CN104379158A - 双聚合物脂-肽缀合物及其纳米颗粒 - Google Patents

双聚合物脂-肽缀合物及其纳米颗粒 Download PDF

Info

Publication number
CN104379158A
CN104379158A CN201380029919.7A CN201380029919A CN104379158A CN 104379158 A CN104379158 A CN 104379158A CN 201380029919 A CN201380029919 A CN 201380029919A CN 104379158 A CN104379158 A CN 104379158A
Authority
CN
China
Prior art keywords
conjugate
micelle
polymer
peptide
1coi
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201380029919.7A
Other languages
English (en)
Inventor
徐婷
董赫
徐诗佳
尼基希尔·杜比
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California
Original Assignee
University of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California filed Critical University of California
Publication of CN104379158A publication Critical patent/CN104379158A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/088—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins conjugates with carriers being peptides, polyamino acids or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Other Resins Obtained By Reactions Not Involving Carbon-To-Carbon Unsaturated Bonds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明提供了双聚合物脂-肽缀合物，其包含疏水性嵌段和含有螺旋肽和两个聚合物嵌段的头基。所述缀合物能自组装形成螺旋束亚基，其进而组装以提供用于药物和其他试剂的胶束纳米载体。还公开了含有所述缀合物的颗粒和形成所述颗粒的方法。

