CN116284006B

CN116284006B - 可电离脂质化合物、包含其的脂质载体及应用

Info

Publication number: CN116284006B
Application number: CN202310518376.0A
Authority: CN
Inventors: 潘兴华; 王成
Original assignee: Beijing Innovic Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Innovic Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2023-05-10
Filing date: 2023-05-10
Publication date: 2023-08-25
Anticipated expiration: 2043-05-10
Also published as: CN116284006A

Abstract

本发明涉及可电离脂质化合物、包含其的脂质载体及应用。本发明提供了一系列式（1）所示的化合物、包含其作为可电离脂质的脂质载体、核酸脂质纳米颗粒组合物及其制剂，由该可电离脂质形成的脂质纳米颗粒能将核酸分子递送至细胞内，特别是眼部细胞内，提高核酸分子的转运率，从而提高核酸药物的治疗效果。

Description

可电离脂质化合物、包含其的脂质载体及应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种可电离脂质化合物及包含其的脂质载体、核酸脂质纳米颗粒组合物和药物制剂。

背景技术

ARPE-19细胞是研究视觉的科学家们常用的细胞模型和工具之一，它们用来研究眼科疾病的发生、疾病的作用机制或具有治疗活性的药物分子，以及破译细胞信号传导事件。视网膜疾病可导致视力受损，严重的视力丧失甚至失明。造成视网膜色素上皮功能障碍和/或光感受器退化的基因突变会导致视力的受损。值得注意的是，遗传性视网膜疾病仍缺乏通过临床批准的基于药理学、细胞或基因的疗法。

ARPE-19细胞是眼部药物研发和药物筛选中使用最广泛的视网膜色素上皮模型，同时也是研究糖尿病视网膜病变（DR, Diabetic Retinopathy）、黄斑水肿（Maculaedema）、年龄相关性黄斑变性（AMD, Age-related Macular Degeneration）和色素性视网膜炎（Retinitis Pigmentosa）等的有用且方便的模型。

脂质纳米颗粒（LNP）被广泛用于药物输送领域，而其中，可电离脂质不但是优良的蛋白/多肽抗原载体，还是一种新型的免疫佐剂，可直接活化抗原呈递细胞，增强疫苗诱导的免疫反应，因此可电离脂质在疫苗领域广泛地用于封装、转运核酸分子。可电离脂质是脂质纳米颗粒产生靶向性和递送性最关键的一环，其与负电荷性的核酸结合，有助于内涵体逃逸、核酸分子体内转染，具有pH敏感性等多种特点。可电离脂质决定了脂质纳米颗粒递送系统的递送效率和转染效率，因此设计靶向性和递送性良好的可电离脂质，是脂质纳米颗粒必不可少的关键要素。

目前，市面上常用的可电离脂质，如DLin-MC3-DMA（以下简称MC3）等，靶向性都较差，大部分都集中在肝靶向。因此开发具有新的靶向性（例如靶向眼部）的可电离脂质是非常有必要的。

发明内容

本发明提供了一系列式（1）所示的化合物、包含其作为可电离脂质的脂质载体、核酸脂质纳米颗粒组合物及其制剂，由该可电离脂质形成的脂质纳米颗粒能将核酸分子递送至细胞内（特别是眼部细胞），提高核酸分子的转运率，从而提高核酸分子的治疗效果。

第一方面，本发明提供了式（1）所示的化合物或其药学上可接受的盐：

（1）

其中，

A为C_2-10亚烷基；

R¹和R²独立地选自-R⁵、-G³-O-C(=O)-R⁵、-G³-C(=O)-O-R⁵、-G³-NH-C(=O)-O-R⁵、-G³-NH-O-C(=O)-R⁵、-G³-NH-C(=O)-R⁵或-G³-O-C(=O)-NH-R⁵；

G³独立地为C_2-10亚烷基；

R⁵独立地选自C_2-30烷基或C_2-30烯基，所述烷基或烯基任选地被一个或多个OH、NH₂、卤素、-O-C_1-30烷基、-C(=O)-O-C_1-30烷基、-O-C(=O)-C_1-30烷基、-O-C_2-30烯基、-C(=O)-O-C_2-30烯基或-O-C(=O)-C_2-30烯基取代。

