CN117500819A - 脂质和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种脂质和组合物，所述脂质能将核酸等导入化合物有效地送达至生物体内的靶细胞或组织等。本发明的脂质是下述式(I)所示的脂质。(式中，R1为碳原子数32～48的烃基，R2为一个任意的氨基酸的侧链或所述氨基酸的衍生物的侧链，R3为碱性氨基酸的侧链或所述氨基酸的衍生物的侧链。)

Description

脂质和组合物
技术领域
本发明涉及一种脂质和组合物。
背景技术
化合物向生物体内的靶细胞或组织等对象内(例如核苷、核苷酸、多核苷酸、核酸以及它们的衍生物，例如包含RNAi药剂的生物活性药物等)的输送通常使用脂质等载体分子。但是，有时例如载体分子被生物体内的分解酶分解或透过细胞膜受到限制，难以使化合物到达对象。此外，若即使能使化合物到达对象也无法高效到达，则为了得到由化合物产生的期望的效果，需要使用比理想的投给量大的投给量的导入化合物，可能使细胞毒作用和副作用的风险增大。因此，要求能向靶细胞、组织高效侵入的载体分子。
对于这样的问题，例如专利文献1公开了通过在含有脂质的微粒内封入作为核酸的siRNA，能保护封入的siRNA不在血浆中分解，并且能透过脂溶性的细胞膜。此外，专利文献2～4公开了用于siRNA等核酸医药的送达，提高生物降解能力的脂质。专利文献5公开了用于送达RNAi剂等生物活性药物的阳离子性脂质化合物。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2012－530059号公报
专利文献2：国际公开第2011/153493号
专利文献3：国际公开第2013/086354号
专利文献4：国际公开第2013/158579号
专利文献5：日本特开2016－514109号公报
发明内容
发明所要解决的问题
然而，尽管最近有所进展，但依然要求能将用于向生物体内的靶细胞或组织等对象内导入的化合物(以下，也称为导入化合物)有效地送达至对象内的脂质。
因此，本发明的目的在于，提供一种脂质和组合物，所述脂质能将核酸等导入化合物有效地送达至生物体内的靶细胞或组织等。
用于解决问题的方案
本发明的脂质是下述式(I)所示的脂质。
(式中，R1为碳原子数32～48的烃基，R2为一个任意的氨基酸的侧链或所述氨基酸的衍生物的侧链，R3为碱性氨基酸的侧链或所述氨基酸的衍生物的侧链。)
此外，本发明的组合物为上述的脂质与导入化合物的组合物。
发明效果
根据本发明，能提供一种脂质和组合物，所述脂质能将核酸等导入化合物有效地送达至生物体内的靶细胞或组织等。
具体实施方式
[脂质]
以下对本发明的实施方式进行示例说明。
本实施方式的脂质由下述式(I)表示。
(式中，R1为碳原子数32～48的烃基，R2为一个任意的氨基酸的侧链或所述氨基酸的衍生物的侧链，R3为碱性氨基酸的侧链或所述氨基酸的衍生物的侧链。)
更详细而言，本实施方式的脂质可以设为两亲性分子，其具有：脂质亲和性区域(尾部)，包含烃基(R1)；以及亲水性区域(头部)，包含通过酯键与所述烃连结的、两个氨基酸或其衍生物(二肽)。
需要说明的是，关于亲水性区域的两个氨基酸部分(残基)，也将与从脂质亲和性区域起数第一个、第二个氨基酸部分对应的氨基酸或氨基酸的衍生物分别称为第一氨基酸、第二氨基酸。
根据本实施方式的脂质，能将核酸等导入化合物有效地送达至生物体内的靶细胞或组织等。
具体而言，本实施方式的脂质的亲水性区域由源自两个氨基酸的部分形成，因此能适当地抑制本实施方式的脂质对生物体的影响。此外，就本实施方式的脂质而言，亲水性区域的末端(R3)侧源自碱性氨基酸，成为具有适度的阳离子性，能在包含核酸等向细胞内的导入化合物的状态下容易地制作包含所述脂质的脂质体等脂质纳米粒子，此外，使脂质纳米粒子容易地透过细胞的细胞膜。而且，本实施方式的脂质中的这样的亲水性区域能提高脂质体等脂质纳米粒子与细胞内导入化合物的相性。
而且，通过脂质亲和性区域为碳原子数32～48的烃基(R1)，能确保膜的稳定性等并且适当地形成脂质体等脂质纳米粒子的膜。
如上，通过使用本实施方式的脂质，能将核酸等导入化合物有效地送达至生物体内的靶细胞或组织等。
需要说明的是，在本实施方式的脂质中除了包含式(I)所示的化合物以外，还包含其药剂学上可接受的盐。药剂学上可接受的盐是指，保持生物学有效性和本发明的化合物的特性，典型而言，并非生物学上或在其他方面不理想的盐。
更详细而言，就本实施方式的脂质而言，例如亲水性区域可以质子化而形成阳离子或脱质子化而形成阴离子。作为能与脂质的阳离子成对的阴离子，只要药剂学上可接受，就没有特别限定，例如可列举出：氯化物离子、溴化物离子、硝酸离子、硫酸离子、磷酸离子等无机离子；乙酸离子、草酸离子、马来酸离子、富马酸离子、柠檬酸离子、苯甲酸离子、甲磺酸离子、三氟乙酸离子等有机酸离子等。此外，作为与脂质的阴离子成对的阳离子，只要药剂学上可接受，就没有特别限定，例如可列举出：铵离子、三烷基铵离子、钠离子、钾离子、镁离子、钙离子等。
在此，在本实施方式中，式(I)中的R1为碳原子数32～48的烃基。通过将烃基的碳原子数设为32～48，脂质体等脂质纳米粒子的膜的稳定性提高并且能防止膜本身变得过大。
在此作为“烃基”，例如可列举出：烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、芳基、芳烷基、环烷基烷基等，优选为烷基、烯基、炔基。
R1可以为支链状的烃基也可以为直链状的烃基，优选为支链状。此外，R1的碳原子数优选为32～46，更优选为32～44，进一步优选为36～44。由此，脂质纳米粒子的膜的稳定性进一步提高并且能进一步防止膜本身变得过大。
而且，在本实施方式中，R1的烃基可以饱和，但优选为不饱和，此外，所述不饱和键更优选为顺式型。
在本实施方式中，作为R1，优选为下述式(II)所示的烃基。
(式中，R11为碳原子数a的烃基，R12为碳原子数b的烃基，在此，a和b满足31≤a+b≤47。)
R11和R12没有特别限定，例如可以设为直链状的烃基，此外，优选为碳原子数1～46的直链状的烃基。R11和R12更优选为碳原子数6～22的直链状的烃基，更优选为碳原子数10～22的直链状的烃基，进一步优选为碳原子数17～22的直链状的烃基，更进一步优选为碳原子数18～22的直链状的烃基。由此，脂质纳米粒子的膜的稳定性进一步提高并且能进一步防止膜本身变得过大。
R11和R12为上述的碳原子数的烃基，优选至少任一方为不饱和烃基。此外，进一步优选R11和R12双方为上述的碳原子数的不饱和烃基。此外，在R11和R12中的至少任一方为不饱和烃基的情况下，一个不饱和烃基内的不饱和键的数量优选为三个以下，更优选为两个以下，最优选为一个。
此外，在R11和R12双方为不饱和烃基的情况下，从R11和R12中的末端碳起数到的不饱和基团的位置优选在R11和R12中为相同位置。
此外，关于R11的碳原子数a和关于R12的碳原子数b优选为1≤b－a≤20，更优选为1≤b－a≤18，进一步优选为1≤b－a≤15，更进一步优选为1≤b－a≤10，最优选为1＝b－a。
而且，碳原子数a、b优选为31≤a+b≤45，更优选为31≤a+b≤43，进一步优选为35≤a+b≤43。
R11和R12没有特别限定，例如优选为碳原子数10～22的直链饱和烃基(即，正癸基、正十一烷基、正十二烷基、正十三烷基、正十四烷基、正十五烷基、正十六烷基、正十七烷基、正十八烷基、正十九烷基、正二十烷基)或碳原子数10～22的直链不饱和烃基(例如，顺－9－十四烯－1－基、顺－8－十五烯－1－基、顺－9－十六烯－1－基、顺－8－十七烯－1－基、顺－9－十八烯－1－基、顺－8－十九烯－1－基、顺－11－十八烯－1－基、顺－9－二十烯－1－基、顺－11－二十烯－1－基、顺－12－二十一烯－1－基、顺－13－二十二烯－1－基等单不饱和烃基；顺－8－顺－11－十七碳二烯－1－基、顺－9－顺－12－十八碳二烯－1－基等二不饱和烃基；顺－8－顺－11－顺－14－十七碳三烯－1－基、顺－9－顺－12－顺－15－十八碳三烯－1－基、顺－8－顺－10－顺－12－十七碳三烯－1－基、顺－9－顺－11－顺－13－十八碳三烯－1－基等三不饱和烃基；顺－3－顺－7－顺－11－顺－14－十七碳四烯－1－基、顺－4－顺－8－顺－12－顺－15－十八碳四烯－1－基、顺－4－顺－7－顺－10－顺－13－十九碳四烯－1－基、顺－5－顺－8－顺－11－顺－14－二十碳四烯－1－基等四不饱和烃基等)。
R11和R12优选为碳原子数16～24的直链不饱和烃基，更优选为碳原子数18～22的直链不饱和烃基，进一步优选R11为顺－8－十七烯－1－基、顺－8－顺－11－十七碳二烯－1－基、顺－12－二十一烯－1－基，R12为顺－9－十八烯－1－基、顺－9－顺－12－十八碳二烯－1－基、顺－13－二十二烯－1－基，最优选R11为顺－8－十七烯－1－基，R12为顺－9－十八烯－1－基。
在本实施方式中，式(I)中的R2为一个任意的氨基酸的侧链或所述氨基酸的衍生物的侧链。作为氨基酸，可列举出：20种天然氨基酸(Gly、Ara、Leu、Ile、Val、Arg、Lys、Glu、Gln、Asp、Asn、Cys、Met、His、Pro、Phe、Tyr、Thr、Ser、Trp)以及修饰和非天然氨基酸(例如，2－氨基己二酸、3－氨基己二酸、β－丙氨酸、2－氨基丁酸、4－氨基丁酸、5－氨基戊酸、6－氨基己酸、2－氨基庚酸、2，3－二氨基丙酸、N－乙基甘氨酸、N－乙基天冬酰胺、羟基赖氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、2－氨基庚二酸、2－氨基辛二酸、高丝氨酸、氨基丙二酸、高精氨酸、胍基乙酸、2，4－二氨基丁酸、氨基苯基丙氨酸等)。
优选的是，R2为亲水性氨基酸的侧链或亲水性氨基酸的衍生物的侧链。由此，能更有效地将核酸等导入化合物送达至生物体内的靶细胞或组织等。作为亲水性氨基酸，没有特别限定，例如可列举出：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、2－氨基己二酸、2－氨基庚二酸、2－氨基辛二酸、高丝氨酸、氨基丙二酸。
此外，优选的是，R2为选自由天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、丝氨酸以及苏氨酸构成的组中的氨基酸的侧链或所述氨基酸的衍生物的侧链，更优选的是，R2为选自由天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、丝氨酸以及苏氨酸构成的组中的氨基酸的侧链。由此，能更有效地将核酸等导入化合物送达至生物体内的靶细胞或组织等。
进而，优选的是，R2为选自由天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸以及苏氨酸构成的组中的氨基酸的侧链或所述氨基酸的衍生物的侧链，更优选的是，R2为天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸以及苏氨酸的侧链。由此，能进一步抑制细胞毒性，并且有效地将核酸等导入化合物送达至细胞质。
需要说明的是，在R2为亲水性氨基酸的衍生物的侧链的情况下，优选亲水性氨基酸的衍生物也示出亲水性，例如可以通过具备极性基团、能具有电荷的官能团来示出亲水性。
需要说明的是，氨基酸的衍生物的侧链是指，可列举出具有如下基团的氨基酸的衍生物的侧链：(i)被－NHR4或－N(R4)2基取代的－NH2基(在此，各R4独立地为烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、烷芳基、芳烷基或杂芳基，可以被取代或也可以未被取代)；(ii)被－O－PO3H2、－OR4或－OCOR4基取代的－OH基(在此，各R4独立地为烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、烷芳基、芳烷基或杂芳基，可以被取代或也可以未被取代)；(iii)被－COOR4基取代的－COOH基(在此，各R4独立地为烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、烷芳基、芳烷基或杂芳基，可以被取代或也可以未被取代)；(iv)被－CON(R4)2基取代的－COOH基(在此，各R4可以独立地为H，或者为烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、烷芳基、芳烷基或杂芳基，可以被取代或也可以未被取代)；(v)被－S－S－CH2－CH(NH2)－COOH或－S－S－CH2－CH2－CH(NH2)－COOH取代的－SH基；(vi)被－CH(NH2)－、－CH(OH)－、－CHR4－基取代的－CH2－基(在此，各R4可以独立地为H，或者为烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、烷芳基、芳烷基或杂芳基，可以被取代或也可以未被取代)；(vii)被－CH2－NH2、－CH2－OH、－CH2R4基取代的－CH3基(在此，各R4独立地为烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、烷芳基、芳烷基或杂芳基，可以被取代或也可以未被取代)；和/或(viii)被卤素取代的、与碳原子键合的H。
此外，上述的R4优选为烷基，更优选为碳原子数1～6的烷基，进一步优选为碳原子数1～3的烷基，更进一步优选为碳原子数1的烷基。
此外，在本说明书中，氨基酸中也包含L体、D体以及外消旋体，优选为L体。
需要说明的是，在R2为选自由天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、蛋氨酸，丝氨酸以及苏氨酸构成的组中的氨基酸的衍生物的侧链的情况下，天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、蛋氨酸、丝氨酸以及苏氨酸的衍生物的侧链是指，例如可列举出下述内容。
即，在R2为天冬氨酸或谷氨酸的情况下，衍生物的侧链是指，可列举出具有如下基团的衍生物的侧链：(iii)被－COOR4基取代的－COOH基；(vi)被－CH(NH2)－、－CH(OH)－、－CHR4－基取代的－CH2－基；和/或(viii)被卤素取代的、与碳原子键合的H。
此外，在R2为组氨酸或蛋氨酸的情况下，衍生物的侧链是指，可列举出具有如下基团的衍生物的侧链：(vi)被－CH(NH2)－、－CH(OH)－、－CHR4－基取代的－CH2－基；和/或(viii)被卤素取代的、与碳原子键合的H。
而且，在R2为丝氨酸的情况下，衍生物的侧链是指，可列举出具有如下基团的衍生物的侧链：(ii)被－O－PO3H2、－OR4或－OCOR4基取代的－OH基；(vi)被－CH(NH2)－、－CH(OH)－、－CHR4－基取代的－CH2－基；和/或(viii)被卤素取代的、与碳原子键合的H。
此外，在R2为苏氨酸的情况下，衍生物的侧链是指，可列举出具有如下基团的衍生物的侧链：(ii)被－O－PO3H2、－OR4或－OCOR4基取代的－OH基；(vii)被－CH2－NH2、－CH2－OH、－CH2R4基取代的－CH3基；和/或(viii)被卤素取代的、与碳原子键合的H。
需要说明的是，关于上述的任意种氨基酸的衍生物的侧链是指，优选的是，优选为具有(vi)被－CH(NH2)－、－CH(OH)－、－CHR4－基取代的－CH2－基的衍生物的侧链(在苏氨酸的情况下为(vii)被－CH2－NH2、－CH2－OH、－CH2R4基取代的－CH3基)，更优选为具有被－CHR4－基取代的－CH2－基的衍生物的侧链(在苏氨酸的情况下为被－CH2R4基取代的－CH3基)。
此外，上述的R4可以为H，或者为烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、烷芳基、芳烷基或杂芳基，可以被取代或也可以未被取代。此外，在分子内存在多个R4的情况下R4相互独立地选自上述基团中。进而，R4优选为烷基，更优选为碳原子数1～6的烷基，进一步优选为碳原子数1～3的烷基，更进一步优选为碳原子数1的烷基。
在本实施方式中，式(I)中的R3为碱性氨基酸的侧链或所述碱性氨基酸的衍生物的所述侧链，优选的是，R3为碱性氨基酸的侧链。更优选的是，R3为选自由赖氨酸、组氨酸、精氨酸构成的组中的氨基酸的侧链或所述氨基酸的衍生物的侧链，进一步优选的是，R3为选自由赖氨酸、组氨酸、精氨酸构成的组中的氨基酸的侧链。此外更优选的是，R3为精氨酸的侧链或精氨酸的衍生物的侧链，进一步优选的是，R3为精氨酸的侧链。
由此，能有效地将核酸等导入化合物送达至细胞质。
需要说明的是，碱性氨基酸是指，可列举出，天然氨基酸以及修饰和非天然氨基酸中具有示出碱性的残基的氨基酸，具体而言，没有特别限定，例如可列举出：赖氨酸、组氨酸、精氨酸、高精氨酸、胍基乙酸、鸟氨酸、2，4－二氨基丁酸、2，3－二氨基丙酸、氨基苯基丙氨酸等。
在R3为碱性氨基酸的衍生物的侧链的情况下，这些侧链可以设为作为上述的氨基酸的衍生物的侧链而列举出的具有(i)～(viii)的侧链。此外，在该情况下，R4优选为烷基，更优选为碳原子数1～6的烷基，进一步优选为碳原子数1～3的烷基，更进一步优选为碳原子数1的烷基。
需要说明的是，在R3为碱性氨基酸的衍生物的侧链的情况下，优选碱性氨基酸的衍生物也示出碱性，例如可以通过具备氨基、能接受质子的官能团来示出碱性。
需要说明的是，在R3为选自由赖氨酸、组氨酸、精氨酸构成的组中的氨基酸的衍生物的侧链的情况下，赖氨酸、组氨酸、精氨酸的衍生物的侧链是指，例如可列举出下述内容。
即，在R3为赖氨酸的情况下，衍生物的侧链是指，可列举出具有如下基团的衍生物的侧链：(i)被－NHR4或－N(R4)2基取代的－NH2基；和/或(vi)被－CH(NH2)－、－CH(OH)－、－CHR4－基取代的－CH2－基。
此外，在R3为组氨酸的情况下，衍生物的侧链是指，可列举出具有如下基团的衍生物的侧链：(vi)被－CH(NH2)－、－CH(OH)－、－CHR4－基取代的－CH2－基。
而且，在R3为精氨酸的情况下，衍生物的侧链是指，可列举出具有如下基团的衍生物侧链：(vi)被－CH(NH2)－、－CH(OH)－、－CHR4－基取代的－CH2－基。
需要说明的是，关于上述的任意种氨基酸的衍生物的侧链是指，优选的是，优选为具有(vi)被－CH(NH2)－、－CH(OH)－、－CHR4－基取代的－CH2－基的衍生物的侧链，更优选为具有被－CHR4－基取代的－CH2－基的衍生物的侧链。
此外，上述的R4可以为H，或者为烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、烷芳基、芳烷基或杂芳基，可以被取代或也可以未被取代。此外，在分子内存在多个R4的情况下R4相互独立地选自上述基团中。进而，R4优选为烷基，更优选为碳原子数1～6的烷基，进一步优选为碳原子数1～3的烷基，更进一步优选为碳原子数1的烷基。
在本实施方式中，优选的是，式(I)中的R2为选自由天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、丝氨酸以及苏氨酸构成的组中的氨基酸的侧链或所述氨基酸的衍生物的侧链，并且R3为选自由赖氨酸、组氨酸、精氨酸构成的组中的氨基酸的侧链或所述氨基酸的衍生物的侧链，更优选的是，式(I)中的R2为选自由天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、丝氨酸以及苏氨酸构成的组中的氨基酸的侧链，并且R3为选自由赖氨酸、组氨酸、精氨酸构成的组中的氨基酸的侧链。
此外，优选的是，式(I)中的R2为选自由天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸以及苏氨酸构成的组中的氨基酸的侧链或所述氨基酸的衍生物的侧链，并且R3为精氨酸的侧链或精氨酸的衍生物的侧链，更优选的是，式(I)中的R2为选自由天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸以及苏氨酸构成的组中的氨基酸的侧链，并且R3为精氨酸的侧链。
