られるミセルは、ミセル表面上にポリマーシェルを含む。特に表面Ｃ−末端ポリマーは、Ｃ−末端ポリマーが無い複合体から集合したミセル、及び他の既に公知の自己集合したナノキャリア構造と比べて、ミセルナノ粒子の驚くべき安定性、及び長い循環時間に寄与する。
ＩＩ．定義
「複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」とは、第一のポリマー、第二のポリマー、ペプチド、及び疎水性部分を全て一緒に結合して有する化合物について言及する。複合体は、自己結合して、らせん束を形成することを可能にする。らせん束は、２〜６個、典型的に３または４個の複合体を含む。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」とは、ポリマーのアミノ酸残基について言及するのに本明細書において同じ意味で使用される。全ての３つの用語は、アミノ酸ポリマーに適用され、ここでの１つ以上のアミノ酸残基は、天然アミノ酸、並びに天然アミノ酸ポリマー及び非天然アミノ酸ポリマーに相当する人工的な化学模倣物である。本明細書において用いられる用語は、全長タンパク質を含む、任意の長さのアミノ酸鎖を包含し、ここでのアミノ酸残基は、共有ペプチド結合により結合する。本発明のペプチドは、らせん構造であってよく、且つコイルドコイル三次タンパク質構造を形成し得る。コイルドコイル三次構造の形成は、複合ポリマーを置き、且つナノ粒子の個々のサブユニットの外形を定義するための構造的な足場を提供する。さらにらせんは、サブユニットの剛性を高め、且つウィルス粒子と同様な方法での幾何学的パッキングを可能にする。
「Ｎ−末端（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」とは、タンパク質またはポリペプチド配列中の最初のアミノ酸残基について言及する。Ｎ−末端残基は、遊離α−アミノ基を含む。
「Ｃ−末端（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」とは、タンパク質またはポリペプチド配列中の最後のアミノ酸残基について言及する。Ｃ−末端残基は、遊離カルボキシレート基を含む。
「ポリマー（ｐｏｌｙｍｅｒ）」とは、共有結合により連結された繰り返し単位を有する微小分子について言及する。ポリマーは、親水性、疎水性または両親媒性であり得る。親水性ポリマーは、実質的に水に混和性であり、またこれに限定されないが、ポリエチレングリコールを含む。疎水性ポリマーは、実質的に水に不混和性であり、またこれらに限定されないが、ポリブタジエン及びポリスチレンを含む。両親媒性ポリマーは、親水性及び疎水性の両特性を有し、また典型的に親水性及び疎水性ポリマーのブロックコポリマーである。ポリマーは、ホモポリマー、ランダムコポリマー、及びブロックコポリマーを含む。本発明において有用な特定のポリマーは、特にポリエチレングリコール、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）、ポリブタジエン及びポリスチレンを含む。
「疎水性部分（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｍｏｉｅｔｙ）」とは、疎水性であるポリマーまたは小分子について言及する。疎水性部分の例は、これらに限定されないが、ポリブタジエン及びポリスチレン等の疎水性ポリマー、並びに本発明の脂質部分を含む。
「脂質部分（ｌｉｐｉｄ ｍｏｉｅｔｙ）」とは、少なくとも１つの脂質を有する部分について言及する。脂質は、疎水性または両親媒性特性を有する小分子であり、また小胞、ミセル及びリポソームの調製に有用である。脂質は、これらに限定されないが、脂肪、ワックス、脂肪酸、コレステロール、リン脂質、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドを含む。脂肪酸は、飽和化物、単不飽和化物、または多価不飽和化物であり得る。脂肪酸の例は、これらに限定されないが、酪酸（Ｃ４）、カプロン酸（Ｃ６）、カプリル酸（Ｃ８）、カプリン酸（Ｃ１０）、ラウリン酸（Ｃ１２）、ミリスチン酸（Ｃ１４）、パルミチン酸（Ｃ１６）、パルミトレイン酸（Ｃ１６）、ステアリン酸 （Ｃ１８）、イソステアリン酸（Ｃ１８）、オレイン酸（Ｃ１８）、バクセン酸（Ｃ１８）、リノール酸 （C１８）、α−リノール酸（C１８）、γ−リノレン酸（Ｃ１８）、アラキジン酸 （Ｃ２０）、ガドレイン酸（Ｃ２０）、アラキドン酸（Ｃ２０）、エイコサペンタエン酸（Ｃ２０）、ベヘン酸（Ｃ２２）、エルカ酸（Ｃ２２）、ドコサヘキサエン酸（Ｃ２２）、リグノセリン酸 （Ｃ２４）及びヘキサコサン酸（Ｃ２６）を含む。脂質部分は、リシン及び他の分岐アミン等の分岐基を用いる数個の脂肪酸基を含み得る。
「アルキル（ａｌｋｙｌ）」とは、示された数の炭素原子を有する直鎖、または分岐鎖、飽和、脂肪族ラジカルについて言及する。アルキル基は、２４個までの炭素原子を有してよく、またヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、イコシル等を含む。アルキルは、Ｃ6~20、Ｃ6~18、Ｃ6~16、Ｃ8~24、Ｃ8~22、及びＣ8~20等の任意の数の炭素を含み得る。アルキル基は、フッ素基を含む置換基により置換され得る。
「アシル（ａｃｙｌ）」とは、上記に定義したようなアルキル基により置換されたカルボニルラジカル（すなわちＣ＝Ｏ）について言及する。アシル基について示される炭素原子の数は、カルボニル炭素及びアルキル炭素を含む。アシル基は、２４個までの炭素原子を有してよく、またヘプトイル、オクトイル、ノノイル、デコイル、ドデコイル、トリデコイル、テトラデコイル、ペンタデコイル、ヘキサデコイル、ヘプタデコイル、オクタデコイル、ノナデコイル、イコソイル等を含み得る。アシルは、Ｃ6~20、Ｃ6~18、Ｃ6~16、Ｃ8~24、Ｃ8~22、及びＣ8~20等の任意の数の炭素を含み得る。アシル基は、フッ素基を含む置換基により置換され得る。
「アントラサイクリン（ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ）」とは、ストレプトマイセス・ピウセチウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ）の天然産物、及び関連誘導体について言及する。アントラサイクリンは、アミノ糖、及び焼成化、四環系アグリコンを含むグリコシドである。多くのアントラサイクリンは、抗生物質及び抗腫瘍活性を実証する。アントラサイクリンの例は、これらに限定されないが、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、及びイダルビシンを含む。
「マクロライド（ｍａｃｒｏｌｉｄｅ）」とは、ペンダントデオキシ糖で置換された大きな（典型的に１４〜１６員の）ラクトン環により特徴付けられる化合物について言及する。多くのマクロライドは、抗生物質及び免疫調節活性を実証する。マクロライドの例は、これらに限定されないが、ラパマイシン、クラリスロマイシン、及びエリスロマイシンを含む。
「治療用薬剤（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）」とは、症状または疾患を処置及び／または改善することができる薬剤について言及する。治療用薬剤は、これらに限定されないが、化合物、薬物、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、抗体等を含む。
「診断用薬剤（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｇｅｎｔ）」とは、症状または疾患を診断することができる作用剤について言及する。診断用薬剤は、これらに限定されないが、染料及び放射性標識を含む。
「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、及び「ポリヌクレオチド」とは、いずれも一本鎖または二本鎖形態にあるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）及びそのポリマーについて言及する。特に限定されていない限り、用語は、参照核酸と同じような結合特性を有し、且つ天然ヌクレオチドと類似する方法で代謝される天然ヌクレオチドの公知の類似物を含む核酸を包含する。用語核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、及び遺伝子によりコード化されたｍＲＮＡと同じ意味で用いられる。
「接触させる（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」とは、少なくとも２つの異なる種を、それらが相互作用できるように接触に至らせる工程について言及する。いくつかの場合では、かかる相互作用は、イオン相互作用及びファン・デル・ワールス相互作用等の非共有結合性相互作用を含む。いくつかの場合では、相互作用は、共有結合形成反応をもたらす。これらの場合では、得られる反応産物は、添加される試薬間の反応から、または反応混合物中で生み出され得る１つ以上の添加される試薬から由来する中間体から直接的に生産され得ることが理解されるだろう。
「アミノ酸」とは、天然及び合成アミノ酸、並びに天然アミノ酸に類似する方法において機能するアミノ酸類似物及びアミノ酸模倣物について言及する。天然アミノ酸は、遺伝子コードによりコードされたもの、並びに後に修飾されたそれらのアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン、及びＯ−ホスホセリンである。
「アミノ酸類似物（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇ）」とは、天然アミノ酸と同一の塩基性化学構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基と結合するα炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムについて言及する。かかる類似物は、修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同一の塩基性化学構造を保持する。
「非天然アミノ酸（ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）」は、遺伝子コードによりコード化されていないが、天然アミノ酸と同一の塩基性構造を有する必要はない。非天然アミノ酸は、これらに限定されないが、アゼチジンカルボン酸、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、三級−ブチルグリシン、２，４−ジアミノイソ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ホモプロリン、ヒドロキシリシン、アロ−ヒドロキシリシン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルペンチルグリシン、Ｎ−メチルバリン、ナフトアラニン（naphthalanine）、ノルバリン、オルニチン、ペンチルグリシン、ピペコリン酸及びチオプロリンを含む。
「アミノ酸模倣物（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｍｉｍｅｔｉｃ）」とは、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と類似する方法において機能する化学化合物について言及する。
アミノ酸は、本明細書において、一般に公知である３つの文字記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１つの文字記号のいずれかにより言及され得る。同様にヌクレオチドは、それらの一般に認められている単一の文字コードにより言及され得る。
「保存的に修飾された変異体（Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｒｉａｎｔ）」は、アミノ酸及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関する「保存的に修飾された変異体」とは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードするそれらの核酸について、或いは核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一な配列について言及する。遺伝子コードの縮重のために、多くの官能的に同一の核酸は、任意の所定のタンパク質をコードする。例えばコドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは、全てアミノ酸アラニンをコードする。したがってアラニンがコドンにより特定化される全ての位置で、コドンは、コード化されたポリペプチドを変えることなく、発表されている任意の対応コドンに変えられ得る。かかる核酸バリエーションは、１種の保存的に修飾されたバリエーションである「サイレントバリエーション（ｓｉｌｅｎｔ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）」である。さらにポリペプチドをコードする本明細書におけるあらゆる核酸配列は、核酸のあらゆる可能性のあるサイレントバリエーションを発表する。当業者は、核酸中のそれぞれのコドン（通常はメチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常はトリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、官能的に同一の分子を産するように修飾され得ることを認識するだろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のそれぞれのサイレントバリエーションは、それぞれ発表される配列中に潜在している。
アミノ酸配列に関し、当業者は、核酸に対する個々の置換、欠損または付加、ペプチド、ポリペプチド、或いは単一のアミノ酸、もしくはコード化配列中の小さい割合のアミノ酸が変化し、付加し、または欠損するタンパク質配列について、変化が化学的に類似するアミノ酸（すなわち疎水性、親水性、正電荷、中性、負電荷）によるアミノ酸の置換をもたらす場合に、「保存的に修飾された変異体」であると認識するだろう。例示的な疎水性アミノ酸は、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、及びトリプトファンを含む。例示的な芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンを含む。例示的な脂肪族アミノ酸は、セリン及びトレオニンを含む。例示的な塩基性アミノ酸は、リシン、アルギニン及びヒスチジンを含む。カルボキシレート側鎖を有する例示的なアミノ酸は、アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩を含む。カルボキサミド側鎖を有する例示的なアミノ酸は、アスパラギン及びグルタミンを含む。官能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、当業界において周知である。かかる保存的に修飾された変異体は追加され、且つ本発明の多形変異体、種間ホモログ、及び対立遺伝子を排除しない。
以下の８つの群は、それぞれ互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ, Ｐｒｏｔｅｉｎｓ （１９８４）を参照）。
「らせん束（ｈｅｌｉｘ ｂｕｎｄｌｅ）」は、疎水性部分が、ペプチド束の一端（典型的にＮ末端）で互いに位置合わせされ、またそれぞれの複合体のポリマーが、ペプチド束の長さに沿って、且つ疎水性部分の反対側のペプチド束の末端（典型的にＣ末端）で配置されている場合に、本発明の複数の複合体の自己集合により形成された構造について言及する。
「投与する（Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」とは、対象への経口投与、坐剤、局所接触、非経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、病巣内、鼻腔内または皮下投与としての投与、髄腔内投与、或いは徐放デバイス、例えばミニ浸透圧ポンプの移植について言及する。
「処置（ｔｒｅａｔ、ｔｒｅａｔｉｎｇ、及びｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、軽減等の任意の客観的または主観的パラメーター；鎮静；症状の減退、或いは症状、傷害、病変または病気を患者または対象により耐え得るものにさせること；症状または病気の頻度または期間を減少させること；或いはいくつかの状況では、症状または病気の開始を防ぐことを含む傷害、病変、病気、または症状（例えば疼痛）の処置または改善における成功の任意の兆候について言及する。症状の処置または改善は、例えば健康診断の結果を含む任意の客観的または主観的パラメーターに基づき得る。
