CN102532259A - 基于寡肽的阳离子脂质衍生物及在药剂制剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药用辅料与制剂领域。具体涉及一类具有寡肽阳离子脂质衍生物(i)或(ii)及其制备方法，还涉及其作为药物载体在制剂中的应用如组装成脂质体、胶束。本发明的阳离子脂质体具有很强的缓冲能力，在酸性的溶酶体环境下能够发生质子海绵作用，可以与质粒dna、寡核苷酸以及小分子干扰(sirna)进行结合形成复合物纳米粒。
Description
技术领域
本发明涉及药用辅料与制剂领域。具体涉及一类具有寡肽阳离子脂质衍生物及其制备方法，还涉及其作为药物载体在制剂中的应用如组装成脂质体、胶束。
背景技术
随着分子生物学的发展，特别是人类基因库的建立和人类疾病相关基因的阐明，疾病的基因治疗应运而生。目前，基因治疗已发展为当代医学和生物学的一个新的研究领域。由于多数基因药物的作用靶点位于肿瘤细胞内的胞质、细胞器或细胞核，因此，如何将治疗基因药物导入人体乃至病变部位就成为了医学、生物学和药学领域的一个研究热点。
基因药物一般为质粒DNA、寡核苷酸、小干扰RNA等，其表面带有大量的负电荷，很难穿透细胞膜进入细胞内部，从而导致靶器官或组织生物利用度极低，极大地限制了基因药物治疗优势的发挥。因此，体外合成的基因药物分子在基础研究和医学领域的成功应用是很大程度上依赖于使用安全而有效的载体将其传送到体内，将基因药物输送到细胞胞质发挥治疗作用。纳米载体进入细胞的主要机制是内吞。内吞形成的溶酶体中存在的各种酶尤其是核糖核酸酶(RNase)可使载体及基因药物发生降解或破坏。因此，载体必须具有三种基本的功能，即(1)保持在血液循环中的稳定性输送基因药物到靶组织；(2)易于被靶细胞内吞入胞；(3)安全从溶酶体中逃逸到胞质并释放基因治疗药物。
目前用于基因药物传递的载体主要包括病毒性和非病毒性载体。病毒载体虽然具有高转染活性，但其免疫毒性极大地限制了应用。非病毒性载体具有低毒，易于合成，免疫反应低等特点，因此得到了广泛的关注。非病毒基因药物载体一般为阳离子性载体，包括阳离子聚合物和阳离子纳米粒，其可以与基因药物通过静电作用自组装形成紧密的复合物，通过胞吞途径进入胞内。其中，阳离子聚合物主要有聚乙烯亚胺(PEI)、聚左旋赖氨酸(PLL)、壳聚糖及其衍生物、聚氨基酯、聚脒和树形分子聚酰胺胺(PAMAM)等，但是阳离子聚合物表面往往带有过量正电荷，粒径很大且不易控制，当进入血液系统中后会和带负电的血清蛋白质结合，导致血液毒性。阳离子纳米载体具有分子量小且易于控制，安全性高等特点，因此在肿瘤化疗及基因给药方面有广泛的研究。阳离子载体的正电荷可以与细胞膜负电荷产生静电作用，容易被内吞进入细胞。另一方面，阳离子载体能结合内涵体中的质子，发生“质子海绵作用”，逃逸出溶酶体，使载体安全到达胞质或其他细胞器。
发明内容
本发明公开了一类的阳离子脂质衍生物，由谷氨酸(或天冬氨酸)-赖氨酸等碱性氨基酸组成亲水头基，由双长链烷烃(正辛醇-正十三醇，油醇，亚油醇)组成疏水尾(结构式I)。或由甘氨酸(或苯丙氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，色氨酸，蛋氨酸，脯氨酸；丝氨酸，苏氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，酪氨酸)-赖氨酸组成亲水头基，由单链烷烃(胆固醇，正辛醇-正二十醇，油醇，亚油醇)组成疏水尾(结构式II)。此外，将衍生物中的氨基酸赖氨酸用碱性氨基酸组氨酸、精氨酸或其组合替代，可以得到一系列其他阳离子脂质衍生物。
本发明的基于寡肽阳离子的结构式(I)或(II)的脂质衍生物如下：
其中n＝1或2
R＝-(CH2)x-CH3，x＝7-12、-(CH2)x-CH＝CH-(CH2)y-CH3，x＝8，y＝8或-(CH2)x-CH＝CH-CH2-CH＝CH-(CH2)y-CH3，x＝8，y＝5；
R2＝-(CH2)n-CH3，n＝7-19、-(CH2)n-CH＝CH-(CH2)m-CH3，n＝8，m＝8、-(CH2)n-CH＝CH-CH2-CH＝CH-(CH2)m-CH3，n＝8，m＝5或
本发明的寡肽阳离子脂质衍生物制备方法包括：
a.将单羧基氨基酸或二元羧基氨基酸和对甲苯磺酸溶于甲苯(或苯，或环己烷)中，回流1h～3h。加入脂肪醇，回流5h～15h。冷却至室温，减压蒸馏去除甲苯(或苯，或环己烷)。用二氯甲烷(或三氯甲烷，或乙酸乙酯)溶解后，5％～15％碳酸氢钠溶液(或碳酸钠，或碳酸钾)、水洗涤，有机层无水硫酸钠(或无水硫酸镁)干燥后浓缩，甲醇(或乙醇，或丙酮)重结晶，得到脂肪醇-单羧基氨基酸(1)或脂肪醇-二元羧基氨基酸(2)，反应式如下：
脂肪醇-单羧基氨基酸的合成反应式1：
脂肪醇-二元羧基氨基酸的合成反应式2：
b.将Boc-L-Lys(Boc)-OH，N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)；N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)(或氯仿)中，室温搅拌1h～3h；将1或2和三乙胺溶于DMF(或氯仿)中，室温搅拌1h～3h后，加入上述混合溶液中，室温搅拌10h～24h。反应结束后，反应液加入水中，二氯甲烷(或氯仿，或乙酸乙酯)萃取产物，浓缩二氯甲烷层(或氯仿，或乙酸乙酯)；乙酸乙酯(或丙酮)溶解，除去析出DCU，重复此操作，直至DCU完全去除。甲醇(或乙醇，或丙酮)重结晶，得到脂肪醇-单羧基氨基酸-赖氨酸(含保护基)(3)或脂肪醇-二元羧基氨基酸-赖氨酸(含保护基)(4)。
脂肪醇-单羧基氨基酸-赖氨酸(含保护基)的合成反应式3：
