WO2022259958A1 - リン脂質 - Google Patents

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WO2022259958A1
WO2022259958A1 PCT/JP2022/022530 JP2022022530W WO2022259958A1 WO 2022259958 A1 WO2022259958 A1 WO 2022259958A1 JP 2022022530 W JP2022022530 W JP 2022022530W WO 2022259958 A1 WO2022259958 A1 WO 2022259958A1
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phospholipid
acid
present
mol
lipid
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康治 冨田
雄希 井上
綾乃 横内
紗衣 朝山
尚文 深田
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日本精化株式会社
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    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Definitions

  • the present invention relates to phospholipids and the like.
  • RNA-containing drugs and vaccines have been developed.
  • siRNA small interfering RNA
  • mRNA messenger RNA
  • An extremely sophisticated delivery system is required for exogenously administered RNA to exhibit its original activity in vivo. This is because RNA is rapidly enzymatically degraded and hardly passes through the cell membrane. Therefore, the development of delivery systems is inevitably associated with the practical use of RNA-containing drugs and vaccines.
  • RNA As a delivery system for drugs such as RNA, it is known to administer drugs in the form of encapsulation in lipid particles. However, when a negatively charged nucleic acid is administered, a positively charged lipid is usually used to cause electrostatic interaction, and thus there is a concern of cytotoxicity (Patent Document 1).
  • the present inventor focused on the fact that charge-reversible phospholipids have siRNA-encapsulating properties and are safe at physiological pH.
  • the present inventors also noted that cytotoxicity can be reduced when the charge-reversible phospholipid is a lipid particle that does not have a positive charge at the pH of body fluid (usually in the neutral range).
  • the purpose of the present invention is to provide a phospholipid that has charge reversibility, does not have a positive charge at the pH of body fluid (usually in the neutral range), and exhibits low cytotoxicity.
  • the present invention further provides lipid particles, and lipids for forming the lipid particles, having a size suitable for more efficient drug encapsulation and/or for more efficient drug delivery. It is also an issue to
  • the phospholipid according to item 1 wherein said m represents a natural number of 13-21, and said n represents a natural number of 11-12. 3.
  • General formula (2) below (In the formula, R 1 is the same as described above.)
  • a lipid particle containing the phospholipid according to item 1 (phospholipid A).
  • the phospholipid according to item 1 represented by. 4.
  • Item 5. Lipid particles according to Item 4, encapsulating a drug. 6.
  • An alcoholic solution containing the phospholipid according to item 1. 10.
  • Item 10. The alcoholic solution according to Item 9, wherein the alcohol in the alcoholic solution is ethanol.
  • Item 10. A method for producing lipid particles, comprising the step of mixing the alcohol solution according to Item 9 and an acidic aqueous solution.
  • Item 5. A medicine containing the lipid particles according to Item 4.
  • the present invention also relates to the following phospholipids and the like.
  • General formula (1) (In the formula, m represents a natural number of 9 to 25, n represents a natural number of 10 to 15, X 1 , X 2 and X 3 are the same or different and represent H or OH.
  • R 1 is the following general represents formula (i) or (ii).)
  • p represents 1 or 2
  • q represents 1 or 2
  • r represents an integer of 1 to 4.
  • s represents an integer of 1 to 3.
  • R 2 represents a hydrogen atom or a hydrocarbon group.
  • the phospholipid according to item 1 wherein said m represents a natural number of 13-21, and said n represents a natural number of 11-12. 3.
  • General formula (2) below (In the formula, R 1 is the same as described above.)
  • the phospholipid according to item 1 or 2 represented by. 4.
  • Item 5. Lipid particles according to Item 4, encapsulating a drug. 6.
  • Item 6. The lipid particle of Item 5, wherein the drug is a polynucleotide. 7.
  • a pharmaceutical comprising the lipid particles according to any one of Items 4 to 8.
  • the phospholipid of the present invention has charge reversibility, does not have a positive charge at the pH of body fluid (usually in the neutral range), and can exhibit low cytotoxicity.
  • Example 1 shows an NMR chart of DHSM-DEDA synthesized in Example 1.
  • FIG. The NMR chart of DHSM-PPZ synthesized in Example 2 is shown.
  • An NMR chart of DOP-DEDA synthesized in Comparative Example 1 is shown.
  • the measurement results of ⁇ -Potential measured in Test Example 1-2 are shown.
  • the legend indicates the phospholipid used as lipid 1.
  • the horizontal axis indicates the pH at the time of measurement.
  • the results of LDH assay in Test Example 2-2 are shown. Shown are the results of WST-8assay in Test Example 2-2.
  • 2 shows the results of the TLC test of Test Example 3-1.
  • 2 shows the results of the TLC test of Test Example 3-2.
  • R 1 is the following general represents formula (i) or (ii).)
  • s represents an integer of 1 to 3.
  • R 2 represents a hydrogen atom or a hydrocarbon group.
  • the phospholipid represented by herein sometimes referred to as "the phospholipid of the present invention”). This will be explained below.
  • m represents a natural number of 9-25
  • n represents a natural number of 10-15
  • m is preferably a natural number from 13 to 21, more preferably a natural number from 14 to 18, and even more preferably 15.
  • n is preferably a natural number of 11 to 12, more preferably 12. More preferably, m is a natural number of 13-21, and n is a natural number of 11-12.
  • X 1 , X 2 and X 3 are the same or different and represent H or OH.
  • X 1 , X 2 and X 3 preferably represent H.
  • the phospholipid of the present invention is preferably a compound represented by the following general formula (2).
  • R 1 is the same as R 1 in general formula (1) above.
  • R 1 represents the following general formula (i) or (ii).
  • p represents 1 or 2
  • q represents 1 or 2.
  • p is two.
  • q is two.
  • both p and q are preferably two.
  • r represents an integer of 1-4. r is preferably 1 from the standpoint of even better low cytotoxicity. Moreover, r is preferably 2 from the viewpoint of further improving the encapsulation rate of the drug.
  • s represents an integer of 1-3. Preferably, s is two.
  • R2 represents a hydrogen atom or a hydrocarbon group.
  • the hydrocarbon group represented by R2 is not particularly limited as long as it is a monovalent hydrocarbon group.
  • the monovalent hydrogen group is preferably a chain hydrocarbon group, more preferably an alkyl group.
  • the number of carbon atoms in the hydrocarbon group is not particularly limited, but is, for example, 1-8, preferably 1-6, more preferably 1-4, still more preferably 1-2, and particularly preferably 1.
  • R 2 is preferably a hydrogen atom or an alkyl group, more preferably a hydrogen atom.
  • the phospholipids of general formula (1) also include salt forms. Both acid salts and basic salts can be employed as the salt.
  • acid salts include mineral salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate, phosphate; acetate, propionate, tartrate, fumarate, maleate, malic acid; Organic salts such as salts, citrates, methanesulfonates, paratoluenesulfonates, etc.
  • Examples of basic salts include alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts; Alkaline earth metal salts such as salts; salts with ammonia; morpholine, piperidine, pyrrolidine, monoalkylamine, dialkylamine, trialkylamine, mono(hydroxyalkyl)amine, di(hydroxyalkyl)amine, tri(hydroxyalkyl) Examples thereof include salts with organic amines such as amines.
  • the phospholipids of the present invention can be synthesized by various methods.
  • the compounds of the present invention are represented by, for example, the following reaction schemes:
  • the compound represented by the general formula (A) and the compound represented by the general formula (B) are reacted in the presence of a known enzyme such as phospholipase to obtain the compound represented by the general formula (1). can be obtained.
  • the amount of the compound represented by the general formula (B) used is preferably 1 mol or more, more preferably 2 mol or more, per 1 mol of the compound represented by the general formula (A), from the viewpoint of yield and the like. , is more preferably 4 mol or more, and particularly preferably 8 mol or more.
  • the amount of the compound represented by the general formula (B) is preferably 20 mol or less, and preferably 16 mol or less per 1 mol of the compound represented by the general formula (A), from the viewpoint of yield and the like. More preferably, 14 mol or less is even more preferable.
  • the reaction is performed in the presence of a solvent.
  • the solvent is not particularly limited as long as it can exhibit the activity of the enzyme.
  • Various buffer solutions are preferably used as the solvent.
  • the buffer preferably includes an acetate buffer.
  • the pH of the solvent is preferably 4-7, more preferably 5-6.
  • the reaction system may contain various organic solvents (eg, chloroform, etc.) for dissolving the compound represented by the general formula (A).
  • This reaction is typically carried out by mixing an organic solvent solution of the compound represented by general formula (A) and an aqueous solvent solution of the compound represented by general formula (B), and adding an enzyme.
  • additives can be used as appropriate within a range that does not significantly impair the progress of the reaction.
  • the reaction temperature is not particularly limited as long as it is a temperature at which the activity of the enzyme can be exhibited, and is usually 20-50°C, preferably 35-45°C.
  • the reaction time is not particularly limited as long as the enzyme activity can be exhibited, usually 6 to 72 hours, preferably 12 to 24 hours.
  • the solvent is distilled off, and the product can be isolated and purified by a conventional method such as chromatography or recrystallization. Also, the structure of the product can be identified by elemental analysis, MS (FD-MS) analysis, IR analysis, 1 H-NMR, 13 C-NMR and the like.
