CN114716355A - 一种脂质化合物、包含其的组合物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体公开了一种脂质化合物、包含其的组合物及应用。该脂质化合物具有式(I)或式(II)所示的结构。该脂质化合物在酸性条件下可电离成阳离子化合物，与带负电的药物活性成分通过静电相互作用结合，从而组装成载药脂质纳米颗粒，进行药物活性成分的递送。本发明所提供的脂质化合物结构简单，反应路径简单，产率高，构建得到的载药脂质纳米颗粒可用于制备核酸药物、基因疫苗、多肽或蛋白质药物、小分子药物，具备广泛的应用前景。
Figure DDA0003580637440000011

Description

一种脂质化合物、包含其的组合物及应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种脂质化合物、包含其的组合物及应用。
背景技术
基因治疗是指将一类核酸药物如小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)，信使RNA(Message RNA，mRNA)，质粒DNA(plasmid DNA，pDNA)等一些具有治疗目的的外源基因通过载体材料递送到靶细胞中从而发挥治疗效果。几十年来基因治疗已经在临床治疗上取得了较好的效果，可以有效的治疗先天和后天的疾病，如，癌症、自身免疫性疾病、传染病、心脏病等。事实上，基因治疗并不难理解，即替换补偿异常基因。但是基因治疗也面临着许多亟需解决的难题，其中核酸药物如何借助载体进入人体特定细胞发挥作用是基因治疗的关键环节。因此，开发一种高效安全的核酸递送系统是基因治疗的基石。
目前运用最广泛的核酸递送系统主要是病毒载体和非病毒载体，其中病毒载体转染效率相对较高，但是存在安全性、靶向性差等问题。近年来，非病毒载体发展迅速，其中脂质体具有免疫原性低、生物相容性好，转染效率高等优势而被看作理想的核酸递送系统。尤其是，可电离阳离子脂质具有pH依赖性电荷可变特性，安全性较高，但其转染效率有待提高。
发明内容
本发明旨在解决上述现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提出一种脂质化合物、包含其的组合物及应用。该脂质化合物可单独使用或与其它脂质化合物，如胆固醇、辅助磷脂、聚乙二醇修饰脂质组合使用，用于高效地将药物活性成分递送至细胞或者组织，发挥特定的生物功能，如递送siRNA至体内细胞发挥基因沉默作用或者递送pDNA至细胞促进基因表达。另外，该脂质化合物的反应路径简单，产率高，因此，具有广泛的应用前景。
本发明的第一方面，提供一种脂质化合物，或其药学上可接受的盐或其立体异构体，所述脂质化合物具有式(1)所示的结构
Figure BDA0003580637420000021
Figure BDA0003580637420000022
优选的，所述R2选自如下所示的结构：
Figure BDA0003580637420000023
n选自0-3的整数，优选1或2；
或，所述脂质化合物具有式(II)所示的结构；
Figure BDA0003580637420000024
y选自1或2；其中，
当y选自1时，R3选自
Figure BDA0003580637420000025
其中，R5选自羟基、未取代或甲基取代的四氢吡咯基、哌啶基、哌嗪基、二甲氨基、二羟甲基氨基、二乙氨基、二羟乙基氨基；优选羟基、未取代或甲基取代的四氢吡咯基、哌啶基、哌嗪基；
当y选自2时，R3选自
Figure BDA0003580637420000031
其中X选自
Figure BDA0003580637420000032
亚甲基、氧原子、或者X与式(II)中的任意一个N相连形成五元杂环或六元杂环；或R3与式(II)中的两个N一起形成五元杂环或六元杂环；
优选的，所述X选自
Figure BDA0003580637420000033
亚甲基；
每个p各自独立的选自0或1，且，
式(II)中至多存在一个p为0，且，
当p均为1时，R4选自C7-C17直链烷基或直链烯基；
或，当其中一个p为0、其余p均为1时，与N原子直接相连的R4选自氢，其余R4独立选自C7-C17直链烷基或直链烯基；
优选的，R4选自如下所示的结构：
Figure BDA0003580637420000034
在本发明的一些实施方式中，
R2选自如下所示的结构：
Figure BDA0003580637420000035
n选自1或2；
y选自1或2；其中，
当y选自1时，R3选自
Figure BDA0003580637420000036
其中，R5选自羟基、未取代或甲基取代的四氢吡咯基；
当y选自2时，R3选自
Figure BDA0003580637420000037
其中X选自
Figure BDA0003580637420000038
每个p各自独立的选自0或1，且，
式(II)中至多存在一个p为0，且，
当p均为1时，R4选自C7-C17直链烷基或直链烯基；
或，当其中一个p为0、其余p均为1时，与N原子直接相连的R4选自氢，其余R4独立选自C7-C17直链烷基或直链烯基；
优选的，R4选自如下所示的结构：
Figure BDA0003580637420000041
在本发明的一些实施方式中，所述脂质化合物选自如下所示的结构：
Figure BDA0003580637420000042
Figure BDA0003580637420000051
优选的，所述脂质化合物选自：A1、A2、B1、B2、B3、B4、B5、C2、C4、C6、1-O15B、2-O15B、3-O15B、2-O19B、1-O25B、2-O25B。
本发明的可电离脂质化合物分为两个大类：(1)式(I)所示结构，在二硫键(S-S)两端依次连接酯基、叔胺、烷基链，还可在烷基链与叔胺之间、或烷基链中引入酯基以提高脂质化合物的生物降解性；以及，(2)式(2)所示结构，将带有酯基和二硫键的疏水尾部与有机胺连接。本发明的可电离脂质化合物在血液中运输时呈电中性或者电负性，可以减小用于基因递送的传统阳离子脂质中的正电荷所带来的细胞毒性，并且可以延长体内循环时间，改善药物代谢动力学特征。本发明的脂质化合物可在酸性条件下获得正电荷，再与带有负电荷的RNA、DNA以及小分子药物通过静电相互作用结合，自组装为脂质纳米颗粒(LipidNanoparticle，LNP)，进行活性成分的递送，如，可以在哺乳动物细胞内高效递送DNA、mRNA，表达靶向基因，以及高效转染siRNA，特异性沉默靶向基因表达。由于细胞内上调的谷胱甘肽等还原性物质可以快速降解可电离脂质化合物中的二硫键，导致纳米载体破裂及包载的核酸分子释放到细胞质中，从而实现内涵体逃逸，提升转染效率。除此之外，二硫键和酯键结构的可生物降解性使得可电离脂质化合物更容易在体内被代谢。