在一些实施方案中，A为C_2-6亚烷基。

在一些实施方案中，A选自、/>、或/>，优选地，A为/>。

在一些实施方案中，R¹和R²独立地选自R⁵、-G³-O-C(=O)-R⁵、-G³-C(=O)-O-R⁵、-G³-NH-C(=O)-O-R⁵或-G³-O-C(=O)-NH-R⁵。

在一些实施方案中，R¹和R²独立地选自R⁵、-G³-O-C(=O)-R⁵或-G³-C(=O)-O-R⁵。

在一些实施方案中，G³独立地为C_2-8亚烷基；优选地，G³独立地选自、/>、/>或；优选地，G³为/>。

在一些实施方案中，R⁵独立地选自C_2-20烷基或C_2-20烯基，所述烷基或烯基任选地被一个或多个OH、NH₂、卤素、-O-C_1-20烷基、-C(=O)-O-C_1-20烷基、-O-C(=O)-C_1-20烷基、-O-C_2-20烯基、-C(=O)-O-C_2-20烯基或-O-C(=O)-C_2-20烯基取代。

在一些实施方案中，R⁵独立地选自C_2-20烷基或C_2-20烯基，所述烷基或烯基任选地被一个或多个OH、NH₂、卤素、-O-C_1-20烷基、-C(=O)-O-C_1-20烷基或-C(=O)-O-C_2-20烯基取代。

在一些实施方案中，R⁵独立地为C_2-20烷基，所述烷基任选地被一个或多个OH、NH₂或卤素取代。

在一些实施方案中，R⁵独立地选自、、/>、/>、/>、、/>、/>、/>、、/>、或/>。

在一些实施方案中，R⁵独立地选自或。

在一些实施方案中，R¹和R²独立地选自、、/>、、/>、、/>、、/>、、/>、、/>、、/>、、/>、、/>、、/>、或/>。

在一些实施方案中，R¹和R²独立地选自或。

在一些实施方案中，式（1）所示的化合物或其药学上可接受的盐为式（2）所示的化合物或其药学上可接受的盐：

其中，各变量如式（1）中所定义。

在一些实施方案中，式（1）所示的化合物或其药学上可接受的盐为式（3）所示的化合物或其药学上可接受的盐：

其中，各变量如式（1）中所定义。

本发明还提供如下化合物或其药学上可接受的盐：

第二方面，本发明提供了一种脂质载体，其包含式（1）所示的化合物或其药学上可接受的盐作为可电离脂质。

在一些实施方案中，所述脂质载体包含式（1）所示的化合物或其药学上可接受的盐、辅助脂质、结构脂质和聚合物结合的脂质。

在一些实施方案中，所述辅助脂质为选自1,2-二油酰-sn--3-/>DOPE、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱DSPC、二油酰基磷脂酰丝氨酸DOPS、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸DSPS、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺DSPE、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸DPPS、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱DPPC、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱DOPC、二棕榈酰磷酯酰甘油DPPG、油酰磷脂酰胆碱POPC、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺POPE、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺DPPE、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺DMPE、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺DSPE和1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺SOPE中的至少一种。

在一些实施方案中，所述结构脂质为选自胆固醇、非甾醇、谷固醇、麦角固醇、菜油甾醇、豆甾醇、芸苔甾醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚、粪固醇和皮质类固醇中的至少一种。

在一些实施方案中，所述聚合物结合的脂质为选自1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000（DMG-PEG2000）、DMG-PEG2000-甘露糖、胆固醇-PEG2000、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基-聚乙二醇PEG-DMG、二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇PEG-c-DMG、聚乙二醇-二肉豆蔻酰基甘油PEG-C14、PEG-1,2-二肉豆蔻酰基氧基丙基-3-胺PEG-c-DMA、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)]PEG-DSPE、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺PEG-PE、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、吐温-20、吐温-80、1,2-二棕榈基-sn-甘油-甲氧基聚乙二醇PEG-DPG、4-O-(2’，3’-二(十四烷酰氧基)丙基-1-O-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯PEG-s-DMG、PEG-二烷氧基丙基PEG-DAA、mPEG2000-1,2-二-O-烷基-sn3-氨基甲酰基甘油酯PEG-c-DOMG和N-乙酰半乳糖胺((R)-2,3-双(十八烷氧基)丙基-1-(甲氧基聚(乙二醇)2000)丙基氨基甲酸酯))GalNAc-PEG-DSG中的至少一种。