  • Ionizable lipids are acidic and positively charged, with a change in net charge from 0 to +1.
  • the change in net charge of the phospholipids (charge-reversible lipids) of the present invention can range from -1 to +2, which is a different focus.
  • the phospholipids of the present invention are ionized even under neutral conditions and may have different physicochemical properties from ionizable lipids.
  • the lipids of the present invention are also capable of behaving as amphipathic lipids even under neutral conditions and are therefore expected to be more stable and safer.
  • lipid particles that do not have a positive charge at the pH of body fluids (usually in the neutral range) and that enable more efficient expression of the effect of the drug contained therein. can.
  • Lipid particles contains the phospholipids of the present invention (herein, sometimes referred to as “phospholipid A”), containing lipid particles (herein, "the lipid particles of the present invention Also referred to as “lipid particles”). This will be explained below.
  • the lipid particles of the present invention are not particularly limited as long as they contain the phospholipid of the present invention as a particle-constituting lipid.
  • the phospholipids of the present invention contained in the lipid particles may be used singly or in combination of two or more.
  • the lipid particles of the present invention include, for example, particles in which an amphipathic lipid containing the phospholipid of the present invention constitutes an outer layer, and the lipids are arranged with the hydrophilic portion facing outward.
  • the particles include particles whose outer layer is composed of a single lipid membrane, and particles whose outer layer is composed of a lipid bilayer, preferably particles whose outer layer is composed of a single lipid membrane, and more preferably particles whose outer layer is composed of a single lipid membrane. in which the amphiphilic lipids are aligned with the hydrophilic portion facing outward.
  • the inner layer of the particles may consist of a homogeneous phase, either an aqueous phase or an oil phase, but preferably contains one or more reverse micelles.
  • the particle size of the lipid particles of the present invention is not particularly limited.
  • the particle size is preferably nano-sized, specifically for example 10 to 700 nm, preferably 20 to 500 nm, more preferably 40 to 200 nm, still more preferably 60 to 150 nm.
  • the lipid particles of the present invention preferably do not have a positive charge at the pH of body fluid (usually in the neutral range).
  • the lipid particles of the present invention may contain other lipids as particle-constituting lipids in addition to the phospholipids of the present invention.
  • Specific examples of lipids include phospholipids, glycolipids, sterols, saturated or unsaturated fatty acids, and the like.
  • phospholipids include phosphatidylcholines such as dilauroylphosphatidylcholine, dimyristoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, distearoylphosphatidylcholine, dioleoylphosphatidylcholine, dilinoleoylphosphatidylcholine, myristoylpalmitoylphosphatidylcholine, myristoylstearoylphosphatidylcholine, palmitoylstearoylphosphatidylcholine; Phosphatidylglycerols such as lauroylphosphatidylglycerol, dimyristoylphosphatidylglycerol, dipalmitoylphosphatidylglycerol, distearoylphosphatidylglycerol, dioleoylphosphatidylglycerol, dilinoleoylphosphati
  • glycolipids include glyceroglycolipids such as diglycosyldiglycerides, digalactosyldiglycerides, galactosyldiglycerides and glycosyldiglycerides; glycosphingolipids such as galactosylcerebrosides and gangliosides; stearyl glucosides and esterified stearyl glycosides.
  • sterols include cholesterol, cholesteryl hemisuccinate, lanosterol, dihydrolanosterol, desmosterol, dihydrocholesterol, phytosterol, phytosterol, stigmasterol, timosterol, ergosterol, sitosterol, campesterol, and brassicasterol.
  • the sterol has the effect of stabilizing the liposome membrane and adjusting the fluidity of the liposome membrane, so it is desirable that the sterol is contained as a constituent lipid of the liposome membrane.
  • saturated or unsaturated fatty acids include saturated or unsaturated fatty acids having 10 to 22 carbon atoms such as decanoic acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, arachidonic acid, oleic acid and docosanoic acid. .
  • the above lipids may be used singly or in combination of two or more.
  • the lipid particles of the present invention preferably contain a phospholipid other than the phospholipid of the present invention (herein sometimes referred to as "phospholipid B") and/or a sterol, more preferably phospholipid X and a sterol including.
  • phospholipid B preferably has a saturated chain hydrocarbon group.
  • Phospholipid B is preferably phosphatidylcholine, particularly preferably dipalmitoylphosphatidylcholine.
  • Phospholipids B also include, for example, distearoylphosphatidylcholine, dimyristoylphosphatidylcholine, dioleoylphosphatidylcholine, palmitoyloleoylphosphatidylcholine, and the like.
  • Preferred sterols include cholesterol.
  • the content thereof is, for example, 15 to 100 mol, preferably 30 to 70 mol, more preferably 40 to 60 mol, per 100 mol of the phospholipid of the present invention. , more preferably 45 to 55 mol.
  • the content is, for example, 5 to 70 mol, preferably 10 to 40 mol, more preferably 15 to 30 mol, still more preferably 17 to 27 mol, per 100 mol of the phospholipid of the present invention.
  • the content is, for example, 400 to 500 mol, preferably 420 to 480 mol, more preferably 430 to 470 mol, still more preferably 445 to 455 mol, per 100 mol of the phospholipid of the present invention.
  • the content is, for example, 30 to 200 mol, preferably 60 to 140 mol, more preferably 80 to 120 mol, per 100 mol of the phospholipid of the present invention. It is preferably 90 to 110 mol, more preferably 95 to 105 mol.
  • the content thereof is, for example, 250 to 600 mol, preferably 300 to 500 mol, more preferably 340 to 480 mol, still more preferably 430 to 470 mol, particularly preferably 430 to 470 mol, particularly preferably 445-455 mol.
  • the content of phospholipid B is, for example, 15 to 100 mol, preferably 30 to 70 mol, more preferably 40 to 60 mol, per 100 mol of sterol. mol, more preferably 45 to 55 mol.
  • the content is, for example, 5 to 70 mol, preferably 10 to 40 mol, more preferably 15 to 30 mol, still more preferably 17 to 27 mol, per 100 mol of sterol.
  • the content is, for example, 70 to 140 mol, preferably 80 to 130 mol, more preferably 90 to 120 mol, still more preferably 95 to 105 mol, per 100 mol of sterol.
  • the total content of the phospholipid of the present invention and other lipids that are optionally blended is relative to 100 mol% of the lipid particles constituting the lipid particles of the present invention, for example It is 50 mol % or more, preferably 70 mol % or more, more preferably 90 mol % or more, still more preferably 95 mol % or more, and even more preferably 99 mol % or more.
  • part of the phospholipid can be modified with a water-soluble polymer such as PEG.
  • the content of the PEG-modified phospholipid is, for example, 0 to 50 mol%, preferably 0 to 30 mol%, more preferably 0 to 20 mol%, relative to 100 mol% of the lipid particles constituting the lipid particles of the present invention. It is preferably 0 to 15 mol %.
  • the lipid particles of the present invention preferably encapsulate a drug.
  • Drugs are not particularly limited, and examples include polynucleotides, peptides, proteins, sugars, low-molecular-weight compounds, and the like.
  • the drug is preferably negatively charged and water-soluble.
  • Polynucleotides can be preferably employed as such drugs.
  • Target diseases of drugs include, but are not particularly limited to, cancer (in particular, solid cancer).
  • Polynucleotides are not particularly limited as long as they can exhibit a function as a drug.
  • guide RNA Cas protein expression vector, TALEN expression vector, etc.
  • Polynucleotides may be subjected to known chemical modifications as exemplified below. Substitution of the phosphate residue of each nucleotide with a chemically modified phosphate residue such as phosphorothioate (PS), methylphosphonate, phosphorodithionate, etc. to prevent degradation by hydrolases such as nucleases can be done.
  • a chemically modified phosphate residue such as phosphorothioate (PS), methylphosphonate, phosphorodithionate, etc.
  • the hydroxyl group at the 2nd position of the sugar (ribose) of each ribonucleotide is replaced by -OR (R is, for example, CH 3 (2'-O-Me), CH 2 CH 2 OCH 3 (2'-O-MOE), CH2CH2NHC ( NH ) NH2 , CH2CONHCH3 , CH2CH2CN , etc.).
  • R is, for example, CH 3 (2'-O-Me), CH 2 CH 2 OCH 3 (2'-O-MOE), CH2CH2NHC ( NH ) NH2 , CH2CONHCH3 , CH2CH2CN , etc.
  • the base moiety pyrimidine, purine
  • phosphate moiety or hydroxyl moiety has been modified with biotin, an amino group, a lower alkylamine group, an acetyl group, or the like.
  • BNA LNA
  • the conformation of the sugar portion is fixed to the N-type by bridging the 2' oxygen and 4' carbon of the sugar portion of a nucleotide, can also be preferably used.
  • the drug is preferably contained in the inner layer of the lipid particles of the present invention.
  • the drug is preferably contained within reverse micelles in the inner layer.
  • the molar ratio of the lipid particle-constituting lipid of the present invention to the drug is, for example, 500 or more, preferably 1000 or more when the drug is a polynucleotide such as siRNA. , more preferably 1,500 or more, still more preferably 1,900 or more, even more preferably 2,500 or more, and particularly preferably 3,200 or more.