「がん（ｃａｎｃｅｒ）」は、固形腫瘍及び血液学的悪性腫瘍を含む。がんは、脳、乳房、結腸、及び卵巣がん、並びに白血病、リンパ腫及び骨髄腫等のがんを含む。
「治療的に有効量または用量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｒ ｄｏｓｅ）」または「治療的に十分な量または用量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｍｏｕｎｔ ｏｒ ｄｏｓｅ）」または「有効または十分な量または用量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｏｒ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｍｏｕｎｔ ｏｒ ｄｏｓｅ）」とは、投与される対象に対して治療効果を生み出す用量について言及する。正確な用量は、処置目的によって決まり、また当業者により、公知技術を用いて確かめられるだろう（例えばＬｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（第１〜３巻、１９９２）； Ｌｌｏｙｄ, Ｔｈｅ Ａｒｔ, Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ （１９９９）； Ｐｉｃｋａｒ, Ｄｏｓａｇｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）；及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、２０編、２００３, Ｇｅｎｎａｒｏ, Ｅｄ., Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ, Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓを参照）。感作細胞における治療的有効用量は、しばしば従来型の非感作細胞の治療的有効用量よりも低く成り得る。
ＩＩＩ．複合体、らせん束、及び粒子
いくつかの実施態様では、本発明は、約１０〜約１００個のアミノ酸を有する第一のペプチドを有する複合体を提供し、ここでのペプチドは、らせん構造を用いる。さらに複合体は：Ｎ−末端及びＣ−末端残基以外のペプチドのアミノ酸残基に共有結合した第一のポリマー；ペプチドのＣ−末端アミノ酸残基に共有結合した少なくとも１つの第二のポリマー；並びにペプチドのＮ−末端に共有結合した疎水性部分を含み、ここでの疎水性部分は、第三のポリマーまたは脂質部分を含む。
本発明の複合体に有用なペプチドは、らせん配座を用いるものである。ペプチドは、任意の適切な長さ、約１０〜約１０００個のアミノ酸、または約１０〜約５００個のアミノ酸、または約１０〜約１００個のアミノ酸等であり得る。いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６であり得る。
好適な態様では、第一のペプチドは、自己集合して、三次ペプチド構造を形成し得る。いくつかの態様では、第一のペプチドは、これに限定されないが、配列番号１等の新たに設計された３−へリックス束ペプチドであり得る。いくつかの態様では、１〜５０個のアミノ酸は、ミセル形成を妨げずに、第一のペプチドのＣ−末端に付加され得る。いくつかの実施態様では、１〜２５個のアミノ酸、好適には１〜１０個のアミノ酸、及びより好適には、１〜５個のアミノ酸は、第一のペプチドのＣ−末端に付加され得る。いくつかの実施態様では、第一のペプチド配列は、これに限定されないが、配列番号４等のランダムコイルを形成するコントロールペプチド配列であり得る。いくつかの実施態様では、第一のペプチドは、配列番号５に基づき設計されてよく、且つＰＩ及び疎水性を含む類似する特徴を有し得る。いくつかの実施態様では、第一のペプチド配列は、配列番号２等の４−らせん束を形成し得るヘム結合ペプチドであり得る。
さらに本発明の複合体は、第一のポリマー及び第二のポリマーを含む。第一及び第二のポリマーは、任意の適切なポリマーであり得る。例示的なポリマーは、親水性、疎水性及び両親媒性ポリマーを含む。非限定的な例として、第一のポリマー及び第二のポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧまたはＰ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＮＩＰＡＭ）、ポリブタジエン（ＰＢＤ）、及びポリスチレン（ＰＳ）から独立して選定され得る。いくつかの実施態様では、第一のポリマー及び第二のポリマーは、親水性ポリマーを含む。親水性ポリマーは、水と混和性であり、且つこれらに限定されないが、ポリエチレングリコール、ＮＩＰＡＭ、及びセルロースを含む。いくつかの態様では、第一のポリマー及び第二のポリマーは、ポリエチレングリコールを含む。
第一のポリマーは、Ｎ−末端アミノ酸残基及びＣ−末端アミノ酸残基以外のペプチドの任意の位置で結合され得る。任意の適切な共有結合は、ペプチドに第一のポリマーを連結させるのに有用である。例えば共有結合は、エステル、アミド、エーテル、チオエーテルまたは炭素結合を介し得る。いくつかの実施態様では、第一ポリマーは、システイン上等のペプチドのスルフヒドリル基と反応するマレイミドにより修飾され得る。いくつかの実施態様では、第一のポリマーは、クリック化学を介して、トリアゾール環を形成するためのアジド及びアルキンの反応によりペプチドに結合され得る。
一般に第二のポリマーは、ポリマーのＣ−末端アミノ酸残基に結合する。例えばアミノ基を有する第二のポリマーは、アミド結合を介してＣ−末端カルボン酸塩に直接結合され得る。さらに第二のポリマーは、Ｃ−末端アミノ残基の側鎖に連結され得る。マレイミドを有する第二のポリマーは、例えばＣ−末端システイン側鎖のチオール基に結合され得る。或いはカルボン酸塩（または活性化カルボン酸塩誘導体）を有する第二のポリマーは、Ｃ−末端リシン側鎖のε−アミノ基に結合され得る。多くの他の結合戦略は、当業者に公知であり、且つ本発明の複合体を合成するために使用され得る。かかる戦略は、“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”、第２編、Ｇ.Ｔ. Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ, Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ, Ａｍｓｔｅｒｄａｍ, ２００８において発表されている。
ペプチドのＣ−末端への第二のポリマーの連結は、外部環境と複合体集合からもたらされるミセルとの相互作用を調節し得る。いくつかの場合では、第二のポリマーは、ミセルを投与された対象におけるミセルと非標的細胞または組織との間の所望されない相互作用を最小限にし得る。さらに第二のポリマーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ標的との所望される相互作用を促進するために使用され得る。複合体の多量体らせん束は、ナノキャリアの標的化を活性化するために、所望される位置に対するミセル表面上のリガンドの提示のためのプラットフォームとして使用され得る。ミセル表面上の第二のポリマーは、配位子間のクラスター間隔を合わせ、そして標的細胞または組織での多原子価リガンド結合を調整するために使用され得る。さらに第二のポリマーは、ミセル安定性を調節するための役割も果たし得る。任意の特定の理論にとらわれることを考えずに、ペプチドらせん束と外面のＣ−末端の第二のポリマーの圧縮の間の分子間相互作用は、サブユニット脱離の活性化エネルギー障壁を増加させ、そしてミセルに対する安定性を提供し得ると信じられている。
複合体集合特性、並びに複合体束及びミセルの安定性は、複合体中のポリマーの複合体構造及び分子量にある程度左右される。複合体の外形は、複合体集合から得られるミセルの大きさ及び外形に影響を及ぼすだろう。第一のポリマー及び第二のポリマーの分子量は、ミセルの集合及び安定性を調整するように選定され得る。一般にポリマー分子量は、集合したミセルを安定させるには十分に大きいが、らせん束集合及びミセル集合を妨げるほど大きくはない。いくつかの実施態様では、第一のポリマーの分子量は、約５００Ｄａ〜約１０，０００Ｄａであり得る。いくつかの実施態様では、第一のポリマーの分子量は、例えば約１０００Ｄａ〜約７５００Ｄａ、または約２０００Ｄａ〜約５０００Ｄａであり得る。第一のポリマーの分子量は、約 ５００Ｄａ、または約１０００Ｄａ、または約２０００Ｄａ、または約３０００Ｄａ、または約４０００Ｄａ、または約５０００Ｄａ、または約６０００Ｄａ、または約７０００Ｄａ、または約８０００Ｄａ、または約９０００Ｄａ、または約１０，０００Ｄａであり得る。いくつかの実施態様では、第一のポリマーの分子量は、約１０００Ｄａ〜約５０００Ｄａであり得る。いくつかの実施態様では、第一のポリマーの分子量は、約２０００Ｄａであり得る。
いくつかの実施態様では、第二のポリマーの分子量は、約２５０Ｄａ〜約５０００Ｄａであり得る。いくつかの実施態様では、第二のポリマーの分子量は、例えば約３００Ｄａ〜約２５００Ｄａ、または約７５０Ｄａ〜約２０００Ｄａであり得る。いくつかの実施態様では、第二のポリマーの分子量は、約２５０Ｄａ、または約３００Ｄａ、または約３５０Ｄａ、または約４００Ｄａ、または約５００Ｄａ、または約１０００Ｄａ、または約１２５０Ｄａ、または約１５００Ｄａ、または約１７５０Ｄａ、または約２０００Ｄａ、または約３０００Ｄａ、または約４０００Ｄａ、または約５０００Ｄａであり得る。いくつかの実施態様では、第二のポリマーの分子量は、約５００Ｄａ〜約２０００Ｄａである。いくつかの実施態様では、第二のポリマーの分子量は、約７５０Ｄａである。
いくつかの実施態様では、疎水性部分は、第三のポリマーであり得る。疎水性部分として有用なポリマーは、ポリブタジエン、ポリスチレン、ポリアクリル酸塩、ポリメタクリル酸塩、ポリジアセチレン等の疎水性ポリマーを含む。いくつかの実施態様では、疎水性部分は、ポリブタジエンであり得る。いくつかの実施態様では、第三のポリマーは、約１０００Ｄａ〜約３０００Ｄａであり得る。いくつかの実施態様では、第三のポリマーは、約１１００Ｄａ〜約２６００Ｄａであり得る。いくつかの実施態様では、第三のポリマーは、約１０００Ｄａ〜約２０００Ｄａであり得る。
いくつかの実施態様では、疎水性部分は、脂質部分であり得る。本発明において有用な脂質部分は、１〜２０個長のアシル鎖、１〜１０個のアシル鎖、または１〜６個のアシル鎖、または１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアシル鎖を含む。脂質部分は、これらに限定されないが、カプリン酸（Ｃ１０）、ラウリン酸（Ｃ１２）、ミリスチン酸（Ｃ１４）、パルミチン酸（Ｃ１６）、パルミトレイン酸（Ｃ１６）、ステアリン酸（Ｃ１８）、イソステアリン酸（Ｃ１８）、オレイン酸（Ｃ１８）、バクセン酸（Ｃ１８）、リノール酸（Ｃ１８）、α−リノール酸（Ｃ１８）、γ−リノレン酸（Ｃ１８）、アラキジン酸（Ｃ２０）、ガドレイン酸（Ｃ２０）、アラキドン酸（Ｃ２０）、エイコサペンタエン酸（Ｃ２０）、ベヘン酸（Ｃ２２）、エルカ酸（Ｃ２２）、ドコサヘキサエン酸（Ｃ２２）、リグノセリン酸（Ｃ２４）及びヘキサコサン酸（Ｃ２６）を含む脂肪酸から調製され得る。
脂質部分における例示的なアシル基は、Ｃ10、Ｃ12、Ｃ14、Ｃ16、Ｃ18、またはＣ20アシル基等のＣ10~20アシル鎖を含む。いくつかの態様では、脂質部分は、少なくとも１つのＣ14アシル基、または少なくとも１つのＣ16アシル基を有する。脂質部分が、２つ以上のアシル基を含む場合、脂質部分は、さらに多数のアシル基の連結を提供する分岐リンカーを含む。本発明において有用な分岐リンカーは、これらに限定されないが、リシン、グルタミン酸、並びに他の分岐アミン及びカルボン酸を含む。いくつかの実施態様では、脂質部分は、１〜６個のＣ10~20アシル基を含む。脂質部分は、１、２、３、４、５または６個のＣ10~20アシル基を含み得る。いくつかの実施態様では、脂質部分は、１、２、または４個のＣ10~20アシル基を含む。いくつかの実施態様では、脂質部分は、１個のＣ10~20アシル基を含む。いくつかの実施態様では、脂質部分は、２個のＣ10~20アシル基を含む。
第二のポリマーが、第一のペプチドのＣ−末端アミノ酸残基の側鎖に結合する場合、Ｃ末端カルボン酸塩は、さらなる部分への結合に利用され得る。第一のペプチドのＣ−末端での部分は、これらに限定されないが、アミノ酸残基、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、診断用薬剤、治療用薬剤、及びポリマーを含み得る任意に有用な結合または標識部分であり得る。いくつかの態様では、本発明は、第一のペプチドのＣ−末端に共有結合した第二のペプチドを含む、上記のような複合体を提供する。第二のペプチドは、２〜約１００個または２〜約５０個、または２〜約２０個のアミノ酸等の任意の適切な数のアミノ酸を有し得る。いくつかの態様では、アミノ酸残基は、ＧＧＧ、ＨＨＨ、ＫＫ、ＥＥ、ＲＧＤ及びＡＹＳＳＧＡＰＰＭＰＰＦ、並びにその組み合わせであり得る。他の第二のペプチドは、本発明の複合体において有用である。或いは追加の部分は、第二のポリマーの鎖端で複合体に共有結合され得る。
いくつかの態様では、本発明は、上記のような複合体を提供し、ここでのペプチドは、配列番号１であり、第一のポリマーは、約２０００Ｄａの分子量を有するポリエチレングリコールであり、第二のポリマーは、約７５０Ｄａの分子量を有し、且つペプチドのＣ−末端残基に結合するポリエチレングリコールであり、そして疎水性部分は、リシン及び２つのＣ18アシル鎖を含む脂質部分である。
さらに本発明は、複数の複合体の自己集合から形成されるらせん束を提供する。らせん束は、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の複合体から形成され得る。いくつかの実施態様では、本発明は、本発明の２〜６個の複合体を有するらせん束を提供する。いくつかの実施態様では、らせん束は、３個の複合体を含む。いくつかの実施態様では、らせん束は、４個の複合体を含む。
さらに本発明は、疎水性部分が疎水性コアを有するミセル構造を形成し、且つらせん束頭部基がコアの外面にあるような、らせん束の自己集合から形成される粒子を提供する。粒子は、任意の適切な数の複合体を含み得る。いくつかの実施態様では、本発明は、本発明の約２０〜約２００個の複合体を有する粒子を提供する。粒子は、適切な大きさであり得る。例えば粒子は、約５ｎｍ〜約５００ｎｍの直径、または約５〜約１００ｎｍの直径、または約５ｎｍ〜約５０ｎｍの直径、または約５ｎｍ〜約２５ｎｍの直径であり得る。
本発明の粒子は、粒子の疎水性内部に積荷を含み得る。いくつかの実施態様では、粒子は、治療用薬剤、診断用薬剤、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、または他の有用な作用剤から選定される少なくとも１つの追加の作用剤を含む。治療用薬剤の例は、これらに限定されないが、アントラサイクリン（ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン等）、マクロライド（ラパマイシン、フジマイシン、ピメクロリムス等）アルキル化剤（テモゾロミド、プロカルバジン、アルトレタミン等）、タキサン、及びビンカ・アルカロイドを含む。診断用薬剤の例は、これらに限定されないが、発色団、蛍光色素分子、及び放射性核種を含む。本発明の複合体、らせん束及び粒子は、画像化及び操作目的のために、典型的に数ナノメートルの直径にある金ナノ粒子及び磁性ナノ粒子等の他の粒子と結合し得る。いくつかの実施態様では、本発明は、上記の粒子を提供し、ここでのそれぞれ追加の作用剤は、蛍光色素分子、放射性核種、アントラサイクリン、タキサン、及びマクロライドから独立して選定される。いくつかの実施態様では、それぞれの追加の作用剤は、ドキソルビシン、パクリタキセル、及びラパマイシンから独立して選定される。或いは追加の作用剤は、両親媒性複合体のペプチド成分、第一のポリマー成分、及び第二のポリマー成分の１つ、組み合わせ、または全てと共有結合、または非共有結合する。
いくつかの態様では、本発明は、本発明の約２０〜約２００個の複合体を有する粒子を提供する。それぞれの複合体は、配列番号１を有する第一のペプチド、約２０００Ｄａの分子量を有するポリエチレングリコールを含む第一のポリマー、ペプチドのＣ−末端残基に共有結合し、且つ約７５０Ｄａの分子量を有するポリエチレングリコールを含む第二のポリマー、並びにリシン及び２つのＣ18アシル鎖を含む脂質部分を有する疎水性部分を含む。さらに粒子は、ドキソルビシン、パクリタキセル、及びラパマイシンから選定される治療用薬剤を含む。
