CN117177738A - 通过混合的阳离子性脂质颗粒的组织特异性核酸递送 - Google Patents

通过混合的阳离子性脂质颗粒的组织特异性核酸递送 Download PDF

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Abstract

本公开涉及将可离子化脂质与阳离子性脂质混合的核酸‑脂质颗粒，其在经肠胃外给药时优先定位至并将所缔合的运载物递送至肝，并且其任选地可用于将所缔合的运载物递送至此类颗粒直接注射至的组织。本公开提供包含任选地与治疗剂(例如，治疗性mRNA和/或核酸控制物系统)缔合的此类脂质颗粒的组合物，以及用于递送缔合脂质颗粒的治疗剂的方法和套组和/或使用本文所提供的脂质颗粒组合物治疗受试者的疾病或疾患例如肝疾病或疾患的方法和套组。

Description

通过混合的阳离子性脂质颗粒的组织特异性核酸递送
相关申请的交叉引用
本申请涉及并且基于35U.S.C.§119(e)而主张2021年4月22日提交的题为“Tissue-Specific Nucleic Acid Delivery by Mixed Cationic Lipid Particles”的美国临时专利申请案号63/178,050的优先权。前述专利申请的整体内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及基于脂质的组合物和可用于给药基于核酸的疗法的方法。特别地，本公开涉及用于将核酸递送至受试者的混合的阳离子/可离子化脂质颗粒，包括用于治疗或预防受试者的疾病和病症，包括受试者肝组织的或涉及肝组织的疾病或病症。
背景技术
全世界每年大约有200万人死于肝病，其中包括大约有100多万人死于肝硬化、病毒性肝炎和肝细胞癌(HCC)并发症。几乎占全世界所有死亡人数的3.5％因肝硬化和肝癌死亡。肝移植是第二普遍的实体器官移植，被用作解决许多肝脏疾病的最后治疗选择，不幸的是，目前只有不到10％的全球移植需求得到满足。尽管存在一些针对肝脏疾病和疾患的治疗方法，可以帮助延迟甚至预防对肝移植的需要，但此类已知的治疗方法绝非完全恢复性的，并且该领域的一个主要挑战仍然是开发有效治疗肝脏疾病而不对经治疗的受治疗者造成过分伤害的治疗剂。
核酸疗法提供了用于在个体靶向基因的水平上治疗疾病的巨大潜力。然而，安全有效的递送系统对于实现核酸治疗剂的全部前景至关重要。核酸治疗剂到全部器官和组织的非特异性递送可能经常导致脱位点(非靶向和/或脱靶)效应和毒性。将核酸治疗剂优先递送到期望在其中进行特异性作用的所关注器官或组织一直是药物递送且特别是基于核酸的药剂递送的目标。仅靶向疾病原因而不伤害身体其他部分的概念由Ehrlich在120年前提出。然而，对于能够在不引入基于配体的靶向策略的情况下靶向特定组织的纳米颗粒递送系统(后者也称为“主动靶向”)，仍然没有有效的选择。因此，在本领域中存在先前未满足的对于媒介物的需求，该媒介物能够仅基于这种此类制剂的结构性组分(而不是通过基于配体的主动靶向策略)实现核酸运载物的器官特异性递送。特别是，因为肝对于基因疗法是关键靶器官，本领域也存在对于能够将核酸运载物选择性地递送至肝的此类媒介的特殊需求。
发明内容
本公开至少部分地基于鉴定基于脂质的纳米颗粒组合物和制剂，其能够将运载物部分(例如，核酸运载物)特异性地靶向至受试者的肝和肝组织，而不需要基于配体的靶向策略。特别地，本公开涉及以下令人惊奇的发现，将第二可离子化或阳离子性脂质引入含有阳离子性脂质DOTAP(1,2-二油基-3-三甲基铵-丙烷)的核酸-脂质颗粒制剂可以有效地将此类颗粒制剂变为在它们的核酸运载物递送方面为肝特异性的，并且稳健地实现将非常大的分子调节控制物运载物递送至经颗粒治疗的受试者的肝细胞的细胞核。本文具体地发现，在含有DOTAP的颗粒内包含可离子化脂质C12-200(1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇))(从而形成混合阳离子性脂质颗粒)将载体的趋性变为特异于肝组织而无需LNP中的其他活性靶向组分，甚至与含有MC3的脂质颗粒(其先前已经在本领域中描述为实现核酸运载物至肝的选择性递送)相比具有显著的改善。因此，本公开提供脂质颗粒，其在全身性给药(例如，经由静脉内(IV)注射)时能够将核酸运载物选择性地有效递送至肝，其中此类核酸运载物包括，例如，核酸调节控制物、治疗性mRNA以及RNA干扰(RNAi)和反义剂(siRNA、miRNA等)等。
一方面，本公开提供一种用于将核酸运载物递送至受试者的肝组织的核酸-脂质颗粒，该核酸-脂质颗粒包括占存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约10mol％至约50mol％的1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)；以及占存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约5mol％至约50mol％的可离子化脂质。
在一种实施方案中，可离子化脂质为1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)、N4-胆甾醇基-精胺盐酸盐(GL67)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基甲酰胺基)乙基]-3,4-二[油酰氧基]-苯甲酰胺(MVL5)和/或聚合支链聚乙烯亚胺(bPEI)。
在某些实施方案中，该颗粒包括占存在于脂质-核酸颗粒中的总脂质的约25mol％至约85mol％的一种或多种非阳离子性脂质。任选地，该一种或多种非阳离子性脂质包括结构性脂质，例如，胆固醇、β-谷甾醇或其一种或多种衍生物。
在多种实施方案中，该颗粒包括以存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约10mol％至约75mol％存在的胆固醇、β-谷甾醇或其一种或多种衍生物。任选地，该颗粒包括以存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约20mol％至约65mol％存在的胆固醇、β-谷甾醇或其一种或多种衍生物。任选地，该颗粒包括以存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约24mol％至约64mol％存在的胆固醇、β-谷甾醇或其一种或多种衍生物。任选地，该颗粒包括占存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约24mol％、存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约34mol％、存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约38mol％、存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约44mol％、存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约54mol％或存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约64mol％的胆固醇、β-谷甾醇或其一种或多种衍生物。
在一种实施方案中，该颗粒包括除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质。任选地，除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种阳离子性脂质以存在于脂质-核酸颗粒中的总脂质的约5mol％至约50mol％存在。任选地，除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种阳离子性脂质以存在于脂质-核酸颗粒中的总脂质的约5mol％至约30mol％存在。任选地，除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种阳离子性脂质以存在于脂质-核酸颗粒中的总脂质的约5mol％至约10mol％存在。
在某些实施方案中，该颗粒以选自下列水平包含除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质：存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约6mol％、存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约7mol％、存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约7.5mol％、存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约8mol％、存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约9mol％、存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约10mol％、存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约16mol％、存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约26mol％、存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约36mol％或存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约46mol％。
在多种实施方案中，除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质为1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DOPC)、和/或1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DSPC)。任选地，除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种阳离子性脂质为DOPE。
在一种实施方案中，核酸-脂质颗粒不包括PEG-脂质缀合物。任选地，核酸-脂质颗粒不包括PEG。
在某些实施方案中，核酸-脂质颗粒为多剂疗法的组分。
在一种实施方案中，该颗粒包括缀合的脂质，其抑制颗粒的集聚且以占存在的总脂质的0.01％至3％存在。任选地，缀合的脂质为或包括聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。任选地，PEG-脂质缀合物中的PEG的平均分子量为550道尔顿至3000道尔顿。任选地，PEG-脂质缀合物为PEG2000-脂质缀合物。任选地，PEG2000-脂质缀合物为或包括1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2k)和1,2-二硬脂酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DSG-PEG2k)中的一种或多种。任选地，PEG2000-脂质缀合物为1,2-二肉豆蔻酰基-rac–甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2k)。任选地，核酸-脂质颗粒以下列水平包括PEG-脂质缀合物：存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约0.5mol％、存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约1.0mol％、存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约1.5mol％或存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约2.0mol％。
在一种实施方案中，核酸运载物为或包含合成的或天然存在的RNA或DNA或其衍生物。任选地，核酸运载物为经修饰的RNA。任选地，经修饰的RNA为经修饰的mRNA、经修饰的反义寡核苷酸和/或经修饰的siRNA。任选地，经修饰的mRNA编码核酸调节控制物。
在多种实施方案中，核酸运载物包括下列修饰中的一种或多种：2'-O-甲基修饰的核苷酸、包括5'-硫代磷酸酯基团的核苷酸、链接至胆固醇基衍生物的末端核苷酸、2'-脱氧-2'-氟修饰的核苷酸、5'-甲氧基-修饰的核苷酸(例如，5'-甲氧基尿苷)、2'-脱氧-修饰的核苷酸、锁核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基-修饰的核苷酸、2'-烷基-修饰的核苷酸、吗啉基核苷酸、氨基磷酸酯、包括非天然碱基的核苷酸；包括以下的核苷间链接或主链：硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、包括3'-亚烷基磷酸酯和手性磷酸酯在内的甲基和其他烷基磷酸酯、次磷酸酯、包括3'-氨基氨基膦酸酯和氨基烷基氨基膦酸酯在内的氨基膦酸酯、硫羰基氨基膦酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯和具有正常3'-5'链接的硼磷酸酯、这些的2'-5'链接的类似物、和具有逆极性的那些，其中核苷单元的相邻对被3'-5'至5'-3'链接或2'-5'至5'-2'链接。
在某些实施方案中，肝组织为或包括肝细胞、血管细胞(即，肝窦)、肝星状细胞、内皮细胞、成纤维细胞、间充质细胞、免疫细胞、癌细胞、库普弗(Kupffer)细胞、星形胶质细胞、椭圆形血管内皮细胞、肝源性干/祖细胞、和/或衍生自非肝组织的干/祖细胞或癌细胞。
在一种实施方案中，该颗粒以下列水平包括DOTAP：存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约10mol％、存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约20mol％、存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约30mol％、存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约40mol％或存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约50mol％。
本公开的另一方面提供一种用于将核酸运载物递送至受试者的肝组织的核酸-脂质颗粒，该核酸-脂质颗粒包括占存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约50mol％的DOTAP和以存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约18mol％存在的可离子化脂质。
在一种实施方案中，可离子化脂质为1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)。
在某些实施方案中，该颗粒进一步包括占存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约24mol％的胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物。任选地，该颗粒进一步包括占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约6mol％的除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质。任选地，除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种阳离子性脂质为DOPE。任选地，该颗粒进一步包括聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。任选地，PEG-脂质缀合物占存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的的约2.0mol％。任选地，PEG-脂质缀合物为1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋(rac)-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2k)。
本公开的一额外方面提供一种用于将核酸运载物递送至受试者的肝组织的核酸-脂质颗粒，该核酸-脂质颗粒包括占存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约40mol％的DOTAP和以存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约18mol％存在的可离子化脂质。
在某些实施方案中，该颗粒进一步包括占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约16mol％的除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质。
本公开的一方面提供一种用于将核酸运载物递送至受试者的肝组织的核酸-脂质颗粒，该核酸-脂质颗粒包括占存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约30mol％的DOTAP和以存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约18mol％存在的可离子化脂质。
在一种实施方案中，该颗粒进一步包括占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约26mol％的除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质。
本公开的另一方面提供一种用于将核酸运载物递送至受试者的肝组织的核酸-脂质颗粒，该核酸-脂质颗粒包括占存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约20mol％的DOTAP和以存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约18mol％存在的可离子化脂质。
在一种实施方案中，该颗粒进一步包括占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约36mol％的除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质。
本公开的又一方面提供一种用于将核酸运载物递送至受试者的肝组织的核酸-脂质颗粒，该核酸-脂质颗粒包括占存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约10mol％的DOTAP和以存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约18mol％存在的可离子化脂质。
在一种实施方案中，该颗粒进一步包括以存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约46mol％存在的除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质。
本公开的一额外方面提供一种用于将核酸运载物递送至受试者的肝组织的核酸-脂质颗粒，该核酸-脂质颗粒包括占存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约50mol％的DOTAP；以存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约18mol％存在的可离子化脂质；以及以存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约7.0mol％存在的除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质。
在一种实施方案中，该颗粒进一步包括占存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约1.0mol％的PEG-脂质缀合物。
本公开的另一方面提供一种用于将核酸运载物递送至受试者的肝组织的核酸-脂质颗粒，该核酸-脂质颗粒包括占存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约50mol％的DOTAP；以存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约18mol％存在的可离子化脂质；以及以存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约7.5mol％存在的除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质。
在一种实施方案中，该颗粒进一步包括占存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约0.5mol％的PEG-脂质缀合物。
本公开的又一方面提供一种用于将核酸运载物递送至受试者的肝组织的核酸-脂质颗粒，该核酸-脂质颗粒包括占存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约50mol％的DOTAP；以存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约18mol％存在的可离子化脂质；以及以存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约8.0mol％存在的除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质。
在一种实施方案中，该颗粒不包括PEG-脂质缀合物。任选地，核酸-脂质颗粒不包括PEG。
本公开的一额外方面提供一种用于将核酸运载物递送至受试者的肝组织的核酸-脂质颗粒，该核酸-脂质颗粒包括占存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约40mol％的DOTAP；以存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约18mol％存在的可离子化脂质；以及以存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约34mol％存在的胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物。