Description

双聚合物脂-肽缀合物及其纳米颗粒
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年4月10日递交的美国临时专利申请第61/622,330号、2012年7月6日递交的美国临时专利申请第61/668,923号的优先权，以上申请的全部均通过引用整体并入本文。
关于在联邦政府资助研发项目下完成的发明的权利声明
本发明基于由美国国防部陆军办公室授予的基金编号W91NF-09-1-0374、由美国能源部科学办公室的基础能源科学办公室授予的资金编号DE-AC02-05CH11231，在政府资助下完成。政府拥有本发明的某些权利。
发明背景
据估计～40％的现有小分子药物具有较差的水溶解性和较短的循环半衰期，并且需要研制有效的药物制剂来改善其药代动力学、生物分布、毒性特征和效力。当经静脉给药时，通过由在实体瘤中常见的血管渗漏和较差的淋巴引流确定的增强的渗透和滞留(EPR)效应，纳米级载体提供了在肿瘤组织中聚集的额外优势。研究显示，随着渗出物进入肿瘤间隙，药物或药物包封载体应当能够运输远离肿瘤血管达100μm，以便到达肿瘤内所有的细胞。持续增加的证据表明药物在肿瘤内的有限渗透和分布，使得不能充分去除恶性细胞，这可能归因于治疗后肿瘤的重新填充。目前FDA批准了Doxil(阿霉素脂质体)(～100nm)和Abraxane(紫杉醇纳米制剂)(～130nm)，尽管具有很高的前景，其仅提供了中等的存活益处。这归因于化学治疗药物至肿瘤的低效运输，这是由于在血液循环期间它们具有相对较大的尺寸和药物渗漏。生理学因素，包括肿瘤位点的血管密度和异质性、间隙的流体压力和肿瘤间隙中的载体运输，影响纳米载体渗出进入肿瘤的程度。而且，纳米载体需要低于某个尺寸以实现有效的渗透，其中用于有效的肿瘤渗透的纳米载体直径范围取决于载体的形状、硬度和体系结构。最近采用小鼠中的人黑素瘤异种移植模型的研究表明，相比60nm的纳米颗粒，更小的颗粒即10-12nm量子点能够更有效地渗透由异常肿瘤血管和稠密间隙基质施加的生理屏障。采用树状聚合物，在恶性实体瘤微血管的血液-肿瘤屏障中，孔径大小的生理上限约为12nm。基于弹性蛋白样肽的～25nm大小的有机纳米颗粒，在鼠类癌症模型中产生了几乎完全的肿瘤消退。
药物载体的有效性还取决于其稳定性和药物在体内的滞留。为确保改善药物的毒性，药物需要滞留在胶束内直至到达靶标位点。除了增强的货运(cargo)稳定性和肿瘤渗透，对于有效的纳米载体一个同样重要的要求是稳定的循环和纳米载体清除之间的平衡。纳米载体最初必需大于6nm以获得延长的循环寿命，且随后需要分解为小于～6nm或50K Da的分子量的物质，以便通过肾脏中肾小球的过滤而从循环系统中被去除。产生大小范围为10-30nm，且结合了长循环半衰期、有效的肿瘤组织渗透、最小的货运渗漏和有效的亚基去除的有机纳米载体，依然是个巨大的挑战。
在热力学上，颗粒大小取决于颗粒表面和局部媒介物以及储存在所述颗粒中的粘附能量之间界面相互作用间的平衡。表面积与体积的比例和颗粒大小成反比。当颗粒大小降低至纳米级时，颗粒表面的低表面张力和/或纳米颗粒内部的高粘附能量密度是稳定单个纳米颗粒所需要的。根据与纳米颗粒形成和稳定有关的化学能的量，可将目前的有机纳米颗粒分为两类。在包括树状聚合物的一类纳米颗粒中，亚基通过共价键结合在一起，通常具有每摩尔几十千卡的能量。第二类有机纳米颗粒通过非共价键来稳定，通常具有每摩尔几千卡的能量。由于储存在颗粒中的能量相对较低，这些纳米颗粒通常具有很低的界面相互作用。
有机纳米颗粒的动力学稳定性决定了其在体内的稳定性、循环半衰期和清除途径。共价的纳米颗粒通常在常见生物条件下是稳定的，直至通过外来刺激如pH、温度、光和酶而发生共价键的化学降解。然而，对于非共价的纳米颗粒，亚基能够与局部的媒介物或在颗粒之间发生交换。当胶束大小降低时，尤其是当大小低于20nm时，所述交换的动能屏障降低。小胶束通常是流动的动态组装物，其中亚基两亲化合物与周围媒介物并与其他胶束持续交换。体内存在的稳定单个两亲化合物的化学阱(chemical trap)还降低了胶束的稳定性，并导致不期望的货运泄漏和分解。使头基进行化学交联和/或改造头基之间的多对分子间相互作用可有效地获得稳定的胶束。然而，生物分布研究显示了在肝脏和脾脏中的积累并引起了与可能的长期毒性有关的担忧。
因此，存在对小的(即级别为几十纳米大小)、稳定的、可从便利的材料组装而来并用于体内递送药物和其他货运物的胶束的未被满足的需求。出人意料的是，本发明解决了该需求和其他需求。
发明概述
在一些实施方案中，本发明提供了包含具有约10至约100个氨基酸的肽的缀合物，其中所述肽呈螺旋结构。所述缀合物还包含第一聚合物，其与所述肽的除N-端和C-端氨基酸残基以外的氨基酸残基共价连接；至少一个第二聚合物，其与所述肽的C-端氨基酸残基共价连接；和疏水部分，其与所述肽的N-端共价连接，其中所述疏水部分包含第三聚合物或脂质部分
在一些实施方案中，本发明提供了具有2-6个本发明的缀合物的螺旋束。
在一些实施方案中，本发明提供了具有约20至约200个本发明的缀合物的颗粒。
在一些实施方案中，本发明提供了具有约20至约200个本发明的缀合物的颗粒。每个缀合物包含具有SEQ ID NO:1的第一肽、含有分子量为约2000Da的聚乙二醇的第一聚合物、与所述肽的C-端残基共价连接且含有分子量为约750Da的聚乙二醇的第二聚合物，以及具有包含赖氨酸和两个C18酰基链的脂质部分的疏水部分。所述颗粒还包括选自阿霉素和雷帕霉素的治疗剂。
在一些实施方案中，本发明提供了形成本发明的颗粒的方法。所述方法包括：使本发明的多个缀合物接触，从而使得所述缀合物自组装形成所述颗粒。
在一些实施方案中，本发明还提供了将诊断剂或治疗剂递送至对象的方法，包括将颗粒给予所述对象。因此，所述颗粒包括约20至约200个本发明的缀合物和治疗剂。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗患病对象的方法。所述方法包括：将治疗有效量的颗粒给予至对象，其中所述颗粒包括约20至约200个本发明的缀合物和治疗剂。因而，所述疾病得到治疗。
附图说明
图1显示了将(a)双聚合物脂-肽缀合物组装形成(b)3-螺旋束亚基和(c)具有由3-螺旋束组成的壳和由脂肪链组成的核的胶束的示意图。
图2显示了(a)制备两亲性双聚合物脂-肽缀合物的合成方案，和(b)缀合物dC18-1coi(PEG2K)-PEG750的MALDI-TOF光谱。
图3显示了采用(a)圆二色谱法，(b)动态光散射，和(c)透射电镜检查的dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束的物理特性。
图4显示了dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束体内稳定性的评估。比较了图4(a)dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束和图4(b)DSPE-PEG2K胶束的时间分辨的FRET数据。图4(c)中描绘了标准化的FRET数据。
图5a显示了通过圆二色谱法分析dC16-1coi(PEG2K)-PEG750和dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束。图5b显示了在一个温度范围内记录的dC16-1coi(PEG2K)-PEG750和dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束的肽螺旋性。
图6a显示了通过差示扫描热量法分析dC16-1coi(PEG2K)-PEG750和dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束。图6b显示了通过FRET评估的dC16-1coi(PEG2K)-PEG750和dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束的稳定性。
图7显示了通过(a)尺寸排阻色谱分析，(b)动态光散射，和(c)荧光光谱法，对装载DOX的dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束的结构特性分析和热稳定性测量。
图8a显示了通过差示扫描热量法表征装载雷帕霉素的dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束。图8b显示了从装载的胶束释放雷帕霉素的动力学。
图9显示了通过尺寸排阻色谱来分析装载紫杉醇的dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束(装载的紫杉醇＝1.5wt％)。
图10显示了通过差示扫描热量法来分析装载紫杉醇的dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束。
图11显示了通过荧光光谱法评估于50mg/mL BSA中的装载紫杉醇的dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束在37℃随时间的稳定性。
图12显示了装载(a)阿霉素和(b)雷帕霉素的dC16-1coi(PEG2K)-PEG750和dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束的药物释放测量。
图13显示了(a)采用正电子发射断层成像(PET)的64Cu-dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束循环和稳定性的体内评估，(b)给予胶束后，随着时间的血液放射性曲线，和(c)血浆和血细胞中的放射性分布。
图14(a)显示了64Cu-dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束相比长循环脂质体的生物分布。图14(b)显示了64Cu-dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束相比长循环脂质体和常规DSPE-PEG2K胶束的生物分布。
图15显示了作为溶于25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的dC18-1coi(PEG2K)-PEG750的浓度的函数而监测的芘荧光性。
图16显示了溶于25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的60μMdC18-1coi(PEG2K)-PEG750的圆二色谱。
图17显示了溶于25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的200μMdC18-1coi(PEG2K)-PEG750的差示扫描热量分析热谱曲线。
图18显示了溶于25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的60μMdC18-1coi(PEG2K)-PEG750的动态光散射迹线。
图19显示了用于以药物装载缀合物胶束的过程。
图20显示了溶于25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的装载了阿霉素的dC18-1coi(PEG2K)-PEG750的动态光散射迹线。
图21显示了溶于25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的装载了阿霉素的dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束的尺寸排阻色谱。
图22显示了溶于25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的装载了阿霉素的dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束的荧光光谱。
图23显示了随时间记载的溶于含有50mg/ml血清白蛋白的25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的、装载了阿霉素的dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束的荧光光谱。
图24显示了溶于25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的装载了雷帕霉素的dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束的尺寸排阻色谱。
图25显示了(a)给药30分钟后64Cu-dC18-1coi(PEG2K)胶束，(b)给药24小时后64Cu-dC18-1coi(PEG2K)胶束，(c)给药30分钟后64Cu-dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束，和(d)给药24小时后64Cu-dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束，在体内的胶束定位的PET分析。
图26显示了64Cu-dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束和64Cu-dC18-1coi(PEG2K)胶束注射后48小时在血液、肝脏和脾脏中的放射性(％ID/g)的比较。
图27显示了64Cu-dC18-1coi(PEG2K)胶束、64Cu-dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束和64Cu-dC16-1coi(PEG2K)-PEG750胶束的药代动力学测量和生物分布数据；图27A显示了64Cu-dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束的较高浓度；图27B显示了与具有较高血液浓度的64Cu-dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束的相对血液浓度；图27C显示了在肝脏、脾脏和肾脏中的胶束的浓度；并且图27D显示了肿瘤中的胶束浓度，64Cu-dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束显示较高的浓度。
图28显示了混合胶束系统的示意图。
图29a显示了dC18-1coi(PEG2K)-PEG750/DSPE-PEG混合胶束的临界胶束浓度的确定。图29b显示了混合胶束的SEC分析。
图30显示了通过(a)圆二色谱和(b)差示扫描热量法来分析dC18-1coi(PEG2K)-PEG750/DSPE-PEG混合胶束。
图31显示了通过(a)动态光散射和(b)尺寸排阻色谱来分析装载了雷帕霉素的dC18-1coi(PEG2K)-PEG750/DSPE-PEG混合胶束。
图32a显示了从装载的dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束和dC18-1coi(PEG2K)-PEG750/DSPE-PEG混合胶束中释放雷帕霉素。图32b显示了根据Higuchi模型绘制的释放数据(R＝kt0.5)。
图33显示了通过(a)荧光光谱法和(b)FRET评估的dC18-1coi(PEG2K)-PEG750/DSPE-PEG混合胶束的稳定性。
发明详述
I.总述
本发明提供了胶束纳米载体，以用于体内递送药物和其他“货运物”。所述纳米颗粒可为靶向的或非靶向的。可通过本发明的纳米载体递送的合适的货运物包括但不限于，疫苗、核酸如DNA或RNA、肽、蛋白、造影剂和药物。本发明的纳米颗粒也可用于基因治疗，将表达的或可表达的核酸给予至对象。
所述纳米载体由能自组装形成胶束的双聚合物脂-肽缀合物组成。所述缀合物包含疏水性嵌段和含有螺旋肽和两个聚合物嵌段的头基。由所述肽形成螺旋束导致肽束N-末端处的疏水性嵌段在所述肽束的N-末端处对齐，其中一个聚合物嵌段沿所述肽的长度与所述肽共价连接，且另一个聚合物嵌段与所述肽的C-末端共价连接。源自缀合物组装的所述胶束在胶束表面上包含聚合物的壳。相比组装自没有C-端聚合物的缀合物的胶束和其他以前所知的自组装纳米载体结构，所述表面C-端聚合物尤其赋予了胶束纳米颗粒的惊人的稳定性和长循环时间。
II.定义
“缀合物”是指具有均连接在一起的第一聚合物、第二聚合物、肽和疏水部分的化合物。所述缀合物能够自组装形成螺旋束。所述螺旋束包含2-6个缀合物，通常为3或4个。
“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用以指氨基酸残基的聚合物。所有3个术语均适用于这样的氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在氨基酸的人工化学模拟物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。如本文所用，这几个术语包含任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。本发明的肽可为螺旋结构并形成卷曲螺旋的蛋白三级结构。卷曲螺旋三级结构的形成提供了放置缀合的聚合物并限定纳米颗粒的单个亚基的形状的结构骨架。该螺旋还增强了亚基的刚性并使得能够以类似于病毒颗粒的方式进行几何包装。
“N-端”是指蛋白或多肽序列中的第一氨基酸残基。N-端残基含有游离α-氨基。
“C-端”是指蛋白或多肽序列中的最后一个氨基酸残基。C-端残基含有游离的羧酸基(carboxylate group)。
“聚合物”是指具有通过共价键连接的重复亚基的大分子。聚合物可为亲水性的、疏水性的或两亲性的。亲水性聚合物与水基本上能混溶，且包括但不限于，聚乙二醇。疏水性聚合物与水基本上不能混溶，且包括但不限于，聚丁二烯和聚苯乙烯。两亲性聚合物兼具亲水性和疏水性，且通常为亲水性和疏水性聚合物的嵌段共聚物。聚合物包括均聚物、随机共聚物和嵌段共聚物。可用于本发明的具体聚合物包括聚乙二醇、N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、聚丁二烯和聚苯乙烯等。
“疏水部分”是指具有疏水性的聚合物或小分子。疏水部分的实例包括但不限于，疏水性聚合物如聚丁二烯和聚苯乙烯，以及本发明的脂质部分。
“脂质部分”是指具有至少一个脂质的部分。脂质是具有疏水性或两亲性特性的小分子，且可用于制备囊泡、胶束和脂质体。脂质包括但不限于，脂肪、蜡质、脂肪酸、胆固醇、磷脂质、甘油单酯、甘油双酯和甘油三酯。脂肪酸可为饱和的、单-不饱和或多-不饱和的。脂肪酸的实例包括但不限于，丁酸(C4)、己酸(C6)、辛酸(C8)、癸酸(C10)、月桂酸(C12)、肉豆蔻酸(C14)、棕榈酸(C16)、棕榈油酸(C16)、硬脂酸(C18)、异硬脂酸(C18)、油酸(C18)、异油酸(C18)、亚油酸(C18)、α-亚油酸(C18)、γ-亚麻酸(C18)、花生酸(C20)、鳕油酸(C20)、花生四烯酸(C20)、二十碳五烯酸(C20)、二十二烷酸(C22)、芥酸(C22)、二十二碳六烯酸(C22)、二十四烷酸(C24)和二十六烷酸(C26)。所述脂质部分可包含一些脂肪酸基团，其采用分枝的基团如赖氨酸和其他分枝的胺类。
“烷基”是指具有所示碳原子数目的直链或支链的、饱和的脂肪族基团。烷基可具有多达24个碳原子，且包括庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基等。烷基可包含任何数目的碳原子如C6-20、C6-18、C6-16、C8-24、C8-22和C8-20。烷基可被取代基包括氟基所取代。
“酰基”是指被如上所定义的烷基取代的羰基(即，C＝O)。酰基所示碳原子数目包括羰基碳和烷基碳。酰基可具有多达24个碳原子，且包括庚酰基、辛酰基、壬酰基、癸酰基、十二酰基、十三酰基、十四酰基、十五酰基、十六酰基、十七酰基、十八酰基、十九酰基、二十酰基等。酰基可包含任何数目的碳原子如C6-20、C6-18、C6-16、C8-24、C8-22和C8-20。酰基可被取代基包括氟基所取代。
“蒽环霉素”是指波赛链霉菌(Streptomyces peucetius)的天然产物和相关的衍生物。蒽环霉素是含有氨基糖和稠合的四环糖苷配基的糖苷。许多蒽环霉素显示出抗菌和抗肿瘤活性。蒽环霉素的实例包括但不限于，道诺霉素、阿霉素、表阿霉素和伊达比星。
“大环内酯”是指其特征在于被侧挂的脱氧糖取代的大(通常为14-至16元)内酯环。许多大环内酯展示了抗菌活性和免疫调节活性。大环内酯的实例包括但不限于，雷帕霉素、克拉霉素和红霉素。
“治疗剂”是指能够治疗和/或缓解疾病状况或疾病的试剂。治疗剂包括但不限于，化合物、药物、肽、寡核苷酸、DNA、抗体等。
“诊断剂”是指能够诊断疾病状况或疾病的试剂。诊断剂包括但不限于，染料和放射性示踪标记。
