BR112020008451A2 - composto fusogênico, composição, composições farmacêutica e para uso na distribuição de um agente ativo, e, método para prevenir, melhorar ou tratar uma doença ou condição - Google Patents

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Abstract

Esta invenção inclui compostos fusogênicos e composições e métodos de uso dos mesmos. Os compostos fusogênicos podem ser usados para preparar composições de nanopartículas para uso em produtos farmacêuticos e terapêuticos. Mais particularmente, esta invenção refere-se a compostos, composições e métodos para prover nanopartículas para incorporar ou encapsular agentes ativos, para entregar e distribuir os agentes ativos em células, tecidos, órgãos e indivíduos.

Description

COMPOSTO FUSOGÊNICO, COMPOSIÇÃO, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICA E PARA USO NA DISTRIBUIÇÃO DE UM AGENTE ATIVO, E, MÉTODO PARA PREVENIR, MELHORAR OU TRATAR UMA DOENÇA OU CONDIÇÃO CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO
[001] Esta invenção referese aos campos de produtos biofarmacêuticos e terapêuticos. Mais particularmente, esta invenção refere-se a compostos, composições e métodos contendo moléculas fusogênicas para prover nanopartículas para entregar e distribuir agentes ativos ou compostos de fármacos em células, tecidos, órgãos e indivíduos.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[002] Agentes terapêuticos, como compostos de fármacos, moléculas de ácido nucleico e outros agentes ativos, operam pela absorção em células, tecidos e órgãos de um indivíduo. A transfecção de agentes e moléculas para as células é frequentemente uma etapa limitante da ação terapêutica.
[003] Quando as moléculas do agente ativo são sensíveis ao ataque ou degradação no soro ou em outras condições biológicas, torna-se necessário proteger as moléculas para alcançar seu efeito medicinal.
[004] Por exemplo, uma maneira de realizar a transfecção de ácidos nucleicos é incorporar ou encapsular as moléculas ativas em uma nanopartícula. Uma desvantagem dessa metodologia pode ser baixas taxas de penetração celular.
[005] Há uma necessidade de longa data de moléculas com propriedades —fusogênicas para prover nanopartículas que possuem propriedades de transfecção favoráveis para aumentar as taxas de penetração celular e entregar agentes ativos às células.
[006] O que é necessário são composições e compostos para a formação de nanopartículas para agentes ativos. Existe uma necessidade contínua de moléculas e composições para transfecção e distribuição eficientes de moléculas de ácido nucleico e outros agentes para células e indivíduos.
BREVE SUMÁRIO
[007] Esta invenção refere-se a moléculas e suas composições para uso em produtos farmacêuticos e terapêuticos. Mais particularmente, esta invenção refere-se a compostos, composições e métodos para prover nanopartículas para entregar e distribuir agentes ativos ou compostos de fármacos em células, tecidos, órgãos e indivíduos.
[008] Esta invenção provê uma gama de compostos fusogênicos. Os compostos fusogênicos desta invenção podem ser utilizados para formar nanopartículas para entregar e distribuir agentes ativos.
[009] Exemplos de agentes ativos desta descrição incluem moléculas biologicamente ativas, ácidos nucleicos, DNA, RNA, mRNA, siRNA e microRNA, entre outras formas.
[0010] As modalidades desta invenção incluem o seguinte:
[0011] Um composto fusogênico com Fórmula I anfifílico | Z anfifílico AA — ligante — AA anfifílico Nanfifílico Fórmula I em que cada anfifílico compreende independentemente uma a duas cadeias lipofílicas, em que as cadeias lipofílicas compreendem independentemente cada uma 8 a 22 átomos de carbono; em que cada AA é independentemente um aminoácido compreendendo uma cadeia lateral com um grupo amino, em que o aminoácido está afixado a um anfifílico em cada um dos seus grupos amino e está afixado ao ligante no seu terminal C; em que o ligante tem a estrutura —NH (cr. ocH.CH. cn )-NH — n m P Ou
—NHQ'NH(C=0)CH2CH2Í OCHÇCH2+—(C=O)NHQ' NH — m em que Q' é alcanodiil C(2-8) ramificado ou não ramificado, alquenodiil C(2-8) ramificado ou não ramificado, alquinodiil C(2-8) ramificado ou não ramificado, ou o * —(CH2)o-3 CI eaos —* q * —(CH2og VV — uv (CHa)”.3—*
AX Ou Q2 (CH) X(C=0)CH;CH2 fOCHÇCH2)-(C=0)X(CH2),-Qº m em que Qº é —NH CH; Hr OCH.CH f e 2 + em que Q? é ocre Her. )-nH - r Pp em que X é —O-, -S-, ou -NH-; n, p, q e t são independentemente para cada ocorrência 1 a 3; m é independentemente 1 a 10; res são independentes para cada ocorrência 1 a 5.
[0012] O composto fusogênico acima, em que AA é selecionado a partir das seguintes estruturas, e qualquer estereoisômero do mesmo:
* * * * * o o º 9% jus O NT NH —* NH—* NH—*
NH HN x NH * "Á
N NH * x * * * * Oo Oo O O NH—* NH—* NH—* NH—*
NH
H HN HN NH NA, * Au ENA “NH NR Pá NH
N * NH * * * * o Oo O (o) NH—* NH—* NH—* NH—* FP = o NA NãO HN
DU NH X /
[0013] O composto fusogênico acima, em que um ou dois dos anfifílicos estão ausentes e são substituídos por um grupo alquila ou um grupo químico orgânico farmaceuticamente aceitável com 1-400 átomos selecionados a partir de carbono, oxigênio, nitrogênio, enxofre, flúor e hidrogênio.
[0014] O composto fusogênico acima, em que o grupo químico orgânico farmaceuticamente aceitável é alquila, alquenila, alquinila, acetil, Boc, Fmoc, TFA ou CBZ, preferencialmente alquila, acetil, mais preferencialmente acetil.
[0015] O composto fusogênico acima, em que o composto é selecionado dentre os seguintes:
* Composto T14 % SE to o. ts õ to o ess o. 0 tm y de po x à aa Prot
A
NH o o “ Pa abs fiel odor vo 8 g o da com No lose Diana N STE ns ore erro o o. ISSA ato Sea AGIR EF.
O DU O, NH Y
[0016] O composto fusogênico acima, em que um ou mais dos anfifílicos têm a estrutura mostrada na Fórmula II o R
Á o DAN JAR R? AA * Fórmula II em que R' e R? são R' = CHCH),O(C=O)R?, CHX(CH>),NH(C=O)R', CHCH)I(C=0) OR, CH(CH))(C=O)NHR*? R? = CHX(CHy). O(C=O)RÍ, CH(CHo) NH(C=O)RS, CHX(CHy)n(C=0)ORS, CH(CH)n(C=O)NHR* em que n e m são cada um independentemente de 1 a 2; e Rê e R são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila C(12-20) ou um grupo alquenila C(12-20);
em que R? é selecionado a partir de alcanodiil C(1-8) ramificado ou não ramificado, alquenodiil C(2-8) substituído ou não substituído, alquinodiil C(2-8) substituído ou não substituído, cicloalcanodiil C(3-8) substituído ou não substituído, arileno substituído ou não substituído, heteroarileno C(4-8) substituído ou não substituído e heterocicloalcanodiil substituído ou não substituído e suas combinações; em que Rº é opcionalmente interrompido por um ou mais de —O-, -S-, -SO-, -SO,-, -NH-, - NRº-, -NH(C=0O)-, -O(C=0O)-, em que R$ é alquila C(1-6)-, alcoxi C(1-6)-, ou alcoxi C(1-6)-alcoxi C(1-6)-.
[0017] R? é preferencialmente alcanodiil C(2-8) ramificado ou não ramificado, alquenodiil C(2-8) substituído ou não substituído, alquinodiil C(2- 8) substituído ou não substituído, cicloalcanodiil C(3-8), arileno C(4-8) substituído ou não substituído, e ainda mais preferencialmente alcanodiil C(2- 8) ramificado ou não ramificado, cicloalcanodiil C(3-8) substituído ou não substituído.
[0018] Como usado aqui, o termo "e combinações dos mesmos" em referência a fórmulas indica variações adicionais na estrutura com base na combinação dos grupos listados. Por exemplo, a combinação de alcanodiil C(1-8) e heteroarileno C(4-8) refere-se a alcanodiil C(1-8)-heteroarileno C(4- 8), bem como alcanodiil C(1-8)-heteroarileno C(4-8)-alcanodiil C(1-8).
[0019] O composto fusogênico acima, em que R? é selecionado a partir de alcanodiil C(2-8) ramificado ou não ramificado, alquenodiil C(2-8) substituído ou não substituído, alquinodiil C(2-8) substituído ou não substituído, cicloalcanodiil C(3-8) substituído ou não substituído, heteroarileno C(4-8) substituído ou não substituído
* —(CH2)o-38 CIR
Õ *t—(CH2a)o.g VV —vuuur(CHa)oa—* o preferencialmente alcanodiil C(2-8) ramificado ou não ramificado, cicloalcanodiil C(3-8) substituído ou não substituído.
[0020] O composto fusogênico acima, em que um ou mais dos anfifílicos têm a estrutura mostrada na Fórmula II
SA Rº ã Fórmula TM em que R' e R? são R' = CH(CH;),O(C=O)R*, CHX(CH>),NH(C=O)R*, CHX(CH))(C=0)ORÍ, CH(CH),(C=O)NHR*? Rº = CH(CH)nO(C=O)R", CH(CHo)nNH(C=O)RS, CHXCH)n(C=0) OR”, CH(CHo))(C=O)NHR* em que n e m são cada um independentemente de 1 a 2; e Rê e Ri são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila C(12-20) ou um grupo alquenila C(12-20); em que R3 é selecionado a partir de -alquila-(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquila-O(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquila-NH(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquila-(C=0O)-alquila-(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquila-O(C=0O)-alquila-(C=0O)-, que está afixado a AA -alquila-NH(C=0O)-alquila-(C=0O)-, que está afixado a AA -alquenila-(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquenila-O(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquenila-NH(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquenila-(C=0O)-alquenila-(C=O)-, que está afixado a AA;
-alquenila-O(C=0O)-alquenila-(C=O)-, que está afixado a AA
-alquenila-NH(C=0O)-alquenila-(C=0O)-, que está afixado a AA
-alquinila-(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquinila-O(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquinila-NH(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquinila-(C=0O)-alquinila-(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquinila-O(C=0O)-alquinila-(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquinila-NH(C=0O)-alquinila-(C=0O)-, que está afixado a AA;
em que qualquer alquila de R? é alquila C(1-6) ramificada ou não ramificada, qualquer alquenila de R? é alquenila C(2-6) ramificada ou não ramificada e qualquer alquinila de R? é alquinila C(2-6) ramificada ou não ramificada;
Rô O N—* R$ R$ DD = N—* N—* R$ R$ == R8 . O 2 R$
R$ º — — <> — R$ e seus isômeros posicionais; R8 | -N * 8 nº AA * 03 [3 O SUVVr(CH2),.2 —* AA * 0-3 e | O AU (CH2)1-2 —*
W em que cada Rº é selecionado independentemente dentre H, alquila, alcoxi e alcoxialcoxi, com a condição de que um Ró seja -(C=0O)- ou -alquila- (C=0O)- que está afixado a AA; cada R* é selecionado independentemente de H, alquila, com a condição de que um R* seja -(C=O)- ou -alquila-(C=O)- que está afixado a AA; q é de zero a quatro; QéOouN.
[0021] O composto fusogênico acima, em que alquila de Rº e Rº são cada um alquila C(1-6) independentemente ramificada ou não ramificada, alcoxi de Rº é alcoxi C(1-6) e alcoxialcoxi de R$ é alcoxi C(1-6)alcoxi C(1-6).
[0022] O composto fusogênico acima, em que Rº e Rº são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila (14-18) ou um grupo alquenila C(14-18), preferencialmente um grupo alquenila C(14-18) com 2 a 4 ligações duplas.
[0023] O composto fusogênico acima, em que o composto é selecionado dentre os seguintes: Composto R4 -
VOAR % & — L. PE aê “1 TP. : S ' ON 56 9 o bb N< SO: O O NA MAO: | e” ot ho tr s6 ' S Composto ta e À "o Pr % A. “ss % " FT Es - Lo à Re lenta, PIA oto nº gh.
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[0024] O composto fusogênico acima, em que um ou mais dos anfifílicos têm a estrutura mostrada na Fórmula III
SA Rº ã Fórmula III em que R' e R? são R' = CHCH),O(C=O)R?, CHXCH>),NH(C=O)R, CH(CH>).(C=0)OR!, CH(CH).(C=O)NHR*? Rº = CHCHo)nO(C=O)R5, CHCHo)NH(C=O)RS, CHX(CH)n(C=0)OR', CH(CH)n(C=O)NHRº em que n e m são cada um independentemente de | a 2; R? e Ró são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila C(12-20) ou um grupo alquenila C(12-20); Ri é um grupo alquila C(1-12) ou um grupo alquenila C(4-12) que é substituída com um -(C=0O)- ou -alquila-(C=O)- que está afixado a AA.
[0025] O composto fusogênico acima, em que Rº e Ró são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila (14-18) ou um grupo alquenila C(14-18), preferencialmente um grupo alquenila C(14-18) com 2 a 4 ligações duplas.
[0026] O composto fusogênico acima, em que um ou mais dos anfifílicos têm a estrutura mostrada na Fórmula IV PA no né P 2 NA -” Fórmula IV em que R' e R? são R' = (C=0) OR, (C=O)NHR$, O(C=O)RÍ, (C=O)R*º R? = (C=0)ORS, (C=O)NHRS, O(C=O)R5, NH(C=O)R* em que Rº e Ró são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila C(12-20) ou um grupo alquenila C(12-20);
Zé OouNH;pébas; em que Rô é selecionado a partir de alcanodiil C(1-8)-(C=0O)- ramificado ou não ramificado que está afixado a AA, alquenodiil C(2-8)- (C=0O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA, alquinodiil C(2- 8)-(C=O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA, cicloalcanodiil C(3-8)-(C=0O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA, arileno-(C=O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA, heteroarileno C(4-8)-(C=0O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA e heterocicloalcanodiil-(C=O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA; em que R? é opcionalmente interrompido por um ou mais de — O-, -S-, -SO-, -SO7-, -NH-, -NRó-, -NH(C=0O)-, -O(C=0O)-, em que Ré é alquila C(1-6)-, alcoxi C(1-6)-, ou alcoxi C(1-6)-alcoxi C(1-6)-.
[0027] Ri é preferencialmente alcanodiil C(2-8) ramificado ou não ramificado, alquenodiil C(2-8) substituído ou não substituído, alquinodiil C(2- 8) substituído ou não substituído, cicloalcanodiil C(3-8), arileno C(4-8) substituído ou não substituído, e ainda mais preferencialmente alcanodiil C(2- 8) ramificado ou não ramificado, cicloalcanodiil C(3-8) substituído ou não substituído.
[0028] O composto fusogênico acima, em que um ou mais dos anfifílicos têm a estrutura mostrada na Fórmula IV A NÓ - R? Fórmula IV em que R' e R? são R' = (C=0) OR, (C=O)NHR$, O(C=O)RÍ, (C=O)R* R? = (C=0)ORS, (C=O)NHRS, O(C=O)R*, NH(C=O)R* em que Rº e Ró são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila C(12-20) ou um grupo alquenila C(12-20); Zé OouNH;pébasS;
em que R3 é selecionado a partir de grupo alquila C(1-12) ou grupo alquenila C(2-12) que é substituído com um -(C=O)- que está afixado a AA. R8 O — R$ R$ => N —" N —*
TZ Rº R$ Rº R8 R6 ? — Us <> — R6 e seus isômeros posicionais; R8 | N * “Us q em que cada Ró é selecionado independentemente dentre H, alquila, alcoxi e alcoxialcoxi, com a condição de que um Ró seja -(C=0O)- ou -alquila- (C=0O)- que está afixado a AA; cada Rº é selecionado independentemente de H, alquila, com a condição de que um Rº seja -(C=O)- ou -alquila-(C=O)- que está afixado a
AA; q é de zero a quatro; QéOouN.
[0029] O composto fusogênico acima, em que Rº e Rº são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila (14-18) ou um grupo alquenila C(14-18), preferencialmente um grupo alquenila C(14-18) com 2 a 4 ligações duplas.
[0030] O composto fusogênico acima, em que o composto é o composto T10: Composto T10 À )
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[0031] O composto fusogênico acima, em que um ou mais dos anfifílicos têm a estrutura mostrada na Fórmula IV A NÓ n R? Fórmula IV em que R' e R? são R' é um grupo alquila C(12-20), ou um grupo alquenila C(12- 20); Rº é (CHo), XR$, em que né 0 a 3, XK É O, S, SO, SO», NH; em que Rº é um grupo alquila C(12-20), ou um grupo alquenila C(12-20); em que Z é O ou NH; emque pé 1; em que Rô é selecionado a partir de grupo alquila C(1-12) ou grupo alquenila C(2-12) que é substituído com um -(C=0O)- que está afixado a AA.
[0032] O composto fusogênico acima, em que um ou mais dos anfifílicos têm a estrutura mostrada na Fórmula V Ri De Fórmula V em que R' e R? são R' = (C=0) OR, (C=O)NHR$, O(C=O)Rº, NH(C=O)R* R? = (C=0)ORS, (C=O)NHRS$, O(C=O)R5, NH(C=O)R5 em que Rº e Ró são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila C(12-20) ou um grupo alquenila C(12-20); em que R? é selecionado a partir de -O(C=0O)-alcanodiil C(1- 8)-(C=0O)- ramificado ou não ramificado que está afixado a AA, -O(C=0O)- alquenodiil C(2-8)-(C=0O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA, -O(C=0O)-alquinodiil C(2-8)-(C=0O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA, -O(C=O)-cicloalcanodiil C(3-8)-(C=O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA, -O(C=0O)-arileno-(C=O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA, -O(C=O)-heteroarileno C(4-8)- (C=O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA e -O(C=0O)- heterocicloalcanodiil-(C=O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA; em que R? é opcionalmente interrompido por um ou mais de —O-, -S-, - SO-, -SO7-, -NH-, -NR-, -NH(C=0)-, -O(C=0O)-, em que R$ é alquila C(1-6)- , alcoxi C(1-6)-, ou alcoxi C(1-6)-alcoxi C(1-6)-.
[0033] Rô é preferencialmente alcanodiil C(2-8) ramificado ou não ramificado, alquenodiil C(2-8) substituído ou não substituído, alquinodiil C(2- 8) substituído ou não substituído, cicloalcanodiil C(3-8), arileno C(4-8) substituído ou não substituído, e ainda mais preferencialmente alcanodiil C(2- 8) ramificado ou não ramificado, cicloalcanodiil C(3-8) substituído ou não substituído.
[0034] O composto fusogênico acima, em que Rº e Rº são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila (14-18) ou um grupo alquenila C(14-18), preferencialmente um grupo alquenila C(14-18) com 2 a 4 ligações duplas.