作为上述式(I)所示的脂质的具体例子，没有特别限定，例如可列举出以下的式(1a)～(1l)所示的脂质。此外，在下述的式(1a)～(1l)所示的脂质中，更优选式(1a)、(1b)、(1e)、(1l)。
[脂质的制造方法]
式(I)所示的化合物没有特别限定，例如可以如下所述地制造。
首先，准备：与脂质亲和性区域(R1－O－)对应的脂肪族醇(R1－OH)；与从脂质亲和性区域起数第一个的第一氨基酸部分(－O－CO－CR2－NH－)对应的氨基酸(HO2C－CR2－NH2)或所述氨基酸的衍生物(也将所述氨基酸和所述氨基酸的衍生物称为第一氨基酸)；以及与第二个的第二氨基酸部分(－NH－CO－CR3－NH2)对应的氨基酸或氨基酸的衍生物(也将所述氨基酸或所述氨基酸的衍生物称为第二氨基酸)。
接着，对脂肪族醇的羟基和第一氨基酸的羧基进行酯化，接着对上述的酯化体的氨基和第二氨基酸的羧基进行酰胺化。通过如此，能得到本实施方式的脂质。
需要说明的是，当进行酯化反应、酰胺化反应时，也可以用保护基预先保护第一氨基酸、第二氨基酸的官能团，以使各化合物以期望的官能团进行反应。
此外，也可以对第一氨基酸和第二氨基酸进行酰胺化，接着对酰胺化体和脂肪族醇进行酯化。
需要说明的是，脂肪族醇(R1－OH)可以通过对期望的脂肪酸或脂肪族酮进行还原反应来得到，例如在脂肪族醇(R1－OH)的R1由下述式(II)表示的情况(即仲醇的情况)下，能如下所述地得到脂肪族醇(R1－OH)。
首先，准备：在R11的烃基的1位具有羧基的脂肪酸(在甲酸的羰基碳附加有R11而成的脂肪酸)以及例如在R12的烃基的1位具有羟基的脂肪族醇(需要说明的是，也可以准备：在R12的烃基的1位具有羧基的脂肪酸以及例如在R11的烃基的1位具有羟基的脂肪族醇，在此对前者的情况进行说明)。
接着，通过由所述在R12的1位具有羟基的脂肪族醇例如经过其羟基的卤化等而得到有机金属试剂。然后，通过使所述在R11的1位具有羧基的脂肪酸与所述有机金属试剂反应，能得到R1由式(II)表示的脂肪族醇。
在此，关于本实施方式的脂质的具体的制造方法，使用上述的式(Ia)的脂质(天冬氨酸作为第一氨基酸，精氨酸作为第二氨基酸部分)，在下述进行说明。
在下述的例子中，在对天冬氨酸与脂肪族醇进行酯化之前，使保护基(分别为t－Bu基、Fmoc基)附加至天冬氨酸的羧基和氨基，然后对脂肪族醇(a)和天冬氨酸(b)进行酯化。
接着，如下所述，使附加至上述的过程中得到的酯化体(c)的氨基的保护基(－Fmoc)脱离，对脱离后的酯化体(d)的氨基和精氨酸(e)的羧基进行酰胺化。在该例子中，在对精氨酸进行酰胺化之前，在精氨酸的氨基和胍基附加有保护基(分别为Fmoc基、Pbf基)。
就如上所述地得到的酰胺化体(f)而言，在该例子中具有保护基，因此通过使保护基脱离，能得到式(Ia)的脂质。
[导入化合物]
在此，本实施方式的脂质能用作用于将规定的导入化合物导入至细胞内的细胞内导入用。作为具体的导入化合物，可列举出：核酸、肽、蛋白质等。导入化合物可以采用生物学上活性的物质，可以是当送达至细胞或脏器，导入细胞内时，对细胞、脏器、或其他身体组织或者系统带来理想的变化的物质，可以对感染症、疾病、障碍、病态等的治疗、预防是有用的。
此外，导入化合物可以是细胞毒素、放射性离子、化学疗法药、疫苗、诱发免疫应答的化合物(治疗药和/或预防药)。疫苗中包含能提供对与流行性感冒、麻疹、人乳头瘤病毒(HPV)、狂犬病、髄膜炎、百日咳、破伤风、鼠疫、肝炎、结核、以及冠状病毒等感染症相关的一种以上状态的免疫的化合物和制剂。此外，疫苗中可以包含编码源自上述感染症的抗原和/或表位的核酸，具体而言可以包含mRNA。此外，疫苗中也包含诱导对癌细胞等肿瘤细胞的免疫应答的化合物和制剂，可以包含编码源自肿瘤细胞的抗原、表位和/或新表位的核酸，具体而言可以包含mRNA。诱发免疫应答的化合物中包括疫苗、皮质类固醇(例如地塞米松)、以及其他物种，但不限定于此。
在本实施方式中，作为核酸，只要是核苷酸和/或具有与该核苷酸同等功能的分子聚合而成的分子，就可以是任何分子，例如可列举出：作为核糖核苷酸的聚合物的RNA、作为脱氧核糖核苷酸的聚合物的DNA、由RNA和DNA构成的嵌合核酸、以及这些核酸的至少一个核苷酸被具有与该核苷酸同等功能的分子取代而成的核苷酸聚合物。此外，包含至少一个核苷酸和/或具有与该核苷酸同等功能的分子聚合而成的分子的衍生物也包含于本实施方式中的核酸。还可列举出：肽核酸(PNA)[Acc.Chem.Res.，32，624(1999)]、氧肽核酸(OPNA)[J.Am.Chem.Soc.，123，4653(2001)]、肽核糖核酸(PRNA)[J.Am.Chem.Soc.，122，6900(2000)]等。需要说明的是，在本实施方式中，RNA中的尿苷U和DNA中的胸腺嘧啶T各自可以替换。
作为具有与核苷酸同等功能的分子，例如可列举出核苷酸衍生物等。
在本实施方式中，作为核酸，可列举出包含信使RNA(mRNA)的核糖核酸(RNA)，mRNA编码目标多肽，所述目标多肽包含任意的天然存在或非天然存在的、或并非如此而经修饰的多肽。通过mRNA编码的多肽可以是任意的尺寸，也可以具有任意的二级结构或活性。在一些实施方式中，通过mRNA编码的多肽当在细胞内表达时能发挥治疗效果。
此外，在本实施方式中，作为核酸，优选可列举出抑制目的基因的表达的核酸，更优选可列举出具有利用了RNA干扰(RNAi)的目的基因的表达抑制作用的核酸。
在本实施方式中，作为目的基因，只要是产生mRNA而表达的基因，就没有特别限定，例如优选与肿瘤或炎症相关的基因，例如可列举出编码如下蛋白质的基因等：血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，以下简称为VEGF)、血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor，以下简称为VEGFR)、成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子受体、血小板源生长因子、血小板源生长因子受体、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、Kruppel样因子(Kruppel－like factor，以下简称为KLF)、Ets转录因子、核因子、低氧诱导因子、细胞周期相关因子、染色体复制相关因子、染色体修复相关因子、微管相关因子、生长信号通路相关因子、生长相关转录因子、细胞凋亡相关因子等，具体而言可列举出：VEGF基因、VEGFR基因、成纤维细胞生长因子基因、成纤维细胞生长因子受体基因、血小板源生长因子基因、血小板源生长因子受体基因、肝细胞生长因子基因、肝细胞生长因子受体基因、KLF基因、Ets转录因子基因、核因子基因、低氧诱导因子基因、细胞周期相关因子基因、染色体复制相关因子基因、染色体修复相关因子基因、微管相关因子基因(例如CKAP5基因等)、生长信号通路相关因子基因(例如KRAS基因等)、生长相关转录因子基因、细胞凋亡相关因子基因(例如，BCL－2基因等)等。
此外，在本实施方式中，作为目的基因，例如优选在肝脏、肺、肾脏或脾脏中表达的基因，例如可列举出：所述的与肿瘤或炎症相关的基因；B型肝炎病毒基因组；C型肝炎病毒基因组；能编码如下蛋白质的基因等：载脂蛋白(APO)、羟甲基戊二酰(HMG)CoA还原酶、KEXIN9型丝氨酸蛋白酶(PCSK9)、第十二因子、胰高血糖素受体、糖皮质激素受体、白三烯受体、血栓素A2受体、组胺H1受体、碳酸酐酶、血管紧张素转化酶、肾素、p53、酪氨酸磷酸酶(PTP)、钠依赖性葡萄糖转运载体、肿瘤坏死因子、白细胞介素等。
作为抑制目的基因的表达的核酸，例如若为包含与编码蛋白质等的基因(目的基因)的mRNA的一部分的碱基序列互补的碱基序列，并且抑制目的基因的表达的核酸，则例如可以使用siRNA(small interfering RNA：小干扰RNA)、miRNA(micro RNA：微小RNA)等双链核酸；shRNA(short hairpin RNA：短发夹RNA)、反义核酸、核酶等单链核酸等任意种核酸，优选使用双链核酸。
将包含与目的基因的mRNA的一部分的碱基序列互补的碱基序列的核酸称为反义链核酸，也将包含与反义链核酸的碱基序列互补的碱基序列的核酸称为有义链核酸。有义链核酸是指，由目的基因的一部分的碱基序列构成的核酸本身等能与反义链核酸配对而形成双链形成部的核酸。
双链核酸是指两条链配对而具有双链形成部的核酸。双链形成部是指构成双链核酸的核苷酸或其衍生物构成碱基对而形成双链的部分。构成双链形成部的碱基对通常为15～27碱基对，优选为15～25碱基对，更优选为15～23碱基对，进一步优选为15～21碱基对，特别优选为15～19碱基对。
作为双链形成部的反义链核酸，优选使用包含与目的基因的mRNA的一部分序列互补的碱基序列的核酸；或在该核酸中1～3碱基，优选为1～2碱基，更优选为1碱基置换、缺失或附加，并且具有目标蛋白的表达抑制活性的核酸。构成双链核酸的单链的核酸长度通常由15～30碱基构成，优选为15～29碱基，更优选为15～27碱基，进一步优选为15～25碱基，特别优选为17～23碱基，最优选为19～21碱基。
构成双链核酸的反义链、有义链中的任一方或两方的核酸也可以在与双链形成部连接的3’侧或5’侧具有未形成双链的追加的核酸。也将该未形成双链的部分称为突出部(单链突出端)。
作为具有突出部的双链核酸，使用在至少一个链的3’末端或5’末端具有由1～4碱基，通常由1～3碱基构成的突出部的双链核酸，优选使用具有由2碱基构成的突出部的双链核酸，更优选使用具有由dTdT或UU构成的突出部的双链核酸。突出部可以仅在反义链具有、仅在有义链具有、以及在反义链和有义链双方具有，优选使用在反义链和有义链双方具有突出部的双链核酸。
此外，可以使用与双链形成部连接，与目的基因的mRNA一部分或全部一致的序列；或与双链形成部连接，与目的基因的mRNA的互补链的碱基序列一致的序列。而且，作为抑制目的基因的表达的核酸，例如可以使用通过Dicer等核糖核酸酶的作用生成所述双链核酸的核酸分子(国际公开第2005/089287号)、不具有3’末端、5’末端的突出部的双链核酸等。
此外，在所述的双链核酸为siRNA的情况下，反义链的从5’末端侧朝向3’末端侧至少第1～17个碱基的序列为与目的基因的mRNA的连续17碱基的序列互补的碱基的序列，优选的是，该反义链的从5’末端侧朝向3’末端侧第1～19个碱基的序列为与目的基因的mRNA的连续19碱基的序列互补的碱基的序列；或第1～21个碱基的序列为与目的基因的mRNA的连续21碱基的序列互补的碱基的序列；或第1～25个碱基的序列为与目的基因的mRNA的连续25碱基的序列互补的碱基的序列。
而且，在本实施方式中，在核酸为siRNA的情况下，优选该核酸中的糖的10～70％，更优选15～60％，进一步优选20～50％为在2’位处被修饰基团取代的核糖。在本实施方式中，在核糖的2’位处被修饰基团取代是指，2’位的羟基被取代为修饰基团，立体构型与核糖的2’位的羟基可以相同也可以不同，优选立体构型与核糖的2’位的羟基相同。在2’位处被修饰基团取代的核糖包含于糖部修饰核苷酸中的2’－修饰核苷酸中，在2’位处被修饰基团取代的核糖的修饰基团与2’－修饰核苷酸的修饰基团含义相同。
在本实施方式中，核酸中包含：核酸的结构中的磷酸部、酯部等所包含的氧原子等例如被取代为硫原子等其他原子而成的衍生物。
此外，就与反义链和有义链的5’末端的碱基键合的糖而言，也可以是，各自的5’位的羟基通过磷酸基或者所述的修饰基团、或利用生物体内的核酸分解酶等转换为磷酸基或者所述的修饰基团的基团进行修饰。
此外，就与反义链和有义链的3’末端的碱基键合的糖而言，也可以是，各自的3’位的羟基通过磷酸基或者所述的修饰基团、或利用生物体内的核酸分解酶等转换为磷酸基或者所述的修饰基团的基团进行修饰。
作为单链的核酸，只要是由目的基因的连续15～27碱基，优选为15～25碱基，更优选为15～23碱基，进一步优选为15～21碱基，特别优选为15～19碱基构成的序列的互补序列构成的核酸；或在该核酸中1～3碱基，优选为1～2碱基，更优选为1碱基置换、缺失或附加，并且具有目标蛋白的表达抑制活性的核酸即可。优选使用该单链的核酸长度为15～30碱基以下，优选为15～29碱基，更优选为15～27碱基，进一步优选为15～25碱基，特别优选为15～23碱基的单链核酸。
作为单链核酸，可以使用将构成上述的双链核酸的反义链和有义链经由间隔物序列(间隔寡聚核苷酸)连结而成的单链核酸。作为间隔寡聚核苷酸，优选6～12碱基的单链核酸分子，优选其5’末端侧的序列为两个U。作为间隔寡聚核苷酸的例子，可列举出由UUCAAGAGA序列构成的核酸。就通过间隔寡聚核苷酸而连接的反义链和有义链的顺序而言，任一者均可以成为5’侧。作为该单链核酸，优选通过茎环结构而具有双链形成部的shRNA等单链核酸。shRNA等单链核酸通常为50～70碱基长度。
可以使用设计为通过核糖核酸酶等的作用生成上述的单链核酸或双链核酸的、70碱基长度以下，优选为50碱基长度以下，进一步优选为30碱基长度以下的核酸。
需要说明的是，在本实施方式中使用的核酸使用已知的RNA或DNA合成法以及RNA或DNA修饰法来制造即可。
[组合物]
接着，对本实施方式的组合物进行说明。
本实施方式的组合物含有上述的式(I)所示的脂质和上述的导入化合物，更具体而言，可以包含多个式(I)所示的脂质集合而形成，内部包含导入化合物的脂质纳米粒子。
本实施方式的组合物也可以组合含有式(I)所示的脂质的两种以上，或者只要在不损害导入化合物的细胞内导入效率、低细胞毒性等本发明的优点的范围内，也可以进一步含有上述式(I)所示的脂质以外的分子，例如，两亲性分子(例如磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷酯酰乙醇胺、磷脂酰胆碱等源自生物体膜的磷脂等)、阳离子性脂质分子、表面活性剂(例如CHAPS、胆酸钠、辛基葡萄糖苷、N－D－葡糖－N－甲基烷酰胺类等)、聚乙二醇修饰脂质、糖脂、肽脂质、蛋白质、固醇等。
需要说明的是，作为聚乙二醇修饰脂质，可列举出：PEG2000－DMG(PEG2000－二肉豆蔻基甘油)、PEG2000－DPG(PEG2000－二棕榈酰甘油)、PEG2000－DSG(PEG2000－二硬脂酰甘油)、PEG5000－DMG(PEG5000－二肉豆蔻基甘油)、PEG5000－DPG(PEG5000－二棕榈酰甘油)、PEG5000－DSG(PEG5000－二硬脂酰甘油)、PEG－cDMA(N－[(甲氧基(乙二醇)2000)氨基甲酰基]－1，2－二肉豆蔻氧基丙基－3－胺)、PEG－C－DOMG(R－3－[(ω－甲氧基－聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基]－1，2－二肉豆蔻氧基丙基－3－胺)、聚乙二醇(PEG)－二酰甘油(DAG)、PEG－二烷基氧基丙基(DAA)、PEG－磷脂、PEG－神经酰胺(Cer)等。聚乙二醇修饰脂质可以单独使用一种或混合使用两种以上。
作为固醇，可列举出：胆固醇、二氢胆固醇、羊毛固醇、β－谷固醇、菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、麦角固醇、岩藻固醇、3β－[N－(N’，N’－二甲基氨基乙基)氨基甲酰基]胆固醇(DC－Chol)等。固醇可以单独使用一种，或混合使用两种以上。
在本实施方式中，脂质纳米粒子的形成可以通过上述的式(I)所示的脂质集合而组织化来形成。在此“组织化”是指，包含上述式(I)所示的脂质和可以任意地含有的、式(I)所示的脂质以外的分子的构成分子彼此经由疏水键等非共价键而集合。作为经组织化的集合体，包括构成分子的疏水部彼此疏水键合而形成的双层膜、脂质体、多泡体(multiplevesicular)、绳状缔合体、盘状缔合体、层状缔合体、杆状缔合体等以及它们的混合物。可以通过在组织化的过程中，在内部包含导入化合物来得到脂质纳米粒子。
本实施方式的组合物除了含有上述成分以外，还可以含有蔗糖、葡萄糖、山梨糖、乳糖等糖；谷氨酰胺、谷氨酸、谷氨酸钠、组氨酸等氨基酸；柠檬酸、磷酸、乙酸、乳酸、碳酸、酒石酸等酸的盐等作为其他添加剂。
本实施方式的组合物也可以制剂化为医药组合物。作为医药组合物的剂型，例如可列举出注射剂。
本实施方式的组合物例如可以是通过冻干等去除了溶剂的粉末状态，也可以是液体状态。在组合物是粉末状态的情况下，可以在使用前使其悬浮或溶解于药学上可接受的介质中制成注射剂来使用。在组合物是液体状态的情况下，保持该状态或使其溶解于药学上可接受的介质中制成注射剂来使用。
作为药学上可接受的介质，可列举出：灭菌水；生理盐水；包含葡萄糖、D－山梨糖醇、D－甘露糖、D－甘露糖醇、氯化钠等辅助药的等渗液等。本实施方式的组合物也可以进一步含有：乙醇、丙二醇、聚乙二醇等醇等溶解辅助剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂等添加剂。
就本实施方式的组合物的脂质纳米粒子的粒径而言，可以计算出平均粒径，脂质纳米粒子的粒径(平均粒径)优选为250nm以下，更优选为200nm以下，进一步优选为150nm以下，更进一步优选为130nm以下，最优选为120nm以下。此外，脂质纳米粒子的粒径(平均粒径)优选为10nm以上，更优选为30nm以上。
此外，脂质纳米粒子的多分散指数(PDI：Polymer Dispersity Index)优选为0.4以下，更优选为0.3以下，进一步优选为0.2以下。
通过粒径和/或多分散指数为上述范围，能容易地到达生物体内的靶细胞或组织等对象。
平均粒径、多分散指数可以通过实施例栏中记载的方法来测定。
从抑制非特异性的吸附、免疫反应的观点考虑，实施方式的组合物例如优选在pH7.4的Tris－HCl中测定出的组合物的电荷低。
在pH7.4的Tris－HCl中测定出的组合物的电荷可以通过实施例栏中记载的方法来测定。
本实施方式的组合物的脂质纳米粒子没有特别限定，可以通过公知的方法来形成。
作为组合物的制造方法，例如包括如下工序：制备包含导入化合物的柠檬酸缓冲液等水溶液和至少含有本实施方式的脂质的含极性有机溶剂的溶液的工序；将水溶液和含极性有机溶剂的溶液混合，得到混合液的工序；以及去除混合液中的极性有机溶剂的工序。根据该组合物的制造方法，能得到包含在内部高效地封入有导入化合物的脂质纳米粒子的组合物。
在含极性有机溶剂的溶液中，除了含有本实施方式的脂质以外的分子，例如也可以进一步含有：两亲性分子(例如磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷酯酰乙醇胺、磷脂酰胆碱等源自生物体膜的磷脂等)、阳离子性脂质分子、表面活性剂(例如CHAPS、胆酸钠、辛基葡萄糖苷、N－D－葡糖－N－甲基烷酰胺类等)、聚乙二醇修饰脂质、糖脂、肽脂质、蛋白质、胆固醇等固醇等。
此外，作为含极性有机溶剂的溶液的极性有机溶剂，没有特别限定，从溶剂的极性、形成脂质纳米粒子后的溶剂的去除容易性的观点考虑，例如可列举出乙醇、叔丁醇等醇。
得到混合液的工序例如可以使用漩涡混合器、微流路来进行。此外，通过得到混合液的工序，能在混合液中形成在内部封入有导入化合物的脂质纳米粒子。
在去除极性有机溶剂的工序中，例如可以通过透析过滤、超滤或减压下的蒸发来降低极性有机溶剂的含量。
需要说明的是，也可以在得到混合液的工序和降低极性有机溶剂的含量的工序之间进行培养工序。
在本实施方式中，例如，可以通过对包括人的哺乳动物静脉内投给本实施方式的组合物，例如送达至产生癌或炎症的脏器或部位，将本实施方式的组合物中的核酸等导入化合物导入至送达脏器或部位的细胞内。作为产生癌或炎症的脏器或部位，没有特别限定，例如可列举出：胃、大肠、肝脏、肺、脾脏、胰脏、肾脏、膀胱、皮肤、血管、眼球等。此外，可以通过对包括人的哺乳动物静脉内投给将本实施方式的组合物，例如送达至血管、肝脏、肺、脾脏和/或肾脏，将本实施方式的组合物中的导入化合物导入至送达脏器或部位的细胞内。肝脏、肺、脾脏和/或肾脏的细胞可以是正常细胞、与癌或炎症相关的细胞或与其他疾病相关的细胞中的任意者。