さらなる材料は、粒子中に導入され、混合ミセルを形成し得る。例えば混合ミセルは、適切な脂質化合物を含み得る。適切な脂質は、これらに限定されないが、脂肪、ワックス、ステロール、コレステロール、脂溶性ビタミン、モノグリセリド、ジグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、誘導化脂質等を含み得る。いくつかの実施態様では、適切な脂質は、両親媒性、中性、非陽イオン性、陰イオン性、陽イオン性、または疎水性脂質を含み得る。特定の実施態様では、脂質は、典型的にリン脂質及び／またはスフィンゴ脂質等の細胞膜中に存在するものを含み得る。適切なリン脂質は、これらに限定されないが、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、及びホスファチジルイノシトール（ＰＩ）を含む。非陽イオン性脂質は、これらに限定されないが、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミン ４-（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ＤＯＰＥ-ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６-Ｏ-モノメチル ＰＥ、１６-Ｏ-ジメチル ＰＥ、１８-１-トランス ＰＥ、１-ステアロイル-２-オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、１，２−ジエライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ｐｈｏｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（トランスＤＯＰＥ）、及びカルジオリピンを含む。
さらに脂質は、ＰＥＧ化脂質等の誘導化脂質を含み得る。ＰＥＧ化脂質は、一般に１つ以上のＰＥＧ鎖に共有結合的に共役する本明細書において発表する脂質部分を含む。ＰＥＧは、直鎖または分岐鎖であってよく、ここでの分岐ＰＥＧ分子は、中心コアから発せられるさらなるＰＥＧ分子を有してよく、及び／または多重のＰＥＧ分子は、ポリマー骨格に接合され得る。ＰＥＧは、低または高分子量のＰＥＧ、例えばＰＥＧ５００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ３４００、ＰＥＧ５０００、ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ９０００、ＰＥＧ１００００、ＰＥＧ２００００、またはＰＥＧ５００００を含めてよく、ここでの数、例えば５００は、平均分子量を示す。誘導化脂質は、例えばＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、コレステロール−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ−ポリグリセロール、または当業界において一般に周知である他の誘導体を含み得る。
したがって、本発明のいくつかの実施態様は、さらにＰＥＧ化脂質を含む、上記の粒子を提供する。いくつかの態様では、ペグ化脂質は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００であり得る。任意の適量のＰＥＧ化脂質は、混合ミセルを形成するために使用され得る。一般にペプチド複合体に対するＰＥＧ化脂質の比率は、重量で約０．１：１〜約１０：１である。らせん束複合体に対するＰＥＧ化脂質の比率は、重量で例えば約０．１：１、０．５：１、１：１、２．５：１、５：１、または１０：１であり得る。ＰＥＧ化脂質の他の量は、ＰＥＧ化脂質自体の構造、及びペプチド複合体の同一性に応じて、本発明の粒子において有用であり得る。いくつかの実施態様では、粒子は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、及び上記のペプチド複合体を、重量で約１：１の比率で含み得る。
ＩＶ．ナノ粒子の調製方法
本発明のナノ粒子は、当業者に公知の任意の適切な方法により調製され得る。例えばナノ粒子は、最初に適切な溶媒中に約１ｎＭ〜約１Ｍ、または約１μＭ〜約１００ｍＭ、または約１ｍＭ〜約１００ｍＭの任意の濃度で複合体を溶かすことにより調製され得る。或いは、複合体は、溶液の約０．１〜約５０重量％、または約１〜約５０重量％、または約１〜約２５重量％の濃度で溶解され得る。複合体は、自己集合して本発明のらせん束形成する。その後にらせん束は、自己集合して粒子を形成する。いくつかの実施態様では、本発明は、複合体を本発明の粒子に自己集合させるのに十分な条件下で、本発明の複数の複合体を維持することにより、本発明の粒子を形成する方法を提供する。いくつかの実施態様では、複合体は、約１ｎＭ〜約１Ｍの濃度である。いくつかの実施態様では、複合体は、約１μＭ〜約１Ｍの濃度である。いくつかの実施態様では、複合体は、約１μＭ〜約１１００ｍＭの濃度である。いくつかの実施態様では、複合体は、約１μＭ〜約１ｍＭの濃度である。
さらに本発明の方法は、上記の混合ミセルを形成するために使用され得る。したがって、ＰＥＧ化脂質等のさらなる化合物は、ペプチド複合体との共集合に使用され得る。いくつかの実施態様では、本発明は、複合体を粒子に自己集合させるのに十分な条件下で、複数の複合体を維持し、さらにＰＥＧ化脂質を、複数の複合体に添加することにより、粒子を形成する方法を提供する。
水性溶媒中における本発明の複合体は、親水性部分がナノキャリアの外側に向かって配向し、且つ疎水性部分が内側に向かって配向するように自己集合し、それによりミセルを形成し得る。非極性溶媒が使用される場合、親水性部分がナノキャリアの内側に向かって配向し、且つ疎水性部分がナノキャリアの外側に向かって配向する逆のミセルが形成され得る。
Ｖ．薬物送達方法
いくつかの実施態様では、本発明は、対象に粒子を投与することを含んで成る、対象に診断用または治療用薬剤を送達するための方法を提供する。いくつかの実施態様では、粒子は、診断用または治療用薬剤をカプセル封入する。他の実施態様では、診断用または治療用薬剤は、本発明の粒子に共役または結合する。したがって、粒子は、約２０〜約２００個の本発明の複合体、及び送達される診断用または治療用薬剤を含む。いくつかの実施態様では、治療用薬剤は、ドキソルビシン、テモゾロマイド及びラパマイシンから成る群から選定される。
治療用薬剤の送達は、薬物充填ミセルが、特定の器官または腫瘍等の対象において所望される部位に選択的に蓄積するように導かれ得る。いくつかの場合では、標的部位でのミセル蓄積は、がん組織等の特定の組織の浸透性及び保持特徴を増強し得るはずである。かかる方法における蓄積は、一部分においてミセルの大きさから生じ得るし、また特別な標的官能性を要求しなくてよい。さらに他の場合では、本発明のミセルは、上記のような活性標的のリガンドを含み得る。さらに標的送達は、所望される部位に向かう薬物充填ミセルを投与することにより達成され得る。いくつかの態様では、治療用薬剤の送達は、腫瘍内注入を介して本発明の粒子を投与することを含み得る。
本発明のナノ粒子は、標的化、または非標的化方法おいて、任意の適切な積荷を送達するために使用され得る。適切な積荷は、これらに限定されないが、ワクチン、ＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸、ペプチド、タンパク質、造影剤、及び薬物を含む。さらに本発明のナノ粒子は、遺伝子治療、対象への発現または発現可能な核酸の投与にも有用である。ナノキャリア積荷は、ナノキャリア中にカプセル封入され得る。
標的作用剤
一般に本発明の標的作用剤は、器官、組織、細胞、細胞外マトリクス、または細胞内領域と関連付けられる標的等の、注目の任意の標的と関連付けられ得る。特定の実施態様では、標的は、がん症状等の特定の病状と関連付けられ得る。いくつかの実施態様では、標的成分は、受容体等の１つの標的のみに特異的であり得る。適切な標的は、これらに限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸、または修飾されたその誘導体を含み得る。さらに適切な標的は、これらに限定されないが、細胞外タンパク質等のタンパク質、受容体、細胞表面受容体、腫瘍マーカー、膜貫通タンパク質、酵素、または抗体を含み得る。適切な標的は、例えば細胞の表面上に存在し得る単糖、二糖、または多糖等の炭水化物を含み得る。
特定の実施態様では、標的作用剤は、標的リガンド、標的リガンドの小分子模倣物、または特定の標的に特異的な抗体もしくは抗体フラグメントを含み得る。いくつかの態様では、標的作用剤は、葉酸誘導体、Ｂ−１２誘導体、インテグリンＲＧＤペプチド、ＮＧＲ誘導体、ソマトスタチン誘導体またはソマトスタチン受容体に結合するペプチド、例えばオクトレオチド及びオクトレオタート（ｏｃｔｒｅｏｔａｔｅ）等をさらに含み得る。さらに本発明の標的作用剤は、アプタマーを含み得る。アプタマーは、注目の標的に関連付けられ、または結合するように設計され得る。アプタマーは、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、及／またはペプチドを含んで成ることができ、且つアプタマーの特定の観点は、当業界において周知である（例えばＫｌｕｓｓｍａｎ, Ｓ編、Ｔｈｅ Ａｐｔａｍｅｒ Ｈａｎｄｂｏｏｋ, Ｗｉｌｅｙ-ＶＣＨ （２００６）； Ｎｉｓｓｅｎｂａｕｍ, Ｅ.Ｔ., Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ. ２６（８）： ４４２〜４４９（２００８）を参照）。
治療用薬剤
本発明において使用される治療用薬剤または作用剤は、対象における症状の処置に向けた任意の作用剤を含み得る。一般に当業界において公知である任意の治療用薬剤は、米国薬局方（Ｕ．Ｓ．Ｐ）、Ｇｏｏｄｍａｎ及びＧｉｌｍａｎのＴｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ, 第１０編、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ, ２００１； Ｋａｔｚｕｎｇ編、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ, ＭｃＧｒａｗ-Ｈｉｌｌ/Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ,第８編、Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２１, ２０００；Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ (Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ； 及び／またはＴｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ, 第１８編、２００６, Ｂｅｅｒｓ及びＢｅｒｋｏｗ編、Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ；或いは動物モデルでは、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第９編、Ｋａｈｎ編, Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ, ２００５に挙げられた作用剤を限定なく含めて使用されてよく；その全ては、参照により本明細書中に含まれる。
治療用薬剤は、処置されることを所望される疾患のタイプに応じて選定され得る。例えば上皮性悪性腫瘍、非上皮性悪性腫瘍、白血病、リンパ種、骨髄腫、及び中枢神経系がん、並びに固形腫瘍及び混合腫瘍等の特定のタイプのがんまたは腫瘍は、同一、または場合により異なる治療用薬剤の投与を伴い得る。特定の実施態様では、治療用薬剤は、送達されて、対象におけるがんの症状を処置し、またはがんの症状に影響を及ぼすことができ、且つアルキル化剤、代謝拮抗剤、アントラサイクリン、アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、及び他の抗がん剤等の化学療法剤を含み得る。いくつかの実施態様では、作用剤は、アンチセンス剤、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及び／またはｓｈＲＮＡ剤を含み得る。
治療用薬剤は、これらに限定されないが、アバスチン、ドキソルビシン、テモゾロミド、ラパマイシン、プラチン（シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチン等）、シチジン、アザシチジン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ゲムシタビン、カペシタビン、カンプトセシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ビンクリスチン、トポテカンまたはタキサン（パクリタキセル及びドセタキセル等）を含む抗がん剤または細胞毒性剤を含み得る。
さらに本発明の治療用薬剤は、治療適用において使用するための放射性核種を含む。例えば、111Ｉｎ等のオージェ電子のエミッタは、ジエチレントリアミン５酢酸（ＤＴＰＡ）または１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１,４,７,１０−４酢酸（ＤＯＴＡ）等のキレートと組み合され、且つナノ粒子中に含められて、処置に使用され得る。他の適切な放射性核種及び／または放射性核種−キレート組み合わせは、これらに限定されないが、ＤＯＴＡを伴うβ放射性核種 （177Ｌｕ、153Ｓｍ、88/90Ｙ）、64Ｃｕ−ＴＥＴＡ、188/186Ｒｅ（ＣＯ）3−ＩＤＡ；188/186Ｒｅ（ＣＯ）トリアミン(環式または線形)、188/186Ｒｅ（ＣＯ）3 -Ｅｎｐｙ２、及び188/186Ｒｅ（ＣＯ）3−ＤＴＰＡを含み得る。
診断用薬剤
本発明において用いられる診断用薬剤は、例えば以下の参照において提供されるような、当業界において公知の任意の診断用薬剤を含み得る：Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ等、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ、第５編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２００４）；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ,Ｖ.Ｐ.編、Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆＩｍａｇｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｖａｌｌａｂｈａｊｏｓｕｌａ, Ｓ., Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ： Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｆｏｒ ＰＥＴ ａｎｄ ＳＰＥＣＴ, Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２００９）。診断用薬剤は、多様な方法により、これらに限定されないが、γ線放射、放射活性、音波発生、光学、蛍光、吸収、磁気または断層撮影法シグナルを含む検出可能なシグナルを提供及び／または増強する作用剤として含まれることにより検出され得る。診断用薬剤を画像化するための技術は、これらに限定されないが、単光子放出コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、光学画像化、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）、Ｘ線画像化、γ線画像化等を含み得る。
いくつかの実施態様では、診断用薬剤は、多様な診断用画像化技術に使用される金属イオンに結合するキレート剤を含み得る。例示的なキレート剤は、これらに限定されないが、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、［４−（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカ−１−イル）メチル］安息香酸（ＣＰＴＡ）、シクロヘキサンジアミン４酢酸（ＣＤＴＡ）、エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）４酢酸（ＥＧＴＡ）、ジエチレントリアミン５酢酸（ＤＴＰＡ）、クエン酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン３酢酸（ＨＥＤＴＡ）、イミノ2酢酸（ＩＤＡ）、トリエチレンテトラアミン６酢酸（ＴＴＨＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１,４,７,１０−テトラ（メチレンホスホン酸）（ＤＯＴＰ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロドデカン−１,４,８,１１−４酢酸（ＴＥＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１,４,７,１０−４酢酸（ＤＯＴＡ）、及びその誘導体を含む。