在一些实施方案中，在脂质载体中，可电离脂质、辅助脂质、结构脂质和聚合物结合的脂质的摩尔比为(20~75): (2~25):(15~55):(0~15)；示例性地，可电离脂质、辅助脂质、结构脂质和聚合物结合的脂质的摩尔比可以为45:10:42:3、30:25:30:10、46:15:40:3、50:10:38.5:1.5、50:10:37:3、50:9:38:3、60:5:34.5:0.5、75:5:19.5:0.5、65:5:29.5:0.5、55:8:36.5:0.5、50:8:41.5:0.5等。

第三方面，本发明提供了一种核酸脂质纳米颗粒组合物，其包括式（1）所示的化合物或其药学上可接受的盐或上述脂质载体、以及核酸。

在一些实施方案中，所述核酸为选自DNA、RNA、含有DNA或RNA的复合物（如DNA和RNA的复合物、DNA和多肽/蛋白的复合物、RNA和多肽/蛋白的复合物）、修饰后的DNA、修饰后的RNA以及修饰后的含有DNA或RNA的复合物中的至少一种。

在一些实施方案中，所述RNA选自mRNA、siRNA、dsRNA、rRNA、circRNA、saRNA、tRNA、snRNA或shRNA，优选地为mRNA。

在一些实施方案中，上述核酸与上述任一种化合物或其药学上可接受的盐的质量比为1:(3~40)。

在一些实施方案中，上述核酸与上述脂质载体的质量比为1:(3~40)。

示例性地，上述质量比为1:3、1:5、1:10、1:15、1:20、1:30等。

第四方面，本发明提供了一种药物制剂，其包含上述任一种化合物或其药学上可接受的盐、或上述脂质载体、或上述核酸脂质纳米颗粒组合物，以及药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，药物制剂的粒径为30~500nm，示例性地，粒径可以为30nm、50nm、60nm、80nm、100nm、120nm、150nm、250nm、350nm、500nm等。

在一些实施方案中，核酸在药物制剂中的包封率大于50%。示例性地，包封率可以为55%、60%、65%、70%、75%、79%、80%、85%、89%、90%、93%、95%、97%等。

第五方面，本发明还提供上述化合物或其药学上可接受的盐或上述脂质载体或上述核酸脂质纳米颗粒组合物或上述药物制剂在制备核酸药物或基因疫苗中的用途。

本发明还提供上述化合物或其药学上可接受的盐或上述脂质载体或上述核酸脂质纳米颗粒组合物或上述药物制剂在制备通过眼部递送核酸的药物中的用途。

本发明还提供用于体内递送核酸药物或基因疫苗的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用上述核酸脂质纳米颗粒组合物或上述药物制剂。

本发明还提供通过眼部递送核酸来治疗或预防眼部疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用上述核酸脂质纳米颗粒组合物或上述药物制剂，所述眼部疾病选自糖尿病视网膜病变、黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性和色素性视网膜炎。

在一些实施方案中，上述核酸脂质纳米颗粒组合物或上述药物制剂通过以下施用途径之一施用：口服、眼部、鼻内、静脉内、腹膜内、肌肉内、关节内、病灶内、气管内、皮下以及皮内。在一些实施方案中，上述核酸脂质纳米颗粒组合物或上述药物制剂例如经由肠内或肠胃外施用途径施用。在一些实施方案中，上述核酸脂质纳米颗粒组合物或上述药物制剂例如经由眼部途径施用。在一些实施方案中，将约0.001mg/kg至约10mg/kg剂量的所述核酸脂质纳米颗粒组合物或药物制剂施用给所述受试者。

附图说明

图1：化合物3的核磁共振氢谱图。

图2：化合物4的核磁共振氢谱图。

具体实施方式

为更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

本说明书中，使用“数值A~数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。当数值范围的下限和上限被公开时，落入该范围中的任何数值或任何亚范围都表示被具体公开。特别地，本文中所公开的参数的每一个数值范围(例如，以“约a至b”，或同等的“大约a至b”，或同等的“约a-b”的形式)均应理解为涵盖其中的每一个数值和亚范围。例如，“C_1-4”应理解为涵盖其中的任意亚范围以及每一个点值，如C_2-4、C_3-4、C_1-2、C_1-3、C_1-4等，以及C₁、C₂、C₃、C₄等。