在某些实施方案中，核酸-脂质颗粒进一步包括以存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约6.0mol％存在的除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质。
本公开的另一方面提供一种用于将核酸运载物递送至受试者的肝组织的核酸-脂质颗粒，该核酸-脂质颗粒包括占存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约30mol％的DOTAP；以存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约18mol％存在的可离子化脂质；以及以存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约44mol％存在的胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物。
本公开的又一方面提供一种用于将核酸运载物递送至受试者的肝组织的核酸-脂质颗粒，该核酸-脂质颗粒包括占存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约20mol％的DOTAP；以存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约18mol％存在的可离子化脂质；以及以存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约54mol％存在的胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物。
本公开的一额外方面提供一种用于将核酸运载物递送至受试者的肝组织的核酸-脂质颗粒，该核酸-脂质颗粒包括占存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约10mol％的DOTAP；以存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约18mol％存在的可离子化脂质；以及以存在于核酸-脂质颗粒中的总脂质的约64mol％存在的胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物。
在另一方面，本公开提供一种药物组合物，其包括本公开的核酸-脂质颗粒。
在某些实施方案中，药物组合物经配制用于肠胃外给药。任选地，药物组合物经配制用于静脉注射。
在多种实施方案中，药物组合物经配制用于直接注射至肝组织内。
在一种实施方案中，给药本公开的核酸-脂质颗粒或药物组合物以治疗有此需要的受试者的肝脏疾病或疾患。任选地，肝脏疾病或疾患为胆道闭锁、先天性肝内胆管发育不良综合征(Alagille综合征)、α-1抗胰蛋白酶缺乏、酪氨酸血症、新生儿肝炎、丙型肝炎病毒感染、乙型肝炎病毒感染、甲型肝炎病毒感染、肝细胞癌和/或威尔森氏病。
本公开的另一方面提供一种注射剂，其包括本公开的核酸-脂质颗粒或药物组合物。
本公开的另一方面提供一种用于将核酸运载物递送至受试者的肝组织的方法，其包括将本公开的核酸-脂质颗粒、药物组合物或注射剂给药至该受试者。
本公开的又一方面提供一种用于治疗或预防受试者的疾病或疾患的方法，该方法包括将本公开的核酸-脂质颗粒、药物组合物或注射剂给药至该受试者。
在多种实施方案中，该核酸-脂质颗粒、药物组合物或注射剂经静脉内给药，且该核酸运载物在受试者的肝组织细胞内的表达以比该核酸运载物在该受试者的肺、心、脾、卵巢、胰、肾和/或其他器官或组织的细胞内的表达高出至少两倍的水平发生。任选地，核酸运载物在受试者的肝组织细胞内的表达比该核酸运载物在该受试者的肺、心、脾、卵巢、胰和/或肾的细胞内的表达高出至少三倍、任选地高出至少四倍、任选地高出至少五倍、任选地高出至少六倍、任选地高出至少七倍、任选地高出至少八倍、任选地高出至少九倍、任选地高出至少十倍、任选地高出至少十一倍、任选地高出至少十二倍、任选地高出至少十三倍、任选地高出至少十四倍、任选地高出至少十五倍、任选地高出至少二十倍。
在一些实施方案中，本公开的核酸-脂质颗粒、药物组合物或注射剂经静脉内给药，并且该核酸-脂质颗粒以比该核酸-脂质颗粒在受试者的下列其他组织中的一者或多者中的浓度高出至少两倍的浓度定位在该受试者的肝组织内：肺、心、脾、卵巢和胰。任选地，与核酸-脂质颗粒以比该核酸-脂质颗粒在该受试者的下列其他组织中的一者或多者中的浓度高出至少三倍、至少四倍、至少五倍或至少六倍的浓度的核酸-脂质颗粒存在于肝内：肺、心、脾、卵巢和/或胰。
在某些实施方案中，进行该核酸-脂质颗粒、药物组合物或注射剂的给药以治疗或预防下列中的一者或多者：肝脏疾病或疾患(例如，胆道闭锁、先天性肝内胆管发育不良综合征、α-1抗胰蛋白酶缺乏、酪氨酸血症、新生儿肝炎、丙型肝炎病毒感染、乙型肝炎病毒感染、甲型肝炎病毒感染、肝细胞癌和/或威尔森氏病)；关节疾病或疾患(例如，类风湿性关节炎、银屑病关节炎、痛风、肌腱炎、滑囊炎、腕管综合征和/或骨关节炎)；炎症性疾病或疾患(例如，炎症性肠病、腹膜炎、骨髓炎、恶病质、胰腺炎、创伤引起的休克、支气管哮喘、过敏性鼻炎、囊性纤维化、急性支气管炎、急性剧烈支气管炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、感染性关节炎、感染后关节炎、淋病性关节炎、结核性关节炎、关节炎、骨关节炎、痛风、脊柱关节病、强制性脊柱炎、与血管炎综合征相关的关节炎、结节性神经性多动脉炎、易激血管炎、化脓性肉芽肿病、类风湿性息肉病肌痛、关节炎细胞动脉炎，钙性多囊关节病、腐蚀性痛风、非关节炎性风湿病、滑囊炎、花粉热、化脓性炎症(例如，网球肘)、神经性关节病、关节积血、过敏性紫癜(Henoch-Schlein紫癜)、肥大性骨关节炎、多发性痔疮、脊柱侧弯、血色素沉着症、高脂蛋白血症、低丙种球蛋白血症、COPD、急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤、支气管肺发育不良和/或系统性红斑狼疮(SLE))；以及表皮疾病或疾患(例如，银屑病、特应性皮炎、硬皮病、湿疹、酒渣鼻、脂溢性皮炎、黑色素瘤、日光性角化病、鱼鳞病、短暂性棘皮松解皮肤病(Grover病)、常见疣、角化棘皮瘤和/或脂溢性角化症)。
在多种实施方案中，核酸-脂质颗粒、药物组合物或注射剂经肠胃外给药。任选地，核酸-脂质颗粒、药物组合物或注射剂经由吸入、外用施加或注射给药。任选地，核酸-脂质颗粒、药物组合物或注射剂通过静脉内注射、气管内注射、关节内注射、皮下注射、皮内注射和/或肌肉内注射给药。
在某些实施方案中，核酸运载物为或包括合成的或天然存在的RNA或DNA或其衍生物。任选地，核酸运载物为经修饰的RNA。任选地，经修饰的RNA为经修饰的mRNA、经修饰的反义寡核苷酸或经修饰的siRNA。任选地，经修饰的mRNA编码核酸调节控制物。
定义
如本文所用，除非具体指定或从上下文明显可见，否则术语“约”理解为处于该领域正常公差范围内，例如处于平均值的2个标准偏差内。“约”可理解为处于所指定值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。
在某些实施方案中，除非另外指明或上下文明显另有意义，否则术语“大约”或“约”是指在任一方向(大于或小于)上落入所指定的参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小的区间内的值范围(但该数字将超过可能数值的100％时除外)。
除非上下文明确排除，否则本文提供的所有数值均以术语“约”修饰。
术语“脂质”指示一组有机化合物，其包括但不限于脂肪酸的酯，并且特征在于不溶于水但溶于很多有机溶剂。它们往往分为至少三类：(1)“单纯脂质”，其包括脂肪和油以及蜡；(2)“复合脂质”，其包括磷脂和糖脂；(3)“衍生脂质”诸如甾族化合物。
如本文所用，术语“阳离子性脂质”是指在选定pH诸如生理pH下携带净正电荷的大量脂质物质中的任一者。阳离子性脂质包括那些具有一个、两个、三个、或更多个脂肪酸或脂肪族烷基链和pH可滴定氨基头部基团(例如，烷基氨基或二烷基氨基头部基团)的脂质及其盐。阳离子性脂质在低于该阳离子性脂质的pKa的pH下典型地质子化(即，荷正电)并且在高于该pKa的pH下基本上为中性。本文说明书的阳离子性脂质也可以称为可滴定阳离子性脂质。在一些实施方案中，阳离子性脂质包含：可质子化的叔胺(例如，pH可滴定的)头部基团；C18烷基链，其中每个烷基链独立地具有0至3个(例如，0、1、2或3个)双键；以及位于该头部基团与烷基链之间的醚、酯或醛键联。此类阳离子性脂质包括但不限于，DOTAP、1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、1,2-二油氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)、1,2-二亚油氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚油氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLenDMA)、1,2-二-γ-亚油烯氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(γ-DLenDMA)、1,2-二亚油氧基-酮基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinK-DMA)、1,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLinKC2-DMA)(也称为DLin-C2K-DMA、XTC2和C2K)、2,2-二亚油基-4-(3-二甲基氨基丙基)[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-K-C3-DMA)、2,2-二亚油基-4-(4-二甲基氨基丁基)[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-K-C4-DMA)、1,2-二亚油烯氧基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧杂环戊烷(γ-DLen-C2K-DMA)、1,2-二-γ-亚油烯氧基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧杂环戊烷(γ-DLen-C2K-DMA)、二亚油基甲基-3-二甲基氨基丙酸酯(DLin-M-C2-DMA)(也称为MC2)、4-(二甲基氨基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-酯(DLin-M-C3-DMA)(也称为MC3)和3-(二亚油基甲氧基)-N,N-二甲基丙烷-1-胺(DLin-MP-DMA)(也称为1-B11)。如本文所用，“DOTAP”是指1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷，或18:1TAP，一种双链或双子(gemini)阳离子性脂质。
DOTAP由于其季铵结构，为一种不依赖于pH的荷阳离子电荷的脂质。它在商业上销售，用于DNA、RNA和其他荷负电分子的脂质体转染。在本公开的一些方面，DOTAP脂质或其变体与C12-200脂质或其变体组合用于脂质纳米颗粒中以将核酸特异性地递送至肝。DOTAP(C42H80NO4 +)的结构如下：
如本文所用，术语“可离子化脂质”是指一种脂质，其随着pH降低至低于该脂质的可离子化基团的pK而变为阳离子性(质子化)，但在较高pH值下逐渐变得更为中性。当脂质-核酸颗粒的组分处于低于该pK的pH值时，则该脂质能够与带负电的聚核酸缔合。示例性可离子化脂质包括但不限于，C12-200；N4-胆甾醇基-精胺盐酸盐(GL67)；N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基甲酰胺基)乙基]-3,4-二[油氧基]-苯甲酰胺(MVL5)；1,2-二硬脂氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)；1,2-二油氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)；1,2-二亚油氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)；1,2-二亚油氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLenDMA)；1,2-二-γ-亚油氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(γ-DLenDMA)；1,2-二亚油氧基-酮基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinK-DMA)；1,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLinKC2-DMA)(也称为DLin-C2K-DMA、XTC2和C2K)；2,2-二亚油基-4-(3-二甲基氨基丙基)[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-K-C3-DMA)；2,2-二亚油基-4-(4-二甲基氨基丁基)[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-K-C4-DMA)；1,2-二亚油烯氧基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧杂环戊烷(γ-DLen-C2K-DMA)；1,2-二-γ-亚油烯氧基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧杂环戊烷(γ-DLen-C2K-DMA)；二亚油基甲基-3-二甲基氨基丙酸酯(DLin-M-C2-DMA)(也称为MC2)；4-(二甲基氨基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-酯(DLin-M-C3-DMA)(也称为MC3)；3-(二亚油基甲氧基)-N,N-二甲基丙烷-1-胺(DLin-MP-DMA)(也称为1-B11)；2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(Octyl-CLinDMA)；(2R)2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(R-Octyl-CLinDMA)；(2S)2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(S-Octyl-CLinDMA)；(2S)-1-{7-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]庚氧基}-3-[(4Z)-癸-4-烯-1-基氧基]-N,N-二甲基丙烷-2-胺；(2R)-1-{4-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丁氧基}-3-[(4Z)-癸-4-烯-1-基氧基]-N,N-二甲基丙烷-2-胺；1-[(2R)-1-{4-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丁氧基}-3-(辛氧基)丙烷-2-基]胍；1-[(2R)-1-{7-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]庚氧基}-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-2-胺；1-[(2R)-1-{4-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丁氧基}-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-2-胺；(2S)-1-({6-[(3β))-胆甾-5-烯-3-基氧基]己基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z)-十八碳-9-烯-1-基氧基]丙烷-2-胺；(3β)-3-[6-{[(2S)-3-[(9Z)-十八碳-9-烯-1-基氧基]-2-(吡咯烷-1-基)丙基]氧基}己基)氧基]胆甾-5-烯；(2R)-1-{4-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丁氧基}-3-(辛氧基)丙烷-2-胺；(2R)-1-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-(戊氧基)丙烷-2-胺；(2R)-1-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-3-(庚氧基)-N,N-二甲基丙烷-2-胺；(2R)-1-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(2Z)-戊-2-烯-1-基氧基]丙烷-2-胺；(2S)-1-丁氧基-3-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基丙烷-2-胺；(2S-1-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-3-[2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9-十六氟壬基)氧基]-N,N-二甲基丙烷-2-胺；2-氨基-2-{[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]甲基}丙烷-1,3-二醇；2-氨基-3-({9-[(3β,8ξ,9ξ,14ξ,17ξ,20ξ)-胆甾-5-烯-3-基氧基]壬基}氧基)-2-{[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]甲基}丙-1-醇；2-氨基-3-({6-[(3β,8ξ,9ξ,14ξ,17ξ,20ξ)-胆甾-5-烯-3-基氧基]己基}氧基)-2-{[(9Z)-十八碳-9-烯-1-基氧基]甲基}丙-1-醇；(20Z,23Z)-N,N-二甲基二十九碳-20,23-二烯-10-胺；(17Z,20Z)-N,N-二甲基二十六碳-17,20-二烯-9-胺；(16Z,19Z)-N,N-二甲基二十五碳-16,19-二烯-8-胺；(13Z,16Z)-N,N-二甲基二十二碳-13,16-二烯-5-胺；(12Z,15Z)-N,N-二甲基二十一碳-12,15-二烯-4-胺；(14Z,17Z)-N,N-二甲基二十三碳-14,17-二烯-6-胺；(15Z,18Z)-N,N-二甲基二十四碳-15,18-二烯-7-胺；(18Z,21Z)-N,N-二甲基二十七碳-18,21-二烯-10-胺；(15Z,18Z)-N,N-二甲基二十四碳-15,18-二烯-5-胺；(14Z,17Z)-N,N-二甲基二十三碳-14,17-二烯-4-胺；(19Z,22Z)-N,N-二甲基二十八碳-19,22-二烯-9-胺；(18Z,21Z)-N,N-二甲基二十七碳-18,21-二烯-8-胺；(17Z,20Z)-N,N-二甲基二十六碳-17,20-二烯-7-胺；(16Z,19Z)-N,N-二甲基二十五碳-16,19-二烯-6-胺；(22Z,25Z)-N,N-二甲基三十一碳-22,25-二烯-10-胺；(21Z,24Z)-N,N-二甲基三十碳-21,24-二烯-9-胺；(18Z)-N,N-二甲基二十七碳-18-烯-10-胺；(17Z)-N,N-二甲基二十六碳-17-烯-9-胺；(19Z,22Z)-N,N-二甲基二十八碳-19,22-二烯-7-胺；N,N-二甲基二十七烷-10-胺；(20Z,23Z)-N-乙基-N-甲基二十九碳-20,23-二烯-10-胺；1-[(11Z,14Z)-1-壬基二十碳-11,14-二烯-1-基]吡咯烷；(20Z)-N,N-二甲基二十七碳-20-烯-10-胺；(15Z)-N,N-二甲基二十七碳-15-烯-10-胺；(14Z)-N,N-二甲基二十九碳-14-烯-10-胺；(17Z)-N,N-二甲基二十九碳-17-烯-10-胺；(24Z)-N,N-二甲基三十三碳-24-烯-10-胺；(20Z)-N,N-二甲基二十九碳-20-烯-10-胺；(22Z)-N,N-二甲基三十一碳-22-烯-10-胺；(16Z)-N,N-二甲基二十五碳-16-烯-8-胺；(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一碳-12,15-二烯-1-胺；(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-1-胺；N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十七烷-8-胺；1-[(1S,2R)-2-己基环丙基]-N,N-二甲基十九烷-10-胺；N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十九烷-10-胺；N,N-二甲基-21-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]二十一烷-10-胺；N,N-二甲基-1-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-戊基环丙基]甲基}环丙基]十九烷-10-胺；N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十六烷-8-胺；N,N-二甲基-1-[(1R,2S)-2-十一烷基环丙基]十四烷-5-胺；N,N-二甲基-3-{7-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]庚基}十二烷-1-胺；1-[(1R,2S)-2-庚基环丙基]-N,N-二甲基十八烷-9-胺；1-[(1S,2R)-2-癸基环丙基]-N,N-二甲基十五烷-6-胺；N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十五烷-8-胺；和(11E,20Z,23Z)-N,N-二甲基二十九碳-11,20,23-三烯-10-胺；以及其药学上可接受的盐，和前述任一者的立体异构体。
C12-200阳离子性脂质(1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇))为可离子化脂质，具有以分支的聚合物样结构分布的五个叔胺结构。C12-200的高正净电荷可增加将大RNA分子密封在纳米颗粒核心内。它在商业上销售，用于DNA、RNA和其他荷负电分子的脂质体转染。在本公开的一些方面，DOTAP脂质或其变体与C12-200脂质或其变体组合用于脂质纳米颗粒中以将核酸特异性地递送至肝。C12-200的结构显示如下：