本实施方式的组合物中的导入化合物为核酸，若核酸为具有利用了RNA干扰(RNAi)的目的基因的表达抑制作用的核酸，则能将抑制基因的表达的核酸等导入至哺乳类的细胞内，能抑制基因等的表达。投给对象优选为人。
此外，若本实施方式的组合物中目的基因例如为与肿瘤或炎症相关的基因，则可以将本实施方式的组合物用作癌或炎症疾病的治疗剂或预防剂，优选用作实体癌或血管或者血管附近的炎症的治疗剂或预防剂。具体而言，若本实施方式的组合物中的目的基因为与血管新生相关的基因等，则能抑制血管平滑肌的生长、血管新生等，因此能将本实施方式的组合物例如用作与血管平滑肌的生长、血管新生相伴的癌或炎症疾病的治疗剂或预防剂。
即，在本实施方式中，也提供将上述说明的本实施方式的组合物对哺乳动物投给的、癌或炎症疾病的治疗方法。投给对象优选为人，更优选为罹患癌或炎症疾病的人。
本实施方式的组合物例如也可以用作以如下内容为目的的制剂：血液成分等生物体成分(例如血液、消化管等)中的所述核酸的稳定化、副作用的减少或向包括目的基因的表达部位的组织或脏器的药剂聚集性的增大等。
而且，本实施方式的组合物中的导入化合物为核酸，若核酸为编码源自感染症、肿瘤细胞的抗原等的mRNA，则能指向为引发特异性免疫应答，因此，能应用于开发如下mRNA疫苗：用于包括感染症、肿瘤的广泛种类疾病的广泛的治疗性和预防性mRNA疫苗。
作为本实施方式的组合物的投给路径，理想的是，使用治疗时最有效的投给路径，可列举出：口腔内、气道内、直肠内、皮下、皮内、肌肉内或静脉内等非经口投给或经口投给，优选的是，可列举出静脉内投给或肌肉内投给。此外，在将本实施方式的组合物用作mRNA疫苗的情况下优选肌肉内投给。
组合物的投给量也根据投给对象、对象脏器、症状、投给方法而不同。
以上，对本发明的实施方式进行了说明，但本发明的脂质和组合物不限定于上述的例子，可以在本发明的脂质和组合物中加入适当变更。
实施例
以下，通过实施例对本发明进一步详细地进行说明，以下的实施例用于举例示出本发明，不应被解释为限定。需要说明的是，最终产物、中间体、以及起始物质的结构例如可以通过标准的分析方法，例如MS或NMR进行确认。在下述的实施例中使用的简称是本领域技术人员公知的惯用的简称。以下示出一些简称。
DCC：二环己基碳化二亚胺。
DMAP：N，N－二甲基－4－氨基吡啶。
TEA：三乙基胺。
THF：四氢呋喃。
TFA：三氟乙酸。
MsCl：甲磺酰氯。
1HNMR谱利用日本电子株式会社制核磁共振装置，JNM－ECZ400S，400MHz的分光计进行了记录。全部化学位移以相对于氯仿的百万分率(δ)来报告。以下的简称用于表示信号图案：S＝单峰、d＝双峰、t＝三重峰、q＝四重峰、quin＝五重峰、M＝多重峰、br＝宽峰。
MS数据使用高效液相色谱串联型质谱仪(装置名：UPLC－MS/MS系统ACQUITY TQD；Nihon Waters株式会社制)，在ESI+的离子模式下进行了测定。测定条件设为毛细管电压4.0kV、锥孔电压30V、源温度100℃、脱溶剂气温度250℃。
＜脂质的合成＞
合成了以下示出的实施例和比较例的脂质。
[实施例1]
3－(2－氨基－5－胍基戊酰胺)－4－(((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)氧基)－4－氧代丁酸(以下，也称为脂质(Ia))的合成
脂质(Ia)的脂质亲和性区域为碳原子数36个的烃基，亲水性区域为源自Asp(第一氨基酸)、Arg(第二氨基酸)的二肽。以下对脂质(Ia)的合成方法进行说明。
工序(a1)：N－甲氧基－N－羟甲基酰胺的合成
将油酸(42.4g，150mmol)、DMAP(2.75g，22.5mmol)、N，O－二甲基羟基胺盐酸盐(21.9g，225mmol)溶解于二氯甲烷(150mL)中。在室温下搅拌至第二天后，用水进行急冷，通过过滤去除析出的二环己基脲。将浓缩滤液而得到的残渣溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，定量地得到了目标N－甲氧基－N－羟甲基酰胺。
工序(a2)：(Z)－十八碳－9－烯－1－基甲磺酸的合成
向将油醇(100.0g，372.45mmol)、TEA(113.07g，1.117mmol)溶解于THF(900mL)中冷却至0℃而得到的溶液中添加MsCl(63.9g，558.7mmol)。添加后升温至室温，在室温下反应2小时。反应结束后，在减压下浓缩二氯甲烷和三乙胺，将所得到的残渣溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，定量地得到了目标(Z)－十八碳－9－烯－1－基甲磺酸。
工序(a3)：(Z)－1－溴十八碳－9－烯的合成
将上述的工序(a2)中得到的(Z)－十八碳－9－烯－1－基甲磺酸(135g，390mmol)、溴化锂(161g，1850mmol)溶解于丙酮(300mL)中，在回流下反应1小时。反应结束后，在减压下浓缩溶剂，将所得到的残渣溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，定量地得到了目标(Z)－1－溴十八碳－9－烯。
工序(a4)：(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－酮的合成
向镁(3.73g，154mmol)、二乙醚(25mL)中，一边搅拌一边滴加工序(a3)中得到的(Z)－1－溴十八碳－9－烯(40.7g，123mmol)的二乙醚(250mL)溶液。滴加结束后搅拌1小时，接着滴加工序(a1)中得到的N－甲氧基－N－羟甲基酰胺(20g，61.4mmol)的二乙醚(125mL)溶液。将利用薄层色谱法(TLC)确认到原料消失的时间点设为反应结束。反应结束后，向反应体系中加入水进行急冷，利用乙酸乙酯进行萃取，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，定量地得到了目标(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－酮。
工序(a5)：(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－醇的合成
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向将工序(a4)中得到的(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－酮(31.9g，61.7mmol)溶解于THF(120mL)、甲醇(120mL)中而得到的溶液中添加硼氢化钠(11.7g，309mmol)，使其反应。反应结束后，在减压下浓缩溶剂，将所得到的残渣溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，定量地得到了目标(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－醇。
工序(a6)：4－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)天冬氨酸酯的合成
将工序(a5)中得到的(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－醇(4.0g，7.7mmol)、预先在天冬氨酸的氨基和羧基附加有保护基(分别为Fmoc基、tBu基)而得到的Fmoc－Asp(tBu)－OH(3.8g，9.2mmol)、DCC(2.3g，11.5mmol)以及DMAP(0.28g，2.3mmol)溶解于二氯甲烷(15mL)中。在室温下搅拌至第二天后，用水进行急冷，通过过滤去除析出的二环己基脲。将浓缩滤液而得到的残渣溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标4－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)天冬氨酸酯(3.5g，3.8mmol，50％)。
工序(a7)：4－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)天冬氨酸酯的合成
将工序(a6)中得到的4－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)天冬氨酸酯(3.0g，3.3mmol)溶解于20％哌啶/DMF溶液(40mL)中。在室温下搅拌至第二天后，在减压下浓缩溶剂。使残渣分散于乙酸乙酯中，通过过滤去除析出物。将滤液溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标4－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)天冬氨酸酯(1.2g，1.7mmol，53％)。
工序(a8)：4－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)N2－(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)－Nw－((2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)磺酰基)精氨酰天冬氨酸酯的合成
将工序(a7)中得到的4－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)天冬氨酸酯(1.0g，1.4mmol)、Fmoc－Arg(Pbf)－OH(1.88g，2.9mmol)(TCI制)以及DCC(0.42g，2.9mmol)溶解于二氯甲烷(9mL)中。在室温下搅拌至第二天后，用水进行急冷，通过过滤去除析出的二环己基脲。将浓缩滤液而得到的残渣溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标4－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)N2－(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)－Nw－((2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)磺酰基)精氨酰天冬氨酸酯(1.8g，1.4mmol，94％)。
工序(a9)：4－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)Nw－((2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)磺酰基)精氨酰天冬氨酸酯的合成
将工序(a8)中得到的4－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)N2－(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)－Nw－((2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)磺酰基)精氨酰天冬氨酸酯(1.8g，1.4mmol)溶解于20％哌啶/DMF溶液(6mL)中。在室温下搅拌至第二天后，在减压下浓缩溶剂。使残渣分散于乙酸乙酯中，通过过滤去除析出物。将滤液溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标4－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)Nw－((2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)磺酰基)精氨酰天冬氨酸酯(0.9g，1.1mmol，73％)。
工序(a10)：3－(2－氨基－5－胍基戊酰胺)－4－(((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)氧基)－4－氧代丁酸(脂质(Ia))的合成
将工序(a9)中得到的4－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)Nw－((2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)磺酰基)精氨酰天冬氨酸酯(0.9g，1.1mmol)溶解于TFA(10mL)中。在室温下搅拌1小时后，在减压下浓缩溶剂。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/甲醇)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标3－(2－氨基－5－胍基戊酰胺)－4－(((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)氧基)－4－氧代丁酸(脂质(Ia))(0.3g，0.37mmol，36％)。
1H－NMR(400MHz，CHLOROFORM－D)δ5.47－5.13(4H)，4.93－4.61(2H)，4.13－3.73(1H)，3.36－2.90(2H)，2.89－2.42(2H)，2.11－1.76(10H)，1.57－1.42(6H)，1.42－0.98(46H)，0.98－0.25(6H)。
[C46H87N5O5H]+：790.73。
[实施例2]
4－(2－氨基－5－胍基戊酰胺)－5－(((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)氧基)－5－氧代戊酸(以下也称为脂质(Ib))的合成
脂质(Ib)是将脂质(Ia)的第一氨基酸变更为Glu而成的脂质。以下，对脂质(Ib)的合成方法进行说明。需要说明的是，合成工序中的合成脂质亲和性区域的工序与脂质(Ia)的工序(a1)～工序(a5)的工序相同，因此省略。
工序(b6)：5－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)谷氨酸酯的合成
将工序(a5)中得到的(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－醇(3.0g，5.7mmol)、预先在谷氨酸的氨基和羧基附加有保护基(分别为Fmoc基、tBu基)而得到的Fmoc－Glu(tBu)－OH(4.92g，11.5mmol)、DCC(2.6g，13mmol)以及DMAP(0.24g，1.9mmol)溶解于二氯甲烷(40mL)中。在室温下搅拌至第二天后，用水进行急冷，通过过滤去除析出的二环己基脲。将浓缩滤液而得到的残渣溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标5－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)谷氨酸酯(6.8g，7.6mmol，79％)。
工序(b7)：5－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)谷氨酸酯的合成
将工序(b6)中得到的5－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)谷氨酸酯(3.6g，3.8mmol)溶解于20％哌啶/DMF溶液(40mL)中。在室温下搅拌至第二天后，在减压下浓缩溶剂。使残渣分散于乙酸乙酯中，通过过滤去除析出物。将滤液溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标5－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)谷氨酸酯(1.6g，2.3mmol，58％)。
工序(b8)：5－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)N2－(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)－Nw－((2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)磺酰基)精氨酰谷氨酸酯的合成
将工序(b7)中得到的5－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)谷氨酸酯(1.6g，2.3mmol)、预先在精氨酸的氨基和胍基附加有保护基(分别为Fmoc基、Pbf基)而得到的Fmoc－Arg(Pbf)－OH(2.95g，4.5mmol)以及DCC(0.65g，4.5mmol)溶解于二氯甲烷(10mL)中。在室温下搅拌至第二天后，用水进行急冷，通过过滤去除析出的二环己基脲。将浓缩滤液而得到的残渣溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标5－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)N2－(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)－Nw－((2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)磺酰基)精氨酰谷氨酸酯(2.8g，2.1mmol，92％)。
工序(b9)：5－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)Nw－((2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)磺酰基)精氨酰谷氨酸酯的合成
将工序(b8)中得到的5－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)N2－(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)－Nw－((2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)磺酰基)精氨酰谷氨酸酯(2.8g，2.1mmol)溶解于20％哌啶/DMF溶液(6mL)中。在室温下搅拌至第二天后，在减压下浓缩溶剂。使残渣分散于乙酸乙酯中，通过过滤去除析出物。将滤液溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标5－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)Nw－((2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)磺酰基)精氨酰谷氨酸酯(1.2g，1.4mmol，68％)。
工序(b10)：4－(2－氨基－5－胍基戊酰胺)－5－(((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)氧基)－5－氧代戊酸(脂质(Ib))的合成
将工序(b9)中得到的5－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)Nw－((2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)磺酰基)精氨酰谷氨酸酯(1.2g，1.4mmol)溶解于TFA(10mL)中。在室温下搅拌1小时后，在减压下浓缩溶剂。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/甲醇)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标4－(2－氨基－5－胍基戊酰胺)－5－(((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)氧基)－5－氧代戊酸(脂质(Ib))(0.3g，0.37mmol，27％)。