  • the upper limit of the molar ratio is not particularly limited, and is 10,000, 7,000, 5,000, for example.
  • the lipid particles of the present invention may contain other components in addition to the above.
  • Other components include, for example, membrane stabilizers, charged substances, antioxidants, membrane proteins, polyethylene glycol (PEG), antibodies, peptides, sugar chains and the like.
  • Antioxidants can be contained to prevent oxidation of the film, and are used as necessary as a component of the film.
  • Antioxidants used as membrane constituents include, for example, butylated hydroxytoluene, propyl gallate, tocopherols, tocopherol acetate, concentrated mixed tocopherols, vitamin E, ascorbic acid, L-ascorbic stearate, palmitic acid. Examples include ascorbic acid, sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite, sodium edetate, erythorbic acid, citric acid and the like.
  • Membrane proteins can be contained for the purpose of adding functions to membranes or stabilizing membrane structures, and are used as necessary as membrane constituents.
  • Membrane proteins include, for example, surface membrane proteins, integral membrane proteins, albumin, recombinant albumin and the like.
  • the content of other components is, for example, 10% or less, preferably 5% or less, more preferably 2% or less, still more preferably 1% or less, relative to 100% by mass of the lipid particles of the present invention.
  • the lipid particles of the present invention can be produced according to or according to known methods for producing lipid particles.
  • the lipid particles of the present invention can be preferably produced by a method including a step of mixing an alcoholic solution containing the phospholipid of the present invention and an acidic aqueous solution (Step 1).
  • the alcohol that is the solvent for the alcohol solution is not particularly limited as long as it can dissolve phospholipids.
  • preferred alcohols include ethanol, 2-propanol, t-butanol, and the like. Among these, ethanol is particularly preferred from the viewpoint of ease of handling, safety, and the like.
  • the acidic aqueous solution usually contains an acid in addition to the solvent water.
  • acids include organic acids and inorganic acids, preferably organic acids.
  • organic acids include maleic acid, formic acid, acetic acid, propionic acid, folic acid, isobutyric acid, valeric acid, isovaleric acid, pyruvic acid, oxalic acid, malonic acid, succinic acid, glutaric acid, ketoglutaric acid, adipic acid, Lactic Acid, Tartaric Acid, Fumaric Acid, Oxaloacetic Acid, Malic Acid, Isocitric Acid, Citric Acid, Benzoic Acid, Phthalic Acid, Isophthalic Acid, Terephthalic Acid, Hemimellitic Acid, Trimellitic Acid, Trimesic Acid, Mellophanic Acid, Prenic Acid, Pyromellitic Acid, Merit acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, camphorsulf
  • Inorganic acids include hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, carbonic acid, boric acid, boronic acid, hydrofluoric acid, hypochlorous acid, chlorous acid, chloric acid, perchloric acid, hypobromous acid, bromous acid, bromine acid, perbromic acid, hypoiodous acid, iodous acid, iodic acid, periodic acid, phosphorous acid, phosphoric acid, polyphosphoric acid, chromic acid, permanganic acid, amberlyst.
  • One type of acid may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • the pH of the acidic aqueous solution is preferably 3-5.
  • the acidic aqueous solution preferably contains a water-soluble drug.
  • the mixing ratio of the acidic aqueous solution and the alcoholic solution is, for example, 1.5-10, preferably 2-8, more preferably 3-6.
  • Mixing is not particularly limited as long as the lipid and the drug can be mixed, but for example, vigorous stirring with a vortex or the like can be adopted.
  • the mixing time varies depending on the mixing mode, but is, for example, 10 seconds to 2 minutes, preferably 15 seconds to 1 minute.
  • step 1 can be performed at room temperature or under heating.
  • the temperature in step 1 is, for example, 5°C to 50°C, preferably 15°C to 45°C. If t-butanol is not used or the amount used is small, lipid particles can be prepared even if the temperature in step 1 is relatively low.
  • the temperature is, for example, less than 30°C and 25°C or less.
  • Step 1 can also be carried out using a reaction system using microchannels. In that case, various conditions can be appropriately adjusted according to the reaction system.
  • step 1 it is preferable to remove alcohol by dialysis.
  • the dialysis solvent water can usually be used.
  • the dialysis time is, for example, 4-48 hours, preferably 6-24 hours, more preferably 6-12 hours. During dialysis, it is preferable to replace the dialysis solvent as appropriate.
  • the lipid particles of the present invention can be frozen products, freeze-dried products, and the like.
  • Lipid Particles One aspect of the present invention relates to a medicine containing the lipid particles of the present invention (herein sometimes referred to as "the medicine of the present invention"). Moreover, the lipid particles of the present invention can also be used as a reagent.
  • the lipid particles of the present invention can exert the effects of drugs (for example, polynucleotides such as siRNA) more efficiently while reducing cytotoxicity. Therefore, the lipid particles of the present invention can be suitably used as drug carriers.
  • drugs for example, polynucleotides such as siRNA
  • the content of the active ingredient in the medicament of the present invention can be about 0.0001 to 100 parts by weight based on 100 parts by weight of the entire medicament of the present invention.
  • the dosage form of the medicament of the present invention is not particularly limited as long as the desired effect is obtained. It can be administered to mammals including humans by any route of administration.
  • a preferred mode of administration is parenteral administration, more preferably intravenous injection.
  • Dosage forms for oral administration and parenteral administration and production methods thereof are well known to those skilled in the art, and can be produced according to conventional methods by mixing the active ingredient with a pharmaceutically acceptable carrier or the like. can.
  • Dosage forms for parenteral administration include preparations for injection (e.g., drip injection, intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous injection, intradermal injection), external preparations (e.g., ointments, poultices, lotions). medicine), suppository inhalant, ophthalmic agent, ophthalmic ointment, nose drops, ear drops and the like.
  • an injectable preparation is prepared by dissolving the lipid particles of the present invention in distilled water for injection, and adding a solubilizer, a buffer, a pH adjuster, a tonicity agent, an analgesic, and a preservative, if necessary. , and stabilizers and the like can be added.
  • the medicament can also be a lyophilized formulation for extemporaneous preparation.
  • the medicament of the present invention may further contain other drugs effective in treating or preventing diseases.
  • the medicament of the present invention can also contain ingredients such as bactericides, antiphlogistic agents, cell activators, vitamins, and amino acids, if necessary.
  • the carrier used for formulating the medicament of the present invention includes excipients, binders, disintegrants, lubricants, coloring agents, flavoring agents, and if necessary, stabilizers, emulsifiers, emulsifiers, Absorption promoters, surfactants, pH adjusters, preservatives, antioxidants, bulking agents, wetting agents, surface activators, dispersants, buffers, preservatives, solubilizers, soothing agents, etc. be able to.
  • the dosage of the medicament of the present invention is determined, for example, by route of administration, type of disease, degree of symptoms, patient age, sex, body weight, severity of disease, pharmacological findings such as pharmacokinetics and toxicological characteristics, It can be determined by the clinician based on a variety of factors, such as whether a drug delivery system is used and whether it is administered as part of a combination of other drugs.
  • the dosage of the drug of the present invention can be, for example, about 1 ⁇ g/kg (body weight) to 10 g/kg (body weight) per day.
  • the administration schedule of the medicament of the present invention can also be determined in consideration of factors similar to the dosage. For example, the above daily doses can be administered once a day to once a month.
  • Synthesis example 1 Synthesis of DHSM-DEDA and DHSM-PPZ ,3R)-3-hydroxy-2-stearamidooctadecyl (2-(piperazino)ethyl) phosphate (DHSM-PPZ: Example 2) was synthesized according to the following scheme.
  • the reaction mixture was diluted with methanol and washed with 20% saline while warming to 50°C.
  • the organic phase was concentrated under reduced pressure and concentrated to dryness. 5.75 g of concentrate was obtained.
  • Example 2 Synthesis of DHSM-PPZ 2.80 g (3.82 mmol) of DHSM was dissolved in chloroform, and 6.90 g of 1-(2-Hydroxyethyl) piperazine (53 mmol) was dissolved in the solution. M acetate buffer was added and warmed to 50°C. After warming, phospholipase (1,440 U) was added and stirred at 40°C. After 17 hours, disappearance of DHSM was confirmed by TLC. One unit is the amount of enzyme that can change 1 micromole ( ⁇ mol) of substrate per minute under optimal conditions (at a temperature of 30°C and acidity at which chemical reactions proceed the most) (1 micromole per minute ).
  • An NMR chart is shown in FIG.
  • siRNA encapsulation rate was measured as follows.
  • An RNA quantification reagent (RiboGreen reagent, manufactured by Thermo Fisher Scientific) was used. Specifically, it was carried out as follows. 2% Triton-X 100 or RNase free water was added to the lipid particle solution. The resulting solution, RNase free water, and RiboGreen reagent were mixed in wells of a 96-well black plate. After shaking the plate for 5 minutes, the fluorescence intensity of each well was measured.
  • encapsulation rate (%) (fluorescence intensity of total siRNA - fluorescence intensity of free siRNA) / (fluorescence intensity of total siRNA), encapsulation of siRNA in lipid particles rate was calculated.
  • Test example 2 Cytotoxicity Evaluation Test ⁇ Test Example 2-1. Production of lipid particles> Lipid particles were produced in the same manner as in Test Example 1-1.