放射性同位体は、本発明において発表されるいくつかの診断用薬剤に導入されてよく、且つγ線、陽電子、β及びα粒子、並びにＸ線を放つ放射性核種を含み得る。適切な放射性核種は、これらに限定されないが、225Ａｃ、72Ａｓ、211Ａｔ、11Ｂ、128Ｂａ、212Ｂｉ、75Ｂｒ、77Ｂｒ、14Ｃ、109Ｃｄ、62Ｃｕ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、18Ｆ、67Ｇａ、68Ｇａ、3Ｈ、123Ｉ、125Ｉ、130Ｉ、131Ｉ、111Ｉｎ、177Ｌｕ、13Ｎ、15Ｏ、32Ｐ、33Ｐ、212Ｐｂ、103Ｐｄ、186Ｒe、188Ｒｅ、47Ｓｃ、153Ｓｍ、89Ｓｒ、99mＴｃ、88Ｙ及び90Ｙを含む。特定の態様では、放射性作用剤は、111Ｉｎ−ＤＴＰＡ、99mTc（ＣＯ）3−ＤＴＰＡ、99mTc（ＣＯ）3−ＥＮＰｙ２、62/64/67Ｃｕ−ＴＥＴＡ、99mTc（ＣＯ）3−ＩＤＡ、及び99mTc（ＣＯ）3トリアミン（環式または線形）を含み得る。他の実施態様では、作用剤は、ＤＯＴＡ、及び111Ｉｎ、177Ｌｕ、153Ｓｍ、88/90Ｙ、62/64/67Ｃｕ、または67/68Ｇａを伴うその多様な類似物を含み得る。いくつかの実施態様では、ミセルは、例えば以下の参照において提供されるような、ＤＴＰＡ−脂質等のキレート基の導入により放射性標識され得る：Ｐｈｉｌｌｉｐｓ等、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１（１）：６９〜８３（２００８）；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ, Ｖ.Ｐ. ＆ Ｗｅｉｓｓｉｇ, Ｖ編. Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ第２編：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ. Ｐｒｅｓｓ （２００３）；Ｅｌｂａｙｏｕｍｉ, Ｔ.Ａ. ＆ Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ, Ｖ.Ｐ., Ｅｕｒ. Ｊ. Ｎｕｃｌ. Ｍｅｄ. Ｍｏｌ. Ｉｍａｇｉｎｇ ３３：１１９６〜１２０５（２００６）；Ｍｏｕｇｉｎ−Ｄｅｇｒａｅｆ, Ｍ等、Ｉｎｔ’ｌ Ｊ. Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ３４４：１１０〜１１７（２００７）。
他の実施態様では、診断用薬剤は、蛍光作用剤、リン光性作用剤、化学発光作用剤等の光学作用剤を含み得る。多くの作用剤（例えば染料、プロ―ブ、標識、または指示薬）は、当業界において公知であり、また本発明において使用され得る（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ, Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ−Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ,第１０編（２００５)を参照）。蛍光作用剤は、多様な有機及び／または無機小分子、或いは多様な蛍光タンパク質及びその誘導体を含み得る。例えば蛍光作用剤は、これらに限定されないが、シアニン、フタロシアニン、ポルフィリン、インドシアニン、ローダミン、フェノキサジン、フェニルキサンテン、フェノチアジン、フェノセレナジン、フルオレセイン、ベンゾポルフィリン、スクアライン、ジピロロピリミドン、テトラセン、キノリン、ピラジン、コリン、クロコニウム、アクリドン、フェナントリジン、ローダミン、アクリジン、アントラキノン、カルコゲノピリリウム類似物、クロリン、ナフタロシアニン、メチン染料、インドレニウム染料、アゾ化合物、アズレン、アザアズレン、トリフェニルメタン染料、インドール、ベンゾインドール、インドカルボシアニン、ベンゾインドカルボシアニン、及び４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセンの一般構造を有するＢＯＤＩＰＹ（商標）誘導体、並びに／或いは任意のこれらの複合体及び／または誘導体を含み得る。使用され得る他の作用剤は、これらに限定されないが、例えばフルオレセイン、フルオレセイン−ポリアスパラギン酸複合体、フルオレセイン−ポリグルタミン酸複合体、フルオレセイン−ポリアルギニン複合体、インドシアニングリーン、インドシアニン−ドデカアスパラギン酸複合体、インドシアニン−ポリアスパラギン酸複合体、イソスルファンブルー、インドール２硫酸塩、ベンゾインドール２硫酸塩、ビス（エチルカルボニルメチル）インドシアニン、ビス（ペンチルカルボキシメチル）インドシアニン、ポリヒドロキシインドールスルホン酸塩、ポリヒドロキシベンゾインドールスルホン酸塩、硬質ヘテロ原子インドールスルホン酸塩、インドシアニンビスプロパン酸、インドシアニンビスヘキサン酸、３，６−ジシアノ−２,５−［（Ｎ，Ｎ,Ｎ’,Ｎ’−トテラキス（カルボキシメチル）アミノ］ピラジン、３，６−［（Ｎ，Ｎ,Ｎ’,Ｎ’−テトラキス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］ピラジン−２,５−ジカルボン酸、３，６−ビス（Ｎ−アザテジノ）ピラジン−２,５−ジカルボン酸、３，６−ビス（Ｎ−モルホリノ）ピラジン−２,５−ジカルボン酸、３，６−ビス（Ｎ−ピペラジノ）ピラジン−２,５−ジカルボン酸、３，６−ビス（Ｎ−チオモルホリノ）ピラジン−２,５−ジカルボン酸、３，６−ビス（Ｎ−チオモルホリノ）ピラジン−２,５−ジカルボン酸Ｓ−オキシド、２，５−ジシアノ−３,６−ビス（Ｎ−チオモルホリノ）ピラジン Ｓ,Ｓ−ジオキシド、インドカルボシアニン４スルホン酸塩、クロロインドカルボシアニン、及び３，６−ジアミノピラジン−２，５−ジカルボン酸を含む。
通常の当業者は、使用される特定の光学作用剤が、励起のために使用される波長、皮膚組織表面下の深さ、及び一般に当業界において周知である他の因子に依存し得ることを理解するだろう。例えば光学作用剤に最適な吸収または励起最高値は、用いられる作用剤に応じて変えられ得るが、一般に本発明の光学作用剤は、電磁スペクトルの紫外線（ＵＶ）、可視、または赤外線（ＩＲ）の範囲における光により吸収または励起されるだろう。画像化には、ＩＲ（〜７００〜９００ｎｍ、例えばインドシアニン）付近で吸収及び放射される染料が好適である。内視鏡的な方法を用いる局所可視化のためには、可視領域で吸収される任意の染料が適切である。
さらに他の実施態様では、診断用薬剤は、これらに限定されないが、例えばヨウ素に基づくＸ線造影剤、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）、ガドリニウムまたはマンガンの複合体等を含む、一般に当業界において周知である磁気共鳴（ＭＲ）及びＸ線造影剤を含み得る（例えばＡｒｍｓｔｒｏｎｇ等、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ、第５編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２００４）を参照）。いくつかの態様では、診断用薬剤は、磁気共鳴（ＭＲ）造影剤を含み得る。例示的な磁気共鳴作用剤は、これらに限定されないが、常磁性作用剤、超常磁性作用剤等を含む。例示的な常磁性作用剤は、これらに限定されないが、ガドペンテト酸、ガドテル酸、ガドジアミド、ガドリニウム、ガドテリドール、マンガホジピール、ガドベルセタミド、クエン酸鉄アンモニウム、ガドベン酸、ガドブトロール、またはガドキセト酸を含み得る。超常磁性作用剤は、これらに限定されないが、超常磁性酸化鉄及びフェリステンを含み得る。特定の実施態様では、診断用薬剤は、例えば以下の参照において提供されるようなＸ線造影剤を含み得る：Ｈ.Ｓ Ｔｈｏｍｓｅｎ, Ｒ.Ｎ. Ｍｕｌｌｅｒ及びＲ.Ｆ. Ｍａｔｔｒｅｙ編,Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｏｎｔｒａｓｔ Ｍｅｄｉａ（ベルリン：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ, １９９９）; Ｐ. Ｄａｗｓｏｎ, Ｄ. Ｃｏｓｇｒｏｖｅ及びＲ. Ｇｒａｉｎｇｅｒ編, Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｏｎｔｒａｓｔ Ｍｅｄｉａ（ＩＳＩＳ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ １９９９）； Tｏｒｃｈｉｌｉｎ, Ｖ.Ｐ., Ｃｕｒｒ. Ｐｈａｒｍ. Ｂｉｏｔｅｃｈ. １：１８３〜２１５ （２０００）； Ｂｏｇｄａｎｏｖ, Ａ.Ａ.等., Ａｄｖ. Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ. Ｒｅｖ. ３７：２７９〜２９３ （１９９９）； Ｓａｃｈｓｅ, Ａ等、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ ３２（１）：４４〜５０ （１９９７）。例示的なＸ線造影剤は、これらに限定されないが、イオパミドール、イオメプロール、イオヘキソール、イオペントール、イオプロミド、イオシミド、イオベルソール、イオトロラン、イオタスル、イオジキサノール、イオデシモール、イオグルカミド、イオグルニド、イオグラミド、イオサルコール、イオキシラン、イオパミロン、メトリザミド、イオビトリドール及びイオシメノールを含む。特定の態様では、Ｘ線造影剤は、イオパミドール、イオメプロール、イオプロミド、イオヘキソール、イオペントール、イオベルソール、イオビトリドール、イオジキサノール、イオトロラン及びイオシメノールを含み得る。
遺伝子治療
さらに本発明のナノ粒子は、任意の発現または発現可能な核酸配列を、遺伝子治療または酢酸ワクチン接種のための細胞に送達するために使用され得る。細胞は、送達の間にｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにあり得る。核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）等の任意の適切な核酸であり得る。さらに任意の適切な細胞は、核酸の送達に使用され得る。
遺伝子治療は、単一遺伝子の欠損、または多数遺伝子の欠損により引き起こされるもの、宿主細胞中の遺伝子を補い、または変化させることにより引き起こされるもの等の多様な疾患を処置するために使用され、それにより疾患が処置される。典型的に遺伝子治療は、突然変異遺伝子を置き換えることを伴うが、さらに遺伝子突然変異を修正すること、または治療用タンパク質をコードするＤＮＡを提供することも含み得る。さらに遺伝子治療は、効率的に突然変異遺伝子を不活性化する、アンチセンス療法として公知でもある突然変異遺伝子により生産された特定の伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に結合する核酸の送達を含む。遺伝子及びアンチセンス療法を介して処置され得る代表的な疾患は、これらに限定されないが、嚢胞性線維症、血友病、筋ジストロフィー、鎌状赤血球貧血、がん、糖尿病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、喘息及び関節炎等の炎症性疾患、並びに色覚異常を含む。
遺伝子治療の方法の一般論は、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ等、１９９３, Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８〜５０５；Ｗｕ及びＷｕ, １９９１, Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７〜９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ, １９９３, Ａｎｎ. Ｒｅｖ. Ｐｈａｒｍａｃｏｌ. Ｔｏｘｉｃｏｌ. ３２：５７３〜５９６； Ｍｕｌｌｉｇａｎ, １９９３, Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６〜９３２；並びにＭｏｒｇａｎ及びＡｎｄｅｒｓｏｎ, １９９３, Ａｎｎ. Ｒｅｖ. Ｂｉｏｃｈｅｍ. ６２：１９１〜２１７； Ｍａｙ, １９９３, ＴＩＢＴＥＣＨ １１（５）：１５５〜２１５を参照する。本発明において使用され得る組み換えＤＮＡ技術の業界において一般に公知である方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ等（編）、１９９３、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ, ＮＹ；及びＫｒｉｅｇｌｅｒ, １９９０, Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ, Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ, Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ, ＮＹにおいて発表されている。
製剤及び投与
ナノキャリアが投与され、上記の積荷を送達する場合、ナノキャリアは、任意の適切な担体、すなわち生理学的に許容され得る担体と共に、任意の適切な組成物中にあり得る。本明細書において使用される用語「キャリア」は、典型的に治療用薬剤等の薬物の希釈剤または賦形剤として使用される不活性物質について言及する。さらに用語は、典型的に組成物に粘着性を与える不活性物質を包含する。典型的に生理学的に許容される得る担体は、液体で存在する。液体の担体の例は、生理食塩水、リン酸緩衝液、標準緩衝食塩水、水、緩衝水、塩類、グリシン、高められた安定性を提供する糖タンパク質（例えばアルブミン、リポタンパク質、グロブリン）等を含む。生理学的に許容され得る担体は、投与される特定の組成物により、及び組成物を投与するために用いられる特定の方法によりある程度決まるので、本発明の医薬組成物には、多種多様な製剤が存在する（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７編、１９８９を参照）。
投与に先立ち、ナノキャリア組成物は、従来型の、周知の殺菌技術により殺菌されてよく、または殺菌条件下で生産され得る。水溶液は、無菌条件下で使用するためにパッケージされ、またはろ過され、そして凍結乾燥されてよく、凍結乾燥された調製品は、投与に先立ち、殺菌水溶液と組み合わされる。組成物は、生理学的条件に近づけることが要求されるので、ｐＨ調整及び緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤等、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウリン酸塩、及びトリエタノールアミンオレイン酸塩等の医薬的に許容され得る補助物質を含み得る。さらに糖は、凍結乾燥組成物のための安定剤のように、組成物を安定させるために含み得る。
ナノキャリア組成物は、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤に成され得る（すなわちそれらが「噴霧」され得る）。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の加圧を許容し得る推進剤中に置かれ得る。
直腸投与に適する製剤は、例えば坐剤基剤と共に有効量のパッケージされた組成物を含む坐剤を含む。適切な坐剤基剤は、天然もしくは合成トリグリセリド、またはパラフィン炭化水素を含む。さらに選定組成物と塩基の組み合わせを含む、例えば液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール、及びパラフィン炭化水素を含むゼラチン直腸カプセルも使用可能である。