本发明的第二方面，提供上述脂质化合物的制备方法：
当所述脂质化合物具有式(I)所示的结构，且其中所述R1选自C8-C12直链烷基时，所述脂质化合物的合成路线如下：
Figure BDA0003580637420000061
当所述脂质化合物具有式(I)所示的结构，且其中所述R1选自
Figure BDA0003580637420000062
时，所述脂质化合物的合成路线如下：
Figure BDA0003580637420000063
R2、n分别如前文所定义。
当所述脂质化合物具有式(II)所示的结构时，该所述化合物由丙烯酸酯衍生物与有机胺通过迈克尔加成反应得到；该反应可以通过控制有机胺与丙烯酸酯衍生物的化学当量比来控制有机胺氮上游离氢原子的取代程度。
所述丙烯酸酯具有如下所示的结构：
Figure BDA0003580637420000064
R4如前文所定义。
优选的，所述有机胺选自如下所示的结构：
Figure BDA0003580637420000065
与传统阳离子脂质的合成需要复杂的化学合成路线不同，本发明提供的可电离脂质结构精简，反应途径简单，产率较高。
本发明的第三方面，提供一种组合物，所述组合物包括上述的脂质化合物，或其药学上可接受的盐或其立体异构体。
在本发明的一些实施方式中，所述组合物还包括其他脂质化合物。
在本发明的一些实施方式中，所述其他脂质化合物包括胆固醇、辅助磷脂和聚乙二醇修饰脂质中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述辅助磷脂包括蛋黄卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬酯酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述聚乙二醇(PEG)修饰脂质包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，在所述组合物还包括胆固醇、辅助磷脂和PEG修饰脂质时，所述脂质化合物，或其药学上可接受的盐或其立体异构体：胆固醇：辅助磷脂：PEG修饰脂质的摩尔比为30-50：30-50：5-20：1-2.5，例如，40-50：35-50：5-10：1.5-2、40-50：40-50：5-10：1.5-2、40-45：45-48：8-10：1.5-2、40：48：10：2，优选40：48：10：2。
在本发明的一些实施方式中，所述组合物为脂质纳米颗粒、脂质体。本发明所述的脂质纳米颗粒或脂质体可用于制备细胞转染试剂，具有很高的转染效率。
在本发明的一些实施方式中，所述组合物还包括药物活性成分。
在本发明的一些实施方式中，所述脂质化合物，或其药学上可接受的盐或其立体异构体与药物活性成分的摩尔比为1-100：1。
在本发明的一些实施方式中，所述药物活性成分包括核酸分子、多肽、蛋白质和小分子化合物中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子包括siRNA、mRNA、miRNA、antisenseRNA、CRISPR guide RNAs、可复制性RNA、环二核苷酸(cyclic dinucleotide，CDN)、polyIC、CpG ODN、plasmid DNA中的至少一种，优选siRNA、plasmid DNA。
在本发明的一些实施方式中，所述蛋白质包括细胞集落刺激因子、白介素类、干扰素类蛋白、肿瘤坏死因子中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，当所述药物活性成分包括核酸分子时，所述脂质化合物，或其药学上可接受的盐或其立体异构体与核酸分子的氮磷比(N/P ratio)为4-32：1，优选16-32：1，更优选32：1。
具体的，本发明的组合物可携带核酸分子透过细胞膜，因此可以作为转染试剂，尤其当转染siRNA后，能够有效抑制靶基因的表达；或当转染pDNA后，能够有效增加靶基因的表达。
在本发明的一些实施方式中，负载药物活性成分的组合物的制备方法包括以下步骤：
将所述脂质化合物与所述药物活性成分按比例溶解于缓冲盐溶液(pH＝4-6)中；若存在其他脂质化合物，在所述混合过程中加入所述其他脂质化合物；室温孵育15-60min，即得。
所述组合物还包括一种或多种药学上可接受的辅料；该组合物可为药学上可接受的任一剂型。药学上可接受的辅料是无毒性、与活性成分相容且其他方面生物学性质上适用于生物体的物质。特定辅料的选择将取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态。药学上可接受的辅料其实例包括但不限于药学领域常规的溶剂、稀释剂、分散剂、助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、粘合剂、润滑剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、着色剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂、和抗氧化剂等。必要时，还可以在药物组合物中加入香味剂、防腐剂和甜味剂等。
在某些实施方案中，上述药物组合物可以以口服、肠胃外、直肠或经肺给药等方式施用于需要这种治疗的患者或受试者。用于口服给药时，所述药物组合物可制成口服制剂，例如可以制成常规的口服固体制剂，如片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂等；也可制成口服液体制剂，如口服溶液剂、口服混悬剂、糖浆剂等。制成口服制剂时，可以加入适宜的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等。用于肠胃外给药时，上述药物组合物也可制成注射剂、包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液。制成注射剂时，可采用现有制药领域中的常规方法生产，配置注射剂时，可以不加入附加剂，也可以根据药物的性质加入适宜的附加剂。用于直肠给药时，所述药物组合物可制成栓剂等。用于经肺给药时，所述药物组合物可制成吸入制剂、气雾剂、粉雾剂或喷雾剂等。
