CN114191561A - 一种可离子化脂质化合物在核酸药物递送系统中的应用 - Google Patents
一种可离子化脂质化合物在核酸药物递送系统中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种可离子化脂质化合物在核酸药物递送系统中的应用。多数现有核酸药物载体存在体内递送效率不高或存在肝脏累积毒副作用等问题，为了解决这些问题，本发明提供了一种新的药物递送系统。本发明的核酸药物递送系统适合多种给药方式，其肝脏毒副作用小而且核酸递送效率高，甚至可以高特异性地将核酸药物分子高效送至脾脏中并有效翻译成目标分子。
Description
技术领域
本发明属于核酸药物递送技术领域，具体涉及一种可离子化脂质化合物在核酸药物递送系统中的应用。
背景技术
核酸药物的活性分子包括信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、反义寡核苷酸(ASO)或质粒DNA(pDNA)，在疫苗以及体外或体内的基因治疗中具有很大应用潜力。如何将核酸药物分子成功递送至体内细胞并高效表达，实现预防或治疗目的是目前急需的技术之一。多数现有核酸药物载体存在进入体内之后容易累积在肝脏部位，增加肝脏的代谢负担，引起明显的毒副作用的问题。又或存在由于递送系统的递送效率不高易于导致用药剂量增大引起毒副作用的现象。因此，开发毒副作用小且核酸递送效率高的递送系统具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种可离子化脂质化合物在核酸药物递送系统中的应用，所述的核酸药物递送系统能够将核酸药物分子高效递送至体内并能够实现核酸高效表达，同时在肝脏中核酸表达量较低，从而能够降低毒性。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种可离子化脂质化合物在核酸药物递送系统中的应用，所述的核酸药物递送系统为能够将核酸药物分子递送至脾脏和/或肺脏的核酸药物递送系统，所述的可离子化脂质化合物为通式(Ⅰ)、通式(Ⅱ)、通式(Ⅲ)所示的化合物中的一种或多种：
其中，
R为-OC(＝O)-或-C(＝O)O-。
本发明中，R的结构以其所在链的靠近N的一端向另一端的方向进行限定的，即当R为-OC(＝O)-，靠近N的是酯基中的O，当R为-C(＝O)O-时，靠近N的是酯基中的C。
R1为氢、甲基、乙基或异丙基。
m为1～10之间的整数，例如m为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
n为1～3之间的整数，例如n为1、2或3。
f为1～5之间的整数，例如f为1、2、3、4或5。
x为1～8之间的整数，例如x为1、2、3、4、5、6、7或8。
y为1～9之间的整数，例如y为1、2、3、4、5、6、7、8或9。
R2和R3独立地为氢、甲基、乙基或异丙基。
p为1～5之间的整数，例如p为1、2、3、4或5。
q为1～3之间的整数，例如q为1、2或3。
优选地，所述的R为-C(＝O)O-。
优选地，所述的R1为氢。
优选地，所述的R2和所述的R3中一个为氢，另一个为甲基、乙基或异丙基。
进一步优选地，所述的R2和所述的R3中一个为氢，另一个为甲基。
优选地，所述的m为3～8之间的整数，进一步优选为4～6之间的整数。
优选地，所述的f为1～4之间的整数，进一步优选为2或3。
优选地，所述的x为2～5之间的整数，进一步优选为2～4之间的整数。
优选地，所述的y为3～9之间的整数，进一步优选为5～9之间的整数。
优选地，所述的R为-C(＝O)O-，所述的R1为氢，所述的n为2，所述的R2和所述的R3中一个为氢，另一个为甲基，所述的p为5。
根据一些实施例，通式(I)中，R1为氢，m为4～6之间的整数，n为2，f为1～3之间的整数。
根据一些实施例，通式(Ⅱ)中，x为3，y为6～9之间的整数。
根据一些实施例，通式(Ⅲ)中，R2为甲基，R3为氢，p为5，q为1～3之间的整数。
根据一些具有且优选地实施方式，所述的可离子化脂质化合物为如下结构式所示化合物中的一种或多种：
优选地，所述的核酸药物分子为mRNA、siRNA、ASO或pDNA(质粒DNA)中的一种或多种。
进一步优选地，所述的核酸药物分子和所述的核酸药物递送系统的质量比为1:(5～50)，进一步优选为1:(5～40)，再进一步优选为1:(5～30)，更进一步优选为1:(5～20)。