术语“包含”、“包括”、“具有”或“含有”或其任何其它变体旨在涵盖非排他性或开放式的包含内容。例如，包含一系列元素的组合物、方法或装置不一定仅限于已明确列出的元素，而是可能还包含其它未明确列出的元素或上述组合物、方法或装置所固有的元素。

本说明书中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。

本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。

在进一步描述本发明之前，应当理解，本发明不限于本文中所述的特定实施方案；还应该理解，本文中所使用的术语仅用于描述而非限定特定实施方案。

术语“药学上可接受的盐”是指对生物体基本上无毒性的本发明的化合物的盐。药学上可接受的盐通常包括(但不限于)本发明的化合物与药学上可接受的无机/有机酸或无机/有机碱反应而形成的盐，此类盐又被称为酸加成盐或碱加成盐。常见的无机酸包括(但不限于)盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸等，常见的有机酸包括(但不限于)三氟乙酸、柠檬酸、马来酸、富马酸、琥珀酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、草酸、甲酸、乙酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等，常见的无机碱包括(但不限于)氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化钡等，常见的有机碱包括(但不限于)二乙胺、三乙胺、乙胺丁醇等。

术语“药学上可接受的载体”是指与上述核酸脂质纳米颗粒组合物或上述药物制剂一同给药的辅料，并且其在合理的医学判断的范围内适于接触人类和/或其它动物的组织而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或与合理的益处/风险比相应的其它问题或并发症。在本发明中可使用的药学上可接受的载体包括但不限于：a)稀释剂；b)润滑剂；c)粘合剂；d)崩解剂；e)吸收剂、着色剂、调味剂和/或甜味剂；f)乳化剂或分散剂；和/或g)增强化合物的吸收的物质等。

术语“独立地”是指结构中存在的取值范围相同或相近的至少两个基团(或环系)可以在特定情形下具有相同或不同的含义。例如，取代基X和取代基Y各自独立地为氢、卤素、羟基、氰基、烷基或芳基，则当取代基X为氢时，取代基Y既可以为氢，也可以为卤素、羟基、氰基、烷基或芳基；同理，当取代基Y为氢时，取代基X既可以为氢，也可以为卤素、羟基、氰基、烷基或芳基。

术语“烷基”是指直链或支链的一价饱和脂肪族烃基。例如，“C_2-30烷基”指包含2至30个碳原子的直链或支链的一价饱和脂肪族烃基，例如为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基等。

术语“亚烷基”是指直链或支链的二价饱和脂肪族烃基，其所连接的两个基团(或片段)既可以连接同一个碳原子，又可以连接不同的碳原子。例如，本文中所使用的术语“C_2-10亚烷基”是指具有2-10个碳原子的亚烷基(如1,1-亚乙基、1,2-亚乙基、1,2-亚丙基、1,3-亚丁基等)。

术语“烯基”是指由碳原子和氢原子组成的直链或支链的具有至少一个双键的不饱和脂肪族烃基。例如“C_2-30烯基”指包含2至30个碳原子并且具有至少1个碳碳双键的一价直链或支链烃基。烯基的非限制性实例包括但不限于乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、异丁烯基、1,3-丁二烯基等。

为了使本发明的目的和技术方案更加清楚，以下结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

实施例中所使用的试剂或仪器均为可以通过市购获得的常规产品。未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行。本发明中所使用的术语“室温”是指20℃±5℃。在用于修饰某一数值或数值范围时，本发明中所使用的术语“约”是指包括该数值或数值范围以及该数值或数值范围的本领域技术人员可接受的误差范围，例如该误差范围为±10%、±5%、±4%、±3%、±2%、±1%、±0.5%等。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