本发明的第四方面，提供上述脂质化合物，或其药学上可接受的盐或其立体异构体，或上述组合物在制备核酸药物、基因疫苗、多肽或蛋白质药物、小分子药物中的应用。
特别的，本发明所述的脂质化合物，或其药学上可接受的盐或其立体异构体或上述组合物可通过激活先天性免疫发挥免疫治疗作用。
除此之外，所述的核酸药物、基因疫苗、多肽或蛋白质药物、小分子药物为可用于治疗其它由基因异常引起的相关疾病的药物，所述疾病包括单基因疾病，例如马凡氏综合征、遗传性高铁血红蛋白血症、镰刀红细胞贫血、血色病；多基因疾病，例如，肿瘤(如白血病、乳腺癌、甲状腺肿瘤、肺癌、骨肿瘤、皮肤癌、多发性骨髓瘤、淋巴瘤等)、心血管疾病(如心力衰竭、心肌病、家族性高胆固醇血症、达农病等)、代谢性疾病(如糖原累积病、黏多糖病、半乳糖血症、苯丙酮尿症、先天性高氨血症、戈谢病、肝豆状核变性等)、神经和精神类疾病(如帕金森症)；以及获得性基因病，例如，艾滋病。
根据本发明实施方式的脂质化合物或组合物，至少具备如下有益效果：
在现有的技术中，脂质的疏水端由长碳链烷烃或烯烃构成，难以被酶降解，体内代谢相对困难。而本发明的脂质化合物在结构中引入了生物可降解的酯键，在体内可被酯酶降解，使得脂质化合物易于代谢清除。本发明的可电离脂质化合物在中性条件下呈电中性，可以增加纳米颗粒的稳定性，从而减小因正电荷过多而带来的细胞毒性，而且能避免在体内与带正电的血红蛋白结合而迅速降解，并有助于延长所负载的基因药物的体内循环时间、改善其药物动力学特征。但在酸性pH条件下，本发明的可电离脂质化合物可电离成阳离子，能够与带负电的药物活性成分通过电荷的相互作用进行结合，与辅助性脂质如二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)或二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)等组成脂质纳米颗粒，有效递送药物活性成分进入细胞内。本发明的可电离脂质化合物，其头部或尾部结构中具有还原性环境敏感的二硫键结构，在胞内高浓度GSH存在下，可以使二硫键断裂，促进药物的释放，帮助纳米药物从内涵体中逃脱，进而增强转染效果。实施例中的数据也表明本发明制备得到的脂质化合物具有很高的转染效率。除此之外，本发明具有原料易得、反应简单、产率高的优点。
本申请中术语：
术语“直链烷基”是指包括一个或多个碳原子(例如、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个碳原子)的直链饱和烃基。具体地，“C8-C12直链烷基”、“C9-C17直链烷基”、“C7-C17直链烷基”分别指包括8-12个碳原子、9-17个碳原子、7-17个碳原子的直链饱和烃基，例如
Figure BDA0003580637420000101
Figure BDA0003580637420000102
术语“直链烯基”是指包含两个或更多个碳原子和至少一个碳-碳双键的直链烃基(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个碳原子)。烯基可以包括一个至四个碳-碳双键。具体地，“C9-C17直链烯基”是指包括9-17个碳原子和一个至四个碳-碳双键的直链烃基。“C7-C17直链烯基”是指包括7-17个碳原子和一个至四个碳-碳双键的直链烃基，例如，
Figure BDA0003580637420000103
Figure BDA0003580637420000104
所述“五元环或六元环”包括以下结构：
Figure BDA0003580637420000105
术语“药学上可接受的盐”可选自无机酸制备的硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物，酸例如盐酸、硝酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸等。代表性盐包括：氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、乙酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘甲酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐、月桂基磺酸盐和羟乙磺酸盐等。盐也可以是从有机酸制备的，例如脂肪族一元与二元羧酸、苯基取代的烷酸、羟基烷酸、烷二酸、芳香族酸、脂肪族与芳香族磺酸等。代表性盐包括：乙酸盐、丙酸盐、辛酸盐、异丁酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盆、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、萘甲酸盐、苯磺酸盐、甲苯奭酸盐、苯乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐等。药学上可接受的盐可以包括基于碱金属与碱土金属的阳离子，例如钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。还涵盖氨基酸的盐，例如精氨酸盐、葡糖酸盐、半乳糖醛酸盐等。
术语“异构体”为具有同样分子式的不同化合物。本发明尤其优选立体异构体，术语“立体异构体”为只是原子空间排列不同的异构体。
本发明的化合物可以存在特定的几何或立体异构体形式。本发明所述的这类立体异构体，包括顺式和反式异构体、(-)-和(+)-对对映体、(R)-和(S)-对映体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体，及其外消旋混合物和其他混合物，例如对映异构体或非对映体富集的混合物，所有这些混合物都属于本发明的范围之内。烷基等取代基中可存在另外的不对称碳原子。所有这些异构体以及它们的混合物，均包括在本发明的范围之内。
术语“组合物”包括含有效量的本发明的化合物的产品，以及直接地或间接地由本申请化合物的组合产生的任何产品。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，其中：
图1为本发明中间体1的核磁共振氢谱图。
图2为本发明B2的核磁共振氢谱图。
图3为本发明B4的核磁共振氢谱图。
图4为本发明B6的核磁共振氢谱图。
图5为本发明C2的核磁共振氢谱图。
图6为本发明C-VA的核磁共振氢谱图。
图7为本发明中间体4的核磁共振氢谱图。
图8为本发明2-O15B的核磁共振氢谱图。