例えば関節内（関節中）、静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮内、腹腔内、及び皮下経路によるような非経口投与に適する製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び意図された受容者の血液と等張な製剤にする溶質、並びに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び防腐剤を含み得る水性及び非水性殺菌懸濁剤を含み得る水性及び非水性の等張殺菌注入溶液を含む。さらに注入溶液および懸濁剤は、殺菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製され得る。本発明の実施において、組成物は、例えば静脈内注入により、局所的に、腹腔内に、膀胱内に、または髄腔内に投与され得る。静脈内投与を含む非経口投与は、好適な投与方法である。
さらに本発明の複合体、粒子、及び製剤は、注入カテーテルの先端で確立された圧力勾配を用いて、脳細胞間のスペース（すなわち細胞外側のスペース）を通り抜ける注入を押し進める大きな流れを開始する技術である、対流強化送達法（ＣＥＤ）により、脳の領域（線条体または脳腫瘍等）に直接的に注入され得る。注入ポンプまたは浸透圧ポンプは、ＣＥＤに使用され得る。ＣＥＤデバイスを用いれば、本発明の複合体、粒子、及び組成物は、脳の大きな領域にわたる多くの細胞に送達され得る。ＣＥＤは、例えば米国特許第６，９５３，５７５号；第７，５３４，６１３号；及び第８，３０９，３５５号において発表されている。
医薬調製品は、好適には単位投与形態にある。かかる形態における調製品は、適量の活性成分、例えばナノキャリア組成物を含む単位投与に細分される。単位投与形態は、パッケージされた調製品であってよく、パッケージは、別個の量の調製品を含む。ナノキャリア組成物の製剤は、アンプル及びバイアル等の単位投与または複数投与の密閉容器において提示され得る。さらに所望されるならば、組成物は、他の適合する治療用薬剤を含み得る。
治療上の使用では、上記のような治療用及び／または診断用薬剤を含むナノキャリア組成物は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇの一日初期投与量で投与され得る。約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲の一日用量が使用され得る。しかしながら投与量は、患者の要求、処置される症状の重篤性、及び用いられるナノキャリア組成物に応じて変えられ得る。例えば投与量は、特定の患者において診断されたがんのタイプ及び進行度を考慮して、経験的に決定され得る。本発明の文脈において患者に投与される用量とは、患者における有益な治療的反応に、長い時間をかけて影響を及ぼすのに十分なものであるだろう。さらに用量の大きさは、特定の患者における特定のナノキャリア組成物の投与に付随する任意の有害な副作用の存在、性質、及び程度により決定されるだろう。特定の状況に対する適切な投与量の決定は、当業者の技能の範囲内にある。一般に処置は、ナノキャリア組成物の最適用量未満であるより少ない投与量から開始される。その後に投与量は、その状況下で最適な効果に達するまで、少しずつ増量される。便宜上、総一日投与量は、分割され、また所望されるならば、一日の間に分割して投与され得る。
ナノキャリアの充填
診断用及び治療用薬剤の充填は、例えば以下の参照において開示されるような当業界において公知の多様な方法により実施され得る：ｄｅ Ｖｉｌｌｉｅｒｓ, Ｍ. Ｍ.等編, Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ, Ｓｐｒｉｎｇｅｒ （２００９）；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ, Ｇ.編, Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ ｏｆ ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｉｎｔｏ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ, ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ （２００６）。いくつかの実施態様では、１つ以上の治療用薬剤は、ナノキャリア中に充填され得る。ナノキャリアの充填は、例えば能動的または受動的な方法において実施され得る。例えば治療用薬剤がナノキャリア中にカプセル封入されるように、治療用薬剤は、ナノキャリアの自己集合工程の間に、溶液中に含められ得る。さらに特定の態様では、治療用薬剤は、ラメラ層中に埋め込まれ得る。他の態様では、治療用薬剤は、ナノキャリア中に能動的に充填され得る。例えばナノキャリアは、エレクトロポレーション等の条件にさらされてよく、ここでのラメラ膜は、治療用薬剤を含む溶液に浸透できるようにされることにより、治療用薬剤をリポソームの内部体積中に侵入できるようにする。
さらに診断用及び治療用薬剤は、ミセル内部、またはミセルのラメラ層中のナノキャリアの表面に共有結合、またはイオン結合し得る。
ＶＩ．疾患の処置方法
いくつかの態様では、本発明は、疾患を伴う対象を処置するための方法を提供する。方法は、治療有効量の粒子を対象に投与することを含む。粒子は、本発明の約２０〜約２００個の複合体、及び治療用薬剤を含む。これにより疾患は処置される。
任意の適切な疾患は、本発明の複合体及び粒子を用いて治療され得る。代表的な疾患は、特にがん及びパーキンソン病を含む。白血病、リンパ腫、皮膚がん（メラノーマ、基底細胞上皮性悪性腫瘍、及び扁平上皮悪性腫瘍を含む）、頭及び首の上皮性悪性腫瘍、肺がん（扁平上皮、または類表皮の上皮性悪性腫瘍、小細胞上皮性悪性腫瘍、腺上皮性悪性腫瘍、及び大細胞上皮性悪性腫瘍を含む）、乳がん、消化管がん、甲状腺の悪性腫瘍、骨及び軟組織の非上皮性悪性腫瘍、卵巣がん、卵管の上皮性悪性腫瘍、子宮がん、子宮頸がん、前立腺上皮性悪性腫瘍、精巣がん、膀胱がん、腎細胞上皮性悪性腫瘍、膵臓がん、及び肝細胞がんを含むがんは、本発明の方法を用いる処置に期待される。いくつかの実施態様では、本発明は、固形腫瘍により特徴付けられるがんを伴う対象を処置するための方法を提供する。いくつかの実施態様では、疾患は、がん及びパーキンソン病から成る群から選定される。いくつかの実施態様では、がんは、多形性膠芽腫である。
いくつかの態様では、本発明は、脳腫瘍を伴う対象を処置するための方法を提供する。脳腫瘍は、神経膠腫、骨髄腫、下垂体腺腫、及び神経鞘腫瘍を含む。いくつかの実施態様では、脳腫瘍は、多形性膠芽腫である。多形性膠芽腫は、巨細胞膠芽腫及び神経膠肉腫を含む変異体を示す。
本発明の粒子は、これらに限定されないが、化学療法及び放射線治療を含む疾患処置の他の公知の方法と結合で、または同時に使用され得る。任意の適切な治療用薬剤は、本発明の複合体及び粒子の組み合わせにおいて有用である。いくつかの実施態様では、治療用薬剤は、ドキソルビシン、テモゾロミド、及びラパマイシンから成る群から選定される。他の実施態様では、治療用薬剤は、ドキソルビシンである。
ＶＩＩ．実施例
実施例１：ビス−ポリマー脂質−ペプチド複合体の合成
材料：Ｆｍｏｃ−保護アミノ酸、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェイト（ＨＢＴＵ）、２−（６−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１,１,３,３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェイト（ＨＣＴＵ）は、ＥＭＤバイオサイエンスから購入し、そしてさらなる精製をせずに使用した。Ｆｍｏｃ−保護アミノ酸の側鎖保護基は、以下の通りであった：Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）。さらにステアリン酸とペプチドとの複合体のために、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを使用し、そしてリンカー、Ｆｍｏｃ−６−Ａｈｘ−ＯＨ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を、ペプチドとアルキル尾部の間に付加した。ペプチド合成等級ジエチルプロピルアミン（ＤＩＰＥＡ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）、ジエチルエーテル、ＨＰＬＣ等級有機溶媒ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、アセトニトリル及びイソプロパノールは、Ｆｉｓｈｅｒから購入し、そしてさらなる精製をせずに使用した。ピペリジン、ステアリン酸及びドキソルビシンは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＰＥＧ（２０００）−マレイミド及びＰＥＧ（７５０）−ＣＯＯＨエステルは、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅから購入した。陰性染色試薬リンタングステン酸は、Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａから購入し、そしてＤＩ水中の２重量％のストック溶液として調製した。
材料合成。「１ｃｏｉ」（ＥＶＥＡＬＥＫＫＶＡＡＬＥＣＫＶＱＡＬＥＫＫＶＥＡＬＥＨＧＷ）は、新たに設計された３−らせん束ペプチドであり、またＰＥＧ−ＰＡＬ樹脂（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上の標準９−フルオレニルメチルカルバメート（Ｆｍｏｃ）保護化学、典型的に０．０５ｍｍｏｌスケールを用いて、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｐｒｅｌｕｄｅ固相シンセサイザーにおいて合成した。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）をＮ−末端に付加し、ステアリン酸分子のペプチドのＮ−末端へのカップリングを可能にした。ＰＥＧ７５０によりペプチドのＣ−末端を修飾するために、トリグリシンスペーサー及びＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨをＣ−末端でカップリングした。ＤＣＭ中のＰｄ（ＰＰｈ3）4触媒、及びラジカル捕獲剤ＰｈＳｉＨ3を利用することにより、Ａｌｌｏｃ基を選択的に除去した。反応を５回繰り返した。得られた遊離アミノ基のリシンを、ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ化学を用いてカルボキシ末端化ＰＥＧ７５０を共役させるために利用した。室温で、２４時間カップリング反応を実施し、そして２回繰り返した。その後に標準手順を用いて、ペプチドを樹脂から開裂させた。位置１４でのシステインは、分子量２０００ｇ／ｍｏｌのマレイミド−官能化ＰＥＧの、中央のペプチド配列への部位特異的カップリングを促進する。ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０のＣ−末端のシステインは、ＰＥＴ画像化のために、ペプチド上への６−ＢＡＴ−マレイミドの共役を可能にさせる。
逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）。ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、Ｃ４カラム（Ｖｙｄａｃカラム２２ｍｍ×２５０ｍｍ）上で、両親媒性複合体を精製した。流量は、分取処理で１０ｍＬ／分であり、また複合体を、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で注入した。溶出を、ダイオードアレイ検出器により、２２０ｎｍ及び２８０ｎｍの波長で観測した。溶媒Ａが水と０．１％（ｖ／ｖ）のＴＦＡから成り、且つ溶媒Ｂがイソプロパノールと０．１％（ｖ／ｖ）のＴＦＡから成る場合に、線形のＡＢ勾配により複合体を溶出した。〜８５％Ｂでの両親媒性物質の典型的な溶出により、３０分かけて３０〜１００％Ｂの線形勾配を用いた。精製収率は、〜３０％であった。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光分析。ペプチドの同一性及び純度は、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸マトリクスを用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により検証した。Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ Ｐｒｏにおいて、質量スペクトルを記録した。
結果及び考察：両親媒性ペプチド−ポリマー設計及び合成。両親媒性物質を図１に図式的に示す。ＰＥＧ鎖が３−らせん束形成ペプチド（タンパク質データバンクコード「１ｃｏｉ」）の中央に連結される場合に、頭部基は、新規に設計されたペプチド−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）複合体から構成される。２つのＣ１８アシル鎖を、両親媒性を導入するためにペプチドとアルキル尾部の間に挿入された（６）−アミノ−ヘキサン酸リンカーを有するペプチドＮ−末端で連結した。他のＰＥＧ鎖は、ペプチドＣ−末端に連結される。得られる両親媒性物質は、「ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０」と呼ばれ；丸括弧中の用語ＰＥＧ２Ｋ（またはＰ２Ｋ）は、ペプチドの中央に共役する２０００ＤａのＰＥＧ鎖について言及し、一方でＰＥＧ７５０（またはＰ７５０）は、ペプチドＣ−末端に共役する７５０ＤａのＰＥＧ鎖について言及する。さらにビス−ポリマー複合体の名前は、Ｎ−末端でのｄＣ１８脂質、ペプチドの中央に共役したＰＥＧ２ｋ、及びＣ−末端に共役したＰＥＧ７５０を伴う１ｃｏｉペプチドを有するビス−ポリマー複合体について言及する場合、「ｄＣ１８−Ｐ７５０」と略すことができる。Ｃ−末端ポリマーが存在しない複合体は、「ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）」等の標識を用いることについて言及される。らせん束外側におけるペプチドとＰＥＧのコンプレッションの間の分子間相互作用は、サブユニット脱離のための活性化エネルギー障壁を増加させ、そしてミセルに安定性を提供すると信じられている。ミセル形成において、頭部基中のペプチド−ＰＥＧ複合体は、三量体サブユニットに自己集合するだろうし（図１ｂ）、またナノキャリアの局在性に関する活性標的におけるリガンド提示のオリゴマー状態の効果を調査するためのプラットフォームを提供し得る。らせん束の外側に連結されたＰＥＧ鎖は、リガンド間のクラスターの距離を調整するために使用され得る。
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を用いて、１ｃｏｉに基づくペプチドを合成した。両親媒性物質の合成の手順を、図２ａに示す。具体的には、ステアリン酸と脱保護されたＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨとの反応を通して、アルキル鎖を固相に共役させ、Ｎ−末端で分岐したアルキル尾部を作り出した。直交する保護−脱保護戦略は、側面及びＣ−末端の両方にＰＥＧ分子を結合させるために用いた。ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ化学を用いるパラジウムで触媒されたＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨのＡｌｌｏｃ−脱保護、その後のカルボキシ末端有機分子の共役を通して、Ｃ−末端を修飾した。得られた複合体は、ペプチド配列：ＥＶＥＡＬＥＫＫＶＡＡＬＥＣＫＶＱＡＬＥＫＫＶＥＡＬＥＨＧＷＧＧＧＫ（配列番号６）を有する。ＰＥＧ２０００は、システイン側鎖に共有結合し、ＰＥＧ７５０は、ε-アミンのＣ−末端リシンに共有結合し、そしてステアリン酸は、６−アミノヘキサン酸リンカー残基にＮ−末端で付加されたα−アミン及びε−アミンのリシン残基に共有結合する。本研究では、ミセルを安定化させ、また非特異的タンパク質の吸収を妨げるステルス層を提供するために、ＰＥＧ（Ｍｗ＝７５０Ｄａ）をＣ−末端官能基として選定した。さらに多様な標的リガンドは、同一の化学を用いて連結され得る。水（０．１％ＴＦＡ）及びイソプロパノール（０．１％ＴＦＡ）を含む混合溶媒の勾配を用いて、複合体を逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により精製した。〜８５％のイソプロパノールで、両親媒性分子を全３０％の収率で溶出した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光分析により、分子量を確認した（図２ｂ）。
実施例２：ビス−ポリマー液体−ペプチド複合体ミセルの特徴化及び充填