脂肪醇-二元羧基氨基酸-赖氨酸(含保护基)的合成反应式4：
c.将3或4溶解在三氟醋酸和二氯甲烷混合溶液中，室温搅拌0.5h～4h；反应结束后，加入5％～15％碳酸氢钠溶液(或碳酸钠，或碳酸钾)调pH值至中性，收集有机层，无水硫酸钠(或无水硫酸镁)干燥后浓缩有机层，二氯甲烷/甲醇柱层析，得到脂肪醇-单羧基氨基酸-赖氨酸或脂肪醇-二元羧基氨基酸-赖氨酸。
脂肪醇-单羧基氨基酸-赖氨酸的合成反应式5：
脂肪醇-二元羧基氨基酸-赖氨酸的合成反应式6：
本发明的阳离子脂质衍生物由碱性氨基酸赖氨酸组成头基的亲水部分，长链烷基或胆固醇链组成疏水部分的阳离子脂质衍生物。可以组装成阳离子脂质体或胶束，构建核酸或基因药物递药系统。阳离子载体具有很强的质子缓冲能力，在酸性的溶酶体环境下特别是pH5.5-4.5能够发生质子海绵作用，发挥溶酶体逃逸作用。
本发明还公开了一种空白脂质体，含脂质体基质和权利要求1的脂质衍生物。脂质体基质为磷脂。脂质体基质还可以含胆固醇。
本发明还公开了一种药物脂质体，其中脂质体基质为磷脂。所述药物优选质粒DNA、寡核苷酸或小分子干扰siRNA。
药物和脂质衍生物的氮磷比优选1∶1～1∶10。
本发明的脂质衍生物可用作脂质体修饰剂。
本发明的阳子离脂质材料可以与质粒DNA、寡核苷酸以及小分子干扰(siRNA)进行结合形成复合物纳米粒。
质粒DNA、寡核苷酸以及小分子干扰(siRNA)等基因药物具有负电性，本发明的阳离子脂质材料可形成表面带有正电荷的药物载体，可以和上述基因药物发生静电相互作用，形成二元复合物，从而实现对基因药物的传递。本发明的阳离子脂质可以在水中形成空白脂质体或胶束，其表面带有一定数量的正电荷，质粒DNA、寡核苷酸以及小分子干扰(siRNA)等基因药物可溶于水中，与载体发生静电吸引，从而被吸附在载体表面。另外，我们发明的阳离子脂质由二元氨基氨基酸赖氨酸提供阳离子头部，赖氨酸除具有α氨基之外，侧链还具有裸露的氨基，此结构特性为阳离子脂质提供了很强的正电荷，从而和带负电的质粒DNA、寡核苷酸以及小分子干扰(siRNA)等基因药物结合，形成稳定的二元复合物。本发明中对一系列阳离子脂质的粒径电位进行了测定并评价了阳离子脂质体1，4-亚油醇-谷氨酸-赖氨酸与质粒结合的效率如图1所示。
当脂质体与质粒没有完全复合时，带负电的游离质粒会在电泳条件下向正极移动，与Goldview核酸染料结合后，在紫外灯下会显示出明亮的条带；当二者完全复合后，复合物会滞留在孔内，从而观察不到游离的质粒条带。由上述电泳图可知，当N/P大于1时，质粒被完全复合，泳道中没有出现游离的质粒条带，二者结合完全。
在酸性条件下，赖氨酸上氨基发生质子化而带有很强的正电性，可以与内涵体或者溶酶体膜发生相互作用，使后者发生破坏，内容物被释放到细胞质中。本发明中分别测定了阳离子脂质体和普通脂质体的质子缓冲能力，对比发现，本发明的阳离子脂质体具有很强的缓冲能力，在酸性的溶酶体环境下(pH 5.5-4.5)能够发生质子海绵作用，发挥溶酶体逃逸作用，而普通脂质体没有这种作用，如图2所示。
附图说明
图1是不同比例的阳离子脂质和质粒复合物的凝胶阻滞电泳
图2是阳离子脂质体和普通脂质体的质子缓冲能力
具体实施方式
实施例1
1，5-正辛醇-谷氨酸-赖氨酸的制备
将谷氨酸(2.9g，19.7mmol)和对甲苯磺酸(4.1g，23.7mmol)溶于60mL甲苯中，回流1h。加入正辛醇(5.1g，39.4mmol)回流12h。反应结束后，减压蒸馏去除甲苯。浓缩物用适量二氯甲烷溶解，5％碳酸氢钠溶液洗涤(10mL×2)，水洗涤(10mL×1)，有机层无水硫酸钠干燥后浓缩，甲醇重结晶，得到白色粉末状固体1，5-正辛醇-谷氨酸(OC2-Glu)。将Boc-L-Lys(Boc)-OH(2.9g，8.4mmol)，N，N-二环己基碳二亚胺(DCC，5.1g，25mmol)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS，1.5g，12.6mmol)溶于100mLDMF中，室温搅拌3h；将OC2-Glu(3.1g，8.4mmol)加入上述混合溶液中，室温搅拌12h。滤去DCU，加入100mL二氯甲烷，水洗(60mL×3)除DMF，干燥二氯甲烷层，浓缩物用甲醇重结晶，得到白色粉末状固体3.8g。将上述得到的白色粉末状固体(3.8g，5.3mmol)溶解在4mL三氟醋酸和4mL二氯甲烷混合溶液中，室温搅拌4h；反应结束后，加入5％碳酸氢钠溶液调pH值至中性，收集有机层，无水硫酸钠干燥后浓缩，浓缩物采用二氯甲烷/甲醇柱层析，得到1，5-正辛醇-谷氨酸-赖氨酸(OC2-Glu-Lys，1.4g，42.4％)。
1H-NMR(CDCl3，500MHz，δppm)：0.96(t，6H，CH3)，1.29(m，26H，CH2)，1.55(m，2H，CH2CH2NH2)，1.57(m，4H，CH2)，1.79(m，2H，CHCH2)，2.65(m，2H，CH2NH2)，2.29(m，2H，CHCH2)，2.25(m，2H，CH2CO)，3.56(s，1H，CHNH2)，4.42(s，1H，CHNH)，4.08(m，4H，CH2-O).
13C-NMR(CDCl3+CD3OD，75MHz，δppm)：14.1(CH3)，20.7(CHCH2CH2)，22.8(CH2)，25.9(CH2)，26.6(CHCH2)，28.2(CH2CO)，29.0(CH2)，29.4(CH2)，29.7(CH2)，31.9(CH2)，32.1(CH2CH2NH2)，34.3(CHCH2)，42.1(CH2NH2)，52.3(CHNH)，54.4(CHNH)，65.3(CH2-O)，171.1(C＝O)，171.6(CHCO)，173.1(C＝O).