  • ⁇ Test Example 2-2 Toxicity Evaluation Test> MDA-MB-231 human breast cancer cells were seeded in a 96-well plate (7 ⁇ 10 3 cells/well) and cultured at 37° C. for 24 hours. Lipid particle solution (containing 0.6/2/6 pmol of siRNA) or lipid complex solution (complex prepared using Lipofectamine® 2000 (manufactured by Thermo Fisher Scientific), containing 0.6/2/6 pmol of siRNA) was added dropwise to the wells and cultured at 37°C for 96 hours. Cytotoxicity of lipid particles and lipid complexes was evaluated using a Viability/Cytotoxicity Multiplex Assay Kit (Dojindo Laboratories).
  • the vertical axis shows the relative value of the damaged cells when the negative control is corrected to 1, and the phospholipid used as lipid 1 is shown below the column.
  • "Nega” indicates negative control, which is a sample to which lipid particles were not added.
  • "Posi” indicates a positive control, a sample added with lysis buffer.
  • “LFA” is a sample added with a lipid complex using Lipofectamine (registered trademark) 2000 instead of lipid particles.
  • Three columns are shown for each sample, and the three columns have different siRNA concentrations in the evaluation system. From the left, siRNA concentrations in the evaluation system are 3 nM, 10 nM, and 30 nM.
  • the TLC plate on the left is a TLC plate developed using copper sulfate as a coloring agent, and organic compounds are detected.
  • the TLC plate on the right is a TLC plate developed with ninhydrin as a coloring agent, and amine compounds are detected.
  • a indicates the TLC test result of the raw material equivalent to 50 ⁇ g of DHSM
  • b indicates the TLC test result of the reaction mixture.
  • the TLC plate on the left is a TLC plate developed using copper sulfate as a coloring agent, and organic compounds are detected.
  • the TLC plate on the right is a TLC plate developed using ninhydrin as a coloring agent, and amines are detected.
  • a indicates the TLC test result of the raw material DOPC equivalent to 50 ⁇ g
  • b indicates the TLC test result of the reaction mixture.

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Abstract

本発明は、チャージリバーシブル性を有し、体液のpH（通常は、中性域）において正電荷を有さず、低細胞毒性を示すリン脂質を提供する。　本発明は、一般式（1）（式中、ｍは９～２５の自然数を示し、ｎは１０～１５の自然数を示し、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３は、同一又は異なって、Ｈ又はＯＨを示す。Ｒ１は下記一般式（ｉ）又は（ｉｉ）を示す。）（式中、ｐは１又は２を示し、ｑは１又は２を示し、ｒは１～４の整数を示す。）（式中、ｓは１～３の整数を示す。Ｒ２は水素原子又は炭化水素基を示す。）で表されるリン脂質を提供する。

Description

リン脂質
　本発明は、リン脂質等に関する。
　近年、small interfering RNA（siRNA）を含有する医薬品やmessenger RNA（mRNA）を含有する遺伝子ワクチンの開発が行われている。外部から投与したRNAが生体内で本来の活性を示すには極めて高度なデリバリーシステムを必要とする。これは、RNAが速やかに酵素分解を受けることや細胞膜をほとんど通過しないことなどに起因する。そのため、RNAを含有する医薬品やワクチンの実用化には、必然的にデリバリーシステムの開発が伴う。
　RNA等の薬物のデリバリーシステムとしては、薬物を脂質粒子に封入した状態で投与することが知られている。ただ、負電荷を有する核酸を投与する場合、通常は、静電的相互作用を起こすべく正電荷を有する脂質が用いられるので、細胞毒性の懸念があった（特許文献１）。
日本国特開2016-023147号公報
　本発明者はチャージリバーシブル性を有するリン脂質が、siRNA封入性及び生理的pHでの安全性を有することに着目した。また、当該チャージリバーシブル性を有するリン脂質が体液のpH（通常は、中性域）において正電荷を有さない脂質粒子である場合に、細胞毒性を低減できることにも着目した。
　本発明は、チャージリバーシブル性を有し、体液のpH（通常は、中性域）において正電荷を有さず、低細胞毒性を示すリン脂質を提供することを目的とする。好ましくは、本発明は、さらに、薬物をより効率的に内封でき、且つ／或いは薬物のより効率的な送達に適したサイズを有する脂質粒子、及び該脂質粒子を形成するための脂質を提供することも課題とする。
　本発明者は鋭意研究を進めた結果、特定の構造であるリン脂質であれば上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は、下記のリン脂質等に関する。
１．一般式（1）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （式中、ｍは９～２５の自然数を示し、ｎは１０～１５の自然数を示し、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３は、同一又は異なって、Ｈ又はＯＨを示す。Ｒ１は下記一般式（ｉ）又は（ｉｉ）を示す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （式中、ｐは１又は２を示し、ｑは１又は２を示し、ｒは１～４の整数を示す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （式中、ｓは１～３の整数を示す。Ｒ２は水素原子又は炭化水素基を示す。）
で表されるリン脂質。
２．前記ｍは１３～２１の自然数を示し、前記ｎは１１～１２の自然数を示す、項１に記載のリン脂質。
３．下記一般式（２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （式中、Ｒ１は前記と同様である。）
で表される、項１に記載のリン脂質。
４．項１に記載のリン脂質（リン脂質Ａ）を含有する、脂質粒子。
５．薬物を内包する、項４に記載の脂質粒子。
６．前記薬物がポリヌクレオチドである、項５に記載の脂質粒子。
７．ステロールを含有する、項４に記載の脂質粒子。
８．更に、前記リン脂質Ａ以外のリン脂質（リン脂質Ｂ）を含有する、項４に記載の脂質粒子。
９．項１に記載のリン脂質を含有する、アルコール溶液。
１０．前記アルコール溶液中のアルコールがエタノールである、項９に記載のアルコール溶液。
１１．項９に記載のアルコール溶液と酸性水溶液とを混合する工程を含む、脂質粒子の製造方法。
１２．項４に記載の脂質粒子を含有する、医薬。
　また、本発明は、下記のリン脂質等に関する。
１．一般式（1）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （式中、ｍは９～２５の自然数を示し、ｎは１０～１５の自然数を示し、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３は、同一又は異なって、Ｈ又はＯＨを示す。Ｒ１は下記一般式（ｉ）又は（ｉｉ）を示す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （式中、ｐは１又は２を示し、ｑは１又は２を示し、ｒは１～４の整数を示す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 （式中、ｓは１～３の整数を示す。Ｒ２は水素原子又は炭化水素基を示す。）
で表されるリン脂質。
２．前記ｍは１３～２１の自然数を示し、前記ｎは１１～１２の自然数を示す、項１に記載のリン脂質。
３．下記一般式（２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 （式中、Ｒ１は前記と同様である。）
で表される、項１又は２に記載のリン脂質。
４．項１～３のいずれかに記載のリン脂質（リン脂質Ａ）を含有する、脂質粒子。
５．薬物を内包する、項４に記載の脂質粒子。
６．前記薬物がポリヌクレオチドである、項５に記載の脂質粒子。
７．ステロールを含有する、項４～６のいずれかに記載の脂質粒子。
８．更に、前記リン脂質Ａ以外のリン脂質（リン脂質Ｂ）を含有する、項４～７のいずれかに記載の脂質粒子。
９．項１～３のいずれかに記載のリン脂質を含有する、アルコール溶液。
１０．前記アルコール溶液中のアルコールがエタノールである、項９に記載のアルコール溶液。
１１．項９又は１０に記載のアルコール溶液と酸性水溶液とを混合する工程を含む、脂質粒子の製造方法。
１２．項４～８のいずれかに記載の脂質粒子を含有する、医薬。