[0035] O composto fusogênico acima, em que o composto é Oo composto T12:
Composto T12 | f) ) A o o N ot Pr º CO PR ox
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[0036] O composto fusogênico acima, em que um ou mais dos anfifílicos têm a estrutura mostrada na Fórmula V Ri Rº R? Fórmula V em que R' e R? são R' = (C=0)ORSÍ, (C=O)NHR$, O(C=O)R, NH(C=O)Rº R? = (C=0)ORS, (C=O)NHRS$, O(C=O)R5, NH(C=O)R5 em que Rº e Ró são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila C(12-20) ou um grupo alquenila C(12-20);
em que Ri é selecionado a partir de HC=0O)- ou -alquila-(C=O)-, que está afixado a AA; —O(C=0O)- ou -alquila-O(C=0O)-, que está afixado a AA; -O(C=0O)-alcanodiil-(C=0O)-, que está afixado a AA -O(C=0O)-alquenodiil-(C=0O)-, que está afixado a AA -O(C=0O)-alquinodiil-(C=O)-, que está afixado a AA —NH(C=0O)- ou -alquila-NH(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquila-(C=0O)-alquila-(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquila-O(C=0O)-alquila-(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquila-NH(C=0O)-alquila-(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquenila-(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquenila-O(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquenila-NH(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquenila-(C=0O)-alquenodiil-(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquenila-O(C=0O)-alquenodiil-(C=O)-, que está afixado a AA; -alquenila-NH(C=0O)-alquenodiil-(C=O)-, que está afixado a AA; -alquinila-(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquinila-O(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquinila-NH(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquinila-(C=0O)-alquinodiil-(C=O)-, que está afixado a AA; -alquinila-O(C=0O)-alquinodiil-(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquinila-NH(C=0O)-alquinodiil-(C=O)-, que está afixado a
AA f A» (C=O0) —** Que está afixado a AA * A» H(C=0O)- alcanodil (C=O) —* Que está afixado a AA * A» (C=O)— aleanodil (C=O) —* Que está afixado a AA * <<» (C=0)- alcanodiil HC=0) —* Que está afixado a AA * A» -alcanodiil -(C=O) —* Que está afixado a AA * <“» -aleanodiil -O(C=0O)—* Que está afixado a AA * «» aleanodiil “NH(C=O)—* Que está afixado a AA * <“ alcanodiil -O(C=O) alcanodisl (C=O)—* Que está afixado a AA e seus isômeros posicionais; em que qualquer alquila de Rô é alquila C(1-6) ramificada ou não ramificada, qualquer alquenila de Rô é alquenila C(2-6) ramificada ou não ramificada e qualquer alquinila de R? é alquinila C(2-6) ramificada ou não ramificada;
[0037] O composto fusogênico acima, em que um ou mais dos anfifílicos têm a estrutura mostrada na Fórmula IV
LÊ RR Fórmula IV em que R' e R? são R' = (C=0) OR, (C=O)NHR$, O(C=O)Rº, NH(C=O)R*? R? = (C=0)ORS, (C=O)NHRS, O(C=O)R5, NH(C=O)R* em que Rº e Ró são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila C(12-20) ou um grupo alquenila C(12-20); em que Rô é selecionado a partir de alcanodiil C(1-8)-(C=0O)- ramificado ou não ramificado que está afixado a AA, alquenodiil C(2-8)- (C=0O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA, alquinodiil C(2- 8)-(C=O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA, cicloalcanodiil C(3-8)-(C=0O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA, arileno-(C=O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA, heteroarileno C(4-8)-(C=0O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA e heterocicloalcanodiil-(C=O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA; em que R? é opcionalmente interrompido por um ou mais de — O-, -S-, -SO-, -SO7-, -NH-, -NRó-, -NH(C=0O)-, -O(C=0O)-, em que Ré é alquila C(1-6)-, alcoxi C(1-6)-, ou alcoxi C(1-6)-alcoxi C(1-6)-.
[0038] Ri é preferencialmente alcanodiil C(2-8) ramificado ou não ramificado, alquenodiil C(2-8) substituído ou não substituído, alquinodiil C(2- 8) substituído ou não substituído, cicloalcanodiil C(3-8), arileno C(4-8) substituído ou não substituído, e ainda mais preferencialmente alcanodiil C(2- 8) ramificado ou não ramificado, cicloalcanodiil C(3-8) substituído ou não substituído.
[0039] O composto fusogênico acima, em que um ou mais dos anfifílicos têm a estrutura mostrada na Fórmula V
RI AL. Fórmula V em que R' e R? são R' = (C=0) ORÍ, (C=O)NHR$, O(C=O)Rº, NH(C=O)Rº R? = (C=0) OR, (C=O)NHRS, O(C=O)R5, NH(C=O)R* em que Rº e Ró são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila C(12-20) ou um grupo alquenila C(12-20);
R? é selecionado a partir de -alquila-(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquila-O(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquila-NH(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquila-(C=0O)-alquila-(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquila-O(C=0O)-alquila-(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquila-NH(C=0O)-alquila-(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquenila-(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquenila-O(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquenila-NH(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquenila-(C=0O)-alquenila-(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquenila-O(C=0O)-alquenila-(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquenila-NH(C=0O)-alquenila-(C=O)-, que está afixado a AA; -alquinila-(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquinila-O(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquinila-NH(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquinila-(C=0O)-alquinila-(C=O)-, que está afixado a AA; -alquinila-O(C=0O)-alquinila-(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquinila-NH(C=0O)-alquinila-(C=0O)-, que está afixado a AA;
. N (C=0) —* Que-está-afixado-a-AA — N—(c=0)- aleanodilt “(C=O) —* Que-está-afixado-a-AA ” NA(C=0O)- alenodilf (C=O0)—* Que-está-afixado-a-AA * < N(C=0)- aleanodiit —(C=O)—*+ Que-está-afixado-a-AA Cl N -aleanodiilf (C=0) —* Que-está-afixado a AA * ( N alcanodilf -O(C=0)-*+ Que-está-afixadoa-AA — N aleanodiilt —NH(C=0)—* Que-está-afixado-a-AA *X Nemo O(C=O) stcmodiao (C=0)—* Que-está-afixado-a-AA e seus isômeros posicionais; em que qualquer alquila de R? é alquila C(1-6) ramificada ou não ramificada, qualquer alquenila de R? é alquenila C(2-6) ramificada ou não ramificada e qualquer alquinila de R? é alquinila C(2-6) ramificada ou não ramificada;
[0040] O composto fusogênico acima, em que Rº e R$ são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila (14-18) ou um grupo alquenila C(14-18), preferencialmente um grupo alquenila C(14-18) com 2 a 4 ligações duplas.
[0041] O composto fusogênico acima, em que o composto é o composto T11
Composto T11
W ) V | ) ) ! ) “Polo do 2 N o º *"
N Oo o
NH Se o
A o Ao e o o Ano o
NH HN H of o oo & SS o q 9º o 07º Po
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[0042] Um composto fusogênico com Fórmula VII anfifílico anfifílico “SN E AA? —Tinker — AA? a “ " AnfifRco anfifilico Fórmula VII em que cada anfifílico compreende independentemente uma a duas cadeias lipofílicas, em que as cadeias lipofílicas compreendem cada uma independentemente 8 a 22 átomos de carbono; em que cada AA* é independentemente um aminoácido compreendendo uma cadeia lateral com um grupo acilo, em que o aminoácido é afixado a um anfifílico em cada um de seus grupos acilo e é afixado ao ligante em seu terminal N; em que ligante tem a estrutura —(C=0) + CH, +H-CH.CHÃO FT CH2T-(C=0) — fere) Coreano) foro) ou —(C=0)Q' (C=O)NH + CH2 + CH.CHÃO +FCH2 FNH(C=0)Q'(C=0) — fere) Coreno fere) em que Q' é alcanodiil C(2-8) ramificado ou não ramificado, alquenodiil C(2-8) ramificado ou não ramificado, alquinodiil C(2-8) ramificado ou não ramificado, ou o * —(CH2)o-3 CL IMiaas o
Õ *—(CH2aog VV — vuUvr(CHa)o.3—*
AX ou —QXÁC=0)X —F CH CH.CH.O +f CH2 + X(C=0)Q — A HW 20H! H k em que Qº? é —(C=0) f1CH OCH,CH ( A e 2 2) em que Q? é AocrzcH2 Hen. )-(c-0) — r Pp em que X é —O-, -S- ou -NH-;
n e p são independentemente para cada ocorrência | a 3; m é independentemente 1 a 10; res são independentes para cada ocorrência 1 a 5.
[0043] O composto fusogênico acima, em que AA”* é selecionado a partir das seguintes estruturas, e qualquer estereoisômero do mesmo: * * * * * o O Oo ( Oo NH* NH* NH—* NH—* NH—* * * . O * O * (o) * Oo O .
[0044] O composto fusogênico acima, em que um ou dois dos anfifílicos estão ausentes e são substituídos por um grupo alquila ou um grupo químico orgânico farmaceuticamente aceitável com 1-400 átomos selecionados a partir de carbono, oxigênio, nitrogênio, enxofre, flúor e hidrogênio.
[0045] O composto fusogênico acima, em que o grupo químico orgânico farmaceuticamente aceitável é selecionado a partir de alquila, alquenila, alquinila, éter alquílico, éter arílico, alcoxi e alcoxi-alcoxi.
[0046] O composto fusogênico acima, em que o grupo químico orgânico farmaceuticamente aceitável é selecionado a partir de metoxi, etoxi, éter t-butílico e benzil oxi.
[0047] O composto fusogênico acima, em que um ou mais dos anfifílicos têm a estrutura mostrada na Fórmula VIII Ri
Ó * —N No Fórmula VIII em que R' e R? são
R' = CHXCH;),O(C=O)Rº, CHX(CH>).NH(C=O)R, CHX(CHo))(C=0) OR, CH(CH))(C=O)NHR*? Rº = CHCHo). O(C=O)R5, CHX(CHo).NH(C=O)RS5, CHXCHo)Im(C=0) OR", CHX(CHo).-(C=O)NHR$ em que n e m são cada um independentemente de | a 2; Rº e Ró são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila C(12-20) ou um grupo alquenila C(12-20).
[0048] O composto fusogênico acima, em que um ou mais dos anfifílicos têm a estrutura mostrada na Fórmula IX Ri AA? *— NH Ren Ng 2 Fórmula IX em que R' e R? são R' = CH(CH;),O(C=O)R?, CHX(CH;),NH(C=O)R?, CH(CH).(C=0)OR?, CHXCHy))(C=O)NHR*? Rº = CHXCH;)nO(C=O)R5, CH(CHo)NH(C=O)R, CHX(CHo)n(C=0)OR, CHXCH>)(C=O)NHR$ em que n e m são cada um independentemente de 1 a 2; Rº e Rº são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila C(12-20) ou um grupo alquenila C(12-20); em que R? é selecionado a partir de alcanodiil C(1-8) ramificado ou não ramificado, alquenodiil C(2-8) substituído ou não substituído, alquinodiil C(2-8) substituído ou não substituído, cicloalcanodiil C(3-8) substituído ou não substituído, arileno substituído ou não substituído, heteroarileno C(4-8) substituído ou não substituído e heterocicloalcanodiil substituído ou não substituído; em que R? é opcionalmente interrompido por um ou mais de —O-, -S-, -SO-, -SOz-, -NH-, -NRé-, -NH(C=0O)-, -O(C=0O)-, em que R$ é alquila C(1-6)-, alcoxi C(1-6)-, ou alcoxi C(1-6)-alcoxi C(1-6)-.
[0049] R? é preferencialmente alcanodiil C(2-8) ramificado ou não ramificado, alquenodiil C(2-8) substituído ou não substituído, alquinodiil C(2- 8) substituído ou não substituído, cicloalcanodiil C(3-8), arileno C(4-8) substituído ou não substituído, e ainda mais preferencialmente alcanodiil C(2- 8) ramificado ou não ramificado, cicloalcanodiil C(3-8) substituído ou não substituído.
[0050] O composto fusogênico acima, em que Rº e Rº são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila (14-18) ou um grupo alquenila C(14-18), preferencialmente um grupo alquenila C(14-18) com 2 a 4 ligações duplas.
[0051] O composto fusogênico acima, em que o composto é Oo composto T9: Composto T9 | |) ( |
A Di o o O o RI)
RS S S õ o não NS Dus º% ao o si id enoreo AO o
O
[0052] O composto fusogênico acima, em que um ou mais dos anfifílicos têm a estrutura mostrada na Fórmula X Ri sa a AA “ns —N Fórmula X em que R' e R? são R' = CHX(CH;),O(C=O)Rº, CHX(CH>).NH(C=O)R, CHXCHo))(C=0) OR, CH(CH))(C=O)NHRº? R?º = CHXCH>)nO(C=O)R5, CH(CH>)NH(C=O)RS5, CHXCHo)In(C=0)ORS, CHX(CHo).-(C=O)NHR$ R? e R são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila C(12-20) ou um grupo alquenila C(12-20); em que R? está ausente ou é selecionado a partir de *-NH- alcanodiil C(1-8)-(C=O)- ramificado ou não ramificado, *-NH-alquenodiil C(2-8)-(C=O)- substituído ou não substituído, *-NH-alquinodiil C(2-8)- (C=0O)- substituído ou não substituído, *-NH-cicloalcanodiil C(3-8)-(C=0O)- substituído ou não substituído, *-NH-arileno-(C=O)- substituído ou não substituído, *-NH-heteroarileno C(4-8)-(C=0O)- substituído ou não substituído e * NH-heterocicloalcanodiil-(C=O)- substituído ou não substituído, em que * indica o terminal afixado a AAº; em que R3 é opcionalmente interrompido por um ou mais de —O-, -S-, -SO-, -SO7-, -NH-, -NRé-, -NH(C=0O)-, - O(C=0O)-, em que R$ é alquila C(1-6)-, alcoxi C(1-6)-, ou alcoxi C(1-6)-alcoxi C(1-6)-.
[0053] Rº é preferencialmente alcanodiil C(2-8) ramificado ou não ramificado, alquenodiil C(2-8) substituído ou não substituído, alquinodiil C(2- 8) substituído ou não substituído, cicloalcanodiil C(3-8), arileno C(4-8)
40 / 94 substituído ou não substituído, e ainda mais preferencialmente alcanodiil C(2- 8) ramificado ou não ramificado, cicloalcanodiil C(3-8) substituído ou não substituído.
[0054] O composto fusogênico acima, em que um ou mais dos anfifílicos têm a estrutura mostrada na Fórmula XI
K AA? * —R3—NH R2 Fórmula XI em que R' e R? são R' = (C=0)ORÍ, (C=O)NHRÍ, O(C=O)Rº, NH(C=O)Rº R? = (C=0)ORSÍ, (C=O)NHRS, O(C=O)RÍ, NH(C=O)R5 Ri e R são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila C(12-20) ou um grupo alquenila C(12-20); em que Ri? está ausente ou é selecionado a partir de *-NH- alcanodiil C(1-8)-(C=O)- ramificado ou não ramificado, *-NH-alquenodiil C(2-8)-(C=O)- substituído ou não substituído, *-NH-alquinodiil C(2-8)- (C=O)- substituído ou não substituído, *-NH-cicloalcanodiil C(3-8)-(C=0O)- substituído ou não substituído, *—NH-arileno-(C=O)- substituído ou não substituído, *-NH-heteroarileno C(4-8)-(C=0O)- substituído ou não substituído e * NH-heterocicloalcanodiil-(C=O)- substituído ou não substituído, em que * indica o terminal afixado a AAº; em que R? é opcionalmente interrompido por um ou mais de —O-, -S-, -SO-, -SOzx-, -NH-, -NRº-, -NH(C=0O)-, - O(C=0O)-, em que Ré é alquila C(1-6)-, alcoxi C(1-6)-, ou alcoxi C(1-6)-alcoxi C(1-6)-.
[0055] Ri é preferencialmente alcanodiil C(2-8) ramificado ou não ramificado, alquenodiil C(2-8) substituído ou não substituído, alquinodiil C(2- 8) substituído ou não substituído, cicloalcanodiil C(3-8), arileno C(4-8) substituído ou não substituído, e ainda mais preferencialmente alcanodiil C(2-
8) ramificado ou não ramificado, cicloalcanodiil C(3-8) substituído ou não substituído.
[0056] O composto fusogênico acima, em que um ou mais dos anfifílicos têm a estrutura mostrada na Fórmula III
SS Rº e Fórmula II em que R' e R? são R' = CH(CH;),O(C=O)R*, CHX(CH>),NH(C=O)R*, CHX(CH/))(C=0) OR, CHX(CH>),(C=O)NHR*? Rº = CH(CH)nO(C=O)R", CH(CHo)nNH(C=O)RS, CHACHo)m(C=0)OR*, CHXCH2)(C=O)NHR5 em que n e m são cada um independentemente de 1 a 2; e Rê e Ri são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila C(12-20) ou um grupo alquenila C(12-20); em que Rô é selecionado a partir de -(C=0O)-alquila-NH-, que está afixado a AA*; -(C=0O)-alquenila-NH-, que está afixado a AAº; -(C=0O)-alquinila-NH-, que está afixado a AAº; em que qualquer alquila de R? é alquila C(1-6) ramificada ou não ramificada, qualquer alquenila de Rô é alquenila C(2-6) ramificada ou não ramificada e qualquer alquinila de R? é alquinila C(2-6) ramificada ou não ramificada;
O R$ R$ Rô R6 ==
R$ R8 R6 R6 e seus isômeros posicionais; Rê h * “hk R q AA * o-3 o2 O IUVVr(CH2)1-2 —* AA * 0-3 e | O SU (CH2)1-2 —*
W em que cada Ró é selecionado independentemente dentre H, alquila, alcoxi e alcoxialcoxi, com a condição de que um R$ seja -(C=0O)-alquila-NH- no qual NH está afixado a AAº; cada Rº é selecionado independentemente de H, alquila, com a condição de que um R$ seja -(C=0O)-alquila-NH- no qual NH está afixado a AAº; q é de zero a quatro;
QéOouN.
[0057] O composto fusogênico acima, em que um ou mais dos anfifílicos têm a estrutura mostrada na Fórmula V Rº Fam Fórmula V em que R' e R? são R' = (C=0) ORÍ, (C=O)NHR$, O(C=O)Rº, NH(C=O)Rº R? = (C=0)ORS, (C=O)NHRS, O(C=O)R5, NH(C=O)R* em que Rº e Ró são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila C(12-20) ou um grupo alquenila C(12-20); em que em que Rô está ausente ou é selecionado a partir de *-NH- alcanodiil C(1-8)-(C=0O)- ramificado ou não ramificado, *-NH-alquenodiil C(2-8)-(C=O)- substituído ou não substituído, *-NH-alquinodiil C(2-8)- (C=0O)- substituído ou não substituído, *-NH-cicloalcanodiil C(3-8)-(C=0O)- substituído ou não substituído, *—NH-arileno-(C=O)- substituído ou não substituído, *-NH-heteroarileno C(4-8)-(C=0O)- substituído ou não substituído e *—NH-heterocicloalcanodiil-(C=O)- substituído ou não substituído, em que * indica o terminal afixado a AAº; em que R? é opcionalmente interrompido por um ou mais de —O-, -S-, -SO-, -SOx-, -NH-, -NRºó-, -NH(C=0O)-, - O(C=0O)-, em que R$ é alquila C(1-6)-, alcoxi C(1-6)-, ou alcoxi C(1-6)-alcoxi C(1-6)-.
[0058] R? é como acima, com preferencialmente alcanodiil C(2-8) ramificado ou não ramificado, alquenodiil C(2-8) substituído ou não substituído, alquinodiil C(2-8) substituído ou não substituído, cicloalcanodiil C(3-8), arileno C(4-8) substituído ou não substituído, e ainda mais preferencialmente — alcanodiil. C(2-8) ramificado ou não ramificado, cicloalcanodiil C(3-8) substituído ou não substituído.
[0059] As modalidades da presente invenção contemplam
44 / 94 adicionalmente composições contendo um composto fusogênico acima e um veículo —farmaceuticamente aceitável... A composição pode conter nanopartículas ou lipossomas.
[0060] Uma composição farmacêutica desta invenção pode incluir um composto fusogênico, um agente ativo e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma composição, o composto fusogênico pode ser de 0,01 mol% a 20 mol% dos lipídios da composição. A composição pode conter nanopartículas ou lipossomas.
[0061] As moléculas fusogênicas e formulações desta invenção podem ser usadas para a entrega de um agente ativo.
[0062] Em algumas modalidades, o agente ativo é um ou mais ácidos nucleicos.
[0063] Em certas modalidades, o agente ativo é um ou mais DNAs, RNAs, mRNAs, siRNAs ou microRNAs. O agente ativo pode ser uma ou mais moléculas de RNA.
[0064] O agente ativo pode ser uma ou mais moléculas de RNAi, uma ou mais moléculas de mMRNA e suas formas modificadas.
[0065] As modalidades desta invenção incluem composições para uso na distribuição de um agente ativo para o tratamento de uma condição ou doença em um indivíduo. À composição pode conter um agente ativo, um composto fusogênico, um lipídio ionizável, um lipídio estrutural, um lipídio estabilizador e um lipídio para reduzir a imunogenicidade da composição.