在下述的实施例中，所用溶剂和药品均为分析纯或化学纯；溶剂在使用前均经过重新蒸馏；无水溶剂均按照标准方法或文献方法进行处理。

本文中所用的缩写具有以下含义：

¹H NMR波谱法采用Bruker超导核磁共振波谱仪(型号AVACE III HD 400 MHz)。

LC/MS采用Aglient 1260 Infinity/Aglient 6120 Quadrupole。

TLC采用硅胶GF 254作为固定相。

柱色谱法一般使用200 ~ 300目硅胶(青岛海洋)作为固定相。

快速柱色谱法使用Biotage快速柱色谱仪。

Prep-HPLC采用Agilent 1260型和Waters 2489型。

在以下实施例中，如无特殊说明，反应的温度为室温(15-30℃)。

实施例1：化合物3和4的合成

原料2的合成

将原料1(10g)溶解于DCM (400 mL)中，加入咪唑(12.67 g)和叔丁基二苯基氯硅烷(TBDPSCl) (25.58 g)，在20℃下搅拌反应16小时，用300 mL水淬灭反应混合物，然后用300 mL (100 mL * 3)EA萃取，合并有机相，用200 mL (200 mL * 1)盐水洗涤，无水Na₂SO₄干燥，减压过滤浓缩得到粗产物。用快速硅胶色谱对粗产物进行纯化，得到的棕色油状物即为原料2 (5.9 g)。

原料4的合成

将原料2 (5.9 g)和原料3 (5.09 g)溶解于DCM (60 mL)中，加入EDCI (3.81 g)和DMAP (404.30 mg)，在15℃下搅拌反应18小时，用50 mL水淬灭反应混合物，之后用100mL (50 mL * 2)DCM萃取，合并有机相，用盐水100 mL (100 mL * 1)洗涤，无水Na₂SO₄干燥，减压过滤浓缩得到粗产物。用快速硅胶色谱对粗产物进行纯化，得到的无色油状物即为原料4 (7.9 g)。

原料5的合成

将原料4 (7.9 g)溶解于THF (80 mL)中，加入TBAF (41.66 g)，在15℃下搅拌反应12小时，TLC(石油醚/乙酸乙酯= 5:1)显示反应物消耗完全，形成一个新的点。用240 mL水淬灭反应混合物，然后用210 mL (70 mL * 3)乙酸乙酯萃取，合并有机相，用盐水150 mL(150 mL * 1)洗涤，无水Na₂SO₄干燥，减压过滤浓缩得到粗产物，经快速硅胶色谱纯化，得到的白色固体即为原料5 (5.4 g)。

原料6的合成

将原料5(4g)溶解于ACN (60 mL)中，加入2-碘苯甲酸(5.03 g)，在25℃下搅拌反应16小时，将反应混合物经减压过滤浓缩得到粗产物，经快速硅胶色谱纯化，得到的白色油状物即为原料6 (2g)。

原料7的合成

向中间体1（5 g，19.50 mmol，1 eq）在DCM（25 mL）中的溶液中加入EDCI（4.49 g，23.40 mmol，1.2 eq）、DMAP（2.38 g，19.50 mmol，1 eq）和中间体2 (3.53 g, 19.50 mmol,2.56 mL, 1 eq)。将混合物在20℃下搅拌16小时。将反应混合物减压浓缩得到残余物。通过快速硅胶色谱纯化残余物，得到原料7，为无色油状物。

原料9的合成

将原料7 (247.25 mg)和原料8 (200 mg)溶解于EtOH (2ml)中，加入TEA (298.22mg)，在80℃下搅拌反应16小时，将反应混合物减压浓缩除去溶剂，残余物用10 mL水稀释，用20 mL (20mL*2)乙酸乙酯萃取，合并有机层，用30mL盐水洗涤，用无水Na₂SO₄干燥，经减压过滤浓缩得到粗产物，经快速硅胶色谱纯化，得到的无色液体即为原料9 (450 mg)。

化合物3的合成

将原料9 (400 mg)、原料6 (754.59 mg)和NaBH(OAc)₃ (451.05 mg)溶解于THF(2 mL)中，在45℃下搅拌反应16小时，用0.5mL水淬灭反应混合物，减压浓缩得到粗产物，用制备级HPLC纯化，得到的棕色油状物即为化合物3。化合物3的核磁共振氢谱图如图1所示。