实施例2
1，5-正癸醇-谷氨酸-赖氨酸的制备
将谷氨酸(2.9g，19.7mmol)和对甲苯磺酸(4.1g，23.7mmol)溶于60mL甲苯中，回流1h。加入正癸醇(6.2g，39.4mmol)回流12h。反应结束后，减压蒸馏去除甲苯。浓缩物用适量二氯甲烷溶解，5％碳酸氢钠溶液洗涤(10mL×2)，水洗涤(10mL×1)，有机层无水硫酸钠干燥后浓缩，甲醇重结晶，得到白色粉末状固体1，5-正癸醇-谷氨酸(DA2-Glu)。将Boc-L-Lys(Boc)-OH(2.9g，8.4mmol)，DCC(5.1g，25mmol)和NHS(1.5g，12.6mmol)溶于100mLDMF中，室温搅拌3h；将DA2-Glu(3.6g，8.4mmol)加入上述混合溶液中，室温搅拌12h。滤去DCU，加入100mL二氯甲烷，水洗(60mL×3)除DMF，干燥二氯甲烷层，浓缩物用甲醇重结晶，得到白色粉末状固体4g。将上述得到的白色粉末状固体(4g，5.3mmol)溶解在4mL三氟醋酸和4mL二氯甲烷混合溶液中，室温搅拌4h；反应结束后，加入5％碳酸氢钠溶液调pH值至中性，收集有机层，无水硫酸钠干燥后浓缩，浓缩物采用二氯甲烷/甲醇柱层析，得到1，5-正癸醇-谷氨酸-赖氨酸(DA2-Glu-Lys，1.5g，51.7％)。
1H-NMR(CDCl3，500MHz，δppm)：0.96(t，6H，CH3)，1.29(m，30H，CH2)，1.55(m，2H，CH2CH2NH2)，1.57(m，4H，CH2)，1.79(m，2H，CHCH2)，2.65(m，2H，CH2NH2)，2.29(m，2H，CHCH2)，2.25(m，2H，CH2CO)，3.56(s，1H，CHNH2)，4.42(s，1H，CHNH)，4.08(m，4H，CH2-O).
13C-NMR(CDCl3+CD3OD，75MHz，δppm)：14.1(CH3)，20.7(CHCH2CH2)，22.8(CH2)，25.9(CH2)，26.6(CHCH2)，28.2(CH2CO)，29.0(CH2)，29.4(CH2)，29.7(CH2)，31.9(CH2)，32.1(CH2CH2NH2)，34.3(CHCH2)，42.1(CH2NH2)，52.3(CHNH)，54.4(CHNH)，65.3(CH2-O)，171.1(C＝O)，171.6(CHCO)，173.1(C＝O).
实施例3
1，5-正十二醇-谷氨酸-赖氨酸的制备
将谷氨酸(2.9g，19.7mmol)和对甲苯磺酸(4.1g，23.7mmol)溶于60mL甲苯中，回流1h。加入正十二醇(7.3g，39.4mmol)回流12h。反应结束后，减压蒸馏去除甲苯。浓缩物用适量二氯甲烷溶解，5％碳酸氢钠溶液洗涤(10mL×2)，水洗涤(10mL×1)，有机层无水硫酸钠干燥后浓缩，甲醇重结晶，得到白色粉末状固体1，5-正十二醇-谷氨酸(DO2-Glu)。将Boc-L-Lys(Boc)-OH(2.9g，8.4mmol)，DCC(5.1g，25mmol)和NHS(1.5g，12.6mmol)溶于100mLDMF中，室温搅拌3h；将DO2-Glu(4.1g，8.4mmol)加入上述混合溶液中，室温搅拌12h。滤去DCU，加入100mL二氯甲烷，水洗(60mL×3)除DMF，干燥二氯甲烷层，浓缩物用甲醇重结晶，得到白色粉末状固体4.3g。将上述得到的白色粉末状固体(4.3g，5.3mmol)溶解在4mL三氟醋酸和4mL二氯甲烷混合溶液中，室温搅拌4h；反应结束后，加入5％碳酸氢钠溶液调pH值至中性，收集有机层，无水硫酸钠干燥后浓缩，浓缩物采用二氯甲烷/甲醇柱层析，得到1，5-正十二醇-谷氨酸-赖氨酸(DO2-Glu-Lys，1.7g，45.1％)。
1H-NMR(CDCl3，500MHz，δppm)：0.96(t，6H，CH3)，1.29(m，38H，CH2)，1.55(m，2H，CH2CH2NH2)，1.57(m，4H，CH2)，1.79(m，2H，CHCH2)，2.65(m，2H，CH2NH2)，2.29(m，2H，CHCH2)，2.25(m，2H，CH2CO)，3.56(s，1H，CHNH2)，4.42(s，1H，CHNH)，4.08(m，4H，CH2-O).
13C-NMR(CDCl3+CD3OD，75MHz，δppm)：14.1(CH3)，20.7(CHCH2CH2)，22.8(CH2)，25.9(CH2)，26.6(CHCH2)，28.2(CH2CO)，29.0(CH2)，29.4(CH2)，29.7(CH2)，31.9(CH2)，32.1(CH2CH2NH2)，34.3(CHCH2)，42.1(CH2NH2)，52.3(CHNH)，54.4(CHNH)，65.3(CH2-O)，171.1(C＝O)，171.6(CHCO)，173.1(C＝O).
实施例4
1，5-正十三醇-谷氨酸-赖氨酸的制备
将谷氨酸(2.9g，19.7mmol)和对甲苯磺酸(4.1g，23.7mmol)溶于60mL甲苯中，回流1h。加入正十三醇(8.9g，39.4mmol)回流12h。反应结束后，减压蒸馏去除甲苯。浓缩物用适量二氯甲烷溶解，5％碳酸氢钠溶液洗涤(10mL×2)，水洗涤(10mL×1)，有机层无水硫酸钠干燥后浓缩，甲醇重结晶，得到白色粉末状固体1，5-正十三醇-谷氨酸(Tr2-Glu)。将Boc-L-Lys(Boc)-OH(2.9g，8.4mmol)，DCC(5.1g，25mmol)和NHS(1.5g，12.6mmol)溶于100mLDMF中，室温搅拌3h；将Tr2-Glu(4.8g，8.4mmol)加入上述混合溶液中，室温搅拌12h。滤去DCU，加入100mL二氯甲烷，水洗(60mL×3)除DMF，干燥二氯甲烷层，浓缩物用甲醇重结晶，得到白色粉末状固体4.6g。将上述得到的白色粉末状固体(4.6g，5.3mmol)溶解在4mL三氟醋酸和4mL二氯甲烷混合溶液中，室温搅拌4h；反应结束后，加入5％碳酸氢钠溶液调pH值至中性，收集有机层，无水硫酸钠干燥后浓缩，浓缩物采用二氯甲烷/甲醇柱层析，得到1，5-正十三醇-谷氨酸-赖氨酸(Tr2-Glu-Lys，2.2g，62.9％)。
1H-NMR(CDCl3，500MHz，δppm)：0.96(t，6H，CH3)，1.29(m，50H，CH2)，1.55(m，2H，CH2CH2NH2)，1.57(m，4H，CH2)，1.79(m，2H，CHCH2)，2.65(m，2H，CH2NH2)，2.29(m，2H，CHCH2)，2.25(m，2H，CH2CO)，3.56(s，1H，CHNH2)，4.42(s，1H，CHNH)，4.08(m，4H，CH2-O).