1H－NMR(400MHz，CHLOROFORM－D)δ5.43－5.19(4H)，5.09－4.96(1H)，4.91－4.74(1H)，4.69－4.46(1H)，3.71－3.52(2H)，3.33－2.99(2H)，2.58－2.31(2H)，2.03－1.84(8H)，1.81－1.69(2H)，1.68－1.42(6H)，1.41－0.98(46H)，0.96－0.71(6H)。
[C47H89N5O5H]+：804.75。
[实施例3]
(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基精氨酰组氨酸酯(以下，也称为脂质(Ic))的合成
脂质(Ic)是将脂质(Ia)的第一氨基酸变更为His而成的脂质。以下，对脂质(Ic)的合成方法进行说明。需要说明的是，合成工序中的合成脂质亲和性区域的工序与脂质(Ia)的工序(a1)～工序(a5)的工序相同，因此省略。
工序(c6)：(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基Na－(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)－Nt－三苯甲基组氨酸酯的合成
将工序(a5)中得到的(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－醇(3.0g，5.8mmol)、预先在组氨酸的氨基和咪唑基附加有保护基(分别为Fmoc基、Trt基)而得到的Fmoc－His(Trt)－OH(4.3g，6.9mmol)、DCC(1.8g，8.6mmol)以及DMAP(0.10g，0.58mmol)溶解于二氯甲烷(30mL)中。在室温下搅拌至第二天后，用水进行急冷，通过过滤去除析出的二环己基脲。将浓缩滤液而得到的残渣溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基Na－(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)－Nt－三苯甲基组氨酸酯(3.8g，3.4mmol，58％)。
工序(c7)：(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基－Nt－三苯甲基组氨酸酯的合成
将工序(c6)中得到的(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基Na－(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)－Nt－三苯甲基组氨酸酯(3.8g，3.4mmol)溶解于20％哌啶/DMF溶液(40mL)中。在室温下搅拌至第二天后，在减压下浓缩溶剂。使残渣分散于乙酸乙酯中，通过过滤去除析出物。将滤液溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基－Nt－三苯甲基组氨酸酯(2.0g，2.2mmol，53％)。
工序(c8)：(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基Na－(N2－(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)－Nw－(2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)精氨酰)－Nt－三苯甲基组氨酸酯的合成
将工序(c7)中得到的(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基－Nt－三苯甲基组氨酸酯(2.2g，3.0mmol)、预先在精氨酸的氨基和胍基附加有保护基(分别为Fmoc基、Pbf基)而得到的Fmoc－Arg(Pbf)－OH(1.7g，2.6mmol)、DCC(0.67g，3.5mmol)以及DMAP(27mg，0.10mmol)溶解于二氯甲烷(20mL)中。在室温下搅拌至第二天后，用水进行急冷，通过过滤去除析出的二环己基脲。将浓缩滤液而得到的残渣溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基Na－(N2－(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)－Nw－(2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)精氨酰)－Nt－三苯甲基组氨酸酯(2.3g，1.6mmol，72％)。
工序(c9)：(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基Na－(Nw－(2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)精氨酰)－Nt－三苯甲基组氨酸酯的合成
将工序(c8)中得到的(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基Na－(N2－(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)－Nw－(2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)精氨酰)－Nt－三苯甲基组氨酸酯(2.3g，1.6mmol)溶解于20％哌啶/DMF溶液(6mL)中。在室温下搅拌至第二天后，在减压下浓缩溶剂。使残渣分散于乙酸乙酯中，通过过滤去除析出物。将滤液溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基Na－(Nw－(2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)精氨酰)－Nt－三苯甲基组氨酸酯(1.5g，1.2mmol，75％)。
工序(c10)：(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基精氨酰组氨酸酯(脂质(Ic))的合成
将工序(c9)中得到的(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基Na－(Nw－(2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)精氨酰)－Nt－三苯甲基组氨酸酯(1.5g，1.2mmol)溶解于TFA(10mL)中。在室温下搅拌1小时后，在减压下浓缩溶剂。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/甲醇)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基精氨酰组氨酸酯(脂质(Ic))(0.2g，0.26mmol，22％)。
1H－NMR(400MHz，CHLOROFORM－D)δ7.86－7.44(1H)，7.09－6.74(1H)，5.40－5.22(4H)，4.91－4.78(1H)，4.16－3.97(1H)，3.78－3.31(3H)，3.27－3.06(2H)，2.10－1.84(8H)，1.84－1.60(2H)，1.60－1.47(6H)，1.36－1.00(46H)，0.93－0.76(6H)。
[C48H89N7O3H]+：812.74。
[实施例4]
(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基(2S)－2－((S)－2－氨基－5－胍基戊酰胺)－3－羟基丙酸酯(以下，也称为脂质(Id))的合成
脂质(Id)是将脂质(Ia)的第一氨基酸变更为Ser而成的脂质。以下，对脂质(Id)的合成方法进行说明。需要说明的是，合成工序中的合成脂质亲和性区域的工序与脂质(Ia)的工序(a1)～工序(a5)的工序相同，因此省略。
工序(d6)：(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基N－(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)－O－(叔丁基)丝氨酸酯的合成
将工序(a5)中得到的(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－醇(3.0g，5.7mmol)、预先在丝氨酸的氨基和羟基附加有保护基(分别为Fmoc基、tBu基)而得到的Fmoc－Ser(tBu)－OH(2.7g，6.9mmol)、DCC(1.8g，8.7mmol)以及DMAP(70mg，0.58mmol)溶解于二氯甲烷(30mL)中。在室温下搅拌至第二天后，用水进行急冷，通过过滤去除析出的二环己基脲。将浓缩滤液而得到的残渣溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基N－(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)－O－(叔丁基)丝氨酸酯(3.7g，4.2mmol，72％)。
工序(d7)：(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基O－(叔丁基)丝氨酸酯的合成
将工序(d6)中得到的(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基N－(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)－O－(叔丁基)丝氨酸酯(3.7g，4.2mmol)溶解于20％哌啶/DMF溶液(40mL)中。在室温下搅拌至第二天后，在减压下浓缩溶剂。使残渣分散于乙酸乙酯中，通过过滤去除析出物。将滤液溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基O－(叔丁基)丝氨酸酯(2.4g，3.6mmol，86％)。
工序(d8)：(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基N－(N2－(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)－Nw－(2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)精氨酰)－O－(叔丁基)丝氨酸酯的合成
将工序(d7)中得到的(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基O－(叔丁基)丝氨酸酯(2.4g，3.6mmol)、预先在精氨酸的氨基和胍基附加有保护基(分别为Fmoc基、Pbf基)而得到的Fmoc－Arg(Pbf)－OH(2.8g，4.3mmol)、DCC(1.1g，5.4mmol)以及DMAP(44mg，0.36mmol)溶解于二氯甲烷(24mL)中。在室温下搅拌至第二天后，用水进行急冷，通过过滤去除析出的二环己基脲。将浓缩滤液而得到的残渣溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基N－(N2－(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)－Nw－(2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)精氨酰)－O－(叔丁基)丝氨酸酯(3.0g，2.4mmol，68％)。
工序(d9)：(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基O－(叔丁基)－N－(Nw－(2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)精氨酰)丝氨酸酯的合成
将工序(a8)中得到的(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基N－(N2－(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)－Nw－(2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)精氨酰)－O－(叔丁基)丝氨酸酯(3.0g，2.4mmol)溶解于20％哌啶/DMF溶液(6mL)中。在室温下搅拌至第二天后，在减压下浓缩溶剂。使残渣分散于乙酸乙酯中，通过过滤去除析出物。将滤液溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基O－(叔丁基)－N－(Nw－(2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)精氨酰)丝氨酸酯(1.8g，1.8mmol，72％)。
工序(d9)：(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基精氨酰丝氨酸酯(脂质(Id))的合成
将工序(d8)中得到的(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基O－(叔丁基)－N－(Nw－(2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)精氨酰)丝氨酸酯(1.8g，1.8mmol)溶解于TFA(10mL)中。在室温下搅拌1小时后，在减压下浓缩溶剂。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/甲醇)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基精氨酰丝氨酸酯(脂质(Id))(0.20g，0.26mmol，15％)。
1H－NMR(400MHz，CHLOROFORM－D)δ5.33(dd，4H)，4.81(s，2H)，4.70－3.46(m，3H)，3.46－2.81(m，2H)，2.27－1.85(m，10H)，1.85－1.37(m，6H)，1.37－0.93(m，46H)，0.87(td，6H)。
[C45H87N5O4H]+：762.92。
[实施例5]
(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基(2S)－2－((S)－2－氨基－5－胍基戊酰胺)－3－羟基丁酸酯(以下，也称为脂质(Ie))的合成
脂质(Ie)是将脂质(Ia)的第一氨基酸变更为Thr而成的脂质。以下，对脂质(Ie)的合成方法进行说明。需要说明的是，合成工序中的合成脂质亲和性区域的工序与脂质(Ia)的工序(a1)～工序(a5)的工序相同，因此省略。
工序(e6)：(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基(2S)－2－((((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)氨基)－3－(叔丁氧基)丁酸酯的合成
将工序(a5)中得到的(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－醇(5.0g，9.6mmol)、预先在苏氨酸的氨基和羟基附加有保护基(分别为Fmoc基、tBu基)而得到的Fmoc－Thr(tBu)－OH(4.6g，12mmol)、DCC(2.6g，13mmol)以及DMAP(0.24g，1.9mmol)溶解于二氯甲烷(40mL)中。在室温下搅拌至第二天后，用水进行急冷，通过过滤去除析出的二环己基脲。将浓缩滤液而得到的残渣溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基(2S)－2－((((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)氨基)－3－(叔丁氧基)丁酸酯(6.8g，7.6mmol，79％)。
工序(e7)：(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基(2S)－2－氨基－3－(叔丁氧基)丁酸酯的合成
将工序(e6)中得到的(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基(2S)－2－((((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)氨基)－3－(叔丁氧基)丁酸酯(5.0g，5.6mmol)溶解于20％哌啶/DMF溶液(40mL)中。在室温下搅拌至第二天后，在减压下浓缩溶剂。使残渣分散于乙酸乙酯中，通过过滤去除析出物。将滤液溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基(2S)－2－氨基－3－(叔丁氧基)丁酸酯(2.0g，3.0mmol，53％)。
工序(e8)：(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基(2S)－3－(叔丁氧基)－2－((S)－2－((叔丁氧基羰基)氨基)－5－(3－((2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)磺酰基)胍基)戊酰胺)丁酸酯的合成
将工序(e7)中得到的(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基(2S)－2－氨基－3－(叔丁氧基)丁酸酯(2.0g，3.0mmol)、预先在精氨酸的氨基和胍基附加有保护基(分别为Boc基、Pbf基)而得到的Boc－Arg(Pbf)－OH(1.7g，3.3mmol)、DCC(0.73g，3.5mmol)以及DMAP(36mg，0.30mmol)溶解于二氯甲烷(20mL)中。在室温下搅拌至第二天后，用水进行急冷，通过过滤去除析出的二环己基脲。将浓缩滤液而得到的残渣溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基(2S)－3－(叔丁氧基)－2－((S)－2－((叔丁氧基羰基)氨基)－5－(3－((2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)磺酰基)胍基)戊酰胺)丁酸酯(3.1g，2.6mmol，88％)。
工序(e9)：(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基(2S)－2－((S)－2－氨基－5－胍基戊酰胺)－3－羟基丁酸酯(脂质(Ie))的合成
将工序(e8)中得到的(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基(2S)－3－(叔丁氧基)－2－((S)－2－((叔丁氧基羰基)氨基)－5－(3－((2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)磺酰基)胍基)戊酰胺)丁酸酯(2.0g，1.7mmol)溶解于TFA(10mL)中。在室温下搅拌1小时后，在减压下浓缩溶剂。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/甲醇)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基(2S)－2－((S)－2－氨基－5－胍基戊酰胺)－3－羟基丁酸酯(脂质(Ie))(0.3g，0.38mmol，20％)。