ネガティブ染色化透過電子顕微鏡法。凍結乾燥ペプチド粉体を、０．１ｍｇ／ｍＬで、２５ｍＭのリン酸緩衝液中に、ｐＨ７．４で溶かした。５μＬのペプチド溶液を、放電した穴のある炭素被覆グリッド（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ ０１８２４）上に滴下した。過剰なペプチド溶液を除去した後に、５μＬのリンタングステン酸（２重量％、ｐＨ＝３．３）溶液を２分間適用した。サンプルを空気中で乾燥させ、そしてＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ １２透過型電子顕微鏡を用いて、１２０ｋＶで試験した。
動的光散乱（ＤＬＳ）。ＤＬＳサイズ測定は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ−ＺＳにおいて、６３３ｎｍのレーザー及び１７°の散乱角で行い、溶液中のサンプルの流体力学半径を決定した。測定に先立ち、サンプルを０．２２μｍのフィルターに通した。
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）。ＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ−Ｓ ４０００カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）において、ＳＥＣを実施した。溶出溶媒として２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）での流量は、１ｍＬ／分であった。溶出プロファイルは、ＵＶ−ｖｉｓ検出器により、２２０ｎｍ、２８０ｎｍ及び４８０ｎｍの１つ以上の波長で観測した。
円偏光二色性（ＣＤ）。ＣＤ測定は、Ｊａｓｃｏ Ｊ８１０分光偏光計において実施した。２６０〜１９０ｎｍの範囲、０．２ｎｍの間隔、１００ｎｍ／分の速度、４つの応答時間、及び１ｎｍのバンド幅で、ＣＤスペクトルを収集した。式［θ］222＝−４００００×［１−（２．５／ｎ）］を用いて、１００パーセントのヘリシティを見積もった。
示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）。ＶＰ−ＭｉｃｒｏＣａｌ（ＧＥ）において、ＤＳＣを実施した。〜６００μＬのサンプル（１ｍｇ／ｍＬ）及び緩衝剤を、加熱サイクルの間に水が蒸発するのを防ぐために〜２７ｐｓｉの圧力下でしっかり密閉した２つの平行ステンレススチールセルの中に充填した。５℃で１５分の平衡時間により、１℃／分の速度で、温度を５℃〜６０℃に上昇させた。ＭｉｃｒｏＣａｌにより提供されたＯｒｉｇｉｎソフトウェアを用いる濃度標準化及びベースライン補正後に、ＤＳＣサーモグラムを得た。
フェルスター共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）。脂溶性ＦＲＥＴ対、３，３’−ジオクタデシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩（ＤｉＯ、供与体）及び１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩（ＤｉＩ、受容体）を使用し、混合におけるエネルギー転移を測定した。所望量のＤｉＯ、ＤｉＩ、及びｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０またはＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋを、１：１のクロロホルム及びメタノールの混合物中に共溶解させた。真空下、６０℃で、少なくとも３時間かけて有機溶媒を蒸発させ、ガラスバイアル中に薄い膜を形成させた。リン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４、２５ｍＭ）を添加し、１ｍｇ／ｍＬの濃度でフィルムを再水和させた。目に見える凝集体が形成された場合に、水槽中、７０℃で、少なくとも３０分間かけて溶液を加熱し、カプセル封入の均質性を促した。室温での撹拌から２４時間後に、溶液を遠心分離及びスピン透析にかけ、上澄み中の任意の不溶性の凝集体及び可溶性染料を取り除いた。３５０μＬのＢＳＡサンプルに、１０μＬの染料カプセル封入ミセル溶液を添加し、そして時間依存性の蛍光強度を、４５０ｎｍでの励起波長と共に、１２時間で４７５ｎｍ〜６５０ｎｍの範囲で記録した。
薬物充填及び放出。薄膜水和方法と同一の手順により、ドキソルビシン、パクリタキセル及びラパマイシン充填ミセルを調製した。ｄＣ１８−１ｃｏｉ（Ｐ２Ｋ）−Ｐ７５０及び多様な薬物を、ガラスバイアル中のメタノールに溶かし、そして真空のオーブン中で、３時間かけて溶媒を蒸発させた。複合体及び薬物を含む乾燥させたフィルムを、２５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４により再水和させ、そして溶液を１６時間撹拌し、薬物充填３−らせんミセルへの凝集を可能にさせた。遠心分離、その後のスピン限外ろ過（Ａｍｉｃｏｎ遠心分離フィルターユニット、ＭＷカットオフ：３０００Ｄａ）により遊離薬物を除去した。得られた濃縮物を水で洗浄し、そして凍結乾燥させ、薬物充填ミセルを得た。薬物充填ミセルをメタノールに溶かし、そして２８０ｎｍでの薬物の吸光度を観測する逆相ＨＰＬＣにより充填を決定した。薬物充填ミセルの全ての特徴化実験については、２５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中にミセル−薬物の凍結乾燥粉末を溶かし、そして水槽中で、６０℃で、１時間溶液を加熱し、潜在的な凝集体を壊し、透明な溶液を得た。
薬物充填３−らせんミセルを、２５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４に、３ｇ／ｍＬの濃度で溶かした。ミセル−薬物溶液（２ｍＬ）を、８０００Ｄａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）の透析袋（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂｓ）中に入れた。その後に透析袋を、８００ｒｐｍで撹拌したガラスビーカー中の１０００ｍＬのＰＢＳ中に浸した。異なる時点で、透析袋から１０μＬの溶液を取り出し、時間関数としての薬物放出を測定した。２８０ｎｍでの吸光度を観測する逆相ＨＰＬＣにより、放出された薬物を定量した。さらに上記のＦＲＥＴ測定を成すために、染色対と共にパクリタキセル及びラパマイシンを共充填した。
結果及び考察：両親媒性ミセルの物理的特徴化。両親媒性物質、ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０は、水溶液中で、そのＣＭＣ値（〜２μＭ）を超えて自発的にミセルに自己集合する。図３ａは、リン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４、２５ｍＭ）中、２５℃での、２００μＭのｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０溶液の円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを示す。２０８ｎｍ及び２２２ｎｍで最小の、典型的な高いαらせん構造の２つのピークが存在する。頭部基中の１ｃｏｉペプチドは、８２％のヘリシティを有するらせん構造を形成する。２２２ｎｍ及び２０８ｎｍでのモル楕円率の比率は、コイルドコイルらせんの存在を同定するために、ごく普通に使用される。単離されたα−らせんの比率を０．８３と見積もり、さらにコイルドコイル等のαらせんを相互作用させるための比率を、〜１．０であると計算した。２２２ｎｍと２０８ｎｍでの楕円率の間の比率は、１．０４であり、ペプチドの三次構造、すなわちコイルドコイルらせん束が、ミセル内部で維持されることを示す。
両親媒性物質の外形を数値化するパッキングパラメーターは、１ｃｏｉのＸ線及び中性子散乱（未発表の結果）、並びに結晶構造から決定された頭部基の大きさに基づき、Ｉｓｒａｅｌａｃｈｖｉｌｉの界面活性剤整数論を用いて計算した。図１ｂに示されるような斜方晶系サブユニットのパッキングパラメーターは、０．２３８であると計算される。比較のために、図１ａに図式的に示したような個々の両親媒性物質のパッキングパラメーターは、０．３３２であると計算される。３−らせん束の形成は、頭部基と疎水性尾部の間の切断面の不整合を増加させる。Ｉｓｒａｅｌａｃｈｖｉｌｉの界面活性剤整数論に基づけば、３−らせん束ペプチド−ＰＥＧ複合体は、球状のミセルの形成に強い優先傾向を有する。凍結乾燥させた両親媒性物質粉末を緩衝液中に溶かした後の動的光散乱（ＤＬＳ）（図３ｂ）は、１５ｎｍの流体力学直径、及びミセルのかなり均一なサイズ分布を明らかにした。図３ｃに示されるようにネガティブ染色されたＴＥＭは、両親媒性物質（２５ｍＭのリン酸緩衝液中、ｐＨ７．５で０．１ｍｇ／ｍＬ)が、〜１５ｎｍの直径を有する球状のミセルを形成するさらなる証拠を提供する。
ＦＲＥＴによるｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性。封入された薬物は、標的部位に到達するまで、キャリア内部に維持されなければならない；しかしながら、ｉｎ ｖｉｖｏでの積荷漏れは、ミセルのナノキャリアの長期にわたる懸案事項とされている。染料充填ＢＣＰミセルに関し、ｉｎ ｖｉｖｏＦＲＥＴ試験は、染料分子が静脈内注入後、１５分間放出されたことを示した。３−らせんミセルのｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性は、ミセルのナノキャリアを破壊する両親媒性物質トラップとして公知であるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在中で、ＦＲＥＴを用いて評価した。脂溶性ＦＲＥＴ対、３，３’−ジオキタデシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩（ＤｉＯ、供与体）及び１，１’−ジオクタデシル-３,３,３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩（ＤｉＩ、受容体）を、ｄＣ１８-１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）-ＰＥＧ７５０ミセル中に共カプセル封入した。コントロール実験として、同一のＦＲＥＴ染料を、１，２−ジステアロイル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスホエタノールアミン-Ｎ-［メトキシ（ポリエチレングリコール）-２０００］、（ＤＳＰＥ-ＰＥＧ２Ｋ）に基づく従来型のミセル中に共カプセル封入した。染料をカプセル封入したミセルを、３７℃で、ＢＳＡ（５０ｍｇ/ｍＬ）の生理学的濃度に希釈し、そしてλex=４５０ｎｍで、４７５ｎｍ〜６００ｎｍの範囲において蛍光を観測した。
ＢＳＡにおける初期平衡の後（〜１０分）に、５０５ｎｍでの小さな放射ピークに付随する、５６５ｎｍでの主要な放射ピークを観察した。これは、両方の染料が、個々のミセル中にカプセル封入され、且つ密に接近して並べられていることを示す。積荷分子が浸出した場合、５０５ｎｍでの蛍光強度の刺激増加、及び５６５ｎｍでの減少をもたらすＤｉＯとＤｉＩの間の分子間距離の増加のせいで、ＦＲＥＴは「オフ」になる。ｄＣ１８-１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）-ＰＥＧ７５０ミセルの経時的な蛍光強度は、５０５ｎｍ及び５６５ｎｍで本質的に未変化のままであった（図４ａ）。対照的に５０５ｎｍでの蛍光強度の増加に付随する、５６５ｎｍでのＤＳＰＥ-ＰＥＧ２Ｋミセルの強度は、有意に低くなった（図４ｂ）。Ｉ565／（Ｉ565＋Ｉ505）のＦＲＥＴ率は、エネルギー伝達の効率を示し、且つ実験条件下でのミセルの相対的な安定性を反映する（図４ｃ）。ＤＳＰＥ-ＰＥＧ２Ｋミセルについて、ＢＳＡ溶液におけるミセルの迅速な積荷放出を示す標準化ＦＲＥＴ率の急激な減少が観察され（図４ｃ、下のトレース）、それに対し３−らせんミセルについての比率は、同一の条件下で、本質的に不変のままであった（図４ｃ、上のトレース）。この結果は、ＤＳＰＥ-ＰＥＧ２Ｋミセルが、３７℃で２０分の半減期により、ＢＳＡ中で溶けにくいことを示す、以前に報告された結果に一致する。
ｄＣ１８-１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）-ＰＥＧ７５０ミセルを、Ｃ−１６アルキルコアを有するｄＣ１６-１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）-ＰＥＧ７５０ミセルと比較した。図５における円偏光二色性測定により示されるように、ペプチドヘリシティ及びコイルドコイル構造は、異なる疎水性のアルキル尾部との共役のために維持された。ペプチド構造の温度安定性は、２つのアルキル尾部で有意に異なる。図６ａにおけるＤＳＣデータにより示されるように、アルキル鎖パッキングの相転移温度は、アルキル鎖の疎水性と共に増加した。より疎水性のコアを有するミセルは、ＦＲＥＴにより評価されるように、より大きな安定性を実証した（図６ｂ）。
薬物充填。分子構造及び疎水性を変えることによる薬物の範囲は、本発明のミセルに組み込まれ得る。染料分子及び他の物質は、蛍光画像化のためにジピロメテンボロンジフルオリド（ＢＯＤＩＰＹ）及び脂溶性カルボシアニンを含むミセル中に、容易にカプセル封入され得る。治療適用へのナノキャリアとして、潜在的な３−らせんミセルを評価するために、ＤＯＸを使用し、薬物充填能を見積もった。ミセルにおけるＤＯＸのカプセル封入は、ドライ−ダウン法を用いて実施した。最初にｄＣ１８-１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）-ＰＥＧ７５０及びＤＯＸをメタノールに溶かし、乾燥させ、そして再水和させた。遊離薬物を除去するためのスピン透析後に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及びＤＬＳを用いて、ＤＯＸ−充填ミセルの均質性を特徴化した。図７ａにおいて示されるように、ミセルの重複する溶出プロファイルを、それぞれペプチド及びＤＯＸを観測する２２０ｎｍ（上のトレース）及び４８０ｎｍ（下のトレース）で観測し、ミセルにおけるドキソルビシンのカプセル封入、及び遊離薬物不存在のカプセル封入を検証した。ＤＬＳ実験（図７ｂ）は、ＤＯＸの添加（８重量％のＤＯＸ充填）は、１５ｎｍの直径を有する単一の種を示すミセルの均質性を壊さなかったことを示す。さらに溶液中の遊離ＤＯＸ（図７ｃ、上のトレース）と比較したミセルにおけるＤＯＸ蛍光の消光（図７ｃ、下のトレース）は、ミセル中のＤＯＸの存在を確認した。凍結乾燥粉体をメタノール中で溶かすことにより、そして４８５ｎｍでのＤＯＸの吸光度を観測することにより、ＤＯＸ充填を決定した。ＤＯＸに関し、７〜８重量％の範囲にある薬物充填は、再現可能な方法で得た。これは、４〜１０重量％と報告されているＤＯＸのデンドリマー及びポリペプチドへの共有結合性複合体により得られた値に相当する。ドキソルビシン、ラパマイシン、及びパクリタキセルのｄＣ１８-１ｃｏｉ（Ｐ２Ｋ）-Ｐ７５０ミセルへの充填は、表１に要約する。
図８ａに示されるように、ラパマイシンのカプセル封入は、ミセルにおけるコアパッキングに最小の効果をもたらした。図８ｂにおいて示されるように、５０％のカプセル封入薬剤は、８時間以内で放出された。
サイズ排除クロマトグラフィーは、パクリタキセル充填が、３らせん束及びミセルへのペプチド複合体の集合を妨げなかったことを示した（図９）。示差走査熱量測定法は、パクリタキセル封入が、ミセルにおけるコアパッキグに最小の影響をもたらしたことを示した（図１０）。
図１１は、ＦＲＥＴにより評価されたように、３−らせんミセルの安定性は、パクリタキセル取り込み後にも悪影響を及ぼされずに、且つ維持されたことを示す。
図１２は、２つの構造的に異なる薬物、ドキソルビシン及びラパマイシンに関し、薬物放出は、より安定なミセル（すなわちｄＣ１８-１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）-ＰＥＧ７５０）からは、より遅いことを示す。
実施例３：ビス−ポリマー脂質−ペプチド複合体ミセルのＩｎ Ｖｉｖｏでの特徴化