　本発明のリン脂質は、チャージリバーシブル性を有し、体液のpH（通常は、中性域）において正電荷を有さず、低細胞毒性を示すことができる。
実施例１で合成したDHSM-DEDAのNMRチャートを示す。 実施例２で合成したDHSM-PPZのNMRチャートを示す。 比較例１で合成したDOP-DEDAのNMRチャートを示す。 試験例１－２で測定したζ-Potentialの測定結果を示す。凡例に、脂質1として使用したリン脂質を示す。横軸に測定時のpHを示す。 試験例２－２のLDH assayの結果を示す。 試験例２－２のWST-8assayの結果を示す。 試験例３－１のTLC試験の結果を示す。 試験例３－２のTLC試験の結果を示す。
　本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
１．脂質含有組成物
　本発明は、その一態様において、一般式（1）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
（式中、ｍは９～２５の自然数を示し、ｎは１０～１５の自然数を示し、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３は、同一又は異なって、Ｈ又はＯＨを示す。Ｒ１は下記一般式（ｉ）又は（ｉｉ）を示す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
（式中、ｐは１又は２を示し、ｑは１又は２を示し、ｒは１～４の整数を示す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
（式中、ｓは１～３の整数を示す。Ｒ２は水素原子又は炭化水素基を示す。）
で表されるリン脂質（本明細書において、「本発明のリン脂質」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
　上記一般式（１）において、式中、ｍは９～２５の自然数を示し、ｎは１０～１５の自然数を示す。ｍは１３～２１の自然数であることが好ましく、１４～１８の自然数であることがより好ましく、１５であることが更に好ましい。また、ｎは１１～１２の自然数であることが好ましく、１２であることがより好ましい。また、ｍは１３～２１の自然数であり、且つ、ｎは１１～１２の自然数であることが更に好ましい。
　上記一般式（１）において、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３は、同一又は異なって、Ｈ又はＯＨを示す。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３は、Ｈを示すことが好ましい。
　本発明のリン脂質は、下記一般式（２）で表わされる化合物であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　上記一般式（２）において、Ｒ１は上記一般式（１）のＲ１と同一である。
　上記一般式（１）及び（２）において、Ｒ１は下記一般式（ｉ）又は（ｉｉ）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　上記一般式（ｉ）中、ｐは１又は２を示し、ｑは１又は２を示す。ｐは２であることが好ましい。また、ｑは２であることが好ましい。また、ｐ及びｑは、共に２であることが好ましい。
　上記一般式（ｉ）中、ｒは１～４の整数を示す。低細胞毒性により一層優れる観点から、ｒは１であることが好ましい。また、薬物の内封率がより一層向上する点で、ｒは２であることが好ましい。
　上記一般式（ｉｉ）中、ｓは１～３の整数を示す。ｓは２であることが好ましい。
　上記一般式（ｉｉ）中、Ｒ２は水素原子又は炭化水素基を示す。Ｒ２で示される炭化水素基は、一価の炭化水素基である限り特に制限されない。当該単価水素基は、好ましくは鎖式炭化水素基であり、より好ましくはアルキル基である。炭化水素基の炭素数は、特に制限されないが、例えば1～8、好ましくは1～6、より好ましくは1～4、さらに好ましくは1～2、とりわけ好ましくは1である。
　Ｒ２は水素原子又はアルキル基である好ましく、水素原子であることがより好ましい。
　一般式（１）のリン脂質には、塩の形態も包含される。塩は、該塩としては、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられ、塩基性塩の例としては、ナトリウム塩、及びカリウム塩等のアルカリ金属塩；並びにカルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；　アンモニアとの塩；モルホリン、ピペリジン、ピロリジン、モノアルキルアミン、ジアルキルアミン、トリアルキルアミン、モノ（ヒドロキシアルキル）アミン、ジ（ヒドロキシアルキル）アミン、トリ（ヒドロキシアルキル）アミン等の有機アミンとの塩等が挙げられる。
　本発明のリン脂質は、様々な方法で合成することができる。本発明の化合物は、例えば以下の反応式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
（式中、ｍ、ｎ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＲ１は前記に同じである。）
に従って又は準じて合成することができる。
　本反応では、一般式（A）で表される化合物と一般式（B）で表される化合物とを、ホスホリパーゼ等の公知の酵素の存在下で反応させることで、一般式（1）で表される化合物を得ることができる。
　一般式（B）で表される化合物の使用量は、収率等の観点から、一般式（A）で表される化合物1モルに対して、1モル以上が好ましく、2モル以上がより好ましく、4モル以上が更に好ましく、8モル以上が特に好ましい。また、一般式（B）で表される化合物の使用量は、収率等の観点から、一般式（A）で表される化合物1モルに対して、20モル以下が好ましく、16モル以下がより好ましく、14モル以下が更に好ましい。
　本反応は、溶媒の存在下で行われる。溶媒としては、酵素の活性を発揮できる溶媒である限り特に制限されない。溶媒としては、各種緩衝液が好適に使用される。緩衝液としては、好ましくは酢酸緩衝液が挙げられる。溶媒のpHは、好ましくは4～7、より好ましくは5～6である。本反応系においては、上記水系溶媒の他にも、一般式（A）で表される化合物を溶解させるために各種有機溶媒（例えば、クロロホルム等）を含んでいてもよい。
　本反応は、典型的には、一般式（A）で表される化合物の有機溶媒溶液と一般式（B）で表される化合物の水系溶媒溶液とを混合し、酵素を添加することにより行われる。
　本反応においては、上記成分以外にも、反応の進行を著しく損なわない範囲で、適宜添加剤を使用することもできる。
　反応温度は、酵素の活性を発揮できる温度である限り特に制限されず、通常20～50℃、好ましくは35～45℃である。
　反応時間は、酵素の活性を発揮できる時間である限り特に制限されず、通常6時間～72時間、好ましくは12時間～24時間である。
　反応終了後、溶媒を留去し、生成物をクロマトグラフィー法、再結晶法等の通常の方法で単離し、精製することができる。また、生成物の構造は、元素分析、MS（FD-MS）分析、IR分析、1H-NMR、13C-NMR等により同定することができる。
　近年、脂質ナノ粒子の安全性を高めるため、イオナイザブル脂質が開発され、ナノ粒子化されている。イオナイザブル脂質は酸性で正に荷電するが、そのときの実効電荷の変化は0→+1である。一方、本発明のリン脂質（チャージリバーシブル脂質）の実効電荷の変化は、－1～+2の範囲であり得、着眼点が異なる。本発明のリン脂質は中性条件下でもイオン化はしており、イオナイザブル脂質とは物理化学的性質が異なり得る。本発明の脂質は、中性条件下でも両親媒性脂質としてふるまうことも可能であり、それ故により高い安定性とより高い安全性を期待できる。
　本発明のリン脂質を用いることにより、体液のpH（通常は、中性域）において正電荷を有さず、且つ内包する薬物のより効率的な効果発現が可能な脂質粒子を形成することができる。
2．脂質粒子
　本発明は、その一態様として、本発明のリン脂質（本明細書において、「リン脂質A」と示すこともある。）を含有する、脂質粒子（本明細書において、「本発明の脂質粒子」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
　本発明の脂質粒子は、粒子構成脂質として本発明のリン脂質が含まれる粒子である限り特に制限されない。脂質粒子に含まれる本発明のリン脂質は1種単独でもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。本発明の脂質粒子としては、例えば本発明のリン脂質を含む両親媒性の脂質が外層を構成し、且つ該脂質が親水性部分を外側に向けて並んでいる粒子が挙げられる。該粒子としては、例えば外層が脂質一重膜からなる粒子、外層が脂質二重膜からなる粒子が挙げられ、好ましくは外層が脂質一重膜からなる粒子が挙げられ、より好ましくは外層の脂質一重膜において両親媒性脂質が親水性部分を外側に向けて並んでいる粒子が挙げられる。粒子の内層は、水相又は油相の均一な相からなるものでもよいが、1又は複数の逆ミセルを含むことが好ましい。
　本発明の脂質粒子の粒子径は、特に制限されない。該粒子径は、好ましくはナノサイズであり、具体的には例えば10～700 nm、好ましくは20～500 nm、より好ましくは40～200 nm、さらに好ましくは60～150 nmである。
　本発明の脂質粒子は、体液のpH（通常は、中性域）において正電荷を有さないことが好ましい。
　本発明の脂質粒子は、本発明のリン脂質以外に、粒子構成脂質として、他の脂質を含み得る。脂質の具体例としては、リン脂質、糖脂質、ステロール、飽和又は不飽和の脂肪酸等が例示される。
　リン脂質の具体例としては、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ミリストイルパルミトイルホスファチジルコリン、ミリストイルステアロイルホスファチジルコリン、パルミトイルステアロイルホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン；ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジリノレオイルホスファチジルグリセロール、ミリストイルパルミトイルホスファチジルグリセロール、ミリストイルステアロイルホスファチジルグリセロール、パルミトイルステアロイルホスファチジルグリセロール等のホスファチジルグリセロール；ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、ミリストイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ミリストイルステアロイルホスファチジルエタノールアミン、パルミトイルステアロイルホスファチジルエタノールアミン等のホスファチジルエタノールアミン；ホスファチジルセリン；ホスファチジン酸；ホスファチジルイノシトール；スフィンゴミエリン；カルジオリピン；卵黄レシチン；大豆レシチン；及びこれらの水素添加物等が例示される。これらは、PEG等の水溶性高分子で修飾されたものであってもよい。