1H－NMR(400MHz，CHLOROFORM－D)δ5.45－5.19(4H)，4.88－4.76(1H)，4.45－4.32(1H)，4.30－4.10(2H)，3.28－2.98(2H)，2.16－1.88(10H)，1.88－1.62(2H)，1.62－1.48(4H)，1.39－0.94(49H)，0.93－0.78(6H)。
[C46H89N5O4H]+：776.72。
[实施例6]
(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基精氨酰蛋氨酸酯(以下，也称为脂质(If))的合成
脂质(If)是将脂质(Ia)的第一氨基酸变更为Met而成的脂质。以下，对脂质(If)的合成方法进行说明。需要说明的是，合成工序中的合成脂质亲和性区域的工序与脂质(Ia)的工序(a1)～工序(a5)的工序相同，因此省略。
工序(f6)：(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)蛋氨酸酯的合成
将工序(a5)中得到的(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－醇(3.0g，5.8mmol)、预先在蛋氨酸的氨基附加有保护基(Fmoc基)而得到的Fmoc－Met－OH(2.7g，6.9mmol)、DCC(1.8g，8.7mmol)以及DMAP(70mg，0.58mmol)溶解于二氯甲烷(30mL)中。在室温下搅拌至第二天后，用水进行急冷，通过过滤去除析出的二环己基脲。将浓缩滤液而得到的残渣溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)蛋氨酸酯(2.9g，3.4mmol，58％)。
工序(f7)：(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基蛋氨酸酯的合成
将工序(f6)中得到的(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)蛋氨酸酯(2.9g，3.4mmol)溶解于20％哌啶/DMF溶液(15mL)中。在室温下搅拌至第二天后，在减压下浓缩溶剂。使残渣分散于乙酸乙酯中，通过过滤去除析出物。将滤液溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基蛋氨酸酯(1.9g，2.9mmol，87％)。
工序(f8)：(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基N2－(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)－Nw－(2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)精氨酰蛋氨酸酯的合成
将工序(f7)中得到的(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基蛋氨酸酯(1.9g，2.9mmol)、预先在精氨酸的氨基和胍基附加有保护基(分别为Fmoc基、Pbf基)而成的Fmoc－Arg(Pbf)－OH(2.3g，3.5mmol)、DCC(0.90g，4.4mmol)以及DMAP(36mg，0.29mmol)溶解于二氯甲烷(30mL)中。在室温下搅拌至第二天后，用水进行急冷，通过过滤去除析出的二环己基脲。将浓缩滤液而得到的残渣溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基N2－(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)－Nw－(2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)精氨酰蛋氨酸酯(2.6g，2.1mmol，71％)。
工序(f9)：(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基Nw－(2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)精氨酰蛋氨酸酯的合成
将工序(f8)中得到的(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基N2－(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)－Nw－(2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)精氨酰蛋氨酸酯(2.6g，2.1mmol)溶解于20％哌啶/DMF溶液(15mL)中。在室温下搅拌至第二天后，在减压下浓缩溶剂。使残渣分散于乙酸乙酯中，通过过滤去除析出物。将滤液溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基Nw－(2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)精氨酰蛋氨酸酯(1.3g，1.2mmol，58％)。
工序(f10)：(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基N－(2－氨基－5－胍基－1－亚氨基戊基)－S－乙基高半胱氨酸酯(脂质(If))的合成
将工序(f9)中得到的(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基Nw－(2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)精氨酰蛋氨酸酯(1.3g，1.2mmol)溶解于TFA(10mL)中。在室温下搅拌1小时后，在减压下浓缩溶剂。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/甲醇)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基N－(2－氨基－5－胍基－1－亚氨基戊基)－S－乙基高半胱氨酸酯(脂质(If))(0.21g，0.26mmol，22％)。
1H－NMR(400MHz，CHLOROFORM－D)δ5.34(d，4H)，5.03(s，1H)，4.78(d，1H)，3.10－2.82(m，5H)，2.22－1.72(m，13H)，1.70－1.60(2H)，1.60－1.36(m，6H)，1.24(s，46H)，0.99－0.76(m，6H)。
[C47H91N5O3SH]+：806.73。
[实施例7]
3－(2，6－二氨基己酰胺)－4－(((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)氧基)－4－氧代丁酸(以下，也称为脂质(Ig))的合成
脂质(Ig)是将脂质(Ia)的第二氨基酸变更为Lys而成的脂质。以下，对脂质(Ig)的合成方法进行说明。需要说明的是，合成工序中的合成脂质亲和性区域的工序以及将脂质亲和性区域与第一氨基酸键合的工序与脂质(Ia)的工序(a1)～工序(a7)的工序相同，因此省略。
工序(g8)：4－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)N2－(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)－N6－(叔丁氧基羰基)赖氨酰天冬氨酸的合成
将工序(a7)中得到的4－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)天冬氨酸(1.5g，2.2mmol)、预先在赖氨酸的氨基和胍基附加有保护基(分别为Fmoc基、Boc基)而成的Fmoc－Lys(Boc)－OH(1.2g，2.6mmol)、DCC(0.67g，3.3mmol)以及DMAP(27mg，0.22mmol)溶解于二氯甲烷(22mL)中。在室温下搅拌至第二天后，用水进行急冷，通过过滤去除析出的二环己基脲。将浓缩滤液而得到的残渣溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标4－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)N2－(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)－N6－(叔丁氧基羰基)赖氨酰天冬氨酸(1.7g，1.5mmol，68％)。
工序(g9)：4－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)N6－(叔丁氧基羰基)赖氨酰天冬氨酸酯的合成
将工序(g8)中得到的4－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)N2－(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)－N6－(叔丁氧基羰基)赖氨酰天冬氨酸(1.7g，1.5mmol)溶解于20％哌啶/DMF溶液(15mL)中。在室温下搅拌至第二天后，在减压下浓缩溶剂。使残渣分散于乙酸乙酯中，通过过滤去除析出物。将滤液溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标4－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)N6－(叔丁氧基羰基)赖氨酰天冬氨酸酯(0.88g，0.96mmol，65％)。
工序(g10)：3－(2，6－二氨基己酰胺)－4－(((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)氧基)－4－氧代丁酸的合成
将工序(g9)中得到的4－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)N6－(叔丁氧基羰基)赖氨酰天冬氨酸酯(0.88g，0.96mmol)溶解于TFA(10mL)中。在室温下搅拌1小时后，在减压下浓缩溶剂。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/甲醇)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标3－(2，6－二氨基己酰胺)－4－(((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)氧基)－4－氧代丁酸(脂质(Ig))(0.26g，0.34mmol，35％)。
1H－NMR(400MHz，CHLOROFORM－D)δ5.32(t，4H)，4.90－4.62(m，1H)，4.14(m，1H)3.02(s，2H)，2.95－2.60(m，1H)，2.12－1.81(m，8H)，1.72(s，2H)，1.65－1.42(m，6H)，1.35－0.98(m，48H)，0.86(t，6H)。
[C46H87N3O5H]+：762.74。
[实施例8]
4－(2，6－二氨基己酰胺)－5－(((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)氧基)－5－氧代戊酸(以下，也称为脂质(Ih))的合成
脂质(Ih)是将脂质(Ia)的第一氨基酸变更为Glu，将第二氨基酸变更为Lys而成的脂质。以下，对脂质(Ih)的合成方法进行说明。需要说明的是，合成工序中的合成脂质亲和性区域的工序以及将脂质亲和性区域与第一氨基酸键合的工序与脂质(Ib)的工序(b1)～工序(b7)的工序相同，因此省略。
工序(h8)：5－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)N2－(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)－N6－(叔丁氧基羰基)赖氨酰谷氨酸的合成
将工序(b7)中得到的5－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)谷氨酸(1.5g，2.1mmol)、预先在赖氨酸的氨基和胍基附加有保护基(分别为Fmoc基、Boc基)而得到的Fmoc－Lys(Boc)－OH(1.2g，2.6mmol)、DCC(0.66g，3.2mmol)以及DMAP(26mg，0.21mmol)溶解于二氯甲烷(21mL)中。在室温下搅拌至第二天后，用水进行急冷，通过过滤去除析出的二环己基脲。将浓缩滤液而得到的残渣溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标5－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)N2－(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)－N6－(叔丁氧基羰基)赖氨酰谷氨酸(1.7g，1.5mmol，70％)。
工序(h9)：5－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)N6－(叔丁氧基羰基)赖氨酰谷氨酸的合成
将工序(h8)中得到的5－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)N2－(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)－N6－(叔丁氧基羰基)赖氨酰谷氨酸(1.7g，1.5mmol)溶解于20％哌啶/DMF溶液(15mL)中。在室温下搅拌至第二天后，在减压下浓缩溶剂。使残渣分散于乙酸乙酯中，通过过滤去除析出物。将滤液溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标5－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)N6－(叔丁氧基羰基)赖氨酰谷氨酸(1.1g，1.2mmol，78％)。
工序(h10)：4－(2，6－二氨基己酰胺)－5－(((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)氧基)－5－氧代戊酸的合成
将工序(g9)中得到的4－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)N6－(叔丁氧基羰基)赖氨酰天冬氨酸酯(1.1g，1.2mmol)溶解于TFA(10mL)中。在室温下搅拌1小时后，在减压下浓缩溶剂。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/甲醇)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标4－(2，6－二氨基己酰胺)－5－(((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)氧基)－5－氧代戊酸(脂质(Ih))(0.23g，0.29mmol，25％)。
1H－NMR(400MHz，CHLOROFORM－D)δ7.94(1H)，6.98(1H)，5.39－5.25(4H)，4.88－4.78(1H)，4.60－4.31(1H)，4.20－4.07(1H)，3.51－3.43(1H)，3.36－3.23(2H)，3.14－2.91(2H)，2.05－1.81(8H)，1.82－1.70(2H)，1.54－1.38(6H)，1.37－1.13(48H)，0.89－0.79(6H)。
[C47H89N3O5H]+：776.70。
[实施例9]
4－(2－氨基－3－(1H－咪唑－4－基)丙酰胺)－5－(((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)氧基)－5－氧代戊酸(以下，也称为脂质(Ii))的合成
脂质(Ii)是将脂质(Ia)的第一氨基酸变更为Glu，将第二氨基酸变更为His而成的脂质。以下，对脂质(Ii)的合成方法进行说明。需要说明的是，合成工序中的合成脂质亲和性区域的工序以及将脂质亲和性区域与第一氨基酸键合的工序与脂质(Ib)的工序(b1)～工序(b7)的工序相同，因此省略。
工序(i8)：5－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)Na－(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)Nt－三苯甲基组氨酰谷氨酸的合成
将工序(b7)中得到的5－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)谷氨酸(1.5g，2.1mmol)、预先在组氨酸的氨基附加了保护基(分别为Fmoc基、Trt基)而得到的Fmoc－His(Trt)－OH(1.6g，2.6mmol)、DCC(0.66g，3.2mmol)以及DMAP(26mg，0.21mmol)溶解于二氯甲烷(21mL)中。在室温下搅拌至第二天后，用水进行急冷，通过过滤去除析出的二环己基脲。将浓缩滤液而得到的残渣溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标5－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)Na－(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)Nt－三苯甲基组氨酰谷氨酸(1.8g，1.4mmol，65％)。
工序(i9)：5－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)Nt－三苯甲基组氨酰谷氨酸的合成
将工序(i8)中得到的5－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)Na－(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)Nt－三苯甲基组氨酰谷氨酸(1.8g，1.4mmol)溶解于20％哌啶/DMF溶液(15mL)中。在室温下搅拌至第二天后，在减压下浓缩溶剂。使残渣分散于乙酸乙酯中，通过过滤去除析出物。将滤液溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标5－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)Nt－三苯甲基组氨酰谷氨酸(1.1g，1.0mmol，73％)。
工序(i10)：4－(2－氨基－3－(1H－咪唑－4－基)丙酰胺)－5－(((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)氧基)－5－氧代戊酸的合成
将工序(i9)中得到的5－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)Nt－三苯甲基组氨酰谷氨酸(1.1g，1.0mmol)溶解于TFA(10mL)中。在室温下搅拌1小时后，在减压下浓缩溶剂。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/甲醇)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标4－(2－氨基－3－(1H－咪唑－4－基)丙酰胺)－5－(((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)氧基)－5－氧代戊酸(脂质(Ii))(0.14g，0.18mmol，18％)。