如本文所用，术语“非阳离子性脂质”是指任何中性脂质以及任何阴离子性脂质。“中性脂质”是指在选定pH表现为不带电或中性的两性离子形式的大量脂质物质中的任一者。在生理pH下，此类脂质包括，例如，二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑苷脂和二酰基甘油。“阴离子性脂质”是指在生理pH下荷负电的任何脂质。这些脂质包括但不限于，磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷酰基磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰基磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰基磷脂酰乙醇胺、赖氨酰基磷脂酰甘油、棕榈酰基油酰基磷脂酰甘油(POPG)、和其他接合至中性脂质的阴离子性修饰基团。在一些实施方案中，本公开中使用的非阳离子性脂质为1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DOPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DSPC)、和/或1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)。在多种实施方案中，非阳离子性脂质为胆固醇(CHE)和/或β-谷甾醇。
如本文所用，术语“脂质纳米颗粒”是指纳米尺度颗粒的不同类型的组合物，其中包含脂质的颗粒用作跨越细胞膜和生物屏障的载体并且将化合物递送至所靶向的人和其他生物体的细胞和组织。如本文所用，本公开的“脂质纳米颗粒”可以进一步包含另外的脂质和其他组分。可以包括其他脂质以用于各种目的，诸如防止脂质氧化或将配体附接至脂质纳米颗粒表面上。任何数量的脂质可以存在于本公开的脂质纳米颗粒中，包括两亲性、中性、阳离子性和阴离子性脂质。此类脂质可单独地或组合地使用，并且也可包括双层稳定化组分诸如聚酰胺寡聚物(参见，例如，美国专利号6,320,017)、肽、蛋白质、表面活性剂、脂质衍生物，诸如与磷脂酰乙醇胺偶联的PEG和缀合至神经酰胺的PEG(参见，例如，美国专利号5,885,613)。
如本文所用，抑制颗粒集聚的“PEG”缀合的脂质是指下列中的一种或多种：聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物、聚酰胺(ATTA)-脂质缀合物、和它们的混合物。在一方面中，PEG-脂质缀合物为以下中的一者或多者：PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-二酰基甘油(DAG)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺、和它们的混合物。在一方面中，PEG-DAG缀合物为以下中的一者或多者：PEG-二月桂酰基甘油(C12)、PEG-二肉豆蔻酰基甘油(C14)、PEG-二棕榈酰基甘油(C16)和PEG-二硬脂酰基甘油(C18)。在一方面中，PEG-DAA缀合物为以下中的一者或多者：PEG-二月桂基氧基丙基(C12)、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(C14)、PEG-二棕榈基氧基丙基(C16)和PEG-二硬脂基氧基丙基(C18)。在一些实施方案中，PEG为2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(PEG-DMG)和/或1,2-二硬脂酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(PEG-DSG)。
如本文所用，术语“N/P比”是指阳离子性氨基脂质与核酸的荷负电磷酸根基团之间的氮(N)与磷酸根(P)的比率。
如本文所用，“多分散性指数”或“PDI”为基于尺寸的样品不均匀性的计量标准。多分散性可能由于样品中的尺寸分布或样品在分离或分析期间的团聚或集聚而发生。
如本文所用，“ζ电位”或“表面电荷”是指分散体中邻近的荷类似电荷的颗粒之间的静电排斥。对于足够小的分子和颗粒，高ζ电位将赋予稳定性，即，溶液或分散体将阻止集聚。
如本文所用，术语核酸“运载物”是指用于递送至细胞或组织的预期核酸(在多种实施方案中，为用于递送至细胞或组织的治疗性核酸)。
如本文所用，术语“核酸-脂质纳米颗粒”是指如上文所述的脂质纳米颗粒，其与一种或多种核酸缔合或密封该核酸以将一种或多种核酸运载物递送至组织。
如本文所用，“密封”可以指核酸-脂质纳米颗粒制剂，其提供具有完全密封、部分密封、通过离子力或范德华力缔合、或前述全部的核酸。在一种实施方案中，核酸被完全密封在核酸-脂质纳米颗粒内。
如本文所用，“核酸”是指合成的或天然存在的RNA或DNA或其衍生物。在一种实施方案中，本公开的运载物和/或药剂为核酸，诸如双链RNA(dsRNA)。在一种实施方案中，核酸或核酸运载物为单链DNA或RNA、或者双链DNA或RNA、或者DNA-RNA杂合物。例如，双链DNA可以是结构性基因、包括控制区和终止区的基因、或自我复制系统诸如病毒或质粒DNA。双链RNA可以是例如dsRNA或另一种RNA干扰试剂。单链核酸可以是例如mRNA、反义寡核苷酸、核糖酶、微小RNA、或三螺旋形成寡核苷酸。在某些实施方案中，核酸或核酸运载物可以包括经修饰的RNA，其中该经修饰的RNA为下列中的一种或多种：经修饰的mRNA、经修饰的反义寡核苷酸、和经修饰的siRNA。在一些实施方案中，本公开的核酸运载物包括或为经修饰的mRNA，其编码核酸调节控制物。
如本文所用，术语“经修饰的核酸”是指任何非天然核酸，包括但不限于那些选自包括下列的组的非天然核酸：2'-O-甲基修饰的核苷酸、包含5'-硫代磷酸酯基团的核苷酸、链接至胆固醇基衍生物的末端核苷酸、2'-脱氧-2'-氟修饰的核苷酸、5'-甲氧基-修饰的核苷酸(例如，5'-甲氧基尿苷)、2'-脱氧-修饰的核苷酸、锁核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基-修饰的核苷酸、2'-烷基-修饰的核苷酸、吗啉基核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸；包括以下的核苷间链接或主链：硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、包括3'-亚烷基磷酸酯和手性磷酸酯在内的甲基和其他烷基磷酸酯、次磷酸酯、包括3'-氨基氨基膦酸酯和氨基烷基氨基膦酸酯在内的氨基膦酸酯、硫羰基氨基膦酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯和具有正常3'-5'链接的硼磷酸酯、这些的2'-5'链接的类似物、和具有逆极性的那些，其中核苷单元的相邻对被3'-5'至5'-3'链接或2'-5'至5'-2'链接。
如本文所用，术语“核酸调节控制物”是指编码蛋白质控制物组分的mRNA，但关于“核酸调节控制物”的表述也可以指代表达mRNA的蛋白质控制物组分本身。在某些实施方案中，mRNA编码的蛋白质控制物组分包括锌指蛋白(ZFP)或其他形式的DNA或RNA结合结构域(DBD或RBD)，它们缔合(且任选地系结至)一种或多种表观遗传调节因子或核酸酶(该表观遗传调节因子或核酸酶一般是指效应子、效应子结构域或效应子部分)。不欲受缚于理论，如本文所述的核酸调节控制物的优势为，其仅在以下各处的交汇处提供持久的基因编程：(1)核酸调节控制物编码mRNA被表达之处；(2)ZFP或其他核酸结合结构域的核酸结合发生之处；和(3)所缔合的效应子结构域能够发挥活性之处(即，效应子结构域能够改变表观遗传状态(例如，在表观遗传控制物的情况下)之处)。
如本文所用，术语“效应子部分”或“效应子结构域”是指一种结构域，其能够在被定位至细胞中的适当部位(例如，细胞的细胞核内)时改变靶基因的表达。在一些实施方案中，效应子部分募集转录机构的组分。在一些实施方案中，效应子部分抑制对转录因子或表达抑制因子的组分的募集。在一些实施方案中，效应子部分包括表观遗传修饰部分(例如，在表观遗传上修饰靶DNA序列)。效应子部分的具体示例包括但不限于，能够结合Krueppel缔合盒(KRAB)结构域(KRAB为75个氨基酸左右的结构域，其见于约三分之一的真核细胞Krueppel型C2H2锌指蛋白(ZFP)的N末端部分)和工程改造的原核细胞DNA甲基转移酶MQ1的效应子等。
如本文所用，“表观遗传修饰部分”是指一种结构域，当表观遗传修饰部分适当地定位至核酸(例如，通过靶向部分)时，其改变：i)染色质的结构，例如，二维结构；和/或ii)表观遗传标记物(例如，DNA甲基化、组蛋白甲基化、组蛋白乙酰化、组蛋白sumo化、组蛋白磷酸化和RNA相关的静默中的一者或多者)。在一些实施方案中，表观遗传修饰部分包括酶或其功能性部分或变体，其影响一种或多种表观遗传标记物(例如，增加或减少其水平)。在一些实施方案中，表观遗传修饰部分包括DNA甲基转移酶、组蛋白甲基转移酶、CREB结合蛋白(CBP)、或其任一者的功能性片段。
如本文所用，术语“表达控制序列”是指一种核酸序列，其增加或减少基因的转录，并且包括(但不限于)启动子和增强子。“增强序列”是指表达控制序列的亚型并且增加基因转录的可能性。“静默或抑制物序列”是指表达控制序列的亚型并且减少基因转录的可能性。
如本文所用，术语“表达抑制物”是指一种试剂或实体，其具有一个或多个减少细胞中靶基因的表达并且特异性地结合至DNA序列(例如，与靶基因相关联的DNA序列或可操作地链接至靶基因的转录控制元件)的官能度。在某些实施方案中，表达抑制物包含至少一个靶向部分和任选具有的一个效应子部分。
如本文所用，术语“靶向部分”意指一种试剂或实体，其特异性地靶向(例如，结合)基因组序列元件(例如，表达控制序列或锚序列；启动子、增强子或CTCF位点)。在一些实施方案中，基因组序列元件接近且/或可操作地连接至靶基因(例如，MYC)。
如本文所用，“肝组织”可以指肝器官内的任何细胞或细胞群，包括但不限于肝细胞、血管细胞、内皮细胞、实质细胞、非实质细胞、成纤维细胞、间充质细胞、免疫细胞、癌细胞、库普弗细胞、星形胶质细胞、椭圆形血管内皮细胞和肝源性干/祖细胞。在某些实施方案中，核酸-脂质纳米颗粒靶向肝组织。在一些其他实施方案中，核酸-脂质纳米颗粒可靶向其他细胞或组织，包括但不限于脑、神经、皮肤、眼、咽、喉、心、血管、造血系统(例如，白血细胞或红血细胞)、乳房、肺、胰腺、脾、食管、胆囊、胃、肠、结肠、肾、膀胱、卵巢、子宫、子宫颈、前列腺、肌肉、骨骼、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺和垂体细胞或组织。
如本文所用，“定位”是指本公开的脂质颗粒的脂质、肽或其他组分在生物体和/或组织内的位置。在一些实施方案中，定位在个体细胞中可能是可检测的。在一些实施方案中，标签可用于检测定位，例如，荧光标签，任选地为经荧光标记的脂质，任选地为Cy7。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的标记可以是量子点，或通过受激拉曼散射可检测的脂质。在其他实施方案中，标记为本领域中已知的任何荧光团，即，具有紫外、可见或红外光谱内的激发和发射。在一些实施方案中，定位通过免疫组化或免疫荧光来检测或进一步证实。
如本文所用，术语“活性”是指任何可检测的效应，其由本公开的组分或组合物介导。在多种实施方案中，如本文所用，“活性”可以指可测量的(无论直接地或通过指标)效应，例如，本公开的脂质颗粒的运载物的效应。活性的例子包括而不限于，核酸运载物(例如，mRNA、CRISPR/Cas系统、RNAi剂、核酸调节控制物等)的细胞内表达和所得效应，其可任选地以细胞、组织、器官和/或生物体水平测量。
如本文所用，“加速血液清除”或“ABC”是指一种充分记录的现象，该现象由针对在LNP表面上的PEG分子的免疫系统活化造成。ABC是在重复投药时导致纳米颗粒从全身性循环中清除的原因。在一些实施方案中，本公开的脂质颗粒可通过采用不含PEG的制剂来避免或降低脂质颗粒的加速血液清除，这也可以提供此类脂质颗粒的改善的(例如，更低毒性和/或更有效的)重复全身性给药。如本文所用，“多剂量”是指作为治疗性方案的一部分而给予两个或更多个剂量的纳米颗粒制剂。
如本文所用，术语“肝脏疾病或疾患”可包括而不限于，疾病或疾患诸如甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、脂肪肝病、肝硬化、肝癌(例如，肝细胞癌)、血色素沉着症和威尔森氏病。
如本文所用，术语“受试者”包括人和哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、猪、猫、狗和马)。在众多实施方案中，受试者为哺乳动物，特别是灵长动物，尤其是人。在一些实施方案中，受试者为家畜诸如牛、绵羊、山羊、奶牛、猪等；家禽诸如鸡、鸭、鹅、火鸡等；以及驯养动物，特别是宠物诸如狗和猫。在一些实施方案中(例如，特别是在研究情境中)，受试哺乳动物将是，例如，啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠)、兔、灵长动物或猪诸如近交系猪等。
如本文所用，“给药”至受试者可包括肠胃外给药，任选地，静脉内注射、吸入、静脉内、动脉内、气管内、外用或涉及直接注射至组织内。
术语“治疗/处理”包括给药组合物以阻止或延迟疾病(例如，癌症，包括例如肿瘤形成、生长和/或转移)的症状、并发症或生化指标的发作、减轻症状或者停滞或抑制疾病、病症或疾患的进一步发展。治疗可以是预防性的(以阻止或延迟疾病的发作，或阻止其临床或亚临床症状的表现)或是在疾病表现之后对症状的治疗性抑制或减轻。
如本文所用，“药物组合物”包含药理学有效量的脂质颗粒，任选地包含核酸-脂质纳米颗粒(NLNP)和药学上可接受的载体。如本文所用，“药理学有效量”、“治疗有效量”或简写“有效量”是指在产生预期药理学、治疗性或预防性结果中有效的核酸的量。例如，如果当与疾病或疾患相关联的可测量参数降低至少25％时，给定临床治疗视为有效，则用于治疗该疾病或疾患的药物的治疗有效量为诱导该参数的至少25％降低所必需的量。
术语“药学上可接受的载体”是指用于给药治疗剂的载体。此类载体包括但不限于，盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其组合。
如本文所用，除非具体指定或从上下文明显可见，否则术语“或”理解为包括性的。如本文所用，除非具体指定或从上下文明显可见，否则术语“一”或“该”理解为单数或复数。
本文中，范围可表示为“约”一个特定值和/或至“约”另一特定值。当此范围被表达时，另一方面包括所述一个特定值和/或至所述另一特定值。同样，当值被使用前缀词“约”表达为近似值时，应理解，所述特定值形成另一方面。还应理解，每一个范围的两个端点明显各自与另一端点相关，并且独立于另一端点。也应理解，本文公开很多的值，并且每个值在本文中除了作为该值本身之外，也作为该特定值的“约”值公开。也应理解，贯穿本申请，数据以很多不同格式提供，并且该数据代表终点和起点以及该数据点的任意组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点“15”，则应理解，大于、大于或等于、小于、小于或等于、以及等于10和15也视为公开，并且介于10到15之间也视为公开。也应理解，两个特定单元之间的每个单元也被公开。例如，如果公开了10和15，则11、12、13和14也被公开。
本文提供的范围理解为是该范围内所有值的简写。例如，1至50的范围理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50所组成的群组的任何数字、数字组合或子范围以及介于前述整数之间的全部十进制小数的中间值，例如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9。关于子范围，特别考虑从该范围的任一个端点延伸的“嵌套子范围”。例如，示例性范围1至50的嵌套子范围可包括一个方向上的1至10、1至20、1至30、和1至40，或另一个方向上的50至40、50至30、50至20、和50至10。
连接词“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，是包含的或开放的，并且不排除另外的未引用的元件或方法步骤。相比之下，连接短语“由...组成”排除权利要求中未具体指明的任何元件、步骤或成分。连接短语“基本上由...组成”将权利要求的范畴限制为具体指明的材料或步骤“以及其它不在材料上影响所主张的发明的基本特征和新颖特征的那些”。
下文详述的和权利要求中引用的实施方案可基于上述定义进行理解。
从下述对其优选实施方案的描述以及从权利要求书可明了本公开的其他特征和优势。除非另做定义，否则本文使用的全部科技术语均具有本公开所属领域技术人员通常理解者相同的意义。尽管与本文所述类似或等效的方法和材料可用于实践或测试本公开，但适合的方法和材料描述如下。本文所引的全部公布的外国专利和专利申请通过引用并入本文。本文所引的全部其它已出版参考文献、文档、手稿和科学文献通过引用并入本文。在相互矛盾的情况下，以包括定义在内的本说明书为准。此外，所述材料、方法和实施例仅做例示性说明而非试图限制。
附图说明
以下具体实施方式以举例方式给出而不试图将本公开唯一性地限制为所描述的具体实施方案，并且可以结合附图最佳地理解，其中：
图1A至1C表明用候选可离子化脂质和不同的多价阳离子性聚合物制备的初始混合脂质颗粒的制剂和性质。图1A显示构成这一初始混合颗粒的组分以及表征结果的表格，该组分包括DOPC、MC3、bPEI、CHE和PEG2k-DMG，并且该表征结果包括颗粒尺寸、ζ电位和多分散性指数。图1B显示在用该初始混合脂质颗粒连续处理48小时的时间段后，Hepa1至6细胞的转染后图像。图1C呈现图表，其表明跨不同的添加混合脂质颗粒体积(10μl、5μl和2.5μl)，针对Hepa 1至6细胞观察到的细胞活力(％)的剂量-应答。
图2A至2C显示，混合脂质颗粒将核酸运载物转染到传统上难以转染的细胞群内。图2A呈现表格，其列出“MbP-2”混合脂质颗粒的组分，包括所指示水平的DOPC、MC3、bPEI、CHE和PEG2k-DMG；以及仅MC3脂质颗粒的组分，其包括DOPC、MC3、CHE和PEG2k-DMG.。图2B显示跨分别用对照制剂、混合脂质(MbP-2)纳米颗粒的制剂和仅MC3脂质纳米颗粒的制剂处理的Hepa 1至6细胞的群体观察到的GFP和Cy5信号表达水平的图。值得注意的是，在超过50％的用混合脂质(MbP-2)纳米颗粒处理的细胞中观察到有效的GFP mRNA转染，与之相比，用仅MC3脂质纳米颗粒处理的细胞为16％的GFP mRNA转染率。图2C显示此类被转染细胞群的GFP信号表达分布。值得注意的是，与仅MC3脂质纳米颗粒相比，混合脂质纳米颗粒在被转染细胞中产生平均增加1.5倍的GFP信号，而在经混合脂质纳米颗粒处理的细胞中还观察到此类GFP水平平均比经对照处理的细胞中的GFP信号水平高出20倍。
图3A至3D显示，在经LNP处理的A549人肺癌细胞中，DOTAP/C12-200(DC)混合脂质纳米颗粒(LNP)对于细胞活力的效应。图3A显示混合脂质颗粒的不同制剂(混合物C至混合物N)的组分和所评估的特征的表格。混合脂质颗粒C至N包括C12-200、DOTAP、DOPE、胆固醇(CHE)和(其中混合物J是唯一的例外)PEG2k-DMG。图3B显示直方图，其描述在用不同的混合脂质核酸-脂质颗粒(包括混合物C、混合物D、混合物E、混合物F、混合物G和对照制剂)处理后观察到的A549人肺癌细胞的细胞活力，其中混合脂质颗粒制剂中C12-200的百分比摩尔浓度维持在18％，而这些混合脂质制剂中DOTAP和DOPE的百分比被改变。图3C显示直方图，其描述在用不同的混合脂质核酸-脂质颗粒(包括混合物C、混合物H、混合物I和对照制剂)处理后观察到的A549人肺癌细胞的细胞活力，其中混合脂质颗粒制剂中C12-200的百分比摩尔浓度维持在18％，而这些混合脂质制剂中PEG-脂质的百分比被改变。图3D显示直方图，其描述在用不同的混合脂质核酸-脂质颗粒(包括混合物K、混合物L、混合物M、混合物N和对照制剂)处理后观察到的A549人肺癌细胞的细胞活力，其中混合脂质颗粒制剂中C12-200的百分比摩尔浓度维持在18％，而这些混合脂质制剂中胆固醇相对于DOTAP的百分比被改变。
图4A至4C显示，在经LNP处理的A549人肺癌细胞中，DOTAP/C12-200(DC)混合脂质纳米颗粒(LNP)的转染功效。图4A显示直方图，其描述在用不同的混合脂质核酸-脂质颗粒(包括如上图3A中所列的混合物C、混合物D、混合物E、混合物F、混合物G和对照制剂)处理的A549人肺癌细胞中观察到的被转染的报告物mCherry信号。图4B显示直方图，其描述在用不同的混合脂质核酸-脂质颗粒(包括如上图3A中所列的混合物C、混合物H、混合物I和对照制剂)处理的A549人肺癌细胞中观察到的被转染的报告物mCherry信号。图4C显示直方图，其描述在用不同的混合脂质核酸-脂质颗粒(包括如上图3A中所列的混合物K、混合物L、混合物M、混合物N和对照制剂)处理的A549人肺癌细胞中观察到的被转染的报告物mCherry信号。
图5显示用0.16μg/ml的混合物C处理的A549人肺癌细胞的显微图像，其中蓝色信号指示细胞核，而红色信号指示被转染的mCherry报告物表达。值得注意的是，图像的全部细胞清楚地表达mCherry报告物，甚至在0.16μg/ml的低转染mRNA浓度下也是如此。
图6A和6B显示，混合脂质颗粒在不同的储存条件下是稳定的。图6A显示在4℃或-80℃分别在仅含有水、水和10％蔗糖、仅HEPES缓冲液、以及HEPES缓冲液和10％蔗糖的溶液中储存之前和储存35天后的混合脂质颗粒性质的表格。图6B显示对携带RNA运载物、在4℃(第1列和第2列)或-80℃(第4列和第5列)的水中储存的混合脂质颗粒进行的凝胶电泳的图像。第2列和第5列用2％ Triton X-100处理，其破坏颗粒并且允许游离RNA跑过凝胶。值得注意的是，全部制剂在4℃均保持稳定，而只有含低温保护剂(10％蔗糖)的混合脂质颗粒在-80℃保留了其特征。
图7A至7D显示，将携带mCre mRNA的混合脂质颗粒给药至携带细胞核Cre活化tdTomato(tdTom)报告物的小鼠，导致选择性递送并在肝脏中产生tdTom。图7A显示用来在体内递送mCre mRNA的两种不同混合脂质颗粒的组分和性质的表格，其中组分“C”代表C12-200。图7B显示针对两种混合脂质mCre mRNA颗粒(以1mg/kg给药)在不同器官(肝、肺和脾)中观察到的表达的tdTom信号的图，与作为对照的仅MC3 mCre mRNA颗粒(以3mg/kg给药)进行比较。图7C显示不同器官中tdTom信号的代表性图像。值得注意的是，针对所测试的两种混合脂质颗粒，均观察到了高度特异性的肝活性。图7D显示肝、肺和脾中的针对面积进行归一化的tdTom信号强度的图，其表明，混合脂质mCre mRNA颗粒在体内以比仅MC3 mCre mRNA脂质颗粒对照高80％至100％的速率转染肝细胞。
图8显示所测试的混合脂质颗粒(如上图7A中所述)在肝脏中的细胞缔合。显示了肝样品的免疫组化图像，其证实两种所测试的颗粒均存在tdTomato产生和Cy7标记的颗粒蓄积(两者均染色为棕色)。