图9为本发明A1、A2、B1-B6、C2、C4、C6、1-O15B、2-O15B所构建的脂质纳米颗粒包载萤火虫萤光素酶小干扰RNA(luciferase siRNA，siLuc)后，萤火虫荧光素酶(Luciferase)的表达量结果图。
图10为本发明A2所构建的脂质纳米颗粒包载siLuc后，萤火虫荧光素酶(Luciferase)的表达量结果图；其中，比例A为可电离脂质化合物A2：Cholesterol：DSPC：DSPE-PEG＝30:28.5:10:0.75；比例B为可电离脂质化合物A2：Cholesterol：DSPC：DSPE-PEG＝50:38.5:10:1.5；比例C为可电离脂质化合物A2：Cholesterol：DSPC：DSPE-PEG＝35:46.5:16:2.5；比例D为可电离脂质化合物A2：Cholesterol：DSPC：DSPE-PEG＝40:48:10:2。
图11为本发明的A1、A2、B1-B6、C2、C4、C6、1-O15B、2-O15B、3-O15B、4-O15B、2-O19B、2-O25B制成脂质纳米颗粒后，转染绿色荧光蛋白质粒DNA，48h后的相对荧光素酶活性结果图；其中，聚乙烯亚胺(PEI)为商业化转染试剂。
图12本发明的A1、A2、B1-B6、C2、C4、C6、1-O15B、2-O15B、3-O15B、4-O15B、2-O19B、2-O25B制成脂质纳米颗粒后，转染绿色荧光蛋白质粒DNA，48h后的荧光显微镜图；其中，聚乙烯亚胺(PEI)为商业化转染试剂。
图13为脂质纳米颗粒在不同氮磷比固缩DNA的能力图。
图14为脂质纳米颗粒在不同条件下固缩DNA的稳定性对比图。
图15为本发明的A1、A2、B1-B6、C2、C4、C6、C-VA、C-VE、1-O15B、2-O15B、3-O15B、4-O15B、5-O15B、6-O15B、1-O19B、2-O19B、1-O25B、2-O25B制成脂质纳米颗粒后，对先天性免疫的激活作用结果图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例
实施例1中间体1的合成
Figure BDA0003580637420000131
向装有磁子的三口烧瓶中加入17mmol 2,2-二硫二乙醇、51mmol三乙胺、25mL四氢呋喃，在冰浴下搅拌20min，然后使用恒压漏斗缓慢滴加40.8mmol丙烯酰氯，反应在室温下过夜，然后用20mL二氯甲烷稀释并用50mL HCl(1mol/L)洗涤，有机层用Na2SO4干燥并过滤，使用旋转蒸发仪除去溶剂，产物通过薄层色谱柱分离(石油醚：乙酸乙酯体积比为10：1)，得到二硫烷二基双(乙烷-2,1-二基)二丙烯酸酯(中间体1)，收率达92％。所得产物的氢谱如图1所示，氢谱数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.36(d,J＝17.2Hz,2H),6.07(t,J＝10.4Hz,2H),5.79(d,J＝13.6Hz,2H),4.37-4.33(m,4H),2.92-2.90(m,4H)。
实施例2中间体2的合成
Figure BDA0003580637420000132
向装有磁子的5mL反应瓶内加入5mmol中间体1和11mmol 2-甲氨基乙醇，在室温搅拌24h，使用旋转蒸发仪除去溶剂，得到产物为中间体2，进行下一步反应。
实施例3中间体3的合成
Figure BDA0003580637420000141
向装有磁子的5mL反应瓶内加入5mmol中间体1，11mmol 2-甲氨基丙醇，在室温搅拌24h，使用旋转蒸发仪除去溶剂，得到产物为中间体3，即可进行下一步反应。
实施例4脂质化合物B2的合成
Figure BDA0003580637420000142
向装有磁子的三口烧瓶中加入5mmol中间体2、12mmol三乙胺、25mL二氯甲烷，在冰浴下搅拌20min，然后使用恒压漏斗缓慢滴加12mmol月桂酰氯，反应在室温下过夜，然后用20mL二氯甲烷稀释并用50mL HCl(1mol/L)洗涤，有机层用Na2SO4干燥并过滤，使用旋转蒸发仪除去溶剂，产物通过薄层色谱柱分离(石油醚：乙酸乙酯＝1：1)，得到可电离脂质化合物B2，收率达86％。所得产物氢谱如图2所示，氢谱数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.29(t,J＝6.8Hz,4H),4.10(t,J＝6.0Hz,4H),2.87(t,J＝6.8Hz,4H),2.72(t,J＝7.2Hz,4H),2.60(t,J＝6.0Hz,4H),2.44(t,J＝7.2Hz,4H),2.25(t,J＝8.8Hz,10H),1.57-1.54(m,4H),1.26-1.20(m,32H),0.82(t,J＝6.4Hz,6H)。
实施例5脂质化合物B4的合成
Figure BDA0003580637420000143
向装有磁子的三口烧瓶中加入5mmol中间体2、12mmol三乙胺、25mL二氯甲烷，在冰浴下搅拌20min，然后使用恒压漏斗缓慢滴加12mmol棕榈酰氯，反应在室温下过夜，然后用20mL二氯甲烷稀释并用50mL HCl(1mol/L)洗涤，有机层用Na2SO4干燥并过滤，使用旋转蒸发仪除去溶剂，产物通过薄层色谱柱分离(石油醚：乙酸乙酯＝1：1)，得到可电离脂质化合物B4，收率达81％。所得产物氢谱如图3所示，氢谱数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.33(t,J＝6.4Hz,4H),4.14(t,J＝6.0Hz,4H),2.91(t,J＝6.4Hz,4H),2.76(t,J＝7.2Hz,4H),2.64(t,J＝6.0Hz,4H),2.48(t,J＝7.2Hz,4H),2.28(t,J＝4.8Hz,10H),1.61-1.58(m,4H),1.28-1.24(m,46H),0.87(t,J＝6.4Hz,6H)。
实施例6脂质化合物B6的合成
Figure BDA0003580637420000151
