KR20230175259A - 혼합 양이온성 지질 입자에 의한 조직 특이적 핵산 전달 - Google Patents

혼합 양이온성 지질 입자에 의한 조직 특이적 핵산 전달 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 이온화 가능한 지질과 양이온성 지질을 혼합하는 핵산-지질 입자에 관한 것이며, 이는 비경구적으로 투여될 때 결합된 운반물을 간에 우선적으로 국소화하고 전달하며, 이는, 선택적으로, 결합된 운반물을 이러한 입자가 직접 주사되는 조직에 전달하는 데 사용될 수 있다. 본 개시내용은, 선택적으로 치료제(예를 들어, 치료 mRNA 및/또는 핵산 조절인자 시스템)와 결합된, 이러한 지질 입자를 포함하는 조성물뿐만 아니라 지질 입자-결합된 치료제를 전달하고/거나 본원에 제공된 지질 입자 조성물을 사용하여 대상체에서 질환 또는 장애, 예를 들어 간 질환 또는 장애를 치료하기 위한 방법 및 키트를 제공한다.

Description

혼합 양이온성 지질 입자에 의한 조직 특이적 핵산 전달
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2021년 4월 22일에 출원된 "Tissue-Specific Nucleic Acid Delivery by Mixed Cationic Lipid Particles"라는 명칭의 미국 임시 특허 출원 제63/178,050호와 관련되어 있으며 35 U.S.C. § 119(e)에 따라 이에 대한 우선권을 주장한다. 전술된 특허 출원의 전체 내용은 이 원용에 의해 본원에 포함된다.
기술분야
본 개시내용은 핵산 기반 요법을 투여하는 데 유용한 지질 기반 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은, 대상체의 간 조직과 관련된 질환 또는 장애를 비롯한 대상체의 질환 및 장애의 치료 또는 예방을 위한 것을 비롯한, 대상체에게 핵산을 전달하기 위한 혼합 양이온성/이온화 가능한 지질 입자에 관한 것이다.
간 질환은 전 세계적으로 연간 약 200만 명의 사망을 차지하며, 여기에는 간경변, 바이러스성 간염 및 간 세포 암종(HCC)의 합병증으로 인한 약 100만 명 초과의 사망이 포함된다. 간경변과 간암은 전 세계적으로 전체 사망의 거의 3.5%를 차지한다. 간 이식은 두 번째로 많이 사용되는 고형 장기 이식이고, 많은 간 병태를 해결하기 위한 최후의 치료 수단 옵션으로 사용되며, 불행히도 전 세계 이식 수요의 10% 미만이 현재 충족되고 있다. 간 이식의 필요성을 지연시키거나 심지어 예방하는 데 도움이 될 수 있는 간 질환 및 장애에 대한 일부 치료법이 존재하지만, 이러한 알려진 치료법은 완전한 복원성 치료법이 아니며, 치료되는 대상체에게 엄청나게 해를 끼치지 않으면서 간 질환을 효과적으로 치료하는 치료제를 개발하는 것이 이 분야의 주요 과제로 남아 있다.
핵산 요법은 개별 표적 유전자 수준에서의 질환의 치료에 엄청난 잠재력을 제공한다. 그러나 핵산 치료제의 완전한 가능성을 실현하려면 안전하고 효과적인 전달 시스템이 필수적이다. 모든 장기 및 조직에 대한 핵산 치료제의 비특이적 전달은 종종 부위 외(off-site)(비표적 및/또는 표적 외) 효과 및 독성을 초래할 수 있다. 특정 작용이 선호되는 관심 장기 또는 조직에 우선적으로 핵산 치료제를 전달하는 것은 약물 전달, 특히 핵산 기반 작용제 전달의 지속적인 목표이다. 신체의 다른 부위에 해를 끼치지 않으면서 질환의 원인만을 표적화한다는 개념은 120년 전 Ehrlich에 의해 설명되었다. 그러나 리간드 기반 표적화 전략("능동 표적화"로도 지칭됨)을 도입하지 않으면서 특정 조직을 표적화할 수 있는 나노입자 전달 시스템에 대한 옵션은 여전히 사실상 존재하지 않는다. 따라서, (리간드 기반 활성 표적화 전략에 의해서가 아닌) 이러한 제제의 구조적 성분에만 기초하여 핵산 운반물의 장기 특이적 전달을 달성할 수 있는 비히클에 대한 이전에 충족되지 않은 요구가 당업계에 존재한다. 특히, 간은 유전자 요법을 위한 핵심 표적 장기이기 때문에, 간에 핵산 운반물을 선택적으로 전달할 수 있는 이러한 비히클에 대한 당업계의 구체적인 요구 또한 존재한다.
본 개시내용은 적어도 부분적으로, 리간드 기반 표적화 전략을 필요로 하지 않으면서, 대상체의 간 및 간 조직에 운반물 모이어티(예를 들어, 핵산 운반물)를 특이적으로 표적화할 수 있는 지질 기반 나노입자 조성물 및 제제의 확인에 기초한다. 특히, 본 개시내용은 양이온성 지질인 DOTAP(1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판)을 함유하는 핵산-지질 입자 제제에 제2 이온화 가능한 또는 양이온성 지질을 도입하면, 이러한 입자 제제가 핵산 운반물의 전달에 있어서 간 특이적이 되도록 만들고 입자-치료되는 대상체의 간 세포의 핵으로의 심지어 대형인 핵산 조정 조절인자(nucleic acid modulatory controller) 운반물의 전달을 강력하게 달성하도록 이러한 입자 제제를 효과적으로 변화시킬 수 있다는 놀라운 발견에 관한 것이다. DOTAP 함유 입자 내에 이온화 가능한 지질인 C12-200(1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-히드록시도데실)아미노)에틸)(2-히드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스(도데칸-2-올))을 포함시키는 것(이에 따라 혼합 양이온성 지질 입자를 형성함)은, LNP 내에 추가적인 활성 표적화 성분을 필요로 하지 않으면서 간 조직에 특이적으로 벡터의 방향성(tropism)을 이동시키는 것으로 본원에서 구체적으로 발견되었으며, 이는 (간으로의 핵산 운반물의 선택적 전달을 달성하기 위해 당업계에 이전에 설명된) MC3 함유 지질 입자와 비교해도 개선을 갖는다. 따라서, 본 개시내용은 (예를 들어, 정맥내(IV) 주사를 통한) 전신 투여 시 핵산 운반물을 간에 선택적으로, 효과적으로 전달할 수 있는 지질 입자를 제공하며, 이러한 핵산 운반물은 예를 들어, 특히, 핵산 조정 조절인자, 치료 mRNA뿐만 아니라, RNA 간섭(RNAi) 및 안티센스 작용제(siRNA, miRNA 등)를 포함한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자를 제공하며, 상기 핵산-지질 입자는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 10 mol% 내지 약 50 mol%의 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP); 및 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 5 mol% 내지 약 50 mol%의 이온화 가능한 지질을 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 이온화 가능한 지질은 1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-히드록시도데실)아미노)에틸)(2-히드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스(도데칸-2-올)(C12-200), N4-콜레스테릴-스페르민 HCl(GL67), N1-[2-((1S)-1-[(3-아미노프로필)아미노]-4-[디(3-아미노-프로필)아미노]부틸카르복사미도)에틸]-3,4-디[올레일옥시]-벤즈아미드(MVL5) 및/또는 중합체성 분지형 폴리에틸렌이민(bPEI)이다.