“核酸”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非被特别限定，该术语包括这样的核酸，其含有具有类似于参照核酸的结合特性且以类似于天然存在的核苷酸的方式被代谢的已知天然核苷酸类似物。术语核酸可与基因、cDNA和基因编码的mRNA互换使用。
“进行接触”是指使至少两种不同物质接触以便它们能够相互作用的过程。在一些情况下，这类相互作用包括非共价的相互作用，如离子间相互作用和范德华力相互作用。在一些情况下，所述相互作用导致形成共价键的反应。在这些情况下，应理解，所得的反应产物可直接从添加的试剂间的反应或从来自一种或多种添加的试剂的中间物(其可在反应混合物中产生)产生。
“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。
“氨基酸类似物”是指这样化合物，其具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构，即，与氢、羧基和R基团结合的α碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。该类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。
“非天然氨基酸”不由遗传密码编码，并且能够但并非必然具有与天然存在的氨基酸相同的基本结构。非天然氨基酸包括但不限于吖丁啶羧酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、叔丁基甘氨酸、2,4-二氨基异丁酸、锁链素、2,2'-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、高脯氨酸、羟基赖氨酸、别羟基赖氨酸、3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、N-甲基丙氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基戊基甘氨酸、N-甲基缬氨酸、萘基丙氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、戊基甘氨酸、哌啶酸和硫代脯氨酸。
“氨基酸模拟物”是指这样的化合物，其具有与氨基酸的通用化学结构不同的结构，但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用。
本文中的氨基酸可用通常所知的3个字母符号表示，或者可用IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的单个字母符号来表示。同样地，核苷酸可用其通常被接受的单个字母代码来表示。
“保守性修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。关于特定核酸序列，“保守性修饰的变体”是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸被密码子指定的每个位置，所述密码子可改为所描述的不改变所编码的多肽的任何相应的密码子。这类核酸变异为“沉默变异”，其为保守修饰的变异中的一种。本文的每种编码多肽的核酸序列还描述了核酸的每种可能的沉默变异。本领域技术人员应理解，核酸中的每个密码子(除AUG和TGG外，AUG通常为蛋氨酸的唯一密码子，TGG通常为色氨酸的唯一密码子)均可被修饰而产生功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异均隐含在每个描述的序列中。
对于氨基酸序列，本领域技术人员应理解改变、添加或缺失编码的序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸的对于核酸、肽、多肽或蛋白序列的单个替换、缺失或添加，是“保守性修饰的变体”，其中所述改变使得用化学上类似的氨基酸(即，疏水性、亲水性、带正电荷、中性、带负电荷)来替换一个氨基酸。示例性疏水性氨基酸包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。示例性芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。示例性脂肪族氨基酸包括丝氨酸和苏氨酸。示例性碱性氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。具有羧酸盐侧链的示例性氨基酸包括天冬氨酸盐和谷氨酸盐。具有甲酰胺侧链的示例性氨基酸包括天冬酰胺和谷氨酰胺。提供功能类似的氨基酸的保守替换表为本领域所熟知。这类保守性修饰的变体补充了并且不排除本发明的多形态的变体、种间同系物和等位基因。
以下8个组各自包含能作为彼此的保守替换的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和
8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)
(参见，例如，Creighton,Proteins(1984))。
“螺旋束”是指通过多个本发明的缀合物的自组装而形成的结构，其中疏水部分在肽束一端(通常为N-末端)彼此对齐，且每个缀合物的聚合物沿着所述肽束的长度并在与疏水部分相对的肽束一端(通常为C-末端)排列。
“给药”是指经口给药、作为栓剂给药、局部接触、肠胃外、静脉内、腹膜内、肌肉内、病灶内、鼻内或皮下给药、囊内给药或向对象植入缓释装置，例如微型渗透泵。
“治疗(treat/treating/treatment)”是指在治疗或缓解损伤、病理、疾病状况或症状(例如，疼痛)中的任何成功指标，包括任何客观的或主观的参数如症状的减少、缓解、消退，或使症状、损伤、病理或疾病状况对于患者或对象更加可忍受；减少症状或疾病状况的频率或时长，或者在一些情况下，防止症状或疾病状况的发作。症状的治疗或缓解可基于任何客观的或主观的参数，包括例如，体检的结果。
“癌症”包括实体瘤和恶性血液病。癌症包括诸如脑癌、乳腺癌、结肠癌和卵巢癌，以及白血病、淋巴癌和骨髓瘤的癌症。
“治疗有效的量或剂量”或“治疗上足够的量或剂量”或“有效量或足够的量或剂量”是指给予的产生治疗效果的剂量。确切的剂量取决于治疗目的，并且可由本领域技术人员采用已知技术来确定(参见，例如，Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(vols.1-3,1992)；Lloyd,The Art,Science andTechnology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,DosageCalculations(1999)；和Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20th Edition,2003,Gennaro,Ed.,Lippincott,Williams&Wilkins)。在敏化的细胞中，所述治疗有效剂量常常可以低于常规用于非敏化细胞的治疗有效剂量。
III.缀合物、螺旋束和颗粒
在一些实施方案中，本发明提供了具有约10至约100个氨基酸长度的第一肽的缀合物，其中所述肽呈螺旋结构。所述缀合物还包含：第一聚合物，其与所述肽的除N-端和C-端残基以外的氨基酸残基共价连接；至少一个第二聚合物，其与所述肽的C-端氨基酸残基共价连接；和疏水部分，其与所述肽的N-端共价连接，其中所述疏水部分包含第三聚合物或脂质部分。
可用于本发明的缀合物的肽是呈螺旋构象的那些。所述肽可为任何合适的长度，如约10至约1000个氨基酸，或约10至约500个氨基酸，或约10至约100个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽可为SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。
在优选的实施方案中，所述第一肽能够自我结合形成三级肽结构。在一些实施方案中，所述第一肽可为从头设计的3-螺旋束肽，诸如但不限于，SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，1-50个氨基酸可被添加至所述第一肽的C-端而不妨碍胶束形成。在一些实施方案中，1-25个氨基酸，优选1-10个氨基酸，且更优选1-5个氨基酸可被添加至所述第一肽的C-端。在一些实施方案中，所述第一肽序列可为形成无规则卷曲的对照肽序列，诸如但不限于，SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，所述第一肽可基于SEQ ID NO:5来设计，并具有类似的特性包括PI和疏水性。在一些实施方案中，所述第一肽序列可为结合血红素的肽，其能够形成4-螺旋束如SEQID NO:2。
本发明的缀合物还包含第一聚合物和第二聚合物。所述第一和第二聚合物可为任何合适的聚合物。示例性聚合物包括亲水性、疏水性和两亲性聚合物。作为非限制性实例，所述第一聚合物和所述第二聚合物可独立地选自：聚乙二醇(PEG或P)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(NIPAM)、聚丁二烯(PBD)和聚苯乙烯(PS)。在一些实施方案中，所述第一聚合物和所述第二聚合物包括亲水性聚合物。亲水性聚合物可与水混合，且包括但不限于，聚乙二醇、NIPAM和纤维素。在一些实施方案中，所述第一聚合物和所述第二聚合物包括聚乙二醇。
所述第一聚合物可连接至所述肽的除N-端氨基酸残基和C-端氨基酸残基以外的任何位点。任何合适的共价连接均可用于使所述第一聚合物连接至肽。例如，所述共价连接可为通过酯、酰胺、醚、硫醚或碳连接。在一些实施方案中，所述第一聚合物可用马来酰亚胺来修饰，其与所述肽的巯基(如半胱氨酸上的)反应。在一些实施方案中，通过使叠氮化物与炔烃反应而形成三唑环，所述第一聚合物可通过点击化学与所述肽相连。
通常，所述第二聚合物连接至聚合物的C-端氨基酸残基。例如，具有氨基的第二聚合物可通过酰胺键直接共价连接至C-端羧酸盐。所述第二聚合物也可连接至C-端氨基酸残基的侧链。具有马来酰亚胺的第二聚合物例如，可连接至C-端半胱氨酸侧链的硫醇基。可选择地，具有羧酸盐(或活化的羧酸盐衍生物)的第二聚合物可连接至C-端赖氨酸侧链的ε-氨基。很多其他连接策略为本领域技术人员所知且可用于合成本发明的缀合物。这样的策略描述于“Bioconjugate Techniques”，第二版，G.T.Hermanson,Academic Press,Amsterdam,2008。
将所述第二聚合物连接至所述肽的C-端可调节外部环境与由缀合物组装产生的胶束之间的相互作用。在一些情况下，所述第二聚合物可使胶束与给予胶束的对象中的非靶标细胞或组织之间不期望的相互作用最小化。此外，所述第二聚合物可用于促进与体外或体内靶标的期望的相互作用。所述缀合物的多聚体螺旋束可用作在胶束表面呈递配体的平台，以使所述纳米载体主动靶向期望的位置。胶束表面上的所述第二聚合物可用于调整配体簇之间的距离并调节多价配体结合至靶标细胞或组织。而且，所述第二聚合物还可用于调节胶束稳定性。不希望受任何具体理论的束缚，据认为肽螺旋束之间的分子间相互作用和在外表面上压缩C-端第二聚合物，能够增加亚基解吸附的活化能屏障并为所述胶束提供稳定性。
缀合物组装特性以及缀合物束和胶束的稳定性，部分取决于缀合物结构和所述缀合物中的聚合物的分子量。缀合物的形状将影响由缀合物组装形成的胶束的尺寸和形状。可挑选所述第一聚合物和所述第二聚合物的分子量以便调节胶束的组装和稳定性。通常，聚合物分子量足够大以便稳定所组装的胶束，但没有大到干扰螺旋束组装和胶束组装。在一些实施方案中，所述第一聚合物的分子量可为约500Da至约10,000Da。在一些实施方案中，所述第一聚合物的分子量可为例如，约1000Da至约7500Da，或约2000Da至约5000Da。所述第一聚合物的分子量可为约500Da或约1000Da或约2000Da或约3000Da或约4000Da或约5000Da或约6000Da或约7000Da或约8000Da或约9000Da或约10,000Da。在一些实施方案中，所述第一聚合物的分子量可为约1000Da至约5000Da。在一些实施方案中，所述第一聚合物的分子量可为约2000Da。
在一些实施方案中，所述第二聚合物的分子量可为约250Da至约5000Da。在一些实施方案中，所述第二聚合物的分子量可为例如，约300Da至约2500Da，或约750Da至约2000Da。在一些实施方案中，所述第二聚合物的分子量可为约250Da或约300Da或约350Da或约400Da或约500Da或约1000Da或约1250Da或约1500Da或约1750Da或约2000Da或约3000Da或约4000Da或约5000Da。在一些实施方案中，所述第二聚合物的分子量为约500Da至约2000Da。在一些实施方案中，所述第二聚合物的分子量为约750Da。
在一些实施方案中，所述疏水部分可为第三聚合物。可用作疏水部分的聚合物包括疏水性聚合物如聚丁二烯、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚二乙炔等。在一些实施方案中，所述疏水部分可为聚丁二烯。在一些实施方案中，所述第三聚合物可为约1000Da至约3000Da。在一些实施方案中，所述第三聚合物可为约1100Da至约2600Da。在一些实施方案中，所述第三聚合物可为约1000Da至约2000Da。
在一些实施方案中，所述疏水部分可为脂质部分。可用于本发明的脂质部分包括1-20个长酰基链、1-10个酰基链或1-6个酰基链，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个酰基链。所述脂质部分可从脂肪酸制备，其包括但不限于，癸酸(C10)、月桂酸(C12)、肉豆蔻酸(C14)、棕榈酸(C16)、棕榈油酸(C16)、硬脂酸(C18)、异硬脂酸(C18)、油酸(C18)、异油酸(C18)、亚油酸(C18)、α-亚油酸(C18)、γ-亚麻酸(C18)、花生酸(C20)、鳕油酸(C20)、花生四烯酸(C20)、二十碳五烯酸(C20)、二十二烷酸(C22)、芥酸(C22)、二十二碳六烯酸(C22)、二十四烷酸(C24)和二十六烷酸(C26)。
所述脂质部分中的示例性酰基包括C10-20酰基链，如C10、C12、C14、C16、C18或C20酰基。在一些实施方案中，所述脂质部分具有至少一个C14酰基，或至少一个C16酰基。当所述脂质部分包括多于一个酰基时，所述脂质部分还包括提供连接多个酰基的支链接头。可用于本发明的支链接头包括但不限于，赖氨酸、谷氨酸以及其他支链胺类和羧酸。在一些实施方案中，所述脂质部分包括1-6个C10-20酰基。所述脂质部分可包括1、2、3、4、5或6个C10-20酰基。在一些实施方案中，所述脂质部分包括1、2或4个C10-20酰基。在一些实施方案中，所述脂质部分包括1个C10-20酰基。在一些实施方案中，所述脂质部分包括2个C10-20酰基。
当所述第二聚合物连接至所述第一肽的C-端氨基酸残基的侧链时，所述C-端羧化物可用于连接至其他部分。在所述第一肽C-端的部分可为任何有用的结合或标记部分，其包括但不限于，氨基酸残基、寡核苷酸、多肽、抗体、诊断剂、治疗剂和聚合物。在一些实施方案中，本发明提供了如上所述的缀合物，其包括共价连接至所述第一肽C-端的第二肽。所述第二肽可具有任何合适数目的氨基酸，如2至约100个或2至约50个或2至约20个氨基酸。在一些实施方案中，所述氨基酸残基可为GGG、HHH、KK、EE、RGD和AYSSGAPPMPPF以及它们的组合。其他第二肽可用于本发明的缀合物。可选择地，其他的部分可在所述第二聚合物的链末端与缀合物共价连接。
在一些实施方案中，本发明提供了如上所述的缀合物，其中所述肽为SEQ ID NO:1，所述第一聚合物为分子量约2000Da的聚乙二醇，所述第二聚合物为分子量约750Da的聚乙二醇并与所述肽的C-端残基连接，且所述疏水部分为包含赖氨酸和两个C18酰基链的脂质部分。
本发明还提供了由多个缀合物自组装形成的螺旋束。所述螺旋束可由2、3、4、5、6、7、8、9或10个缀合物组成。在一些实施方案中，本发明提供了具有2-6个本发明的缀合物的螺旋束。在一些实施方案中，所述螺旋束包含3个缀合物。在一些实施方案中，所述螺旋束包含4个缀合物。
本发明还提供了由所述螺旋束自组装形成的颗粒，如所述疏水部分形成具有疏水核心的胶束结构，且螺旋束头基位于所述核心的外部。所述颗粒可包括任何合适数目的缀合物。在一些实施方案中，本发明提供了具有约20至约200个本发明的缀合物的颗粒。所述颗粒可为任何合适的尺寸。例如，所述颗粒的直径可为约5nm至约500nm或约5nm至约100nm或约5nm至约50nm，或者直径为约5nm至约25nm。
本发明的颗粒可包含所述颗粒疏水内部的货运物。在一些实施方案中，所述颗粒包含至少一种选自治疗剂、诊断剂、DNA、寡核苷酸或其他有用试剂的其他试剂。治疗剂的实例包括但不限于，蒽环霉素(如阿霉素、道诺霉素、表阿霉素等)、大环内酯(如雷帕霉素、藤霉素(fujimycin)、吡美莫司等)、烷化剂(如替莫唑胺、甲基苄肼、六甲蜜胺等)、紫杉烷和长春花生物碱。诊断剂的实例包括但不限于，发色团、荧光团和放射性核素。本发明的缀合物、螺旋束和颗粒可连接至其他颗粒如用于成像和操作目的的直径通常为几纳米的金纳米颗粒和磁性纳米颗粒。在一些实施方案中，本发明提供了如上所述的颗粒，其中每种其他的试剂独立地选自荧光团、放射性核素、蒽环霉素、紫杉烷和大环内酯。在一些实施方案中，每种其他的试剂独立地选自阿霉素、紫杉醇和雷帕霉素。可选择地，所述其他试剂共价地或非共价地连接至所述两亲性缀合物的肽部件、第一聚合物部件和第二聚合物部件中的一个、其组合或全部。
在一些实施方案中，本发明提供了具有约20至约200个本发明的缀合物的颗粒。每个缀合物包含具有SEQ ID NO:1的第一肽、含有分子量为约2000Da的聚乙二醇的第一聚合物、共价连接至所述肽的C-端残基且包含分子量为约750Da的聚乙二醇的第二聚合物，和具有包含赖氨酸和两个C18酰基链的脂质部分的疏水部分。所述颗粒还包含选自阿霉素、紫杉醇和雷帕霉素的治疗剂。
其他材料可被掺入至所述颗粒中以形成混合胶束。例如，混和胶束可包含合适的脂质化合物，合适的脂质可包括但不限于：脂肪、蜡、甾醇、胆甾醇、脂溶性维生素、甘油单酯、甘油二酯、磷脂、鞘脂、糖脂、衍生脂质等。在一些实施方案中，合适的脂质可包括两亲性的、中性的、非阳离子的、阴离子的、阳离子的或疏水性的脂质。在某些实施方案中，脂质可包括通常出现在细胞膜中的那些，如磷脂和/或鞘脂。合适的磷脂包括但不限于：磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酸(PA)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)。非阳离子性脂质包括但不限于：二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)、二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、1,2-二反油酸酰基(dielaidoyl)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE)和心磷脂。
所述脂质也可包括衍生的脂质，如PEG化的脂质。PEG化的脂质通常含有本文描述的脂质部分，其共价缀合至一个或多个PEG链。所述PEG可为直链的或支链的，其中支链的PEG分子可具有自中央核发散的额外的PEG分子和/或多个PEG分子可接枝至聚合物骨架。PEG可包括低或高分子量PEG，例如PEG500、PEG2000、PEG3400、PEG5000、PEG6000、PEG9000、PEG10000、PEG20000或PEG50000，其中所述数目例如，500表示平均分子量。衍生的脂质可包括例如，DSPE-PEG2000、胆固醇-PEG2000、DSPE-聚甘油或其他本领域通常熟知的衍生物。
因此，本发明的一些实施方案提供了如上所述的颗粒，其还包含PEG化的脂质。在一些实施方案中，所述PEG化的脂质可为DSPE-PEG2000。任何合适量的PEG化脂质可用于形成混合胶束。通常，所述PEG化的脂质与肽缀合物的重量比为约0.1:1至约10:1。所述PEG化脂质与螺旋束缀合物的重量比可为例如，约0.1:1、0.5:1、1:1、2.5:1、5:1或10:1。可用于本发明的颗粒的PEG化脂质的其他用量，取决于PEG化的脂质本身的结构和所述肽缀合物的性质。在一些实施方案中，所述颗粒可包括重量比为约1:1的DSPE-PEG2000和如上所述的肽缀合物。
IV.纳米颗粒的制备方法