向装有磁子的三口烧瓶中加入5mmol中间体2、12mmol三乙胺、25mL二氯甲烷，在冰浴下搅拌20min，然后使用恒压漏斗缓慢滴加12mmol油酰氯，反应在室温下过夜，然后用20mL二氯甲烷稀释并用50mL HCl(1mol/L)洗涤，有机层用Na2SO4干燥并过滤，使用旋转蒸发仪除去溶剂，产物通过薄层色谱柱分离(石油醚：乙酸乙酯＝1：1)，得到可电离脂质化合物B6，收率达67％。所得产物氢谱如图4所示，氢谱数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.37-5.31(m,4H),4.33(t,J＝6.4Hz,4H),4.15(t,J＝6.0Hz,4H),2.90(t,J＝6.4Hz,4H),2.77(t,J＝7.2Hz,4H),2.66(t,J＝6.0Hz,4H),2.49(t,J＝7.2Hz,4H),2.29(t,J＝7.2Hz,10H),2.04-1.98(m,8H),1.59(t,J＝7.2Hz,4H),1.29-1.24(m,40H),0.87-0.85(m,6H)。
实施例7脂质化合物C2的合成
Figure BDA0003580637420000152
向装有磁子的三口烧瓶中加入5mmol中间体3、12mmol三乙胺、25mL二氯甲烷，在冰浴下搅拌20min，然后使用恒压漏斗缓慢滴加12mmol月桂酰氯，反应在室温下过夜，然后用20mL二氯甲烷稀释并用50mL HCl(1mol/L)洗涤，有机层用Na2SO4干燥并过滤，使用旋转蒸发仪除去溶剂，产物通过薄层色谱柱分离(石油醚：乙酸乙酯＝2：1)，得到可电离脂质化合物C2，收率达80％。所得产物氢谱如图5所示，氢谱数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.33(t,J＝6.4Hz,4H),4.08(t,J＝6.4Hz,4H),2.91(t,J＝6.4Hz,4H),2.68(t,J＝7.2Hz,4H),2.49-2.40(m,8H),2.29-2.21(m,10H),1.77(t,J＝7.2Hz,4H),1.61-1.58(m,4H),1.30-1.24(m,32H),0.86(t,J＝6.4Hz,6H)。
实施例8脂质化合物C4的合成
Figure BDA0003580637420000161
向装有磁子的三口烧瓶中加入5mmol中间体3、12mmol三乙胺、25mL二氯甲烷，在冰浴下搅拌20min，然后使用恒压漏斗缓慢滴加12mmol棕榈酰氯，反应在室温下过夜，然后用20mL二氯甲烷稀释并用50mL HCl(1mol/L)洗涤，有机层用Na2SO4干燥并过滤，使用旋转蒸发仪除去溶剂，产物通过薄层色谱柱分离(石油醚：乙酸乙酯＝2：1)，得到可电离脂质C4，收率达78％。
实施例9脂质化合物C-VA的合成
Figure BDA0003580637420000162
向装有磁子的三口烧瓶中加入2mmol中间体3、4.8mmol Retinoic Acid(视黄酸)，再依次加入0.83mmol DMAP(4-二甲氨基吡啶)，6.3mmol EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)，25mL二氯甲烷，反应在室温下过夜，通过TLC检测原料反应完毕，用Na2SO4干燥并过滤，使用旋转蒸发仪除去溶剂，产物通过薄层色谱柱分离(二氯甲烷：甲醇＝20：1)，得到可电离脂质化合物C-VA，收率达64％。所得产物氢谱如图6所示，氢谱数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.97-6.91(m,2H)，6.33-6.06(m,10H)，3.78(t,J＝7.6Hz,4H)，3.33-3.29(m,4H)，2.34-2.28(m,5H)，2.22-2.16(m,18H)，2.03-1.95(m,11H)，1.81-1.78(m,4H)，1.71-1.59(m,14H)，1.47-1.44(m,4H)，1.01(t,J＝6.4Hz,12H)。
实施例10中间体4的合成
Figure BDA0003580637420000163
向装有磁子的三口烧瓶中加入8.87mmol巯基乙醇、9.67mmol三乙胺、20mL三氯甲烷，在冰浴下搅拌15min，然后使用恒压漏斗缓慢滴加8mmol辛酰氯，反应在室温下过夜，然后用20mL二氯甲烷稀释并用50mL HCl(1mol/L)洗涤，有机层用Na2SO4干燥并过滤，使用旋转蒸发仪除去溶剂，得到产物2-巯基辛酸乙酯，可进行下一步反应。
Figure BDA0003580637420000171
向装有磁子的三口烧瓶中加入13.65mmol 2,2’-二硫二吡啶、催化当量的冰乙酸、12mL甲醇，在室温搅拌下缓慢滴加6.75mmol 2-巯基辛酸乙酯(溶于10mL二氯甲烷溶液中)，反应在室温下搅拌3h，用二氯甲烷和饱和食盐水萃取，有机层用Na2SO4干燥并过滤，使用旋转蒸发仪除去溶剂，产物通过薄层色谱柱分离(石油醚：乙酸乙酯＝15：1)，得到产物2-(吡啶-2-基二硫烷基)辛酸乙酯，收率达85％。
Figure BDA0003580637420000172
向装有磁子的三口烧瓶中加入5mmol 2-(吡啶-2-基二硫烷基)辛酸乙酯、催化当量的冰乙酸、10mL甲醇，在室温搅拌下缓慢滴加5.5mmol巯基乙醇(溶于10mL甲醇溶液中)，反应在室温下搅拌6h，用二氯甲烷和饱和食盐水萃取，有机层用Na2SO4干燥并过滤，使用旋转蒸发仪除去溶剂，得到产物2-((2-羟乙基)二硫烷基)辛酸乙酯，进行下一步反应。
Figure BDA0003580637420000173
向装有磁子的三口烧瓶中加入5mmol 2-(吡啶-2-基二硫烷基)辛酸乙酯、7.5mmol三乙胺、20mL二氯甲烷，在冰浴下搅拌20min，然后用恒压漏斗缓慢滴加6.25mmol丙烯酰氯，反应在室温下过夜，用二氯甲烷(20mL)稀释并用50mL HCl(1mol/L)洗涤，有机层用Na2SO4干燥并过滤，使用旋转蒸发仪除去溶剂，产物通过薄层色谱柱分离(石油醚：乙酸乙酯＝15：1)，得到中间体4，收率达76％。产物氢谱如图7所示，氢谱数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.43(dd,J＝16.0,4.6Hz,1H),6.12(q,J＝6.8Hz,1H),5.85(dd,J＝8.8,1.6Hz,1H),4.37(dt,J＝35.6,6.8Hz,4H),2.94(td,J＝13.2,6.8Hz,4H),2.31(t,J＝7.2Hz,2H),1.65-1.59(m,2H),1.29-1.26(m,8H),0.88-0.85(m,3H)。
实施例11脂质化合物1-O15B的合成
Figure BDA0003580637420000181
向装有磁子的5mL反应瓶内加入200mg 2,2'-二氨基-N-甲基二乙胺，3倍化学当量的中间体4，90℃搅拌48h，经过薄层色谱柱分离(二氯甲烷：甲醇＝10：1)，即可得到可电离脂质化合物1-O15B。