６-ｐ-（４-（Ｎ-マレイミドメチル）シクロヘキサン-１-アミノ）ベンジル １，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’,Ｎ”,Ｎ’’’テトラアセテート（６-ＢＡＴ-マレイミド）の合成。６-ｐ-アミノベンジル １，４，８，１１-テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’,Ｎ”,Ｎ’’’テトラアセテート（６−アミノベンジル ＴＥＴＡ、２５ｍｇ）を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ １×、８ｍＬ）中で、スルホ−ＳＭＣＣ（２５ｍｇ、ＰｒｏｔｅｏＣｈｅｍ、Ｄｅｎｖｅｒ）と反応させ、そして１Ｍの水酸化ナトリウム溶液を添加し、２時間、ｐＨを７で維持した。反応混合物を、０．１％のＴＦＡ溶液（４ｍＬ）で希釈した。逆相ＨＰＬＣシステム（Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｏ Ｃ１２、２５０×１０ｍｍ）により、６-ＢＡＴマレイミドを単離し、そして２２０及び２５４ｎｍの波長で、溶出を観測した。流量は、３ｍＬ/分であり、そして５〜６０％溶媒Ｂとして、３０分かけて線形勾配を適用した（溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ ＤＩ水（ｖ/ｖ）、溶媒Ｂ：０．１％ＴＦＡアセトニトリル（ｖ／ｖ））。
６-ＢＡＴ-ｄＣ１８-１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）-ＰＥＧ７５０の合成。ＰＥＧ２Ｋを導入するために、Ｆｍｏｃ-Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）-ＯＨを、１ｃｏｉ骨格に沿って、１５位で使用した。５０μｍｏｌの反応のために、１２ｍｇのＰｄ（ＰＰｈ３）4触媒、及び１５０μＬのラジカル捕獲剤ＰｈＳｉＨ3が存在する中で、ＤＣＭ中、３０分間、Ａｌｌｏｃ基の選択的な脱保護を行った。反応を５回以上繰り返した。その後にＨＢＴＵ/ＤＩＰＥＡ化学を用いて、カルボニル末端ＰＥＧ２Ｋを、リシン残基の側鎖にカップリングした。カップリング反応は、室温で、２４時間行い、そして２回繰り返した。ＴＦＡ中での開裂後に、粗ペプチドを、リン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）中で、１対４のモル比で６-ＢＡＴ-マレイミドと反応させた。逆相ＨＰＬＣによる精製は、３０％の収率で最終産物を与えた。
Ｃｕ-６４によるｄＣ１８-１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）-ＰＥＧ７５０ミセルの放射性標識。フィルム水和法により、混合ミセルを調製した。９８／２重量／重量％にあるｄＣ１８-１ｃｏｉ（Ｐ２Ｋ）-Ｐ７５０及び６-ＢＡＴ-１ｃｏｉ-ｄＣ１８-ＰＥＧ２Ｋを、ガラスバイアル中のメタノールに溶かし、そして真空オーブン中で、３時間溶媒を蒸発させた。２５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４により乾燥フィルムを再水和させ、そして溶液を１６時間撹拌し、混合ミセルへの集合を可能にさせた。スピン限外ろ過（Ａｍｉｃｏｎ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ ｕｎｉｔｓ、ＭＷ カットオフ：３０００Ｄａ）により、リン酸塩を取り除いた。得られた濃縮物を水で洗浄し、そして凍結乾燥させて混合ミセルを得た。
凍結乾燥させたｄＣ１８-１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）-ＰＥＧ７５０及び６-ＢＡＴ-ｄＣ１８-１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）-ＰＥＧ７５０粉末（９８/２、ｍｏｌ％／ｍｏｌ％、３．７ｍｇ）を、脱イオン水中に溶かし、そして一晩、室温で寝かした。０．１Ｍのクエン酸アンモニウム（ｐＨ５．５、１００ ｍＬ）中で緩衝化させた64ＣｕＣｌ2（Ｉｓｏｔｒａｃｅ、Ｓｔ.Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、ミセル溶液に添加し、そして３０℃で、１．５時間培養した。Ｃｕ-６４の非特異的結合を取り除くために、０．１ＭのＥＤＴＡ（１０ｍＬ）を添加し、そして混合物を、１０分間、室温で培養した。サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ-７５、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）は、２ｍＬの体積において、９５％を超える標識収率を有するＣｕ-６４標識ミセルを実証した。３０分間の遠心分離（４０００ｇ）によりＣｕ-６４ミセルを濃縮した。合成終了時でのミセルの特異的な活性は、１４０ＧＢｑ/ｍｏｌであった。
Ｃｕ−６４による従来型のミセル（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ−ＯＭｅ）の放射性標識。クロロホルム中のＤＳＰＥ-ＰＥＧ２Ｋ-ＯＭｅ及び６-ＢＡＴ脂質（９７/３、ｍｏｌ％/ｍｏｌ％、２ｍｇ）を、穏やかな窒素流下、５０℃で、ガラス試験管中で乾燥させた。乾燥させた脂質を、一晩凍結乾燥させた。温めた脱イオン水（０．５ｍＬ）を試験管に添加し、溶液が透明になるまで穏やかに振った。０．１Ｍのクエン酸アンモニウム（ｐＨ５．５、１００ｍＬ）中で緩衝化させた64ＣｕＣｌ2（２．５１ｍＣｉ）を、ミセル溶液に添加し、そして３０℃で１時間培養した。サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ-７５、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、標識された従来型のミセルを分離した。標識収率は９５％であり、また合成終了時でのミセルの特異的な活性は、１２４ＧＢｑ/ｍｏｌであった。
動物プロトコル（ＮＤＬ腫瘍マウスモデル）。カリフォルニア大学、Ｄａｖｉｓ、Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ （Ｄａｖｉｓ, ＣＡ）により認可させたプロトコル下で、全ての動物実験を行った。１９〜２２ｇの体重の４週齢の雌性ＦＶＢマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を、換気したゲージ中の温度管理した部屋で飼育した。全ての動物を、１２時間の光サイクルで維持し、そして標準的な齧歯動物の食餌及び水を、不断で与えた。腫瘍細胞注入によりＮＤＬ腫瘍を作り出すために、受容者であるマウスを、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）溶液のＩＰ注入により麻酔した。その後に４番目の鼠径脂肪体をざっくり解剖し、そして露出させた。２０μＬのＰＢＳ中に懸濁させた１×１０６ＮＤＬ腫瘍細胞の溶液を、２９個の標準規格注射針を用いて、受容体マウスの右及び左の４番目の鼠径乳腺脂肪体中に直接注入した。その後に１つの側面ごとに１つの創傷クリップで切開部位を閉じ、そして動物が歩きだす前に、疼痛管理のために、０．０５〜０．１ｍｇ／ｋｇのＢｕｐｒｅｎｅｘを皮下に１回注入した。創傷クリップを外すまで、７日間、創傷を観察した。試験開始の初日に約５ｍｍの大きさに達する前に、腫瘍を１２日間成長させた。
マイクロＰＥＴ画像化及び生体内分布分析。64Ｃｕ-ｄＣ１８-１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）-ＰＥＧ７５０ミセルの注入後に、乳腺脂肪体中に左右対称にＮＤＬ腫瘍を有する雌性ＦＶＢマウス（ｎ＝６）をマイクロＰＥＴにより画像化し、そして生体内分布を評価した。Ｉｎ ｖｉｖｏでのＰＥＴスキャンは、１５０ｍＬのＰＳＢ中の64Ｃｕ−ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセル（マウス１匹あたり、３１６±８３μＣｉ及び８６±２４ｎｍｏｌの脂質）を尾静脈注入した直後の３０分間、並びに注入から３、６、２４、及び４８時間後の３０分間に獲得した。２％〜３％のイソフルランで麻酔した動物を、２匹１組でスキャナーベットに置き、そして小動物ＰＥＴスキャナー（Ｆｏｃｕｓ１２０, Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ, Ｉｎｃ.）を用いてＰＥＴデータを取得した。それぞれの動物セットのスキャン終了時点後に、頸椎脱臼により動物を安楽死させ、そして血液を心穿刺により取り出した。簡潔には、一度動物を安楽死させ、γ−カウンター（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）において生体内分布及び放射活性を測定するために臓器を摘出した。Ｃｕ−６４標識された従来型のミセルの生体内分布について、２６〜２７ｇの体重の２匹の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、ＭＡ）を使用した。尾静脈を介して、Ｃｕ−６４標識された従来型のミセル（１匹のマウスあたり、７．３３±０．０７ＭＢｑ及び６９±１ｎｍｏｌの脂質）を投与し、放射活性の迅速なクリアランスのために、注入から２４時間後に動物を解剖し、そして生体内分布について上記手順を行った。
結果及び考察：ＰＥＴ画像化を用いる３−らせんミセルのＩｎ Ｖｉｖｏ試験。
ナノキャリアとしてのそれらの潜在能力を検証するために、３−らせんミセルの薬物動力学的評価及び生体内分布を行った。64Ｃｕ標識化３−らせんミセルの調製は、金属キレート剤官能化両親媒性ペプチドの通常の両親媒性物質との共集合、その後の64Ｃｕイオンとの高親和性配位反応により達成した。静脈内注入を介して、ＮＤＬ腫瘍を有するマウスにミセル溶液を投与した。ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）を用いて放射性標識されたミセルの薬物動態を評価し、そして長循環リポソーム及び従来型のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋミセルと比較した。全ての試験させたミセルは、非特異的タンパク質吸着を妨げるように二重のＣ１８尾部及びＰＥＧ層から構成されるものと類似する程度の疎水性を有する。図１３ａは、64Ｃｕ−ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセル投与マウスの薄切りＰＥＴ画像の冠状（上）及び横切り（下）図を示す。画像は、最大事後確率（ＭＡＰ）推定によるヒストグラムの再構成後に得た。注入後４８時間かけてＰＥＴ画像を取得し、そして３−らせんミセルが、最小の肝臓及び脾臓蓄積により、血液プール中で高度に濃縮されたままであったことを実証した。図１３ｂは、64Ｃｕ−ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセルの血液放射活性（％ＩＤ／ｃｃ）を示す。データ曲線は、２相の指数関数的減衰（Ｙ＝４５．３２ｅ-0.0235×t＋１６．４２ｅ-1.27×t、ｔ1/2 α＝０．５５、β＝２９．５２）と一致した。約１５±１．５％ＩＤ／ｇは、注入から４８時間後であっても血液プール中で循環したままだった。画像データセットに基づき、３−らせんミセルの薬物動態を、二相モデルを用いて一致させた。ミセルのβ−相血液循環半減期（ｔ1/2,β）を、成功したデンドリマーのものに匹敵する〜２９．５時間であると見積もった（図１３ｂ）。図１３ｃは、注入から４８時間後の血漿及び血液細胞中の算出された％放射活性を示す。％放射活性は、［１００×血漿放射活性／（血漿放射活性＋血液細胞放射活性）］として算出した。分析は、活性が循環している細胞成分よりもむしろ血漿に限定されたことを示す。
64Ｃｕ−ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセルは、モノ−ＰＥＧ複合体（すなわちＣ−末端ＰＥＧ７５０がない64Ｃｕ−ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ））から構成されるミセルと比べて、改良された特徴を示す。図２５中のＰＥＴ画像は、投与２４時間後に対象において循環している64Ｃｕ−ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセルのレベル（図２５ｄ）が、投与２４時間後での64Ｃｕ−ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）ミセルのレベル（図２５ｂ）よりも有意に高いことを示す。さらにこれは、注入４８時間後の血液、肝臓、及び脾臓における64Ｃｕ−ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセル及び64Ｃｕ−ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）ミセルの放射活性の比較に影響を及ぼす（図２６）。Ｃ−末端でＰＥＧ７５０を連結することは、血液循環存続期間を有意に増加させ（ＰＥＧ化ミセル １４．５ ％ＩＤ／ｇ 対．非ＰＥＧ化ミセル ２．９ ％ＩＤ／ｇ）、そして肝臓及び脾臓等の網内系器官における蓄積を減少させた。図２７において示されるように、Ｃ１８コアを有するミセルは、Ｃ１６コアを有するミセルよりも高度に安定であり、且つより長い血液循環時間を有することが実証された。
図１４は、非かん流マウスにおける長循環リポソーム（ｎ＝４）、及び従来型のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ−ＯＭｅミセル（ｎ＝２）との３−らせんミセル（ｎ＝６）の生体内分布プロファイルの比較を示す。３−らせんミセルの注入によりもたらされる放射活性は、血液プールにおいて、１５．０±１．５％ＩＤ／ｇで最も高い。ＮＤＬモデル腫瘍（５．７±０．９％ＩＤ／ｇ）における３−らせんミセルの取り込みは、類似のモデル（ＭＩＮ−Ｏ）において64Ｃｕ−リポソーム（４．３％ＩＤ／ｇ）及び64Ｃｕ−アルブミンにより達成されるものと類似した。取り込みは、ＥＰＲ効果に起因し得ると信じられている。多様な臓器の放射活性は、以下のように観察した：脾臓中、４．６±０．５％ＩＤ／ｇ、肝臓中、４．５±０．２％ＩＤ／ｇ、腎臓中、２．９±０．３％ＩＤ／ｇ、心臓中、２．１±０．２％ＩＤ／ｇ。試験において動物は、かん流されなかった。生体内分布試験の時点で血中に高い活性が残っていたことを考慮すれば、肝臓及び脾臓中の残りの血液は、これらの臓器において観察された活性を部分的に構成し得る。さらに全身のクリアランス経路を明確にするために、〜２％ＩＤ／ｇである十二指腸及び空腸における放射活性を測定した（図１４ａ）。４８時間での64Ｃｕ-ｄＣ１８-１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）-ＰＥＧ７５０ミセルの放射活性（％ＩＤ／ｇ）を、長循環リポソームの放射活性と比較した（リポソームの４８時間のデータは、以前の試験から得た）。消化系、肝臓及び脾臓における低い活性は、網内系（ＲＥＳ）クリアランスが、３−らせんミセルの主要なクリアランス経路で有り得ないことを示した。
さらに血液、肝臓及び脾臓中で検出された放射活性は、３−らせんミセル、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ−ＯＭｅミセル及び長循環リポソームの中で比較した（図１４ｂ）。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ−ＯＭｅミセルの迅速なクリアランスのために、２４時間での生体内分布結果は、長循環リポソーム及び３−らせんミセルにより４８時間で得られたものとの比較のために使用した。ＤＰＳＥ−ＰＥＧ２Ｋ−ＯＭｅミセルから得られた肝臓中の放射活性は、長循環リポソームのものと類似するレベルのままであった。３−らせんミセルと長循環リポソームの間の実質的な相違は明白であり：これまでのいずれの戦略と比べてみても、血液循環は引き伸ばされ、また肝臓及び脾臓蓄積は減少した。ワンウェイＡＮＯＶＡ、その後のＴｕｋｅｙのマルチプル比較検定により、群間の統計解析を行った（図１４、***Ｐ＜０．０００１、**Ｐ＜０．００１、*Ｐ＜０．０５）。
Ｉｎ ｖｉｖｏでの薬物動態及び生体内分布試験は、３−らせんミセルが長い循環半減期及び効率的なクリアランスを達成することを明確に実証した。尿活動と組み合わされた肝臓、脾臓及び腸における減少した蓄積は、３−らせんミセルが、主としてＲＥＳ経路を介して取り除かれなかったことを示唆する。３−らせんミセルの全身クリアランスの１つの仮説は、まず血液循環中に、単一の、または三量体の両親媒性物質がミセルから出ていく際の単量体脱離による。疎水性Ｃ１８尾部が頭部基により遮断され得ないならば、両親媒性物質は血清タンパク質により捕捉され、そしてその後に、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ及びブロックコポリマーに基づくミセルを含む、他のミセルの結果と類似するＲＥＳ系により、取り除かれるだろう。親水性頭部基、すなわち、１ｃｏｉ−ＰＥＧ２Ｋが５ｋＤａを超える分子量であるので、１ｃｏｉ−ＰＥＧ２ＫがＣ１８鎖を包み、Ｃ１８と水の間の好ましくない相互作用を遮断し得ることは可能である。これは１ｃｏｉが折り畳まれず、また疎水性ＰＳの界面活性剤として作用する場合の、１ｃｏｉ−ポリスチレン複合体における本発明者等の最近の研究に類似する。ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０両親媒性物質の分子量は、糸球体膜を通過する臨界分子量カットオフをはるかに下回る、わずか〜６ｋＤａである。１ｃｏｉペプチドの配列には、プロテアーゼにより開裂され得る２〜３個の部位が存在する。ミセルの物理的な脱離に代わるものとして、３−らせんミセルは、細胞中に内在化し、そしてタンパク質分解を介して消化され得る。一度ペプチドが酵素的に分解すれば、ミセルはバラバラになるだろうし、また両親媒性物質のフラグメントは代謝されるだろう。