图9A至9F显示呈现混合脂质和DOTAP颗粒在小鼠中的肝功能安全性评估测试的图。进行的肝功能测试包括测量：碱性磷酸酶(ALP)水平(图9A)、丙氨酸转氨酶(ALT)水平(图9B)、天冬氨酸转氨酶(AST)水平(图9C)、直接胆红素(DBILI)水平(图9D)、总胆红素(TBILI)水平(图9E)和乳酸脱氢酶(LDH)水平(图9F)。值得注意的是，本公开的混合脂质颗粒鉴定为在1mg/kg mRNA剂量下是安全的。
图10A和10B显示，携带核酸调节控制物(已知诱导VEGFa表达)的混合脂质颗粒在给药至小鼠时稳健地增加血清VEGFa水平。图10A呈现，跨所指示的投药浓度，在给药携带VEGFa调节控制物的混合脂质颗粒DC20182和DC50182后观察到的血清VEGFa水平的直方图，其与经PBS治疗的对照小鼠进行比较。图10B呈现直方图，其显示，跨上图10A的核酸-脂质颗粒观察到的VEGFa水平相对于PBS对照水平的百分比变化。值得注意的是，将处于混合脂质颗粒中的VEGFa调节核酸控制物以三种不同的剂量水平经静脉内给药至小鼠，引发显著增加的血清VEGFa水平，尤其是在1mg/kg剂量水平下，与经对照治疗的小鼠进行比较。
具体实施方式
本公开至少部分地提供混合阳离子性脂质颗粒组合物、制剂和相关方法，用于将脂质颗粒缔合的分子运载物递送至受试者的细胞。在某些方面，提供核酸-脂质纳米颗粒，其优先定位至并将所缔合的核酸运载物递送至受试者的肝脏，且发生递送至受试者肝脏内的各种类型的组织。特别地，本公开的颗粒包括可离子化脂质和一种或多种不同阳离子性脂质的混合物，同时还在某些实施方案中包括非阳离子性“辅助”脂质，辅助脂质是一种结构性脂质(例如，胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物)和/或稳定剂/抗聚集脂质(例如，PEG-脂质)。
核酸疗法对于在基因水平上治疗疾病具有广为人知的巨大潜力。然而，安全有效的递送系统对于核酸治疗剂至关重要。非特异性递送至器官和组织往往导致脱靶效应和毒性。通常，将治疗剂递送至特定目标器官在脂质-纳米颗粒的研发中以及在药物研发中是公认的需求。仅靶向疾病原因而不伤害身体其他部分的概念由Ehrlich在120年前提出。然而，在不引入额外的基于配体的靶向策略的情况下，现有的方法没有提供用于开发靶向特定组织的纳米颗粒的明确或众所周知的方法。因此，如本文现在所公开，在降低脱靶效应和毒性方面，脂质纳米颗粒的基于该脂质与组织的结构性亲和性的器官特异性靶向满足充分建立的需求。
传统的LNP由四种主要组分构成。用于mRNA密封的可离子化或阳离子性脂质、用于增加的功效的两亲性辅助磷脂质、用于结构性稳定性的胆固醇和用于立体稳定性的PEG-脂质。这种第一代LNP可视为“仅一种LNP的可离子化脂质”或“单一LNP”。常规地，有效细胞内递送材料依赖于可离子化胺结合并释放RNA的最佳平衡(pKa介于6.0与6.5之间)和纳米颗粒稳定化疏水性。因此，人们一直致力于开发可离子化脂质，这已被证明是肝脏和肝细胞的高效递送平台。但是，尽管已经验证，改变可离子化/阳离子性脂质的化学结构以实现不同的pKa值以及生成文库，是一项耗时、投资大和劳动力密集的工作。
本文最初设想，使用一种以上的阳离子脂质可以产生具有核酸递送有用性质的独特LNP，通过微调整个系统的pKa以提高细胞内递送功效，并且还可以通过额外脂质的结构亲和力改变单个LNP的趋向性。在本公开的初始研究中，制备混合可离子化脂质/阳离子性聚合物制剂并鉴定为具备适用于使用此类颗粒作为核酸-脂质纳米颗粒递送模式的尺寸和其他特征(包括低的体外细胞毒性)。随后发现，将可离子化脂质与多价阳离子性聚合物(支链聚乙烯亚胺，bPEI)组合的混合脂质颗粒表现出类似的特征，并且也被鉴定为甚至能够将大核酸调节控制物(例如，编码蛋白质控制物组分的mRNA)有效转染至传统上难以转染的细胞群(例如，初代T细胞)。
DOTAP是一种广为人知的季氨脂质，为某些核酸-脂质纳米颗粒(LNP)的结构性组分，这些纳米颗粒最近被描述为表现出肺特异性核酸递送而无需此类LNP中的进一步活性靶向组分。随后制备包括可离子化脂质和DOTAP两者的脂质颗粒作为混合阳离子性脂质，并评定核酸运载物递送的功效以及是否观察到组织特异性递送(而无需关于是否和/或哪些组织特异性/特异性可以被识别的先前知识)。选择C12-200作为可离子化脂质用于此类示例性含DOTAP的混合脂质制剂，但明确预期其他可离子化脂质可替换C12-200而仍得到有效颗粒。在示例性实施方案中，所采用的非阳离子性“辅助脂质”为DOPE(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)，选择它的原因是所描述的其由于形成逆六边形相的能力而通过与内质体膜融合来改善内质体逃逸的能力。先前已经鉴定，向LNP中的不饱和脂质结构添加饱和度改善此类LNP的细胞内活性。同时，胆固醇和PEG2k-DMG水平在当前例示的颗粒中已经维持在与先前所述颗粒中的那些类似的水平。
本文所呈现的数据已经具体地鉴定，将C12-200添加至基于DOTAP的LNP中将此类制剂的趋向性从肺改变为肝，同时也从而表明此类混合LNP在全身性给药时的器官选择性活性。简而言之，据先前报导，具有50％mol DOTAP的LNP，与其颗粒尺寸、表面电荷和PEG化无关，提供稳健的肺靶向，这归因于DOTAP对于肺组织的结构亲和性。本公开已经发现C12-200/DOTAP混合脂质颗粒在肝中的特异性活性，在本文中通过基于报告物的生物分布得以证实并且也在功效研究中得以证实。此外，本文已经描述了采用低水平的C12-200(以减轻C12-200的可能毒性)的混合脂质颗粒制剂的文库。当以18％存在于混合脂质颗粒中，C12-200能够提供肝靶向效应，而无需活性靶向配体。
如上所述，C12-200携带高正净电荷，其可增强将较大RNA分子密封在纳米颗粒核心内(当与每分子仅存在一个胺的其他阳离子性脂质诸如DOTAP和MC3相比时)。因此，强的RNA/C12-200封装可允许对含C12-200颗粒的其余脂质组分和表面电荷进行微调，而不显著影响此类颗粒的总体直径。不欲受缚于理论，含C12-200颗粒在内质体酸性pH下的高正净电荷也可改善将运载物递送至所靶向的细胞的细胞质中，其可归因于质子海绵效应。因此，此类颗粒可以较低治疗剂量提供有效的mRNA转染。本公开的颗粒也为研发混合脂质颗粒的更大文库提供了基础，通过微调此类混合脂质颗粒的组分，现在可预期允许靶向甚至与当前描述的那些不同的器官/组织(最值得注意的是，分别可肠胃外给药的肺特异性和肝特异性颗粒)，而无需采用活性靶向配体。
因此，本公开提供而不限于下列特征和益处：(1)经由引入可离子化脂质(如本文所具体例示的C12-200)将基于DOTAP的颗粒的主要靶器官从肺改变为肝；(2)经由使用此类基于DOTAP的颗粒进行核算运载物/治疗剂的肝特异性递送；(3)预防脱靶毒性(包括通过将示例性C12-200水平维持在低于约20％(高于该水平，则可能预期出现C12-200相关细胞毒性效应)来降低/预防毒性)；(4)当全身性给药(通过IV，如所例示的)时增加的功效，从而提供对于采用DLin-MC3-DMA的广泛使用的肝靶向LNP的改善替代品；和(5)用于颗粒形成的过程是可缩放的和一贯的，允许在用于直接给药的人治疗效性制剂中的可能用途。
尽管本公开的DOTAP/可离子化脂质已经被鉴定为将运载物选择性地递送至肝组织，在一些方面，也考虑到使用本公开的DOTAP/可离子化脂质颗粒或其变体递送至具有渗漏或有孔毛细管的其他区域，诸如关节和/或炎症位点和/或脾。此外，也明确地考虑到经由吸入、外用施加或非静脉内注射给药本公开的颗粒。非限制性地，本公开的核酸-脂质颗粒、药物组合物或注射剂可经由非静脉内途径给药，例如，通过气管内注射、关节内注射、皮下注射、皮内注射和/或肌肉内注射。
本公开某些组合物和方法的多种明确地考虑到的组分在下文额外地详细阐述。
基于DOTAP/C12-200的脂质纳米颗粒(“DC LNP”)组合物
1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)或18:1TAP为阳离子性脂质。DOTAP由于其季铵结构，为一种不依赖于pH的荷阳离子电荷的脂质。DOTAP(C42H80NO4 +)的结构呈现于上。
C12-200(1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇))是一种可离子化脂质，其具有分布在分支链聚合物样结构中的五个季胺结构。C12-200的结构已经呈现于上。
在本公开的脂质颗粒的某些实施方案中，以及在本公开的相关方法中，存在于本公开的脂质纳米颗粒中的总脂质的至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或介于约10％与50％(以摩尔浓度计)为DOTAP。在本公开的脂质颗粒的某些实施方案中，以及在本公开的相关方法中，总脂质的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、介于约5％与约20％之间、少于约20％、介于约12％与约45％之间、或约18％(以摩尔浓度计)为可离子化脂质(例如，C12-200)。在本公开的脂质颗粒的某些实施方案中，以及在本公开的相关方法中，总脂质的至少约0.1％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约40％、至少约60％、介于约24％与约64％之间、约24％、约34％、约44％、约54％或约64％(以摩尔浓度计)为胆固醇、β-谷甾醇和/或其衍生物。在某些实施方案中，总脂质的至少约0.1％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约40％、介于约6％与约46％之间、约6％、约7％、约7.5％、约8％、约16％、约26％、约36％或约46％(以摩尔浓度计)为其他非阳离子性脂质，例如，DOPE、DOPC和/或DSPC。在本公开的脂质颗粒的某些实施方案中，以及在本公开的相关方法中，该颗粒包括抑制颗粒集聚的缀合的脂质，其以存在的总脂质的0.01mol％至约3mol％、约0.5mol％、约1.0mol％、约1.5mol％或约2.0mol％存在。此类缀合的脂质的示例包括而不限于，聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物，例如，PEG2000-脂质缀合物，例如，1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2k)和1,2-二硬脂酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DSG-PEG2k)。
可根据本公开使用任何尺寸的脂质纳米颗粒。在本公开的某些实施方案中，脂质纳米颗粒具有约0.02微米至约0.4微米、介于约0.05与约0.2微米之间或介于0.07与0.12微米之间的直径范围内的尺寸。
在一些实施方案中，LNP也可包括其他阳离子性脂质，该阳离子性脂质包括但不限于包含以下的那些：可质子化的叔胺(例如，pH可滴定的)头部基团；C18烷基链，其中每个烷基链独立地具有0至3个(例如，0、1、2或3个)双键；以及位于该头部基团与烷基链之间的醚、酯或醛键联。此类阳离子性脂质包括但不限于，1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、1,2-二油氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)、1,2-二亚油氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚油烯氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLenDMA)、1,2-二-γ-亚油烯氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(γ-DLenDMA)、1,2-二亚油氧基-酮基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinK-DMA)、1,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLinKC2-DMA)(也称为DLin-C2K-DMA、XTC2和C2K)、2,2-二亚油基-4-(3-二甲基氨基丙基)[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-K-C3-DMA)、2,2-二亚油基-4-(4-二甲基氨基丁基)[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-K-C4-DMA)、1,2-二亚油烯氧基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧杂环戊烷(γ-DLen-C2K-DMA)、1,2-二-γ-亚油烯氧基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧杂环戊烷(γ-DLen-C2K-DMA)、二亚油基甲基-3-二甲基氨基丙酸酯(DLin-M-C2-DMA)(也称为MC2)、4-(二甲基氨基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-酯(DLin-M-C3-DMA)(也称为MC3)和3-(二亚油基甲氧基)-N,N-二甲基丙-1-胺(DLin-MP-DMA)(也称为1-B11)。
在一些实施方案中，本公开的颗粒可以包括中性脂质，例如，二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑苷脂和二酰基甘油。在其他实施方案中，LNP可以包括阴离子性脂质，包括但不限于，磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷酰基磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰基磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰基磷脂酰乙醇胺、赖氨酰基磷脂酰甘油、棕榈酰基油酰基磷脂酰甘油(POPG)、和其他接合至中性脂质的阴离子修饰基团。在一些方面，本公开中使用的非阳离子性脂质为1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DOPC)、和/或1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DSPC)。在一些方面，本发明颗粒中的一种或多种非阳离子性脂质为胆固醇(CHE)、β-谷甾醇和/或其衍生物。
在一些实施方案中采用PEG缀合的脂质，该PEG-缀合的脂质为下列中的一种或多种：聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物、聚酰胺(ATTA)-脂质缀合物、和它们的混合物。在一方面中，PEG-脂质缀合物为以下中的一者或多者：PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-二酰基甘油(DAG)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺、和它们的混合物。在一方面中，PEG-DAG缀合物为以下中的一者或多者：PEG-二月桂酰基甘油(C12)、PEG-二肉豆蔻酰基甘油(C14)、PEG-二棕榈酰基甘油(C16)和PEG-二硬脂酰基甘油(C18)。在一方面中，PEG-DAA缀合物为以下中的一者或多者：PEG-二月桂基氧基丙基(C12)、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(C14)、PEG-二棕榈基氧基丙基(C16)和PEG-二硬脂基氧基丙基(C18)。在一些实施方案中，PEG为2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(PEG-DMG)和/或1,2-二硬脂酰基-rac-甘油-3-甲氧基乙二醇-2000(PEG-DSG)。
在一些实施方案中，两亲性脂质包括在本公开的颗粒中。两亲性脂质可以指任何合适的材料，其中脂质材料的疏水部分朝向疏水相内，而亲水性部分朝向水相。此类化合物包括但不限于，磷脂、氨基脂质和鞘脂。代表性磷脂质包括神经鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱或二亚油酰基磷脂酰胆碱。也可使用其他乏磷化合物，诸如神经鞘脂、糖神经鞘脂家族、二酰基甘油和β-酰氧酸。此外，此类两亲性脂质可轻易地与其他脂质诸如甘油三酸酯和甾醇混合。
也适用于包含在本公开的脂质颗粒中的是可编程的融合脂质制剂。此类制剂具有极低的与细胞膜融合并将其运载物递送的倾向性，直至给定信号事件发生。这使得脂质制剂在注射至生物体内或疾病位点之后在其开始与细胞融合之前更均匀地分布。信号事件可以是例如pH、温度、离子环境或时间的变化。在后一种情况下，融合延迟或“掩盖”组分，诸如ATTA-脂质缀合物或PEG-脂质缀合物，可随着时间推移而简单地从脂质纳米颗粒膜中交换出来。到制剂合适地分布在体内的时间时，它已经失去了足够的掩盖剂，从而是膜融合的。对于其他信号事件，希望选择与疾病部位或靶细胞相关的信号，诸如炎症部位增加的温度。
在某些实施方案中，希望使用对于细胞类型或组织具有特异性的靶向部分来使本公开的脂质颗粒进一步具有靶向性。先前已经描述了使用各种靶向部分诸如配体、细胞表面受体、糖蛋白、维生素(例如，核黄素)和单克隆抗体而造成的脂质纳米颗粒的靶向性(参见，例如，美国专利号4,957,773和4,603,044)。靶向部分可包括完整蛋白质或其片段。
靶向机制一般需要将靶向剂定位在脂质纳米颗粒的表面上，定位方式为使得靶向部分可用于与靶(例如，细胞表面受体)相互作用。多种不同靶向剂和方法是本领域中已知且可获得的，包括例如在Sapra,P.and Allen,T M,Prog.Lipid Res.42(5):439-62(2003)以及Abra,R M et al.,J.Lipid nanoparticle Res.12:1-3,(2002)中描述的那些。
可使用将靶向剂偶联的标准方法。例如，可使用可被活化以用于靶向剂的附接的磷脂酰乙醇胺，或衍生的亲脂性化合物，诸如脂质衍生的博来霉素。靶向抗体的脂质纳米颗粒可使用例如并入蛋白A的脂质纳米颗粒来构建(参见，Renneisen,et al.,J.Bio.Chem.,265:16337-16342(1990)和Leonetti,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),87:2448-2451(1990))。抗体缀合的其他示例在美国专利号6,027,726中公开，其教导通过引用并入本文。靶向部分的示例也可包括对于细胞组分具有特异性的其他蛋白质，包括与瘤形成或肿瘤相关联的抗原。用作靶向部分的蛋白质可以经由共价键附接至脂质纳米颗粒(参见，Heath,Covalent Attachment of Proteins to Lipid nanoparticles,149Methods inEnzymology111-119(Academic Press,Inc.1987))。其他靶向方法包括生物素-亲和素系统。
多种用于制备脂质纳米颗粒的方法为本领域中已知的，包括例如，以下中描述的那些：Szoka,et al.,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,9:467(1980)；美国专利号4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028、4,946,787；PCT公开号WO 91/17424；Deamer and Bangham,Biochim.Biophys.Acta,443:629--634(1976)；Fraley,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:3348--3352(1979)；Hope,et al.,Biochim.Biophys.Acta,812:55--65(1985)；Mayer,et al.,Biochim.Biophys.Acta,858:161--168(1986)；Williams,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,85:242--246(1988)；Lipidnanoparticles,Marc J.Ostro,编,Marcel Dekker,Inc.,New York,1983,第1章；Hope,etal.,Chem.Phys.Lip.,40:89(1986)；和Lipid nanoparticles:A Practical Approach,Torchilin,V.P.et al.,编,Oxford University Press(2003)，以及本文引用的参考文献。合适的方法包括但不限于，超声波处理、挤出、高压/匀浆、微流动、清洁剂透析、小脂质纳米颗粒囊泡的钙诱导融合、以及醚灌注法，其全部是本领域中公知的。
在本公开的一些实施方案中，使用微流体混合工艺制备基于DOTAP/C12-200的LNP。简单地说，在乙醇中以20mg/ml浓度制备DOTAP、C12-200、DOPE、CHE和PEG-DMG的储备液(注意，20mg/ml至80mg/ml的储备液可轻易地用于例如动物研究)。制备并评定了不同的PEG化水平(0至2％)和脂质组成(脂质彼此之间的摩尔比)。在全部制剂中，DOTAP的mol％在10与50之间变动，并通过改变DOPE和/或胆固醇水平来抵消DOTAP水平的变动，同时将C12-200的mol％保持在18。将脂质混合在一起用于在乙醇中的给定组成，其中最终脂质浓度为6.5至8.5mg/mL以用于体外研究，或为15至120mg/mL以用于动物研究。mCherry蛋白质编码mRNA(mCherry)在水相中以0.25至2mg/ml的浓度用作mRNA。在具有交错人字结构的微流体芯片中，使用2:1或3:1水与有机体积比并且以8或12ml/min的流速进行两相的混合和LNP制备。通过分子生物学级水的切向流过滤(TFF)对所得LNP进行纯化和缓冲液交换。或者，使用具有介于8与300kDa之间的MWCO范围的膜针以分子生物学级水对所得LNP进行透析。制剂的表征参数总结在下文和图3A中。对表征参数的精确控制实现了基于DOTAP/C12-200的LNP的制备，其尺寸范围在70至100nm，表面电荷(ζ值)在3与16mV之间，且PDI低于0.22。
根据如本文所公开的以及如本领域所知的方法制备的脂质颗粒在某些实施方案中可在装载药物并给药至患者之前储存实质性的一段时间。例如，在给药之前，脂质纳米颗粒可以经脱水、储存并随后再水合并装载一种或多种活性剂。脂质纳米颗粒亦可在装载有一种或多种活性剂之后脱水。脱水可通过本领域中可获得的各种方法实现，包括例如在美国专利号4,880,635、5,578,320、5,837,279、5,922,350、4,857,319、5,376,380、5,817,334、6,355,267和6,475,517中描述的脱水和冻干过程。在一种实施方案中，使用标准冷冻干燥仪器将脂质纳米颗粒脱水，即，将它们在低压条件下脱水。而且，在脱水之前，可将脂质纳米颗粒例如在液氮中冷冻。可在脱水之前将糖添加至LNP环境例如含有脂质纳米颗粒的缓冲液中，从而促进脂质纳米颗粒在脱水期间的完整性。参见，例如，美国专利号5,077,056或5,736,155。