13C-NMR(CDCl3+CD3OD，75MHz，δppm)：14.1(CH3)，20.7(CHCH2CH2)，22.8(CH2)，25.9(CH2)，26.6(CHCH2)，28.2(CH2CO)，29.0(CH2)，29.4(CH2)，29.7(CH2)，31.9(CH2)，32.1(CH2CH2NH2)，34.3(CHCH2)，42.1(CH2NH2)，52.3(CHNH)，54.4(CHNH)，65.3(CH2-O)，171.1(C＝O)，171.6(CHCO)，173.1(C＝O).
实施例5
1，4-亚油醇-天冬氨酸-赖氨酸的制备
将天冬氨酸(3g，22.5mmol)和对甲苯磺酸(4.7g，27.1mmol)溶于100mL甲苯中，回流1h。加入1，4-亚油醇(12g，45mmol)回流12h。反应结束后，减压蒸馏去除甲苯。浓缩物用适量二氯甲烷溶解，5％碳酸氢钠溶液洗涤(20mL×2)，水洗涤(20mL×1)，有机层无水硫酸钠干燥后浓缩，甲醇重结晶，得到白色粉末状固体1，4-亚油醇-天冬氨酸(OCT2-Asp)。将Boc-L-Lys(Boc)-OH(2.9g，8.4mmol)，DCC(5.1g，25mmol)和NHS(1.5g，12.6mmol)溶于100mL DMF中，室温搅拌3h；将OCT2-Asp(5.3g，8.4mmol)加入上述混合溶液中，室温搅拌12h。滤去DCU，加入100ml二氯甲烷，水洗(60mL×3)除DMF，干燥二氯甲烷层，浓缩物用甲醇重结晶，得到白色粉末状固体4.6g。将上述得到的白色粉末状固体(4.6g，4.9mmol)溶解在8mL三氟醋酸和8mL二氯甲烷混合溶液中，室温搅拌4h；反应结束后，加入5％碳酸氢钠溶液调pH值至中性，收集有机层，无水硫酸钠干燥后浓缩；二氯甲烷/甲醇柱层析，得到白色粉末状固体，1，4-亚油醇-天冬氨酸-赖氨酸(OCT2-Asp-L-Lys，1.4g，38.9％)。
1H-NMR(CDCl3，500MHz，δppm)：0.96(t，6H，CH3)，1.29(m，32H，CH2)，1.57(m，4H，CH2)，1.96(m，8H，CH2)，2.63(m，4H，CH2)，4.08(m，2H，CH2)，5.4(m，4H，CH＝CH)，5.49(m，4H，CH＝CH)，1.57(m，4H，CH2)，1.79(m，2H，CHCH2)，2.65(m，2H，CH2NH2)，3.95(s，1H，CHNH2)，5.06(s，1H，CHNH).
13C-NMR(CDCl3+CD3OD，75MHz，δppm)：14.1(CH3)，22.9(CH2)，25.9(CH2)，29.0(CH2)，29.4(CH2)，29.8(CH2)，30.0(CH2)，32.0(CH2)，33.0(CHCH2)，33.8(CH2)，37.3(CHCH2)，37.6(CH2)，65.3(CH2)，48.6(CONH)，53.9(CONH2)，119.6(CH＝CH)，133.5(C＝CH)，127.3(CH＝CH)，132.2(CH＝CH)，171.6(C＝O)，173.1(C＝O)，171.8(CHCO).
实施例6
1，4-亚油醇-谷氨酸-赖氨酸的制备
将谷氨酸(2.8g，22.5mmol)和对甲苯磺酸(4.7g，27.1mmol)溶于100mL甲苯中，回流1h。加入1，4-亚油醇(12g，45mmol)回流12h。反应结束后，减压蒸馏去除甲苯。浓缩物用适量二氯甲烷溶解，5％碳酸氢钠溶液洗涤(20mL×2)，水洗涤(20mL×1)，有机层无水硫酸钠干燥后浓缩，甲醇重结晶，得到白色粉末状固体1，4-亚油醇-谷氨酸(OCT2-Glu)。将Boc-L-Lys(Boc)-OH(2.9g，8.4mmol)，DCC(5.1g，25mmol)和NHS(1.5g，12.6mmol)溶于100mL DMF中，室温搅拌3h；将OCT2-Glu(5.2g，8.4mmol)加入上述混合溶液中，室温搅拌12h。滤去DCU，加入100ml二氯甲烷，水洗(60mL×3)除DMF，干燥二氯甲烷层，浓缩物用甲醇重结晶，得到白色粉末状固体4.5g。将上述得到的白色粉末状固体(4.5g，4.9mmol)溶解在8mL三氟醋酸和8mL二氯甲烷混合溶液中，室温搅拌4h；反应结束后，加入5％碳酸氢钠溶液调pH值至中性，收集有机层，无水硫酸钠干燥后浓缩；二氯甲烷/甲醇柱层析，得到白色粉末状固体，1，4-亚油醇-谷氨酸-赖氨酸(OCT2-Glu-L-Lys，1.4g，39.7％)。
1H-NMR(CDCl3，500MHz，δppm)：0.96(t，6H，CH3)，1.29(m，32H，CH2)，1.57(m，4H，CH2)，1.96(m，8H，CH2)，2.63(m，2H，CH2)，4.08(m，2H，CH2)，5.4(m，4H，CH＝CH)，5.49(m，4H，CH＝CH)，1.57(m，4H，CH2)，1.79(m，2H，CHCH2)，2.65(m，2H，CH2NH2)，3.95(s，1H，CHNH2)，5.06(s，1H，CHNH).
13C-NMR(CDCl3+CD3OD，75MHz，δppm)：14.1(CH3)，22.9(CH2)，25.9(CH2)，29.0(CH2)，29.4(CH2)，29.8(CH2)，30.0(CH2)，32.0(CH2)，33.0(CHCH2)，33.8(CH2)，37.3(CHCH2)，37.6(CH2)，65.3(CH2)，48.6(CONH)，53.9(CONH2)，119.6(CH＝CH)，133.5(C＝CH)，127.3(CH＝CH)，132.2(CH＝CH)，171.6(C＝O)，173.1(C＝O)，171.8(CHCO).