[0066] Esta invenção inclui métodos para prevenir, melhorar ou tratar uma doença ou condição em um indivíduo em necessidade, compreendendo administrar ao indivíduo uma composição acima. As composições desta invenção podem ser utilizadas no tratamento do corpo humano ou animal.
[0067] As modalidades desta invenção também incluem o seguinte:
[0068] Um composto de fórmula(A)
R R3 AO Ligante oe" o º fórmula À em que ligante é um grupo divalente compreendendo porção PEG, X, e X; são independentemente grupo alcanodiil C1-C5, R1, R2, R3 e R1 são independentemente O oO oO EA XX ar Rã “xs
O X; é ligação simples, grupo alcanodiil CI-C5 ou grupo alquenodiil C2-C5, X, e Xs são independentemente grupo alcanodiil C2-5, Z1, Z2 é Z3 são independentemente -O-, —-S- ou -NH-, e R; e Rs são independentemente um grupo alquila C11-23 ou alquenila C11-23.
[0069] As modalidades desta invenção também incluem o seguinte:
[0070] Um composta de fórmula(B) R7 7 xs Ligante x Zzº Rº
TSE TEL nº RO fórmula B em que ligante é um grupo divalente compreendendo porção PEG, Xç« e X; são independentemente grupo alcanodiil C1-C5, Xg e Xo são independentemente grupo alcanodiil C1-C5, Za e Zs são independentemente -O-, —S- ou —-NH-, R7, Rg, Ro e Rio são independentemente
46 / 94 o o ANA . penção “
O X, e Xs são independentemente grupo alcanodiil C2-5, Za, e Z3 são independentemente -O-, —S- ou -NH-, e R; e Rs são independentemente um grupo alquila C11-23 ou alquenila C11-23.
[0071] O composto acima, em que o ligante é
O O , AdonJ ou SA oo m n p q em que m é um número inteiro de 1-12, Y1 é -O-, -NH- ou -NHCH,;-, Y7 é -O-, -NH- ou -CHANH-, n e q são independentemente um número inteiro de 1 a 5, p é um número inteiro de 0-5, Y;3 e Ys são independentemente -O-, -NH- ou -NHCH;-, e Ya e Ys são independentemente -O-, -NH- ou -CH.NH-.
[0072] O composto acima, em que X, e X; são independentemente um grupo alcanodiil linear C1-C5, preferencialmente um grupo alcanodiil linear C2-CA4, mais preferencialmente um grupo alcanodiil linear C4.
[0073] O composto acima, em que Ri, Ro, R; e R1 são o mesmo grupo.
[0074] O composto acima, em que X* é ligação simples ou grupo alcanodiil linear C1-C5, X; é preferencialmente grupo alcanodiil linear C2- CA, mais preferencialmente etileno, isto é, grupo etanodi-il.
[0075] O composto acima, em que X, e X; são independentemente um grupo alcanodiil linear C2-5, X, e Xs preferencialmente um grupo alcanodiil linear C2-4, mais preferencialmente etileno, isto é, grupo etanodi-il.
[0076] O composto acima, em que Z, é — NH-.
[0077] O composto acima, em que Z, e Z;3 são -O-.
[0078] O composto acima, em que R; e R;« são independentemente um grupo alquenila C11-23 linear.
[0079] O composto acima, em que R; e R;« são independentemente um grupo alquenil C11-23 linear com 1-6 ligação(ões) dupla(s), em que o número de ligações duplas é preferencialmente 1-3, mais preferencialmente 2-3, e ainda mais preferencialmente 2.
[0080] O composto acima, em que R; e R; são independentemente um grupo alquenila C11-23 linear com 2 ligações duplas.
[0081] O composto acima, em que Rs; e R;« são independentemente grupo alquenila linear C13-17, Rs e Rs são preferencialmente um grupo alquenila linear C15-17, mais preferencialmente um grupo alquenila linear C17.
[0082] O composto acima, em que R; e R;« são independentemente um grupo alquenila C17 linear.
[0083] O composto acima, em que R; e R; é um grupo heptadeca- 8,1 1-dienil.
[0084] Uma composição que compreende um lipídio catiônico, um lipídio ionizável e um lipídio do composto acima em uma nanopartícula lipídica compreendendo uma bicamada de moléculas lipídicas.
[0085] A composição acima, que compreende adicionalmente um ácido nucleico.
[0086] A composição acima, em que o ácido nucleico é siRNA, MRNA ou microRNA.
[0087] A composição acima, em que a composição é uma composição farmacêutica.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0088] A Fig. 1 mostra um esquema para a preparação do Composto
48 / 94 RI.
[0089] A Fig. 2 mostra um esquema para a preparação do Composto R2.
[0090] A Fig. 3A mostra um esquema para a preparação do Composto R3.
[0091] A Fig. 3B mostra a estrutura do Composto R3.
[0092] A Fig. 4A mostra um esquema para a preparação do Composto R4.
[0093] A Fig. 4B mostra a estrutura do Composto R4.
[0094] A Fig. 5 mostra um esquema para a preparação do Composto R5.
[0095] A Fig. 6 mostra um esquema para a preparação do Composto R6.
[0096] A Fig. 7 mostra um esquema alternativo para a preparação do Composto R6.
[0097] A Fig. 8 mostra um esquema para a preparação do Composto S2.
[0098] A Fig. 9 mostra um esquema para a preparação do Composto S3.
[0099] A Fig. 10A mostra um esquema para a preparação do Composto S4.
[00100] A Fig. 10B mostra a estrutura do Composto S4.
[00101] A Fig. 11 mostra um esquema para a preparação do Composto S5.
[00102] A Fig. 12A mostra um esquema para a preparação do Composto S6.
[00103] A Fig. 12B mostra a estrutura do Composto S6.
[00104] A Fig. 13A mostra um esquema para a preparação do Composto S7.
49 / 94
[00105] A Fig. 13B mostra a estrutura do Composto S7.
[00106] A Fig. 14A mostra um esquema para a preparação do Composto S8.
[00107] A Fig. 14B mostra a estrutura do Composto S8.
[00108] A Fig. 15A mostra um esquema para a preparação do Composto TI.
[00109] A Fig. 15B mostra a estrutura do Composto T1.
[00110] A Fig. 16A mostra um esquema para a preparação do Composto T2.
[00111] A Fig. 16B mostra a estrutura do Composto T2.
[00112] A Fig. 17A mostra um esquema para a preparação do Composto T4.
[00113] A Fig. 17B mostra a estrutura do Composto T4.
[00114] A Fig. 18A mostra um esquema para a preparação do Composto T5.
[00115] A Fig. 18B mostra a estrutura do Composto T5.
[00116] A Fig. 19A mostra um esquema para a preparação do Composto T6.
[00117] A Fig. 19B mostra a estrutura do Composto T6.
[00118] A Fig. 20A mostra um esquema para a preparação do Composto T7.
[00119] A Fig. 20B mostra a estrutura do Composto T7.
[00120] A Fig. 21A mostra um esquema para a preparação do Composto T8.
[00121] A Fig. 21B mostra a estrutura do Composto T8.
[00122] A Fig. 22A mostra um esquema para a preparação do Composto T9.
[00123] A Fig. 22B mostra a estrutura do Composto T9.
[00124] A Fig. 23A mostra um esquema para a preparação do
Composto T3.
[00125] A Fig. 23B mostra a estrutura do Composto T3.
[00126] A Fig. 24 mostra resultados para a entrega de moléculas biologicamente ativas in vitro usando moléculas fusogênicas desta invenção. Como mostrado na Fig. 24, a formulação de entrega lipossômica nº 5, que continha 2% (de lipídios totais) de um composto fusogênico R4 desta invenção, proveu atividade para nocaute de expressão gênica em células estreladas de um siRNA exemplificativo direcionado ao HSP47 que aumentou surpreendentemente, em comparação com a formulação de controle nº 1, que não continha um composto fusogênico desta invenção.
[00127] A Fig. 25 mostra resultados para a entrega de moléculas biologicamente ativas in vitro usando moléculas fusogênicas desta invenção. A atividade do nocaute da expressão do gene HSP47 de várias formulações de entrega lipossômica de siRNA foi medida. As formulações proveram alta atividade para nocaute de expressão gênica em células estreladas. As formulações continham 2% (de lipídios totais) de um composto fusogênico desta invenção e proveram alta atividade do siRNA direcionado a HSP47.
[00128] A Fig. 26 mostra resultados para a entrega de moléculas biologicamente ativas in vivo usando moléculas fusogênicas desta invenção. As formulações de entrega lipossômica mostraram atividade para nocaute da expressão gênica in vivo (camundongos), usando um siRNA direcionado ao HSP47. As formulações ativas nº 2- nº 8 continham 2% (de lipídios totais) de um composto fusogênico designado desta invenção.
[00129] A Fig. 27 mostra a metade esquerda da estrutura do Composto TIO.
[00130] A Fig. 28 mostra a metade direita da estrutura do Composto TIO.
[00131] A Fig. 29 mostra um esquema para a preparação do Composto TIO.
[00132] A Fig. 30 mostra um esquema para a preparação do Composto TIO.
[00133] A Fig. 31 mostra a metade esquerda da estrutura do Composto TI.
[00134] A Fig. 32 mostra a metade direita da estrutura do Composto TI.
[00135] A Fig. 33 mostra um esquema para a preparação do Composto TI.
[00136] A Fig. 34 mostra um esquema para a preparação do Composto TI.
[00137] A Fig. 35 mostra a metade esquerda da estrutura do Composto T12.
[00138] A Fig. 36 mostra a metade direita da estrutura do Composto T12.
[00139] A Fig. 37 mostra um esquema para a preparação do Composto T12.
[00140] A Fig. 38 mostra um esquema para a preparação do Composto T12.
[00141] A Fig. 39 mostra a metade esquerda da estrutura do Composto TI3.
[00142] A Fig. 40 mostra a metade direita da estrutura do Composto TI3.
[00143] A Fig. 41 mostra um esquema para a preparação do Composto TI3.
[00144] A Fig. 42 mostra um esquema para a preparação do Composto TI3.
[00145] A figura 43 mostra as metades direita e esquerda da estrutura do composto T14.
[00146] A Fig. 44 mostra um esquema para a preparação do Composto
TI.
[00147] A Fig. 45 mostra um esquema para a preparação do Composto TI.
[00148] A Fig. 46 mostra a atividade in vitro para nocaute da expressão gênica usando um siRNA exemplificativo em células estreladas de rato para formulações lipossômicas contendo um composto fusogênico desta invenção. (1) Resultados para uma formulação lipossômica composta por lipídios HEDC e S104, que não continham um composto fusogênico desta invenção. (2) Resultados para uma formulação lipossômica semelhante a (1), exceto que continha 2% (de lipídios totais) do composto fusogênico R4. (3) Resultados para uma formulação lipossômica semelhante a (1), exceto que continha 10% (de lipídios totais) do composto fusogênico R4. A presença do composto fusogênico R4 na formulação aumentou muito a atividade entregue do siRNA de exemplo, e o aumento da atividade foi diretamente atribuível à presença do composto fusogênico R4.
[00149] A Fig. 47 mostra a atividade in vitro para nocaute da expressão gênica usando um siRNA exemplificativo em células estreladas de rato usando uma formulação lipossômica contendo um composto fusogênico desta invenção. (1) Resultados para uma formulação lipossômica composta por lipídios HEDC e S104, que não continham um composto fusogênico desta invenção. (2) Resultados para uma formulação lipossômica semelhante a (1), exceto que continha 2% (de lipídios totais) do composto fusogênico R4. (3) Resultados para uma formulação lipossômica semelhante a (1), exceto que continha 2% (de lipídios totais) do composto fusogênico T3. A presença de compostos fusogênicos R4 e T3, respectivamente, nas formulações aumentou muito a atividade entregue do siRNA de exemplo, e o aumento da atividade foi diretamente atribuível à presença dos compostos fusogênicos R4 e T3.
[00150] A Fig. 48 mostra resultados para entrega e transfecção de mMRNA de GFP a 5 nM (Superior) e 2 nM (inferior) em células AS49 in vitro com nanopartículas de LNP desta invenção com a composição HEDC:S104:CH:DOPE: DMPE-PEG2000:Composto T3. As imagens de fluorescência (esquerda) da expressão de GFP foram adquiridas 48 horas após transfecção com um microscópio de fluorescência. A imagem de sobreposição (direita) das imagens de fluorescência e campo claro (BF) demonstra que quase 100% das células foram transfectadas e estão expressando GFP.
[00151] A Fig. 49 mostra resultados para a entrega de MRNA de GFP in vivo usando moléculas fusogênicas do tipo lipídio desta invenção. O mRNA de GFP foi transfectado em camundongos Balb/c com as nanopartículas de LNP desta invenção com a composição HEDC:S104:CH: DOPE: DMPE-PEG2000:Composto T3. Como mostrado na Fig. 49, a entrega do MRNA a vários tecidos e células foi determinada com um MAXDISCOVER GFP ELISA. Surpreendentemente, o MRNA da GFP foi seletivamente transfectado e/ou traduzido no pulmão, com menor transfecção e/ou tradução no músculo, fígado, coração e rim.
[00152] A Fig. 50 mostra resultados para a entrega de mMRNA de Luciferase in vivo usando moléculas fusogênicas do tipo lipídio desta invenção. O mRNA de luciferase foi transfectado em camundongos Balb/c com as nanopartículas de LNP desta invenção com a composição HEDC:S104:CH: DOPE: DMPE-PEG2000:Composto T3. Como mostrado na Fig. 50, a entrega relativa, transfecção e/ou tradução do mMRNA em vários tecidos e células foi determinada com um kit de ensaio Promega EA510. Surpreendentemente, o mRNA de Fluc foi entregue, transfectado e/ou traduzido seletivamente no pulmão e no baço, com entrega, transfecção e/ou tradução mais baixas no fígado, coração, rim e músculo.
[00153] A Fig. 51 mostra resultados para a entrega de mRNA de Luciferase in vivo usando moléculas fusogênicas do tipo lipídio desta invenção. O mRNA da luciferase foi transfectado em camundongos Balb/c com as nanopartículas de LNP desta invenção com a composição:
54 / 94 (-01) — HE2DC:S104:CH:DOPE:DMPE-PEG2000:Composto T3, ou (-02) HEDC:S104:CH: DOPE: DMPE-PEG2000:Composto T3, injetada a 2 mpk. Como mostrado na Fig. 51, a entrega relativa, transfecção e/ou tradução do mMRNA em vários tecidos e células foi determinada com um kit de ensaio Promega E4510. O mRNA de Fluc foi entregue, transfectado e/ou traduzido seletivamente no pulmão e no baço, com entrega, transfecção e/ou tradução mais baixas no pâncreas, rim, fígado, testículo e intestino delgado.
[00154] A Fig. 52 mostra resultados de bioluminescência para a entrega de mRNA de luciferase em camundongos in vivo usando moléculas fusogênicas do tipo lipídio desta invenção. Como mostrado na Fig. 52, a entrega relativa, transfecção e/ou tradução do mRNA em vários tecidos e células foi determinada com imagens de luminescência 7 horas após a injeção.
[00155] A Fig. 53 mostra resultados para a entrega de mMRNA de Luciferase in vivo em camundongos usando moléculas fusogênicas do tipo lipídio desta invenção. Como mostrado na Fig. 53, a entrega relativa de mRNA foi muito maior em formulações contendo a molécula fusogênica desta invenção (2035-03-03) do que na mesma formulação sem a molécula fusogênica (2035-13-01).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[00156] Esta invenção provê uma gama de moléculas fusogênicas. Os compostos fusogênicos desta invenção podem ser utilizados na administração de agentes terapêuticos a células, tecidos ou órgãos, organismos e indivíduos.
[00157] Em alguns aspectos, esta invenção provê compostos de plataforma para a formação de moléculas fusogênicas. As moléculas fusogênicas podem ser formadas anexando uma ou várias moléculas neutras, como moléculas de hidrocarbonetos, molécula alifática, molécula de ácido graxo saturado, molécula de ácido graxo insaturado, molécula de ácido graxo monoinsaturado ou molécula de ácido graxo poli-insaturado à estrutura da plataforma.
[00158] Exemplos de um composto fusogênico desta invenção incluem, mas não estão limitados a, um composto R4 mostrado na Fig. 4B; um composto S6 mostrado na Fig. 12B; um composto S7 mostrado na Fig. 13B; um composto S8 mostrado na Fig. 14B; um composto T1 mostrado na Fig. 15B; um composto T2 mostrado na Fig. 16B; um composto T4 mostrado na Fig. 17B; um composto T5 mostrado na Fig. 18B; um composto T6 mostrado na Fig. 19B; um composto T7 mostrado na Fig. 20B; um composto T8 mostrado na Fig. 21B; um composto T9 mostrado na Fig. 22B; um composto T3 mostrado na Fig. 23B; um composto T10 mostrado nas Figs. 27 e 28; um composto T11 mostrado nas Figs. 31 e 32; um composto T12 mostrado nas Figs. 35 e 36; um composto T13 mostrado nas Figs. 39 e 40; um composto T14 mostrado na Fig. 43.
[00159] Compostos mostrados nas Figs. 1, 2, 3A, 3B e 6-11 são mostrados para fins de ilustração de métodos de síntese de compostos.
[00160] Em alguns aspectos, esta invenção provê uma variedade de moléculas fusogênicas, que podem ser usadas em formulações para formar e utilizar nanopartículas lipídicas para entregar agentes ativos a células e indivíduos.
[00161] Um composto fusogênico da presente invenção pode ter um ou dois anfifílicos afixados a um grupo de aminoácidos, cujo grupo aminoácido é afixado por um ligante a um grupo de aminoácidos separado que transporta um ou dois anfifílicos adicionais.
[00162] As cadeias lipofílicas de um anfifílico podem cada uma conter independentemente 8 a 22 átomos de carbono.
[00163] Um grupo anfifílico pode ser um grupo do tipo lipídio, tendo uma ou duas cadeias lipofílicas afixadas a um grupo químico orgânico. O grupo químico orgânico pode ter até 400 átomos ou 20-400 átomos ou 10-400 átomos ou 4-400 átomos ou 3-400 átomos ou 2-400 átomos ou 1-400 átomos selecionados a partir de carbono, oxigênio, nitrogênio, enxofre, flúor e hidrogênio, e pode ter qualquer estrutura adequada para anexar as uma ou duas cadeias lipofílicas e anexar ao grupo aminoácido. O grupo químico orgânico pode ser neutro ou zwitteriônico ou pode prover uma natureza hidrofílica. Em certas modalidades, o grupo químico orgânico pode ser ionizável. Exemplos de um grupo químico orgânico incluem alquila, alquenila, alquinila e acetil, bem como grupos protetores como Boc, Fmoc, TFA e CBZ (benziloxicarbonil).
[00164] Sem desejar estar vinculado a qualquer teoria em particular, um anfifílico pode ter uma estrutura do tipo lipídio, de modo que o anfifílico possa entrar em uma bicamada lipídica em uma orientação semelhante às moléculas lipídicas da bicamada, enquanto permanece afixado ao composto fusogênico maior. Um composto fusogênico desta invenção pode disromper a estrutura dinâmica da bicamada para aumentar a fusogenicidade para as células.
[00165] Um grupo de aminoácidos de um composto fusogênico (designado AA ou AAº*) pode ser modificado com substituintes. Um grupo de aminoácidos de um composto fusogênico pode ser qualquer grupo de aminoácidos D ou L com a fórmula -NRY-CR'Rº-(C=0O)-, em que R' é uma cadeia lateral substituída ou não substituída de certos aminoácidos naturais. R? e RN podem ser cada um independentemente hidrogênio, ou um grupo orgânico consistindo em átomos de carbono, oxigênio, nitrogênio, enxofre e hidrogênio, e ter de 1 a 20 átomos de carbono, ou podem ser alquila C(1-6), cicloalquila, cicloalquilalquila, alquenila C(2-6), alquinila C(2-6), alcanoila C(1-6), alcanoiloxi C(1-6), alcoxi C(1-6), alcoxi C(1-6)-alquila C(1-6), alcoxi C(1-6)-alcoxi C(1-6).