脂质纳米颗粒可在其制备期间的任何时间点通过常规方法无菌化，时间点包括例如在筛分后或在产生pH梯度后。
装载运载物的脂质颗粒组合物
在各种实施方案中，本公开的脂质颗粒可用于多种不同应用中，包括将活性剂递送至细胞、组织、器官或受试者。例如，本公开的脂质纳米颗粒可用于将治疗剂经由血流而全身性地递送或将美容剂递送至皮肤。因此，本公开的脂质纳米颗粒以及作为运载物的一种或多种活性剂包括在本公开中。
脂质颗粒运载物
本公开描述与作为运载物的活性剂组合的混合阳离子性脂质纳米颗粒(即，包括可离子化脂质(例如，C12-200)和另一阳离子性脂质(例如，DOTAP)的脂质纳米颗粒))。如本文所用，活性剂包括能够对细胞、组织、器官或受试者发挥所希望效应的任何分子或化合物。此类效应可以是例如生物学的、生理学的或美容的。活性剂可以是任何类型的分子或化合物，包括例如，核酸诸如单链或双链多核苷酸、质粒、反义RNA、RNA干扰剂，包括例如DNA-DNA杂交物、DNA-RNA杂交物、RNA-DNA杂交物、RNA-RNA杂交物、短干扰RNA(siRNA)、微小RNA(mRNA)和短发夹RNA(shRNA)；肽和多肽，包括，例如抗体，诸如例如多克隆抗体、单克隆抗体、抗体片段；人源化抗体、重组抗体、重组人抗体和PrimatizedTM抗体、细胞因子、生长因子、凋亡因子、分化诱导因子、细胞表面受体及其配体；激素；以及小分子，包括有机小分子或化合物。
与LNP缔合或由其密封的核酸可含有修饰，包括但不限于选自下列组的那些：2'-O-甲基修饰的核苷酸、包含5'-硫代磷酸酯基团的核苷酸、链接至胆固醇基衍生物的末端核苷酸、2'-脱氧-2'-氟修饰的核苷酸、5'-甲氧基-修饰的核苷酸(例如，5'-甲氧基尿苷)、2'-脱氧-修饰的核苷酸、锁核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基-修饰的核苷酸、2'-烷基-修饰的核苷酸、吗啉基核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸；包括以下的核苷间链接或主链：硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、包括3'-亚烷基磷酸酯和手性磷酸酯在内的甲基和其他烷基磷酸酯、次磷酸酯、包括3'-氨基氨基膦酸酯和氨基烷基氨基膦酸酯在内的氨基膦酸酯、硫羰基氨基膦酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯和具有正常3'-5'链接的硼磷酸酯、这些的2'-5'链接的类似物、和具有逆极性的那些，其中核苷单元的相邻对被3'-5'至5'-3'链接或2'-5'至5'-2'链接。
在某些实施方案中，活性剂为mRNA或能够在细胞内表达mRNA的载体。
在多种实施方案中，活性剂为CRISPR/Cas系统。任选地，本公开的LNP可配制为包括例如向导链(gRNA)和Cas酶两者作为运载物，从而提供自包含的递送媒介物，其能够影响并控制基因在靶细胞中的CRISPR介导的靶向。
在某些特征实施方案中，活性剂为核酸调节控制物(例如，编码蛋白质控制物组分的mRNA，如上所述)。
在一些实施方案中，活性剂为治疗剂或其盐或衍生物。治疗剂衍生物本身可以是治疗活性的或它们可以是前药，其在进一步修饰后变为活性的。因此，在一种实施方案中，与未经修饰的药剂相比，治疗剂衍生物保留一些或全部治疗活性，而在另一实施方案中，治疗剂衍生物缺乏治疗活性。
在各种实施方案中，治疗剂包括药剂和药物，诸如抗炎化合物、麻醉剂、镇定剂、抗抑郁药物、兴奋剂、致幻剂、镇痛剂、抗生素、避孕药、退热药、血管舒张药、抗血管生成药、细胞血管药物、信号转导抑制剂、血管收缩药、激素和类固醇。
在某些实施方案中，活性剂为肿瘤学药物，其也可称为抗肿瘤药物、抗癌药、肿瘤药物、抗瘤形成药等。可根据本公开使用的肿瘤学药物的示例包括但不限于，亚德里亚霉素、马法兰、别嘌醇、六甲蜜胺、氨磷汀、阿那曲唑、araC、三氧化二砷、硫唑嘌呤、蓓萨罗丁、biCNU、博来霉素、白消安静脉剂型、白消安口服型、卡培他滨(Xeloda)、卡铂、卡莫司汀、CCNU、塞来昔布、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、环孢菌素A、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、道诺霉素、环磷酰胺、柔红霉素、地塞米松、右雷佐生、多西他赛、多柔比星、DTIC、表柔比星、雌莫司汀、磷酸依托泊苷、依托泊苷和VP-16、依西美坦、FK506、氟达拉滨、氟尿嘧啶、5-FU、吉西他滨(Gemzar)、吉姆图珠单抗奥泽加明、醋酸戈舍瑞林、羟脲、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、甲磺酸伊马替尼、干扰素、伊立替康(Camptostar、CPT-111)、来曲唑、亚叶酸、克拉他滨注射液(leustatin)、亮丙瑞林、左旋咪唑、利瑞宁(litretinoin)、甲地孕酮、美法仑、L-PAM、美司钠、氨甲蝶呤、甲氧沙林、光神霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、氮芥、紫杉醇、帕米膦酸盐、培加酶、喷司他丁、卟吩姆钠、强的松、美罗华、链脲佐菌素、STI-571、它莫西芬、泰素帝、替莫唑胺、替尼泊苷、VM-26、拓扑替康(Hycamtin)、托瑞米芬、维甲酸、ATRA、戊柔比星、长春花碱、长春碱、长春新碱、VP16和长春瑞滨。可根据本公开使用的肿瘤学药物的其他示例为玫瑰树碱(ellipticin)和玫瑰树碱类似物或衍生物、埃博霉素、细胞内激酶抑制剂和喜树碱。
尽管本公开的LNP组合物一般包含单一活性剂，但在某些实施方案中，它们可包含超过一种活性剂。
在本公开的其他实施方案中，本公开的脂质纳米颗粒具有至少0.5、0.8、1.2、1.5、2.0、4.0、6.0、8.0或12小时的血浆循环半衰期。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有至少0.5、0.8、1.2、1.5、2.0、4.0、6.0、8.0或12小时的血浆药物半衰期。循环和血液或血浆清除半衰期可按照例如美国专利公开号2004-0071768-A1中描述的进行测定。
本公开还提供套组形式的脂质纳米颗粒及其变体。该套组可包括即用型制剂或需要在给药前混合的制剂。该套组通常将包括容器，该容器被划分以容纳该套组的各种元件。该套组将含有水合或脱水形式的本公开的脂质纳米颗粒组合物或其组分，以及关于其再水合和给药的说明。在特定实施方案中，套组包括至少一个容纳装载有活性剂的本公开的脂质纳米颗粒的隔室。在另一实施方案中，套组包括至少两个隔室，一个容纳本公开的脂质纳米颗粒，而另一个容纳活性剂。当然，应理解，这些套组中的任一者可包括额外的隔室，例如，包括缓冲液的隔室，诸如美国专利公开号2004-0228909-A1中描述的那些。本公开的套组包括包含混合阳离子性脂质(例如，可离子化脂质诸如C12-200和其他阳离子性脂质诸如DOTAP)的脂质纳米颗粒，也可含有美国专利公开号2004-0228909A1中描述的套组的其他特征。再者，该试套组可包括处于一个隔室中的装载药物的脂质纳米颗粒和处于第二隔室中的空脂质纳米颗粒。或者，该套组可含有本公开的脂质纳米颗粒、处于第二隔室中的待装载到本公开的脂质纳米颗粒中的活性剂、和处于第三隔室中的空脂质纳米颗粒。
在特定实施方案中，本公开的套组包括密封在包含C12-200和DOTAP两者的混合脂质纳米颗粒中的治疗性化合物，其中C12-200构成存在于脂质纳米颗粒中的总脂质的5％至20％(以摩尔浓度计)并且DOTAP占存在于脂质纳米颗粒中的总脂质的10％至50％(以摩尔浓度计)，以及空脂质纳米颗粒。在一种实施方案中，含有治疗性化合物的脂质纳米颗粒和空脂质纳米颗粒存在于套组的不同隔室中。
脂质颗粒介导的运载物递送的功效
在某些实施方案中，本公开至少部分地基于以下令人惊奇的结果：含有10％至50％(摩尔/重量)DOTAP与18％ C12-200脂质颗粒混合的颗粒在将活性核酸运载物(甚至包括大核酸调节控制物)相对于其他组织递送至肝的细胞内方面高度有效。再者，与其他组织相比，密封的活性剂(运载物)例如mRNA的报告物活性几乎排他性地在肝组织中出现，并且也表明了此类运载物的核定位和功效。脂质颗粒的定位的功效可以描述为定位至受试者特定组织的核酸-脂质颗粒相对于该受试者的一种或多种其他组织的倍数差异(增加或减少)。作为评定递送的另一组分的活性功效可以描述为活性剂(例如，核酸运载物或其他化合物)在受试者特定组织细胞内的活性相对于在该受试者的一种或多种其他组织细胞中观察到的活性的倍数差异(增加或减少)。在一些实施方案中，该倍数差异可因此以细胞水平检测，或可通过针对以细胞水平发生的事件的适当指标来检测。在一些实施方案中，被影响的肝组织的细胞为下列中的一种或多种：肝细胞、血管细胞(即，肝窦)、肝星状细胞、内皮细胞、成纤维细胞、间充质细胞、免疫细胞、癌细胞、库普弗细胞、星形胶质细胞、椭圆形血管内皮细胞、肝源性干/祖细胞、和源自非肝组织的干/祖细胞或癌细胞。在一些实施方案中，效应/活性的倍数差异可以亚细胞水平检测，即，在活性可以在所靶向细胞的核内检测的情况下。
为了确定LNP的定位功效，可根据所标记或检测的感兴趣分子的特征进行测定。在本公开的例示性实施方案中，荧光标记的脂质已经用于确定LNP定位。在其他实施方案中，可使用标记的肽或脂质颗粒的其他组分。在一些实施方案中，定位在个体细胞中是可检测的。在一些实施方案中，标记为荧光标记，即，荧光标记的脂质诸如Cy7。在其他实施方案中，脂质纳米颗粒的标记可以是量子点，或通过受激拉曼散射可检测的脂质。在其他实施方案中，标记为本领域中已知的任何荧光团，即，具有紫外、可见或红外光谱内的激发和发射。在一些实施方案中，通过免疫组化或免疫荧光方法来检测或进一步证实定位。
定位的功效可以描述为定位至受试者的组织(即肝组织)的核酸-脂质颗粒相对于该受试者的一种或多种其他组织的倍数差异(增加或减少)。在本公开的例示性实施方案中，对Cy7标记的脂质进行体内成像，并且荧光辐射率充当Cy7-LNP浓度的指标(参见下文实施例6)。Cy7-DOPE标记的DOTAP/C12-200核酸LNP表现出相对于定位到其他组织特别是相对于肺、心和脾增加的定位到肝的功效。在本公开的一些实施方案中，相对于定位到肺、心或脾，Cy7标记的核酸LNP表现出至少两倍的定位到肝。在一些实施方案中，相对于定位到肺、心和脾，Cy7标记的核酸LNP表现出至少三倍的定位到肝，在一些实施方案中，Cy7标记的核酸LNP表现出至少四倍的定位到肝，在一些实施方案中，Cy7标记的核酸LNP表现出至少五倍的定位到肝，在一些实施方案中，Cy7标记的核酸LNP表现出至少六倍的定位到肝，在一些实施方案中，Cy7标记的核酸LNP表现出至少十倍的定位到肝，在一些实施方案中，Cy7标记的核酸LNP表现出至少十五倍的定位到肝，在一些实施方案中，Cy7标记的核酸LNP表现出至少二十倍的定位到肝。
为了确定由脂质颗粒密封的活性剂的活性功效，可根据活性剂的特征进行测定。在某些实施方案中，混合脂质颗粒中的活性剂为核酸。在其他实施方案中，混合脂质颗粒中的活性剂为小分子或其他化合物。
在一些实施方案中，混合脂质颗粒中的活性剂为mRNA。在例示性实施方案中，报告物mRNA即mCherry的局部化表达充当关于mRNA作为活性剂/运载物的细胞内递送功效的指标。在其他实施方案中，mRNA可编码Cre酶(如经由本文实施例6的tdTomato报告物系统证实运载物mRNA的核递送和活性中所使用的)、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白或蓝色荧光蛋白。或在治疗性实施方案中，mRNA可编码蛋白质以在受试者的LNP靶向细胞中进行治疗性细胞内表达(包括核酸调节控制物的递送和表达)，任选地所递送的mRNA或所编码的蛋白质的细胞内水平可通过本领域已知适合于所递送的治疗性mRNA的方法检测，。在其他实施方案中，报告物mRNA编码细胞表面标志物诸如Lyt2细胞表面标志物。在又其他实施方案中，报告物可以是β-半乳糖苷酶、α-内酰胺酶、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。在其他实施方案中，报告物mRNA编码阴性选择标志物诸如胸苷激酶(tk)、HRPT或APRT。在一些实施方案中，使用免疫组化或免疫荧光来检测或证实报告物mRNA的活性。
在某些实施方案中，本公开的脂质颗粒在递送运载物中的有效性是基于在脂质颗粒靶向组织内观察到的细胞内运载物(活性剂)活性的水平进行评定。此类效应可以鉴定为与适当的对照制剂和/或组织相比的活性的倍数差异，例如，具有核酸运载物的LNP的递送功效可描述为核酸运载物在受试者的靶组织(即肝组织)的细胞中的活性相对于该受试者的一种或多种其他组织的倍数差异(增加或减少)。因此，对于某些核酸运载物，LNP制剂的递送功效可以描述为一种LNP，其实现例如比在非靶向组织细胞中或相对于不包括该核酸运载物的LNP制剂高出两倍的在靶向组织细胞中的核酸载荷的细胞内活性。任选地，用于递送核酸运载物的有效LNP制剂可描述为一种制剂，其实现比在非靶向组织细胞中或相对于不包括该核酸运载物的LNP制剂高出至少约三倍、任选地高出约四倍、任选地高出约五倍、任选地高出约六倍、任选地高出约七倍、任选地高出约八倍、任选地高出约九倍、任选地高出约十倍、任选地高出约二十倍、任选地高出约50倍、任选地高出约100倍等的在靶向组织细胞中的核酸载荷的细胞内活性。在本公开的示例性实施方案中，混合脂质颗粒递送mCremRNA，其在受试者的肝组织细胞内以显著高于在该受试者的肺、心和脾细胞内的水平表达(参见下文实施例6)。表达mCre的细胞通过对Cre表达应答性tdTomato报告物成像来检测。在一些实施方案中，Cre mRNA在受试者的肝组织细胞内以比在该受试者的肺、心和脾细胞内的mRNA表达高出至少两倍的水平表达。在一些实施方案中，运载物mRNA在受试者的肝组织细胞内以比在该受试者的肺、心和脾细胞内的mRNA表达高出至少三倍的水平表达。在一些实施方案中，与受试者的肺、心和脾细胞内的运载物mRNA表达相比，荧光素酶mRNA在肝内的表达高出至少四倍，在一些实施方案中，荧光素酶mRNA在肝内的表达高出至少五倍，在一些实施方案中，在肝内高出至少六倍，在一些实施方案中，在肝内高出至少七倍，在一些实施方案中，在肝内高出至少八倍，在一些实施方案中，在肝内高出至少九倍，在一些实施方案中，在肝内高出至少十倍，在一些实施方案中，在肝内高出至少十一倍，在一些实施方案中，在肝内高出至少十二倍，在一些实施方案中，在肝内高出至少十三倍，在一些实施方案中，在肝内高出至少十四倍，在一些实施方案中，在肝内高出至少十五倍，在一些实施方案中，在肝内高出至少二十倍。
在其他实施方案中，混合脂质颗粒可用于将RNAi剂(例如，siRNA)递送至组织，即肝组织。对于siRNA或其他RNAi剂，递送和活性功效测量可采用例如靶特异性PCR来检测转录物水平，采用免疫吸附或其他免疫方法来检测靶蛋白水平，和/或流式细胞术(FACS)(Testoni etal.,Blood 1996,87:3822.)。在一些实施方案中，siRNA在受试者的肝组织细胞内的活性水平比在该受试者的肺、心、脾、卵巢、胰、肾和/或其他非肝器官或组织的细胞中的水平高出至少两倍。在一些实施方案中，siRNA在受试者的肝组织细胞内的活性水平比在该受试者的肺、心、脾、卵巢、胰、肾和/或其他非肝器官或组织的细胞中的水平高出至少三倍。在一些实施方案中，与在受试者的肺、心、脾、卵巢、胰、肾和/或其他非肝器官或组织的细胞内的siRNA活性相比，siRNA在肝内的活性水平高出至少四倍，在一些实施方案中，siRNA在肝内的活性水平可以高出至少五倍，在一些实施方案中，siRNA在肝内的活性水平可以高出至少六倍，在一些实施方案中，在肝内高出至少七倍，在一些实施方案中，在肝内高出至少八倍，在一些实施方案中，在肝内高出至少九倍，在一些实施方案中，在肝内高出至少十倍，在一些实施方案中，在肝内高出至少十一倍，在一些实施方案中，在肝内高出至少十二倍，在一些实施方案中，在肝内高出至少十三倍，在一些实施方案中，在肝内高出至少十四倍，在一些实施方案中，在肝内高出至少十五倍，在一些实施方案中，在肝内高出至少二十倍。在相关实施方案中，与非靶向组织相比或与一些其他适当的对照(例如，未处理的肝组织细胞中的靶转录物的水平)相比，将RNAi运载物优先递送至肝的混合脂质颗粒可在靶向的肝组织细胞内表现出靶转录物和/或蛋白质水平的大于20％的降低。任选地，与非靶向组织相比或与一些其他适当的对照(例如，未处理的肝组织细胞中的靶转录物的水平)相比，将RNAi运载物优先递送至肝的混合脂质颗粒可在靶向的肝组织细胞内表现出靶转录物和/或蛋白质水平的例如超过30％的降低、超过40％的降低、超过50％的降低、超过60％的降低、超过70％的降低、超过80％的降低、超过90％的降低、超过95％的降低、超过97％的降低、超过97％的降低、超过98％的降低或超过99％的降低。
在一些实施方案中，本公开的混合脂质颗粒可用于将CRISPR-Cas9系统递送至组织，即肝组织。CRISPR-Cas9递送和活性功效测量可能需要例如PCR来检测Cas9、靶向区的基因组结构和/或靶转录物水平，需要免疫吸附或其他免疫方法来检测Cas9或敲入、敲除、或靶蛋白的其他修饰，且/或需要流式细胞术(FACS)(Testoni et al.,Blood 1996,87:3822.)。在一些实施方案中，可以在受试者的肝组织内鉴定出比在该受试者的肺、心、脾、卵巢、胰、肾和/或其他非肝器官或组织的细胞中高出至少两倍的CRISPR-Cas9介导的效应。在一些实施方案中，可以在受试者的肝组织内鉴定出比在该受试者的肺、心、脾、卵巢、胰、肾和/或其他非肝器官或组织的细胞中高出至少三倍的CRISPR-Cas9介导的效应。在一些实施方案中，与受试者的肺、心、脾、卵巢、胰、肾和/或其他非肝器官组织的细胞内的CRISPR-Cas9介导的效应相比，在该受试者的肝细胞内鉴定出的CRISPR-Cas9介导的效应水平高出至少四倍，在一些实施方案中，在肝细胞中鉴定出的CRISPR-Cas9介导的效应水平高出至少五倍，在一些实施方案中，在细胞中鉴定出的CRISPR-Cas9介导的效应水平高出至少六倍，在一些实施方案中，在细胞中鉴定出的CRISPR-Cas9介导的效应水平高出至少七倍，在一些实施方案中，高出至少八倍，在一些实施方案中，高出至少九倍，在一些实施方案中，高出至少十倍，在一些实施方案中，高出至少十一倍，在一些实施方案中，高出至少十二倍，在一些实施方案中，高出至少十三倍，在一些实施方案中，高出至少十四倍，在一些实施方案中，高出至少十五倍，在一些实施方案中，高出至少二十倍。
在其他实施方案中，混合脂质颗粒可将mRNA或其他核酸运载物递送至组织，即肝组织，其中表达和可能的活性在细胞核内发生。在本公开中，一些实施方案已经利用Cre重组酶作为关于活性剂的核活性的报告物(参见下文实施例6)。Cre重组酶需要所编码的蛋白质易位到细胞核并因此可充当核易位的报告物。Cre重组酶催化DNA在loxP位点之间的位点特异性重组。当由于loxP重组而进行Cre重组酶活性表达时，表达了报告物荧光蛋白。在一种实施方案中，Ai14小鼠系使用插入Gt(ROSA)26Sor基因座内的Cre报告物(侧翼为loxP的STOP匣)来防止CAG启动子驱动的红色荧光蛋白变体(tdTomato)的转录。Ai14小鼠经静脉注射装载mCre的DOTAP-LNP，并且在递送并表达Cre酶、Cre酶的核易位和后续的tdTomato启动子的Cre介导的重组之后，开始在肝细胞的细胞核中表达强劲的tdTomato荧光。在示例性实施方案中，在肝细胞的细胞核内观察到了活性的功效，即在细胞核内可检测的mRNA表达，其水平比肺、心和脾细胞中的水平高出至少两倍。在一些实施方案中，在肝细胞的细胞核内观察到了在细胞核内可检测的mRNA表达，其水平比肺、心和脾细胞中的水平高出至少三倍。在一些实施方案中，在肝细胞的细胞核中可观察到可检测的mRNA表达，与在肺、心和脾细胞的细胞核中可检测的mRNA活性相比，其水平高出至少四倍，在一些实施方案中，其水平高出五倍，在一些实施方案中，高出六倍，在一些实施方案中，高出七倍，在一些实施方案中，高出八倍，在一些实施方案中，高出九倍，在一些实施方案中，高出十倍，在一些实施方案中，高出十一倍，在一些实施方案中，高出十二倍，在一些实施方案中，高出十三倍，在一些实施方案中，高出十四倍，在一些实施方案中，高出十五倍，在一些实施方案中，高出二十倍。
在其他实施方案中，混合脂质颗粒可以将小分子或其他化合物递送至组织，即肝组织。小分子的定位或活性功效可通过大量体内成像方法(例如，PET/CT)、质谱以及靶效应的免疫组化和免疫荧光来确定。在一些实施方案中，混合脂质颗粒介导的小分子在肝内的定位和/或活性可能比在其他组织内例如比在肺、心、肾、卵巢、胰或其他组织内，任选地比在脾内高出两倍。在一些实施方案中，混合脂质颗粒介导的小分子在肝内的定位和/或活性可能比在其他组织内高出三倍，比在其他组织内例如比在肺、心、肾、卵巢、胰或其他组织内，任选地比在脾内高出四倍、高出五倍、高出六倍、高出七倍、高出八倍、高出九倍、高出十倍、高出十一倍、高出十二倍、高出十三倍、高出十四倍、高出十五倍或高出二十倍。
在某些实施方案中，经配制用于肝递送的脂质颗粒是指一种脂质颗粒，其表现出，与受试者的一种或多种其他组织的细胞相比，运载物优先定位和细胞内递送至肝细胞(基于对细胞内活性的直接测量或通过指标的测量)。例如，用于肝递送的脂质颗粒为一种脂质颗粒，其能够在受试者的肝细胞内引起比该受试者的其他组织内高出至少两倍的运载物(例如，核酸运载物，例如mRNA、CRISPR/Cas系统、核酸调节控制物等)活性。在受试者肝细胞内的此类效应可在肝的一种或多种细胞类型内评估，如本文别处所述。在某些实施方案中，用于肝递送的脂质颗粒为一种脂质颗粒，其能够在受试者的肝细胞内引起比该受试者的其他组织内高出至少三倍、高出至少四倍、高出至少五倍、高出至少六倍、高出至少七倍、高出至少八倍、高出至少九倍、高出至少十倍、高出至少十五倍、高出至少二十倍、高出至少三十倍、高出至少40倍、高出至少50倍、高出至少60倍、高出至少70倍、高出至少80倍、高出至少90倍、高出至少100倍、高出至少1000倍等的运载物(例如，核酸运载物，例如mRNA、CRISPR/Cas系统、核酸调节控制物等)活性。
在又其他实施方案中，不使用PEG修饰的脂质来配制的混合脂质颗粒可减少或避免加速血液清除效应(ABC)，其中免疫系统靶向PEG进行去除。
LNP介导的运载物递送
本文所公开的脂质颗粒组合物可用于各种目的，包括将活性剂或治疗剂或化合物递送至有此需要的受试者或患者。受试者包括人和非人动物两者。在某些实施方案中，受试者为哺乳动物。在其他实施方案中，受试者为一种或多种特定物种或培育动物，包括例如人、小鼠、大鼠、狗、猫、牛、猪、绵羊或鸟。
因此，本公开也提供用于各种疾病和疾患的治疗方法，以及旨在提供美容益处的方法。
治疗方法
本公开的LNP组合物可用于治疗多种疾病或疾患中的任一者，该疾病或疾患包括但不限于，炎症性疾病、心血管疾病、神经系统疾病、肿瘤、脱髓鞘疾病、消化系统疾病、内分泌系统疾病、生殖系统疾病、血液和淋巴疾病、免疫性疾病、精神障碍、肌肉骨骼疾病、神经疾病、神经肌肉疾病、代谢疾病、性传播疾病、皮肤和结缔组织疾病、泌尿道疾病和感染。