进一步优选地，所述的递送系统与所递送的核酸药物形成纳米脂质颗粒，所述的纳米脂质颗粒的平均尺寸为50nm～200nm。
更为优选地，所述的纳米脂质颗粒的多分散指数≤0.4。
进一步地，所述的纳米脂质颗粒的平均尺寸为50nm～150nm。
进一步地，所述的纳米脂质颗粒的多分散指数≤0.3。
优选地，所述的可离子化脂质化合物可选择性地带有靶向物质修饰，所述的靶向物质为叶酸、单链抗体或靶向多肽中的一种或多种。
优选地，所述的核酸药物递送系统还包括选择性地带有靶向物质修饰的辅助性分子，所述的可离子化脂质化合物和所述的辅助性分子的投料摩尔比为(0.1～1)：(0.1～1)，进一步优选为(0.5～1)：(0.5～1)。
所述的辅助性分子包括本领域中常用的辅助脂质或类脂分子。
优选地，所述的辅助性分子包括但不限于胆固醇、卡泊三醇、豆甾醇、β-谷甾醇、白桦脂醇、羽扇豆醇、熊果酸、齐墩果酸、二油酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰基-2-油酰基卵磷脂、二油酰磷脂酰乙醇胺、(1,2-二油氧基丙基)三甲基氯化铵、双十烷基二甲基溴化铵、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇5000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000中的一种或多种。
优选地，所述的靶向物质为叶酸、单链抗体或靶向多肽中的一种或多种。
本发明中，可使用本领域中常规的方法进行靶向物质修饰可离子化脂质化合物或辅助性分子。
根据一些实施方式，可将Mal-PEG2000-DSPE与多肽溶于超纯水中，搅拌反应48h，透析浓缩得到多肽-PEG2000-DSPE，即可得到具有靶向性的辅助性分子。
进一步地，将可电离脂质分子：胆固醇：DOPE：多肽-PEG2000-DSPE溶解于无水乙醇中，与DNA或RNA混合形成多肽修饰的脂质体。
优选地，所述的核酸药物递送系统为注射剂。
优选地，所述的核酸药物递送系统还包括添加剂，所述的添加剂为包括稳定剂和/或稀释剂。
优选地，所述的添加剂的添加量为所述的注射剂的总质量的1％～20％。
所述的添加剂可以是本领域中常用的添加剂。
优选地，所述的稳定剂包括但不限于蔗糖或海藻糖。
优选地，所述的稀释剂包括但不限于本领域中常用的缓冲液，包括但不限于磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、tris盐酸盐缓冲液中的一种或多种。
优选地，所述的核酸药物递送系统通过局部肌肉、皮下、内皮、瘤内注射或灌注方式给药，或通过静脉注射方式给药。
本发明的核酸药物递送系统可通过局部肌肉、皮下、内皮、瘤内以及灌注等多种给药方式，还可通过静脉注射等全身给药方式，将mRNA、siRNA或pDNA等核酸药物分子递送到体内，甚至可以靶向脾脏/肺脏，在体内细胞中有效表达治疗性蛋白药物或抗原，起到预防或治疗疾病的作用。本发明的核酸药物递送系统可明显降低脂质体的肝脏累积作用，通过选择适宜的给药方式，可以高效地将核酸送至脾脏或肺脏中并有效翻译成目标分子，因此本发明的核酸药物递送系统的潜力在于适合于递送核酸药物进入体内行使预防性或治疗性疫苗的功能。
本发明与现有技术相比具有如下优势：
本发明的核酸药物递送系统，可以高效地将核酸药物分子递送至脾脏和/或肺脏中并有效翻译成目标分子，同时可降低脂质体在肝脏累积副作用，对核酸药物的发展和应用具有重要的意义。
附图说明
图1为化合物1-1的氢谱图；
图2为2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙-1-醇)的氢谱图；
图3为化合物1的氢谱图；
图4为化合物1的质谱图；
图5为化合物2-1的氢谱图；
图6为化合物2的氢谱图；
图7为化合物2的质谱图；
图8为化合物3-1的氢谱图；
图9为1,3-二氨基-2-丙醇的氢谱图；
图10为化合物3的氢谱图；
图11为化合物3的质谱图；
图12为实施例4中的Lipid-1、Lipid-2及Lipid-3的粒径分布图；
图13为小鼠肌肉注射Lipid-1后不同时间点的荧光表达情况；
图14为小鼠通过静脉注射和肌肉注射Lipid-1 6h后各器官的荧光表达情况；
图15为小鼠肌肉注射Lipid-2后不同时间点的荧光表达情况；