[00166] Como usado aqui, o termo "que está afixado a AA" é usado para designar o ponto de afixação de um grupo a AA. Por exemplo, o termo "-
alquila-(C=O)-, que está afixado a AA" refere-se à afixação a AA através do grupo (C=O)-, para que o grupo -alquila-(C=O)-AA seja formado. Salvo indicação em contrário, pretende-se que o último grupo que aparece ao lado da frase "que está afixado a AA" seja o grupo afixado a AA.
[00167] Esta invenção pode prover composições para uso na distribuição de um agente ativo em células, tecidos ou órgãos, organismos e indivíduos, em que a composição inclui uma ou mais das moléculas fusogênicas da presente invenção.
[00168] Os compostos fusogênicos desta invenção podem prover composições e formulações para uso na entrega de agentes terapêuticos a células, tecidos e indivíduos vantajosamente, sem agregação significativa dos componentes da composição.
[00169] Um composto fusogênico desta invenção pode prover uma formulação lipossômica para uso na entrega de agentes terapêuticos a células, tecidos e indivíduos vantajosamente, sem agregação significativa dos lipossomas da composição.
[00170] As composições desta invenção podem incluir uma ou mais das moléculas fusogênicas, juntamente com um lipídio estrutural e um ou mais lipídios para reduzir a imunogenicidade da composição.
[00171] Em alguns aspectos, esta invenção provê novos lipídios fusogênicos que facilitam a entrega de moléculas biologicamente ativas nas células. Os lipídios fusogênicos podem ser incorporados em formulações, como nanopartículas ou lipossomas, para entregar moléculas terapêuticas, incluindo ácidos nucleicos ou oligonucleotídeos, às células, incluindo tumores. Em certas modalidades, nanopartículas ou lipossomas contendo lipídios fusogênicos podem se fundir com uma membrana plasmática de uma célula ou membrana intracelular de uma célula e facilitar a liberação de moléculas terapêuticas, bem como aumentar a eficácia da transfecção.
[00172] Em modalidades adicionais, uma série de novos lipídios fusogênicos pode ser sintetizada e incorporada em nanopartículas ou lipossomas. As nanopartículas ou lipossomas podem incorporar ou encapsular moléculas terapêuticas, incluindo moléculas à base de ácido nucleico, como siRNA, miRNA ou mRNA, bem como fármacos de pequenas moléculas e qualquer agente terapêutico ativo que possa ser entregue com as nanopartículas ou lipossomas.
[00173] O tamanho de partícula de nanopartículas ou lipossomas pode estar na faixa de 50 a 200 nm, com uma polidispersividade menor que 0,2. À eficácia da transfecção das nanopartículas ou lipossomas em várias linhas celulares pode ser aumentada em relação às nanopartículas ou lipossomas sem um ou mais dos novos lipídios fusogênicos.
[00174] Em modalidades adicionais, a absorção celular de nanopartículas ou lipossomas desta invenção por uma via endocitótica ou mecanismo de micropinocitose, entre outros, pode ser aumentada.
[00175] Nanopartículas ou lipossomas desta invenção também podem reduzir a degradação lisossômica de moléculas terapêuticas na entrega.
[00176] Em algumas modalidades, esta invenção inclui composições contendo uma ou mais das moléculas fusogênicas, juntamente com outras moléculas lipídicas para a formação de nanopartículasó. Em certas modalidades, as moléculas fusogênicas podem compreender 0,1 a 40% mol dos lipídios da composição. Em outras modalidades, o composto fusogênico pode compreender 1 a 20% mol dos lipídios da composição. Em modalidades adicionais, o composto fusogênico pode compreender 1 a 10% mol ou 2 a 10% mol dos lipídios da composição. Em modalidades adicionais, as moléculas fusogênicas podem compreender 2% mol dos lipídios da composição.
[00177] Em algumas modalidades, um composto fusogênico pode compreender um quarto ou quinto componente dos lipídios da composição, ou as moléculas fusogênicas podem substituir um dos componentes dos lipídios da composição.
[00178] As moléculas fusogênicas desta invenção podem ser compostas por uma estrutura de plataforma, e estando afixadas à estrutura de plataforma de um a quatro grupos anfifílicos com vinculações químicas adequadas.
[00179] Uma composição desta invenção pode incluir uma molécula fusogênica desta descrição. A molécula fusogênica pode ser de 1 a 10% mol da composição, ou mais. A composição pode formar uma nanopartícula ou lipossoma.
[00180] Em algumas modalidades, uma composição desta invenção pode incluir um lipídio catiônico, um lipídio ionizável e uma molécula lipídica fusogênica, que pode ser combinada para formar uma nanopartícula lipídica. Em certas modalidades, uma nanopartícula lipídica pode ter uma bicamada de moléculas lipídicas.
[00181] Em certas modalidades, um ou dois anfifílicos podem estar ausentes e, quando ausentes, podem ser substituídos por um grupo protetor Rº.
[00182] Em modalidades adicionais, um ou dois anfifílicos podem estar ausentes e, quando ausentes, podem ser substituídos por um grupo alquila, alquenila ou alquinila, ou um grupo químico orgânico com até 400 átomos, 20-400 átomos ou 10-400 átomos , ou 4-400 átomos, ou 3-400 átomos, ou 2-400 átomos, ou 1-400 átomos selecionados de carbono, oxigênio, nitrogênio, enxofre, flúor e hidrogênio.
[00183] Os métodos para preparar vários grupos orgânicos e grupos protetores são conhecidos na técnica e seu uso e modificação geralmente estão dentro da capacidade de um versado na técnica. Ver, por exemplo, Stanley R. Sandler and Wolf Karo, Organic Functional Group Preparations (1989); Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques (1996); Leroy G. Wade, Compendium Of Organic Synthetic Methods (1980); alguns exemplos de grupos protetores são encontrados em T. W. Greene e P. G. M. Wuts, Protective Groups In Organic Synthesis (3º ed. 1991). Ver, por exemplo, Helmut Vorbriggen, Handbook of Nucleoside Synthesis (2001).
[00184] Exemplos de um grupo protetor R” incluem Fmoc (fluorenilmetiloxicarbonil).
[00185] Exemplos de um grupo protetor R” incluem Boc (terc- butiloxicarbonil).
[00186] Exemplos de um grupo protetor R” incluem OTrt (O trifenilmetil).
[00187] Exemplos de um grupo protetor de amino R” incluem Ac (acetamida (C=O)CH;).
[00188] Exemplos de grupos protetores de amino incluem Fmoc, Boc, Trt, Dde e Alloc.
[00189] Exemplos de grupos alcoxi protetores incluem OTrt, OCIt, OMmt, OMtt, ODpm e OtBu.
[00190] Exemplos de um grupo protetor incluem éter t-butílico.
[00191] Exemplos de um grupo protetor de ácido carboxílico incluem éster benzílico. Lipídios catiônicos e lipídios ionizáveis
[00192] Exemplos dos lipídios catiônicos e dos lipídios ionizáveis desta descrição são dados em US20130022665A e US20130330401A.
[00193] A estrutura do HEDC é mostrada em US2013/0022665A em
[0146].
[00194] A estrutura do S104 é mostrada em US 2013/0115274A1 em
[0046]. Composições com três ou mais componentes
[00195] Como usado aqui, um componente de uma formulação, como um "lipídio", pode ser um único composto ou pode ser uma combinação de um ou mais compostos lipídicos adequados. Por exemplo, "um lipídio estabilizador" pode se referir a um único lipídio estabilizador ou a uma combinação de um ou mais lipídios estabilizadores adequados. Um versado na técnica pode compreender facilmente que certas combinações dos compostos aqui descritos podem ser utilizadas sem experimentação indevida e que várias combinações de compostos são englobadas pela descrição de um componente de uma formulação.
[00196] Os compostos ionizáveis de uma composição desta invenção podem ser de 20% mol a 80% mol dos componentes lipídicos da composição. Em certas modalidades, as moléculas ionizáveis de uma composição podem ser de 55% mol a 65% mol dos componentes lipídicos da composição. Em outras modalidades, as moléculas ionizáveis de uma composição podem ser cerca de 60% mol dos componentes lipídicos da composição.
[00197] O lipídio estrutural de uma composição desta invenção pode ser de 20% mol a 50% mol dos componentes lipídicos da composição. Em certas modalidades, o lipídio estrutural de uma composição pode ser de 35% mol a 45% mol dos componentes lipídicos da composição.
[00198] O um ou mais lipídios para reduzir a imunogenicidade da composição pode ser de um total de 1% mol a 8% mol dos componentes lipídicos da composição. Em certas modalidades, o um ou mais lipídios para reduzir a imunogenicidade da composição pode ser de um total de 1% mol a 5% mol dos componentes lipídicos da composição.
[00199] Em aspectos adicionais, uma composição desta invenção pode incluir adicionalmente um lipídio catiônico, que pode ser de 5% mol a 25% mol dos componentes lipídicos da composição. Em certas modalidades, uma composição desta invenção pode incluir adicionalmente um lipídio catiônico, que pode ser de 5% mol a 15% mol dos componentes lipídicos da composição. Nestes aspectos, a razão molar das concentrações do lipídio catiônico para as moléculas ionizáveis de uma composição desta invenção pode ser de 5:80 a 25:50.
[00200] Nas composições desta invenção, a totalidade dos componentes lipídicos pode incluir um ou mais componentes moleculares do composto ionizável, um lipídio estrutural e um ou mais lipídios para reduzir a imunogenicidade da composição.
[00201] Além dos componentes acima, uma composição desta invenção pode incluir adicionalmente uma molécula fusogênica desta descrição. À molécula fusogênica pode ser de 1 a 10% mol da composição. Composições com quatro ou mais componentes
[00202] As moléculas ionizáveis de uma composição desta invenção podem ser de 15% mol a 40% mol dos componentes lipídicos da composição. Em certas modalidades, as moléculas ionizáveis de uma composição podem ser de 20% mol a 35% mol dos componentes lipídicos da composição. Em certas modalidades, as moléculas ionizáveis de uma composição podem ser de 25% mol a 30% mol dos componentes lipídicos da composição.
[00203] O lipídio estrutural de uma composição desta invenção pode ser de 25% mol a 40% mol dos componentes lipídicos da composição. Em certas modalidades, o lipídio estrutural de uma composição pode ser de 30% mol a 35% mol dos componentes lipídicos da composição.
[00204] A soma dos lipídios estabilizadores de uma composição desta invenção pode ser de 25% molar a 40% mol dos componentes lipídicos da composição. Em certas modalidades, a soma dos lipídios estabilizadores de uma composição pode ser de 30% molar a 40% molar dos componentes lipídicos da composição.
[00205] Em algumas modalidades, uma composição desta invenção pode incluir dois ou mais lipídios estabilizadores, em que cada um dos lipídios estabilizadores individualmente pode ser de 5% mol a 35% mol dos componentes lipídicos da composição. Em certas modalidades, uma composição desta invenção pode incluir dois ou mais lipídios estabilizadores, em que cada um dos lipídios estabilizadores individualmente pode ser de 10%
mol a 30% mol dos componentes lipídicos da composição.
[00206] Em certas modalidades, a soma dos um ou mais lipídios estabilizadores pode ser de 25% mol a 40% mol dos lipídios da composição, em que cada um dos lipídios estabilizadores individualmente pode ser de 5% mol a 35% mol.
[00207] Em certas modalidades, a soma dos um ou mais lipídios estabilizadores pode ser de 30% mol a 40% mol dos lipídios da composição, em que cada um dos lipídios estabilizadores individualmente pode ser de 10% mol a 30% mol.
[00208] O um ou mais lipídios para reduzir a imunogenicidade da composição pode ser de um total de 1% mol a 8% mol dos componentes lipídicos da composição. Em certas modalidades, o um ou mais lipídios para reduzir a imunogenicidade da composição pode ser de um total de 1% mol a 5% mol dos componentes lipídicos da composição.
[00209] Em aspectos adicionais, uma composição desta invenção pode incluir adicionalmente um lipídio catiônico, que pode ser de 5% mol a 25% mol dos componentes lipídicos da composição. Em certas modalidades, uma composição desta invenção pode incluir adicionalmente um lipídio catiônico, que pode ser de 5% mol a 15% mol dos componentes lipídicos da composição. Nestes aspectos, a razão molar das concentrações do lipídio catiônico para as moléculas ionizáveis de uma composição desta invenção pode ser de 5:35 a 25:15.
[00210] Em certas modalidades, a totalidade dos componentes lipídicos de uma composição pode incluir um ou mais componentes moleculares do composto ionizável, um lipídio estrutural e um ou mais lipídios para reduzir a imunogenicidade da composição, e um ou mais lipídios estabilizadores.
[00211] Além dos componentes acima, uma composição desta invenção pode incluir adicionalmente uma molécula fusogênica desta descrição. A molécula fusogênica pode ser de 1 a 10% mol da composição.
64 / 94 Exemplos de composições lipídicas
[00212] Em algumas modalidades, uma composição pode conter uma ou mais moléculas ionizáveis, um lipídio estrutural, um ou mais lipídios para reduzir a imunogenicidade da composição e uma molécula fusogênica da presente invenção, que representaria 100% dos componentes lipídicos da composição. Em certas modalidades, um lipídio catiônico pode ser usado.
[00213] Exemplos de composições dessa invenção são mostrados na Tabela 1 abaixo. Tabela 1: Composições de componentes lipídicos (cada uma em % mol do total) fonizável —“Catiônico Estrutural Reduzir — JFusogênico limun. ko o Bo 8 R o) o B3 5 R 65 o 2 1 R o B1 B 1 o) B3 a 3 65 8 3 a o o po 5 5 BB b Bb 6 8 B bb 5 2 10
BB Boo fi Ep
[00214] Exemplos de composições dessa invenção são mostrados na Tabela 2 abaixo. Tabela 2: Composições de componentes lipídicos (cada uma em % mol do total) 'atiônico [Estrutural Estabilizador — [Reduzir imun. fFusogênico Bob bs 56 O BB ao Bs 5s 7 ' p E 34 B PR | Bs Ph os 56 5 Bo o Rr RB Bo os 56 5 p E sa CS bo bs a ER Bb o 7
E O O Bs IS E o EB Lipídios estruturais
[00215] Exemplos de lipídios estruturais incluem colesteróis, esteróis e esteroides.
[00216] Exemplos de lipídios estruturais incluem colanos, colestanos, ergostanos, campestanos, poriferastanos, estigmastanos, gorgostanos, lanostanos, gonanos, estanos, androstanos, pregnanos e cicloartanos.
[00217] Exemplos de lipídios estruturais incluem esteróis e zoosteróis, como colesterol, lanosterol, zimosterol, zimostenol, desmosterol, estigmastanol, di-hidrolanosterol e 7-desidrocolesterol.
[00218] Exemplos de lipídios estruturais incluem colesteróis peguilados e compostos de colestano 3-0x0-acil(C1-22), por exemplo, acetato de colesteril, araquidonato de colesteril, butirato de colesteril, hexanoato de colesteril, miristato de colesteril, palmitato de colesteril, be-henato de colesteril, estearato de colesteril, caprilato de colesteril, n-decanoato de colesteril, dodecanoato de colesteril, nervonato de colesteril, pelargonato de colesteril, n-valerato de colesteril, oleato de colesteril, elaidato de colesteril, erucato de colesteril, heptanoato de colesteril, linolelaidato de colesteril e linoleato de colesteril.
[00219] Exemplos de lipídios estruturais incluem esteróis como fitoesteróis, beta-sitosterol, campesterol, ergosterol, brassicasterol, delta-7- estigmasterol e delta-7-avenasterol. Lipídios estabilizadores
[00220] Exemplos de lipídios estabilizadores incluem lipídios zwitteriônicos.
[00221] Exemplos de lipídios estabilizadores incluem compostos como fosfolipídios.
[00222] Exemplos —“de fosfolipídios incluem fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, ácido fosfatídico, palmitoiloleoil fosfatidilcolina, lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina, dipalmitoilfosfatidilcolina, dioleoilfosfatidilcolina, diestearoilfosfatidilcolina
66 / 94 e ordilinoleoilfosfatidilcolina.
[00223] Exemplos de lipídios estabilizadores incluem compostos de fosfatidiletanolamina e compostos de fosfatidilcolina.
[00224] Exemplos de lipídios estabilizadores incluem 1,2-dioleoil-sn- glicero-3-fosfocolina (DOPC).
[00225] Exemplos de lipídios estabilizadores incluem difitanoilfosfatidiletanolamina — (DPRPE) e 1,2-difiltanoil-sn-glicero-3- fosfocololina (DPhPC).
[00226] Exemplos de lipídios estabilizadores incluem 1,2-diestearoil- sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocololina (DPPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3 -fosfoetanolamina (DPPE) e 1,2 dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE).
[00227] Exemplos de lipídios estabilizadores incluem 1,2-dilauroil-sn- glicerol (DLG); 1,2-dimiristoil-sn-glicerol (DMG); 1,2-dipalmitoil-sn-glicerol (DPG); 1,2-diestearoil-sn-glicerol (DSG); 1,2-diaraquidoil-sn-glycero-3- fosfocolina (DAPC); 1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfocolina (DLPC); 1,2- dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC); 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-O- etil-3-fosfocolina — (DPePC); 1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DLPE); 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina — (DMPE); 1,2- diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DSPE); 1-palmitoil-2-linoleoil-sn- glicero-3-fosfocolina; 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC); 1-palmitoil-2-liso-sn-glicero-3-fosfocolina (P-Lyso-PC); e 1-estearoil-2-liso- sn-glicero-3-fosfocolina (S-Lyso-PC). Lipídios para reduzir a imunogenicidade
[00228] Exemplos de lipídios para reduzir a imunogenicidade incluem compostos poliméricos e conjugados polímero-lipídios.
[00229] Exemplos de lipídios para reduzir a imunogenicidade incluem lípidios peguilados com regiões de polietilenoglicol (PEG). As regiões de PEG podem ter qualquer massa molecular. Em algumas modalidades, uma região de PEG pode ter uma massa molecular de 200, 300, 350, 400, 500, 550, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 3500, 4000 ou 5000 Da.
[00230] Exemplos de lipídios para reduzir a imunogenicidade incluem compostos possuindo uma região de metoxipolietilenoglicol.
[00231] Exemplos de lipídios para reduzir a imunogenicidade incluem compostos possuindo uma região de carbonil-metoxipolietilenoglicol.
[00232] Exemplos de lipídios para reduzir a imunogenicidade incluem lípidios peguilados com regiões de polietilenoglicol (PEG.
[00233] Exemplos de lipídios para reduzir a imunogenicidade incluem compostos possuindo uma região de poliglicerina.
[00234] Exemplos de lipídios para reduzir a imunogenicidade incluem lipídios poliméricos, como DSPE-mPEG, DMPE-mPEG, DPPE-mPEG e DOPE-mPEG.
[00235] Exemplos de lipídios para reduzir a imunogenicidade incluem PEG-fosfolipídios e PEG-ceramidas. Lipídios catiônicos
[00236] Exemplos de lipídios catiônicos incluem compostos de HEDC catiônicos (brometo de 2-(bis(2-(tetradecanoiloxi)etil)amino)-N-(2- hidroxietil)-N, N-dimetil-2-o0xoetano-amínio), conforme descrito no US 2013/0330401 Al. Alguns exemplos de lipídios catiônicos são dados no US 2013/0115274 AL. Composições lipídicas
[00237] Em algumas modalidades, uma composição pode conter uma molécula fusogênica, um composto ionizável, colesterol, lipídios DOPC e DOPE e DPPE-mPEG. Em certas modalidades, a molécula fusogênica pode ser de 1 a 20% mol da composição, a molécula ionizável pode ser de 15 a 25% mol da composição; o colesterol, DOPC e DOPE combinados podem ser de 75 a 85% mol da composição; e DPPE-mPEG pode ser 2-5% mol da composição.
[00238] Em uma modalidade, a molécula fusogênica pode ser 2% mol da composição, a molécula ionizável pode ser 24% mol da composição; colesterol pode ser 29% mol da composição, DOPC pode ser 20% mol da composição, DOPE pode ser 20% mol da composição; e DPPE-mPEG (2000) pode ser 5% mol da composição. Nanopartículas
[00239] Modalidades desta invenção podem prover composições de nanopartículas de lipossomas. As moléculas fusogênicas desta invenção podem ser usadas para formar composições de lipossomas, que podem ter uma ou mais estruturas de duas camadas de moléculas semelhantes a lipídios.