实施例7
正二十醇-缬氨酸-赖氨酸的制备
将缬氨酸(3g，25.6mmol)和对甲苯磺酸(5.29g，30.7mmol)溶于100mL甲苯中，回流1h。加入正二十醇(7.7g，25.6mmol)回流12h。反应结束后，减压蒸馏去除甲苯。浓缩物用适量二氯甲烷溶解，5％碳酸氢钠溶液洗涤(20mL×2)，水洗涤(20mL×1)，有机层无水硫酸钠干燥后浓缩，甲醇重结晶，得到白色粉末状固体正二十醇-缬氨酸(EI-Val)。将Boc-L-Lys(Boc)-OH(2.9g，8.4mmol)，DCC(5.1g，25mmol)和NHS(1.5g，12.6mmol)溶于100mL DMF中，室温搅拌3h；将EI-Val(3.4g，8.4mmol)加入上述混合溶液中，室温搅拌12h。滤去DCU，加入80ml二氯甲烷，水洗(50mL×3)除DMF，干燥二氯甲烷层，浓缩物用甲醇重结晶，得到白色粉末状固体3.3g。将上述得到的白色粉末状固体(3.3g，4.7mmol)溶解在5mL三氟醋酸和5mL二氯甲烷混合溶液中，室温搅拌4h；反应结束后，加入5％碳酸氢钠溶液调pH值至中性，收集有机层，无水硫酸钠干燥后浓缩，二氯甲烷/甲醇柱层析，得到白色粉末状固体，正二十醇-缬氨酸-赖氨酸(EI-Val-Lys，1.3g，54.2％)。
1H-NMR(CDCl3，500MHz，δppm)：0.96(t，3H，CH3)，1.29(m，34H，CH2)，1.57(m，2H，CH2)，1.96(m，4H，CH2)，1.01(t，6H，CH3)，3.09(s，1H，CH-CH3)，1.79(m，2H，CHCH2)，1.55(m，2H，CH2CH2NH)，2.65(m，2H，CH2NH)，3.56(s，1H，CHNH2)，4.08(m，2H，CH2-O).4.41(s，1H，CHNH).
13C-NMR(CDCl3+CD3OD，75MHz，δppm)：14.1(CH3)，17.5(CH3)，22.8(CH2)，24.3(CH2CH2NH)，25.9(CH2)，29.0(CH2)，29.4(CH2)，29.8(CH2)，30.0(CH2)，30.5(CHCH3)，31.7(CHCH2)，31.9(CH2)，33.7(CH2)，37.1(CH2NH)，54.1(CHNH2)，55.9(CHNH)，65.3(CH2-O)，171.1(COCH)，171.6(C＝O)，
实施例8
正十六醇-丙氨酸-赖氨酸的制备
将丙氨酸(2.3g，25.6mmol)和对甲苯磺酸(5.29g，30.7mmol)溶于100mL甲苯中，回流1h。加入正十六醇(6.2g，25.6mmol)回流12h。反应结束后，减压蒸馏去除甲苯。浓缩物用适量二氯甲烷溶解，5％碳酸氢钠溶液洗涤(20mL×2)，水洗涤(20mL×1)，有机层无水硫酸钠干燥后浓缩，甲醇重结晶，得到白色粉末状固体正十六醇-丙氨酸(HE-Ala)。将Boc-L-Lys(Boc)-OH(2.9g，8.4mmol)，DCC(5.1g，25mmol)和NHS(1.5g，12.6mmol)溶于100mL DMF中，室温搅拌3h；将HE-Ala(2.7g，8.4mmol)加入上述混合溶液中，室温搅拌12h。滤去DCU，加入80ml二氯甲烷，水洗(50mL×3)除DMF，干燥二氯甲烷层，浓缩物用甲醇重结晶，得到白色粉末状固体2.9g。将上述得到的白色粉末状固体(2.9g，4.7mmol)溶解在5mL三氟醋酸和5mL二氯甲烷混合溶液中，室温搅拌4h；反应结束后，加入5％碳酸氢钠溶液调pH值至中性，收集有机层，无水硫酸钠干燥后浓缩，浓缩物二氯甲烷/甲醇柱层析，得到白色粉末状固体，正十六醇-丙氨酸-赖氨酸(HE-Ala-Lys，1.2g，50.0％)。
1H-NMR(CDCl3，500MHz，δppm)：0.96(t，3H，CH3)，1.29(m，26H，CH2)，1.57(m，4H，CH2)，1.79(m，2H，CHCH2)，2.65(m，2H，CH2NH2)，1.96(m，4H，CH2)，1.01(t，6H，CH3)，3.09(s，1H，CH-CH3)，1.79(m，2H，CHCH2)，1.55(m，2H，CH2CH2NH)，2.65(m，2H，CH2NH)，3.56(s，1H，CHNH2)，4.08(m，2H，CH2-O).4.41(s，1H，CHNH).
13C-NMR(CDCl3+CD3OD，75MHz，δppm)：14.1(CH3)，17.5(CH3)，22.8(CH2)，24.3(CH2CH2NH)，25.9(CH2)，29.0(CH2)，29.4(CH2)，29.8(CH2)，30.0(CH2)，30.5(CHCH3)，31.7(CHCH2)，31.9(CH2)，33.7(CH2)，37.1(CH2NH)，54.1(CHNH2)，55.9(CHNH)，65.3(CH2-O)，158(C＝NH)，171.1(COCH)，171.6(C＝O)，
实施例9
正十八醇-甘氨酸-赖氨酸
将甘氨酸(2.1g，25.6mmol)和对甲苯磺酸(5.29g，30.7mmol)溶于100mL甲苯中，回流1h。加入正十八醇(6.4g，25.6mmol)回流12h。反应结束后，减压蒸馏去除甲苯。浓缩物用适量二氯甲烷溶解，5％碳酸氢钠溶液洗涤(20mL×2)，水洗涤(20mL×1)，有机层无水硫酸钠干燥后浓缩，甲醇重结晶，得到白色粉末状固体正十八醇-甘氨酸(SA-Gly)。将Boc-L-Lys(Boc)-OH(2.9g，8.4mmol)，DCC(5.1g，25mmol)和NHS(1.5g，12.6mmol)溶于100mL DMF中，室温搅拌3h；将SA-Gly(2.7g，8.4mmol)加入上述混合溶液中，室温搅拌12h。滤去DCU，加入80ml二氯甲烷，水洗(50mL×3)除DMF，干燥二氯甲烷层，浓缩物用甲醇重结晶，得到白色粉末状固体2.89g。将上述得到的白色粉末状固体(2.89g，4.7mmol)溶解在5mL三氟醋酸和5mL二氯甲烷混合溶液中，室温搅拌4h；反应结束后，加入5％碳酸氢钠溶液调pH值至中性，收集有机层，无水硫酸钠干燥后浓缩，浓缩物二氯甲烷/甲醇柱层析，得到白色粉末状固体，正十八醇-甘氨酸-赖氨酸(SA-Gly-Lys，1.2g，51.0％)。
1H-NMR(CDCl3，500MHz，δppm)：0.96(t，3H，CH3)，1.29(m，26H，CH2)，1.57(m，4H，CH2)，1.79(m，2H，CHCH2)，2.65(m，2H，CH2NH2)，1.96(m，4H，CH2)，1.01(t，6H，CH3)，3.09(s，1H，CH-CH3)，1.79(m，2H，CHCH2)，1.55(m，2H，CH2CH2NH)，2.65(m，2H，CH2NH)，3.56(s，1H，CHNH2)，4.08(m，2H，CH2-O).4.41(s，1H，CHNH).