实施例12脂质化合物2-O15B的合成
Figure BDA0003580637420000182
向装有磁子的5mL反应瓶内加入200mg N,N-双(3-氨丙基)甲胺，4倍化学当量的中间体4，90℃搅拌48h，经过薄层色谱柱分离(二氯甲烷：甲醇＝10：1)，即可得到可电离脂质化合物2-O15B。所得产物氢谱如图8所示，氢谱数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.32(t,J＝6.8Hz,14H),2.92(t,J＝6.4Hz,16H),2.76(t,J＝7.2Hz,6H),2.47-2.08(m,29H),1.61(t,J＝7.2Hz,14H),1.32-1.26(m,32H),0.87(t,J＝6.4Hz,12H)。
实施例13脂质化合物3-O15B的合成
Figure BDA0003580637420000183
向装有磁子的5mL反应瓶内加入200mg 1-(2-氨乙基)吡咯烷，2倍化学当量的中间体4，90℃搅拌48h，经过薄层色谱柱分离(二氯甲烷：甲醇＝10：1)，即可得到可电离脂质化合物3-O15B。
本发明的脂质化合物的反应机理可以概括为酰氯的醇解反应，烯烃和有机胺的迈克尔加成反应。该反应机理十分成熟，反应过程也为本领域熟知，因此利用上述反应机理生成的化合物，其具体类型以及反应程度都是完全可以预料的。上述为本发明合成的部分化合物的反应条件以及结构表征，本发明其余化合物的合成同上述化合物，其结构式及结构表征数据在此不再详述。
实施例14
使用能表达萤火虫荧光素酶的黑色素瘤细胞系(B16F10-Luciferase,B16F10-Luc)验证可电离脂质化合物递送siRNA(Luciferase siRNA,siLuc)进行基因敲除的效率。分别使用可电离脂质化合物1-O15B、2-O15B、A1、A2、B1-B6、C2、C4、C6作为siLuc核酸递送的载体材料。
具体步骤如下：
1.细胞培养
实验前一天将B16F10-Luc细胞种于96孔细胞培养板中，待细胞密度生长至70-80％左右，进行细胞转染。
2.制备包裹siLuc的脂质纳米颗粒LNP并进行细胞转染
实验组：将可电离脂质化合物1-O15B、2-O15B、A1、A2、B1-B6、C2、C4、C6与二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)，胆固醇(Cholesterol)，二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)按照一定浓度溶于无水乙醇中，放置于-20℃冰箱保存，将可电离脂质化合物：Cholesterol：DSPC：DSPE-PEG按照比例40：48：10：2均匀混合，同时吸取50ng siLuc溶于柠檬酸钠缓冲液(pH＝4)中(柠檬酸钠缓冲液体积为脂质混合物总体积的两倍)，将溶于缓冲液的siLuc与脂质快速混合以形成脂质纳米颗粒LNP，再室温孵育15min。将制得的脂质纳米颗粒用PBS稀释后，加入到细胞培养液中进行转染，其中可电离脂质化合物与siRNA的氮磷比例(N/P ratio，即可电离脂质上的可质子化氨基与RNA上的磷酸基团之间的摩尔比)32:1为最优比例。
阳性对照组：使用Lipofectamine 2000(lipo2000)商业化转染试剂对siLuc进行转染。按照lipo2000的使用说明书，取50ng siLuc加入到5μL Opti-MEM转染液中，再取0.3μL lipo2000置于另一5μL Opti-MEM转染液中，然后将siRNA Opti-MEM溶液与lipo2000Opti-MEM溶液充分混合，室温孵育15min后，加入到B16F10-Luc细胞培养板中进行转染。
阴性对照组：正常培养B16F10-Luc细胞，不进行转染。
3.细胞转染效率分析
转染24h后，裂解细胞，离心后取上清液体，加入萤火虫荧光素酶底物，用酶标仪检测萤火虫荧光素酶含量(化学发光)。结果如图9所示，其中阴性对照组表达萤火虫荧光素酶相对量最高，阳性对照lipo2000转染效率为30％(表达萤火虫荧光素酶相对量为0.7，相对于阴性对照敲除了30％基因表达)，而本发明所合成的可电离脂质化合物大部分都有较强的转染效率，其中1-O15B和2-O15B转染效率为70％-75％左右，明显高于商业化转染试剂Lipofectamine 2000。
实施例15
使用可电离脂质化合物A2对制备纳米颗粒四种物质之间的比例进行优化实验，在黑色素瘤细胞系(B16F10-Luciferase,B16F10-Luc)中递送siLuc。
具体步骤参考实施例14，区别在于实施例15中，实验组为：可电离脂质化合物A2以及二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)，胆固醇(Cholesterol)，二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)按照一定浓度溶于无水乙醇中，放置-20℃冰箱保存。使用四种不同摩尔比例进行混合，比例A为可电离脂质化合物A2：Cholesterol：DSPC：DSPE-PEG＝30:28.5:10:0.75；比例B为可电离脂质化合物A2：Cholesterol：DSPC：DSPE-PEG＝50:38.5:10:1.5；比例C为可电离脂质化合物A2：Cholesterol：DSPC：DSPE-PEG＝35:46.5:16:2.5；比例D为可电离脂质化合物A2：Cholesterol：DSPC：DSPE-PEG＝40:48:10:2。
3.细胞转染效率分析
转染24小时后，裂解细胞，离心后取上清液体，加入萤火虫荧光素酶底物，用酶标仪检测萤火虫荧光素酶含量(化学发光)。结果如图10所示，这四种比例组合制备的脂质纳米颗粒对B16F10-Luc细胞都有一定的敲除效果，其中比例D为最优比例。
实施例16
使用可电离脂质递送同时编码绿色荧光蛋白(GFP)和萤火虫荧光素酶(Luc)的质粒DNA(pDNA-GFP-Luc)转染至293T细胞系中。分别使用可电离脂质化合物1-O15B、2-O15B、3-O15B、4-O15B、2-O19B、2-O25B、A1、A2、B1-B6、C2、C4、C6脂质作为pDNA-GFP-Luc核酸递送的载体材料。
具体步骤如下：
1.细胞培养
实验前一天将293T细胞种于96孔细胞培养板中，待细胞密度生长至70-80％左右，进行细胞转染。
2.制备包裹pDNA-GFP-Luc的脂质纳米颗粒LNP并进行细胞转染