　糖脂質の具体例としては、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド等のグリセロ糖脂質；ガラクトシルセレブロシド、ガングリオシド等のスフィンゴ糖脂質；ステアリルグルコシド、エステル化ステアリルグリコシド等が例示される。
　ステロールの具体例としては、コレステロール、コレステリルヘミスクシネート、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール、フィトステロール、フィトステロール、スチグマステロール、チモステロール、エルゴステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール等が例示される。特に、当該ステロールには、リポソーム膜を安定化させたり、リポソーム膜の流動性を調節したりする作用があるため、リポソーム膜の構成脂質として含まれていることが望ましい。
　飽和又は不飽和の脂肪酸の具体例としては、デカン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、オレイン酸、ドコサン酸等の炭素数10～22の飽和又は不飽和の脂肪酸が例示される。
　上記脂質は、1種単独で使用してもよいが、2種以上を組み合わせて使用してもよい。
　本発明の脂質粒子は、好ましくは本発明のリン脂質以外のリン脂質（本明細書において、「リン脂質B」と示すこともある）及び／又はステロールを含み、より好ましくはリン脂質X及びステロールを含む。本発明のリン脂質が不飽和鎖式炭化水素基を有するリン脂質である場合、本発明の一態様において、リン脂質Bは飽和鎖式炭化水素基を有することが好ましい。リン脂質Bとしては、好ましくはホスファチジルコリンが挙げられ、特に好ましくはジパルミトイルホスファチジルコリンが挙げられる。また、リン脂質Bとしては、他にも、例えばジステアロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン等が挙げられる。ステロールとしては、好ましくはコレステロールが挙げられる。
　本発明の脂質粒子がリン脂質Bを含有する場合、その含有量は、本発明のリン脂質100モルに対して、例えば15～100モル、好ましくは30～70モル、より好ましくは40～60モル、さらに好ましくは45～55モルである。或いは、その含有量は、本発明のリン脂質100モルに対して、例えば5～70モル、好ましくは10～40モル、より好ましくは15～30モル、さらに好ましくは17～27モルである。或いは、その含有量は、本発明のリン脂質100モルに対して、例えば400～500モル、好ましくは420～480モル、より好ましくは430～470モル、さらに好ましくは445～455モルである。
　本発明の脂質粒子がステロールを含有する場合、その含有量は、本発明のリン脂質100モルに対して、例えば30～200モル、好ましくは60～140モル、より好ましくは80～120モル、さらに好ましくは90～110モル、よりさらに好ましくは95～105モルである。或いは、その含有量は、本発明のリン脂質100モルに対して、例えば250～600モル、好ましくは300～500モル、より好ましくは340～480モル、さらに好ましくは430～470モル、特に好ましくは445～455モルである。
　本発明の脂質粒子がリン脂質B及びステロールを含有する場合、リン脂質Bの含有量は、ステロール100モルに対して、例えば15～100モル、好ましくは30～70モル、より好ましくは40～60モル、さらに好ましくは45～55モルである。或いは、その含有量は、ステロール100モルに対して、例えば5～70モル、好ましくは10～40モル、より好ましくは15～30モル、さらに好ましくは17～27モルである。或いは、その含有量は、ステロール100モルに対して、例えば70～140モル、好ましくは80～130モル、より好ましくは90～120モル、さらに好ましくは95～105モルである。
　本発明のリン脂質と必要に応じて配合される他の脂質（好ましい態様においては、リン脂質B及びステロール）との合計含有量は、本発明の脂質粒子構成脂質100モル％に対して、例えば50モル％以上、好ましくは70モル％以上、より好ましくは90モル％以上、さらに好ましくは95モル％以上、よりさらに好ましくは99モル％以上である。
　本発明の脂質粒子においては、リン脂質の一部がPEG等の水溶性高分子で修飾されていることができる。PEG修飾されたリン脂質の含有量は、本発明の脂質粒子構成脂質100モル％に対して、例えば0～50モル％、好ましくは0～30モル％、より好ましくは0～20モル％、さらに好ましくは0～15モル％である。
　本発明の脂質粒子は、好ましくは薬物を内包する。薬物としては、特に制限されず、例えば、ポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、糖、低分子化合物等が挙げられる。薬物は、負電荷を有するものが好ましく、また水溶性のものが好ましい。このような薬物としては、ポリヌクレオチドを好適に採用できる。薬物の対象疾患としては、特に制限されないが、例えばがん（特に、固形がん）が挙げられる。
　ポリヌクレオチドとしては、薬物としての機能を発揮し得るものである限り特に制限されないが、例えばsiRNA、miRNA、アンチセンス核酸、mRNA、これらの発現ベクターや、タンパク質の発現ベクター、ゲノム編集用核酸（例えばガイドRNA、Casタンパク質発現ベクター、TALEN発現ベクター等）等が挙げられる。
　ポリヌクレオチドには、次に例示するように、公知の化学修飾が施されていてもよい。ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各リボヌクレオチドの糖（リボース）の2位の水酸基を、-OR（Rは、例えばCH3（2´-O-Me）、CH2CH2OCH3（2´-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。さらには、リン酸部分やヒドロキシル部分が、例えば、ビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等で修飾されたものなどを挙げることができるが、これに限定されない。また、ヌクレオチドの糖部の2´酸素と4´炭素を架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをN型に固定したものであるBNA（LNA）等もまた、好ましく用いられ得る。
　薬物は、本発明の脂質粒子の内層に含まれることが好ましい。薬物がポリヌクレオチドである場合、薬物は、内層における逆ミセル内に含まれることが好ましい。
　本発明の脂質粒子構成脂質と薬物とのモル比（本発明の脂質粒子構成脂質／薬物、mol/mol）は、例えば薬物がsiRNA等のポリヌクレオチドである場合、例えば500以上、好ましくは1000以上、より好ましくは1500以上、さらに好ましくは1900以上、よりさらに好ましくは2500以上、特に好ましくは3200以上である。該モル比の上限は特に制限されず、例えば10000、7000、5000である。
　本発明の脂質粒子は、上記以外にも他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば膜安定化剤、荷電物質、抗酸化剤、膜タンパク質、ポリエチレングリコール（PEG）、抗体、ペプチド、糖鎖等が挙げられる。
　抗酸化剤は、膜の酸化防止のために含有させることができ、膜の構成成分として必要に応じて使用される。膜の構成成分として使用される抗酸化剤としては、例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン、没食子酸プロピル、トコフェロール、酢酸トコフェロール、濃縮混合トコフェロール、ビタミンE、アスコルビン酸、L-アスコルビン酸ステアリン酸エステル、パルミチン酸アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エリソルビン酸、クエン酸等が例示される。
　膜タンパク質は、膜への機能付加又は膜の構造安定化を目的として含有させることができ、膜構成成分として必要に応じて使用される。膜タンパク質としては、例えば、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質、アルブミン、組換えアルブミン等が挙げられる。
　他の成分の含有量は、本発明の脂質粒子100質量％に対して、例えば10％以下、好ましくは5％以下、より好ましくは2％以下、さらに好ましくは1％以下である。
　本発明の脂質粒子は、脂質粒子の公知の製造方法に従って又は準じて製造することができる。本発明の脂質粒子は、好適には、本発明のリン脂質を含有するアルコール溶液と酸性水溶液とを混合する工程（工程1）を含む方法によって、製造することができる。
　アルコール溶液の溶媒であるアルコールとしては、リン脂質を溶解可能なアルコールである限り特に制限されない。溶解性の観点から、アルコールとしては、好ましくはエタノール、2－プロパノール、t－ブタノール等が挙げられる。これらの中でも、取扱い容易性、安全性等の観点から、エタノールが特に好ましく挙げられる。
　酸性水溶液は、溶媒である水の他に、通常は酸が含まれる。酸としては、例えば有機酸及び無機酸が挙げられ、好ましくは有機酸が挙げられる。有機酸としては、例えば、マレイン酸、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、葉酸、イソ酪酸、吉草酸、イソ吉草酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、ケトグルタル酸、アジピン酸、乳酸、酒石酸、フマル酸、オキサロ酢酸、リンゴ酸、イソクエン酸、クエン酸、安息香酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、ヘミメリト酸、トリメリト酸、トリメシン酸、メロファン酸、プレーニト酸、ピロメリト酸、メリト酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、p-トルエンスルフィン酸、ベンゼンスルフィン酸等が挙げられ、好ましくはクエン酸が挙げられる。無機酸としては、塩酸、硫酸、硝酸、炭酸、ホウ酸、ボロン酸、フッ化水素酸、次亜塩素酸、亜塩素酸、塩素酸、過塩素酸、次亜臭素酸、亜臭素酸、臭素酸、過臭素酸、次亜ヨウ素酸、亜ヨウ素酸、ヨウ素酸、過ヨウ素酸、亜リン酸、リン酸、ポリリン酸、クロム酸、過マンガン酸、アンバーリストが挙げられる。酸は1種単独で用いてもよいし、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
　酸性水溶液のpHは、好ましくは3～5である。
　酸性水溶液は水溶性薬物を含有することが好ましい。
　酸性水溶液とアルコール溶液との混合比（酸性水溶液／アルコール溶液、v/v）は、例えば1.5～10、好ましくは2～8、より好ましくは3～6である。
　混合は、脂質と薬物とが混合可能な態様である限り特に制限されないが、例えば、ボルテックス等で激しく撹拌する態様を採用することができる。混合時間は、混合態様によっても異なるが、例えば10秒間～2分間、好ましくは15秒間～1分間である。