13C-NMR(CDCl3+CD3OD，75MHz，δppm)：14.1(CH3)，17.5(CH3)，22.8(CH2)，24.3(CH2CH2NH)，25.9(CH2)，29.0(CH2)，29.4(CH2)，29.8(CH2)，30.0(CH2)，30.5(CHCH3)，31.7(CHCH2)，31.9(CH2)，33.7(CH2)，37.1(CH2NH)，54.1(CHNH2)，55.9(CHNH)，65.3(CH2-O)，158(C＝NH)，171.1(COCH)，171.6(C＝O)，
实施例10
正十二醇-亮氨酸-赖氨酸的制备
将亮氨酸(3.3g，25.6mmol)和对甲苯磺酸(5.29g，30.7mmol)溶于100mL甲苯中，回流1h。加入正十二醇(4.8g，25.6mmol)回流12h。反应结束后，减压蒸馏去除甲苯。浓缩物用适量二氯甲烷溶解，5％碳酸氢钠溶液洗涤(20mL×2)，水洗涤(20mL×1)，有机层无水硫酸钠干燥后浓缩，甲醇重结晶，得到白色粉末状固体正十二醇-亮氨酸(DO-Leu)。将Boc-L-Lys(Boc)-OH(2.9g，8.4mmol)，DCC(5.1g，25mmol)和NHS(1.5g，12.6mmol)溶于100mL DMF中，室温搅拌3h；将DO-Leu(2.5g，8.4mmol)加入上述混合溶液中，室温搅拌12h。滤去DCU，加入80ml二氯甲烷，水洗(50mL×3)除DMF，干燥二氯甲烷层，浓缩物用甲醇重结晶，得到白色粉末状固体2.6g。将上述得到的白色粉末状固体(2.6g，4.7mmol)溶解在5mL三氟醋酸和5mL二氯甲烷混合溶液中，室温搅拌4h；反应结束后，加入5％碳酸氢钠溶液调pH值至中性，收集有机层，无水硫酸钠干燥后浓缩，浓缩物(二氯甲烷/甲醇柱层析，得到白色粉末状固体，正十二醇-亮氨酸-赖氨酸(DO-Leu-Lys，0.7g，40.7％)。
1H-NMR(CDCl3，500MHz，δppm)：0.96(t，3H，CH3)，1.29(m，18H，CH2)，1.57(m，4H，CH2)，1.79(m，2H，CHCH2)，2.65(m，2H，CH2NH2)，1.96(m，4H，CH2)，1.01(t，6H，CH3)，3.09(s，1H，CH-CH3)，1.79(m，2H，CHCH2)，1.55(m，2H，CH2CH2NH)，2.65(m，2H，CH2NH)，3.56(s，1H，CHNH2)，4.08(m，2H，CH2-O)，4.41(s，1H，CHNH).
13C-NMR(CDCl3+CD3OD，75MHz，δppm)：14.1(CH3)，17.5(CH3)，22.8(CH2)，24.3(CH2CH2NH)，25.9(CH2)，29.0(CH2)，29.4(CH2)，29.8(CH2)，30.0(CH2)，30.5(CHCH3)，31.7(CHCH2)，31.9(CH2)，33.7(CH2)，37.1(CH2NH)，54.1(CHNH2)，55.9(CHNH)，65.3(CH2-O)，171.1(COCH)，171.6(C＝O)，
实施例11
正辛醇-异亮氨酸-赖氨酸的制备
将异亮氨酸(3.3g，25.6mmol)和对甲苯磺酸(5.29g，30.7mmol)溶于100mL甲苯中，回流1h。加入正辛醇(3.3g，25.6mmol)回流12h。反应结束后，减压蒸馏去除甲苯。浓缩物用适量二氯甲烷溶解，5％碳酸氢钠溶液洗涤(20mL×2)，水洗涤(20mL×1)，有机层无水硫酸钠干燥后浓缩，甲醇重结晶，得到白色粉末状固体正辛醇-异亮氨酸(OC-Ile)。将Boc-L-Lys(Boc)-OH(2.9g，8.4mmol)，DCC(5.1g，25mmol)和NHS(1.5g，12.6mmol)溶于100mL DMF中，室温搅拌3h；将OC-Ile(1.9g，8.4mmol)加入上述混合溶液中，室温搅拌12h。滤去DCU，加入80ml二氯甲烷，水洗(50mL×3)除DMF，干燥二氯甲烷层，浓缩物用甲醇重结晶，得到白色粉末状固体2.5g。将上述得到的白色粉末状固体(2.5g，4.7mmol)溶解在5mL三氟醋酸和5mL二氯甲烷混合溶液中，室温搅拌4h；反应结束后，加入5％碳酸氢钠溶液调pH值至中性，收集有机层，无水硫酸钠干燥后浓缩，二氯甲烷/甲醇柱层析，得到白色粉末状固体，正辛醇-异亮氨酸-赖氨酸(OC-Ile-Lys，0.6g，39.5％)。
1H-NMR(CDCl3，500MHz，δppm)：0.96(t，3H，CH3)，1.29(m，10H，CH2)，1.57(m，4H，CH2)，1.79(m，2H，CHCH2)，2.65(m，2H，CH2NH2)，1.96(m，4H，CH2)，1.01(t，6H，CH3)，3.09(s，1H，CH-CH3)，1.79(m，2H，CHCH2)，1.55(m，2H，CH2CH2NH)，2.65(m，2H，CH2NH)，3.56(s，1H，CHNH2)，4.08(m，2H，CH2-O)，4.41(s，1H，CHNH).