[00240] Uma composição de nanopartículas pode ter uma ou mais das moléculas fusogênicas desta invenção em uma estrutura lipossômica, uma estrutura de duas camadas, uma micela, uma estrutura lamelar ou uma mistura das mesmas.
[00241] Em algumas modalidades, uma composição pode incluir um ou mais componentes de carreador líquidos. Um carreador líquido adequado para a entrega de agentes ativos desta invenção pode ser um carreador líquido farmaceuticamente aceitável. Um carreador líquido pode incluir um solvente orgânico ou uma combinação de água e um solvente orgânico.
[00242] As modalidades desta invenção podem prover nanopartículas lipídicas com um tamanho de 10 a 1000 nm. Em algumas modalidades, as nanopartículas de lipossomas podem ter um tamanho de 10 a 150 nm. Composições farmacêuticas
[00243] Esta invenção contempla adicionalmente métodos para distribuir um agente ativo a um órgão de um indivíduo para tratamento de fibrose, administrando ao indivíduo uma composição desta invenção. Os órgãos que podem ser tratados incluem pulmão, fígado, pâncreas, rim, cólon, coração, medula óssea, pele, intestino, cérebro e olhos.
[00244] Em algumas modalidades, esta invenção provê métodos para o tratamento de uma doença de fibrose pulmonar, administrando ao indivíduo uma composição desta invenção.
[00245] Exemplos de doença de fibrose incluem fibrose pulmonar idiopática e cirrose hepática.
[00246] Em outros aspectos, esta invenção provê uma variedade de formulações farmacêuticas.
[00247] Uma formulação farmacêutica aqui contida pode incluir um agente ativo, bem como um carreador de fármaco ou um lipídio desta invenção, juntamente com um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável.
[00248] Em geral, os agentes ativos desta descrição incluem siRNAs, agentes ativos para fibrose, bem como qualquer fármaco de molécula pequena. Um agente ativo pode ser um ácido nucleico, um siRNA, um mBRNA ou um microRNA.
[00249] Uma formulação farmacêutica desta invenção pode conter um ou mais de cada um dos seguintes itens: um tensoativo, um diluente, um excipiente, um conservante, um estabilizador, um corante e um agente de suspensão.
[00250] Alguns veículos farmacêuticos, diluentes e componentes para uma formulação farmacêutica, bem como métodos para formular e administrar os compostos e composições desta invenção são descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18º Ed., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1990).
[00251] Exemplos de conservantes incluem benzoato de sódio, ácido ascórbico e ésteres de ácido p-hidroxibenzoico.
[00252] Exemplos de agentes tensoativos incluem álcoois, ésteres, álcoois alifáticos sulfatados.
[00253] Exemplos de excipientes incluem sacarose, glicose, lactose, amido, celulose cristalizada, manitol, silicato anidro leve, aluminato de magnésio, aluminato de metassilicato de magnésio, silicato de alumínio sintético, carbonato de cálcio, carbonato de ácido de sódio, hidrogenofosfato de cálcio e carboximetilcelulose de cálcio.
[00254] Exemplos de agentes de suspensão incluem óleo de coco, azeite, óleo de gergelim, óleo de amendoim, soja, ftalato de acetato de celulose, copolímero de metilacetato-metacrilato e éster ftalatos. Estruturas de caudas moleculares
[00255] Um composto desta invenção pode ter uma ou mais caudas lipofílicas que contêm um ou mais grupos alquila ou alquenila. Exemplos de caudas lipofílicas com grupos alquenila incluem alquenila C(14:1(5)), alquenila C(14:1(9)), alquenila C(16:1(7)), alquenila C(16:1(9)), alquenila C(18:1(3)), alquenila C(18:1(5)), alquenila C(18:1(7)), alquenila C(18:1(9)), alquenila C(18:1(11)), alquenila C(18:1(12)), alquenila C(18:2(9,12)), alquenila C(18:2(9,11)), alquenila C(18:3(9,12,15)), alquenila C(18:3(6,9,12)), alquenila C(18:3(9,11,13)), alquenila C(18:4(6,9,12,15)), alquenila C(18:4(9,11,13,15)), alquenila C(20:1(9)), alquenila C(20:1(11)), alquenila C(20:2(8,11)), alquenila C(20:2(5,8)), alquenila C(20:2(11,14)), alquenila C(20:3(5,8,11)), C(20:4(5,8,11,14)), alquenila C(20:4(7,10,13,16)), alquenila C(20:5(5,8,11,14,17)), alquenila C(20:6(4,7,10,13,16,19)), alquenila C(22:1(9)), alquenila C(22:1(13)), e alquenila C(24:1(9)). Alguns exemplos de estruturas de cauda são encontrados em Donald Voet e Judith Voet, Biochemistry, 3a Edição (2005), p. 383.
[00256] Alguns exemplos de caudas lipofílicas incluem as seguintes estruturas:
NOITES IM EA EIS, 020:4 II DIANA NÉ c183 DIDI DIOS OOD, 018:2 MOSS C18:1 VA ÇA co DA DADDADAODÔAODÔ AOS AO DÔ, 016 MODAMDADAMAODADRAMON SÁ Cu
[00257] Qualquer uma dessas estruturas de exemplo de caudas lipofílicas pode ter uma ou mais ramificações químicas adicionais. Modalidades adicionais
[00258] Modalidades desta invenção incluem adicionalmente:
[00259] Um composto de fórmula (A) R Rº Ligante 4 R -R 2X x NE — e
O 9 fórmula (A) em que o ligante é um grupo divalente compreendendo a porção de PEG, Xi, e X) são independentemente grupo alcanodiil CI-C5, R1, R2, R3 e R4 são independentemente o oO O a CS NANATA | —Xs Re 25
Y Oo X; é ligação simples, grupo alcanodiil CI-C5 ou grupo alquenodiil C2-C5, Xa e Xs são independentemente grupo alcanodiil C2-5, Z1, Z2 € Z3 são independentemente -O-, —S- ou -NH-, e
Rs e Rs são independentemente um grupo alquila C11-23 ou alquenila C11-23.
[00260] Um composto de fórmula (B) R7 71 xs Ligante x zo Rº
TSE SEK nº O o górmula (B) em que ligante é um grupo divalente compreendendo porção PEG, Xç e X; são independentemente grupo alcanodiil C1-C5, Xzg e Xo são independentemente grupo alcanodiil C1-C5, Za. e Zs são independentemente -O-, —S- ou -NH-, R7, Rg, Ro é Rio são independentemente BZ; A . As 2 “s Oo X, e Xs são independentemente grupo alcanodiil C2-5, Za e Z3 são independentemente -O-, —S- ou -NH-, e R; e R« são independentemente um grupo alquila C11-23 ou alquenila C11-23.
[00261] O composto acima, em que o ligante é
O O e Ee m n p q em que m é um número inteiro de 1 a 12, Y1 é -O-, -NH- ou -NHCH,;-, Y7; é -O-, -NH- ou -CH,NH-, n e q são independentemente um número inteiro de 1 a5, p é um número inteiro de 0 a 5, Y;3 e Ys são independentemente -O-, -NH- ou -NHCH,;-, e
Ya e Ys são independentemente -O-, -NH- ou -CH.NH-.
[00262] O composto acima, em que X, e X; são independentemente um grupo alcanodiil linear C1-C5, preferencialmente um grupo alcanodiil linear C2-CA4, mais preferencialmente um grupo alcanodiil linear C4.
[00263] O composto acima, em que Ri, Ro, R; e R1 são o mesmo grupo.
[00264] O composto acima, em que X; é ligação simples ou grupo alcanodiil linear C1-C5, X; é preferencialmente grupo alcanodiil linear C2- CA, mais preferencialmente etileno, isto é, grupo etanodi-il.
[00265] O composto acima, em que X, e X; são independentemente um grupo alcanodiil linear C2-5, X, e Xs preferencialmente um grupo alcanodiil linear C2-4, mais preferencialmente etileno, isto é, grupo etanodi-il.
[00266] O composto acima, em que Z, é — NH-.
[00267] O composto acima, em que Z, e Z;3 são -O-.
[00268] O composto acima, em que R; e R;« são independentemente um grupo alquenila C11-23 linear.
[00269] O composto acima, em que R; e R;« são independentemente um grupo alquenil C11-23 linear com 1-6 ligação(ões) dupla(s), em que o número de ligações duplas é preferencialmente 1-3, mais preferencialmente 2-3, e ainda mais preferencialmente 2.
[00270] O composto acima, em que R; e R; são independentemente um grupo alquenila C11-23 linear com 2 ligações duplas.
[00271] O composto acima, em que Rs; e R;« são independentemente grupo alquenila linear C13-17, Rs e Ró são preferencialmente um grupo alquenila linear C15-17, mais preferencialmente um grupo alquenila linear C17.
[00272] O composto acima, em que R; e R« são independentemente um grupo alquenila C17 linear.
[00273] O composto acima, em que R; e R« é um grupo heptadeca-
8,1 1-dienil.
[00274] Uma composição que compreende um lipídio catiônico, um lipídio ionizável e um lipídio do composto acima em uma nanopartícula lipídica compreendendo uma bicamada de moléculas lipídicas.
[00275] A composição acima, que compreende adicionalmente um ácido nucleico.
[00276] À composição acima, em que o ácido nucleico é siRNA, mMRNA ou microRNA.
[00277] À composição acima, em que a composição é uma composição farmacêutica. Definições químicas
[00278] O termo "alquila", como aqui utilizado, refere-se a um radical hidrocarbil de um grupo alifático saturado, que pode ter qualquer comprimento, a menos que seja especificado de outra forma. Um grupo alquila pode ser um grupo alifático ramificado ou não ramificado, substituído ou não substituído contendo de 1 a 22 átomos de carbono. Esta definição também se aplica à porção alquila de outros grupos, como, por exemplo, cicloalquila, alcoxi, alcanoil e aralquila, por exemplo.
[00279] Como usado aqui, por exemplo, um termo como "alquila C(1- 5)" inclui alquila C(1), alquila C(2), alquila C(3), alquila C(4), e alquila C(5). Da mesma forma, por exemplo, o termo "alquila C(3-22)" inclui alquila C(1), alquila C(2), alquila C(3), alquila C(4), alquila C(5), alquila C(6), alquila C(7), alquila C(8), alquila C(9), alquila C(10), alquila C(11), alquila C(12), alquila C(13), alquila C(14), alquila C(15), alquila C(16), alquila C(17), alquila C(18), alquila C(19), alquila C(20), alquila C(21), e alquila C(22).
[00280] Como aqui utilizado, um grupo alquila pode ser designado por um termo como Me (metila, -CH;3), Et (etila, -CH;CH;3), Pr (qualquer grupo propila), "Pr (n-Pr, n-propila), 'Pr (i-Pr, isopropila), Bu (qualquer grupo butila), "Bu (n-Bu, n-butila), "Bu (1-Bu, isobutila), *Bu (s-Bu, sec-butila), e 'Bu
(t-Bu, terc-butila).
[00281] O termo "alquenila", como aqui utilizado, refere-se a um radical hidrocarbil tendo pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono. Um grupo alquenila pode ser um radical hidrocarbil ramificado ou não ramificado, substituído ou não substituído, com 2 a 22 átomos de carbono e pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono. Um grupo "alquenila" possui uma ou mais ligações duplas carbono-carbono.
[00282] O termo "substituído", tal como aqui utilizado, refere-se a um átomo com uma ou mais substituições ou substituintes que podem ser iguais ou diferentes e podem incluir um substituinte de hidrogênio. Assim, os termos alquila, cicloalquila, alquenila, alcoxi, alcanoil e aril, por exemplo, referem-se a grupos que podem incluir variações substituídas. As variações substituídas incluem variações lineares, ramificadas e cíclicas, e grupos tendo um substituinte ou substituintes substituindo um ou mais hidrogênios afixados a qualquer átomo de carbono do grupo.
[00283] Em geral, um composto pode conter um ou mais centros quirais. Os compostos contendo um ou mais centros quirais podem incluir aqueles descritos como "isômero", "estereoisômero", "diastereômero", "enantiômero", "isômero óptico" ou "mistura racêmica". As convenções para a nomenclatura estereoquímica, por exemplo, as regras de nomeação de estereoisômeros de Cahn, Ingold e Prelog, bem como métodos para a determinação da estereoquímica e a separação de estereoisômeros são conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Michael B. Smith and Jerry March, March's Advanced Organic Chemistry, 5a Edição, 2001. Os compostos e estruturas desta descrição, incluindo desenhos químicos, devem abranger todos os possíveis isômeros, isômeros posicionais quimicamente razoáveis, estereoisômeros, diastereômeros, enantiômeros e/ou isômeros ópticos que seriam entendidos como existindo para o composto ou estrutura especificado, incluindo qualquer mistura racêmica ou não.
[00284] Esta invenção abrange todas e quaisquer formas tautoméricas, solvatadas ou não solvatadas, hidratadas ou não hidratadas, bem como quaisquer formas isotópicas de átomos dos compostos e composições aqui descritas.
[00285] Esta invenção abrange todos e quaisquer polimorfos cristalinos ou diferentes formas cristalinas dos compostos e composições aqui descritos.
[00286] Abreviações usadas: DMAP - 4-N ,N-dimetilaminopiridina DCM - Diclorometano TEA - Trietilamina EDC - Cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodi- imida Na7sSO, - Sulfato de sódio EtOAc - Acetato de etila DMF — N,N-Dimetilformida ELSD - Detector por espalhamento de luz evaporativo NaCl - Cloreto de sódio K3CO; - Carbonato de potássio MeOH — Metanol TFA - Ácido trifluoroacético DIEA — N N-di-isopropiletilamina PEG - polietileno glicol, também conhecido como óxido de polietileno MgSO,- Sulfato de magnésio LCMS - Cromatografia líquida - espectrometria de massa NaHCO; — Bicarbonato de sódio HO0- Água HCl - Cloridrato KI - Iodeto de potássio
DMSO - Dimetilsulfóxido TBAF- Fluoreto de tetra-n-butilamônio NaBH, — Boro-hidreto de sódio THF - Tetra-hidrofurano TBDMS- Terc-butildimetilsilil LiOH - Hidróxido de lítio Mel - Iodeto de metila BOC - Terc-butiloxicarbonil Fmoc — Fluorenilmetiloxicarbonil
EXEMPLOS
[00287] Exemplo 1: As moléculas fusogênicas desta invenção foram úteis para entregar um ou mais agentes biologicamente ativos nas células. Neste exemplo, mostrou-se que as moléculas fusogênicas desta invenção proveem entrega surpreendentemente ativa de um siRNA exemplificativo direcionado ao HSP47 para realizar o nocaute da expressão gênica. O siRNA exemplificativo foi entregue em uma formulação lipossômica contendo as moléculas fusogênicas. A presença das moléculas fusogênicas desta invenção na formulação de entrega surpreendentemente proveu alta atividade da formulação para nocaute da expressão gênica pelo siRNA exemplificativo.
[00288] A atividade in vitro para nocaute da expressão gênica usando um siRNA foi medida usando células estreladas de rato em meio DMEM de acordo com o seguinte protocolo: Um dia antes da transfecção, transfira as células para uma placa de 96 poços a 3 X 10º células por poço para células estreladas com 100 ul de meio contendo 10% de FBS e cultura em uma incubadora a 37ºC contendo uma atmosfera umidificada de 5% de CO; em ar. Antes da transfecção, troque o meio para 90 ul de meio sem antibióticos. Prepare as diluições apropriadas da solução coletada dos tubos em tampão PBS para que a adição de 10 ul em cada poço seja suficiente para atingir a concentração desejada. 48 horas após a transfecção, lave as células uma vez com PBS gelado. Lise as células com 50 mL de tampão de lise Cell-to-Ct por 5-30 minutos à temperatura ambiente. Adicione 5 mL de solução de paragem e incube durante 2 minutos à temperatura ambiente. Meça o nível de MBRNA por qPCR com TAQMAN imediatamente. Alternativamente, as amostras podem ser congeladas a -80ºC e analisadas posteriormente. Para o ensaio qgRT-PCR: Descongele todos os reagentes no gelo. Misture os reagentes agrupados em tubos de PCR de 0,2 ml. Distribua a mistura preparada em uma placa de 384 poços, 10 ul/poço x3. Sele a placa com filme, centrifugue a mistura para o fundo dos poços. Realize o ensaio qRT-PCR.
[00289] Neste exemplo, um siRNA de HSP47 foi usado para realizar o nocaute do gene HSP47. Para ensaios de expressão do gene TaqMan, foi utilizada a sonda TaqMan específica do gene HSP47.
[00290] Resultados experimentais para a atividade de silenciamento de genes in vitro em células estreladas de rato são mostrados nas Tabelas 3 e 4. Tabela 3: Atividade in vitro em células estreladas de ratos A to nM:
EE FILE
M [controle PBS) ro ko Be |Composto RE ash ho E [Composto S6 by ko b3 | IEomposto 7 kg by [Composto 8 ha ka ho | |eomposto PE bh kg ha | [Composto TE ka ho ka | |Eomposto PB RR (Composto PR ho ka | Tabela 4: Atividade in vitro em células estreladas de ratos Amostra jnM) Controle PBS) ——=—>—>—>deg eg 8 = composto TA bb ho kg | composto TS -=——————>—>——hbo h3 hi | Composto Tê -=—=—=—=—=—úúbo bb kk |
[00291] Estes dados mostram que uma formulação de siRNA contendo uma molécula fusogênica desta invenção foi surpreendentemente eficaz para prover um agente siRNA ativo nas células. Mostrou-se que as moléculas fusogênicas desta invenção proveem entrega surpreendentemente ativa para nocaute de expressão gênica de um siRNA exemplificativo direcionado ao HSP47.
[00292] Exemplo 2: Foi demonstrado que uma ampla gama de moléculas fusogênicas desta invenção é útil para a entrega de um agente ativo nas células. Neste exemplo, foi mostrado que uma gama de moléculas fusogênicas desta invenção provê entrega surpreendentemente ativa de um siRNA exemplificativo direcionado ao HSP47 para nocaute de expressão gênica. O siRNA exemplificativo foi entregue em uma formulação lipossômica contendo as moléculas fusogênicas.
[00293] A atividade in vitro para nocaute de expressão gênica medida em células estreladas usando um siRNA exemplificativo em uma formulação lipossômica contendo várias moléculas fusogênicas desta invenção é mostrada na Tabela 5. Tabela 5: % de expressão de HSP47 na célula estrelada lAmostra sSiRNA conc.
18 nM 75 nM 300 nM [Apenas célula pélula + PBS (Composto T11 (Composto T13 (Composto TI4 103,3
[00294] Como mostrado na tabela 5, a presença das moléculas fusogênicas desta invenção na formulação de entrega lipossômica surpreendentemente proveu alta atividade da formulação para nocaute da expressão gênica pelo siRNA exemplificativo.
[00295] Exemplo 3: As moléculas fusogênicas desta invenção foram surpreendentemente ativas para aumentar a atividade de entrega de um agente ativo nas células. A atividade de um agente entregue em uma formulação lipossômica contendo uma molécula fusogênica desta invenção foi grandemente aumentada em comparação com a atividade de uma formulação lipossômica que não continha uma molécula fusogênica desta invenção.
[00296] Neste exemplo, a atividade para nocaute de expressão gênica de um siRNA exemplificativo direcionado ao HSP47 foi surpreendentemente aumentada usando uma formulação de entrega lipossômica que incluía a presença do composto R4 desta invenção.
[00297] A formulação de entrega lipossômica foi preparada de acordo com o seguinte protocolo: HEDC (brometo de 2-(bisQ2- (tetradecanoiloxi)etil)Jamino)-N-(2-hidroxietil)-N N-dimetil-2-oxoetan- amínio) e S104 (((2-((2-(dimetilamino)etil)tio)acetil)azanodi-il)bis(etano-2,1- di-il)ditetradecanoato) foram solubilizados em EtOH absoluto (prova 200) a uma razão molar de 1:1. O siRNA de HSP47 foi solubilizado em tampão de citrato 50 mM e a temperatura foi ajustada para 35-40ºC. A mistura de etanol/lipídio foi então adicionada ao tampão contendo siRNA enquanto se agitava para formar espontaneamente lipossomas carregados com siRNA. Os lipídios foram combinados com siRNA para atingir uma razão final de lipídio total para siRNA de 5:1 a 15:1 (peso:peso). Os lipossomas carregados com siRNA foram diafiltrados contra 10 x volumes de PBS (pH 7,2) para remover o etanol e trocar o tampão. O produto final foi filtrado através de filtro PES de 0,22 um, grau esterilizante, para redução da carga biológica.