1H－NMR(400MHz，CHLOROFORM－D)δ5.34(d，J＝15.1Hz，4H)，4.86(s，1H)，3.83－3.47(m，1H)，3.35－2.83(m，3H)，2.29(s，2H)，2.03(d，J＝34.8Hz，10H)，1.66－1.36(m，6H)，1.24(s，46H)，0.96－0.74(m，6H)。
[C47H84N4O5H]+：785.65。
[实施例10]
(6Z，9Z，27Z，30Z)－三十六碳－6，9，27，30－四烯－18－基2－(2－氨基－5－胍基戊酰胺)－3－羟基丁酸酯(以下，也称为脂质(Ij))的合成
脂质(Ij)是变更了脂质(Ie)的脂质亲和性区域的烃基的不饱和键的数量而成的脂质。
合成工序中的合成脂质亲和性区域的工序按与脂质(Ia)的工序(a1)～工序(a5)的工序同样的顺序进行。此外，对脂质亲和性区域键合第一氨基酸、第二氨基酸的工序按与脂质(Ie)的合成工序中对脂质亲和性区域键合第一氨基酸、第二氨基酸的工序(工序(e6)～工序(e8))同样的顺序进行，得到了(6Z，9Z，27Z，30Z)－三十六碳－6，9，27，30－四烯－18－基2－(2－氨基－5－胍基戊酰胺)－3－羟基丁酸酯(脂质(Ij))。
1H－NMR(400MHz，CHLOROFORM－D)δ5.43－5.18(8H)，4.88－4.76(1H)，4.46－4.36(1H)，4.34－4.18(2H)，3.30－2.94(2H)，2.78－2.72(4H)，2.10－1.82(10H)，1.81－1.42(6H)，1.40－0.97(37H)，0.93－0.69(6H)。
[C46H85N5O4H]+：772.70。
[实施例11]
4－(2－氨基－5－胍基戊酰胺)－5－氧代－5－(((9Z，30Z)－四十碳－9，30－二烯－18－基)氧基)戊酸(以下，也称为脂质(Ik))的合成
脂质(Ik)是变更了脂质(Ib)的脂质亲和性区域的烃基的碳原子数而成的脂质。
合成工序中的合成脂质亲和性区域的工序按与脂质(Ia)的工序(a1)～工序(a5)的工序同样的顺序进行。此外，对脂质亲和性区域键合第一氨基酸、第二氨基酸的工序按与脂质(Ib)的合成工序中对脂质亲和性区域键合第一氨基酸、第二氨基酸的工序(工序(b6)～工序(b10))同样的顺序进行，得到了4－(2－氨基－5－胍基戊酰胺)－5－氧代－5－(((9Z，30Z)－四十碳－9，30－二烯－18－基)氧基)戊酸(脂质(Ik))。
1H－NMR(400MHz，CHLOROFORM－D)δ5.47－5.18(4H)，4.88－4.76(1H)，4.46－4.36(1H)，4.34－4.18(1H)，4.16－3.92(1H)，3.46－2.85(2H)，2.56－2.10(3H)，2.09－1.95(10H)，1.77－1.57(2H)，1.57－1.42(4H)，1.41－1.06(54H)，0.93－0.78(6H)。
[C51H97N5O5H]+：860.74。
[实施例12]
4－(2－氨基－5－胍基戊酰胺)－5－氧代－5－(((10Z，34Z)－四十四碳－10，34－二烯－22－基)氧基)戊酸(以下，也称为脂质(Il))的合成
脂质(Il)是变更了脂质(Ib)的脂质亲和性区域的烃基的碳原子数而成的脂质。
合成工序中的合成脂质亲和性区域的工序按与脂质(Ia)的工序(a1)～工序(a5)的工序同样的顺序进行。此外，对脂质亲和性区域键合第一氨基酸、第二氨基酸的工序按与脂质(Ib)的合成工序中对脂质亲和性区域键合第一氨基酸、第二氨基酸的工序(工序(b6)～工序(b10))同样的顺序进行，得到了4－(2－氨基－5－胍基戊酰胺)－5－氧代－5－(((10Z，34Z)－四十四碳－10，34－二烯－22－基)氧基)戊酸(脂质(Il))。
1H－NMR(400MHz，CHLOROFORM－D)δ5.46－5.18(4H)，4.95－4.70(1H)，4.70－4.41(1H)，4.26－3.81(1H)，3.40－2.66(2H)，2.65－2.11(2H)，2.08－1.81(10H)，1.81－1.43(8H)，1.42－0.98(62H)，0.98－0.78(7H)。
[C55H105N5O5H]+：916.92。
[比较例1]
(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基2－氨基－3－羟基丁酸酯(以下，也称为脂质(CEa))的合成
脂质(CEa)的脂质亲和性区域为碳原子数36个的烃基，亲水性区域为Thr(第一氨基酸)。
就脂质(CEa)的合成方法而言，关于合成工序中的合成脂质亲和性区域的工序，与脂质(Ia)的工序(a1)～工序(a5)的工序相同。此外，使第一氨基酸键合于脂质亲和性区域的工序按与脂质(Ie)的工序(e6)、工序(e7)、工序(e9)的工序同样的顺序进行。
1H－NMR(400MHz，CHLOROFORM－D)δ5.44－5.25(m，4H)，5.12－4.89(m，1H)，3.86(d，J＝4.6Hz，2H)，1.98(q，J＝6.7Hz，8H)，1.72－1.33(m，4H)，1.42－1.06(m，49H)，0.97－0.76(m，6H)。
[比较例2]
3－胍基－4－(((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)氧基)－4－氧代丁酸(以下，也称为脂质(CEb))的合成
脂质(CEb)是将脂质(CEa)的第一氨基酸变更为具有胍基的化合物而成的脂质。以下，对脂质(CEb)的合成方法进行说明。需要说明的是，合成工序中的合成脂质亲和性区域的工序及之后的一部分工序与脂质(Ia)的工序(a1)～工序(a7)的工序相同，因此省略。
工序：4－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)((E)－N，N’－双(叔丁氧基羰基)甲脒基)天冬氨酸酯的合成
将4－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)天冬氨酸酯(1.5g，2.2mmol)、N，N’－二－BOC－1H－吡唑－1－甲脒(0.74g，2.4mmol)以及三乙胺(0.26g，2.6mmol)溶解于二氯甲烷(5mL)中。在室温下搅拌至第二天后，用水进行急冷。将浓缩有机相而得到的残渣溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标4－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)((E)－N，N’－双(叔丁氧基羰基)甲脒基)天冬氨酸酯(1.88g，2.0mmol，93％)。
工序：3－胍基－4－(((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)氧基)－4－氧代丁酸(脂质(CEb))的合成
将4－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)((E)－N，N’－双(叔丁氧基羰基)甲脒基)天冬氨酸酯(1.88g，2.0mmol)溶解于三氟乙酸(以下，也记为TFA)(5mL)中。在室温下搅拌1小时后，在减压下浓缩溶剂。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/甲醇)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标脂质(CEb)(0.66g，0.98mmol，61％)。
1H－NMR(400MHz，CHLOROFORM－D)δ5.44－5.25(m，4H)，4.87(t，J＝5.9Hz，1H)，3.48－3.31(m，1H)，3.20－3.16(t，1H)，2.09－1.86(m，8H)，1.78－1.52(m，4H)，1.38－1.18(m，46H)，0.87(t，J＝6.9Hz，6H)。
[比较例3]
4－胍基－5－(((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)氧基)－5－氧代戊酸(以下，也称为脂质(CEc))的合成
脂质(CEc)是将脂质(CEa)的第一氨基酸变更为具有胍基的化合物而成的脂质。以下，对脂质(CEc)的合成方法进行说明。需要说明的是，合成工序中的合成脂质亲和性区域的工序及之后的一部分工序与脂质(Ia)的工序(a1)～工序(a5)以及工序(b6)、(b7)的工序相同，因此省略。
工序：5－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)((Z)－N，N’－双(叔丁氧基羰基)甲脒基)谷氨酸酯的合成
将5－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)谷氨酸酯(1.0g，1.4mmol)、N，N’－二－BOC－1H－吡唑－1－甲脒(0.48g，1.6mmol)以及三乙胺(0.17g，1.7mmol)溶解于二氯甲烷(5mL)中。在室温下搅拌至第二天后，用水进行急冷。将浓缩有机相而得到的残渣溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标5－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)((Z)－N，N’－双(叔丁氧基羰基)甲脒基)谷氨酸酯(1.34g，1.4mmol，100％)。
工序：4－胍基－5－(((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)氧基)－5－氧代戊酸(脂质(CEc))的合成
将5－(叔丁基)1－((9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基)((Z)－N，N’－双(叔丁氧基羰基)甲脒基)谷氨酸酯(1.34g，1.4mmol)溶解于三氟乙酸(以下，也记为TFA)(5mL)中。在室温下搅拌1小时后，在减压下浓缩溶剂。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/甲醇)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标脂质(CEc)(0.45g，0.67mmol，44％)。
1H－NMR(400MHz，CHLOROFORM－D)δ5.44－5.25(m，4H)，4.87(t，J＝5.9Hz，1H)，3.48－3.31(m，1H)，3.20－3.16(m，2H)，2.09－1.86(m，10H)，1.78－1.52(m，4H)，1.38－1.18(m，46H)，0.87(t，J＝6.9Hz，6H)。
[比较例4]
(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基赖氨酸酯(以下，也称为脂质(CEd))的合成
脂质(CEd)是将脂质(CEa)的第一氨基酸变更为Lys而成的脂质。以下，对脂质(CEd)的合成方法进行说明。需要说明的是，合成工序中的合成脂质亲和性区域的工序与脂质(Ia)的工序(a1)～工序(a5)的工序相同，因此省略。
工序(CEd1)：(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基N2，N6－双(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)赖氨酸酯的合成
将工序(a5)中得到的(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－醇(2.0g，3.9mmol)、Nα，Nε－双[(9H－芴－9－基甲氧基)羰基]－L－赖氨酸(Fmoc－Lys(Fmoc)－OH)(4.55g，7.7mmol)以及DCC(2.0g，7.7mmol)溶解于二氯甲烷(15mL)中。在室温下搅拌至第二天后，用水进行急冷，通过过滤去除析出的二环己基脲。将浓缩滤液而得到的残渣溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基N2，N6－双(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)赖氨酸酯(3.8g，3.5mmol，90％)。
工序(CEd2)：(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基赖氨酸酯的合成
将(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基N2，N6－双(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)赖氨酸酯(3.5g，3.5mmol)溶解于20％哌啶/DMF溶液(6mL)中。在室温下搅拌至第二天后，在减压下浓缩溶剂。使残渣分散于乙酸乙酯中，通过过滤去除析出物。将滤液溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标脂质(CEd)(1.5g，2.3mmol，72％)。
1H－NMR(400MHz，CHLOROFORM－D)δ5.44－5.25(m，4H)，4.87(t，J＝5.9Hz，1H)，3.48－3.31(m，1H)，3.20－3.16(t，1H)，2.70－2.66(t，1H)，2.09－1.86(m，10H)，1.78－1.52(m，4H)，1.38－1.18(m，50H)，0.87(t，J＝6.9Hz，6H)。
[比较例5]
(6Z，14Z)－二十碳－6，14－二烯－10－基赖氨酸酯(以下，也称为脂质(CEe))的合成
脂质(CEe)是变更了脂质(CEd)的脂质亲和性区域的烃基的碳原子数而成的脂质。在脂质(CEe)的合成方法中，合成工序中的合成脂质亲和性区域的工序按与脂质(Ia)的工序(a1)～工序(a5)的工序同样的顺序进行。此外，对脂质亲和性区域附加第一氨基酸的工序与脂质(CEd)的工序(CEd1)、工序(CEd2)同样地进行，得到了脂质(CEe)。
1H－NMR(400MHz，CHLOROFORM－D)δ5.44－5.25(m，4H)，4.87(t，J＝5.9Hz，1H)，3.48－3.31(m，1H)，3.20－3.16(t，1H)，2.70－2.66(t，1H)，2.09－1.86(m，24H)，1.38－1.18(m，8H)，0.87(t，J＝6.9Hz，6H)。
[比较例6]
(7Z，25Z)－三十二碳－7，25－二烯－16－基赖氨酸酯(以下，也称为脂质(CEf))的合成
脂质(CEf)是变更了脂质(CEd)的脂质亲和性区域的烃基的碳原子数而成的脂质。在脂质(CEf)的合成方法中，合成工序中的合成脂质亲和性区域的工序按与脂质(Ia)的工序(a1)～工序(a5)的工序同样的顺序进行。此外，对脂质亲和性区域附加第一氨基酸的工序与脂质(CEd)的工序(CEd1)、工序(CEd2)同样地进行，得到了脂质(CEf)。
1H－NMR(400MHz，CHLOROFORM－D)δ5.44－5.25(m，4H)，4.87(t，J＝5.9Hz，1H)，3.48－3.31(m，1H)，3.20－3.16(t，1H)，2.70－2.66(t，1H)，2.09－1.86(m，8H)，1.54－1.66(4H，)，1.38－1.18(m，42H)，0.87(t，J＝6.9Hz，6H)。
[比较例7]
(9Z，35Z)－四十四碳－9，35－二烯－22－基赖氨酸酯(以下，也称为脂质(CEg))的合成
脂质(CEg)是变更了脂质(CEd)的脂质亲和性区域的烃基的碳原子数而成的脂质。在脂质(CEg)的合成方法中，合成工序中的合成脂质亲和性区域的工序按与脂质(Ia)的工序(a1)～工序(a5)的工序同样的顺序进行。此外，对脂质亲和性区域附加第一氨基酸的工序与脂质(CEd)的工序(CEd1)、工序(CEd2)同样地进行，得到了脂质(CEg)。
1H－NMR(400MHz，CHLOROFORM－D)δ5.44－5.25(m，4H)，4.87(t，J＝5.9Hz，1H)，3.48－3.31(m，1H)，3.20－3.16(t，1H)，2.70－2.66(t，1H)，2.09－1.86(m，10H)，1.54－1.66(4H，)，1.38－1.18(m，58H)，0.87(t，J＝6.9Hz，6H)。
[比较例8]
(3Z，15Z)－二十二碳－3，15－二烯－7－基赖氨酸酯(以下，也称为脂质(CEh))的合成
脂质(CEh)是变更了脂质(CEd)的脂质亲和性区域的烃基的碳原子数而成的脂质。在脂质(CEh)的合成方法中，合成脂质亲和性区域的工序按与脂质(Ia)的工序(a1)～工序(a5)的工序同样的顺序进行。此外，对脂质亲和性区域附加第一氨基酸的工序与脂质(CEd)的工序(CEd1)、工序(CEd2)同样地进行，得到了脂质(CEh)。
1H－NMR(400MHz，CHLOROFORM－D)δ5.44－5.25(m，4H)，4.87(t，J＝5.9Hz，1H)，3.48－3.31(m，1H)，3.20－3.16(t，1H)，2.70－2.66(t，1H)，2.09－1.86(m，8H)，1.54－1.66(6H)，1.38－1.18(m，22H)，1.09(3H，t，J＝7.5Hz)，0.87(t，J＝6.9Hz，3H)。
[比较例9]
(3Z，19Z)－二十八碳－3，19－二烯－7－基赖氨酸酯(以下，也称为脂质(CEi))的合成
脂质(CEi)是变更了脂质(CEd)的脂质亲和性区域的烃基的碳原子数而成的脂质。在脂质(CEi)的合成方法中，合成脂质亲和性区域的工序按与脂质(Ia)的工序(a1)～工序(a5)的工序同样的顺序进行。此外，对脂质亲和性区域附加第一氨基酸的工序与脂质(CEd)的工序(CEd1)、工序(CEd2)同样地进行，得到了脂质(CEi)。
1H－NMR(400MHz，CHLOROFORM－D)δ5.44－5.25(m，4H)，4.87(t，J＝5.9Hz，1H)，3.48－3.31(m，1H)，3.20－3.16(t，1H)，2.70－2.66(t，1H)，2.09－1.86(m，14H)，1.54－1.66(14H)，1.38－1.18(m，30H)，1.09(3H，t，J＝7.5Hz)，0.87(t，J＝6.9Hz，3H)。
[比较例10]
3－(2－氨基－5－胍基戊酰胺)－4－(2，3－双(((Z)－十七碳－8－烯酰基)氧基)丙氧基)－4－氧代丁酸(以下，也称为脂质(CEj))的合成
/>
脂质(CEj)是变更了脂质(Ia)的脂质亲和性区域的烃基而成的脂质。以下，对脂质(CEj)的合成方法进行说明。
将(2，2－二甲基－1，3－二氧戊环－4－基)甲醇(5.0g，37.8mmol)溶解于DMF(250mL)中，向冷却至0℃的溶液中添加氢化钠(1.2g，50.3mmol)。在室温下搅拌至第二天，冷却至0℃，滴加4－甲氧基氯苄(7.1g，45.4mmol)。在室温下搅拌1小时后用水进行急冷，利用庚烷进行萃取，用离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标4－(((4－甲氧基苄基)氧基)甲基)－2，2－二甲基－1，3－二氧戊环(8.6g，34.1mmol，90％)。
将4－(((4－甲氧基苄基)氧基)甲基)－2，2－二甲基－1，3－二氧戊环(8.6g，34.1mmol)溶解于水(40mL)和乙酸(160mL)中，升温至50℃，反应1小时。反应结束后在减压下浓缩，利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标3－((4－甲氧基苄基)氧基)丙烷－1，2－二醇(6.4g，30.0mmol，88％)。