化合物4的合成

将原料9 (170 mg)和原料6B (111.14 mg)分别置于微波管中，加入EtOH (3 mL)，在140℃下微波加热5小时，LCMS显示原料消耗完全。减压浓缩反应混合物，得到粗产物，用制备级HPLC纯化，得到的无色液体即为化合物4 (16.89 mg, 19.19 μmol，产率6.36%)。化合物4的核磁共振氢谱图如图2所示。

实施例2：核酸脂质纳米颗粒的制备方法及其粒径和mRNA包封率测定

以MC3和本发明的化合物3作为可电离脂质，其他成分包括：DSPC作为辅助脂质，胆固醇作为结构脂质，和DMG-PEG2000作为聚合物结合的脂质，具体比例如表1所示。

将各脂质按照表1中的比例混合配置成8mg/mL的乙醇溶液，将Luc-eGFP mRNA溶解在pH4.0的50 mM柠檬酸溶液中，将乙醇相和水相以1:3的比例迅速混合，同时保证总脂质与mRNA的质量比为20:1。混合后静置1个小时，随后用30倍体积的PBS稀释。

利用马尔文粒度仪测量制备的脂质纳米颗粒的粒径、多分散指数（PDI）。

对于包裹了mRNA的脂质纳米颗粒，可以利用Quant-iT^TM RiboGreen^® RNA试剂盒的检测方法。具体操作如下：利用TE缓冲液（10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5）将样品稀释至10-20倍。向待测样品加入等体积的破乳剂（2% Triton X-100）后再稀释10-20倍。将RiboGreen^®试剂在TE缓冲液中稀释100倍，并将100微升加入96孔板中。在相应的96孔板中加入100微升待测样品。同时利用mRNA标准品制备标准曲线。在酶标仪中读取利用480nm激发光激发的520nm的荧光值。通过标准曲线计算包裹的和游离的mRNA的浓度。

实施例3：核酸脂质纳米颗粒在细胞水平的转染效果

将ARPE-19（人视网膜色素上皮细胞）、293T（人胚肾细胞）、Huh7（人肝癌细胞）和HepG2（人肝癌细胞）培养在DMEM + 10% FBS的培养基中。转染前将细胞铺在24孔板中，每孔1 E+5个活细胞，体积为1毫升，将制备的核酸脂质纳米颗粒以0.26 ug mRNA/1 E+5个细胞的量加入，在37℃、5% CO₂条件下孵育18小时后通过荧光素酶底物检测荧光素酶的表达。

从上述实验数据中可以看到，

由MC3制成的核酸脂质纳米颗粒对HepG2细胞及Huh-7细胞有很强的转染能力，这两种细胞均为肝癌组织细胞，因此，由MC3制成的核酸脂质纳米颗粒对肝癌细胞有很强的靶向能力。

而由本发明的化合物3制成的核酸脂质纳米颗粒对ARPE-19细胞的转染能力明显高于对其他细胞（293T、Huh7和HepG2）的转染能力，并且对ARPE-19细胞的转染能力显著优于由MC3制成的核酸脂质纳米颗粒。因此，本发明的化合物有成为靶向眼部的核酸脂质纳米颗粒的可电离脂质的潜力。

Claims

1.如下化合物或其药学上可接受的盐：

2.一种脂质载体，其包含权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐作为可电离脂质。

3.根据权利要求2所述的脂质载体，其进一步包含辅助脂质、结构脂质和聚合物结合的脂质。

4.一种核酸脂质纳米颗粒组合物，其包括权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐或者权利要求2或3所述的脂质载体、以及核酸。

5.根据权利要求4所述的核酸脂质纳米颗粒组合物，其中，所述核酸为选自DNA、RNA、含有DNA或RNA的复合物、修饰后的DNA、修饰后的RNA以及修饰后的含有DNA或RNA的复合物中的至少一种。

6.一种药物制剂，其包含权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐、权利要求2或3所述的脂质载体或者权利要求4或5所述的核酸脂质纳米颗粒组合物，以及药学上可接受的载体。

7.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐、权利要求2或3所述的脂质载体、权利要求4或5所述的核酸脂质纳米颗粒组合物或者权利要求6所述的药物制剂在制备核酸药物或基因疫苗中的用途。