13C-NMR(CDCl3+CD3OD，75MHz，δppm)：14.1(CH3)，17.5(CH3)，22.8(CH2)，24.3(CH2CH2NH)，25.9(CH2)，29.0(CH2)，29.4(CH2)，29.8(CH2)，30.0(CH2)，30.5(CHCH3)，31.7(CHCH2)，31.9(CH2)，33.7(CH2)，37.1(CH2NH)，54.1(CHNH2)，55.9(CHNH)，65.3(CH2-O)，158(C＝NH)，171.1(COCH)，171.6(C＝O)，
实施例12
油醇-苯丙氨酸-赖氨酸的制备
将苯丙氨酸(4.2g，25.6mmol)和对甲苯磺酸(5.29g，30.7mmol)溶于100mL甲苯中，回流1h。加入油醇(6.9g，25.6mmol)回流12h。反应结束后，减压蒸馏去除甲苯。浓缩物用适量二氯甲烷溶解，5％碳酸氢钠溶液洗涤(20mL×2)，水洗涤(20mL×1)，有机层无水硫酸钠干燥后浓缩，甲醇重结晶，得到白色粉末状固体油醇-苯丙氨酸(OA-Phe)。将Boc-L-Lys(Boc)-OH(2.9g，8.4mmol)，DCC(5.1g，25mmol)和NHS(1.5g，12.6mmol)溶于100mL DMF中，室温搅拌3h；将OA-Phe(3.5g，8.4mmol)加入上述混合溶液中，室温搅拌12h。滤去DCU，加入80ml二氯甲烷，水洗(50mL×3)除DMF，干燥二氯甲烷层，浓缩物用甲醇重结晶，得到白色粉末状固体3.4g。将上述得到的白色粉末状固体(3.4g，4.7mmol)溶解在5mL三氟醋酸和5mL二氯甲烷混合溶液中，室温搅拌4h；反应结束后，加入5％碳酸氢钠溶液调pH值至中性，收集有机层，无水硫酸钠干燥后浓缩；二氯甲烷/甲醇柱层析，得到白色粉末状固体，油醇-苯丙氨酸-赖氨酸(OA-Phe-Lys，1.2g，35.8％)。
1H-NMR(CDCl3，500MHz，δppm)：0.96(t，3H，CH3)，1.29(m，22H，CH2)，1.57(m，4H，CH2)，1.79(m，2H，CHCH2)，2.65(m，2H，CH2NH2)，1.96(m，4H，CH2)，5.48(m，2H，CH＝CH)，1.01(t，6H，CH3)，3.09(s，1H，CH-CH3)，1.79(m，2H，CHCH2)，1.55(m，2H，CH2CH2NH)，2.65(m，2H，CH2NH)，3.56(s，1H，CHNH2)，4.41(s，1H，CHNH)，7.1-7.2(m，5H，CHbenzene).
13C-NMR(CDCl3+CD3OD，75MHz，δppm)：14.1(CH3)，17.5(CH3)，22.8(CH2)，24.3(CH2CH2NH)，25.9(CH2)，29.0(CH2)，29.4(CH2)，29.8(CH2)，30.0(CH2)，30.5(CHCH3)，31.7(CHCH2)，31.9(CH2)，33.7(CH2)，37.1(CH2NH)，54.1(CHNH2)，55.9(CHNH)，65.3(CH2-O)，130.7(CH＝CH)，171.1(COCH)，171.6(C＝O)，
实施例13
胆固醇-异亮氨酸-赖氨酸的制备
将异亮氨酸(2.9g，22.1mmol)和对甲苯磺酸(4.6g，26.5mmol)溶于100mL甲苯中，回流1h。加入胆固醇(8.5g，22.1mmol)回流12h。反应结束后，减压蒸馏去除甲苯。浓缩物用适量二氯甲烷溶解，5％碳酸氢钠溶液洗涤(50mL×2)，水洗涤(50mL×1)，有机层无水硫酸钠干燥后浓缩，甲醇重结晶，得到白色粉末状固体胆固醇-异亮氨酸(Chol-Ile)。将Boc-L-Lys(Boc)-OH(3.2g，8.4mmol)，DCC(5.1g，25mmol)和NHS(1.5g，12.6mmol)溶于100mL DMF中，室温搅拌3h；将Chol-Ile(4.2g，8.4mmol)加入上述混合溶液中，室温搅拌12h。滤去DCU，加入100ml二氯甲烷，水洗(50mL×3)除DMF，干燥二氯甲烷层，浓缩物用甲醇重结晶，得到白色粉末状固体5g。将上述得到的白色粉末状固体(5g，6.0mmol)溶解在8mL三氟醋酸和8mL二氯甲烷混合溶液中，室温搅拌4h；反应结束后，加入5％碳酸氢钠溶液调pH值至中性，收集有机层，无水硫酸钠干燥后浓缩，二氯甲烷/甲醇柱层析，得到白色粉末状固体，胆固醇-异亮氨酸-赖氨酸(Chol-Ile-Lys，1.4g，36.8％)。
1H-NMR(CDCl3，500MHz，δppm)：1.01(t，6H，CH3)，1.06(t，3H，CH3)，1.16(t，3H，CH3)，1.25(m，4H，CH2)，0.96(t，3H，CH2CH3)，1.28(m，2H，CH2)，1.06(t，3H，CH3)，1.29(m，2H，CH2CH3)，1.47(s，1H，CHCH3)，1.6，1.35(m，4H，CH2)，1.4(s，1H，CH)，1.24，1.49(m，2H，CH2)，1.27，1.52(m，2H，CH2)，1.26(t，3H，CH3)，1.38，1.13(m，2H，CH2)，1.4，1.65(m，2H，CH2)，1.4，1.65(m，2H，CH2)，1.57(m，4H，CH2)，1.79(m，2H，CHCH2)，2.65(m，2H，CH2NH2)，1.64(s，1H，CHCH3)，1.79，2.04(m，2H，CH2)，2.08，2.33(m，2H，CH2)，2.91(s，1H，CHCH3)，2.92，3.17(m，2H，CH2CH＝CH)，3.95(s，1H，CHNH2)，3.99(s，1H，CH-O)，4.41(s，1H，CHNH)，5.37(s，1H，C＝CH).
13C-NMR(CDCl3+CD3OD，75MHz，δppm)：15.0(CH3)，19.4(CH3)，20.7(CH3)，23.2(CH3)，24.7(CH2)，25.1(CH2)，27.3(CH2)，28.2(CHCH3)，28.5(CH2)，30.0(CH2)，30.3(CH2)，31.9(CH2)，33.0(CH2-C＝CH)，35.8(CHCH3)，36.1(CH2)，37.2(CH2)，37.5(C-CH3)，38.6(CH2)，39.9(CH2)，44.0(C-CH)，50.8(CH)，56.5(CH)，58.3(CH)，121.9(CH＝C)，140.9(C＝CH)，73.9(CH-O)，11.3(CH3)，36.3(CHCH3)，53.7(CHNH)，53.9(CHNH2)，119.6(C＝CH)，133.5(CH＝N)，135.5(C＝NH)，171.6(COO)，171.8(CONH).