本发明的纳米颗粒可通过本领域技术人员已知的任何合适方法来制备。例如，所述纳米颗粒可通过首先将所述缀合物溶解于以下任何浓度的合适溶剂中来制备：约1nM至约1M或约1μM至约100mM或约1mM至约100mM。可选择地，所述缀合物可以溶液的约0.1至约50wt.％或约1至约50wt.％或约1至约25wt.％的浓度进行溶解。所述缀合物自组装形成本发明的螺旋束。然后所述螺旋束自组装形成所述颗粒。在一些实施方案中，本发明提供了通过将多个本发明的缀合物维持在足以允许所述缀合物自组装形成本发明的颗粒的条件下，而形成本发明的颗粒的方法。在一些实施方案中，所述缀合物的浓度为约1nM至约1M。在一些实施方案中，所述缀合物的浓度为约1μM至约1M。在一些实施方案中，所述缀合物的浓度为约1μM至约1100mM。在一些实施方案中，所述缀合物的浓度为约1μM至约1mM。
本发明的方法还可用于形成上述混合胶束。因此，其他化合物如PEG化的脂质可用于与肽缀合物共组装。在一些实施方案中，本发明提供了通过将多个缀合物维持在足以允许所述缀合物自组装形成所述颗粒的条件下，并通过进一步添加PEG化的脂质至多个缀合物，而形成颗粒的方法。
在含水溶剂中，本发明的缀合物能够自组装，从而使得所述亲水性部分定向于所述纳米载体的外部，且所述疏水性部分定向于内部，因而形成胶束。当使用非极性溶剂时，可形成反胶束，其中所述亲水性部分定向于所述纳米载体的内部，且所述疏水性部分定向于所述纳米载体的外部。
V.药物递送的方法
在一些实施方案中，本发明提供了将诊断剂或治疗剂递送至对象的方法，其包括向所述对象给予颗粒。在一些实施方案中，所述颗粒包封所述诊断剂或治疗剂。在其他实施方案中，所述诊断剂或治疗剂缀合或偶联至本发明的颗粒。因此，所述颗粒包含约20至约200个本发明的缀合物和待递送的诊断剂或治疗剂。在一些实施方案中，所述治疗剂选自阿霉素、替莫唑胺和雷帕霉素。
可进行治疗剂的递送以便荷载药物的胶束选择性地在对象中期望的位点如特定器官或肿瘤处积聚。在一些情况下，胶束在靶标位点的积聚可能是由于某些组织如癌症组织增加的渗透性和保留特性。以这种方式的积聚可部分源于胶束的大小，且可能不需要特别的靶向功能。在其他情况下，本发明的胶束也可包含用于如上所述的主动靶向的配体。也可通过将荷载药物的胶束直接给予至期望的位点来完成靶向递送。在一些实施方案中，治疗剂递送可包括通过肿瘤内输注来给予本发明的颗粒。
本发明的纳米颗粒可用于以靶向的或非靶向的方式递送任何合适的货物。合适的货运物包括但不限于，疫苗、核酸如DNA或RNA、肽、蛋白、造影剂和药物。本发明的纳米颗粒也可用于基因治疗、将表达的或可表达的核酸给予对象。
所述纳米载体货物可被包封在所述纳米载体中。
靶向试剂
通常，本发明的靶向试剂可结合任何目标靶标，如与器官、组织、细胞、胞外基质或胞内区域有关的靶标。在某些实施方案中，靶标可能与特定疾病状态如癌症状况有关。在一些实施方案中，所述靶向部件可能仅对一个靶标如受体具有特异性。合适的靶标可包括但不限于：核酸如DNA、RNA或其修饰的衍生物。合适的靶标也可包括但不限于蛋白如胞外蛋白、受体、细胞表面受体、肿瘤标记、跨膜蛋白、酶或抗体。合适的靶标可包括碳水化合物如可例如出现在细胞表面上的单糖、二糖或多糖。
在某些实施方案中，靶向试剂可包括靶标配体、靶标配体的小分子模拟物或者对特定靶标具有特异性的抗体或抗体片段。在一些实施方案中，靶向试剂可进一步包括叶酸衍生物、B-12衍生物、整合蛋白RGD肽、NGR衍生物、生长激素抑制素衍生物或与生长激素抑制素受体结合的肽，例如，奥曲肽(octreotide)和奥曲肽盐等。本发明的靶向试剂也可包括适体。适体可设计为与目标靶标联合或结合。适体可由例如DNA、RNA和/或肽组成，且适体的某些方面为本领域所熟知(参见例如，Klussman,S.,Ed.,The Aptamer Handbook,Wiley-VCH(2006)；Nissenbaum,E.T.,Trends inBiotech.26(8):442-449(2008))。
治疗剂
用于本发明的治疗剂或试剂可包括旨在治疗对象的疾病状况的任何试剂。通常，可使用本领域所知的任何治疗剂，包括但不限于以下文献中所列举的试剂：United States Pharmacopeia(U.S.P.),Goodman andGilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,第10版,McGraw Hill,2001；Katzung,Ed.,Basic and Clinical Pharmacology,McGraw-Hill/Appleton&Lange,第8版,2000年9月21日；Physician’s DeskReference(Thomson Publishing；和/或The Merck Manual of Diagnosis andTherapy,第18版,2006,Beers and Berkow,Eds.,Merck Publishing Group；或者，在动物情形下,The Merck Veterinary Manual,第9版,Kahn Ed.,Merck Publishing Group,2005；以上所有文献均通过引用并入本文。
可根据期望治疗的疾病类型来选择治疗剂。例如，某些类型的癌症或肿瘤如癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤和中枢神经系统癌症以及实体瘤和混合瘤，可能涉及给予相同或可能不同的治疗剂。在某些实施方案中，可递送治疗剂以治疗或影响对象中的癌症疾病状态，且可包括化学治疗剂如烷化剂、抗代谢物、蒽环霉素、生物碱、拓扑异构酶抑制剂和其他抗癌剂。在一些实施方案中，所述试剂可包括反义试剂、微小RNA、siRNA和/或shRNA试剂。
治疗剂可包括抗癌剂或细胞毒性剂，包括但不限于：阿瓦斯汀、阿霉素、替莫唑胺、雷帕霉素、铂类如顺铂、奥沙利铂和卡铂、胞苷、氮杂胞苷、5-氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨、卡培他滨、喜树碱、博来霉素、道诺霉素、长春新碱、拓扑替康或紫杉烷如紫杉醇和多西他赛。
本发明的治疗剂还可包括用于治疗应用的放射性核素。例如，可将奥格(Auger)电子发射器如111In组合螯合剂如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或1,4,7,10-四氮杂环十二烷基-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)，并包含在待用于治疗的纳米颗粒中。其他合适的放射性核素和/或放射性核素-螯合剂组合，可包括但不限于：β-放射性核素(177Lu、153Sm、88/90Y)组合DOTA、64Cu-TETA、188/186Re(CO)3-IDA；188/186Re(CO)三胺(环状或线性)、188/186Re(CO)3-Enpy2和188/186Re(CO)3-DTPA。
诊断剂
用于本发明的诊断剂可包括本领域已知的任何诊断剂，例如以下文献中所提供的：Armstrong et al.,Diagnostic Imaging,第5版,BlackwellPublishing(2004)；Torchilin,V.P.,Ed.,Targeted Delivery of Imaging agents,CRC Press(1995)；Vallabhajosula,S.,Molecular Imaging:Radiopharmaceuticals for PET and SPECT,Springer(2009)。可通过各种方法检测诊断剂，包括作为提供和/或增强可检测信号的试剂，其包括但不限于，γ-发射、放射性、反射性、光学的、荧光的、吸收性、磁性或断层摄影术信号。用于诊断剂成像的技术可包括但不限于，单光子发射计算机断层成像(SPECT)、磁共振成像(MRI)、光学成像、正电子发射断层成像(PET)、计算机断层成像(CT)、x-射线成像、γ-射线成像等。
在一些实施方案中，诊断剂可包含结合至用于各种诊断成像技术的金属离子的螯合剂。示例性的螯合剂包括但不限于：乙二胺四乙酸(EDTA)、[4-(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1-基)甲基]苯甲酸(CPTA)、环己烷二胺四乙酸(CDTA)、乙二醇双(氧亚乙基次氮基)四乙酸(EGTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、柠檬酸、羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、亚氨基二乙酸(IDA)、三乙烯四胺六乙酸(TTHA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四(亚甲基膦酸)(DOTP)、1,4,8,11-四氮杂环十二烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)和它们的衍生物。
放射性同位素可被掺入至一些本文描述的诊断剂中，且可包括发射γ射线、正电子、β和α粒子以及X-射线的放射性核素。合适的放射性核素包括但不限于：225Ac、72As、211At、11B、128Ba、212Bi、75Br、77Br、14C、109Cd、62Cu、64Cu、67Cu、18F、67Ga、68Ga、3H、123I、125I、130I、131I、111In、177Lu、13N、15O、32P、33P、212Pb、103Pd、186Re、188Re、47Sc、153Sm、89Sr、99mTc、88Y和90Y。在某些实施方案中，放射性试剂可包括111In-DTPA、99mTc(CO)3-DTPA、99mTc(CO)3-ENPy2、62/64/67Cu-TETA、99mTc(CO)3-IDA和99mTc(CO)3三胺(环状或线性)。在其他实施方案中，所述试剂可包括具有111In、177Lu、153Sm、88/90Y、62/64/67Cu或67/68Ga的DOTA及其各种类似物。在一些实施方案中，例如通过掺入螯合基团如DTPA-脂质，所述胶束可被放射标记，如以下文献中所提供的：Phillips et al.,Wiley InterdisciplinaryReviews:Nanomedicine and Nanobiotechnology,1(1):69-83(2008)；Torchilin,V.P.&Weissig,V.,Eds.Liposomes 2nd Ed.:Oxford Univ.Press(2003)；Elbayoumi,T.A.&Torchilin,V.P.,Eur.J.Nucl.Med.Mol.Imaging33:1196–1205(2006)；Mougin-Degraef,M.et al.,Int’l J.Pharmaceutics344:110-117(2007)。
在其他实施方案中，所述诊断剂可包括光学试剂如荧光剂、磷光剂、化学发光剂等。本领域已知有众多试剂(例如，染料、探针、标记物或指示物)并可将其用于本发明中。(参见，例如，Invitrogen,The Handbook—AGuide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies,Tenth Edition(2005))。荧光剂可包括各种有机和/或无机的小分子或各种荧光蛋白和它们的衍生物。例如，荧光剂可包括但不限于：花青、酞菁、卟啉、吲哚菁、罗丹明、吩恶嗪、苯基氧杂蒽、吩噻嗪、吩硒嗪、荧光素、苯并卟啉、方酸、二吡咯嘧啶酮、并四苯、喹啉、吡嗪、咕琳、克酮酸鎓(croconium)、吖啶酮、菲啶、若丹明、吖啶、蒽醌、硫属吡喃鎓类似物、二氢卟酚、萘酞菁、次甲基染料、吲哚鎓染料、偶氮化合物、薁、氮杂薁、三苯基甲烷染料、吲哚、苯并吲哚、吲哚羰花青、苯并吲哚羰花青和具有通式结构4,4-二氟-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省的BODIPYTM衍生物和/或它们的任何缀合物和/或衍生物。可使用的其他试剂包括但不限于，例如，荧光素、荧光素-聚天冬氨酸缀合物、荧光素-聚谷氨酸缀合物、荧光素-聚精氨酸缀合物、吲哚菁绿、吲哚菁-十二天冬氨酸缀合物、吲哚菁-聚天冬氨酸缀合物、异硫蓝、吲哚二磺酸盐、苯并吲哚二磺酸盐、二(乙基羧甲基)吲哚菁、二(戊基羧甲基)吲哚菁、聚羟基吲哚磺酸盐、聚羟基苯并吲哚磺酸盐、刚性杂原子吲哚磺酸盐、吲哚菁二丙酸、吲哚菁二己酸、3,6-二氰基-2,5-[(N,N,N’,N’-四(羧甲基)氨基]吡嗪、3,6-[(N,N,N’,N’-四(2-羟乙基)氨基]吡嗪-2,5-二羧酸、3,6-二(N-氮杂环丁烷基(azatedino))吡嗪-2,5-二羧酸、3,6-二(N-吗啉基)吡嗪-2,5-二羧酸、3,6-二(N-哌嗪基)吡嗪-2,5-二羧酸、3,6-二(N-硫代吗啉基)吡嗪-2,5-二羧酸、3,6-二(N-硫代吗啉基)吡嗪-2,5-二羧酸S-氧化物、2,5-二氰基-3,6-二(N-硫代吗啉基)吡嗪S,S-二氧化物、吲哚羰花青四磺酸盐、氯代吲哚羰花青和3,6-二氨基吡嗪-2,5-二羧酸。
本领域技术人员应理解，所用的具体光学试剂可取决于所用的激发光波长、皮肤组织下的深度和本领域通常熟知的其他因素。例如，光学试剂的最佳吸收或最大激发波长可根据所用试剂而改变，但通常，本发明的光学试剂将吸收或通过紫外光(UV)、可见光或红外线范围的电磁光谱的光来激发。对于成像，优选用吸收和发射在IR(～700-900nm,例如，吲哚菁)附近的染料。对于采用内窥镜法的局部可视化，任何在可见光范围吸收的染料均为合适的。
在其他实施方案中，所述诊断剂可包括但不限于：本领域通常熟知的磁共振(MR)和x-射线造影剂，包括例如，基于碘的x-射线造影剂、超顺磁氧化铁(SPIO)、钆或锰的复合物等。(参见，例如，Armstrong et al.,Diagnostic Imaging,第5版,Blackwell Publishing(2004))。在一些实施方案中，诊断剂可包括磁共振(MR)造影剂。磁共振试剂的实例包括但不限于：顺磁试剂、超顺磁试剂等。顺磁试剂的实例可包括但不限于：钆喷酸、钆特酸、钆双胺、钆、钆特醇、锰福地吡、钆弗塞胺、柠檬酸铁铵、钆贝酸、钆布醇或钆塞酸。超顺磁试剂可包括但不限于：超顺磁的氧化铁以及铁利司坦(ferristene)。在某些实施方案中，所述诊断剂可包括x-射线造影剂，例如在以下文献中所提供的：H.S Thomsen,R.N.Muller and R.F.Mattrey,Eds.,Trends in Contrast Media,(Berlin:Springer-Verlag,1999)；P.Dawson,D.Cosgrove and R.Grainger,Eds.,Textbook of Contrast Media(ISIS Medical Media 1999)；Torchilin,V.P.,Curr.Pharm.Biotech.1:183-215(2000)；Bogdanov,A.A.et al.,Adv.Drug Del.Rev.37:279-293(1999)；Sachse,A.et al.,Investigative Radiology 32(1):44-50(1997)。x-射线造影剂的实例，包括但不限于，碘帕醇、碘美普尔、碘海醇、碘喷托、碘普罗胺、碘西胺、碘佛醇、碘曲仑、碘酞硫、碘克沙醇、碘西醇、碘葡胺、碘葡苯胺、碘古酰胺(iogulamide)、碘沙考、碘昔兰、碘帕醇、甲泛葡胺、碘比醇和碘美醇。在某些实施方案中，所述x-射线造影剂可包括碘帕醇、碘美普尔、碘普罗胺、碘海醇、碘喷托、碘佛醇、碘比醇、碘克沙醇、碘曲仑和碘美醇。
基因治疗
本发明的纳米颗粒也可用于将任何表达的或可表达的核酸序列递送至细胞以进行基因治疗或核酸疫苗接种。递送期间所述细胞可为体内的或体外的。所述核酸可为任何合适的核酸，如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。而且，任何合适的细胞均可用于递送所述核酸。
基因治疗可用于治疗各种疾病，如通过添加或改变宿主细胞中的基因而由单个基因缺陷或多个基因缺陷引起的那些疾病，从而治疗所述疾病。通常，基因治疗涉及替换突变的基因，但也可包括矫正基因突变或提供编码治疗蛋白的DNA。基因治疗还包括递送与由该突变基因产生的特定信使RNA(mRNA)结合的核酸，而有效地使该突变基因失活，也被称为反义疗法。可通过基因和反义疗法治疗的代表性疾病，包括但不限于，囊肿性纤维化、血友病、肌营养不良、镰刀形细胞贫血症、癌症、糖尿病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、炎性疾病如哮喘和关节炎和色盲。
关于基因治疗方法的综述，可参见：Goldspiel et al.,1993,ClinicalPharmacy 12:488-505；Wu and Wu,1991,Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev,1993,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596；Mulligan,1993,Science260:926-932；和Morgan and Anderson,1993,Ann.Rev.Biochem.62:191-217；May,1993,TIBTECH 11(5):155-215。本领域熟知的可用于本发明的重组DNA技术的方法描述于：Ausubel et al.(eds.),1993,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY；和Kriegler,1990,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY。
制剂和给药
当给予所述纳米载体以递送如上所述的货运物时，所述纳米载体可与任何合适的载体即生理上可接受的载体存在于任何合适的组合物中。如本文所用，术语“载体”是指用作药物如治疗剂的稀释剂或媒介物的通常为惰性的物质。该术语还包括赋予所述组合物粘性特性的通常为惰性的物质。通常，所述生理上可接受的载体以液体形式存在。液体载体的实例包括生理盐水、磷酸盐缓冲液、常规缓冲盐水、水、缓冲的水、盐水、甘氨酸、糖蛋白，以提供增加的稳定性(例如，白蛋白、脂蛋白和球蛋白等)等。由于生理上可接受的载体部分地由给予的具体组合物以及用于给予所述组合物的具体方法所决定，存在众多适合本发明的药物组合物的剂型(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版,1989)。
在给药前，所述纳米载体组合物可通过常规、熟知的灭菌技术进行灭菌，或者可在无菌条件下生产。含水溶液可被包装供使用或在无菌条件下过滤和冻干，在给药前将所述冻干制剂与无菌水溶液混合。所述组合物可包含药学上可接受的助剂，如大致的生理条件所要求，如pH调节剂和缓冲剂、紧张性调节剂、湿润剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、山梨醇单月桂酸酯和油酸三乙醇胺。糖类也可被包括在内，其用于稳定该组合物，如用于冻干的组合物的稳定剂。
所述纳米载体组合物可制备为通过吸入来给药的气雾剂(即，其可被“喷洒”)。气雾剂可被放入加压的可接受的推进剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。
用于直肠给药的合适剂型包括，例如，栓剂，其包括含有栓剂基质的有效量的包装的组合物。合适的栓剂基质包括天然的或合成的甘油三酯或石蜡烃。此外，也可采用含有所选组合物与基质包括例如液态甘油三酯、聚乙二醇和石蜡烃的组合的明胶直肠胶囊。
适用于肠胃外给药的剂型，例如，通过关节内(在关节的内部)、静脉内、肌肉内、瘤内、皮内、腹膜内和皮下的途径，包括含水的和非含水的、等渗的无菌注射液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使得该制剂与预期的接受者血液等渗的溶质，以及含水或非含水的无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。注射液和悬浮液也可从无菌粉、颗粒和片剂制备。在实施本发明时，可通过例如静脉内输注、局部地、在腹膜内、膀胱内或鞘内给予组合物。肠胃外给药包括静脉内给药是优选的给药方法。
本发明的缀合物、颗粒和制剂也可通过增强传送递送(CED)直接输注至大脑区域(如脑纹状体或脑瘤)，增强传送递送(CED)技术采用在输注管顶端建立的压力梯度来驱动迫使输注液流过脑细胞之间的空间(即胞外空间)的整个液流。输注泵或渗透泵可用于CED。采用CED装置，本发明的缀合物、颗粒和组合物可递送至脑部大面积的众多细胞。CED描述于例如，美国专利第6,953,575、7,534,613和8,309,355号。
所述药物制剂优选为单位剂量形式。以该形式所述制剂被细分为含有合适量的活性成分例如纳米载体组合物的单位剂量。该单位剂量形式可为包装的制剂，该包装含有离散量的制剂。纳米载体组合物的制剂可以单剂量或多剂量的封装容器如安瓶和小瓶形式提供。如需要，所述组合物也可含有其他兼容的治疗剂。