[00298] Neste exemplo, a atividade in vitro para nocaute de expressão gênica usando um siRNA exemplificativo em células estreladas de rato foi realizada da mesma maneira que o Exemplo 1. Os resultados são mostrados na Fig. 46. A formulação lipossômica compreendia HEDC de lipídio e S104, bem como o composto fusogênico.
[00299] Na Fig. 46, os resultados para uma formulação lipossômica composta por HEDC de lipídio e S104, que não continham o composto fusogênico são designados como (1). O nocaute da expressão do gene HSP47 para esta formulação de controle foi substancial apenas na concentração mais alta de 300 nm.
[00300] Na Fig. 46, os resultados para uma formulação lipossômica composta por HEDC de lipídio e S104, que continham o composto fusogênico R4 são designados como (2). A quantidade de composto fusogênico R4 nesta formulação foi de 2% dos lipídios totais. O nocaute da expressão do gene HSP47 para esta formulação aumentou muito e surpreendentemente em todas as concentrações de siRNA, em comparação com a formulação de controle que não continha o composto fusogênico R4. Assim, a presença do composto fusogênico R4 na formulação aumentou muito a atividade entregue do siRNA de exemplo, e o aumento da atividade foi diretamente atribuível à presença do composto fusogênico R4.
[00301] Na Fig. 46, os resultados para uma formulação lipossômica composta por HEDC de lipídio e S104, que continham o composto fusogênico R4 são designados como (3). A quantidade de composto fusogênico R4 nesta formulação foi de 10% dos lipídios totais. O nocaute da expressão do gene HSP47 para esta formulação aumentou muito e surpreendentemente em todas as concentrações de siRNA, em comparação com a formulação de controle que não continha o composto fusogênico R4. Assim, a presença do composto fusogênico R4 na formulação aumentou muito a atividade entregue do siRNA de exemplo, e o aumento da atividade foi diretamente atribuível à presença do composto fusogênico R4.
[00302] Como mostrado na Fig. 46, para formulações de entrega lipossômica compreendendo lipídios HEDC e S104, a atividade de nocaute de expressão gênica em células estreladas de um siRNA exemplificativo direcionado ao HSP47 foi surpreendentemente aumentada em formulações contendo de 2-10% (de lipídios totais) de composto fusogênico R4.
[00303] Exemplo 4: As moléculas fusogênicas desta invenção proveram uma atividade surpreendentemente aumentada de um agente ativo de ácido nucleico nas células. A atividade de um agente de ácido nucleico entregue em uma formulação lipossômica contendo uma molécula fusogênica desta invenção foi grandemente aumentada em comparação com a atividade de uma formulação lipossômica que não continha uma molécula fusogênica desta invenção.
[00304] Neste exemplo, a atividade in vitro para nocaute de expressão gênica usando um siRNA exemplificativo em células estreladas de rato foi realizada em uma maneira similar ao Exemplo 1. Os resultados são mostrados na Fig. 47. A formulação lipossômica compreendia HEDC de lipídio e S104, bem como o composto fusogênico.
[00305] Na Fig. 47, os resultados para uma formulação lipossômica composta por HEDC de lipídio e S104, que não continham o composto fusogênico dessa invenção são designados como (1). O nocaute da expressão do gene HSP47 para esta formulação de controle foi substancial apenas na concentração mais alta de 300 nm de siRNA.
[00306] Na Fig. 47, os resultados para uma formulação lipossômica composta por HEDC de lipídio e S104, que continham o composto fusogênico R4 são designados como (2). A quantidade de composto fusogênico R4 nesta formulação foi de 2% dos lipídios totais. O nocaute da expressão do gene HSP47 para esta formulação aumentou muito e surpreendentemente em todas as concentrações de siRNA, em comparação com a formulação de controle que não continha o composto fusogênico R4. Assim, a presença do composto fusogênico R4 na formulação aumentou muito a atividade entregue do siRNA de exemplo, e o aumento da atividade foi diretamente atribuível à presença do composto fusogênico R4.
[00307] Na Fig. 47, os resultados para uma formulação lipossômica composta por HEDC de lipídio e S 104, que continham o composto fusogênico T3 são designados como (3). A quantidade de composto fusogênico T3 nesta formulação foi de 2% dos lipídios totais. O nocaute da expressão do gene
HSP47 para esta formulação aumentou muito e surpreendentemente em todas as concentrações de siRNA, em comparação com a formulação de controle que não continha o composto fusogênico T3. Assim, a presença do composto fusogênico T3 na formulação aumentou muito a atividade entregue do siRNA de exemplo, e o aumento da atividade foi diretamente atribuível à presença do composto fusogênico T3.
[00308] Exemplo 5: As moléculas fusogênicas desta invenção foram ativas para entregar uma ou mais moléculas biologicamente ativas in vitro. Por exemplo, a atividade para nocaute de expressão gênica usando um siRNA (siPRA HSP47, ver Exemplo 1) foi surpreendentemente aumentada devido à presença de um composto fusogênico desta invenção em uma formulação de entrega lipossômica.
[00309] Neste exemplo, preparações de entrega lipossômica foram preparadas para compostos comparativos, bem como para o composto fusogênico R4. As formulações de entrega lipossômica foram preparadas da mesma maneira que a do Exemplo 1, com as composições mostradas na Tabela 6 (CH refere-se a colesterol). Tabela 6: Formulações lipossômicas fusogênicas PN Formulação |Descr. Tipo "one. de siRNA final o e ' P' IlnM) ll — [HEDC:SIO4:DOPE:CH:DMPE-PEG A granel [Controle — — Pooo |? — HEDC;SI04:DOPE:CH:DMPE-PEG:R1] A granel — Jexperimentaáà— ooo B —— [HEDC;SIO4:DOPE:CH:DMPE-PEG:R2]A granel lexperimentaáà— ooo lá — [HEDC;SI04:DOPE:CH:DMPE-PEG:R3|A granel — Jexperimentalà — ooo EDC:S104:DOPE:CH:DMPE-PEG:R4JA granel — experimental —booo >) ló — [HEDC;SI04:DOPE:CH:DMPE-PEG:R5/A granel fexperimentaaàr — [2000 EDC:S104:DOPE:CH:DMPE-PEG:S1 |A granel — lexperimentaià— [2000 8 — HEDC;SI04:DOPE:CH:DMPE-PEG:S2 |A granel — experimental — [2000 bP — |HEDC'SI04:DOPE:CH:DMPE-PEG:S3|A granel —fexperimental = pooo ===>>> | [10 — [HEDC;S104:DOPE:CH:DMPE-PEG:S4]|A granel — fexperimentalá— [2000
[00310] Como mostrado na Fig. 24, para as formulações de entrega lipossômica da Tabela 6, a atividade para nocaute de expressão gênica em células estreladas de um siRNA exemplificativo direcionado ao HSP47 foi surpreendentemente aumentada em formulações contendo 2% (de lipídios totais) de um composto fusogênico R4 desta invenção, em comparação com a
84 / 94 formulação de controle que não continha um composto fusogênico desta invenção. A estrutura do composto fusogênico R4 desta invenção proveu uma atividade de entrega surpreendente para nocaute da expressão gênica em células estreladas de um siRNA exemplificativo.
[00311] Exemplo 6: As moléculas lipídicas fusogênicas desta invenção foram ativas para entregar uma ou mais moléculas biologicamente ativas in Célula. Neste exemplo, as formulações de entrega lipossômica contendo um siRNA exemplificativo (HSP47 siRNA, consulte o Exemplo 1), bem como um composto fusogênico desta invenção, proveram atividade para realizar nocaute da expressão gênica. Neste exemplo, como mostrado na Tabela 7, preparações de entrega lipossômica do siRNA foram preparadas contendo vários compostos T3 a T9 (nº 1 a nº 7), cada um contendo 2% (de lipídios totais) de um composto fusogênico desta invenção. As formulações de entrega lipossômica foram preparadas da mesma maneira que a do Exemplo 1. Tabela 7: Formulações lipossômicas fusogênicas |é — |HEDC:SIO4DOPE-CHDMPEPEGTO |
[00312] Como mostrado na Fig. 25, nesta medição da atividade de formulações de entrega lipossômica de siRNA da Tabela 7, as formulações proveram alta atividade para nocaute da expressão de genes em células estreladas. Assim, formulações contendo 2% (de lipídios totais) de um composto fusogênico desta invenção proveram alta atividade do siRNA direcionado a HSP47.
[00313] Exemplo 7: Atividade in vivo para formulações fusogênicas. As moléculas fusogênicas desta invenção foram úteis para entregar um ou agente ativos in vivo. Por exemplo, as formulações de entrega lipossômica para nocaute de expressão gênica usando um siRNA exemplificativo direcionado ao HSP47 estavam ativas devido à presença de um composto fusogênico desta invenção.
[00314] Como mostrado na Fig. 26, as formulações de entrega lipossômica mostraram atividade para nocaute da expressão gênica in vivo (camundongos), usando um siRNA direcionado ao HSP47. As formulações continham 2% (de lipídios totais) do composto fusogênico designado desta invenção. As formulações foram entregues por bolus de infusão. Os parâmetros para a entrega são mostradas na Tabela 8. Tabela 8: Formulações lipossômicas fusogênicas in vivo Nº da laçã Dose onc.
brapo — Formulação jose ng/ma) Meo ge salina de carreador 10 mpk no & | lo-2 Nº2 — [HEDC;SIO4:DOPE:CH:DMPE-PEG:T4/- 0,5 mg/kg Nº 3 — [HEDC:;SI04:DOPE:CH:DMPE-PEG:TSº 0,5 mg/kg Nº4 — [HEDC;SIO4:DOPE:CH:DMPE-PEG:T6 É [0,5 mg/kg Nº 5 — [HEDC;SI04:DOPE:CH:DMPE-PEG:T7 = |o,5 mg/kg Nº 6 — [HEDC:;SI04:DOPE:CH:DMPE-PEG:T8 Nº 7 — [HEDC;S104:DOPE:CH:DMPE-PEG:T9 Nº 8 — [HEDC:;S104:DOPE:CH:DMPE-PEG:T3 INº9 — [Solução salina simulada E
[00315] Um exemplo de um protocolo para esses resultados é o seguinte.
1.1. Animais
[00316] Oitenta ratos Sprague-Dawley machos com —49 dias de idade foram adquiridos dos Laboratórios Charles River e entregues nas instalações de teste. O peso médio dos animais após a recepção foi de cerca de 200-210 gramas. Os animais foram alojados em sistemas de gaiola padrão com 2 animais por gaiola sob um ciclo de claro/escuro alternado de 12 horas À temperatura ambiente foi mantida a 64-79ºF (18-26ºC) e a umidade a 30- 70%, com pelo menos 10 trocas de ar por hora usando 100% de ar fresco sem recirculação. Os animais foram providos com uma ração fresca para roedores padrão certificada irradiada e com água da torneira à vontade.
[00317] Setenta e dois animais foram submetidos ao tratamento com DMN dos dias 0-5 e depois divididos aleatoriamente em 9 grupos, 8 ratos por grupo, com base no peso corporal, de modo que não houve diferença significativa no peso corporal entre os grupos anteriores ao tratamento com siRNA. Isso foi confirmado usando uma análise ANOVA unidirecional. Como esperado, esses animais tratados com DMN mostraram um peso corporal significativamente menor do que os animais sem tratamento
1.2. Tratamento com DMN
[00318] O DMN foi obtido da Wako (número de lote DSP2369) e formulado para injeção intraperitoneal (IP) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) dissolvendo o composto a 5 mg/mL. Setenta e dois dos ratos foram administrados diariamente com DMN a 10 mg/kg em um volume de dose de 2 mL/Kkg do dia O ao dia 2 e, em seguida, 5 mg/kg em um volume de dose de 1 mL/kg do Dia 3 a Dia 5; oito animais, não tratados com DMN, foram utilizados como simulações para esse procedimento. Os animais foram pesados diariamente e a dose de DMN foi ajustada de acordo.
1.3 Tratamento com siRNA
[00319] No Dia experimental 5, os animais foram designados para diferentes grupos de tratamento e dosados com um regime de dosagem apropriado. Os artigos de teste foram utilizados para os Grupos de tratamento 2a8(nº1anº38), respectivamente; enquanto os animais do grupo 1 (nº 1) receberam apenas carreador (solução salina) a 3 mI/kg por injeção intravenosa única na veia lateral da cauda. Os animais no Grupo 9 (grupo sem tratamento, nº 9) não receberam tratamento.
1.4. Eutanásia e Necropsia
[00320] No Dia experimental 6, 24 horas após o tratamento, os animais foram sacrificados por inalação de overdose de dióxido de carbono. O fígado foi imediatamente lavado com PBS, pH 7,4 (40 mL a uma taxa de 20 mL/min) através da veia porta hepática para remover o sangue residual e a formulação associada ao sangue. Uma seção transversal hepática de 2 mm de espessura foi coletada do lobo lateral esquerdo e imediatamente submersa em
2 mL de RNAlater em um tubo de microcentrífuga. As amostras foram armazenadas a 4ºC até processamento adicional para isolamento de RNA.
1.6. Análise de RNA:
[00321] A abundância de MRNA de HSP47 nas amostras de fígado foi avaliada. O RNA total foi extraído usando as colunas RNeasy (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de RNA para cada amostra foi quantificada usando um espectrofotômetro Nanodrop e depois diluída para 10 ng/ul usando água livre de nuclease. Para cada reação de PCR, foram utilizados 20 ng de RNA total. Em resumo, o RNA total de uma seção do lobo esquerdo do tecido hepático será extraído usando as colunas RNeasy (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. Um espectrofotômetro Nanodrop foi utilizado para quantificação de RNA. O RNA foi ajustado para ng/mL com água livre de nuclease. A PCR em tempo real foi realizada no sistema ViiA7 em um formato de 96 poços. Cada amostra foi medida em triplicata usando o TaqMan Gene Expression Master Mix. O programa de ciclos foi definido como 48ºC por 15 min, 95ºC por 10 min, seguido por 40 ciclos a 95ºC por 15 s e 60ºC por 1 min. O valor médio do limite do ciclo para o gene de manutenção MRPI19 foi utilizado para normalizar os dados brutos do limite do ciclo e o cálculo do ACt. O AACt para cada gene de interesse (GOI) foi calculado deduzindo o ACt médio de GOI na amostra de controle do ACt de cada GOI nas amostras alvo. Os dados para cada animal foram expressos como porcentagem do grupo médio tratado com carreador e como modulação do grupo sem tratamento. As diferenças entre os grupos de tratamento com siRNA e o grupo tratado com carreador foram analisadas usando ANOVA unidirecional, seguida pelo teste post-hoc de comparações múltiplas de Dunnett. Para todas as análises, um valor de p menor que 0,05 foi considerado significativo.
[00322] Exemplo 8: Preparação de nanopartícula de mRNA. Lipídios catiônicos, como HEDC ou HE2DC (brometo de 2-(bis(2-
(palmitoiloxi)etil)Jamino)-N) N-bis(2-hidroxietil)-N-metil-2-oxoetan-1- amínio), lipídios ionizáveis como S104 ou TUI104 Dlin (bis(octadeca-9,12- dienoato) de (97,9'Z7,12Z,12'Z)-((2-((2-(dimetilamino)etil)tio)acetil)azanodi- il)bis(etano-2,1-di-11)) e colesterol lipídico auxiliar, DOPE foram dissolvidos em etanol. O mRNA foi dissolvido em tampão de citrato 50 mM (pH 3,5). Nanopartículas lipídicas (LNPs) foram preparadas injetando uma quantidade apropriada de uma solução etanólica dos lipídios no tampão de Citrato contendo o mRNA, com uma vazão de 25 mL/min a 37ºC. A razão percentual molar para a composição do LNP foi 20% HEDC, 20% S104, 30% DOPE (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina) (lipídio polar Avanti), 25% de colesterol (grau Puriss) (Wilshire Technologies), 5% de DMPE-Peg (1,2- dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenoglico])-2000] (sal de amônio) e 2% da molécula fusogênica desta invenção, por exemplo Composto T3.
[00323] A injeção em alta velocidade produziu uma alta encapsulação de mRNA, bem como uma distribuição controlada do tamanho das partículas. A solução mista de LNPs foi então diluída com tampão HEPES 20 mM em sacarose a 9% (p/v) na razão de 1:1, o que reduziu o teor de etanol na solução de LNP de 35% para 17,5%. A solução diluída de LNP foi transferida para o processo de filtração de fluxo tangencial (TFF) para ultrafiltração e diafiltração com tampão HEPES 20 mM em sacarose a 9% (p/v). Para remover o etanol da solução de LNPs, foi utilizado um total de 10 volumes de diafiltração de tampão HEPES em sacarose a 9%. A solução concentrada de LNP do TFF foi dividida em alíquotas em frascos de filtro centrífugo (EMD Millipore) para maior concentração; no entanto, essa etapa foi necessária apenas para um lote de pequena escala. Após concentração final, os LNPs foram filtrados através de filtros de 0,2 um. A eficiência da encapsulação e o rendimento de mRNA foram calculados usando o método RiboGreen.
[00324] Exemplo 9: Entrega por transfecção de mRNA para células in vitro. A transfecção de células in vitro com mRNA foi realizada em três linhas celulares diferentes: Hek-293, AS549 e fibroblasto pulmonar. JET MESSENGER (Polyplus Transfection Company) foi usado como controle positivo de transfecção. O mRNA de GFP (TriLink) que foi encapsulado nas nanopartículas de LNP desta invenção, ou misturado com o JET MESSENGER Control, foi utilizado para transfectar as células em diferentes concentrações. Após 24, 48 e 72 horas de transfecção, as células foram vistas sob um microscópio confocal e a fluorescência gerada a partir da GFP expressa nas células foi então detectada e capturada. O mBRNA de GFP foi bem transfectado em todas as três linhas celulares com as nanopartículas de LNP desta invenção, e o MRNA foi traduzido.
[00325] Exemplo 10: Entrega por transfecção de mRNA para células in vivo. O MRNA foi transfectado em tecidos e células in vivo com as nanopartículas de LNP desta invenção. Dois MRNA diferentes com tamanhos diferentes, NRNA de GFP e mRNA de luciferase (TriLink) foram entregues e transfectados em camundongos Balb/c. Em alguns estudos de entrega de mMRNA da luciferase, o MRNA também foi entregue usando um reagente de transfecção de mRNA Viromer in vivo como controle positivo. Os animais receberam por via intravenosa uma injeção única com o mMRNA encapsulado nas nanopartículas de LNP desta invenção, ou nas partículas de controle positivo na dose de 1,0, 2,0 ou 4,0 mg/kg. Os ratos foram anestesiados 6-8 horas após a injeção de mRNA, e a fluorescência de corpo inteiro para estudos de entrega de mRNA de luciferase foi detectada e analisada com um sistema IVIS. Os animais foram então sacrificados imediatamente, e diferentes órgãos foram colhidos e salvos sob -80ºC até análise posterior. À entrega do mMRNA a vários tecidos e células foi determinada com um kit MAXDISCOVER GFP ELISA para analisar o nível de proteína GFP nos tecidos a partir dos estudos de entrega de GFP mRNA. Para estudos de entrega de mRNA da luciferase, os tecidos foram homogeneizados em tampão de lise CCLR e centrifugados. Os sobrenadantes resultantes foram utilizados para o ensaio da atividade da luciferase usando reagentes do ensaio Promega FA4510. Surpreendentemente, o MRNA de GFP e o mRNA de luciferase foram predominantemente transfectados e/ou traduzidos no pulmão e baço com uma transfecção e/ou tradução muito menor em outros tecidos.