在某些实施方案中，LNP组合物可用于治疗或预防肝疾病或疾患，包括但不限于选自下列的疾病或疾患：胆道闭锁、先天性肝内胆管发育不良综合征、α-1抗胰蛋白酶缺乏、酪氨酸血症、新生儿肝炎、丙型肝炎病毒感染、乙型肝炎病毒感染、甲型肝炎病毒感染、肝细胞癌和威尔森氏病。
在其他实施方案中，本公开的LNP组合物可用于治疗或预防关节疾病或疾患，包括但不限于选自下列的疾病或疾患：类风湿性关节炎、银屑病关节炎、痛风、肌腱炎、滑囊炎、腕管综合征和骨关节炎。
在其他实施方案中，本公开的LNP组合物可用于治疗或预防炎症性疾病或疾患，包括但不限于选自下列的疾病或疾患：炎症性肠病、腹膜炎、骨髓炎、恶病质、胰腺炎、创伤引起的休克、支气管哮喘、过敏性鼻炎、囊性纤维化、急性支气管炎、急性剧烈支气管炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、感染性关节炎、感染后关节炎、淋病性关节炎、结核性关节炎、关节炎、骨关节炎、痛风、脊柱关节病、强制性脊柱炎、与血管炎综合征相关的关节炎、结节性神经性多动脉炎、易激血管炎、化脓性肉芽肿病、类风湿性息肉病肌痛、关节炎细胞动脉炎，钙性多囊关节病、腐蚀性痛风、非关节炎性风湿病、滑囊炎、花粉热、化脓性炎症(例如，网球肘)、神经性关节病、关节积血、过敏性紫癜、肥大性骨关节炎、多发性痔疮、脊柱侧弯、血色素沉着症、高脂蛋白血症、低丙种球蛋白血症、COPD、急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤、支气管肺发育不良和系统性红斑狼疮(SLE)。
在其他实施方案中，本公开的LNP组合物可用于治疗或预防表皮疾病或疾患，包括但不限于银屑病、特应性皮炎、硬皮病、湿疹、酒渣鼻、脂溢性皮炎、黑色素瘤、日光性角化病、鱼鳞病、短暂性棘皮松解皮肤病、常见疣、角化棘皮瘤和脂溢性角化症。
在一种实施方案中，本公开的LNP组合物可用于治疗或预防一种类型的癌症。特别地，这些方法可用于血液和淋巴系统的癌症，包括淋巴瘤、白血病和骨髓瘤。可根据本公开治疗的具体癌症的示例包括但不限于，霍奇金和非霍奇金淋巴瘤(NHL)，包括根据各种分类系统(诸如操作制式化(Working formulation)、拉帕波特(Rappaport)分类和优选的REAL分类)中任一者定义的任何类型的NHL。此类淋巴瘤包括但不限于，低恶性度、中恶性度和高恶性的淋巴瘤，以及B细胞淋巴瘤和T细胞淋巴瘤两者。这些类别中包括各种类型的小细胞淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、裂解细胞淋巴瘤、淋巴细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、NK细胞淋巴瘤、CNS淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、成淋巴细胞淋巴瘤、成人成淋巴细胞淋巴瘤、惰性淋巴瘤、侵袭性淋巴瘤、转化性淋巴瘤和其他类型的淋巴瘤。本公开的方法可用于成年或儿童形式的淋巴瘤，以及处于任何分期例如I、II、III或IV期的淋巴瘤。各种类型的淋巴瘤是本领域技术人员已知的，并且由例如美国癌症学会描述(参见，例如，www3.cancer.org)。
本文所述的组合物和方法也可用于任何类型的白血病，包括成年和儿童形式的该疾病。例如，任何急性、慢性、骨髓性和淋巴细胞性形式的该疾病可使用本公开的方法治疗。在优选的实施方案中，该方法用于治疗急性淋巴细胞性白血病(ALL)。关于各种类型的白血病的更多信息可见于美国白血病学会等(参见，例如，www.leukemia.org)。
另外类型的肿瘤也可使用本文所述的方法治疗，诸如成神经细胞瘤、骨髓瘤、前列腺癌、小细胞肺癌、结肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、脑肿瘤、乳癌等。
本公开的LNP组合物可作为第一线治疗或作为次要治疗给药。此外，它们可作为主要化疗治疗或作为辅助或新辅助化疗给药。例如，治疗复发性、惰性、转化性和侵袭性形式的非霍奇金淋巴瘤可在至少一个疗程的主要抗癌治疗诸如化疗和/或放射疗法后给药。
LNP组合物的给药
本公开的LNP组合物以多种方式中的任一种给药，包括肠胃外、静脉内、全身性、局部、口服、肿瘤内、肌肉内、皮下、腹膜内、吸入或任何此类递送方法。在一种实施方案中，组合物经肠胃外给药，即，关节内、静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内给药。在具体实施方案中，LNP组合物通过静脉输液或通过快速静脉注射腹膜内给药。例如，在一种实施方案中，历经例如5至10分钟、15至20分钟、30分钟、60分钟、90分钟或更久通过静脉输液管路将脂质纳米颗粒密封的活性剂以静脉输液给予患者。在一种实施方案中，使用60分钟的输液。在其他实施方案中，使用6至10分钟或15至20分钟范围内的输液。此类输液可以周期性地给予，例如，每1、3、5、7、10、14、21或28天或更久一次，优选地每7至21天一次，且优选地每7或14天一次。
本公开的LNP组合物可以配制为适用于递送至受试者的药物组合物。本公开的药物组合物往往将进一步包含一种或多种缓冲液(例如，中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)；碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖、右旋糖或右旋糖酐)；甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；抗细菌剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；使得制剂与接纳者的血液等渗、低渗或弱高渗的溶质；悬浮剂；增稠剂；和/或防腐剂。或者，本公开的组合物可以配制为冻干物质。
药物制剂中药物和脂质纳米颗粒的浓度可以大幅度改变，即，以重量计，从小于约0.05％，一般为或至少约2％至5％到多达10％至30％，并且将依据所使用的特定药物、被治疗的疾病和临床医生所采取的判断而选择。再者，药物和脂质纳米颗粒的浓度也将考虑所给药的流体体积、所给药的溶液渗透压、和该药物和脂质纳米颗粒的耐受性。在一些情况下，可能优选的是使用较低的药物或脂质纳米颗粒浓度以降低输液相关副作用的发生率或严重程度。
用于本公开的合适制剂可见于，例如，《雷明顿药物科学》(Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Philadelphia,Pa.,17thEd.(1985))中。通常，静脉内组合物将包含脂质纳米颗粒悬浮于可接受的载体诸如水性载体中的溶液。可使用多种水性载体中的任一者，例如，水、缓冲的水、0.4％盐水、0.9％等渗盐水、0.3％甘氨酸、5％葡萄糖等，并且可包括用于增强稳定性的糖蛋白，诸如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。通常，将使用正常缓冲盐水(135-150mM NaCl)或5％葡萄糖。这些组合物可通过常规无菌化技术诸如过滤进行无菌化。所得水溶液可经包装备用或在无菌条件下过滤并冻干，冻干的制剂与无菌溶液在给药之前组合。组合物也可含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，诸如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂等，例如，醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙等。此外，组合物可包括脂质保护剂，其保护脂质在储存时免于自由基损伤和脂质过氧化损伤。亲脂性自由基淬灭剂诸如α-生育酚和水溶性铁特异性螯合剂诸如铁草胺(ferrioxamine)是合适的。
将每剂量给药的活性剂的量选择为高于最小治疗剂量但低于毒性剂量。每剂量的量的选择将取决于多种因素，诸如患者的病史、其他疗法的使用和疾病的特性。此外，所给药的活性剂的量可在整个治疗期间调整，取决于患者对治疗的应答和任何治疗相关副作用的存在或严重程度。在某些实施方案中，LNP组合物的剂量或给药频率与用相应游离活性剂治疗的剂量和时间表大致相同。然而应理解，与游离药物治疗相比，特别是在LNP组合物表现出降低的毒性的情况下，该剂量可能更高或更频繁地给药。也应理解，与游离药物治疗相比，特别是在相较于游离药物LNP组合物表现出增加的功效的情况下，该剂量可能更低或以更低频率给药。各种化疗化合物(游离药物)的示例性剂量和治疗是已知的并且本领域技术人员可获得的并且在例如Physician's Cancer Chemotherapy Drug Manual,E.Chu andV.Devita(Jones and Bartlett,2002)中描述。
患者典型地将接受至少两个疗程并且可能更多的此类治疗，取决于患者对该治疗的应答。在单剂方案中，治疗的总疗程数由患者和医师基于所观察到的应答和毒性决定。
联合疗法
在某些实施方案中，本公开的LNP组合物可以与一种或多种另外的化合物或疗法诸如手术、放射治疗、化疗或其他活性剂(包括上述那些中的任一者)联合给药。出于各种原因，包括增加功效或降低不期望的副作用，LNP组合物可以与第二活性剂联合给药。LNP组合物可以在另外治疗之前、之后或同时给药。此外，在本公开的LNP组合物(其包含第一活性剂)与第二活性剂联合给药的情况下，该第二活性剂可以作为游离药物、作为独立的LNP制剂、或作为包含第一药物的LNP组合物的组分给药。在某些实施方案中，将多种活性剂装载到相同的脂质纳米颗粒内。在其他实施方案中，包含活性剂的脂质纳米颗粒与一种或多种游离药物合用。在特定实施方案中，包含活性剂的LNP组合物单独地形成并且后续与其他化合物组合以进行单次共给药。或者，以预定顺序依序给药某些疗法。因此，本公开的LNP组合物可包含一种或多种活性剂。
本领域技术人员已知的其他联合疗法可与本公开的方法协同使用。
除非另做定义，否则本文使用的全部技术与科学术语均具有与本公开所属领域技术人员通常理解者相同的意义。尽管与本文所述类似或等效的方法和材料可用于实践或测试本公开，但适合的方法和材料描述如下。本文提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其整体并入本文。在相互矛盾的情况下，以包括定义在内的本说明书为准。此外，所述材料、方法和实施例仅做例示性说明而非试图限制。
现在参照本公开的示例性实施方案进行详细说明。尽管本公开将会结合示例性实施方案进行描述，但应理解，这不旨在将本公开限制为那些实施方案。相反，这旨在覆盖替代物、修饰和等效物，如同可以包括在由所附权利要求书限定的本公开精神和范畴内。利用了本领域中已知的标准技术或下文具体描述的技术。
实施例
实施例1：使用微流体方法制备混合脂质纳米颗粒(LNP)制剂
使用可离子化脂质、阳离子性脂质、非阳离子性脂质(例如，作为辅助脂质)、胆固醇(例如，作为结构脂质)和任选使用的缀合的脂质(例如，PEG-脂质)制备LNP的制剂，以用于密封作为运载物的寡核苷酸。在先导试验阶段制剂中，一种经验证并被广泛接受的可离子化脂质(4-(二甲基氨基)丁酸三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-酯(MC3))用作第一组分，并与作为第二组分的阳离子性支链聚乙烯亚胺(bPEI)组合。相较于每个MC3分子具有一个带正电的氮，第二组分，bPEI具有支链结构，其具有每个分子超过一个带正电的氮原子。跨摩尔比范围将这两种组分与其他类型的脂质混合(参见图1A)以形成在乙醇(EtOH)中调配的LNP的有机相。也通过在有机相中包括Cy5-脂质缀合物对LNP进行荧光标记。对于寡核苷酸运载物，将编码核酸调节控制物和GFP蛋白的具有8870bp的大环状质粒在pH 4.5柠檬酸缓冲液(50mM)中以0.27mg/ml浓度混合。采用2:1体积比(水相：有机相)使用微流体混合装置进行两相与LNP制剂的混合。LNP不经进一步纯化和浓缩即使用。使用DLS-PALS测量颗粒尺寸、ζ电位和多分散性指数(PDI)，并将表征结果列表(图1A)。100nm颗粒尺寸混合LNP能够使用给定制剂和脂质成功地制备。将Hepa 1至6鼠肝细胞癌细胞以20,000个细胞/孔/100μl接种在96孔黑壁微型板中。将细胞在37℃在5％ CO2孵育，并且将其孵育且粘附过夜。随后，在次日用标记为MbP的混合LNP制剂使用三种不同体积的LNP处理细胞，对应于500至125ng质粒/孔，总计100μl细胞培养基/孔。用该等制剂将细胞连续处理48小时。随后，将孔用无酚红的完全细胞培养基洗涤，并且将细胞核用Hoechst染色。进行成像以检测活细胞中的Cy5(红色)、Hoechst(蓝色)和GFP(绿色)。在48小时处理后，观察到对Hepa 1.6细胞的成功转染(图1B)。100％的经处理的细胞为Cy5阳性的(图1B)，这指示这些细胞为LNP阳性的。本公开的混合LNP也能够用大质粒运载物转染细胞，不同于平行测定的基于MC3的LNP。本实施例的混合LNP在所测试的浓度下也不发挥对细胞的显著细胞毒性，这指示添加bPEI不具有对于MbP混合LNP的负效应(图1C)。
实施例2：混合阳离子性脂质颗粒被鉴定为对于转染历史上难以转染的细胞系有效
初代T细胞在历史上是难以用非病毒载体转染的，并且它们显示非常低的对polyplexes的胞吞作用。此外，T细胞的细胞内pH高于其他细胞类型并且更接近大多数可离子化脂质诸如MC3(pKa：6.4)的pKa。不欲受缚于理论，据信这在LNP内化时造成内质体隔室中的减少的正电荷转换，并因此似乎阻止质子海绵效应和内质体逃逸。使用高度阳离子性脂质和聚合物进行转染也可诱导细胞毒性和自噬体的形成。在评估混合颗粒及其针对上述挑战的效能的初步尝试中，研发了由MC3、bPEI、DOPC、胆固醇和PEG2k-DMG(比率显示于图2A中)组成的标记为“MbP-2”的混合LNP制剂。也以与其他脂质组分的相对应比率制备了仅MC3制剂，并用作基线制剂以用于比较。作为代表性寡核苷酸运载物，将GFP mRNA密封在两种形式的LNP中并且评估相应LNP制剂的性质/能力。尽管MbP-2和MC3制剂两者均造成100％ Cy5阳性细胞，指示两种LNP被成功地内化，但观察到MbP-2混合LNP制剂用GFP mRNA转染>50％的细胞(图2B)。相比之下，观察到MC3制剂在相同条件下仅转染16％的细胞。结果，与仅MC3的LNP相比，MbP-2混合LNP制剂在被转染细胞中产生了增加1.5倍的GFP信号，并且与经对照处理的细胞相比，MbP-2混合LNP制剂在被转染细胞中产生了增加20倍的GFP信号(图2C)。这些结果表明了与仅MC3的LNP相比，混合LNP用于密封和递送mRNA至细胞内的有效性。
实施例3：制备具有不同制剂参数的混合C12-200/DOTAP颗粒
将C12-200与DOTAP脂质以不同相对浓度混合制备一系列DOTAP/C12-200混合脂质纳米颗粒(“DC LNP”)，从而将不饱和饱和脂质链两者引入单个LNP制剂中。使用微流体混合过程产生DC LNP。在乙醇中以20至80mg/mL的浓度制备DOTAP、C12-200、DOPE、CHE和PEG2k-DMG的储备液。研究DOPE、DOTAP和PEG的百分比摩尔浓度(％mol)的变动，同时将C12-200的百分比摩尔浓度(％mol)以及总脂质与mRNA的质量比保持恒定。将C12-200的浓度保持在低于20％mol以减轻在较高C12-200水平下的预计毒性。使用在水相中的浓度为0.25mg/mL的mCherry mRNA(长度为996个核苷酸)作为核酸运载物。使用3:1(水相与有机相)体积比以8mL/min流速进行有机相与水相的混合。制剂的表征参数总结在图3A中。
C12-200的高正净电荷允许对颗粒尺寸进行精确控制，在12种所测试的制剂中的11种的颗粒尺寸在72与97nm之间变动。表面电荷保持为介于4与15mV之间，且PDI低于0.2。包括PEG2k-DMG以增加制剂的稳定性以及提供在全身性给药时具有预计隐身性质的此类颗粒。
实施例4：混合C12-200/DOTAP颗粒转染肺癌细胞系A549
A549人肺癌细胞在体外用选定的混合C12-200/DOTAP颗粒(图3A)处理。在用混合C12-200/DOTAP颗粒在37℃、5％ CO2处理24小时的20,000个细胞每孔中诱导mCherry mRNA转染。在完全培养基中，mRNA的剂量从5至0.16μg/mL变动。最开始评定了选定制剂的细胞毒性。将细胞在三种不同的实验条件下用混合C12-200/DOTAP颗粒特异性地处理：(i)将C12-200的百分比摩尔浓度维持在18％，同时改变DOTAP和DOPE的百分比摩尔浓度(图3B)，以研究DOTAP的百分比摩尔浓度的影响，(ii)将C12-200的百分比摩尔浓度维持在18％并变动PEG-脂质比(图3C)，以及(iii)将C12-200的百分比摩尔浓度维持在18％，并且变动DOTAP和胆固醇的百分比摩尔浓度(图3D)，以研究特定颗粒中DOPE和胆固醇的相应角色。24小时处理表明，所测定的颗粒中最大耐受mRNA剂量为0.63μg/ml。也评定了针对各种颗粒观察到的被转染细胞的百分比(图4A至4C)。在耐受剂量水平下，全部混合C12-200/DOTAP颗粒均转染100％的细胞(其中至少80％的细胞是活的)。结果进一步指示，当将C12-200的百分比摩尔浓度保持恒定并且通过增加胆固醇浓度而抵消降低水平的DOTAP％时，此类较低DOTAP颗粒的转染功效在低处理浓度下降低。也鉴定出，在制剂中包括PEG-脂质增加了转染功效，这可能是通过增强颗粒稳定性而实现的。也对以最低测试浓度处理的细胞进行了详细的显微镜分析，表明全部细胞均清晰地表达mCherry报告物蛋白，甚至在非常低的mRNA浓度下也是如此(图5)。
实施例5：混合C12-200/DOTAP颗粒在-80℃储存后是稳定的
使用如上所述的微流动混合过程来生产混合C12-200/DOTAP颗粒。为了制备混合C12-200/DOTAP颗粒，在乙醇中以20至80mg/mL的浓度制备DOTAP、C12-200、DOPE、CHE和PEG-DMG的储备液。对于DOTAP、C12-200、DOPE、胆固醇(CHE)和PEG-DMG，颗粒中的最终液体浓度分别维持在50％mol、18％mol、6％mol、24％mol和2％mol。编码核酸调节控制物(即，其编码蛋白质控制物组分)的长度为4598个核苷酸的mRNA在水相中以0.20mg/mL浓度用作核酸运载物。使用3:1(水相与有机相)体积比以8mL/min流速在微流体流路设计中进行有机相与水相的混合，与传统的交错人字形模型相比，该设计允许增加的工作体积。通过在水或4mMHEPES缓冲液pH 6.5中的切向流过滤对所得颗粒进行纯化和缓冲液交换。将颗粒按原样或添加至最终10％蔗糖再在4℃和-80℃储存35天。蔗糖充当低温保护剂，其可在冷冻过程期间保持颗粒的结构。确定了在储存之前和之后的颗粒制剂的表征参数(图6A)。无论添加或不添加蔗糖，全部制剂在4℃均保持稳定。如果冷冻，则只有具有低温保护剂(这里是10％蔗糖)的LNP才保持其特征。冷冻储存未显示过早的mRNA释放或在融化时不稳定的证据(图6B)。因此，本公开的颗粒可能适用于低温储存并且具备强健的内部结构，该结构可提供对运载物核酸(包括长mRNA或核酸调节控制物运载物)的保护。
实施例6：混合C12-200/DOTAP颗粒相对于仅DOTAP颗粒改变趋向性，实现肝靶向
为了确定本公开的颗粒在肝组织靶向方面的功效，使用Ail4小鼠(其需要细胞核中的运载物核酸活性以产生信号)，并且在Ai14小鼠中评估混合C12-200/DOTAP颗粒的生物分布(B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J；Ail4是一种Cre报告物工具品系，其经设计为具侧翼为loxP的STOP匣，该匣阻止CAG启动子驱动的红色荧光蛋白质变体(tdTomato)的转录，其全部插入Gt(ROSA)26Sor基因座中；Ai14小鼠在Cre介导的重组(Cre重组酶(由mCre编码)通过催化位于loxP位点之间的DNA的位点特异性重组而显示其活性)后表达稳健的tdTomato荧光)。测试高和低％mol的DOTAP(50％和10％)，以研究其对于颗粒的器官分布的贡献。先前证实，具有50％mol DOTAP的仅DOTAP颗粒在肺中提供强烈且高度器官限制性的活性。在本公开的生物分布研究中，评估了包括饱和脂质链C12-200对于本公开颗粒的趋向性的影响，同时将DOTAP mol％维持在50％。本公开的颗粒用Cy7-DOPE(0.25％mol)进行荧光标记并且装载有mCre mRNA。经由静脉内途径将颗粒制剂以1mg/kg剂量给药。将本公开的颗粒与不同的肝靶向制剂(装载有mCre的含MC3制剂)进行比较，该不同的肝靶向制剂也经制备并且以3mg/kg剂量给药。在给药后48小时，进行针对tdTomato的离体器官成像。对于全部制剂，均观察到了高度特异性的肝活性(图7A至7C)。本公开的混合C12-200/DOTAP颗粒能够将仅DOTAP的LNP的特异性活性从肺转变至肝。针对混合C12-200/DOTAP颗粒观察到的蛋白质表达程度为比针对含MC3颗粒所观察到的效应高80％至100％，MC3颗粒以高3X剂量用作对照(图7D)。肝样品的免疫组化图像证实了tdTomato的产生和Cy7标记的颗粒的蓄积(两者均染色为棕色；图8)。再者，肝功能测试证实了所测定的混合脂质颗粒在1mg/kg mRNA剂量下的安全性(图9A至9F)。
实施例7：混合C12-200/DOTAP颗粒将核酸调节控制物有效地递送至肝组织内
已经评估了混合C12-200/DOTAP颗粒的生物分布，评估此类荷有核酸调节控制物的颗粒在肝组织内的体内功效。特别地，野生型C57Bl6/J小鼠用两种不同的混合C12-200/DOTAP颗粒制剂治疗，每种颗粒制剂荷有VEGFa mRNA。将这些制剂以三种不同的剂量水平静脉内给药至小鼠显示，与适当的对照相比，两种所测试形式的混合C12-200/DOTAP颗粒显著地增加血清VEGFa水平，尤其是在1mg/kg剂量水平下(图10A至10B)。这些数据进一步证实了本公开的混合C12-200/DOTAP颗粒在密封大核酸(包括核酸调节控制物)以及将它们以高选择性、特异性和功效递送至肝脏，从而以甚至低剂量水平生成生理应答的功效。
说明书中提及的全部专利和出版物都表明了本公开所属领域技术人员的技术水平。本公开引用的全部参考文献通过引用并入本文，其程度与每篇参考文献通过引用以其整体独立地并入本文的程度相同。
本领域技术人员将会轻易地了解，本公开经充分调适以实现目标并且获得所提及的终点和优点，以及其中所固有的那些终点和优点。本文所述的作为优选实施方案的目前代表性方法和组合物是示例性的并且不试图限制本公开的范畴。其中的改变和其他用途对于本领域技术人员是显而易见的，这些改变和用途涵盖在本公开的精神内，并且由权利要求书的范畴限定。
此外，在本公开的特征或方面以马库什组或其他替代性分组的形式描述的情况下，本领域技术人员将会认识到，本公开也因此以该马库什组或其他组的任何个体成员或成员亚组的形式描述。