在治疗应用中，包含如上所述的治疗剂和/或诊断剂的纳米载体组合物可按每天约0.001mg/kg至约1000mg/kg的起始剂量给药。可采用的每日剂量范围为：约0.01mg/kg至约500mg/kg或约0.1mg/kg至约200mg/kg或约1mg/kg至约100mg/kg或约10mg/kg至约50mg/kg。然而，所述剂量可根据患者要求、接受治疗的疾病状况的严重性和所用的纳米载体组合物而改变。例如，可考虑具体患者中诊断的癌症的类型和阶段而凭经验确定剂量。在本发明的情况中，给予至患者的剂量应足以随时间在患者内产生有益的治疗响应。剂量的大小也由具体患者中伴随给予特定纳米载体组合物的任何不良副作用的存在、特性和程度而确定。确定特定情况下的合适剂量在从业者技能范围内。通常，以小于所述纳米载体组合物的最佳剂量的较小剂量开始治疗。此后，该剂量以小的增量增加直至实现该情况下的最佳效果。为方便起见，如需要，总的每日剂量可分开并在一天中分几部分给药。
装载纳米载体
可通过本领域已知的众多方法进行所述诊断剂和治疗剂的装载，例如，如以下文献中所公开的：de Villiers,M.M.et al.,Eds.,Nanotechnologyin Drug Delivery,Springer(2009)；Gregoriadis,G.,Ed.,LiposomeTechnology:Entrapment of drugs and other materials into liposomes,CRCPress(2006)。在一些实施方案中，可将一种或多种治疗剂装载至所述纳米载体中。纳米载体的装载例如，可以主动或被动的方式进行。例如，可在所述纳米载体的自组装过程中于溶液中包含治疗剂，从而使得所述治疗剂被包封在所述纳米载体中。在某些实施方案中，所述治疗剂也可嵌入在薄层中。在可选择的实施方案中，所述治疗剂可被主动地装载至所述纳米载体中。例如，可将所述纳米载体暴露于诸如电穿孔的条件下，其中使得该层状膜对于包含治疗剂的溶液为可渗透的，从而允许所述治疗剂进入该脂质体的内部体积。
所述诊断剂和治疗剂也可以共价键或离子键形式连接至所述纳米载体表面、胶束内部或胶束的薄层内。
VI.疾病治疗方法
在一些实施方案中，本发明提供了治疗患病对象的方法。该方法包括将治疗有效量的颗粒给予至所述对象。所述颗粒包含约20至约200个本发明的缀合物和治疗剂。从而，该疾病得到治疗。
任何合适的疾病均可采用本发明的所述缀合物和颗粒进行治疗。代表性的疾病包括癌症和帕金森氏病等。包括的可采用本发明方法治疗的癌症包括白血病、淋巴瘤、皮肤癌(包括黑素瘤、基底细胞癌和鳞状细胞癌)、头和颈的上皮细胞癌、肺癌(包括鳞状或表皮样癌、小细胞癌、腺癌和大细胞癌)、乳腺癌、胃肠癌、甲状腺恶性肿瘤、骨和软组织肉瘤、卵巢癌、输卵管癌、子宫癌、宫颈癌、前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌、肾细胞癌、胰腺癌和肝细胞癌。在一些实施方案中，本发明提供了治疗患有特征为实体瘤的癌症的对象的方法。在一些实施方案中，所述疾病选自癌症和帕金森氏病。在一些实施方案中，所述癌症为多形性成胶质细胞瘤。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗患有脑癌的对象的方法。脑癌包括胶质瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤和神经鞘瘤。在一些实施方案中，脑癌为多形性成胶质细胞瘤。多形性成胶质细胞瘤存在变型，包括巨细胞成胶质细胞瘤和神经胶质肉瘤。
本发明的颗粒可结合或同时与其他已知的疾病治疗方法一起使用，包括但不限于—化疗和放射疗法。任何合适的治疗剂均可与本发明的缀合物和颗粒结合使用。在一些实施方案中，所述治疗剂选自阿霉素、替莫唑胺和雷帕霉素。在其他实施方案中，所述治疗剂为阿霉素。
VII.实施例
实施例1:双聚合物脂-肽缀合物的合成
材料。Fmoc-保护的氨基酸、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)、2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基胺鎓六氟磷酸盐(HCTU)购自EMD biosciences，且使用时不做进一步纯化。Fmoc-保护的氨基酸的侧链保护基如下：Lys(Boc)、Glu(OtBu)、Asp(OtBu)、Cys(Trt)、Arg(Pbf)、His(Trt)、Trp(Boc)、Gln(Trt)、Lys(Alloc)。此外，Fmoc-Lys(Fmoc)-OH用于将硬脂酸连接至肽，且连接子Fmoc-6-Ahx-OH(Sigma Aldrich)附着于肽和烷基尾部之间。肽合成级的二乙基丙基胺(DIPEA)、三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷(TIS)、二乙醚，HPLC级的有机溶剂二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、乙腈和异丙醇购自Fisher，且使用时不做进一步纯化。哌啶、硬脂酸和阿霉素购自Sigma Aldrich。PEG(2000)-马来酰亚胺和PEG(750)-COOH酯购自Rapp Polymere。负染色试剂磷钨酸购自Ted Pella，并制备为于去离子水中的2wt％储备液。
材料合成。“1coi”(EVEALEKKVAALECKVQALEKKVEALEHGW)是从头设计的3-螺旋束肽，并通常以0.05mmol的规模在PEG-PAL树脂(Applied Biosystems)上，采用标准的9-芴甲基氨基甲酸酯(Fmoc)保护化学，在Protein Technologies Prelude固相合成仪上合成。将Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(EMD Bioscience)添加至N-端以允许硬脂酸分子偶联至所述肽的N-端。为了用PEG750修饰肽的C-端，将三甘氨酸间隔子和Fmoc-Lys(Alloc)-OH偶联至C-端。通过在DCM中利用Pd(PPh3)4催化剂和自由基捕获剂PhSiH3选择性地去除所述Alloc基团。将该反应重复5次。利用HBTU/DIPEA化学法将所得的赖氨酸的游离氨基用于结合端羧基的PEG750。于室温进行该偶联反应24小时并重复两次。然后采用标准程序将所述肽从树脂上切割下来。在位置14处的半胱氨酸促进马来酰亚胺功能化的分子量为2000g/mol的PEG位点特异性地偶联至所述肽序列中间。dC18-1coi(PEG2K)-PEG750的C-端半胱氨酸允许6-BAT-马来酰亚胺结合至所述肽以用于PET成像。
反相高压液相色谱法(RP-HPLC)。采用RP-HPLC(Beckman Coulter)在C4柱(Vydac柱22mm x 250mm)上纯化所述两亲性缀合物。对于半制备性运行，流量为10ml/min，且以10mg/ml的浓度注入缀合物。用二极管阵列检测器在波长220nm和280nm处监测洗脱。用线性AB梯度洗脱缀合物，其中溶剂A由水加0.1％(v/v)TFA组成，且溶剂B由异丙醇加0.1％(v/v)TFA组成。采用30％-100％B的线性梯度历经30min，通常以～85％B洗脱所述两亲物。纯化产率为～30％。
MALDI-TOF质谱分析。采用α-氰基-4-羟基肉桂酸基质通过MALDI-TOF质谱分析鉴定和纯化所述肽。在Applied BioSystemsVoyager-DE Pro上记录质谱。
结果和讨论：两亲性肽-聚合物的设计和合成。所述两亲物示意图如图1所示。头基由新设计的肽-聚(乙二醇)(PEG)缀合物组成，其中PEG链连接至形成3-螺旋束的肽中间(蛋白数据库代码“1coi”)。两个C18酰基链连接于所述肽N-端，且(6)-氨基-己酸连接子被插入至肽和烷基尾部之间以引入两亲性。另一PEG链连接至肽C-端。所得的两亲物称为“dC18-1coi(PEG2K)-PEG750”；该术语括号中的PEG2K(或P2K)是指缀合至所述肽中间的2000Da PEG链，而PEG750(或P750)是指缀合至肽C末端的750Da PEG链。该双-聚合物缀合物的名称也可缩写为“dC18-P750”，是指该双-聚合物缀合物具有在N-端有dC18脂质的1coi肽、缀合至所述肽中间的PEG2k和缀合至C-端的PEG750。没有C-端聚合物的缀合物采用标记如“dC18-1coi(PEG2K)”等来表示。肽之间的分子间相互作用和在所述螺旋束外部的PEG压缩据认为增加了亚基解吸附的活化能障，并为胶束提供了稳定性。形成胶束后，头基中的肽-PEG缀合物会自行结合为三聚体亚基(图1b)，并可提供一个平台以研究配体存在的寡聚状态对主动靶向纳米载体位置的影响。所述PEG链连接至所述螺旋束外部可用于调整配体簇之间的距离。
采用固相肽合成(SPPS)基于1coi合成所述肽。所述两亲物的合成方法如图2a所示。具体地，通过硬脂酸与去保护的Fmoc-Lys(Fmoc)-OH的反应产生N-端的支链烷基尾部而将所述烷基链缀合至固相上。采用正交保护-去保护策略将PEG分子连接至两侧和C-端。通过钯催化的Alloc-去保护的Fmoc-Lys(Alloc)-OH修饰C-端，然后采用HBTU/DIPEA化学法缀合端羧基的有机分子。所得的缀合物具有如下肽序列：EVEALEKKVAALECKVQALEKKVEALEHGWGGGK(SEQ ID NO:6)。PEG 2000共价结合至半胱氨酸侧链，PEG 750共价结合至C-端赖氨酸的ε-胺，且硬脂酸共价结合至与N-端的6-氨基己酸连接子残基连接的赖氨酸残基的α-胺和ε-胺。在本研究中，将PEG(MW＝750Da)选为C-端官能团以使胶束稳定并提供隐藏层用于防止非特异性的蛋白吸收。还可采用同样的化学方法连接多种靶向配体。通过反相高压液相色谱(RP-HPLC)采用含有水(0.1％TFA)和异丙醇(0.1％TFA)的混合溶剂梯度来纯化所述缀合物。以～85％异丙醇洗脱所述两亲性分子，总产率为30％。通过MALDI-TOF质谱分析确定分子量(图2b)。
实施例2：双聚合物脂-肽缀合物胶束的表征和装载
负染透射电镜检查。以0.1mg/ml将冻干的肽粉末溶解于25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中。将5μl肽溶液滴至放电的多孔碳包被网格(Ted Pella01824)。去除过量肽溶液后，然后加入5μl磷钨酸(2wt％,pH＝3.3)溶液，维持2min。在空气中干燥样品，并用FEI Tecnai 12透射电子显微镜于120kV下检查。
动态光散射(DLS)。在Malvern Zetasizer Nano-ZS上用633nm激光和17°的散射角进行DLS尺寸测量，以确定溶液中样品的流体动力学半径。测量前使样品流经0.22μm滤膜。
尺寸排阻色谱分析(SEC)。在BioSep-SEC-S 4000柱(Phenomenex)上进行SEC。流量为1ml/min，并用25mM磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)作为洗脱溶剂。用UV-可见光检测器在220nm、280nm和480nm中的一个或多个波长处监测洗脱曲线。
圆二色谱(CD)。在Jasco J810分光偏振计上进行CD测量。以0.2nm间隔、100nm/min的速率、4s的响应时间和1nm的带宽从260-190nm收集CD光谱。采用公式[θ]222＝-40000x[1-(2.5/n)]估计百分之百的螺旋性。
差示扫描热量分析(DSC)。在VP-MicroCal(GE)上进行DSC。将～600μl的样品(1mg/ml)和缓冲液加载至在～27psi压力下牢固密封的两个平行的不锈钢小室中，以防止加热循环期间水分的蒸发。将温度以1℃/min的速率从5℃增加至60℃，并于5℃平衡15min的时间。在使用MicroCal提供的Origin软件将浓度归一化和进行基线校正后，获得DSC热分析图。
福斯特共振能量转移(FRET)。将亲脂性FRET对3,3′-双十八烷基氧杂羰花青高氯酸盐(DiO,供体)和1,1′-双十八烷基-3,3,3′,3′-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(DiI,受体)用于测量混合时的能量转移。将所需量的DiO、DiI和dC18-1coi(PEG2K)-PEG750或DSPE-PEG2K一起溶解于1:1的氯仿和甲醇混合物中。于60℃在真空下蒸发有机溶剂至少3h以在玻璃小瓶中形成薄膜。以1mg/ml的浓度添加磷酸盐缓冲液(pH＝7.4,25mM)以再水化所述膜。在形成了可看得见的聚集的情况下，于70℃水浴中加热溶液至少30min，以促进包封的同质性。室温下搅拌24h后，然后将该溶液离心并进行旋转透析，以去除上清液中任何不溶性聚集物和可溶性染料。向350μlBSA样品中添加10μl染料包封的胶束溶液，并以450nm处的激发波长在475-650nm范围记录与时间相关联的荧光强度，维持12h。
药物装载和释放。通过薄膜水合方法采用相同的程序制备装载有阿霉素、紫杉醇和雷帕霉素的胶束。将dC18-1coi(P2K)-P750和不同的药物溶解于小玻璃瓶中的甲醇中，并于真空炉中蒸发溶剂3h。将含有缀合物和药物的干燥膜用25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)再水化，并搅拌所述溶液16h以允许组装为装载有药物的3-螺旋胶束。通过离心去除游离的药物，然后进行旋转超滤(Amicon离心过滤单元，截留MW：3000Da)。将获得的浓缩物用水洗涤并冻干，以获得装载有药物的胶束。将所述装载有药物的胶束溶解于甲醇中，并通过反相HPLC检测药物在280nm处的吸光度来确定装载。对于装载有药物的胶束的所有表征实验，将胶束-药物的冻干粉溶解于25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，于60℃水浴中加热所述溶液1h，以破坏可能的聚集体而获得清澈的溶液。
将装载有药物的3-螺旋胶束溶解于25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，浓度为3mg/ml。将胶束-药物溶液(2ml)放入截留分子量(MWCO)为8000Da的透析袋(SpectrumLabs)中。然后将该透析袋浸没于玻璃烧杯中的1000mL PBS中，并以800rpm搅拌。在不同的时间点从透析袋中取出10μL溶液，以测量作为时间函数的药物释放。通过反相HPLC监测280nm处的吸光度来定量释放的药物。
还将紫杉醇和雷帕霉素与染料对共同装载，以便进行如上所述的FRET测量。
结果和讨论：两亲性胶束的物理特性。两亲物dC18-1coi(PEG2K)-PEG750自行自组装为胶束，大于其在水溶液中的CMC值(～2μM)。图3a显示了200μM的dC18-1coi(PEG2K)-PEG750溶液在25℃于磷酸盐缓冲液(pH＝7.4,25mM)中的圆二色谱(CD)图。在208nm和222nm处有两个最小峰，通常为高度α-螺旋的结构的峰。在头基中的1coi肽形成具有82％螺旋性的螺旋结构。在222nm和208nm处的摩尔椭圆率比率通常用于确定卷曲螺旋螺旋线的存在。对于分离的α-螺旋，该比率估计为0.83，而对于相互作用的α-螺旋如卷曲螺旋，该比率计算为～1.0。222nm和208nm处的椭圆率间的比率为1.04，表明肽的三级结构，即卷曲螺旋的螺旋束被维持在胶束内。
采用Israelachvili的表面活性剂数目理论(surfactant number theory)，基于由x-射线和中子散射(未发表的结果)确定的头基大小和1coi的晶体结构，计算定量两亲物形状的包装参数。如图1b所示的三聚体亚基的包装参数经计算为0.238。作为比较，如图1a所示的单个两亲物的包装参数经计算为0.332。3-螺旋束的形成增加了头基和疏水性尾部之间横截面的错配。基于Israelachvili的表面活性剂数目理论，所述3-螺旋束肽-PEG缀合物具有形成球形胶束的强烈倾向。将冻干的两亲物粉溶解于缓冲液中后，动态光散射(DLS)(图3b)揭示了15nm的流体动力直径和胶束的非常均匀的大小分布。如图3c所示的负染色TEM还提供了以下证据：两亲物(0.1mg/mL于25mM磷酸盐缓冲液中，pH 7.5)形成直径为～15nm的球形胶束。
通过FRET的体外稳定性。包封的药物必须维持在载体内直至到达靶标位点；然而，体内货运物泄漏仍然是胶束纳米载体存在已久的问题。对于装载有染料的BCP胶束，体内FRET研究显示在静脉内注射后15min释放了染料分子。采用FRET在牛血清白蛋白(BSA)存在下评估3-螺旋胶束的体外稳定性，牛血清白蛋白已知为破坏胶束纳米载体的两亲物阱(trap)。将亲脂性FRET对3,3′-双十八烷基氧杂羰花青高氯酸盐(DiO,供体)和1,1′-双十八烷基-3,3,3′,3′-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(DiI,受体)共同包封于dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束中。作为对照实验，将相同的FRET染料共同包封到基于1,2-双硬酯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG2K)的常规胶束中。将染料包封的胶束稀释到37℃的生理浓度BSA(50mg/ml)中，并在475-600nm范围内以λex＝450nm监测荧光性。
在起始的于BSA中平衡(～10min)后，在565nm处观察到主要发射峰，其伴随有在505nm处的次要发射峰。这表明两种染料均被包封于单个胶束内，且贴近排列。如果货运物分子泄漏，则FRET“关闭”，因为DiO和DiI之间的分子间距离增加导致同时发生的505nm处荧光强度增加和565nm处荧光强度降低。对于dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束，在505nm和565nm处荧光强度随时间基本上保持不变(图4a)。相反，对于DSPE-PEG2K胶束，565nm处的强度明显下降，其伴随着505nm处的荧光强度增加(图4b)。I565/(I565+I505)的FRET比率表示能量转移的效率并反映了在实验条件下胶束的相对稳定性(图4c)。对于DSPE-PEG2K胶束，观察到标准化FRET比率的剧烈下降(图4c，底部迹线)，表明在BSA溶液中胶束快速释放出货运物，然而在相同条件下对于3-螺旋胶束该比率基本上保持不变(图4c，上部迹线)。该结果与此前报告的结果一致，表明DSPE-PEG2K胶束在BSA中具有差的稳定性，37℃时的半衰期为20min。
将dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束与具有C16烷基核心的dC16-1coi(PEG2K)-PEG750胶束进行比较。如图5中的圆二色谱测量所示，保持了具有不同疏水性烷基尾部的缀合物的肽螺旋性和卷曲的螺旋结构。对于所述两个烷基尾部，肽结构的温度稳定性没有明显的不同。如图6a中通过DSC数据所显示，烷基链包装的相变温度伴随烷基链的疏水性而增加。如通过FRET所评估，具有更多疏水核心的胶束显示了更大的稳定性(图6b)。
药物装载。可将具有不同分子结构和疏水性的多种药物整合至本发明的胶束中。染料分子和其他物质可容易地被包封于胶束中，包括二吡咯亚甲基二氟化硼(BODIPY)和亲脂性羰花青，用于荧光成像。为评估3-螺旋胶束作为纳米载体用于医疗应用的可能性，将DOX用于评估药物装载能力。采用脱水法进行胶束中DOX的包封。首先将dC18-1coi(PEG2K)-PEG750和DOX溶解于甲醇中，干燥并脱水。旋转透析去除游离的药物后，用尺寸排阻色谱分析(SEC)和DLS表征装载有DOX的胶束的同质性。如图7a所示，在220nm(上部迹线)和480nm(底部迹线)监测的胶束的重叠洗脱曲线分别监测了所述肽和DOX，其证明了阿霉素包封于胶束中且没有游离药物。DLS实验(图7b)表明，添加DOX(8wt％DOX装载)没有破坏胶束的均匀性，显示了直径15nm的单一物质。胶束中DOX荧光性的淬灭(图7c,底部迹线)，相比溶液中的游离DOX(图7c,上部迹线)，进一步证明了DOX在胶束中的存在。通过将冻干粉溶解于甲醇中并监测485nm处DOX的吸光度，确定所述DOX装载。对于DOX，可重复地获得7-8wt％范围的药物装载。这与通过将DOX共价连接至树状聚合物和多肽得到的值相当，其已经报道为4-10wt％。将阿霉素、雷帕霉素和紫杉醇装载于dC18-1coi(P2K)-P750胶束概括于表1中。
表1.将药物包封于dC18-1coi(P2K)-P750胶束中。
药物 装载(wt％)
阿霉素 7.6±0.4
雷帕霉素 2.1±0.6
紫杉醇 1.9±0.4