将3－((4－甲氧基苄基)氧基)丙烷－1，2－二醇(6.4g，30.0mmol)、油酸(10.2g，36.0mmol)、DCC(7.4g，36.0mmol)以及DMAP(0.37g，3.0mmol)溶解于二氯甲烷(30mL)中。在室温下搅拌至第二天后，用水进行急冷，通过过滤去除析出的二环己基脲。将浓缩滤液而得到的残渣溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标3－((4－甲氧基苄基)氧基)丙烷－1，2－二基二油酸酯(10.2g，13.8mmol，46％)。
将3－((4－甲氧基苄基)氧基)丙烷－1，2－二基二油酸酯(10.2g，13.8mmol)溶解于乙酸乙酯(120mL)和水(12mL)中，向其中添加2，3－二氯－5，6－二氰基对苯醌(DDQ)(6.0g，49.2mmol)，在室温下搅拌至第二天。反应结束后通过过滤去除晶体，浓缩滤液。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标3－羟基丙烷－1，2－二基二油酸酯(6.5g，10.5mmol，76％)。
将3－羟基丙烷－1，2－二基二油酸酯(2.0g，3.2mmol)、预先在天冬氨酸的氨基和羰基附加有保护基(分别为Fmoc基、tBu基)而得到的Fmoc－Asp(tBu)－OH(1.59g，3.8mmol)、DCC(1.33g，6.4mmol)以及DMAP(0.2g，1.6mmol)溶解于二氯甲烷(30mL)中。在室温下搅拌至第二天后，用水进行急冷，通过过滤去除析出的二环己基脲。将浓缩滤液而得到的残渣溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标1－(2，3－双(油酰氧基)丙基)4－(叔丁基)(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)天冬氨酸(3.1g，3.0mmol，95％)。
将1－(2，3－双(油酰氧基)丙基)4－(叔丁基)(((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)天冬氨酸(3.1g，3.0mmol)溶解于20％哌啶/DMF溶液(6mL)中。在室温下搅拌至第二天后，在减压下浓缩溶剂。使残渣分散于乙酸乙酯中，通过过滤去除析出物。将滤液溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标1－(2，3－双(油酰氧基)丙基)4－(叔丁基)天冬氨酸(1.75g，2.2mmol，72％)。
将1－(2，3－双(油酰氧基)丙基)4－(叔丁基)天冬氨酸(1.75g，2.2mmol)、预先在精氨酸的氨基和胍基附加有保护基(Boc基)而得到的Boc－Arg(Boc)2－OH(1.72g，2.6mmol)、DCC(0.55g，2.6mmol)以及DMAP(27mg，0.22mmol)溶解于二氯甲烷(13mL)中。在室温下搅拌至第二天后，用水进行急冷，通过过滤去除析出的二环己基脲。将浓缩滤液而得到的残渣溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标1－(2，3－双(油酰氧基)丙基)4－(叔丁基)N2，Nw，Nw’－三(叔丁氧基羰基)精氨酰天冬氨酸酯(1.6g，1.2mmol，58％)。
将1－(2，3－双(油酰氧基)丙基)4－(叔丁基)N2，Nw，Nw’－三(叔丁氧基羰基)精氨酰天冬氨酸酯(1.6g，1.2mmol)溶解于TFA(4mL)中。在室温下搅拌1小时后，在减压下浓缩溶剂。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/甲醇)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标1－(2，3－双(油酰氧基)丙基)4－(叔丁基)精氨酰天冬氨酸酯(0.30g，0.33mmol，26％)。
1H－NMR(400MHz，CHLOROFORM－D)δ5.32(m，4H)，5.30－5.18(m，1H)，4.90－4.75(m，1H)，4.35－4.05(m，4H)，3.15－3.02(4H)，2.95－2.20(m，4H)，2.12－1.81(m，10H)，1.65－1.42(m，12H)，1.35－0.98(m，28H)，0.86(t，6H)。
[比较例11]
3－(2－氨基－5－胍基戊酰胺)－4－((2，3－双(((Z)－十七碳－8－烯酰基)氧基)丙基)氨基)－4－氧代丁酸(以下，也称为脂质(CEk))的合成
/>
脂质(CEk)是变更了脂质(Ia)的脂质亲和性区域的烃基而成的脂质。以下，对脂质(CEk)的合成方法进行说明。
将Fmoc－Asp(tBu)－OH(3.4g，8.3mmol)、DCC(2.3g，10.8mmol)以及DMAP(0.10g，8.3mmol)溶解于二氯甲烷(105mL)中，在室温下搅拌混合溶液2小时。向该溶液中添加溶解于DMF(55mL)中的3－氨基－1，2－丙二醇(4.0g，7.7mmol)，在室温下搅拌至第二天后，用水进行急冷，通过过滤去除析出的二环己基脲。将浓缩滤液而得到的残渣溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标3－((((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)氨基)－4－((2，3－二羟基丙基)氨基)－4－氧代丁酸叔丁酯(3.5g，7.2mmol，87％)。
将3－((((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)氨基)－4－((2，3－二羟基丙基)氨基)－4－氧代丁酸叔丁酯(3.5g，7.5mmol)、油酸(4.47g，15.8mmol)、DCC(3.89g，18.8mmol)以及DMAP(0.09g，0.8mmol)溶解于二氯甲烷(30mL)中。在室温下搅拌至第二天后，用水进行急冷，通过过滤去除析出的二环己基脲。将浓缩滤液而得到的残渣溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标3－(2－((((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)氨基)－4－(叔丁氧基)－4－氧代丁酰胺)丙烷－1，2－二基二油酸酯(3.4g，3.4mmol，45％)。
将3－(2－((((9H－芴－9－基)甲氧基)羰基)氨基)－4－(叔丁氧基)－4－氧代丁酰胺)丙烷－1，2－二基二油酸酯(3.5g，3.5mmol)溶解于20％哌啶/DMF溶液(6mL)中。在室温下搅拌至第二天后，在减压下浓缩溶剂。使残渣分散于乙酸乙酯中，通过过滤去除析出物。将滤液溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标3－(2－氨基－4－(叔丁氧基)－4－氧代丁酰胺)丙烷－1，2－二基二油酸酯(3.2g，3.2mmol，91％)。
将3－(2－氨基－4－(叔丁氧基)－4－氧代丁酰胺)丙烷－1，2－二基二油酸酯(1.0g，1.3mmol)、Fmoc－Arg(Pbf)－OH(0.9g，1.4mmol)(TCI制)、DCC(0.31g，1.5mmol)以及DMAP(0.03g，0.3mmol)溶解于二氯甲烷(13mL)中。在室温下搅拌至第二天后，用水进行急冷，通过过滤去除析出的二环己基脲。将浓缩滤液而得到的残渣溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标8－(2－(叔丁氧基)－2－氧乙基)－1－(9H－芴－9－基)－3，6，9－三氧－5－(3－(3－((2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)磺酰基)胍基)丙基)－2－氧杂－4，7，10－三氮杂十三烷－12，13－二醇二脲酸酯(1.68g，1.2mmol，93％)。
将8－(2－(叔丁氧基)－2－氧乙基)－1－(9H－芴－9－基)－3，6，9－三氧－5－(3－(3－((2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)磺酰基)胍基)丙基)－2－氧杂－4，7，10－三氮杂十三烷－12，13－二醇二脲酸酯(1.68g，1.2mmol)溶解于20％哌啶/DMF溶液(6mL)中。在室温下搅拌至第二天后，在减压下浓缩溶剂。使残渣分散于乙酸乙酯中，通过过滤去除析出物。将滤液溶解于乙酸乙酯中，用10％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、离子交换水对有机相进行清洗后，在减压下浓缩有机相。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/庚烷)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标3－(2－(2－氨基－5－(3－((2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)磺酰基)胍基)戊酰胺)－4－(叔丁氧基)－4－氧代丁酰胺)丙烷－1，2－二乙基二油酸甘油酯(1.2g，1.0mmol，85％)。
将3－(2－(2－氨基－5－(3－((2，2，4，6，7－五甲基－2，3－二氢苯并呋喃－5－基)磺酰基)胍基)戊酰胺)－4－(叔丁氧基)－4－氧代丁酰胺)丙烷－1，2－二乙基二油酸甘油酯(1.2g，1.0mmol)溶解于TFA(4mL)中。在室温下搅拌1小时后，在减压下浓缩溶剂。利用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/甲醇)对所得到的粗产物进行纯化，得到了目标脂质(CEk)(0.24g，0.27mmol，27％)。
1H－NMR(400MHz，CHLOROFORM－D)δ5.34(d，J＝17.4Hz，4H)，5.08(s，1H)，4.94－4.64(1H)，4.21(s，1H)，4.02(s，1H)，3.39(s，1H)，3.01(s，1H)，2.43－2.14(m，4H)，1.99－1.70(m，10H)，1.55(s，5H)，1.26(m，46H)，0.86(t，J＝6.6Hz，6H)。
[比较例12]
(9Z，27Z)－三十六碳－9，27－二烯－18－基蛋氨酸酯(以下，也称为脂质(CEl))的合成
脂质(CEl)是将脂质(CEa)的第一氨基酸变更为Met而成的脂质。
就脂质(CEl)的合成方法而言，关于合成工序中的合成脂质亲和性区域的工序，与脂质(Ia)的工序(a1)～工序(a5)的工序相同。此外，对脂质亲和性区域键合第一氨基酸的工序按与脂质(If)的工序(f6)、工序(f7)的工序同样的顺序进行。
1H－NMR(400MHz，CHLOROFORM－D)δ5.44－5.25(m，4H)，4.87(t，J＝5.9Hz，1H)，3.48－3.31(m，1H)，3.20－3.16(t，1H)，2.70－2.66(t，1H)，2.19(s，3H)，2.09－1.86(m，10H)，1.78－1.52(m，4H)，1.38－1.18(m，46H)，0.87(t，J＝6.9Hz，6H)。
[参考例1]
脂质(r1)(Cayman Chemical公司制，SM102－33474)为了对各评价进行比较而用作参考的脂质。
＜评价＞
接着，使用上述的实施例和比较例的脂质，制作包含内包siRNA和mRNA的脂质纳米粒子的组合物，进行了各评价。
[脂质纳米粒子(LNP：lipid nanoparticle)的制作]
A.脂质溶液、柠檬酸缓冲液的制备
首先，使用实施例和比较例的脂质制备出脂质溶液。制备按以下顺序进行。
(i)制作出实施例和比较例的规定的脂质(10mM，以下也称为主要脂质)的乙醇溶液、与所述主要脂质不同的辅助脂质(DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)：10mM)的乙醇溶液、胆固醇(10mM)的乙醇溶液。
(ii)将上述(i)中制备出的各溶液以主要脂质/辅助脂质/胆固醇＝45/10/45(摩尔比(molar ratio))的方式混合，得到了脂质溶液。
接着，制备出柠檬酸缓冲液。具体而言，分别制作出1mM的柠檬酸水溶液50mL和1mM柠檬酸钠水溶液50mL。一边用pH计进行确认一边将柠檬酸水溶液和柠檬酸钠水溶液混合，制备出pH＝4.5的1mM柠檬酸缓冲液。
B.脂质纳米粒子的制作
接着，使用微流路制作出脂质纳米粒子。微流路法是通过使用微反应器使脂质溶液与siRNA溶液或mRNA溶液混合来制作脂质纳米粒子的方法。需要说明的是，作为siRNA溶液，使用将21碱基对的siRNA溶解于RFW(RNase Free Water)中而成的溶液，作为mRNA溶液，使用TriLink BioTechnologies公司(制造商)的CleanCap FLuc mRNA(型号L－7602－100)。
首先，关于含有siRNA的脂质纳米粒子的制作方法，在以下记述顺序。
(i)将上述脂质溶液和上述1mM柠檬酸缓冲液、清洗用的乙醇在设定为25℃的培养箱中保温。
(ii)在微流路(YMC公司制，KC－M－S－SUS)的脂质溶液侧流通乙醇，siRNA溶液侧流通RFW，进行清洗。
(iii)将需要量的1mM柠檬酸缓冲液与siRNA溶液混合，制作出siRNA柠檬酸缓冲液溶液。
(iv)将脂质溶液0.33mL、siRNA柠檬酸缓冲液溶液1.66mL分别取至不同的注射器中，置于各自的泵中。需要说明的是，脂质溶液与siRNA柠檬酸缓冲液溶液设定为总流量成为3.3mL/min，此外，设定为总脂质与siRNA的摩尔比成为7000∶1，脂质浓度1.7mM，溶剂比(醇浓度)24.1％。
(v)启动装置，在流路内剧烈混合脂质溶液与siRNA柠檬酸缓冲液溶液。废弃最初的约750μL的量，将剩余的溶液回收至艾本德(eppendorf)管中。
接着，关于含有mRNA的脂质纳米粒子的制作方法，在以下记述顺序。
(i)将上述脂质溶液和上述1mM柠檬酸缓冲液在设定为25℃的培养箱中保温。
(ii)在微流路(YMC公司制，KC－M－S－SUS)的脂质溶液侧流通脂质溶液的乙醇，mRNA溶液侧流通RFW，进行清洗。
(iii)将需要量的1mM柠檬酸缓冲液与mRNA溶液混合，制作出mRNA柠檬酸缓冲液溶液。需要说明的是，在此的1mM柠檬酸缓冲液使用的是，使用酸性的1mM柠檬酸缓冲液调整为pH4.5的柠檬酸缓冲液。
(iv)将脂质溶液0.522mL、mRNA柠檬酸缓冲液溶液1.478mL分别取至不同的注射器中，置于各自的泵中。需要说明的是，脂质溶液与mRNA柠檬酸缓冲液溶液的量为调整为脂质与mRNA的重量比成为30∶1的量。
(v)在将脂质溶液的流量设定为685.7μL/min，将mRNA柠檬酸缓冲液溶液的流量设定为2.914mL/min下启动装置，在流路内剧烈混合脂质溶液与mRNA柠檬酸缓冲液溶液。废弃最初的约13.75秒，将剩余的溶液回收至艾本德管中。
需要说明的是，以下说明使用了参考例1的脂质(r1)的、含有mRNA的脂质纳米粒子的制作方法。
使用了脂质(r1)的、含有mRNA的脂质纳米粒子的制作变更了下述的方面，除此以外，与使用了各实施例的脂质的、含有mRNA的脂质纳米粒子的制作方法同样地进行。
关于脂质溶液的制作，如下所述。(i)制作出脂质(r1)(10mM)的乙醇溶液、辅助脂质(DSPC(1，2－二硬脂酰基－sn－甘油－3－磷酸胆碱)：10mM)的乙醇溶液、胆固醇(10mM)的乙醇溶液、PEG2000－DMG(10mM)的乙醇溶液。(ii)将上述(i)中制备出的各溶液以成为主要脂质/辅助脂质/胆固醇/PEG2000－DMG＝50/10/38.5/1.5(摩尔比)的方式混合，得到了脂质溶液。
接着，关于含有mRNA的脂质纳米粒子的制作方法，(iv)将脂质溶液与mRNA柠檬酸缓冲液溶液的量调整为脂质(r1)与mRNA的重量比成为19.35∶1，除此以外，与使用了各实施例的脂质的、含有mRNA的脂质纳米粒子的制作方法同样地进行。
接着，通过使用透析膜(REPLIGEN公司制，Spectra/Por 2Membrane)，对如上所述地得到的包含siRNA或mRNA的含脂质纳米粒子的溶液进行透析，去除了使用的乙醇等有机溶剂、缓冲液所含的盐等。在以下示出顺序。
(i)将透析膜切成需要的长度，加水使其活化。
(ii)去除活化的透析膜的水分，用夹子固定下方，以使含脂质纳米粒子的溶液不会从下方漏出。
(iii)向透析膜内用移液管一边计量一边加入含脂质纳米粒子的溶液，加完后用夹子固定上方。
(iv)放入装满大量的水的容器(烧杯等)中，用搅拌器以透析膜缓慢旋转的程度的速度进行搅拌。中途交换几次水，并且搅拌整夜。
(v)透析结束后，将透析膜从水中取出。使用剪刀打开，用移液管一边计量一边将内容物移至另一容器中。
[脂质纳米粒子的粒径、多分散指数、ZETA电位的测定]
分别量取通过上述的操作得到的透析后的含脂质纳米粒子的溶液30μL，加入超纯水800μL对所述含脂质纳米粒子的溶液进行稀释，使用稀释后的制备液，利用粒度分析仪(Malvern Panalytical公司制，Zetasizer nano Ultra)测定出粒径(nm)、多分散指数(PDI)。粒径在超纯水中按Z－平均进行了评价。此外，ZETA电位在稀释溶液使用pH7.4Tris－HCl测定出。
[脂质纳米粒子的siRNA包封率和mRNA包封率的评价]
如下所述地得到了脂质纳米粒子的siRNA包封率和mRNA包封率。首先，向含脂质纳米粒子的溶液中加入表面活性剂(Sigma Aldrich公司制，Triton(注册商标)、X－100(还原型))，使脂质纳米粒子崩解，使包封的siRNA或mRNA游离。含脂质纳米粒子的溶液和表面活性剂的量调整为在向含脂质纳米粒子的溶液中加入了表面活性剂后的溶液40μL中，siRNA或mRNA成为2pmol，表面活性剂成为1％。接着，向所述溶液中加入RiboGreen试剂(与siRNA作用而发出荧光的试剂。Thermo Fisher Scientific公司制，Quant－iT(注册商标)RiboGreen(注册商标)RNA化验试剂盒)，利用荧光强度计(TECAN公司制，InfiniteM200)在激发波长480nm、荧光波长520nm的条件下测定出荧光强度。具体而言，在向所述溶液10μL中加入柠檬酸缓冲液65μL而稀释后的溶液中，添加将RiboGreen试剂稀释为2000分之1而成的试剂75μL，测定出荧光强度。由此，能相对地测定溶液中存在的总siRNA量或总mRNA量。
接着，在未向含脂质纳米粒子的溶液中加入表面活性剂的状态下加入RiboGreen试剂，同样地利用荧光强度计测定出荧光强度。通过不加入表面活性剂，能相对地测定未被脂质纳米粒子包封而在溶液中游离的siRNA或mRNA的量。
然后，将如上所述地得到的、由加入了表面活性剂的溶液得到的荧光强度设为荧光强度a，将由加入了表面活性剂的溶液得到的荧光强度设为荧光强度b，通过式(a－b)/a×100，得到了脂质纳米粒子的siRNA包封率(％)或mRNA包封率(％)。需要说明的是，各荧光强度a、b是从对各溶液进行了3次测定的结果的算术平均值减去空白而得到的值。需要说明的是，空白是对加入有水的孔(well)进行相同操作而测定出的，该水未加入细胞、脂质纳米粒子。
[细胞实验1]
为了对使用各实施例和各比较例的脂质制作出的、包封有siRNA的脂质纳米粒子进行评价，使用HT1080－EGFP(人/纤维肉瘤)细胞进行了细胞实验。该细胞是具有绿色荧光蛋白基因(EGFP)的细胞。通过测定溶解有细胞的溶液的荧光强度能容易地确认EGFP的表达，因此通过使包封有抑制EGFP的表达的siRNA的脂质纳米粒子进行作用，观察荧光强度的降低，能对使用的脂质纳米粒子的性能进行评价。以下，示出细胞实验的顺序。
A.细胞的准备
(i)从冷藏库中取出液体培养基(DMEM/Ham’sF12，FBS+，P/S+)(FBS：胎牛血清，P/S：抗生物质)，在设定为37℃的恒温器中进行调温。
(ii)从－80℃的冷冻库中取出加入有细胞的冻存管(cryotube)，在设定为37℃的恒温器中一口气解冻。
(iii)将解冻后的细胞的贮存液(stock liquid)采取至带盖的试管中。