实施例14
取磷脂90mg，胆固醇12mg，阳离子脂质衍生物1，5-正辛醇-谷氨酸-赖氨酸(30mg)、1，5-正十三醇-谷氨酸-赖氨酸(30mg)、1，4-亚油醇-天冬氨酸-赖氨酸(40mg)或1，4-亚油醇-谷氨酸-赖氨酸(40mg)溶于5ml氯仿与1ml甲醇的混合有机溶剂中。旋转蒸发15min除去有机溶剂，真空干燥过夜。将加入5ml水，在37℃下水合30min。探头超声10-30min。得到的脂质体溶液定依次过0.8um，0.45um，0.22um滤膜，即得到阳离子脂质体溶液，其粒径和电位性质如表1所示。
表1空白脂质体的性质
实施例15
将实施例14中制备的的寡肽两性阳离子脂质体1，4-亚油醇-谷氨酸-赖氨酸和cpusiRNA2分别用水稀释后，保持每个样品中加入的cpusiRNA2(其序列如下：正义链：5’-GAAUUUGAGGAAACUGCGAtt-3’反义链：3’-ttCUUAAACUCCUUUGACGCU-5；cpusiRNA2对肝癌，肺癌，乳腺癌，胃癌等多种癌细胞生长均有显著的抑制作用，具有广谱抗肿瘤作用，尤其是抗肝癌活性十分显著。CN200710020520)质量一定(如2ug)，按照不同的氮磷比(N/P＝0.1，0.2，1，3，5，10)加入一定量的空白脂质体溶液，并用水将样品定容至相同终体积，涡旋10s，室温放置30min，即得材料/cpusiRNA2二元复合物溶液，进行凝胶阻滞电泳实验，紫外灯下观察，结果如图2所示。
实施例16
将10mg阳离子脂质脂质衍生物正十八醇-甘氨酸-赖氨酸，30mg磷脂，加入4ml氯仿与2ml甲醇，超声使之完全溶解；40℃下旋蒸15min使其均匀成膜；抽真空过夜，以除尽有机溶剂；加入5ml水，37℃下水合30min；探头超声30min，过0.22um滤膜。粒径为110nm，表面电位为51.2mv。将cpusiRNA2和空白脂质体分别用水稀释后，保持每个样品中加入的cpusiRNA2质量一定(如2ug)，按照氮磷比(N/P)为2加入一定量的空白脂质体溶液，并用水将样品定容至相同终体积，涡旋10s，室温放置30min，即得材料/cpusiRNA2二元复合物溶液，粒径为155nm，表面电位为34mv。
实施例17
将10mg阳离子脂质脂质衍生物正辛醇-异亮氨酸-赖氨酸，30mg磷脂，加入4ml氯仿与2ml甲醇，超声使之完全溶解；40℃下旋蒸15min使其均匀成膜；抽真空过夜，以除尽有机溶剂；加入5ml水，37℃下水合30min；探头超声30min，过0.22um滤膜。粒径为121nm，表面电位为40.2mv。将cpusiRNA2和空白脂质体分别用水稀释后，保持每个样品中加入的cpusiRNA2质量一定(如2ug)，按照氮磷比(N/P)为2加入一定量的空白脂质体溶液，并用水将样品定容至相同终体积，涡旋10s，室温放置30min，即得材料/cpusiRNA2二元复合物溶液，粒径为187nm，表面电位为35mv。
实施例18
将10mg阳离子脂质脂质衍生物胆固醇-异亮氨酸-赖氨酸，30mg磷脂，加入4ml氯仿与2ml甲醇，超声使之完全溶解；40℃下旋蒸15min使其均匀成膜；抽真空过夜，以除尽有机溶剂；加入5ml水，37℃下水合30min；探头超声30min，过0.22um滤膜。粒径为135nm，表面电位为50.2mv。将cpusiRNA2和空白脂质体分别用水稀释后，保持每个样品中加入的cpusiRNA2质量一定(如2ug)，按照氮磷比(N/P)为2加入一定量的空白脂质体溶液，并用水将样品定容至相同终体积，涡旋10s，室温放置30min，即得材料/cpusiRNA2二元复合物溶液，粒径为194nm，表面电位为46mv。
实施例19
将10mg阳离子脂质脂质衍生物油醇-苯丙氨酸-赖氨酸，30mg磷脂，加入4ml氯仿与2ml甲醇，超声使之完全溶解；40℃下旋蒸15min使其均匀成膜；抽真空过夜，以除尽有机溶剂；加入5ml水，37℃下水合30min；探头超声30min，过0.22um滤膜。粒径为124nm，表面电位为48.2mv。将cpusiRNA2和空白脂质体分别用水稀释后，保持每个样品中加入的cpusiRNA2质量一定(如2ug)，按照氮磷比(N/P)为2加入一定量的空白脂质体溶液，并用水将样品定容至相同终体积，涡旋10s，室温放置30min，即得材料/cpusiRNA2二元复合物溶液，粒径为175nm，表面电位为36mv。
实施例20
将磷脂90mg，胆固醇12mg，阳离子脂质衍生物正十八醇-甘氨酸-赖氨酸30mg，溶于5ml氯仿与1ml甲醇的混合有机溶剂中。40℃旋转蒸发15min除去有机溶剂。加入5ml水，在37℃下水合30min。头超声30min。得到的脂质体溶液过0.22um滤膜，即得到阳离子脂质体溶液(SGL-L)。将磷脂120mg，胆固醇12mg，溶于5ml氯仿与1ml甲醇的混合有机溶剂中。40℃旋转蒸发15min除去有机溶剂。加入5ml水，在37℃下水合30min。探头超声10min。得到的脂质体溶液定过0.22um滤膜，即得到普通脂质体溶液(SPC-L)。
取1ml上述阳离子脂质体溶液稀释10倍至10ml，测定稀释后脂质体溶液的pH。然后，用0.3M的NaOH溶液调节上述脂质体溶液的pH至10左右，在搅拌作用下，向脂质体溶液中逐次滴加0.01M的HCl，开始时每次滴加60ul，滴定至pH为8左右时，每次滴加20ul，待pH值稳定后记录读数，直到pH降至4以下终止滴定。结果见图2，表明阳离子脂质体具有很强的缓冲能力，在酸性的溶酶体环境下(pH 5.5-4.5)能够发生质子海绵作用，发挥溶酶体逃逸作用，而普通脂质体没有这种作用。
Claims (9)
1.一种基于寡肽阳离子的结构式(I)或(II)的脂质衍生物：
其中n＝1或2
R＝-(CH2)x-CH3，x＝7-12、-(CH2)x-CH＝CH-(CH2)y-CH3，x＝8，y＝8或-(CH2)x-CH＝CH-CH2-CH＝CH-(CH2)y-CH3，x＝8，y＝5；
R2＝-(CH2)n-CH3，n＝7-19、-(CH2)n-CH＝CH-(CH2)m-CH3，n＝8，m＝8、-(CH2)n-CH＝CH-CH2-CH＝CH-(CH2)m-CH3，n＝8，m＝5或
2.一种空白脂质体，含脂质体基质和权利要求1的脂质衍生物。
3.权利要求2的空白脂质体，其中脂质体基质为磷脂。
4.权利要求3的空白脂质体，其中脂质体基质还含胆固醇。
5.一种药物脂质体，含药物、脂质体基质和权利要求1的脂质衍生物。
6.权利要求5的药物脂质体，其中脂质体基质为磷脂。
7.权利要求5的药物脂质体，其中药物为质粒DNA、寡核苷酸或小分子干扰siRNA。
8.权利要求5的药物脂质体，其中药物和脂质衍生物的氮磷比为1∶1～1∶10。
9.权利要求1的脂质衍生物用作脂质体修饰剂的用途。
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