图16为小鼠通过静脉注射和肌肉注射Lipid-2 6h后各器官的荧光表达情况；
图17为小鼠肌肉注射Lipid-3后不同时间点的荧光表达情况；
图18为小鼠通过静脉注射和肌肉注射Lipid-3 6h后各器官的荧光表达情况；
图19为小鼠通过静脉注射Lipid-1、Lipid-2、Lipid-3 6h后的体内荧光表达情况与SM-102进行对照。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
为了能够将核酸药物分子有效包装及递送外源核酸药物靶向进入体内特定的器官、组织并高效表达，发明人对核酸药物递送系统的主要脂质化合物进行了大量的研究，最终发明一种新型核酸药物递送系统，其能够将核酸药物分子递送至特定器官或组织并能够实现核酸高效表达。与该领域内常用的MC3系统相比，目标核酸药物分子的表达水平相近或更高，同时肝脏累积程度明显降低。
根据本发明，所述的药物递送系统能够将核酸药物分子递送至脾脏和/或肺脏，且在肝脏中的积累量较低，所述的药物递送系统包括可离子化脂质化合物，所述的可离子化脂质化合物为通式(Ⅰ)、通式(Ⅱ)、通式(Ⅲ)所示的化合物中的一种或多种：
其中，
R为-OC(＝O)-或-C(＝O)O-；R1为氢、甲基、乙基或异丙基；m为1～10之间的整数；n为1～3之间的整数；f为1～5之间的整数；x为1～8之间的整数；y为1～9之间的整数；R2和R3独立地为氢、甲基、乙基或异丙基；p为1～5之间的整数；q为1～3之间的整数。
本发明中，所述的核酸药物递送系统为纳米脂质颗粒。
体内实验显示，通过局部肌肉、皮下、内皮、瘤内以及灌注等多种给药方式，或通过全身给药，都可以将mRNA、siRNA或pDNA核酸分子大部分递送到脾脏或肺脏，而其在肝脏的分布比例明显降低。本发明的核酸药物递送系统的优势在于，即使不连接靶向基团也可以选择性靶向脾脏和/或肺脏，而在肝脏中只有少量分布或只有可忽略的分布，从而具有较低的肝脏毒性。这是本发明的核酸药物递送系统相比现有多数核酸药物递送系统的最显著的特点，是在其具备一般递送载体的可避免所载核酸药物分子(尤其是mRNA和siRNA)在体内被核酸酶降解这一属性之外的优势属性。
下面根据一些具体实施例，进一步说明本发明的技术方案和有益效果。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂厂商购买得到的。
以下实施例中，Lipid-1仅是指使用实施例1制备的化合物1作为可电离脂质化合物与其他组分形成的纳米脂质颗粒，Lipid-2仅是指使用实施例2制备的化合物2作为可电离脂质化合物与其他组分形成的纳米脂质颗粒，Lipid-3仅是指使用实施例3制备的化合物3作为可电离脂质化合物与其他组分形成的纳米脂质颗粒，对其包封的mRNA没有限制。
SM102作为对照，使用现有脂质体SM-102包封mRNA形成的纳米脂质颗粒。
Lipo2000作为对照，使用现有脂质体Lipo2000包封带有绿色荧光GPF标签的质粒形成的纳米脂质颗粒。
实施例1
化合物1的合成路线：
步骤1：化合物1-1的合成：
将亚麻醇(0.267g，1mmol)和三乙胺(0.133g，1.3mmol)加入反应瓶中冰水浴，加入二氯甲烷(6mL)，将丙烯酰氯(0.11g，1.2mmol)溶于二氯甲烷(2.2mL)，缓慢滴加入反应瓶中，反应持续10分钟，该反应保持在10℃以下，最后冰浴移除，反应液在室温条件下反应2小时。用饱和食盐水洗涤，得到粗产物，将粗产品通过色谱法(硅胶柱，洗脱剂为含有0.5％EA(体积百分比)的石油醚)纯化，并将纯产物蒸发，得到浅黄色油状化合物1-1(2-烯丙酸(9Z，12Z)-十八碳二烯酯)(0.173g，收率：50％)化合物1-1的氢谱见图1。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:6.41(dd,J＝17.3,1.5Hz,1H),6.13(dd,J＝17.3,10.4Hz,1H),5.82(dd,J＝10.4,1.5Hz,1H),5.47-5.26(m,4H),4.16(t,J＝6.7Hz,2H),2.78(t,J＝6.5Hz,2H),2.06(dd,J＝13.6,6.7Hz,4H),1.75-1.60(m,2H),1.39-1.17(m,16H),0.88(dt,J＝10.4,5.3Hz,3H).