　工程1は、例えば、常温で行うこともできるし、加温下で実行することもできる。工程1の温度は、例えば5℃～50℃、好ましくは15℃～45℃である。t－ブタノールを使用しない場合或いはその使用量が少ない場合、工程1の温度が比較的低くとも、脂質粒子の調製が可能である。当該温度は、例えば30℃未満、25℃以下である。
　工程1は、マイクロ流路を用いた反応系を用いて実施することも可能である。その場合、各種条件は、該反応系に応じて適宜調整することができる。
　工程1後は、透析によりアルコールを除去することが好ましい。透析溶媒は、通常は水を使用することができる。透析時間は、例えば4～48時間、好ましくは6～24時間、より好ましくは6～12時間である。透析中は、適宜、透析溶媒を交換することが好ましい。
　本発明の脂質粒子は、凍結物、凍結乾燥物等であることができる。
　3．脂質粒子の用途
　本発明は、その一態様として、本発明の脂質粒子を含有する、医薬（本明細書において、「本発明の医薬」と示すこともある。）に関する。また、本発明の脂質粒子は、試薬としても利用することができる。
　本発明の脂質粒子は、細胞毒性をより低減しつつも、より効率的に薬物（例えば、siRNA等のポリヌクレオチド）の効果を発揮することができる。このため、本発明の脂質粒子は、薬物のキャリアとして好適に利用することができる。
　本発明の医薬中の有効成分（＝薬物）の含有量は、対象とする疾患の種類、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、患者の年齢、及び患者の体重等を考慮して適宜設定することができる。例えば、本発明の医薬中の有効成分の含量は、本発明の医薬全体を100重量部として0.0001重量部～100重量部程度をすることができる。
　本発明の医薬の投与形態は、所望の効果が得られる限り特に制限されず、経口投与、及び非経口投与（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与、局所投与）のいずれかの投与経路でヒトを含む哺乳類に投与することができる。好ましい投与形態は非経口投与であり、より好ましくは静脈注射である。経口投与および非経口投与のための剤形ならびにその製造方法は当業者に周知であり、有効成分を、薬学的に許容される坦体等と混合等することにより、常法に従って製造することができる。
　非経口投与のための剤型は、注射用製剤（例えば、点滴注射剤、静脈注射剤、筋肉注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤）、外用剤（例えば、軟膏剤、パップ剤、ローション剤）、坐剤吸入剤、眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤等が挙げられる。例えば、注射用製剤は、本発明の脂質粒子を注射用蒸留水に溶解して調製し、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、及び安定化剤等を添加することができる。医薬は、用事調製用の凍結乾燥製剤とすることもできる。
　本発明の医薬は、疾患の治療又は予防に有効な他の薬剤を更に含有していてもよい。本発明の医薬は、必要に応じて殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、及びアミノ酸等の成分を配合することもできる。
　本発明の医薬の製剤化に用いる担体には、当該技術分野において通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤、増量剤、湿潤化剤、表面活性化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、無痛化剤等を用いることができる。
　本発明の医薬の投与量は、例えば、投与経路、疾患の種類、症状の程度、患者の年齢、性別、体重、疾患の重篤度、薬物動態および毒物学的特徴等の薬理学的知見、薬物送達系の利用の有無、並びに他の薬物の組合せの一部として投与されるか、など様々な因子を元に、臨床医師により決定することができる。本発明の医薬の投与量は、例えば、一日当たりで、1μg/kg（体重）～10g/kg（体重）程度とすることができる。本発明の医薬の投与スケジュールも、その投与量と同様の要因を勘案して決定することができる。例えば、上記の1日当たりの投与量で、1日～1月に1回投与することできる。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　合成例1．DHSM-DEDA、及び、DHSM-PPZの合成
　(2S,3R)-3-hydroxy-2-stearamidooctadecyl (2-(2’-aminoethylenamine)ethyl) phosphate（DHSM-DEDA：実施例１）、及び、(2S,3R)-3-hydroxy-2-stearamidooctadecyl (2-(piperazino)ethyl) phosphate（DHSM-PPZ：実施例２）を、以下のスキームに従って合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 （実施例１）DHSM-DEDAの合成
　3.00 g（4.1 mmol）のDHSMをクロロホルムに溶解した混合物に5.54 gの2-(2-アミノエチルアミノ)エタノール（53 mmol）を溶解させたpH 5.5の0.5M酢酸緩衝液を加えて、50℃に加熱した。加熱後、ホスホリパーゼ（1,440 U）を加え、16時間撹拌した。DHSMの消費がTLC分析で確認されるまで撹拌した。なお、本明細書において、1ユニットは、至適条件下（温度30℃で、最も化学反応が進む酸性度）で毎分1マイクロモル(μmol)の基質を変化されることができる酵素量（1マイクロモル毎分）と定義される。
　反応混合物をメタノールで希釈し、50℃に加温しながら20％食塩水で洗浄した。有機相を減圧濃縮し、濃縮乾固させた。5.75 gの濃縮物が得られた。得られた反応粗製物のうち3.04 gをクロロホルム：メタノール：水＝60：30：5(vol/vol)55.0 gに溶解させ、16 mLのEtOH/1.25M HClを滴下し、ろ液を氷冷しながら30分間撹拌した。撹拌した後に析出した白色結晶をろ過し、結晶をアセトンで3回懸濁洗浄した。得られた結晶を一晩真空乾燥して、2.15 gの白色結晶を得た。得られた白色結晶全量にクロロホルム：メタノール＝2：1(vol/vol) 21.5 gを添加し、60℃に昇温し溶解させた後、0.2 μmメンブレンろ過した。この後冷却し、室温で1時間撹拌した。撹拌後に析出した白色結晶をろ過し、結晶をクロロホルム：メタノール＝2：1(vol/vol)で懸濁洗浄した。得られた結晶を一晩真空乾燥して、1.25 gの白色結晶を得た（収率79%）NMRチャートを図１に示す。
（実施例２）DHSM-PPZの合成
　2.80 g（3.82 mmol）のDHSMをクロロホルムに溶解させ、その溶液に6.90 gの1-(2-Hydroxyethyl) piperazine（53 mmol）を溶解させたpH 5.5の0.5 M酢酸緩衝液を加えて、50℃に加温した。加温後、ホスホリパーゼ（1,440 U）を加え、40℃で撹拌した。17時間後、TLCにてDHSMの消失を確認した。なお、1ユニットは、至適条件下（温度30℃で、最も化学反応が進む酸性度）で毎分1マイクロモル(μmol)の基質を変化されることができる酵素量（1マイクロモル毎分）と定義される。
　反応混合物をメタノール：1-ブタノール＝4：1で希釈し、45℃に加温しながら20％食塩水で洗浄した。抽出/水洗後、有機相を減圧濃縮し、濃縮乾固させた。2.53 gの濃縮物が得られた。得られた反応粗製物をクロロホルム：メタノール：水＝60：30：5(vol/vol)25.5 mLに溶解させ、0.2 μmメンブレンろ過した後、ろ液を氷冷しながら12.7 mLのEtOH/1.25M HClを滴下し、30分間撹拌した。撹拌後に析出した白色結晶をろ過し、結晶をアセトンで3回懸濁洗浄した。得られた結晶を一晩真空乾燥して、1.90 gの白色結晶を得た（収率65%）。NMRチャートを図２に示す。
（比較例１）DOP-DEDAの合成（dioleoylphosphate - diethylenediamine conjugate）
　DOP-DEDAを以下のスキームに従って合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　1.0 g（1.3 mmol）のDOPCを酢酸エチルに溶解した混合物に1.84 gの2-(2-アミノエチルアミノ)エタノール（17.8 mmol）を溶解させたpH 5.5の0.5M酢酸緩衝液を加えて、40℃へ加熱した。加熱後、ホスホリパーゼ（600 U）を加え、48時間撹拌した。DOPCの消費がTLC分析で確認されるまで撹拌した。
　反応混合物をクロロホルム：メタノール＝6：1で希釈し、1％塩酸、20％食塩水で洗浄した。反応混合物を減圧濃縮し、濃縮乾固させた。0.72 gの濃縮物が得られた。得られた反応粗製物のうち0.36 gをジオキサン4 mLに溶解させ、2 mLのジオキサン/4M HClを滴下し、室温で撹拌した。氷冷した後にアセトンを加え、1時間撹拌した後に析出した白色結晶をアセトンで懸濁洗浄を3回した。得られた結晶を一晩真空乾燥して、0.20 gの白色結晶を得た（収率40%）。NMRチャートを図３に示す。
試験例１．脂質粒子の製造及び各種物性値の測定
＜試験例１－１．脂質粒子の製造＞
　siRNAを1mMクエン酸緩衝液（pH 4.0）に添加して、siRNA酸性水溶液を調製した（25℃、siRNA濃度：301.2 nM）。一方で、脂質をエタノールに添加して、リン脂質のアルコール溶液を調製した（25℃、脂質濃度：2.5 mM）。脂質のモル比は、（１）DHSM-DEDA：DHSM：コレステロール（Chol）＝45：10：45、（２）DHSM-PPZ：DOPC：コレステロール（Chol）＝45：10：60、（３）DOP-DEDA：DPPC：コレステロール（Chol）＝45：10：45であった。リン脂質アルコール溶液に対して4.15倍容量のsiRNA酸性水溶液を使用し（siRNA/脂質モル比＝1/7000）、マイクロ流路（KeyChem-Basic、ワイエムシィ社製）を用いて、脂質粒子を得た。最後にエタノールを透析によって除去した。
＜試験例１－２．各種物性値の測定＞
　脂質粒子をRNase free waterで50倍希釈した後、ゼータサイザーナノZS（Malvern社製）を用いて粒子径と多分散指数（PDI）を測定した。また、脂質粒子を緩衝液（pH=4.0、5.0、6.0、又は7.0）で50倍希釈した後、ζ-Potentialを測定した。
　さらに、次のようにしてsiRNA内包率を測定した。RNA定量試薬（RiboGreen試薬、Thermo Fisher SCIENTIFIC社製）を用いて行った。具体的には次のようにして行った。脂質粒子溶液に対して2％ Triton-X 100又はRNase free waterを添加した。得られた溶液、RNase free water、及びRiboGreen試薬を、96ウェルブラックプレートのウェル中で混合した。プレートを5分間振盪した後、各ウェルの蛍光強度を測定した。測定された蛍光強度に基づいて、次の式：内包率（％）＝（全siRNAの蛍光強度－遊離のsiRNAの蛍光強度）／（全siRNAの蛍光強度）　により、siRNAの脂質粒子中の内包率を算出した。