如图8a所示，雷帕霉素包封对胶束中的核心包装产生了最小的影响。50％的包装药物在8h内被释放，如图8b所示。
尺寸排阻色谱分析显示，紫杉醇装载没有阻止所述肽缀合物组装为3-螺旋束和胶束(图9)。差示扫描热量分析显示，紫杉醇包封对胶束中的核心包装产生了最小的影响(图10)。
图11显示如通过FRET所评估，3-螺旋胶束的稳定性没有受到不利影响且在紫杉醇整合后得到维持。
图12显示对于两种结构不同的药物阿霉素和雷帕霉素，从更具稳定性的胶束(即，dC18-1coi(PEG2K)-PEG750)的药物释放更慢。
实施例3:双聚合物脂-肽缀合物胶束的体内表征
合成6-p-(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-氨基)苄基1,4,8,11-四氮杂环十四烷-N,N',N″,N″'四乙酸盐(6-BAT-马来酰亚胺)。使6-p-氨基苄基1,4,8,11-四氮杂环十四烷-N,N',N″,N″'四乙酸盐(6-氨基苄基TETA,25mg)与磺基-SMCC(25mg,ProteoChem,Denver)于磷酸盐缓冲的盐水(PBS 1x,8mL)中反应且维持pH为7，持续2h，并添加1M氢氧化钠溶液。用0.1％TFA溶液(4mL)稀释所述反应混合物。用反相HPLC系统(Jupiter ProteoC12,250x 10mm)分离6-BAT马来酰亚胺，并在220和254nm波长处监测洗脱。流量为3mL/min，并施加5％-60％溶剂B的线性梯度历时30min(溶剂A:0.1％TFA去离子水(v/v),溶剂B:0.1％TFA乙腈(v/v))。
合成6-BAT-dC18-1coi(PEG2K)-PEG750。为了引入PEG2K，将Fmoc-Lys(Alloc)-OH用于沿着1coi骨架的15位置。对于50μmol反应，于DCM中在12mg Pd(PPh3)4催化剂和150μl自由基捕获剂PhSiH3存在下进行Alloc基团的选择性去保护，持续30min。再重复该反应5次。随后采用HBTU/DIPEA化学法，将端羧基的PEG2K偶联至赖氨酸残基的侧链上。于室温进行该偶联反应持续24h，并重复两次。在TFA中裂解后，在磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中使所述粗制肽与6-BAT-马来酰亚胺以1比4的摩尔比反应。通过反相HPLC纯化得到的终产物产率为30％。
用Cu-64放射性标记dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束。通过薄膜水化法制备混合胶束。dC18-1coi(P2K)-P750和6-BAT-1coi-dC18-PEG2K以98/2wt/wt％溶解于小玻璃瓶内的甲醇中，并将所述溶剂在真空炉中蒸发3h。将干燥的膜用25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)再水化，并搅拌所述溶液16h以允许组装至混合胶束中。通过旋转超滤(Amicon离心过滤单元，截留MV：3000Da)去除所述磷酸盐。所得浓缩物用水冲洗，并冻干以获得混合胶束。
将冻干的dC18-1coi(PEG2K)-PEG750和6-BAT-dC18-1coi(PEG2K)-PEG750粉末(98/2,mol％/mol％,3.7mg)溶解于去离子水中，并在室温下过夜成熟。将在0.1M柠檬酸铵(pH 5.5,100mL)中缓冲的64CuCl2(Isotrace,St.Louis,MO)添加至胶束溶液中，并于30℃孵育1.5h。为了去除Cu-64的非特异性结合，添加0.1M EDTA(10μL)，并于室温孵育所述混合物10min。尺寸排阻色谱分析(Sephadex G-75,GEhealthcare)表明，在2mL体积中Cu-64标记的胶束具有超过95％的标记产率。通过离心(4000g)浓缩Cu-64胶束达30min。在合成结束时所述胶束的特异性活性为140GBq/mol。
用Cu-64放射性标记常规胶束(DSPE-PEG2K-OMe)。50℃下，在玻璃测试管中，于温和氮气流下，将于氯仿中的DSPE-PEG2K-OMe和6-BAT脂质(97/3,mol％/mol％,2mg)干燥。干燥的脂质冻干过夜。将加温的去离子水(0.5mL)添加至该测试管中，轻轻摇动该管直至溶液变澄清。将于0.1M柠檬酸铵(pH 5.5,100mL)中缓冲的64CuCl2(2.51mCi)添加至胶束溶液中，并于30℃孵育1h。用尺寸排阻色谱分析(Sephadex G-75,GE healthcare)分离标记的常规胶束。标记产率为95％，且在合成结束时所述胶束的特异性活性为124GBq/mol。
动物方案(NDL肿瘤小鼠模型)。所有动物实验均在加利福尼亚大学戴维斯动物护理和使用委员会(Davis,CA)批准的方案下进行。将4只称重为19-22g的4-周龄雌性FVB小鼠(Charles River,Wilmington,MA)笼养于控温室的通风笼中。所有动物均维持12h光照循环，并提供随意取用的标准啮齿类食物和水。为了通过肿瘤细胞注射产生NDL肿瘤，通过腹腔注射氯胺酮(100mg/kg)/甲苯噻嗪(10mg/kg)溶液来麻醉受体小鼠。然后钝切并暴露#4腹股沟脂肪垫。将悬浮于20μl PBS中的1x 106个NDL肿瘤细胞溶液用29-G针头直接注射至受体小鼠的左右侧第4腹股沟乳腺脂肪垫。然后，在每侧用1个伤口夹封闭切口位点，并在让动物走动前以0.05-0.1mg/kg经皮下给予一次性注射Buprenex，以控制疼痛。监测伤口7天直至移除伤口夹。在本研究的第一天达到约5mm大小之前，允许肿瘤生长12天。
微型PET成像和生物分布分析。注射64Cu-dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束后，采用微型PET对两侧乳腺脂肪垫内荷载NDL肿瘤的雌性FVB小鼠(n＝6)成像，并评估生物分布。在经尾静脉注射于150μL PBS中的64Cu-dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束(每只小鼠316±83μCi和86±24nmol脂质)后立即获得30min体内PET扫描，并在注射后3、6、24和48h获得30min体内PET扫描。将用2％-3％异氟烷麻醉的动物成对放置于扫描床，并采用小动物PET扫描仪(Focus120,Siemens Medical Solutions,Inc.)完成PET获取。在每组动物的最后时间点扫描后，通过颈椎脱位法将动物安乐死，并通过心脏穿刺取血。简而言之，一旦将动物安乐死即获取器官用于在γ-Counter(Perkin-Elmer Life Sciences)内测量生物分布和放射性。对于Cu-64标记的常规胶束的生物分布，采用了两只重量为26-27g的雌性Balb/c小鼠(Charles River,MA)。经尾静脉给予Cu-64标记的常规胶束(每只小鼠7.33±0.07MBq和69±1nmol脂质)，由于放射性的快速清除，在注射后24h处死动物，随后进行上述步骤用于检测生物分布。
结果和讨论：采用PET成像进行3-螺旋胶束的体内研究。进行3-螺旋胶束的药代动力学评估和生物分布以证明其作为纳米载体的可能性。通过金属-螯合剂功能化的两亲性肽与常规两亲物的共同组装，然后与64Cu离子进行高亲和力的配位反应，实现64Cu标记的3-螺旋胶束的制备。通过静脉内注射将胶束溶液给予至荷载NDL肿瘤的小鼠。采用正电子发射断层成像(PET)，评估放射性标记的胶束的药代动力学，并与长循环脂质体和常规DSPE-PEG2K胶束比较。所有测试的胶束均具有类似的疏水性程度，因为其由双C18尾和PEG层组成而防止非特异性蛋白吸附。图13a显示了给予64Cu-dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束的小鼠切片PET图像的冠状面图(上图)和横切面图(下图)。用最大后验概率(MAP)估计获取了重建柱形图后的图像。注射后48h获得了PET图像，并表明3-螺旋胶束在血池中保持了高度浓缩，具有最小的肝和脾累积。图13b显示了64Cu-dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束的血液放射性(％ID/cc)。该数据曲线被拟合为两相指数衰减(Y＝45.32e-0.0235×t+16.42e-1.27×t,t1/2α＝0.55,β＝29.52)。甚至在注射后48h，约15±1.5％ID/g保持在血池中循环。基于图像数据组，采用双相模型拟合3-螺旋胶束的药代动力学。估计胶束的β-相血液循环半衰期(t1/2,β)为～29.5h(图13b)，其与成功的树状聚合物相当。图13c显示了注射后48h，血浆和血细胞中计算的％放射性。％放射性计算为：[100x血浆放射性/(血浆放射性+血细胞放射性)]。该分析显示所述活性受限于血浆而非循环的细胞成分。
相比由单-PEG缀合物组成的胶束(即无C-端PEG750的64Cu-dC18-1coi(PEG2K))，64Cu-dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束展现出改善的特性。图25的PET图像显示给药后24h对象中循环的64Cu-dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束水平(图25d)明显高于给药后24hr64Cu-dC18-1coi(PEG2K)胶束的水平(图25b)。这也反映在注射后48h，在血液、肝和脾中64Cu-dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束和64Cu-dC18-1coi(PEG2K)胶束的放射性比较中(图26)。将PEG750连接于C-端明显增加了血液循环寿命(PEG化胶束的14.5％ID/g相对于非-PEG化胶束的2.9％ID/g)，并降低了在网状内皮系统器官如肝和脾中的累积。如图27中所示，相比具有C16核心的胶束，具有C18核心的胶束展现出更高的稳定性和更长的血液循环时间。
图14显示了具有长循环脂质体(n＝4)的3-螺旋胶束(n＝6)和常规DSPE-PEG2K-OMe胶束(n＝2)在非灌注小鼠中的生物分布概况比较。注射3-螺旋胶束产生了在血池中最高的放射性15.0±1.5％ID/g。在NDL模型肿瘤中，3-螺旋胶束的摄取(5.7±0.9％ID/g)类似于在类似模型(MIN-O)中以64Cu-脂质体(4.3％ID/g)和64Cu-白蛋白获得的摄取。据认为该摄取可能归因于EPR作用。观察到的不同器官的放射性如下：脾内为4.6±0.5％ID/g，肝内为4.5±0.2％ID/g，肾内为2.9±0.3％ID/g，心脏内为2.1±0.2％ID/g。这些动物在研究中没有被灌注。考虑到在生物分布研究点血液中保持了高活性，肝和脾中残留的血液可能部分地导致在这些器官中观察到的活性。为了进一步弄清楚系统性清除途径，测量了十二指肠和空肠中的放射性，其为～2％ID/g(图14a)。将64Cu-dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束在48h的放射性(％ID/g)与长循环脂质体的放射性(脂质体48h的数据获自此前的研究)进行比较。在消化系统、肝和脾中低的活性显示，网状内皮系统(RES)清除可能不是3-螺旋胶束的主要清除途径。
也将在血液、肝和脾中检测到的放射性在3-螺旋胶束、DSPE-PEG2K-OMe胶束和长循环脂质体中进行了比较(图14b)。由于DSPE-PEG2K-OMe胶束的快速清除，使用24h的生物分布结果与以长循环脂质体和3-螺旋胶束在48h获得的结果进行比较。肝中从DPSE-PEG2K-OMe胶束产生的放射性保持在与长循环脂质体类似的水平。3-螺旋胶束和长循环脂质体之间的实质性差异是明显的：相比此前的任一策略，血液循环得以延伸且肝和脾积累降低了。采用单因素ANOVA进行各组之间的统计学分析，然后进行Tukey多重比较检测(在图14中，***P<0.0001,**P<0.001,*P<0.05)。
体内药代动力学和生物分布研究清楚表明，3-螺旋胶束获得了长循环半衰期和有效的清除。在肝、脾和肠内降低的累积结合尿活性显示，3-螺旋胶束并非主要通过RES途径来清除。3-螺旋胶束系统性清除的一个假说为，首先通过单体解吸附，其中在血液循环期间单个或三聚体两亲物脱离胶束。如果所述疏水性C18尾不能被头基遮盖，所述两亲物将会被血清蛋白捕获，并于随后被RES系统清除，这类似于其他胶束包括基于DSPE-PEG2K和嵌段共聚物的胶束的结果。当亲水性头基即1coi-PEG2K分子量大于5kDa时，则有可能1coi-PEG2K可包裹C18链以防止C18和水之间的不利相互作用。这与我们最近在1coi-聚苯乙烯缀合物中的研究类似，其中1coi展开并作为所述疏水性PS的表面活性剂。dC18-1coi(PEG2K)-PEG750两亲物的分子量仅为～6kDa，明显低于穿过肾小球膜的临界截留分子量。在1coi肽的序列中，有几个可被蛋白酶切割的位点。作为胶束物理性解吸附的替代，所述3-螺旋胶束可被内化至细胞中并通过蛋白水解来消化。一旦所述肽被酶促降解，所述胶束将分解且所述两亲物的碎片会被代谢掉。
实施例4:缀合物和胶束的进一步表征
监测了作为溶解于25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的dC18-1coi(PEG2K)-PEG750浓度的函数的芘荧光性(图15)。芘浓度保持4x10-7μM不变。随着两亲物浓度增加，胶束核心中的芘开始分开。曲线的斜率开始增加处的浓度指示临界胶束浓度(CMC)。dC18-1coi(PEG2K)-PEG750的CMC为～2μM。
记录了溶解于25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的60μMdC18-1coi(PEG2K)-PEG750的CD光谱。肽的螺旋性为～74％。在222nm和208nm处的椭圆率为～1.06，表明胶束壳中的肽的结构为卷曲螺旋的螺旋束(图16)。
记录了溶解于25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的200μMdC18-1coi(PEG2K)-PEG750的差示扫描热量分析热谱曲线(图17)。在该迹线中观察到的峰表明了胶束核心中的异质性脂质包装。对应于主峰的脂质核心中烷基链的相变温度为～37℃。
记录了溶解于25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的60μMdC18-1coi(PEG2K)-PEG750的动态光散射迹线。胶束的流体动力学直径为～16nm(图18)。
根据图19中概述的过程将阿霉素装载于胶束中。记录了溶解于25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的装载阿霉素的dC18-1coi(PEG2K)-PEG750的动态光散射迹线(图20)。所述装载为～8wt％阿霉素。
记录了溶解于25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的装载阿霉素的dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束的尺寸排阻色谱(图21)。在280nm(肽；上部迹线)和490nm(DOX；底部迹线)的重叠洗脱曲线表明，所述颗粒与药物的结合具有最小的游离药物和颗粒聚集。
记录了溶解于25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的装载阿霉素的dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束的荧光光谱(图22)。相对于游离药物(上部迹线)，胶束中阿霉素荧光的猝灭(底部迹线)显示在胶束核心中存在药物。
随时间记录了溶解于含有50mg/ml血清白蛋白的25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的装载阿霉素的dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束的荧光光谱(图23)。
记录了溶解于25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的装载雷帕霉素的dC18-1coi(PEG2K)-PEG750胶束的尺寸排阻色谱(图24)。
实施例5:采用装载有药物的胶束在大鼠模型中治疗多形性成胶质细胞 瘤
通过增强传送递送系统(CED)，经输注将本发明的装载有药物的胶束直接递送至脑肿瘤如多形性成胶质细胞瘤(GBM)中。在输注导管顶部的压力梯度被用于驱动迫使输注液穿过胞外空间的体积流。然后，受压的输注液接触血管周围空间，且其分布主要借助血管的搏动。
所述胶束被GBM细胞快速摄取。胶束能够扩展货运药物的药代动力学。相比其他载体，胶束的小尺寸能够改善药效。肿瘤内输注限制了药物递送至肿瘤位点，带来改善的安全性和效力，但在实践中这类递送的频率可受到限制。本发明的胶束的长药代动力学甚至能够在给药频率受限的情况下提供良好的效力。
通过以浓度范围：0(盐水)、0.3、0.7、1和3mg/ml，将20微升(N＝3/组)装载药物的胶束注射至正常大鼠纹状体，建立胶束的DOX和TMZ的固有安全性。7天后，将大鼠大脑切片，并用苏木精和伊红(H&E)染色进行染色以查找组织病理学。在大鼠效力研究中采用了最高的无毒性剂量。
研究了大鼠GBM异种移植物中胶束的阿霉素(MC-DOX)和替莫唑胺(MC-TMZ)的药代动力学。在将肿瘤植入裸鼠10天后，将最高的无毒性剂量的MC-DOX或MC-TMZ注射至植入的肿瘤中。在1、3、7、10和24h以及3天和7天的时候，从大鼠切取肿瘤(每个时间N＝3)。提取这些样品，并通过HPLC分析药物含量。
所述动力学数据被用于在GBM的裸鼠U87异种移植模型中进行效力研究。将长期插管导管用于通过CED把药物输入至异种移植肿瘤达10次。每周以MC-DOX或MC-TMZ输入大鼠异种移植物2-3次，且存活是主要终点。所述模型在肿瘤植入后通常具有约20天的存活时间。无论是对照或装载药物的胶束输注，最早在植入后10天开始，并重复直至动物(N＝10/组)显示出指示需要安乐死的神经学征象和/或失去>15％的体重。通过Meier-Kaplan分析来评估对存活的影响。尸检后分析包括H&E染色。观察到相比对照的大于10天的存活率统计显著性的增加(p<0.05)。
实施例6.混合胶束
通过薄膜水化法制备混合胶束(图28)。将50/50wt/wt％的dC18-1coi(P2K)-P750和DSPE-PEG2000(参见以下通式I)溶解于小玻璃瓶中的甲醇内。对于装载有药物的混合胶束，将药物(10wt％)添加至所述混合物中。将所述溶剂在真空炉中蒸发3h。以25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)将干燥膜再水化，并搅拌所述溶液16h以允许其组装为混合胶束。通过离心并随后进行旋转超滤(Amicon离心过滤单元，截留MV：3000Da)去除所述盐和游离药物。将所得浓缩物用水冲洗，并冻干以获得混合胶束。
空白和装载有药物的混合胶束均以类似于3-螺旋胶束的方式表征。进行SEC和DLS以确定混合胶束的尺寸和尺寸分布。通过HPLC测定药物装载量。进行DSC以研究胶束核心的结构。采用透析袋法进行释放实验。
采用芘荧光分析确定了唯一的临界胶束浓度(～1.5μM)，显示DSPE-PEG和dC18-1coi(P2K)-P750组装形成了均匀的混合胶束(图29a)。通过尺寸排阻色谱分析观察了所述胶束作为同质群体的洗脱(图29b)。在混合胶束中的肽螺旋性为～80％，表明所述肽的结构得以维持(图30a)。通过DSC分析混合胶束的烷基核心的相转变(图30b)；实验数据的去卷积产生了11.5℃和15.4℃的Tt值。
观察到的混合胶束的雷帕霉素装载能力为7-8wt％；这比仅含dC18-1coi(P2K)-P750的胶束高得多(参见，表1)。如通过动态光散射(图31a)和尺寸排阻色谱分析(图31b)所观察到的，雷帕霉素装载期间维持了混合胶束的结构和窄的尺寸分布。
相比仅含dC18-1coi(P2K)-P750的胶束，从混合胶束释放雷帕霉素被延长(图32)。不希望受任何具体理论的束缚，据认为从没有DSPE-PEG的胶束更快速地释放雷帕霉素可能是造成该差异的原因。而所述混合胶束在BSA溶液中于37℃随时间展现出稳定性(图33a)，所述混合胶束的稳定性略低于仅含dC18-1coi(P2K)-P750的胶束(图33b)。
尽管为了清楚理解的目的，通过说明和实例方式相当详细地描述了前述发明，本领域技术人员应理解，在所附权利要求范围内可进行一些改变和修饰。此外，本文提供的每篇文献均通过引用整体并入本文，其程度如同每篇文献被单独通过引用并入本文。当本申请和本文提供的文献之间存在冲突时，应以本申请为主。