[00326] Exemplo 11: Entrega por transfecção de mRNA para células in vitro. De acordo com um método descrito nos Exemplos 9 e 10 acima, o MRNA de GFP (mRNA CleanCap EGFP, 5 moU) foi transfectado para células AS49 in vitro com as nanopartículas de LNP desta invenção com a composição HEDC:S104:CH:DOPE:DMPE-PEG2000:Composto T3. Os resultados após 48 horas de transfecção são mostrados na Fig. 48. As células foram vistas sob um microscópio confocal e a fluorescência gerada a partir da GFP expressa nas células foi detectada. Os resultados mostraram que o MRNA de GFP foi transfectado e traduzido em células AS49.
[00327] Exemplo 12: Entrega por transfecção de mRNA para células in vivo. De acordo com um método descrito nos Exemplos 9 e 10 acima, o MRNA de GFP (mMRNA CleanCap EGFP, 5 moU) foi transfectado para camundongos Balb/c in vitro com as nanopartículas de LNP desta invenção com a composição HEDC:S104:CH: DOPE: DMPE- PEG2000:Composto T3, conforme mostrado na Tabela 9: Tabela 9: Transfecção in vivo em camundongos Balb/c Coleta de tecidos (másculo, fígado, coração, pulmão e rim)
ELISA
[00328] Como mostrado na Fig. 49, a entrega do mRNA a vários tecidos e células foi determinada com um MAXDISCOVER GFP ELISA. Surpreendentemente, o MRNA da GFP foi seletivamente transfectado e/ou traduzido no pulmão, com menor transfecção e/ou tradução no músculo,
fígado, coração e rim.
[00329] Exemplo 13: Entrega por transfecção de mRNA para células in vivo. De acordo com um método descrito nos Exemplos 9 e 10 acima, o MRNA de luciferase (Fluc MRNA (5meC)) foi transfectado para camundongos Balb/c in vitro com as nanopartículas de LNP desta invenção com a composição HEDC:S104:CH:DOPE:DMPE-PEG2000:Composto T3, conforme mostrado na Tabela 10: Tabela 10: Transfecção in vivo em camundongos Balb/c po RB pj Imagiologia de IVIS
E
[00330] Como mostrado na Fig. 50, a entrega relativa, transfecção e/ou tradução do MRNA em vários tecidos e células foi determinada com um kit de ensaio Promega E4510. Surpreendentemente, o MRNA de Fluc foi entregue, transfectado e/ou traduzido seletivamente no pulmão e no baço, com entrega, transfecção e/ou tradução mais baixas no fígado, coração, rim e músculo.
[00331] Exemplo 14: Entrega por transfecção de mRNA para células in vivo. De acordo com um método descrito nos Exemplos 9 e 10 acima, o MRNA de luciferase (Fluc MRNA (5meC)) foi transfectado para camundongos Balb/c in vitro com as nanopartículas de LNP desta invenção com a composição: (-O01) — HE2DC:S104:CH: DOPE: DMPE-PEG2000:Compound T3, ou (-02) HEDC:S104:CH: DOPE: DMPE-PEG2000:Compound T3, injetado a 2 mpk, com imagem de luminescência 7 horas após a injeção.
[00332] Como mostrado na Fig. 51, a entrega relativa, transfecção e/ou tradução do mMRNA em vários tecidos e células foi determinada com um de ensaio Promega F4510. Surpreendentemente, o MRNA de Fluc foi entregue, transfectado e/ou traduzido seletivamente no pulmão e no baço, com entrega, transfecção e/ou tradução mais baixas no pâncreas, rim, fígado, testículo e intestino delgado.
[00333] Como mostrado na Fig. 52, a entrega relativa, transfecção e/ou tradução do mMRNA em vários tecidos e células foi determinada com imagens de luminescência 7 horas após a injeção. Na Fig. 52, um conjunto de fotografias na linha superior indica camundongos Balb/c transfectados com as nanopartículas de LNP do (-01). Um conjunto de fotografias na linha inferior indica camundongos Balb/c transfectados com as nanopartículas de LNP do (- 02).
[00334] Exemplo 15: Entrega de mRNA para células in vivo com compostos fusogênicos. Os compostos fusogênicos desta invenção aumentam muito a entrega de agentes ativos às células, órgãos e tecidos in vivo.
[00335] Neste exemplo, as formulações para entrega de um mRNA in vivo foram preparadas com um composto fusogênico T3 e comparadas com a mesma formulação sem o composto fusogênico, como mostrado na Tabela 11. Tabela 11: Formulações de entrega em camundongos in vivo a união Bop E IHEDC:S104:DOPE:CH:DMPE-PEG2K:Composto T3 035-03-03 — (20:20:30:25:5:5) Bl 10 pena fai O pe do | bo35-13-01º— (20:20:30:25:5) B3 0,148
[00336] A Fig. 53 mostra resultados para a entrega de mRNA de Luciferase in vivo em camundongos usando moléculas fusogênicas do tipo lipídio desta invenção. Como mostrado na Fig. 53, a entrega relativa de mRNA foi muito maior em formulações contendo a molécula fusogênica desta invenção (2035-03-03) do que na mesma formulação sem a molécula fusogênica (2035-13-01). Em todos os órgãos observados, incluindo pâncreas, baço, fígado, rim, pulmão, testículo e intestino, a entrega foi vantajosa e surpreendentemente maior para a formulação que contém o composto fusogênico T3.
[00337] As modalidades descritas aqui não são limitativas e um versado na técnica pode apreciar prontamente que combinações específicas das modificações aqui descritas podem ser testadas sem experimentação indevida na identificação de moléculas de ácido nucleico com atividade de RNAi melhorada.
[00338] Todas as publicações, patentes e literatura especificamente mencionadas aqui são incorporadas por referência na íntegra para todos os fins.
[00339] Entende-se que esta invenção não está limitada à metodologia, protocolos, materiais e reagentes específicos descritos, pois estes podem variar. Deve ser também entendido que a terminologia aqui utilizada é com a finalidade de descrever apenas modalidades particulares e não se destina a limitar o escopo da presente invenção. Será prontamente aparente para um versado na técnica que várias substituições e modificações podem ser feitas na descrição descrita aqui sem se afastar do escopo e espírito da descrição, e que essas modalidades estão dentro do escopo desta descrição e das reivindicações anexas.
[00340] Deve-se notar que, conforme usado aqui e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um, uma", e "o/a" incluem referência plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Como tal, os termos "um/uma" (ou "uns/umas"), "um ou mais" e "pelo menos um" podem ser usados indistintamente aqui. É também de notar que os termos "compreende", "compreendendo", "contendo", "incluindo" e "tendo" podem ser usados de forma intercambiável e devem ser lidos de forma expansiva e sem limitação.
[00341] A recitação de intervalos de valores aqui visa meramente servir como um método abreviado de se referir individualmente a cada valor separado dentro do intervalo, a menos que indicado de outra forma aqui, e cada valor separado é incorporado ao relatório descritivo como se fosse aqui recitado individualmente. Para os grupos Markush, os versados na técnica reconhecerão que esta descrição inclui os membros individuais, bem como subgrupos dos membros do grupo Markush.
[00342] Um composto, molécula ou composição desta invenção pode ter uma forma iônica para a qual o contrafon ou contrafons correspondentes não são mostrados. Uma pessoa versada na técnica entenderá imediatamente que o contrafon ou os contrafons existirão conforme necessário. Exemplos de contraíons incluem íons de metais alcalinos, Cl e contrafons farmaceuticamente aceitáveis.
[00343] Por exemplo, quando é fornecida uma lista de exemplos ou componentes, como uma lista de compostos, moléculas ou composições adequadas para esta invenção, será evidente para os versados na técnica que as misturas dos compostos, moléculas ou composições listadas também podem ser adequadas.
[00344] Sem uma maior elaboração, acredita-se que um versado na técnica pode, com base na descrição anterior, utilizar a presente invenção até o seu máximo. As modalidades específicas a seguir são, portanto, interpretadas como meramente ilustrativas e não limitativas do restante da descrição de qualquer maneira.
[00345] Todas as características descritas neste relatório descritivo podem ser combinadas em qualquer combinação. Cada característica descrita neste relatório descritivo pode ser substituída por uma característica alternativa que serve ao mesmo objetivo, equivalente ou similar.
[00346] Os desenhos nas reivindicações anexas são ajustados para caber na página, e a aparência das moléculas nos desenhos não reflete necessariamente nenhum formato ou propriedades significativas do composto representado.

Claims (52)

REIVINDICAÇÕES
1. Composto fusogênico com Fórmula I anfifílico | Z anfifílico AA — ligante — AA anfifílico Nanfifíilico górmulal caracterizado pelo fato de que cada anfifílico compreende independentemente uma a duas cadeias lipofílicas, em que as cadeias lipofílicas compreendem cada uma independentemente 8 a 22 átomos de carbono; em que cada AA é independentemente um aminoácido compreendendo uma cadeia lateral com um grupo amino, em que o aminoácido é afixado a um anfifílico em cada um de seus grupos amino e é afixado ao ligante em seu terminal C; em que o ligante tem a estrutura —NH feria) (ocrzcH2) fon.) -NH— ou —NHQ!NH(C=0)CHzCH2 f OCHÇCH2)(C=0)NHQ'NH — m em que Q' é alcanodiil C(2-8) ramificado ou não ramificado, alquenodiil C(2-8) ramificado ou não ramificado, alquinodiil C(2-8) ramificado ou não ramificado, ou * —(CH2)o-8 AIR
FÃ * —(CH2)o.g VV — Sur (CHa)3—*
DA ou
Q2 (CH) X(C=0)CH;CH2 fLOCHZCH2)-(C=0)X(CH2),-Qº m em que Qº é —NH 1CH OCH/CH f ai 2 + em que Qº é AfocH2eH Hera kn —- r Pp em que X é —O-, -S- ou -NH-; n, p, q e t são independentemente para cada ocorrência 1 a 3; m é independentemente 1 a 10; res são independentes para cada ocorrência 1 a 5.
2. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que AA é selecionado a partir das seguintes estruturas, e qualquer estereoisômero do mesmo: * * * * * o o o o n.º NH NH—* NH—* NH NH—*
NH HNº NH *
PÁ
N NH * x * * * * Oo Oo O O NH—* NH—* NH—* NH—*
Ç
H HN HN A NH Vá
N HN A, C A * NA HN / NH KH < * NH * NH
* * * * o Oo Oo (e NH—* NH—* NH—* NH—* — = Oo 7 Ná Nos N—+ O HN
RE NH X /
3. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um ou dois dos anfifílicos estão ausentes e são substituídos por um grupo alquila ou um grupo químico orgânico farmaceuticamente aceitável com 1-400 átomos selecionados a partir de carbono, oxigênio, nitrogênio, enxofre, flúor e hidrogênio.
4. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o grupo químico orgânico farmaceuticamente aceitável é alquila, alquenila, alquinila, acetil, Boc, Fmoc, TFA ou CBZ.
5. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o composto é selecionado dentre os seguintes: o O. R O. Composto T13 Y VT OTA =
S Ç O NH >
NJ O " | oo Y ANO é o o Pá
FA HN o Í o RO Í 1 i PP >
ZH > f > Pá rá F L” Pi
SS
Composto T14
NX
XY
RW
SNS o o ox ) NH
NE o o o
QNH o no ANA EA A, = o o PD) Ro A No Ao) a SS Oo o NH T :
6. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos anfifílicos têm a estrutura mostrada na Fórmula II o R' 7 o DAN PAR R? AA * Fórmula II em que R' e R? são R' = CHX(CH:),O(C=O)Rº, CHX(CH>).NH(C=O)R?, CHXCH).(C=0)OR!, CH(CHo))(C=O)NHR*? R2? = CH(CHo).O(C=O)R5, CHX(CHo)NH(C=O)RS, CHXCHo)n(C=0) OR, CH(CHo)n(C=O)NHR” em que n e m são cada um independentemente de 1 a 2; e Rê e R são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila C(12-20) ou um grupo alquenila C(12-20);
em que R? é selecionado a partir de alcanodiil C(1-8) ramificado ou não ramificado, alquenodiil C(2-8) substituído ou não substituído, alquinodiil C(2-8) substituído ou não substituído, cicloalcanodiil C(3-8) substituído ou não substituído, arileno substituído ou não substituído, heteroarileno C(4-8) substituído ou não substituído e heterocicloalcanodiil substituído ou não substituído; em que Rô? é opcionalmente interrompido por um ou mais de —O-, -S-, -SO-, -SO>-, -NH-, -NRº-, -NH(C=0O)-, -O(C=0O)-, em que Rº é alquila C(1-6)-, alcoxi C(1-6)-, ou alcoxi C(1-6)-alcoxi C(1-6)-.
7. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que R? é selecionado a partir de alcanodiil C(2-8) ramificado ou não ramificado, alquenodiil C(2-8) substituído ou não substituído, alquinodiil C(2-8) substituído ou não substituído, cicloalcanodiil C(3-8) substituído ou não substituído, heteroarileno C(4-8) substituído ou não substituído o * —(CH2)o-3 A LIMias o
ÃÕ * —(CH23)o.g VV — vuvur(CHa)oa—*
DA
8. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos anfifílicos têm a estrutura mostrada na Fórmula III
DA Rº e Fórmula III em que R' e R? são R' = CHCH),O(C=O)R?, CHXCH>),NH(C=O)R,
CHXCHo))(C=0) OR, CH(CH))(C=O)NHRº?
R?º = CHXCH>)nO(C=O)R5, CH(CH>)NH(C=O)RS5,
CHXCHo)Ia(C=0)OR', CHX(CHo).-(C=O)NHR$ em que n e m são cada um independentemente de 1 a 2; e Rê e R$” são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila C(12-20) ou um grupo alquenila C(12-20);
em que R é selecionado a partir de
-alquila-(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquila-O(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquila-NH(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquila-(C=0O)-alquila-(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquila-O(C=0O)-alquila-(C=0O)-, que está afixado a AA
-alquila-NH(C=0O)-alquila-(C=O)-, que está afixado a AA
-alquenila-(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquenila-O(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquenila-NH(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquenila-(C=0O)-alquenila-(C=O)-, que está afixado a AA;
-alquenila-O(C=0O)-alquenila-(C=O)-, que está afixado a AA
-alquenila-NH(C=0O)-alquenila-(C=O)-, que está afixado a AA
-alquinila-(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquinila-O(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquinila-NH(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquinila-(C=0O)-alquinila-(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquinila-O(C=0O)-alquinila-(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquinila-NH(C=0O)-alquinila-(C=0O)-, que está afixado a AA;
em que qualquer alquila de R? é alquila C(1-6) ramificada ou não ramificada, qualquer alquenila de R? é alquenila C(2-6) ramificada ou não ramificada e qualquer alquinila de R? é alquinila C(2-6) ramificada ou não ramificada;
O — R6 R6 =[— N—* N—*
TXT Rô Rô Rº O — R$ R$ O «O R6 e seus isômeros posicionais; Rê ú * 2 nº q AA * 03 0-2 O IUVUr(CH2)1-2 —* AA * 0-3 e | O SAUVr(CH2).2 —*
W em que cada Ró é selecionado independentemente dentre H, alquila, alcoxi e alcoxialcoxi, com a condição de que um Ró seja -(C=0O)- ou -alquila- (C=0O)- que está afixado a AA; cada Rº é selecionado independentemente de H, alquila, com a condição de que um Rº seja -(C=O)- ou -alquila-(C=O)- que está afixado a AA; q é de zero a quatro; QéOouN.
9. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que alquila de Rº e Rº são cada um alquila C(1-6) independentemente ramificada ou não ramificada, alcoxi de Rº é alcoxi C(1- 6) e alcoxialcoxi de Rº é alcoxi C(1-6)alcoxi C(1-6).
10. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que R* e Ró são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila (14-18) ou um grupo alquenila C(14-18).
11. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o composto é selecionado dentre os seguintes:
Composto R4 x
N X y No A e Da o DS R é o a VC º DD We o.
FO EA H Nº o A. o bs xX "A,
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DOIDO A o o A HA o No o) Tee ço SS ' o o o O; de
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12. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos anfifílicos têm a estrutura mostrada na Fórmula III
IX Rº “x Fórmula TI em que R' e R? são R' = CHXCH>)/O(C=O)Rº, CH(CH2) NH(C=O)R, CHXCH))(C=0)ORÍ, CHX(CH2).(C=O)NHR*? Rº = CHCHo)nO(C=O)R”, CHCHo)nNH(C=O)RS, CHXCHo)1n(C=0)ORS, CHCH>)n(C=O)NHRº em que n e m são cada um independentemente de | a 2; R? e R são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila C(12-20) ou um grupo alquenila C(12-20); Ri é um grupo alquila C(1-12) ou um grupo alquenila C(4-12) que é substituído com um -(C=0O)- ou -alquila-(C=O)- que está afixado a AA.
13. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que Rº e Ró são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila (14-18) ou um grupo alquenila C(14-18).
14. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos anfifílicos têm a estrutura mostrada na Fórmula IV O N — R' nº? ON Fórmula IV em que R' e R? são R' = (C=0) OR, (C=O)NHR$, O(C=O)RÍ, (C=O)R* R? = (C=0)ORS, (C=O)NHRS, O(C=O)R5, NH(C=O)R* em que Rº e Ró são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila C(12-20) ou um grupo alquenila C(12-20);
Zé O ou NH; pélad; em que R3 é selecionado a partir de alcanodiil C(1-8)-(C=0O)- ramificado ou não ramificado que está afixado a AA, alquenodiil C(2-8)- (C=0O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA, alquinodiil C(2- 8)-(C=O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA, cicloalcanodiil C(3-8)-(C=O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA, arileno-(C=O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA, heteroarileno C(4-8)-(C=0O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA e heterocicloalcanodiil-(C=O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA; em que R? é opcionalmente interrompido por um ou mais de — O-, -S-, -SO-, -SO2-, -NH-, -NRº-, -NH(C=0O)-, -O(C=0O)-, em que Ró é alquila C(1-6)-, alcoxi C(1-6)-, ou alcoxi C(1-6)-alcoxi C(1-6)-.
15. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos anfifílicos têm a estrutura mostrada na Fórmula IV p 1 JÁ, no” R? Fórmula IV em que R' e R? são R' = (C=0) OR, (C=O)NHR$, O(C=O)RÍ, (C=O)R*º R? = (C=0)ORS, (C=O)NHRS, O(C=O)R*, NH(C=O)R* em que Rº e Rº são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila C(12-20) ou um grupo alquenila C(12-20); Zé O ou NH; pélad; em que R3 é selecionado a partir de grupo alquila C(1-12) ou grupo alquenila C(2-12) que é substituído com um -(C=O)- que está afixado a AA.
R$ O — Rº Rº =— N — N —
XT R$ R$ R$ " O — R86 R$ * — = <> — R6 e seus isômeros posicionais; R8 | N * “Mk R q em que cada Rº é selecionado independentemente dentre H, alquila, alcoxi e alcoxialcoxi, com a condição de que um Ró seja -(C=0O)- ou -alquila- (C=0O)- que está afixado a AA; cada R* é selecionado independentemente de H, alquila, com a condição de que um Rº seja -(C=0O)- ou -alquila-(C=0O)- que está afixado a AA; q é de zero a quatro; QéOouN.
16. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que Rº e Rº são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila (14-18) ou um grupo alquenila C(14-18).
17. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o composto é o composto T10: Composto T10
N | ÀV |
XY
SS XY
DS Oo À º o NS O N Z, NX o 4 QH O
AN Oo o à NH
DS a N Oo S o
O Z MW O º
N ANO o NOTA o o Z/R Oo o A
O N
O = =. ”
J
18. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 1,
caracterizado pelo fato de que um ou mais dos anfifílicos têm a estrutura mostrada na Fórmula IV o Rn p nO R? Fórmula IV em que R' e R? são R' é um grupo alquila C(12-20), ou um grupo alquenila C(12- 20); Rº é (CHo),XR$, em que né 0 a 3, XKÉ O, S, SO, SO», NH; em que Rº? é um grupo alquila C(12-20), ou um grupo alquenila C(12-20); em que Z é O ou NH; emque pé l a 4; em que Rô é selecionado a partir de grupo alquila C(1-12) ou grupo alquenila C(2-12) que é substituído com um -(C=0O)- que está afixado a AA.
19. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos anfifílicos têm a estrutura mostrada na Fórmula V R' De Fórmula V em que R' e R? são R' = (C=0) OR, (C=O)NHR$, O(C=O)Rº, NH(C=O)R* R? = (C=0)ORS, (C=O)NHRS, O(C=O)R5, NH(C=O)R* em que Rº? e Rº são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila C(12-20) ou um grupo alquenila C(12-20); em que R3 é selecionado a partir de -O(C=0O)-alcanodiil C(1- 8)-(C=0O)- ramificado ou não ramificado que está afixado a AA, -O(C=0O)-
alquenodiil C(2-8)-(C=O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA, -O(C=0O)-alquinodiil C(2-8)-(C=0O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA, -O(C=0O)-cicloalcanodiil C(3-8)-(C=O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA, -O(C=0O)-arileno-(C=0O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA, -O(C=0O)-heteroarileno C(4-8)- (C=0O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA e -O(C=0)- heterocicloalcanodiil-(C=O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA; em que R? é opcionalmente interrompido por um ou mais de —O-, -S-, - SO-, -SO7-, -NH-, -NRº-, -NH(C=0O)-, -O(C=0O)-, em que Rº é alquila C(1-6)-, alcoxi C(1-6)-, ou alcoxi C(1-6)-alcoxi C(1-6)-.
20. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que Rº e Ró são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila (14-18) ou um grupo alquenila C(14-18).
21. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o composto é o composto T12:
Composto T12 / fo) ) SA o A, o o Oo N XY Fo o S H S et ” X o o X Né
E Pr Y O N Oo o ú o Ada TONA o “Po
NH
O o Oo
SA
O NH
O
O
OZ
22. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos anfifílicos têm a estrutura mostrada na Fórmula V Ri Rº R? Fórmula V em que R' e R? são
R' = (C=0)OR?, (C=O)NHR$, O(C=O)Rº, NH(C=O)R*
R? = (C=0)ORS, (C=O)NHRS$, O(C=O)Ró, NH(C=O)R em que Rº e R* são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila C(12-20) ou um grupo alquenila C(12-20);
em que R? é selecionado a partir de
HC=0O)- ou -alquila-(C=O)-, que está afixado a AA;
—O(C=0O)- ou -alquila-O(C=0O)-, que está afixado a AA;
-O(C=0O)-alcanodiil-(C=0O)-, que está afixado a AA
-O(C=0O)-alquenodiil-(C=0O)-, que está afixado a AA
-O(C=0O)-alquinodiil-(C=0O)-, que está afixado a AA
—NH(C=0O)- ou -alquila-NH(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquila-(C=0O)-alquila-(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquila-O(C=0O)-alquila-(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquila-NH(C=0O)-alquila-(C=O)-, que está afixado a AA;
-alquenila-(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquenila-O(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquenila-NH(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquenila-(C=0O)-alquenodiil-(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquenila-O(C=0O)-alquenodiil-(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquenila-NH(C=0O)-alquenodiil-(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquinila-(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquinila-O(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquinila-NH(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquinila-(C=0O)-alquinodiil-(C=O)-, que está afixado a AA;
-alquinila-O(C=0O)-alquinodiil-(C=O)-, que está afixado a AA;
-alquinila-NH(C=0O)-alquinodiil-(C=O)-, que está afixado a
AA + Ç N (C=0) —* Que-está-afixado a-AA NV /
FAN < N(C=0)- alemodilt “(C=O) —* Que-está-afixado-a-AA / A NAC=0)- lemodit —(C=0) —* Que-está-afixado-a-AA * À Nc=0)- alcanodidt —(C=O)—* Que-está-afixado-a-AA " A XW alanoditt -(C=0)—* Que-está-afixado-a-AA NO Z/ * ( NY alcanodilt -O(C=0O)-* Que-está-afixado-a-AA * À N aleamodias NH(C=0)—* Que-está-afixado-a-AA
A (AN A N -aleanodils “O(C=O) -alcanodils (C=O)—* Que-está-afixado a AA N/ e seus isômeros posicionais; em que qualquer alquila de R? é alquila C(1-6) ramificada ou não ramificada, qualquer alquenila de Rô é alquenila C(2-6) ramificada ou não ramificada e qualquer alquinila de R? é alquinila C(2-6) ramificada ou não ramificada;
23. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos anfifílicos têm a estrutura mostrada na Fórmula VI
CL Rº R? Fórmula VI em que R' e R? são R' = (C=0) OR, (C=O)NHR$, O(C=O)Rº, NH(C=O)R*? R? = (C=0) OR, (C=O)NHRS, O(C=O)R5, NH(C=O)R* em que Rº e Ró são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila C(12-20) ou um grupo alquenila C(12-20); em que Rô é selecionado a partir de alcanodiil C(1-8)-(C=0O)- ramificado ou não ramificado que está afixado a AA, alquenodiil C(2-8)- (C=0O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA, alquinodiil C(2- 8)-(C=O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA, cicloalcanodiil C(3-8)-(C=0O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA, arileno-(C=O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA, heteroarileno C(4-8)-(C=0O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA e heterocicloalcanodiil-(C=O)- substituído ou não substituído que está afixado a AA; em que R? é opcionalmente interrompido por um ou mais de — O-, -S-, -SO-, -SO7-, -NH-, -NRó-, -NH(C=0O)-, -O(C=0O)-, em que Ré é alquila C(1-6)-, alcoxi C(1-6)-, ou alcoxi C(1-6)-alcoxi C(1-6)-.
24. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos anfifílicos têm a estrutura mostrada na Fórmula VI Rº LL. Fórmula VI em que R' e R? são R' = (C=0) OR, (C=O)NHR$, O(C=O)Rº, NH(C=O)R* R? = (C=0)ORS, (C=O)NHRS, O(C=O)R*, NH(C=O)R* em que Rº e Ró são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila C(12-20) ou um grupo alquenila C(12-20); Rô é selecionado a partir de -alquila-(C=O)-, que está afixado a AA; -alquila-O(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquila-NH(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquila-(C=0O)-alquila-(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquila-O(C=0O)-alquila-(C=0O)-, que está afixado a AA;
-alquila-NH(C=0O)-alquila-(C=O)-, que está afixado a AA; -alquenila-(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquenila-O(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquenila-NH(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquenila-(C=0O)-alquenila-(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquenila-O(C=0O)-alquenila-(C=O)-, que está afixado a AA; -alquenila-NH(C=0O)-alquenila-(C=O)-, que está afixado a
AA;
-alquinila-(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquinila-O(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquinila-NH(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquinila-(C=0O)-alquinila-(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquinila-O(C=0O)-alquinila-(C=0O)-, que está afixado a AA; -alquinila-NH(C=0O)-alquinila-(C=0O)-, que está afixado a AA;
* < N (C=O0) —* Que-está-afixado-a-AA
4 õ N(C=0)- aleansáioy -(C=0) —* Que-está-afixado a-AA
Ee N(C=0O)- aleanodilf (C=O) —* Que-está-afixado-a-AA
* É N—(C=O)- alanodilf (C=O) —* Que-está- afixado a AA
* CÊ N -aleanodiilf -(C=0) —* Que-está-afixado a AA
— N -aleanodiilf -O(C=0)-* Que-está-afixado a:AA
*—— N -aleanodilt —NH(C=O)—* Que-está-afixado-a-AA
*X N emodiis O(C=O) -aleançáits (C=O)—* Que-está-afixado-a-AA e seus isômeros posicionais;
em que qualquer alquila de R? é alquila C(1-6) ramificada ou não ramificada, qualquer alquenila de Rº é alquenila C(2-6) ramificada ou não ramificada e qualquer alquinila de R? é alquinila C(2-6) ramificada ou não ramificada;
25. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que Rº e Ró são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila (14-18) ou um grupo alquenila C(14-18).
26. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o composto é o composto T11.
Composto T11
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À ) | )) o 9 Yo do o N Oo o
À
N o o NH y Se o
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27. Composto fusogênico com Fórmula VII anfifílico anfifílico à Fã AA? —Tlinker — AA? a ar bá. O anfifílico anfifilico Fórmula VII caracterizado pelo fato de que cada anfifílio compreende independentemente uma a duas cadeias lipofílicas, em que as cadeias lipofílicas compreendem cada uma independentemente 8 a 22 átomos de carbono; em que cada AA* é independentemente um aminoácido compreendendo uma cadeia lateral com um grupo carboxila, em que o aminoácido é afixado a um anfifílico em cada um de seus grupos carboxila e é afixado ao ligante em seu terminal N; em que ligante tem a estrutura —(C=0) + CH CH2CH,O +TCH2 + (C=0) — t e 20H K k ou —(C=0)Q' (C=O)NH + CH2 + CH.CHÃO Ff CH2 FNH(C=0)Q'(C=0) — fere) Foneerzo) fere) em que Q' é alcanodiil C(2-8) ramificado ou não ramificado, alquenodiil C(2-8) ramificado ou não ramificado, alquinodil C(2-8) ramificado ou não ramificado, ou o * —(CH2)o-a Ira
QD *—(CHo8g Vw —vuuvr(CHa).3—*
AX ou —QXÁC=0)X —F CH CHaCH.O+fCH2+X(C=0)Q — fone) Ferieoneo) (et:), em que Qº é
—(C=0) Lene) focnaera)- em que Q? é AocrzeH2 Hon. )-(c-0) — r p em que X é —O-, -S- ou -NH-; n e p são independentemente para cada ocorrência | a 3; m é independentemente 1 a 10; res são independentes para cada ocorrência 1 a 5.
28. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que AA* é selecionado a partir das seguintes estruturas, e qualquer estereoisômero do mesmo: * * * * * o o o o o NH=* NH—* NH—* NH—* NH—* * * fe) o * O * Oo O .
29. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que um ou dois dos anfifílicos estão ausentes e são substituídos por um grupo alquila ou um grupo químico orgânico farmaceuticamente aceitável com 1-400 átomos selecionados a partir de carbono, oxigênio, nitrogênio, enxofre, flúor e hidrogênio.
30. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o grupo químico orgânico farmaceuticamente aceitável é selecionado a partir de alquila, alquenila, alquinila, éter alquílico, éter arílico, alcoxi e alcoxi-alcoxi.
31. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 29,
caracterizado pelo fato de que o grupo químico orgânico farmaceuticamente aceitável é selecionado a partir de metoxi, etoxi, éter t-butílico e benzil oxi.
32. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos anfifílicos têm a estrutura mostrada na Fórmula VIII Ri * NÓ Ng > Fórmula VIII em que R' e R? são R' = CHXCH;),O(C=O)Rº, CHX(CH>).NH(C=O)R, CHXCHo))(C=0) OR, CH(CH))(C=O)NHRº? R?º = CHXCH>)nO(C=O)R5, CH(CH>)NH(C=O)RS5, CHXCHo)I1(C=0)ORS, CHX(CHo).-(C=O)NHR$ em que n e m são cada um independentemente de 1 a 2; Rº e Rº são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila C(12-20) ou um grupo alquenila C(12-20).
33. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos anfifílicos têm a estrutura mostrada na Fórmula IX Ri AA? x — NH nen Ne Fórmula IX em que R' e R? são R' = CHXCH3;))/O(C=O)Rº, CH(CHo),NH(C=O)R, CH(CH).(C=0)OR?, CHXCHy))(C=O)NHR*? Rº = CH(CHo)nO(C=O)R5, CH(CH2)WNH(C=O)R', CHXCHo)(C=0) OR, CHCH).(C=O)NHRº em que n e m são cada um independentemente de 1 a 2; Rº e Rº são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila C(12-20) ou um grupo alquenila C(12-20); em que R? é selecionado a partir de alcanodiil C(1-8) ramificado ou não ramificado, alquenodiil C(2-8) substituído ou não substituído, alquinodiil C(2-8) substituído ou não substituído, cicloalcanodiil C(3-8) substituído ou não substituído, arileno substituído ou não substituído, heteroarileno C(4-8) substituído ou não substituído e heterocicloalcanodiil substituído ou não substituído; em que R? é opcionalmente interrompido por um ou mais de —O-, -S-, -SO-, -SO>-, -NH-, -NRº-, -NH(C=0O)-, -O(C=0O)-, em que Rº é alquila C(1-6)-, alcoxi C(1-6)-, ou alcoxi C(1-6)-alcoxi C(1-6)-.
34. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que R* e Ró são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila (14-18) ou um grupo alquenila C(14-18).
35. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o composto é o composto T9:
Composto T9 | | | | à s o% o
W
SN CNN o
RS
N * o | SO " D o O NH
ES o y o o NH O MS o IE aaa o H o om Tão o)
É = o
JP Prá
36. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos anfifílicos têm a estrutura mostrada na Fórmula X R' R2 AA? * —N >p3 Fórmula X em que R' e Rº? são
R' = CHX(CH;),O(C=O)Rº, CH(CH>).NH(C=O)R, CHX(CHo))(C=0) OR, CH(CH))(C=O)NHR*? R?º = CHCHo). O(C=O)R5, CHXCHo).NH(C=O)R'5, CHXCHo)Im(C=0) OR", CHX(CHo).-(C=O)NHR$ Rº e R são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila C(12-20) ou um grupo alquenila C(12-20); em que R? está ausente ou é selecionado a partir de *-NH-alcanodiil C(1-8)- (C=0O)- ramificado ou não ramificado, *-NH-alquenodiil C(2-8)-(C=0O)- substituído ou não substituído, *-NH-alquinodiil C(2-8)-(C=0O)- substituído ou não substituído, *-NH-cicloalcanodiil C(3-8)-(C=O)- substituído ou não substituído, *-NH-arileno-(C=O)- substituído ou não substituído, *-NH- heteroarileno C(4-8)-(C=O)- substituído ou não substituído e *-NH- heterocicloalcanodiil-(C=O)- substituído ou não substituído, em que * indica o terminal afixado a AAº; em que Rô é opcionalmente interrompido por um ou mais de —O-, -S-, -SO-, -SO7-, -NH-, -NRó-, -NH(C=0)-, -O(C=0O)-, em que Rº é alquila C(1-6)-, alcoxi C(1-6)-, ou alcoxi C(1-6)-alcoxi C(1-6)-.
37. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos anfifílicos têm a estrutura mostrada na Fórmula XI NE " AA? * —R3-NH CX R2 Fórmula XI em que R' e R? são R' = (C=0)ORÍ, (C=O)NHR$, O(C=O)RÍ, (C=O)R* R? = (C=0)ORSÍ, (C=O)NHRS, O(C=O)RÍ, NH(C=O)R5 Rº e Ró são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila C(12-20) ou um grupo alquenila C(12-20); em que R? está ausente ou é selecionado a partir de *-NH-alcanodiil C(1-8)-
40 / 44 (C=O)- ramificado ou não ramificado, *-NH-alquenodiil C(2-8)-(C=0O)- substituído ou não substituído, *-NH-alquinodiil C(2-8)-(C=O)- substituído ou não substituído, *-NH-cicloalcanodiil C(3-8)-(C=O)- substituído ou não substituído, *-NH-arileno-(C=O)- substituído ou não substituído, *-NH- heteroarileno C(4-8)-(C=O)- substituído ou não substituído e *-NH- heterocicloalcanodiil-(C=O)- substituído ou não substituído, em que * indica o terminal afixado a AAº; em que R? é opcionalmente interrompido por um ou mais de —O-, -S-, -SO-, -SO7-, -NH-, -NRº-, -NH(C=0O)-, -O(C=0O)-, em que Ró é alquila C(1-6)-, alcoxi C(1-6)-, ou alcoxi C(1-6)-alcoxi C(1-6)-.
38. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos anfifílicos têm a estrutura mostrada na Fórmula III
SA Rº x Fórmula TI em que R' e R? são R' = CH(CH;),O(C=O)R*, CHX(CH>),NH(C=O)R*, CHX(CH>))(C=0)ORÍ, CH(CH>).(C=O)NHR*? Rº = CH(CH)nO(C=O)R", CH(CHo)nNH(C=O)RS, CHX(CH)n(C=0)OR', CH(CH)n(C=O)NHR* em que n e m são cada um independentemente de 1 a 2; e Rê e Ri são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila C(12-20) ou um grupo alquenila C(12-20); em que R é selecionado a partir de -(C=0O)-alquila-NH-, que está afixado a AA*; -(C=0O)-alquenila-NH-, que está afixado a AAº; -(C=0O)-alquinila-NH-, que está afixado a AA*; em que qualquer alquila de R? é alquila C(1-6) ramificada ou não ramificada, qualquer alquenila de R? é alquenila C(2-6) ramificada ou não ramificada e qualquer alquinila de R? é alquinila C(2-6) ramificada ou não ramificada; R$ O — R6$ R$
Ú N—* N—*
TS R$ R$ R$ " O — R$ R$ — — <> — R$ e seus isômeros posicionais; R8 | -N * “Mu R q
0-3 02 O JUV (CH2)1.2 —* AA * TO O MU (CHa)1.2 —*
VW em que cada Ró é selecionado independentemente dentre H, alquila, alcoxi e alcoxialcoxi, com a condição de que um Ró seja -(C=0O)-alquila-NH- no qual NH está afixado a AAº; cada R$ é selecionado independentemente de H, alquila, com a condição de que um R$ seja -(C=0O)-alquila-NH- no qual NH está afixado a AAº*; q é de zero a quatro; QéOouN.
39. Composto fusogênico de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos anfifílicos têm a estrutura mostrada na Fórmula V
RI De Fórmula V em que R' e R? são R' = (C=0) OR, (C=O)NHR$, O(C=O)Rº, NH(C=O)R* R? = (C=0)ORS, (C=O)NHRS, O(C=O)R5, NH(C=O)R* em que Rº e Ró são independentemente para cada ocorrência um grupo alquila C(12-20) ou um grupo alquenila C(12-20); em que Rô está ausente ou é selecionado a partir de *-NH-alcanodiil C(1-8)- (C=O)- ramificado ou não ramificado, *-NH-alquenodiil C(2-8)-(C=0O)-
substituído ou não substituído, *-NH-alquinodiil C(2-8)-(C=0O)- substituído ou não substituído, *-NH-cicloalcanodiil C(3-8)-(C=O)- substituído ou não substituído, *-NH-arileno-(C=O)- substituído ou não substituído, *-NH- heteroarileno C(4-8)-(C=0O)- substituído ou não substituído e *-NH- heterocicloalcanodiil-(C=O)- substituído ou não substituído, em que * indica o terminal afixado a AAº; em que R? é opcionalmente interrompido por um ou mais de —O-, -S-, -SO-, -SO7-, -NH-, -NRº-, -NH(C=0O)-, -O(C=0O)-, em que R$ é alquila C(1-6)-, alcoxi C(1-6)-, ou alcoxi C(1-6)-alcoxi C(1-6)-.
40. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um composto fusogênico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
41. Composição de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que a composição compreende nanopartículas ou lipossomas.
42. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto fusogênico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, um agente ativo e um veículo farmaceuticamente aceitável.
43. Composição de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que o composto fusogênico é de 0,01% mol a 20% mol dos lipídios da composição.
44. Composição de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que a composição compreende nanopartículas ou lipossomas.
45. Composição de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que o agente ativo é um ou mais ácidos nucleicos.
46. Composição de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que o agente ativo é um ou mais DNAs, RNAs, MRNAs, siRNAs ou microRNAs.
44 / 44
47. Composição de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que o agente ativo é uma ou mais moléculas de RNA.
48. Composição de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que o agente ativo é selecionado a partir de uma ou mais moléculas de RNAiI, uma ou mais moléculas de mRNA e formas modificadas das mesmas.
49. Composição para uso na distribuição de um agente ativo para o tratamento de uma condição ou doença em um indivíduo, a composição caracterizada pelo fato de que compreende o agente ativo, um composto fusogênico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, um lipídio ionizável, um lipídio estrutural, um lipídio estabilizador e um lipídio para reduzir a imunogenicidade da composição.
50. Composição de acordo com a reivindicação 49, caracterizada pelo fato de que o agente ativo é um ou mais ácidos nucleicos.
51. Método para prevenir, melhorar ou tratar uma doença ou condição em um indivíduo em necessidade, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma composição como definido na reivindicação 42.
52. Composição de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento do corpo humano ou animal.
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