步骤2：化合物1的合成：
将2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙-1-醇)(0.0735g，0.50mmol，氢谱见图2)和2-烯丙酸(9Z，12Z)-十八碳二烯酯(0.64g，2mmol)加入反应瓶中，在80℃下反应48小时。反应冷却至室温后，真空除去溶剂，得到粗产品，将粗产品通过色谱法(硅胶柱，洗脱剂为含有0.5％甲醇(体积百分比)二氯甲烷纯化，并将纯产物蒸发，得到黄色油状化合物1(25.7mg，收率：3.6％)。化合物的氢谱见图3，质谱见图4。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.45-5.30(m,16H),4.07(t,J＝6.8Hz,8H),3.52(s,1H),2.80(dd,J＝12.5,6.4Hz,16H),2.63(s,4H),2.54(s,3H),2.48(t,J＝7.2Hz,8H),2.07(q,J＝6.7Hz,16H),1.62(dd,J＝13.4,6.6Hz,8H),1.42-1.25(m,68H),0.91(t,J＝6.8Hz,12H),0.91(t,J＝6.8Hz,1H)。
实施例2
化合物2的合成路线
步骤1：化合物2-1的合成
将6-溴己酸(1.0g，5.13mmol)和十一醇(1.77g，10.25mmol)溶于二氯甲烷中(60mL)，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC盐酸盐，0.98g，5.13mmol)和DMAP(0.125g，1.03mmol)。混合物在常温条件下搅拌18小时。反应结束后，用DCM(200mL)稀释，并用饱和的NaHCO3(100mL)和盐水(100mL)洗涤。合并有机层用无水Na2SO4干燥，真空除去溶剂，得到粗产品，将粗产品通过色谱法(硅胶柱，洗脱剂为含有0.5％EA(体积百分比)的石油醚)纯化，并将纯产物蒸发，得到浅黄色油状化合物2-1(6-溴己酸十一酯)(0.69g，收率38.6％)。化合物2-1的氢谱见图5。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.10(t,J＝6.6Hz,2H),3.45(t,J＝6.7Hz,2H),2.36(t,J＝7.3Hz,2H),1.97-1.88(m,2H),1.68(tt,J＝14.5,7.3Hz,4H),1.53(dd,J＝15.1,7.9Hz,2H),1.33(d,J＝16.9Hz,16H),0.92(t,J＝6.5Hz,3H).