Claims (31)

1.缀合物，包含
第一肽，其具有约10至约100个氨基酸，其中所述肽呈螺旋结构；
第一聚合物，其与所述肽的除N-端和C-端氨基酸残基以外的氨基酸残基共价连接；
至少一个第二聚合物，其与所述肽的C-端氨基酸残基共价连接；和
疏水部分，其与所述肽的N-端共价连接，其中所述疏水部分包含第三聚合物或脂质部分。
2.如权利要求1所述的缀合物，其中所述肽选自：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。
3.如权利要求1所述的缀合物，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物各自包含亲水性聚合物。
4.如权利要求1所述的缀合物，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物各自包含聚乙二醇。
5.如权利要求1所述的缀合物，其中所述第一聚合物的分子量为约500Da至约10,000Da。
6.如权利要求5所述的缀合物，其中所述第一聚合物的分子量为约1000Da至约5000Da。
7.如权利要求6所述的缀合物，其中所述第一聚合物的分子量为约2000Da。
8.如权利要求1所述的缀合物，其中所述第二聚合物的分子量为约250Da至约5000Da。
9.如权利要求8所述的缀合物，其中所述第二聚合物的分子量为约500Da至约2000Da。
10.如权利要求9所述的缀合物，其中所述第二聚合物的分子量为约750Da。
11.如权利要求1所述的缀合物，其中所述第三聚合物包含聚丁二烯。
12.如权利要求1所述的缀合物，其中所述脂质部分包含1-6个C10-20酰基。
13.如权利要求1所述的缀合物，其中所述脂质部分包含1、2或4个C10-20酰基。
14.如权利要求1所述的缀合物，还包含与所述肽的C-端共价连接的第二肽。
15.如权利要求14所述的缀合物，其中所述第二肽包含选自以下的成员：GGG、HHH、KK、EE、RGD和AYSSGAPPMPPF。
16.如权利要求1所述的缀合物，其中
所述第一肽包含SEQ ID NO:1；
所述第一聚合物包含分子量为约2000Da的聚乙二醇；
所述第二聚合物与所述肽的C-端残基连接，且包含分子量为约750Da的聚乙二醇；并且
所述疏水部分包含含有赖氨酸和两个C18酰基链的脂质部分。
17.螺旋束，其包括2-6个权利要求1的缀合物。
18.如权利要求17所述的螺旋束，其包含3个缀合物。
19.如权利要求17所述的螺旋束，其包含4个缀合物。
20.颗粒，其包含约20至约200个权利要求1的缀合物。
21.如权利要求20所述的颗粒，还包含至少一种其他试剂，其各自独立地选自：治疗剂、诊断剂、DNA和寡核苷酸。
22.如权利要求21所述的颗粒，其中每种其他试剂独立地选自：荧光团、放射性核素、蒽环霉素、紫杉烷和大环内酯。
23.如权利要求22所述的颗粒，其中每种其他试剂独立地选自：阿霉素、紫杉醇和雷帕霉素。
24.如权利要求20所述的颗粒，还包含PEG化的脂质。
25.如权利要求24所述的颗粒，其中所述PEG化的脂质包含DSPE-PEG2000。
26.颗粒，包含：
约20至约200个缀合物，每个缀合物包含：
第一肽，其包含SEQ ID NO:1；
第一聚合物，其包含分子量为约2000Da的聚乙二醇；
第二聚合物，其与所述肽的C-端残基共价连接，且包含分子量为约750Da的聚乙二醇；和
疏水部分，其包含含有赖氨酸和两个C18酰基链的脂质部分；以及
治疗剂，其选自阿霉素、紫杉醇和雷帕霉素。
27.如权利要求26所述的颗粒，还包含DSPE-PEG2000。
28.如权利要求27所述的颗粒，其中所述DSPE-PEG与所述缀合物的重量比为约1:1。
29.形成权利要求20的颗粒的方法，所述方法包括：将多个权利要求1的缀合物维持在足以允许所述缀合物自我组装为权利要求20的颗粒的条件下。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述缀合物的浓度为约1nM至约1M。
31.如权利要求29所述的方法，还包括将PEG化的脂质添加至所述多个缀合物。
CN201380029919.7A 2012-04-10 2013-04-10 双聚合物脂-肽缀合物及其纳米颗粒 Pending CN104379158A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261622330P 2012-04-10 2012-04-10
US61/622,330 2012-04-10
US201261668923P 2012-07-06 2012-07-06
US61/668,923 2012-07-06
PCT/US2013/035924 WO2013155152A1 (en) 2012-04-10 2013-04-10 Bis-polymer lipid-peptide conjugates and nanoparticles thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104379158A true CN104379158A (zh) 2015-02-25