实验组：将可电离脂质化合物1-O15B、2-O15B、3-O15B、4-O15B、2-O19B、2-O25B、A1、A2、B1-B6、C2、C4、C6以及二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，胆固醇(Cholesterol)，二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)按照一定浓度溶于无水乙醇中，放置-20℃冰箱保存，按照比例可电离脂质：Cholesterol：DOPE：DSPE-PEG＝40：48：10：2均匀混合，同时吸取200ng pDNA-GFP-Luc溶于醋酸钠缓冲液(pH＝5.3)中(醋酸钠缓冲液体积为脂质混合物总体积的两倍)，将溶于缓冲液的pDNA-GFP-Luc与脂质快速混合以形成脂质纳米颗粒LNP，在室温孵育15min。将制得的脂质纳米颗粒用PBS稀释后，分别加入到细胞培养液中进行转染，其中可电离脂质化合物与pDNA的氮磷比例(N/Pratio，即可电离脂质上的可质子化氨基与DNA上的磷酸基团之间的摩尔比)32:1为最优比例。
阳性对照组：使用聚乙烯亚胺(PEI)商业化转染试剂和阳离子脂质DOTAP对pDNA-GFP-Luc进行转染。其中PEI按照使用说明书，取200ng DNA溶于5μL DEPC水中混匀，再取2μLPEI溶于5μL DEPC中，将稀释的PEI加入到DNA的DEPC水溶液中，室温孵育15min，加入到293T的96孔细胞培养板中进行转染；DOTAP-LNP的制备方法与上述可电离脂质制备方法相同。为制备DOTAP-LPR纳米颗粒，先制备DOTAP脂质体，具体操作是将DOTAP和胆固醇(1:1，摩尔比)的氯仿混合物风干并在真空泵下干燥过夜；将预热的DEPC水(50℃)加入到脂质膜中，涡旋1min，并在55℃水浴下超声10min进行水化；然后将脂质体依次挤出通过200nm和100nm孔径的聚碳酸酯膜(Whatman)，形成80-100nm单层脂质体。随后，制备DOTAP-LPR纳米颗粒的步骤如下：将含200ng pDNA-GFP-Luc的DEPC水溶液和150ng鱼精蛋白(0.1mg/mL)混合，并在室温下孵育10min，然后将1.939μL预制的DOTAP脂质体(10mM)和上述溶液混合，并在室温下孵育10min，最后，将1.11μg DSPE-PEG与上述溶液混合，置于50℃金属浴中12min，然后进行转染。
阴性对照组：正常培养293T细胞，不进行转染。
3.细胞转染效率分析
转染48h后，使用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白的表达；然后，裂解细胞，离心后取上清液体，加入萤火虫荧光素酶底物，用酶标仪检测萤火虫荧光素酶含量(化学发光)。相对荧光素酶活性结果如图11所示，荧光显微镜结果如图12所示。
其中阴性对照表达萤火虫荧光素酶为最低，阳性对照PEI转染表达荧火虫荧光素酶相对量可达160万数值，而商业化阳离子脂质DOTAP，其制备方式无论是DOTAP-LNP还是DOTAP-LPR都无法有效转染pDNA-GFP-Luc。而本发明的部分可电离脂质化合物有很强的转染效率，其中2-O15B表达萤火虫荧光素酶相对量最高，达到190万数值。
实施例17凝胶迁移实验考察脂质纳米颗粒固缩DNA的能力
1.制备pDNA-GFP-Luc的脂质纳米颗粒进行凝胶迁移实验
依照上述制备pDNA-GFP-Luc的脂质纳米颗粒的方法，使用2-O15B，2-O19B，2-O25B分别制备氮磷比例为8:1，16:1，24:1，32:1(即可电离脂质上的可质子化氨基与DNA上的磷酸基团之间的摩尔比)的脂质纳米颗粒，制备完成后，脂质纳米颗粒与适量的的PBS混合后加样与1％琼脂糖凝胶中，100V电压条件下电泳50分钟，采用凝胶成像仪观察结果，具体见图13。
依照上述制备pDNA-GFP-Luc的脂质纳米颗粒的方法，使用2-O15B制备三份氮磷比例为32:1的脂质纳米颗粒，制备完成后，分别将脂质纳米颗粒置于PBS，10％serum(血清)，5mM GSH(谷胱甘肽)的溶液中，分别孵育一定的时间后加样与1％琼脂糖凝胶中，100V电压条件下电泳50分钟，采用凝胶成像仪观察结果，具体见图14。
2.凝胶迁移结果分析
如图13所示，2-O15B脂质纳米颗粒在氮磷比例最小为8:1时依然能完全固缩DNA，而2-O19B，2-O25B脂质纳米颗粒则在氮磷比例为24:1，32:1时候才能完全固缩DNA，说明在一定的范围内随着烷基链长度的增加脂质纳米颗粒固缩DNA的能力在逐步下降，脂质纳米颗粒和DNA的固缩主要是因为静电相互作用，而烷基链太长可能会影响氨基头部质子化的能力，所以包裹DNA的能力下降。
如图14所示，2-O15B脂质纳米颗粒在PBS溶液中能保持稳定，在含有10％血清的溶液中2个小时依然能保持脂质纳米颗粒的稳定性，DNA并没有释放。而在模拟细胞质内环境条件下(5mM的谷胱甘肽)，30分钟后就有一定量的DNA完成了释放，这说明脂质纳米颗粒在细胞内可以触发二硫键的降解，从而有效的释放出所包裹的基因药物。
实施例18
检测由可电离脂质制备的纳米颗粒对RAW-Luc细胞的先天性免疫的激活作用。这种RAW-Luc细胞的干扰素刺激基因(interferon-stimulated gene，ISG)的信号通路被激活时，会分泌萤火虫荧光素酶到胞外的细胞培养液中，通过酶标仪检测萤火虫荧光素酶的分泌情况(化学发光)，从而定量检测由可电离脂质制备的纳米颗粒对先天性免疫的激活作用。
具体步骤如下：
1.细胞培养
实验前一天将RAW-Luc细胞种于96孔细胞培养板，待细胞密度生长至70-80％左右，进行细胞转染。
2.制备空包载的脂质纳米颗粒LNP并进行细胞转染
实验组：将可电离脂质化合物1-O15B、2-O15B、3-O15B、4-O15B、5-O15B、6-O15B、1-O19B、2-O19B、1-O25B、2-O25B、A1、A2、B1-B6、C2、C4、C6、C-VA、C-VE与二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，胆固醇(Cholesterol)，二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)按照一定浓度溶于无水乙醇中，放置于-20℃冰箱保存，按照比例可电离脂质化合物：Cholesterol：DOPE：DSPE-PEG＝40:48:10:2均匀混合。随后，将一定量的醋酸钠缓冲液(pH＝5.3，醋酸钠缓冲液体积为脂质混合物总体积的两倍)与脂质快速混合以形成脂质纳米颗粒LNP，在室温孵育15min。将制得的脂质纳米颗粒用PBS稀释后，分别加入到细胞培养液中进行转染。