步骤2：化合物2的合成
将2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙-1-醇)(0.044g，0.30mmol)和6-溴己酸十一酯(0.417g，1.20mmol)溶于THF/CH3CN(1:1，6mL)，之后再加入DIPEA(0.155g，1.20mmol)。反应物在63℃条件下搅拌72h，反应冷却至室温后，真空除去溶剂。粗产品用乙酸乙酯和饱和的NaHCO3萃取，合并有机层用无水Na2SO4干燥，真空除去溶剂，得到粗产品，将粗产品通过色谱法(硅胶柱，洗脱剂为含有1-2％甲醇(体积百分比)二氯甲烷)纯化，并将纯产物蒸发，得到黄色油状化合物2(14.64mg，收率4％)。化合物2的氢谱见图6，质谱见图7。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.10-3.98(m,8H),3.63(d,J＝16.5Hz,2H),3.46(s,1H),3.22(d,J＝45.3Hz,3H),3.05(d,J＝4.0Hz,2H),3.01-2.73(m,9H),2.66(d,J＝14.3Hz,2H),2.33(dd,J＝16.6,7.4Hz,8H),1.98(s,2H),1.78(s,2H),1.64(dt,J＝23.5,7.0Hz,20H),1.41-1.20(m,74H),0.88(t,J＝6.7Hz,12H)。
实施例3
化合物3的合成路线
步骤1：化合物3-1的合成
将8-溴辛酸(1.139g，5.13mmol)和3,7-二甲基辛-6-烯-1-醇(香茅醇，1.599g，10.25mmol)溶于二氯甲烷(60mL)，充分溶解后，加入EDC盐酸盐(0.98g，5.13mmol)和DMAP(0.125g，1.03mmol)。混合物在常温条件下搅拌18小时。反应结束后，用DCM(200mL)稀释，并用饱和的NaHCO3(100mL)和盐水(100mL)洗涤。合并有机层用无水Na2SO4干燥，真空除去溶剂，得到粗产品,将粗产品通过色谱法(硅胶柱，洗脱剂为含有0.5％EA(体积百分比)的石油醚)纯化，并将纯产物蒸发，得到浅黄色油状化合物3-1(6-溴己酸3,7-二甲基辛-6-烯酯)(0.648g，35％)化合物3-1的氢谱见图8。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:5.09(s,1H),4.18-4.01(m,2H),3.40(t,J＝6.8Hz,2H),2.29(t,J＝7.4Hz,2H),1.98(s,2H),1.84(dd,J＝14.3,7.0Hz,2H),1.70-1.60(m,9H),1.38(d,J＝37.7Hz,9H),0.89(t,J＝12.9Hz,4H).
步骤2：化合物3的合成
将1,3-二氨基-2-丙醇(0.027g，0.30mmol，氢谱见图9)和6-溴己酸3,7-二甲基辛-6-烯酯(0.398g，1.2mmol)加入反应瓶中溶于THF/CH3CN(1:1，6mL)，之后再加入DIPEA(0.155g，1.20mmol)。反应物在63℃条件下搅拌72h，反应冷却至室温后，真空除去溶剂。粗产品用乙酸乙酯和饱和的NaHCO3萃取，合并有机层用无水Na2SO4干燥，真空除去溶剂，得到粗产品，将粗产品通过色谱法将粗产品通过色谱法(硅胶柱，洗脱剂为含有1％甲醇(体积百分比)二氯甲烷)纯化，并将纯产物蒸发，得到浅黄色油状化合物3(11.63mg，收率3.2％)。化合物3的氢谱见图10，质谱见图11。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.30(s,1H),5.08(t,J＝6.4Hz,4H),4.10(h,J＝10.9Hz,8H),3.67(s,1H),2.46(s,10H),2.28(t,J＝7.3Hz,8H),1.97(d,J＝9.2Hz,8H),1.74-1.51(m,41H),1.49-1.37(m,12H),1.37-1.16(m,33H),0.91(d,J＝5.9Hz,12H)。
实施例4：LNP-mRNA纳米脂质颗粒的制备、粒径及电位的测定：
使用无水乙醇作为溶剂，将实施例1至3中制备的化合物1、化合物2以及化合物3分别与DSPC、DMG-PEG2000及胆固醇按照摩尔比为50:10:1.5:38.5溶解混合得到脂质体原料溶液，控制各组分浓度之和为50mM，完全溶解混匀后放置-20℃保存。