(iv)用液体培养基对加入有细胞的管进行清洗，清洗液也采取至试管中。
(v)将试管设于离心分离器，使细胞沉淀。
(vi)吸取上清液，添加液体培养基并轻叩，使细胞分散。
(vii)少量采取分散后的液体培养基，用显微镜观察细胞数量，进行计数。
(viii)向24孔板以每一个孔成为2×104个细胞数量的方式播种细胞。需要说明的是，就后述的LDH检测用的板而言，向96孔板以每一个孔成为4×103个细胞数量的方式播种细胞。
(ix)将24孔板或96孔板放入培养箱，在37℃、5％CO2的条件下培养细胞24小时。
B.转染
将制作出的脂质纳米粒子导入至细胞中。
(i)向与上述A的(i)同样地进行了调温的液体培养基(FBS－，P/S－)中以成为10％的方式添加胎牛血清(FBS)。
(ii)从培养箱中取出24孔板，吸取24孔板中的液体培养基上清液，用磷酸缓冲液(PBS)进行清洗。
(iii)向清洗后的24孔板中添加上述(i)中制作出的液体培养基400μL。此外，添加调制了浓度的LNP溶液100μL。
(iv)将24孔板放入培养箱，培养细胞(24小时)。
(v)24小时后，吸取24孔板中的液体培养基上清液，添加加入有FBS10％的液体培养基(FBS+/P/S+)500μL。
(vi)将24孔板放入培养箱，在37℃、5％CO2的条件下培养细胞24小时。
需要说明的是，脂质纳米粒子后述的向LDH检测用的细胞的导入如下所述地进行。
(i)从培养箱中取出96孔板。
(ii)吸取96孔板中的液体培养基上清液，用磷酸缓冲液(PBS)进行清洗。
(iii)向清洗后的96孔板中添加加入有FBS10％的液体培养基(FBS+/P/S+)160μL。此外，添加调制了浓度的LNP溶液40μL。
(iv)将96孔板放入培养箱，在37℃、5％CO2的条件下培养细胞24小时。
C.毒性的评价(CCK－8检测、LDH检测)
通过对实施例1～9进行CCK－8检测或LDH检测，测定活细胞的代谢活性，相对地对生存的细胞数量进行定量，对脂质纳米粒子的毒性进行了评价。
(a)CCK－8检测
(i)向与上述A的(i)同样地进行了调温的液体培养基(FBS－，P/S－)中以FBS成为10％，活细胞数量测定试剂盒(同仁化学研究所制，Cell Count Kit－8)成为10％的方式添加。
(ii)从培养箱中取出24孔板。去除液体培养基，添加上述(i)中制作出的加入有活细胞数量测定试剂盒的液体培养基315μL。
(iii)在培养箱内进行1小时熟化。
(iv)取出24孔板，用酶标仪(plate reader)(TECAN公司制，Infinite M200)在测定波长450nm、对象波长630nm的条件下测定出吸光度。吸光度是将未添加脂质纳米粒子的对照的细胞的吸光度设为1.00而计算出的。将所得到的值为0.80以上且1.00以下评价为◎(优)，将0.50以上且小于0.80评价为〇(良)，将0.20以上且小于0.50评价为△(合格)，将小于0.20评价为×(不合格)。
(b)LDH检测
LDH检测使用制细胞数量测定试剂盒(同仁化学研究所制，Cytotoxicity LDHAssay Kit－WST)如下所述地进行。
(i)向阳性对照孔中加入溶解缓冲液20μL，在37℃下在培养箱内培养30分钟。
(ii)从各孔中取上清液100μL，移至测定用的96孔板。
(iii)向全部孔中加入试剂盒所附属的试剂的混合液100μL，在遮光下、室温下进行30分钟呈色反应。
(iv)向全部孔中加入试剂盒所附属的终止液(stop solution)试剂50μL。
(v)用酶标仪(TECAN公司制，InfiniteM200)在测定波长490nm、对象波长630nm的条件下测定96孔板，计算出吸光度。吸光度是将未添加脂质纳米粒子的对照的细胞的吸光度设为1.00而计算出的。将所得到的值为0.5以下评价为◎(优)，将超过0.5且1.0以下评价为〇(良)，将超过1.0且小于6.0评价为△(合格)，将6.0以上评价为×(不合格)。
D.敲低效果的评价(GFP检测)
通过进行GFP检测，测定细胞的EGFP表达量，对由脂质纳米粒子产生的绿色荧光蛋白基因(EGFP)的敲低效果进行了评价。
(i)将24孔板从培养箱中取出，用PBS进行清洗。
(ii)为了破坏细胞，添加加入有蛋白酶抑制剂的1％辛基葡萄糖苷液。用移液管搅拌使细胞溶解。
(iii)将细胞溶解液移至艾本德管中，设于离心分离器。
(iv)采取上清液150μL，添加至荧光测定用的板。
(v)用酶标仪(TECAN公司制，Infinite M200)在激发波长485nm、荧光波长535nm的条件下测定出荧光强度。荧光强度是将未添加脂质纳米粒子的对照的细胞的荧光强度设为100％而计算出的。
[细胞实验2]
关于实施例1、2、5的脂质(Ia)、(Ib)、(Ie)，为了对包封有mRNA的脂质纳米粒子进行评价，使用HEK293T细胞、NIH3T3细胞进行了细胞实验。通过使脂质纳米粒子转染于该细胞，测定产生规定的蛋白质的量，能对使用的脂质纳米粒子的性能进行评价。以下，示出细胞实验的顺序。
A.细胞的播种
(i)对液体培养基(DMEM高糖(High glucose)，FBS+，P/S+)在设定为37℃的恒温器中进行调温。
(ii)从－80℃的冷冻库中取出加入有细胞的冻存管，在设定为37℃的恒温器中一口气解冻。
(iii)将试管设于离心分离器，使细胞沉淀。
(iv)吸取上清液，添加液体培养基并轻叩，使细胞分散。
(v)少量采取分散后的液体培养基，用显微镜观察细胞数量，进行计数。
(vi)向3个24孔黑板以每一个孔成为1×104个/μL细胞数量的方式播种细胞。将24孔黑板放入培养箱，在37℃、5％CO2的条件下培养细胞24小时。
B.转染
(i)将包含mRNA的含脂质纳米粒子的溶液以mRNA浓度成为100ng/20μL(＝0.005μg/μL)的方式浓缩。
(ii)将液体培养基(DMEM高糖，FBS－，P/S－)和FBS加温至37℃，将需要量的液体培养基与FBS混合(此时的液体培养基中的FBS浓度：12.5％)，使制备出的液体培养基通过0.22μm过滤器进行过滤灭菌。
(iii)吸取培养了细胞的24孔黑板中的液体培养基上清液，向每一个孔添加80μL的制备液体培养基。
(iv)向每一个孔添加20μL的RFW和上述的调制了浓度的含脂质纳米粒子的溶液。
(v)将24孔黑板放入培养箱，在37℃、5％CO2的条件下培养细胞24小时。
C.蛋白质表达效果的评价(高斯荧光素酶(GLuc)的检测)
使用Thermo Scientific公司制的高斯荧光素酶检测的试剂盒进行了蛋白质表达效果的评价。
(i)将上述的B.(v)中培养的细胞从培养箱中取出，在室温下静置。
(ii)采取板中的上清液20μL，添加至新的96孔白板。
(iii)使试剂盒所附属的100X腔肠素(Coelenterazine)和Gaussia Glow检测缓冲液恢复至室温，分别按1∶100混合而制备出。使用多道移液管，向上清液中以每一个孔50μL的方式添加调整后的溶液。
(iv)用铝箔对板进行遮光，静置10分钟后，用酶标仪(TECAN公司制，InfiniteM200)测定发光量(测定时间：2秒)，以所得到的发光量为指标计算出蛋白质表达量。
D.毒性的评价(CellTiter－Fluor(注册商标)细胞活性(Cell Viability)检测)
(i)使CellTiter－Fluor(注册商标)细胞活性(CTF)检测的试剂在37℃的热水浴中完全解冻。
(ii)利用漩涡混匀器均匀混合GF－AFC底物。
(iii)将CTF检测试剂(试剂盒)所附属的缓冲液与GF－AFC底物分别按10mL∶10μL的混合比混合需要量。
(iv)向上述的包含B.(v)中培养的细胞的24孔黑板以每一个孔100μL的方式添加混合后的CTF试剂混合物，迅速地用铝箔进行遮光后，用板振荡器振荡30秒。
(v)将板放入培养箱，将24孔黑板放入培养箱，在37℃、5％CO2的条件下培养30分钟细胞。
(vi)用酶标仪测定出荧光强度(激发波长380nm，荧光波长505nm)。根据所得到的测定结果，将未添加脂质纳米粒子的细胞的荧光强度设为1而计算出生存的细胞数量。将生存的细胞数量超过0.8且1.00以下评价为◎(优)，将超过0.50且0.80以下评价为〇(良)，将超过0.20且0.50以下评价为△(合格)，将0.20以下评价为×(不合格)。
[体内(in vivo)动物实验]
为了对包封有mRNA的脂质纳米粒子进行评价，使用小鼠进行了实验。通过对小鼠注射包含脂质纳米粒子的溶液，进行转染，测定产生的规定的蛋白质的量，能对使用的脂质纳米粒子的性能进行评价。以下，示出实验的顺序。
A.含脂质纳米粒子的溶液的调整
使用实施例2、11、12的脂质(Ib)、(Ik)、(Il)调整了体内动物实验用的含脂质纳米粒子的溶液。在上述的[脂质纳米粒子(LNP：lipid nanoparticle)的制作]中记载的脂质溶液的调整方法的(ii)中，将脂质溶液以主要脂质/辅助脂质/胆固醇＝45/10/45的方式混合，进而向混合液中以成为1.5mol％的方式添加聚乙二醇修饰脂质(PEG2000－DMG)来制作，除了变更该方面以外，与上述的[脂质纳米粒子(LNP：lipid nanoparticle)的制作]的方法同样地调整了含脂质纳米粒子的溶液。
此外，关于由实施例2的脂质(Ib)形成的含脂质纳米粒子的溶液，为了进行比较，也将未添加聚乙二醇修饰脂质而制作出的含脂质纳米粒子的溶液用于体内动物实验。
B.投给用溶液的调整
使用离心式超滤单元(Amicon Ultra－2、10k)，将由实施例2、11、12的脂质(Ib)、(Ik)、(Il)形成的含脂质纳米粒子的溶液浓缩至目标浓度(以mRNA计为0.03125μg/μL)(6000xg)。接着，以最终的蔗糖浓度成为0.3M的方式，向经浓缩的含脂质纳米粒子的溶液中添加1.5M蔗糖溶液，得到了投给用溶液。
C.投给和测定
将投给用溶液50μL(以mRNA量计为1.25μg/小鼠)对小鼠的左后肢进行肌肉内投给。然后，在从投给起经过规定时间(2、4、6、8、24小时)的10分钟前，将30mg/mL荧光素溶液/PBS(－)按150mg/kg body的用量对小鼠进行腹腔内投给。投给荧光素溶液10分钟后，在异氟烷麻酔下，利用体内成像系统(Xenogen公司制，IVIS)测定从投给起规定时间内的发光量，计算出蛋白质表达量。
＜评价结果＞
(1)关于含有siRNA的脂质纳米粒子的评价结果
将使用各实施例和各比较例的脂质而得到的、含有siRNA的脂质纳米粒子的评价结果示于表1、2。
[表1]
*:表中的“-”表示未测定
[表2]
*:表中的“-”表示未测定
如表1所示，由实施例1～12的脂质得到的脂质纳米粒子的粒径、PDI变低。若像这样脂质纳米粒子的粒径、PDI低，则能使脂质纳米粒子容易地到达靶细胞、组织。具体而言，粒径、PDI低，因此例如在目标组织为肿瘤的情况下，存在脂质纳米粒子小于肿瘤的血管的细孔的大小的倾向，能容易地使脂质纳米粒子到达组织内。
此外，由实施例1～12的脂质得到的脂质纳米粒子在pH7.4的Tris－HCl中测定出的电荷变低。生物体的血液为约pH7.4的环境，在那样的环境下，若脂质纳米粒子的阳离子性强(电荷大)，则产生非特异性的吸附、免疫反应，或者脂质纳米粒子具有毒性，或容易在到达靶细胞、组织之前被代谢。由实施例1～12的脂质得到的脂质纳米粒子在pH7.4下电荷低(接近0mV)，因此能抑制毒性、代谢的可能性。
此外，如表1所示，由实施例1～12的脂质得到的脂质纳米粒子具有高siRNA的包封率。因此，能高效地得到包封siRNA的脂质纳米粒子。
而且，如表1的GFP检测和毒性的细胞实验的结果所示，由实施例1～12的脂质得到的脂质纳米粒子的GFP检测的结果成为低的值。因此，可知有效地敲低HT1080－EGFP(人/纤维肉瘤)细胞的绿色荧光蛋白基因(EGFP)，就是说，脂质纳米粒子到达细胞内，通过siRNA阻碍所述基因的表达。因此，通过使用实施例1～12的脂质，能有效地将siRNA送达至细胞内。
此外，如表1的实施例1～6所示，可知第一氨基酸为亲水性氨基酸的脂质(实施例1～5)与第一氨基酸不为亲水性的脂质(实施例6)相比，GFP检测的结果良好。因此，第一氨基酸为亲水性氨基酸的脂质能更有效地将核酸等导入化合物送达至生物体内的靶细胞或组织等。
此外，表1中示出的CCK检测、LDH检测为与细胞毒性相关的评价，可知实施例1～3、5、6的脂质的细胞毒性也低。需要说明的是，为了将siRNA导入至细胞内，与将mRNA导入至细胞内的情况相比，使用较多的脂质，但就实施例1～3、5、6的脂质而言，即使将较多的脂质应用于细胞，也能降低毒性。
此外，实施例10～12的脂质是脂质亲和性区域与实施例1～9的脂质不同的脂质。根据实施例5和实施例10的结果，可知在脂质亲和性区域的烃基中，即使不饱和键的数量变化，也能得到良好的结果。而且，根据实施例2、11、12的结果，可知即使使脂质亲和性区域的烃基的碳原子数变化，只要在期望的范围(具体而言，式(I)中的R1的烃基的碳原子数为32～48个)内，也能得到良好的结果。
接着，表2的比较例1～4、12示出使用了具有各自相同的脂质亲和性区域和由相互不同的一个氨基酸构成的亲水性区域的脂质的结果。如表2的比较例1所示，由比较例1、12的脂质得到的脂质纳米粒子的粒径、PDI成为大的值。因此，可知在如比较例1、12那样的将一个氨基酸设为亲水性区域的脂质中，难以使导入化合物到达靶细胞、组织。另一方面，如表2的比较例2～4所示，由比较例2～4的脂质得到的脂质纳米粒子与比较例1的情况相比，虽然粒径、PDI并非大的值，但GFP检测的结果成为大的值。因此，可知如比较例2～4那样即使亲水性区域为一个氨基酸但所述氨基酸的侧链具有碱性的脂质与氨基酸的侧链并非碱性的脂质(比较例1、12)相比，虽然粒径、PDI能得到改善，但难以使导入化合物有效地导入至细胞内。此外，可知如各实施例所示的、具有由两个氨基酸构成的亲水性区域的脂质是有效的。
此外，在表2的比较例5～10中，示出相对于比较例4的脂质使脂质亲和性区域的烃基的碳原子数变化的脂质的结果。具体而言，与脂质亲和性区域的烃基的碳原子数为36个的比较例4的脂质相比，碳原子数为20个的比较例5的脂质、碳原子数为22个的比较例8的脂质、碳原子数为28个的比较例9的脂质的粒径和PDI中的任意方或两方大幅恶化。与此相对，可确认碳原子数为32个的比较例6的脂质、碳原子数为44个的比较例7的脂质与比较例4的脂质相比，粒径和PDI是同等的。因此，根据表2的比较例4～9的结果，可知若将脂质亲和性区域的烃基的碳原子数设为32～48个的范围以外，粒径和PDI中的任意方或两方大幅恶化。
而且，比较例8、9的脂质是关于脂质亲和性区域的分支的烃基，支链之间的碳原子数存在差(10个或16个)的脂质。比较例8、9的脂质与如比较例6、7的脂质那样支链之间的碳原子数不存在差的脂质比较，粒径和PDI恶化。因此，可知在脂质亲和性区域的烃基分支的情况下，分支的烃基之间的碳原子数之差小能得到良好的结果。
而且，根据使用了表1的实施例1的脂质、表2的比较例10、11的脂质的结果，可知在脂质亲和性区域与亲水性区域的键合部分中，与经由酯基、酰胺基形成键相比，作为烃基的脂质亲和性区域与作为氨基酸部分的亲水性区域直接键合能得到良好的结果。
(2)关于含有mRNA的脂质纳米粒子的评价结果
接着，将使用实施例1、2、5的脂质制作出的、含有mRNA的脂质纳米粒子的评价结果示于表3。
[表3]
使用实施例1、2、5的脂质得到的、含有mRNA的脂质纳米粒子与上述的含有siRNA的脂质纳米粒子同样，粒径、PDI变低，容易使脂质纳米粒子到达靶细胞、组织。
此外，由实施例1、2、5的脂质得到的脂质纳米粒子在pH7.4的Tris－HCl中测定出的电荷变低，能抑制在生物体内产生非特异性的吸附、免疫反应。
此外，如表3所示，由实施例1、2、5的脂质得到的脂质纳米粒子具有高的mRNA的包封率。因此，能高效地得到包封mRNA的脂质纳米粒子。
而且，如表3的蛋白质表达量和CTF检测(关于毒性的评价)的结果所示，可知由实施例1、2、5的脂质得到的脂质纳米粒子使期望的蛋白质以一定量表达，就是说，脂质纳米粒子到达细胞内，通过脂质纳米粒子含有的mRNA而蛋白质表达。因此，实施例1、2、5的脂质能有效地将mRNA送达至细胞内。
此外，如表3所示，就实施例1、2、5的脂质而言，在细胞实验中生存的细胞数量多。因此，可知实施例1、2、5的脂质在用于将mRNA送达至靶细胞、组织的情况下，细胞毒性也低。
需要说明的是，在表3中也示出了使用了用作mRNA疫苗的脂质的参考例1的脂质(r1)的例子，可知使用了实施例1、2、5的脂质的结果与使用了参考例1的脂质的结果相比为良好的结果。
(3)关于体内动物实验的评价结果
接着，将使用实施例2、11、12的脂质制作出的、体内动物实验用的脂质纳米粒子的评价结果示于表4。
[表4]
根据实施例2的结果，可知通过在调整含脂质纳米粒子的溶液时，使聚乙二醇修饰脂质存在，能大幅提高蛋白质表达量。此外，如由实施例11、12的结果可知的那样，可知在使用了由实施例11、12的脂质制作出的含脂质纳米粒子的溶液的情况下，能大幅提高蛋白质表达量。
因此，就本实施方式的脂质而言，能想到通过在调整含脂质纳米粒子的溶液时，使本实施方式的脂质以外的分子存在，能得到更良好的特性。
产业上的可利用性
根据本发明，能提供一种脂质和组合物，该脂质能将核酸等导入化合物有效地送达至细胞质。

Claims (15)

1.一种脂质，其是下述式(I)所示的脂质，
式中，R1为碳原子数32～48的烃基，R2为一个任意的氨基酸的侧链或所述氨基酸的衍生物的侧链，R3为碱性氨基酸的侧链或所述氨基酸的衍生物的侧链。
2.根据权利要求1所述的脂质，其中，
R2为亲水性氨基酸的侧链或亲水性氨基酸的衍生物的侧链。
3.根据权利要求1或2所述的脂质，其中，
R2为选自由天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、丝氨酸以及苏氨酸构成的组中的氨基酸的侧链或所述氨基酸的衍生物的侧链。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的脂质，其中，
R2为选自由天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸以及苏氨酸构成的组中的氨基酸的侧链或所述氨基酸的衍生物的侧链。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的脂质，其中，
R3为选自由赖氨酸、组氨酸、精氨酸构成的组中的氨基酸的侧链或所述氨基酸的衍生物的侧链。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的脂质，其中，
R3为精氨酸的侧链或精氨酸的衍生物的侧链。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的脂质，其中，
R1为碳原子数32～48的支链状的烃基。
8.根据权利要求7所述的脂质，其中，
R1由下述式(II)表示，
式中，R11为碳原子数a的直链状的烃基，R12为碳原子数b的直链状的烃基，在此，a和b满足31≤a+b≤47。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的脂质，其中，
所述脂质由下述式(Ia)～(Il)中的任意式表示，
10.根据权利要求1～9中任一项所述的脂质，其中，
所述脂质为导入化合物的细胞内导入用。
11.根据权利要求10所述的脂质，其中，
导入化合物为核酸。
12.根据权利要求11所述的脂质，其中，
核酸为具有利用了RNA干扰即RNAi的、目的基因的表达抑制作用的核酸；或mRNA。
13.根据权利要求12所述的脂质，其中，
核酸为siRNA或mRNA。
14.一种组合物，其为如权利要求1～13中的任一项所述的脂质与导入化合物的组合物。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中，
多个所述脂质集合而形成脂质纳米粒子，在所述脂质纳米粒子的内部包含导入化合物。
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