阴性对照组：正常培养RAW-luc细胞，不进行转染。
3.结果分析
转染12，24，36小时后，取细胞培养液上清，加入萤火虫荧光素酶底物，用酶标仪检测萤火虫荧光素酶含量(化学发光)。结果如图15所示，第二种类可电离脂质对RAW-Luc细胞激活效果明显，在36小时后，2-O19B和2-O25B有8-10倍的激活效果。表明2-O19B和2-O25B可能具有免疫治疗作用。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.脂质化合物，或其药学上可接受的盐或其立体异构体，其特征在于，
所述脂质化合物具有式(I)所示的结构：
Figure FDA0003580637410000011
R1选自C8-C12直链烷基或
Figure FDA0003580637410000012
其中，R2选自C9-C17直链烷基或直链烯基、
Figure FDA0003580637410000013
Figure FDA0003580637410000014
n选自0-3的整数；
或，所述脂质化合物具有式(II)所示的结构；
Figure FDA0003580637410000015
y选自1或2；其中，
当y选自1时，R3选自
Figure FDA0003580637410000016
其中，R5选自羟基、未取代或甲基取代的四氢吡咯基、哌啶基、哌嗪基、二甲氨基、二羟甲基氨基、二乙氨基、二羟乙基氨基；
当y选自2时，R3选自
Figure FDA0003580637410000017
其中X选自
Figure FDA0003580637410000018
亚甲基、氧原子、或者X与式(II)中的任意一个N相连形成五元杂环或六元杂环；或R3与式(II)中的两个N一起形成五元杂环或六元杂环；
每个p各自独立的选自0或1，且，
式(II)中至多存在一个p为0，且，
当p均为1时，R4选自C7-C17直链烷基或直链烯基；
或，当其中一个p为0、其余p均为1时，与N原子直接相连的R4选自氢或C1-C4直链烷基，其余R4独立选自C7-C17直链烷基或直链烯基。
2.根据权利要求1所述的脂质化合物，其特征在于，
R2选自如下所示的结构：
Figure FDA0003580637410000021
n选自1或2。
3.根据权利要求1所述的脂质化合物，其特征在于，
y选自1或2；其中，
当y选自1时，R3选自
Figure FDA0003580637410000022
其中，R5选自羟基、未取代或甲基取代的四氢吡咯基、哌啶基、哌嗪基；
当y选自2时，R3选自
Figure FDA0003580637410000023
其中X选自
Figure FDA0003580637410000024
亚甲基；
每个p各自独立的选自0或1，且，
式(II)中至多存在一个p为0，且，
当p均为1时，R4选自C7-C17直链烷基或直链烯基；
或，当其中一个p为0、其余p均为1时，与N原子直接相连的R4选自氢，其余R4独立选自C7-C17直链烷基或直链烯基；
所述C7-C17直链烷基或直链烯基选自如下所示的结构：
Figure FDA0003580637410000031
4.根据权利要求1所述的脂质化合物，其特征在于，所述脂质化合物选自如下所示的结构：
Figure FDA0003580637410000032
Figure FDA0003580637410000041
Figure FDA0003580637410000051
5.一种如权利要求1-4中任一项所述的脂质化合物的制备方法，其特征在于：
当所述脂质化合物具有式(I)所示的结构，且其中所述R1选自C8-C12直链烷基时，所述脂质化合物的合成路线如下：
Figure FDA0003580637410000061
当所述脂质化合物具有式(I)所示的结构，且其中所述R1选自
Figure FDA0003580637410000062
时，所述脂质化合物的合成路线如下：
Figure FDA0003580637410000063
R2、n如权利要求1-4中任一项所定义；
当所述脂质化合物具有式(II)所示的结构时，该所述脂质化合物由丙烯酸酯衍生物与有机胺通过迈克尔加成反应得到；
其中，所述丙烯酸酯具有如下所示的结构：
Figure FDA0003580637410000064
R4选自C7-C17直链烷基或直链烯基。
6.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1-4中任一项所述的脂质化合物，或其药学上可接受的盐或其立体异构体。
7.根据权利要求6所述组合物，其特征在于，所述组合物还包括胆固醇、辅助磷脂和聚乙二醇修饰脂质中的至少一种。
8.根据权利要求7所述组合物，其特征在于，所述辅助磷脂包括蛋黄卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬酯酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱中的至少一种；
任选地，所述聚乙二醇修饰脂质包括聚乙二醇修饰的磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇修饰的磷脂酸、聚乙二醇修饰的神经酰胺、聚乙二醇修饰的二烷基胺、聚乙二醇修饰的二酰基甘油、聚乙二醇修饰的二烷基甘油中的至少一种；
任选地，在所述组合物还包括胆固醇、辅助磷脂和聚乙二醇修饰脂质时，所述脂质化合物，或其药学上可接受的盐或其立体异构体：胆固醇：辅助磷脂：聚乙二醇修饰脂质的摩尔比为30-50：30-50：5-20：1-2.5。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的组合物，其特征在于，还包括药物活性成分；
进一步，所述药物活性成分包括核酸分子、多肽、蛋白质和小分子化合物中的至少一种；
更进一步，当所述药物活性成分包括核酸分子时，所述脂质化合物，或其药学上可接受的盐或其立体异构体中的氮与核酸分子中的磷的氮磷比为4-32：1。
10.权利要求1-4中任一项所述的脂质化合物，或其药学上可接受的盐或其立体异构体，或权利要求6-9中任一项所述的组合物在制备核酸药物、基因疫苗、多肽或蛋白质药物、小分子药物中的应用。
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