将mRNA溶解在pH为5.2左右的25mM的醋酸钠缓冲液中，制得终浓度约为0.1mg/mL的核酸制剂。
将上述配制的脂质体原料溶液和核酸制剂以两相体积比约为4:1，两相溶液总速率为12mL/min条件下，通过Nano Assemblr微流控系统，也可通过涡旋的方法快速地将两相溶液混匀，形成均一稳定的纳米脂质体颗粒，然后快速地将纳米脂质体颗粒环境从pH为5.2转变成7.0～7.4。具体操作为，用pH为7.2的PBS缓冲液或pH为7.4的醋酸钠缓冲液将其稀释20倍体积后，利用10KD的超滤管进行浓缩，离心机的转速不bj要超过超滤管的最高转速限制，经过2～3次换液之后，纳米脂质体颗粒的溶液环境的pH在7.2～7.4左右，将其浓缩至终浓度为200mM左右，放置在4℃环境下备用，分别标记为Lipid-1、Lipid-2及Lipid-3。
利用Zetasizer Nano ZS(Malvern,Worcestershire,UK)检测纳米脂质体颗粒的粒径，PDI。粒径的测量通过将纳米脂质体颗粒溶液用1×PBS稀释50倍之后测量，Zeta电位的测定是通过将纳米脂质体颗粒稀释到15mM的PBS中进行测定，包封率的测定利用Quant-It RiboGreenRNA定量检测试剂盒在Modulus微孔型多功能检测仪上进行。粒径、PDI、包封率及电位的检测结果如表1和图12所示。
表1.代表性LNP-mRNA纳米脂质颗粒的物理参数
结果显示，Lipid-1、Lipid-2和Lipid-3的平均粒径在100-150nm，粒径分布均匀，包封效率均在90％以上，电位为-20.8mV～-10.2mV。
实施例5：纳米脂质颗粒动物体内转染实验：
采用纳米脂质颗粒肌肉注射方式，按照实施例4的制备方法制备纳米脂质颗粒，其中mRNA为表达Luciferase荧光蛋白的mRNA，mRNA的用量为60μg，可电离化脂质体化合物、DSPC、DMG-PEG2000及胆固醇的总量为600μg，采用200μL的中性PBS缓冲液快速转换脂质体环境，并迅速注射到6-8周雌性Babl/c小鼠的后肢内侧肌肉中，控制左右后肢分别注射30μgmRNA，或通过静脉注射到6-8周雌性Babl/c小鼠，控制静脉注射50μg mRNA。
小鼠腿部肌肉注射Lipid-1、Lipid-2、Lipid-3后不同时间点mRNA在小鼠体内4h、24h、48h及72h时的荧光表达情况，并对圈内部的荧光强度进行积分并得到荧光强度数值，用于定量表征荧光素酶的表达量并绘制柱形图。图中的荧光强度与脂质体的递送效率密切相关，荧光越强，代表脂质体的递送效率越高。
小鼠肌肉注射Lipid-1后不同时间点的荧光表达情况见图13。Lipid-1通过肌肉注射到小鼠的腿部之后，4h之后的平均荧光表达量为3.5×107，与该领域内的参照标准MC3以及Moderna公司的SM-102相比，Lipid-1在肝脏部位的荧光量明显降低，因此肝脏需要承受的代谢负担较低。而且荧光表达能够持续72h，说明脂质体对mRNA的保护效果好。
小鼠通过静脉注射和肌肉注射Lipid-1 6h后各器官的荧光表达情况见图14。结果显示，在静脉注射(IV)Lipid-1的脂质体后，小鼠各个器官中的荧光表达量分别约为脾脏56％，肝脏34％，肺部10％；肌肉注射(IM)后，小鼠各个器官中的荧光表达量分别约为脾脏60％，肝脏30％，肺部10％。
小鼠肌肉注射Lipid-2后不同时间点的荧光表达情况见图15。Lipid-2通过肌肉注射到小鼠的腿部之后，4h之后的平均荧光表达量为4.0×107，并且24h后肌肉组织的荧光表达量仍然高达1.0×106。与MC3及SM102相比，荧光在肝脏部位的分布显著降低。
小鼠通过静脉注射Lipid-2 6h后各器官的荧光表达情况见图16。结果显示，在静脉注射(IV)Lipid-2的脂质体后，小鼠各个器官中的荧光表达量分别约为肝脏92％，脾脏8％。
小鼠肌肉注射Lipid-3后不同时间点的荧光表达情况见图17。Lipid-3通过肌肉注射到小鼠的腿部之后，4h之后的平均荧光表达量为1.0×106，并且持续48h之后荧光表达仍然能够大致保持在这一水平。与MC3及SM102相比，荧光在肝脏部位的分布显著降低。
小鼠通过静脉注射Lipid-3 6h后各器官的荧光表达情况见图18。结果显示，在静脉注射(IV)Lipid-3脂质体后，小鼠各个器官中的荧光表达量分别约为脾脏88％，肝脏12％，而采用肌肉注射后，脾脏中荧光表达量数值相对静脉注射低一点。