実施例４：複合体及びミセルのさらなる特徴化。
２５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中に溶解したｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０の濃度関数として、ピレン蛍光を観測した（図１５）。ピレンの濃度は、４×1０-7μＭで一定のままを保った。両親媒性物質の濃度の増加に伴い、ピレンは、ミセルのコアの中で分割し始めた。曲線の勾配が増加し始めた時の濃度は、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を示した。ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０のＣＭＣは、〜２μＭである。
２５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中に溶解した６０μＭのｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０のＣＤスペクトルを記録した。ペプチドのヘリシティは、〜７４％であった。２２２ｎｍ及び２０８ｎｍでの楕円率は、〜１．０６であり、ミセルのシェル中のペプチドが、コイルドコイルらせん束として構築されていることを示す（図１６）。
２５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中に溶解した２００μＭのｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０の示差走査熱量測定法サーモグラムを記録した（図１７）。トレースにおいて観察されたピークは、ミセルのコアにおける不均質の液体パッキングを示す。主なピークに相当する液体コア中のアルキル鎖の相転移温度は、〜３７℃であった。
２５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中に溶解した６０μＭのｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０の動的光散乱トレースを記録した。ミセルの流体力学直径は、〜１６ｎｍであった（図１８）。
図１９に概説される手順に従い、ミセルにドキソルビシンを充填した。２５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中に溶解したドキソルビシン充填ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０の動的光散乱トレースを記録した（図２０）。充填は、〜８重量％のドキソルビシンであった。
２５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中に溶解したドキソルビシン充填ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセルのサイズ排除クロマトグラムを記録した（図２１）。２８０ｎｍ（ペプチド；上のトレース）及び４９０ｎｍ（ＤＯＸ； 下のトレース）で重複している溶出プロファイルは、薬物を伴う粒子の、最小限の遊離薬物及び粒子凝集との関連性を示す。
２５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中に溶解したドキソルビシン充填ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセルの蛍光スペクトルを記録した（図２２）。遊離薬物（上のトレース）に対するミセル中のドキソルビシン蛍光の消光は（下のトレース）、ミセルコア中の薬物の存在を示す。
５０ｍｇ／ｍＬの血清アルブミンを含む２５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中に溶解したドキソルビシン充填ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセルの蛍光スペクトルを、経時的に記録した（図２３）。
２５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中に溶解した、ラパマイシン充填ｄＣ１８−１ｃｏｉ（ＰＥＧ２Ｋ）−ＰＥＧ７５０ミセルのサイズ排除クロマトグラムを記録した（図２４）。
実施例５：薬物充填ミセルを用いるラットモデルにおける多形性膠芽腫の処置
多形性膠芽種（ＧＢＭ）等の脳腫瘍中への伝達増強送達（ＧＢＭ）による直接注入により、本発明の薬物充填ミセルを送達する。細胞外の空間を通して注入剤を課す初期バルク流に、注入カテーテルの先端の圧力勾配を使用する。その後に加圧注入剤は、血管周囲の空間に引き込まれ、そして分布は、血管の脈動に大いに助けられる。
ミセルは、ＧＢＭ細胞により迅速に取り込まれる。ミセルは、積荷薬物の薬物動態を拡張し得る。小さなサイズのミセルは、他のキャリアと比べて薬効を改良し得る。腫瘍内注入は、薬物の送達を腫瘍部位に限定し、改良された安全性及び有効性を導くが、かかる送達の頻度は、実際には制限され得る。本発明のミセルの長い薬物動態は、投与頻度が制限されているような状況でさえ、良好な有効性を提供し得る。
ミセルＤＯＸ及びＴＭＺの固有の安全性は、２０マイクロリットル（Ｎ＝３／群）の薬物充填ミセルを、０（生理食塩水）、０．３、０．７、１及び３ｍｇ／ｍＬにわたる濃度範囲で、正常ラットの線条体に注入することにより確立される。７日後に、ラットの脳を切開し、そして組織の病変を探すためにヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色により染色する。ラットの有効性試験では、最も高い非毒性用量を使用する。
ラットＧＢＭ異種移植片におけるミセルドキソルビシン（ＭＣ−ＤＯＸ）及びテモゾロミド（ＭＣ−ＴＭＺ）の薬物動態を研究する。ヌードラットへの腫瘍移植１０日後に、移植された腫瘍中に、最も高い非毒性用量でＭＣ−ＤＯＸまたはＭＣ−ＴＭＺを注入する。１、３、７、１０、及び２４時間、並びに３日及び７日で、ラットの腫瘍（Ｎ＝３／時間）を解剖する。これらのサンプルを抽出し、そしてＨＰＬＣにより薬物含有量を分析する。
動力学的データを使用し、ＧＢＭのヌードラットＵ８７異種移植モデルにおける有効性の試験を行う。常習的なカニューレガイドを使用し、１０回まで、ＣＥＤにより異種移植腫瘍中に薬物を注入する。ラット異種移植片にＭＣ−ＤＯＸまたはＭＣ−ＴＭＺを、１週あたり２〜３回注入し、そして生存は、主要エンドポイントである。モデルは、腫瘍移植後に正常では約２０日の生存期間を有する。早ければ移植から１０日後に、コントロールまたは薬物充填のいずれかのミセル注入を開始し、そして動物（Ｎ＝１０／群）が、安楽死の必要性を示す神経学的兆候及び／または＞１５％の体重喪失を示すまで繰り返す。Ｍｅｉｅｒ−Ｋａｐｌａｎ分析により、生存への効果を評価する。検視分析は、Ｈ＆Ｅ染色を含む。コントロールと比べて、１０日を超える統計学的に有意な（ｐ＜０．０５）生存の増加を観察する。
実施例６：混合ミセル
薄膜水和法により、混合ミセル（図２８）を調製した。５０／５０重量／重量％のｄＣ１８−１ｃｏｉ（Ｐ２Ｋ）−Ｐ７５０及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（以下の式Ｉを参照）を、ガラスバイアル中のメタノールに溶かした。薬物充填混合ミセルのために、薬物（１０重量％）を混合物に添加した。真空オーブン中で、３時間かけて溶媒を蒸発させた。乾燥させたフィルムを、２５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４で再水和させ、そして溶液を１６時間撹拌し、混合ミセルへの集合を可能にさせた。遠心分離、及びその後のスピン限外ろ過（Ａｍｉｃｏｎ遠心分離フィルターユニット、ＭＷカットオフ：３０００Ｄａ）により、塩及び遊離薬物を除去した。得られた濃縮物を水で洗浄し、そして凍結乾燥させて、混合ミセルを得た。
空のミセル、及び薬物充填ミセルの両方を、３−らせんミセルと同じように特徴化した。ＳＥＣ及びＤＬＳを行い、混合ミセルのサイズ及びサイズ分布を決定した。ＨＰＬＣにより、薬物充填含有量を決定した。ＤＳＣを行い、ミセルコア構造を研究した。透析袋法を用いて、放出実験を行った。
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ及びｄＣ１８−１ｃｏｉ（Ｐ２Ｋ）−Ｐ７５０が集合し、一様の混合ミセルを形成することを示すピレン蛍光アッセイを用いて、固有の臨界ミセル濃度（〜１．５μＭ）を決定した（図２９ａ）。サイズ排除クロマトグラフィーにより、均質集団としてのミセルの溶出を観察した（図２９ｂ）。混合ミセル中のペプチドヘリシティは〜８０％であり、ペプチド構造が維持されたことを示した（図３０ａ）。ＤＳＣにより、混合ミセルのアルキルコアの相転移を分析し（図３０ｂ）：実験データのデコンボリューションは、１１．５℃及び１５．４℃のＴt値をもたらした。
観察された混合ミセルのラパマイシン充填能は、７〜８重量％であり；これは、ｄＣ１８−１ｃｏｉ（Ｐ２Ｋ）−Ｐ７５０だけを含むミセルのものよりもかなり高かった（表１を参照）。混合ミセルの構造及び狭いサイズ分布は、動的光散乱（図３１ａ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（図３１ｂ）により観察されたように、ラパマイシン充填の間に維持される。
混合ミセルからのラパマイシン放出は、ｄＣ１８−１ｃｏｉ（Ｐ２Ｋ）−Ｐ７５０だけを含むミセルと比べて長く持続した（図３２）。任意の特定の理論にとらわれずに、ＤＳＰＥ−ＰＥＧが存在しないミセルからのラパマイシンのより速い拡散が、この相違の主な原因であり得ると考えられる。混合ミセルは、３７℃で、ＢＳＡ溶液における長時間の安定性を実証したが（図３３ａ）、混合ミセルの安定性は、ｄＣ１８−１ｃｏｉ（Ｐ２Ｋ）−Ｐ７５０だけを含むミセルよりもわずかに低かった（図３３ｂ）。
上記の発明は、理解の明確性を目的にする説明及び実施例の手段により、いくつかの詳細において発表したが、当業者は、特定の変化及び修正が、添付の特許請求の範囲内で実行され得ることを理解するだろう。さらに本明細書において提供されるそれぞれの参照は、あたかもそれぞれの参照が、参照により個々に導入されているかのように、参照により、同一の範囲まで、その全体において本明細書に組み込まれている。本願と本明細書において提供される参照の間で矛盾が存在する場合、本願が優位に立つべきである。
配列表
配列番号１
ＥＶＥＡＬＥＫＫＶＡＡＬＥＣＫＶＱＡＬＥＫＫＶＥＡＬＥＨＧＷ
配列番号２
ＧＧＧＥＩＷＫＬＨＥＥＦＬＣＫＦＥＥＬＬＫＬＨＥＥＲＬＫＫＭ
配列番号３
ＡＹＳＳＧＡＰＰＭＰＰＦ
配列番号４
ＥＧＫＡＧＥＫＡＧＡＡＬＫＣＧＶＱＥＬＥＫＧＡＥＡＧＥＧＧＷ
配列番号５
ＥＶＥＡＬＥＫＫＶＡＡＬＥＳＫＶＱＡＬＥＫＫＶＥＡＬＥＨＧＷ
配列番号６
ＥＶＥＡＬＥＫＫＶＡＡＬＥＣＫＶＱＡＬＥＫＫＶＥＡＬＥＨＧＷＧＧＧＫ

Claims (31)

  1. 約１０〜約１００個のアミノ酸を有する第一のペプチド、ここで、前記ペプチドが、らせん構造をとり；
    前記ペプチドのＮ末端及びＣ末端アミノ酸残基以外のアミノ酸残基に共有結合した第一のポリマー；
    前記ペプチドのＣ−末端アミノ酸残基に共有結合した少なくとも１つの第二のポリマー；並びに
    前記ペプチドのＮ−末端に共有結合した疎水性部分、ここで、前記疎水性部分が、第三のポリマーまたは脂質部分を含む
    を含む、複合体。
  2. 前記ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から成る群から選択される、請求項１に記載の複合体。
  3. 前記第一のポリマー、及び前記第二のポリマーが、それぞれ親水性ポリマーを含む、請求項１に記載の複合体。
  4. 前記第一のポリマー及び前記第二のポリマーが、それぞれポリエチレングリコールを含む、請求項１に記載の複合体。
  5. 前記第一のポリマーの分子量が、約５００Ｄａ〜約１０，０００Ｄａである、請求項１に記載の複合体。
  6. 前記第一のポリマーの分子量が、約１０００Ｄａ〜約５０００Ｄａである、請求項５に記載の複合体。
  7. 前記第一のポリマーの分子量が、約２０００Ｄａである、請求項６に記載の複合体。
  8. 前記第二のポリマーの分子量が、約２５０Ｄａ〜約５０００Ｄａである、請求項１に記載の複合体。
  9. 前記第二のポリマーの分子量が、約５００Ｄａ〜約２０００Ｄａである、請求項８に記載の複合体。
  10. 前記第二のポリマーの分子量が、約７５０Ｄａである、請求項９に記載の複合体。
  11. 前記第三のポリマーが、ポリブタジエンを含む、請求項１に記載の複合体。
  12. 前記脂質部分が、１〜６個のＣ10~20アシル基を含む、請求項１に記載の複合体。
  13. 前記脂質部分が、１，２または４個のＣ10~20アシル基を含む、請求項１に記載の複合体。
  14. 前記ペプチドのＣ−末端に共有結合した第二のペプチドをさらに含む、請求項１に記載の複合体。
  15. 前記第二のペプチドが、ＧＧＧ、ＨＨＨ、ＫＫ、ＥＥ、ＲＧＤ及びＡＹＳＳＧＡＰＰＭＰＰＦから成る群から選択される構成要素を含む、請求項１４に記載の複合体。
  16. 前記第一のペプチドが、配列番号１を含み；
    前記第一のポリマーが、約２０００Ｄａの分子量を有するポリエチレングリコールを含み；
    前記第二のポリマーが、前記ペプチドのＣ−末端残基に結合し、そして約７５０Ｄａの分子量を有するポリエチレングリコールを含み；及び
    前記疎水性部分が、リシン及び２つのＣ18アシル鎖を含む脂質部分を含む、請求項１に記載の複合体。
  17. ２〜６個の請求項１に記載の複合体を含む、らせん束。
  18. ３個の複合体を含む、請求項１７に記載のらせん束。
  19. ４個の複合体を含む、請求項１７に記載のらせん束。
  20. 約２０〜約２００個の請求項１に記載の複合体を含む、粒子。
  21. 治療用薬剤、診断用薬剤、ＤＮＡ、及びオリゴヌクレオチドから成る群からそれぞれ独立して選択される、少なくとも１つの追加の作用剤をさらに含む、請求項２０に記載の粒子。
  22. 追加の作用剤が、蛍光色素分子、放射性核種、アントラサイクリン、タキサン、及びマクロライドから成る群からそれぞれ独立して選択される、請求項２１に記載の粒子。
  23. 追加の作用剤が、ドキソルビシン、パクリタキセル、及びラパマイシンから成る群からそれぞれ独立して選択される、請求項２２に記載の粒子。
  24. ＰＥＧ化脂質をさらに含む、請求項２０に記載の粒子。
  25. 前記ＰＥＧ化脂質が、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を含む、請求項２４に記載の粒子。
  26. 配列番号１を含む、第一のペプチド；
    約２０００Ｄａの分子量を有するポリエチレングリコールを含む、第一のポリマー；
    前記ペプチドのＣ−末端残基に共有結合し、そして約７５０Ｄａの分子量を有するポリエチレングリコールを含む、第二のポリマー；並びに
    リシン及び２つのＣ18アシル鎖を含む脂質部分を含む、疎水性部分；並びに
    ドキソルビシン、パクリタキセル、及びラパマイシンから成る群から選択される治療用薬剤をそれぞれ含む約２０〜約２００個の複合体を含む、粒子。
  27. ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００をさらに含む、請求項２６に記載の粒子。
  28. 前記ＤＳＰＥ−ＰＥＧ対前記複合体の比率が、重量で約１：１である、請求項２７に記載の粒子。
  29. 請求項２０に記載の粒子を形成するための方法であって、前記方法が、複数の請求項１に記載の複合体を、前記複合体を請求項２０に記載の粒子に自己集合させるのに十分な条件下で、維持することを含む、前記方法。
  30. 前記複合体が、約１ｎＭ〜約１Ｍの濃度である、請求項２９に記載の方法。
  31. ＰＥＧ化脂質を、前記複数の複合体に添加することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
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