除非本文中另做指示或明显与情境矛盾，否则术语“一”和“该”及类似指称物在描述本公开的情境(尤其在权利要求书的情境)中的使用应解释为覆盖单个和多个两种情况。除非另外指定，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应解释为开放性术语(即，意为“包括但不限于”)。除非本文中另有说明，否则本文中值范围的引用仅旨在作为单独引用落在该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值均并入说明书中，如同其在本文中被单独引用一样。
除非本文中另有指示或与上下文明显冲突，否则本文所述的全部方法可以任何合适顺序执行。除非另有主张，否则本文提供的任何或全部实施例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地示例性说明公开内容，而不试图限制本公开的范畴。说明书中的任何文字均不应解释为将任何未主张的元件指示为实践本公开所必需的元件。
本公开的实施方案在本文中描述，包括发明人已知的用于实现所公开的发明的最佳模式。在阅读前述说明之后，那些实施方案的变更变为对于本领域一般技术人员是显而易见的。
本文中示例性地描述的本公开可以适当地在不存在本文未具体公开的任何一个或多个元件、一种或多种限制条件的情况下实践。因此，例如，在本文中的每个实例中，术语“包含”、“基本由...组成”和“由...组成”中的任一者均可替换为另外两个术语。已经采用的术语和表达用作说明性而非限制性术语，并且在使用这些术语和表达时无意排除所显示和描述的特征或其部分的任何等价物，但是应当认识到，在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应理解，尽管本公开提供优选的实施方案，但本领域技术人员可采用本文所公开的概念的任选特征、修改和变更，并且此类修改和变更视为处于本公开的如说明书和所附权利要求书限定的范畴内。
本领域技术人员将会轻易地了解，可以对本文所公开的发明作出各种替换和修改而不背离本发明的范畴和精神。因此，此类额外实施方案处于本公开和权利要求书的范畴内。本公开教导本领域技术人员测试本文所述化学修饰的各种组合和/或替换，以生成具有改进的对比度、诊断和/或成像活性的缀合物。因此，本文所述的具体实施方案不是限制性的，并且本领域技术人员可轻易地了解，可测试本文所述修饰的具体组合，而无需过度的实验来识别具有改进的对比度、诊断和/或成像活性的缀合物。
发明人期望熟练技术人员在适当的情况下采用这种变更，并且发明人希望除了本文具体描述的之外，本公开内容也可以被实践。据此，本公开包括适用法律所允许的本申请所附权利要求中所引用的主题的全部修改和等效物。此外，除非本文另做指示或明显与情境矛盾，否则其全部可能变更中的上述元件的任何组合为本公开所涵盖。本领域技术人员将认识到或能够仅使用不超出常规的实验来确定本文所述公开的特定实施例的许多等效物。此类等效物旨在为以下权利要求所涵盖。

Claims (63)

1.一种核酸-脂质颗粒，其用于将核酸运载物递送至受试者的肝组织，所述核酸-脂质颗粒包含：
占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约10mol％至约50mol％的1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)；以及
占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约5mol％至约50mol％的可离子化脂质。
2.根据权利要求1所述的核酸-脂质颗粒，其中，所述可离子化脂质选自由下列组成的群组：1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)、N4-胆甾醇基-精胺盐酸盐(GL67)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基甲酰胺基)乙基]-3,4-二[油酰氧基]-苯甲酰胺(MVL5)和聚合支链聚乙烯亚胺(bPEI)。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的核酸-脂质颗粒，其包含占存在于所述脂质-核酸颗粒中的总脂质的约25mol％至约85mol％的一种或多种非阳离子性脂质，任选地其中，所述一种或多种非阳离子性脂质包括选自由下列组成的群组的结构性脂质：胆固醇、β-谷甾醇及其衍生物。
4.根据前述权利要求中任一项所述的核酸-脂质颗粒，其包含占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约10mol％至约75mol％的胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物，任选地包含占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约20mol％至约65mol％的胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物，任选地包含占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约24mol％至约64mol％的胆固醇或其衍生物，任选地以选自下列组成的群组的水平包含胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物：存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约24mol％、存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约34mol％、存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约38mol％、存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约44mol％、存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约54mol％和存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约64mol％。
5.根据前述权利要求中任一项所述的核酸-脂质颗粒，其包含除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质，任选地其中，所述除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质占存在于所述脂质-核酸颗粒中的总脂质的约5mol％至约50mol％，任选地其中，所述除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质占存在于所述质子-核酸颗粒中的总脂质的约5mol％至约30mol％，任选地其中，所述除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质占存在于所述脂质-核酸颗粒中的总脂质的约5mol％至约10mol％。
6.根据前述权利要求中任一项所述的核酸-脂质颗粒，其以选自下列组成的群组的水平包含除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质：存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约6mol％、存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约7mol％、存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约7.5mol％、存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约8mol％、存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约9mol％、存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约10mol％、存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约16mol％、存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约26mol％、存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约36mol％和存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约46mol％。
7.根据权利要求5或权利要求6所述的核酸-脂质颗粒，其中，所述除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质包括选自由下列组成的群组的非阳离子性脂质：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DOPC)和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DSPC)，任选地其中，所述除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质为1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)。
8.根据权利要求1所述的核酸-脂质颗粒，其中，所述核酸-脂质颗粒不包含PEG-脂质缀合物，任选地其中，所述核酸-脂质颗粒不包含PEG。
9.根据权利要求8所述的核酸-脂质颗粒，其中，所述核酸-脂质颗粒为多剂量疗法的组成部分。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的核酸-脂质颗粒，其包含占存在的总脂质的0.01％至3％的抑制颗粒集聚的缀合的脂质，任选地其中，所述缀合的脂质包括聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物，任选地其中，所述PEG-脂质缀合物的所述PEG具有550道尔顿至3000道尔顿的平均分子量，任选地其中，所述PEG-脂质缀合物为PEG2000-脂质缀合物，任选地其中，所述PEG2000-脂质缀合物包含1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2k)和1,2-二硬脂酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DSG-PEG2k)中的一者或多者，任选地其中，所述PEG2000-脂质缀合物为1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2k)，任选地其中，所述核酸-脂质颗粒以选自由以下所组成的群组的水平包含PEG-脂质缀合物：存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约0.5mol％、存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约1.0mol％、存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约1.5mol％和存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约2.0mol％。
11.根据前述权利要求中任一项所述的核酸-脂质颗粒，其中，所述核酸运载物包括合成的或天然存在的RNA或DNA或它们的衍生物，任选地其中，所述核酸运载物为经修饰的RNA，任选地其中，所述经修饰的RNA选自由以下所组成的群组：经修饰的mRNA、经修饰的反义寡核苷酸和经修饰的siRNA，任选地其中，所述经修饰的mRNA编码核酸调节控制物。
12.根据前述权利要求中任一项所述的核酸-脂质颗粒，其中，所述核酸运载物包含选自由以下所组成的群组的一种或多种修饰：2'-O-甲基修饰的核苷酸、包含5'-硫代磷酸酯基团的核苷酸、链接至胆固醇基衍生物的末端核苷酸、2'-脱氧-2'-氟修饰的核苷酸、5'-甲氧基-修饰的核苷酸(例如，5'-甲氧基尿苷)、2'-脱氧-修饰的核苷酸、锁核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基-修饰的核苷酸、2'-烷基-修饰的核苷酸、吗啉基核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸；包括以下的核苷间链接或主链：硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、包括3'-亚烷基磷酸酯和手性磷酸酯在内的甲基和其他烷基磷酸酯、次磷酸酯、包括3'-氨基氨基膦酸酯和氨基烷基氨基膦酸酯在内的氨基膦酸酯、硫羰基氨基膦酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯和具有正常3'-5'链接的硼磷酸酯、这些的2'-5'链接的类似物、和具有逆极性的那些，其中，核苷单元的相邻对被3'-5'至5'-3'链接或2'-5'至5'-2'链接。
13.根据前述权利要求中任一项所述的核酸-脂质颗粒，其中，所述肝组织选自由下列组成的群组：肝细胞、血管细胞(即，肝窦)、肝星状细胞、内皮细胞、成纤维细胞、间充质细胞、免疫细胞、癌细胞、库普弗细胞、星形胶质细胞、椭圆形血管内皮细胞、肝源性干/祖细胞、和衍生自非肝组织的干/祖细胞或癌细胞。
14.根据前述权利要求中任一项所述的核酸-脂质颗粒，其以选自由下列组成的群组的水平包含DOTAP：存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约10mol％、存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约20mol％、存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约30mol％、存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约40mol％和存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约50mol％。
15.一种核酸-脂质颗粒，其用于将核酸运载物递送至受试者的肝组织，所述核酸-脂质颗粒包含：
占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约50mol％的1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)；以及
占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约18mol％的可离子化脂质。
16.根据权利要求15所述的核酸-脂质颗粒，其中，所述可离子化脂质为1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)。
17.根据权利要求15或权利要求16所述的核酸-脂质颗粒，其包含占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约24mol％的胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物，任选地进一步包含占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约6mol％的除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质，任选地其中，所述除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质为1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)，任选地进一步包含聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物，任选地其中，所述PEG-脂质缀合物占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约2.0mol％，任选地其中，所述PEG-脂质缀合物为1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2k)。
18.一种核酸-脂质颗粒，其用于将核酸运载物递送至受试者的肝组织，所述核酸-脂质颗粒包含：
占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约40mol％的1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)；以及
占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约18mol％的可离子化脂质。
19.根据权利要求18所述的核酸-脂质颗粒，其中，所述可离子化脂质为1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)。
20.根据权利要求18或权利要求19所述的核酸-脂质颗粒，其包含占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约24mol％的胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物，任选地进一步包含占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约16mol％的除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质，任选地其中，所述除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质为1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)，任选地进一步包含聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物，任选地其中，所述PEG-脂质缀合物占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约2.0mol％，任选地其中，所述PEG-脂质缀合物为1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2k)。
21.一种核酸-脂质颗粒，其用于将核酸运载物递送至受试者的肝组织，所述核酸-脂质颗粒包含：
占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约30mol％的1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)；以及
占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约18mol％的可离子化脂质。
22.根据权利要求21所述的核酸-脂质颗粒，其中，所述可离子化脂质为1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)。
23.根据权利要求21或权利要求22所述的核酸-脂质颗粒，其包含占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约24mol％的胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物，任选地进一步包含占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约26mol％的除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质，任选地其中，所述除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质为1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)，任选地进一步包含聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物，任选地其中，所述PEG-脂质缀合物占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约2.0mol％，任选地其中，所述PEG-脂质缀合物为1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2k)。
24.一种核酸-脂质颗粒，其用于将核酸运载物递送至受试者的肝组织，所述核酸-脂质颗粒包含：
占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约20mol％的1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)；以及
占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约18mol％的可离子化脂质。
25.根据权利要求24所述的核酸-脂质颗粒，其中，所述可离子化脂质为1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)。
26.根据权利要求24或权利要求25所述的核酸-脂质颗粒，其包含占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约24mol％的胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物，任选地进一步包含占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约36mol％的除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质，任选地其中，所述除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质为1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)，任选地进一步包含聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物，任选地其中，所述PEG-脂质缀合物占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约2.0mol％，任选地其中，所述PEG-脂质缀合物为1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2k)。
27.一种核酸-脂质颗粒，其用于将核酸运载物递送至受试者的肝组织，所述核酸-脂质颗粒包含：