将含有Lipid-1、Lipid-2、Lipid-3以及SM102分别通过尾静脉注射到小鼠体内，6h后各小鼠体内都出现了明显的荧光分布，见图19，从荧光分布可以看出，SM-102和lipid-2脂质体的荧光主要分布在肝脏部位，Lipid-1和Lipid-3脂质体的荧光主要分布在脾脏部位，这与小鼠解剖的器官的荧光分布一致。Lipid-1和Lipid-3脂质体具有明显的脾脏部位靶向的作用，适合肌肉注射局部给药或静脉注射全身给药，肝脏毒性较低，而Lipid-2更适合肌肉注射给药方式。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种可离子化脂质化合物在核酸药物递送系统中的应用，其特征在于：所述的核酸药物递送系统为能够将核酸药物分子递送至脾脏和/或肺脏的核酸药物递送系统，所述的可离子化脂质化合物为通式(Ⅰ)、通式(Ⅱ)、通式(Ⅲ)所示的化合物中的一种或多种：
其中，
R为-OC(＝O)-或-C(＝O)O-；
R1为氢、甲基、乙基或异丙基；
m为1～10之间的整数；
n为1～3之间的整数；
f为1～5之间的整数；
x为1～8之间的整数；
y为1～9之间的整数；
R2和R3独立地为氢、甲基、乙基或异丙基；
p为1～5之间的整数；
q为1～3之间的整数。
2.根据权利要求1所述的核酸药物递送系统，其特征在于，所述的R为-C(＝O)O-；
和/或，所述的R1为氢；
和/或，所述的R2和所述的R3中一个为氢，另一个为甲基、乙基或异丙基；
和/或，所述的m为3～8之间的整数；
和/或，所述的f为1～4之间的整数；
和/或，所述的x为2～5之间的整数；
和/或，所述的y为3～9之间的整数。
3.根据权利要求1所述的核酸药物递送系统，其特征在于，所述的可离子化脂质化合物为如下结构式所示化合物中的一种或多种：
4.根据权利要求1所述的核酸药物递送系统，其特征在于，所述的核酸药物分子为mRNA、siRNA、ASO或pDNA中的一种或多种；
和/或，所述的核酸药物分子和所述的核酸药物递送系统的质量比为1:(5～50)。
5.根据权利要求1所述的核酸药物递送系统，其特征在于，所述的核酸药物递送系统为纳米脂质颗粒，所述的纳米脂质颗粒的平均尺寸为50nm～200nm。
6.根据权利要求1所述的核酸药物递送系统，其特征在于，所述的可离子化脂质化合物可选择性地带有靶向物质修饰，所述的靶向物质为叶酸、单链抗体或靶向多肽中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的核酸药物递送系统，其特征在于，所述的核酸药物递送系统还包括选择性地带有靶向物质修饰的辅助性分子，所述的可离子化脂质化合物和所述的辅助性分子的投料摩尔比为(0.1～1)：(0.1～1)；所述的辅助性分子包括胆固醇、卡泊三醇、豆甾醇、β-谷甾醇、白桦脂醇、羽扇豆醇、熊果酸、齐墩果酸、二油酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰基-2-油酰基卵磷脂、二油酰磷脂酰乙醇胺、(1,2-二油氧基丙基)三甲基氯化铵、双十烷基二甲基溴化铵、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇5000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000中的一种或多种；所述的靶向物质为叶酸、单链抗体或靶向多肽中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的核酸药物递送系统，其特征在于，所述的核酸药物递送系统为注射剂，所述的核酸药物递送系统还包括添加剂，所述的添加剂为包括稳定剂和/或稀释剂，所述的添加剂的添加量为所述的注射剂的总质量的1％～20％。
9.根据权利要求8所述的核酸药物递送系统，其特征在于，所述的稳定剂包括蔗糖或海藻糖；所述的稀释剂包括磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐、tris盐酸盐缓冲液中的一种或多种。
10.根据权利要求1或8所述的核酸药物递送系统，其特征在于，所述的核酸药物递送系统通过局部肌肉、皮下、内皮、瘤内注射或灌注方式给药，或通过静脉注射方式给药。
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