Family

ID=49328119

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380029919.7A Pending CN104379158A (zh) 2012-04-10 2013-04-10 双聚合物脂-肽缀合物及其纳米颗粒

Country Status (11)

Country Link
EP (1) EP2841083B1 (zh)
JP (2) JP6426600B2 (zh)
KR (1) KR20140143838A (zh)
CN (1) CN104379158A (zh)
AU (1) AU2013245989B2 (zh)
CA (1) CA2869984C (zh)
IL (1) IL235167A0 (zh)
IN (1) IN2014DN08781A (zh)
MX (1) MX2014012271A (zh)
RU (1) RU2014144945A (zh)
WO (1) WO2013155152A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9949927B2 (en) 2012-04-10 2018-04-24 The Regents Of The University Of California Bis-polymer lipid-peptide conjugates and nanoparticles thereof
EP3263107B1 (en) * 2015-02-23 2020-11-11 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha Block copolymer conjugate of physiologically active substance
WO2017059338A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 Cornell University Enzyme-responsive peptide nanofiber compositions and uses thereof
AU2019359458A1 (en) * 2018-10-12 2021-05-13 University Of Pittsburgh- Of The Commonwealth System Of Higher Education Small polymeric carriers for delivery of agents

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110200527A1 (en) * 2007-11-05 2011-08-18 Shanghai Jiaotong University Peptide Ligand Directed Drug Delivery
WO2011112999A2 (en) * 2010-03-12 2011-09-15 The Regents Of The University Of California Lipid-peptide-polymer conjugates and nanoparticles thereof

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2324540T3 (es) 1998-05-27 2009-08-10 Genzyme Corporation Vectores aav para la fabricacion de medicamentos para la administracion potenciada por conveccion.
WO2003022250A2 (en) * 2001-09-10 2003-03-20 Celator Technologies Inc. Unilamellar vesicles stabilized with short chain hydrophilic polymers
WO2009142892A1 (en) * 2008-05-19 2009-11-26 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions comprising novel cationic lipids
US8470442B2 (en) * 2009-04-03 2013-06-25 University Of Houston System Metal nanoparticles functionalized with rationally designed coatings and uses thereof
PT2508170E (pt) * 2009-12-03 2015-10-16 Shanghai Hengrui Pharm Co Ltd Lipossoma de irinotecano ou o seu cloridrato e seu método de preparação

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110200527A1 (en) * 2007-11-05 2011-08-18 Shanghai Jiaotong University Peptide Ligand Directed Drug Delivery
WO2011112999A2 (en) * 2010-03-12 2011-09-15 The Regents Of The University Of California Lipid-peptide-polymer conjugates and nanoparticles thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PERKINS ET AL: "Novel therapeutic nano-particles (lipocores) : trapping water soluble compounds", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF PHARMACEUTICS》 *

Also Published As

Publication number Publication date
IL235167A0 (en) 2014-12-31
AU2013245989B2 (en) 2017-03-30
WO2013155152A1 (en) 2013-10-17
EP2841083B1 (en) 2020-08-05
EP2841083A4 (en) 2016-07-13
JP6426600B2 (ja) 2018-11-21
CA2869984A1 (en) 2013-10-17
AU2013245989A1 (en) 2014-10-30
IN2014DN08781A (zh) 2015-05-22
JP2018150327A (ja) 2018-09-27
RU2014144945A (ru) 2016-05-27
KR20140143838A (ko) 2014-12-17
MX2014012271A (es) 2015-05-11
EP2841083A1 (en) 2015-03-04
JP2015520126A (ja) 2015-07-16
CA2869984C (en) 2021-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9044514B2 (en) Lipid-peptide-polymer conjugates and nanoparticles thereof
Accardo et al. Receptor binding peptides for target-selective delivery of nanoparticles encapsulated drugs
Oerlemans et al. Polymeric micelles in anticancer therapy: targeting, imaging and triggered release
Seo et al. Self-assembled 20-nm 64Cu-micelles enhance accumulation in rat glioblastoma
Petersen et al. Positron emission tomography evaluation of somatostatin receptor targeted 64Cu-TATE-liposomes in a human neuroendocrine carcinoma mouse model
Chacko et al. Targeted nanocarriers for imaging and therapy of vascular inflammation
Wei et al. pH-responsive pHLIP (pH low insertion peptide) nanoclusters of superparamagnetic iron oxide nanoparticles as a tumor-selective MRI contrast agent
Wang et al. Multifunctional reduction-responsive SPIO&DOX-loaded PEGylated polymeric lipid vesicles for magnetic resonance imaging-guided drug delivery
Liu et al. Theranostic polymeric micelles for the diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma
US10806702B2 (en) Bis-polymer lipid-peptide conjugates and nanoparticles thereof
JP2018150327A (ja) ビス−ポリマー脂質−ペプチド複合体及びそのナノ粒子
US20170165382A1 (en) Nanocarriers for cancer treatment
Tang et al. Construction and evaluation of hyaluronic acid-based copolymers as a targeted chemotherapy drug carrier for cancer therapy
EP3046586B1 (en) Methods of treatment using bis-polymer lipid-peptide conjugates and nanoparticles thereof
Accardo et al. Naposomes: A new class of peptide-derivatized, target-selective multimodal nanoparticles for imaging and therapeutic applications
US20140363378A1 (en) Self-assembling molecules that accumulate in acidic tumor microenvironments
US20170224833A1 (en) Self-assembling molecules that accumulate in acidic tumor microenvironments
US20090130018A1 (en) Supramolecular aggregates containing chelating agents and bioactive peptides as effective and selective delivery tools for drugs and contrast agents in mri or nuclear medicine
Hai et al. The Labeling, Visualization, and Quantification of Hyaluronan Distribution in Tumor-Bearing Mouse Using PET and MR Imaging
JP5320569B2 (ja) 高分子ミセル及びそれを有効成分として含有する固形がんの診断又は治療剤
Wang Advanced Materials for the Delivery of Anti‐Cancer Compounds and Imaging Contrast Agents
US11135301B2 (en) Triblock polypeptide-based nanoparticles for the delivery of hydrophilic drugs
Ang 3-Helix Micelles as Nanocarriers–Understanding Hierarchical Structures, Kinetic Pathway, and Controlling Multivalency
Amreddy et al. Multifunctional dendrimers for theranostic applications
Daniels Synthesis, characterization, and tumor targeting of novel pH sensitive nanoparticles

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20150225

RJ01 Rejection of invention patent application after publication