占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约10mol％的1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)；以及
占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约18mol％的可离子化脂质。
28.根据权利要求27所述的核酸-脂质颗粒，其中，所述可离子化脂质为1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)。
29.根据权利要求27或权利要求28所述的核酸-脂质颗粒，其包含占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约24mol％的胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物，任选地进一步包含占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约46mol％的除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质，任选地其中，所述除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质为1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)，任选地进一步包含聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物，任选地其中所述PEG-脂质缀合物占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约2.0mol％，任选地其中所述PEG-脂质缀合物为1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2k)。
30.一种核酸-脂质颗粒，其用于将核酸运载物递送至受试者的肝组织，所述核酸-脂质颗粒包含：
占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约50mol％的1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)；
占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约18mol％的可离子化脂质；以及
以存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约7.0mol％存在的除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质。
31.根据权利要求30所述的核酸-脂质颗粒，其中，所述可离子化脂质为1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)。
32.根据权利要求30或权利要求31所述的核酸-脂质颗粒，其包含占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约24mol％的胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物，任选地其中，所述除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质为1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)，任选地进一步包含聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物，任选地其中，所述PEG-脂质缀合物占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约1.0mol％，任选地其中，所述PEG-脂质缀合物为1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2k)。
33.一种核酸-脂质颗粒，其用于将核酸运载物递送至受试者的肝组织，所述核酸-脂质颗粒包含：
占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约50mol％的1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)；
占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约18mol％的可离子化脂质；以及
占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约7.5mol％的除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质。
34.根据权利要求33所述的核酸-脂质颗粒，其中，所述可离子化脂质为1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)。
35.根据权利要求33或权利要求34所述的核酸-脂质颗粒，其进一步包含占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约24mol％的胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物，任选地其中，所述除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质为1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)，任选地进一步包含聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物，任选地其中，所述PEG-脂质缀合物占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约0.5mol％，任选地其中，所述PEG-脂质缀合物为1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2k)。
36.一种核酸-脂质颗粒，其用于将核酸运载物递送至受试者的肝组织，所述核酸-脂质颗粒包含：
占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约50mol％的1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)；
占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约18mol％的可离子化脂质；以及
占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约8.0mol％的除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质。
37.根据权利要求36所述的核酸-脂质颗粒，其中，所述可离子化脂质为1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)。
38.根据权利要求36或权利要求37所述的核酸-脂质颗粒，其进一步以存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约24mol％包含胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物，任选地其中，所述除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质为1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)，任选地其中，所述核酸-脂质颗粒不包含PEG-脂质缀合物，任选地其中，所述核酸-脂质颗粒不包含PEG。
39.一种核酸-脂质颗粒，其用于将核酸运载物递送至受试者的肝组织，所述核酸-脂质颗粒包含：
占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约40mol％的1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)；
占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约18mol％的可离子化脂质；以及
占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约34mol％的胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物。
40.根据权利要求39所述的核酸-脂质颗粒，其中，所述可离子化脂质为1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)。
41.根据权利要求39或权利要求40所述的核酸-脂质颗粒，其进一步包含占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约6.0mol％的除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质，任选地其中，所述除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质为1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)，任选地进一步包含聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物，任选地其中，所述PEG-脂质缀合物占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约2.0mol％，任选地其中，所述PEG-脂质缀合物为1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2k)。
42.一种核酸-脂质颗粒，其用于将核酸运载物递送至受试者的肝组织，所述核酸-脂质颗粒包含：
占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约30mol％的1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)；
占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约18mol％的可离子化脂质；以及
占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约44mol％的胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物。
43.根据权利要求42所述的核酸-脂质颗粒，其中，所述可离子化脂质为1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)。
44.根据权利要求42或权利要求43所述的核酸-脂质颗粒，其进一步包含占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约6.0mol％的除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质，任选地其中，所述除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质为1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)，任选地进一步包含聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物，任选地其中，所述PEG-脂质缀合物占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约2.0mol％，任选地其中，所述PEG-脂质缀合物为1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2k)。
45.一种核酸-脂质颗粒，其用于将核酸运载物递送至受试者的肝组织，所述核酸-脂质颗粒包含：
占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约20mol％的1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)；以及
占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约18mol％的可离子化脂质；以及
占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约54mol％的胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物。
46.根据权利要求45所述的核酸-脂质颗粒，其中，所述可离子化脂质为1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)。
47.根据权利要求45或权利要求46所述的核酸-脂质颗粒，其进一步包含占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约6.0mol％的除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质，任选地其中，所述除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质为1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)，任选地进一步包含聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物，任选地其中，所述PEG-脂质缀合物占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约2.0mol％，任选地其中，所述PEG-脂质缀合物为1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2k)。
48.一种核酸-脂质颗粒，其用于将核酸运载物递送至受试者的肝组织，所述核酸-脂质颗粒包含：
占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约10mol％的1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)；以及
占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约18mol％的可离子化脂质；以及
占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约64mol％的胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物。
49.根据权利要求48所述的核酸-脂质颗粒，其中，所述可离子化脂质为1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)。
50.根据权利要求48或权利要求49所述的核酸-脂质颗粒，其进一步包含占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约6.0mol％的除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质，任选地其中，所述除胆固醇、β-谷甾醇或其衍生物之外的一种或多种非阳离子性脂质为1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)，任选地进一步包含聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物，任选地其中，所述PEG-脂质缀合物占存在于所述核酸-脂质颗粒中的总脂质的约2.0mol％，任选地其中，所述PEG-脂质缀合物为1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2k)。
51.一种药物组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的核酸-脂质颗粒和药学上可接受的载体。
52.根据权利要求51所述的药物组合物，其中，所述药物组合物经配制用于肠胃外给药，任选地用于静脉注射。
53.根据权利要求51所述的药物组合物，其中，所述药物组合物经配制用于直接注射至所述肝组织内。
54.根据前述权利要求中任一项所述的核酸-脂质颗粒或药物组合物，其中，将所述核酸-脂质颗粒或药物组合物给药以治疗肝脏疾病或疾患，任选地其中，所述疾病或疾患选自由下列组成的群组：胆道闭锁、先天性肝内胆管发育不良综合征、α-1抗胰蛋白酶缺乏、酪氨酸血症、新生儿肝炎、丙型肝炎病毒感染、乙型肝炎病毒感染、甲型肝炎病毒感染、肝细胞癌和威尔森氏病。
55.一种注射剂，其包含根据前述权利要求中任一项所述的核酸-脂质颗粒、药物组合物或不含PEG的脂质-核酸颗粒。
56.一种用于将核酸运载物递送至受试者的肝组织的方法，其包括向所述受试者给药根据前述权利要求中任一项所述的核酸-脂质颗粒、药物组合物或注射剂。
57.一种用于治疗或预防受试者的疾病或疾患的方法，所述方法包括向所述受试者给药根据权利要求1至55中任一项所述的核酸-脂质颗粒、药物组合物或注射剂。
58.根据权利要求56或权利要求57所述的方法，其中，所述核酸-脂质颗粒、药物组合物或注射剂经静脉内给药，并且所述核酸运载物在所述受试者的所述肝组织的细胞内的表达以下述水平发生：比所述核酸运载物在所述受试者的肺、心和脾的细胞内的表达高出至少两倍，任选地其中，所述核酸运载物在所述受试者的所述肝组织的细胞内的表达比所述核酸运载物在所述受试者的肺、心和脾的细胞内的表达高出至少三倍、任选地高出至少四倍、任选地高出至少五倍、任选地高出至少六倍、任选地高出至少七倍、任选地高出至少八倍、任选地高出至少九倍、任选地高出至少十倍、任选地高出至少十一倍、任选地高出至少十二倍、任选地高出至少十三倍、任选地高出至少十四倍、任选地高出至少十五倍、任选地高出至少二十倍。
59.根据权利要求56至58中任一项所述的方法，其中，所述核酸-脂质颗粒、药物组合物或注射剂经静脉给药，并且所述核酸-脂质颗粒以比所述核酸-脂质颗粒在所述受试者的选自由肺、心、脾、卵巢和胰所组成的群组的一种或多种其他组织内的浓度高出至少两倍的浓度定位至所述受试者的所述肝组织，任选地其中，与所述受试者的选自由肺、心、脾、卵巢和胰所组成的群组的一种或多种其他组织相比，高出至少三倍、任选地至少四倍、任选地至少五倍、任选地至少六倍浓度的所述核酸-脂质颗粒存在于肝内。
60.根据权利要求57至59中任一项所述的方法，其中，所述疾病或疾患选自由以下所组成的群组：
肝脏疾病或疾患，任选地其中，所述肝脏疾病或疾患选自由下列组成的群组：胆道闭锁、先天性肝内胆管发育不良综合征、α-1抗胰蛋白酶缺乏、酪氨酸血症、新生儿肝炎、丙型肝炎病毒感染、乙型肝炎病毒感染、甲型肝炎病毒感染、肝细胞癌和威尔森氏病；
关节疾病或疾患，任选地其中，所述关节疾病或疾患选自由以下所组成的群组：类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、痛风、肌炎、滑囊炎、腕管综合征和骨关节炎；
炎症性疾病或疾患，任选地其中，所述炎症性疾病或疾患选自由以下所组成的群组：炎症性肠病、腹膜炎、骨髓炎、恶病质、胰腺炎、创伤引起的休克、支气管哮喘、过敏性鼻炎、囊性纤维化、急性支气管炎、急性剧烈支气管炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、感染性关节炎、感染后关节炎、淋病性关节炎、结核性关节炎、关节炎、骨关节炎、痛风、脊柱关节病、强制性脊柱炎、与血管炎综合征相关的关节炎、结节性神经性多动脉炎、易激血管炎、化脓性肉芽肿病、类风湿性息肉病肌痛、关节炎细胞动脉炎，钙性多囊关节病、腐蚀性痛风、非关节炎性风湿病、滑囊炎、花粉热、化脓性炎症(例如，网球肘)、神经性关节病、关节积血、过敏性紫癜、肥大性骨关节炎、多发性痔疮、脊柱侧弯、血色素沉着症、高脂蛋白血症、低丙种球蛋白血症、COPD、急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤、支气管肺发育不良和系统性红斑狼疮(SLE)；以及
表皮疾病或疾患，任选地其中，所述表皮疾病或疾患选自由以下所组成的群组：银屑病、特应性皮炎、硬皮病、湿疹、酒渣鼻、脂溢性皮炎、黑色素瘤、日光性角化病、鱼鳞病、短暂性棘皮松解皮肤病、常见疣、角化棘皮瘤和脂溢性角化症。
61.根据权利要求56至-60中任一项所述的方法，其中，所述核酸-脂质颗粒、药物组合物或注射剂经肠胃外给药，任选地其中，所述核酸-脂质颗粒、药物组合物或注射剂经由选自由以下所组成的群组的路径给药：吸入、外用施加和注射，任选地其中，所述注射选自由以下所组成的群组：静脉注射、气管内注射、关节内注射、皮下注射、皮内注射和肌肉注射。
62.根据权利要求56至61中任一项所述的方法，其中，所述核酸运载物包括合成的或天然存在的RNA或DNA或它们的衍生物，任选地其中，所述核酸运载物为经修饰的RNA，任选地其中，所述经修饰的RNA选自由以下所组成的群组：经修饰的mRNA、经修饰的反义寡核苷酸和经修饰的siRNA，任选地其中，所述经修饰的mRNA编码核酸调节控制物。
63.根据权利要求56至62中任一项所述的方法，其中，所述核酸运载物包含选自由以下所组成的群组的一种或多种修饰：2'-O-甲基修饰的核苷酸、包含5'-硫代磷酸酯基团的核苷酸、链接至胆固醇基衍生物的末端核苷酸、2'-脱氧-2'-氟修饰的核苷酸、5'-甲氧基-修饰的核苷酸(例如，5'-甲氧基尿苷)、2'-脱氧-修饰的核苷酸、锁核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基-修饰的核苷酸、2'-烷基-修饰的核苷酸、吗啉基核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸；包括以下的核苷间链接或主链：硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、包括3'-亚烷基磷酸酯和手性磷酸酯在内的甲基和其他烷基磷酸酯、次磷酸酯、包括3'-氨基氨基膦酸酯和氨基烷基氨基膦酸酯在内的氨基膦酸酯、硫羰基氨基膦酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯和具有正常3'-5'链接的硼磷酸酯、这些的2'-5'链接的类似物、和具有逆极性的那些，其中，核苷单元的相邻对被3'-5'至5'-3'链接或2'-5'至5'-2'链接。
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