　結果を表１及び図４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
試験例２．細胞毒性評価試験
＜試験例２－１．脂質粒子の製造＞
　試験例１－１と同様にして脂質粒子を製造した。
＜試験例２－２．毒性評価試験＞
　MDA-MB-231ヒト乳がん細胞を96ウェルプレートに播種（7×103 cells/ウェル）し、37℃で24時間培養した。脂質粒子溶液（siRNA 0.6/2/6 pmolを含む）又は脂質複合体溶液（Lipofectamine（登録商標） 2000（Thermo Fisher Scientific製）を用いて調製した複合体、siRNA 0.6/2/6 pmolを含む）をウェルに滴下し、37℃で96時間培養した。脂質粒子及び脂質複合体の細胞毒性は、Viability/Cytotoxicity Multiplex Assay Kit（同仁化学研究所）を用いて評価した。陽性対照群用のウェルにはLysis buffer 20μLを滴下し、37℃で30分間インキュベートした。各ウェルの上清100μLを96ウェルクリアプレートに移した後、上清にキットのLDH assay reagent液を100μL添加し、室温で30分間インキュベートした。その後Stop solution 50μLを加え、吸光度（absorbance 450nm）を測定した。結果を図５に示す。また、細胞が付着したプレートから培地を除去し、各ウェルにWST-8 assay reagent液（Cell Counting Kit: 培地 = 1:9）を120μL添加した。37℃で5時間インキュベートした後、吸光度（absorbance 450nm）を測定した。結果を図６に示す。
　図５のLDH assayの結果を示す図では、縦軸にNegative controlを1に補正した際の損傷細胞の相対値を示し、カラム下方に脂質1として使用したリン脂質を示す。図５中、「Nega」はNegative controlを示し、脂質粒子を添加していないサンプルである。「Posi」はPositive controlを示し、Lysis bufferを添加したサンプルである。「LFA」は脂質粒子に代えてLipofectamine（登録商標） 2000を使用した脂質複合体を添加したサンプルである。また、サンプル毎に３カラムずつ示されているが、３カラムは評価系中のsiRNA濃度が異なり、左から評価系中のsiRNA濃度3 nM、10 nM、30 nMである。
　図６のWST-8assayの結果を示す図では、縦軸にNegative controlを1に補正した際の生細胞の相対値を示し、カラム下方に脂質1として使用したリン脂質を示す。図６中の「Nega」、「Posi」、「LFA」は上記図５と同じである。また、サンプル毎に３カラムずつ示されているが、図５と同様に、３カラムは評価系中のsiRNA濃度が異なり、左から評価系中のsiRNA濃度3 nM、10 nM、30 nMである。
試験例３．薄層クロマトグラフィー（TLC）試験（反応特異性の検証）
＜試験例３－１．DHSM-DEDAのTLC試験＞
　実施例１において、ホスホリパーゼ（1,440 U）を加えた後の撹拌時間を16時間に変更して、DHSM-DEDAを含有する反応混合物を得た。次いで、反応混合物を体積比でクロロホルム：メタノール＝１：１の溶媒で３倍希釈し、希釈液を調製した。当該希釈液を3μLチャージして、TLC試験を行った。TLCプレートは、MERCK社製Silica gel 60F254を使用した。展開溶媒は、体積比でクロロホルム：メタノール：水＝60：30：5の混合溶媒を用いた。また、発色剤は、硫酸銅、ニンヒドリンを用いた。結果を図７に示す。
　図７において、左側のTLCプレートは発色剤として硫酸銅を用いて発色させたTLCプレートであり、有機化合物が検出される。また、右側のTLCプレートは発色剤としてニンヒドリンを用いて発色させたTLCプレートであり、アミン化合物が検出される。また、図７の各プレートにおいて、ａは原料のDHSM50μg相当量のTLC試験結果を示し、ｂは反応混合物のTLC試験結果を示す。
　図７の結果から、DHSMを基質として用いた場合、右側のTLCプレートのｂにおいてアミン化合物が検出されており、DHSM-DEDAが十分に生成していることが分かる。また、左側のTLCプレートのｂにおいてDHSM-DEDA以外の有機化合物が殆どないことが示されており、不純物の生成が抑制されていることが分かる。以上より、図７から、DHSMを基質として用いた場合、不純物の生成を抑制しながらDHSM-DEDAを生成しており、反応特異性に優れることが分かった。
＜試験例３－２．DOP-DEDAのTLC試験＞
　比較例１において、ホスホリパーゼ（600 U）を加えた後の撹拌時間を20時間に変更して、DOP-DEDAを含有する反応混合物を得た。次いで、反応混合物を体積比でクロロホルム：メタノール＝１：１の溶媒で３倍希釈し、希釈液を調製した。当該希釈液を3μLチャージして、TLC試験を行った。TLCプレートは、MERCK社製Silica gel 60F254を使用した。展開溶媒は、体積比でクロロホルム：メタノール：水＝60：30：5の混合溶媒を用いた。また、発色剤は、硫酸銅、ニンヒドリンを用いた。結果を図８に示す。
　図８において、左側のTLCプレートは発色剤として硫酸銅を用いて発色させたTLCプレートであり、有機化合物が検出される。また、右側のTLCプレートは発色剤としてニンヒドリンを用いて発色させたTLCプレートであり、アミンが検出される。また、図８の各プレートにおいて、ａは原料のDOPC50μg相当量のTLC試験結果を示し、ｂは反応混合物のTLC試験結果を示す。
　図８の結果から、DOPCを基質として用いた場合、右側のTLCプレートのｂにおいてアミン化合物が検出されており、DOP-DEDAが十分に生成していることが分かる。一方、左側のTLCプレートのｂにおいてDOP-DEDA以外の有機化合物も検出されており、不純物の生成が抑制されていないことが分かる。以上より、図８から、DOPCを基質として用いた場合、DOP-DEDAの生成が十分でなく、不純物の生成が抑制されておらず、反応特異性に劣ることが分かった。

Claims (12)

  1. 一般式（1）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、ｍは９～２５の自然数を示し、ｎは１０～１５の自然数を示し、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３は、同一又は異なって、Ｈ又はＯＨを示す。Ｒ１は下記一般式（ｉ）又は（ｉｉ）を示す。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、ｐは１又は２を示し、ｑは１又は２を示し、ｒは１～４の整数を示す。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式中、ｓは１～３の整数を示す。Ｒ２は水素原子又は炭化水素基を示す。）
    で表されるリン脂質。
  2. 　前記ｍは１３～２１の自然数を示し、前記ｎは１１～１２の自然数を示す、請求項１に記載のリン脂質。
  3. 　下記一般式（２）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式中、Ｒ１は前記と同様である。）
    で表される、請求項１に記載のリン脂質。
  4. 　請求項１に記載のリン脂質（リン脂質Ａ）を含有する、脂質粒子。
  5. 　薬物を内包する、請求項４に記載の脂質粒子。
  6. 　前記薬物がポリヌクレオチドである、請求項５に記載の脂質粒子。
  7. 　ステロールを含有する、請求項４に記載の脂質粒子。
  8. 　更に、前記リン脂質Ａ以外のリン脂質（リン脂質Ｂ）を含有する、請求項４に記載の脂質粒子。
  9. 　請求項１に記載のリン脂質を含有する、アルコール溶液。
  10. 　前記アルコール溶液中のアルコールがエタノールである、請求項９に記載のアルコール溶液。
  11. 　請求項９に記載のアルコール溶液と酸性水溶液とを混合する工程を含む、脂質粒子の製造方法。
  12. 請求項４に記載の脂質粒子を含有する、医薬。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010055340A1 (en) * 2008-11-12 2010-05-20 Ludwig Institute For Cancer Research Use of inkt or tlr agonists for protecting against or treating a disease such as acute infection or cancer
WO2021048868A1 (en) * 2019-09-12 2021-03-18 Gundala Venkata Naveen Kumar A drug delivery carrier composition for brain disorders
WO2022054955A1 (ja) * 2020-09-14 2022-03-17 富士フイルム株式会社 脂質組成物

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010055340A1 (en) * 2008-11-12 2010-05-20 Ludwig Institute For Cancer Research Use of inkt or tlr agonists for protecting against or treating a disease such as acute infection or cancer
WO2021048868A1 (en) * 2019-09-12 2021-03-18 Gundala Venkata Naveen Kumar A drug delivery carrier composition for brain disorders
WO2022054955A1 (ja) * 2020-09-14 2022-03-17 富士フイルム株式会社 脂質組成物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE REGISTRY 10 December 2019 (2019-12-10), ANONYMOUS : "3,5-Dioxa-8-aza-4-phosphatetracosan-1-aminium, N-(2-aminoethyl)-4-hydroxy-7-[(1R,2E)-1-hydroxy-2-hexadecen-1-yl]-N,N- dimethyl-9-oxo-, inner salt, 4-oxide, (7S)- (CA INDEX NAME)", XP093013735, retrieved from STN Database accession no. 2389048-38-6 *

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