특정 실시형태에서, 상기 입자는 상기 지질-핵산 입자에 존재하는 총 지질의 약 25 mol% 내지 약 85 mol%로 존재하는 하나 이상의 비양이온성 지질을 포함한다. 선택적으로, 상기 하나 이상의 비양이온성 지질은 구조적 지질, 예를 들어 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 하나 이상의 유도체를 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 입자는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 10 mol% 내지 약 75 mol%로 존재하는 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 하나 이상의 유도체를 포함한다. 선택적으로, 상기 입자는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 20 mol% 내지 약 65 mol%로 존재하는 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 하나 이상의 유도체를 포함한다. 선택적으로, 상기 입자는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 24 mol% 내지 약 64 mol%로 존재하는 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 하나 이상의 유도체를 포함한다. 선택적으로, 상기 입자는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 24 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 34 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 38 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 44 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 54 mol%, 또는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 64 mol%의 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 하나 이상의 유도체를 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 입자는 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질을 포함한다. 선택적으로, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 상기 지질-핵산 입자에 존재하는 총 지질의 약 5 mol% 내지 약 50 mol%로 존재한다. 선택적으로, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 상기 지질-핵산 입자에 존재하는 총 지질의 약 5 mol% 내지 약 30 mol%로 존재한다. 선택적으로, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 상기 지질-핵산 입자에 존재하는 총 지질의 약 5 mol% 내지 약 10 mol%로 존재한다.
특정 실시형태에서, 상기 입자는 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질을 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 6 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 7 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 7.5 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 8 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 9 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 10 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 16 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 26 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 36 mol%, 또는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 46 mol%의 수준으로 포함한다.
실시형태에서, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 및/또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)이다. 선택적으로, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 DOPE이다.
일 실시형태에서, 상기 핵산-지질 입자는 PEG-지질 접합체를 포함하지 않는다. 선택적으로, 상기 핵산-지질 입자는 PEG를 포함하지 않는다.
특정 실시형태에서, 상기 핵산-지질 입자는 다중 용량 요법의 성분이다.
일 실시형태에서, 상기 입자는 존재하는 총 지질의 0.01 내지 3%로 존재하는, 입자의 응집을 억제하는 접합된 지질을 포함한다. 선택적으로, 상기 접합된 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 접합체이거나 이를 포함한다. 선택적으로, 상기 PEG-지질 접합체의 PEG는 550 달톤 내지 3000 달톤의 평균 분자량을 갖는다. 선택적으로, 상기 PEG-지질 접합체는 PEG2000-지질 접합체이다. 선택적으로, 상기 PEG2000-지질 접합체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2k) 및 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DSG-PEG2k) 중 하나 이상이거나 이를 포함한다. 선택적으로, 상기 PEG2000-지질 접합체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2k)이다. 선택적으로, 상기 핵산-지질 입자는 PEG-지질 접합체를 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 0.5 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 1.0 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 1.5 mol%, 또는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 2.0 mol%의 수준으로 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 핵산 운반물은 합성 또는 자연 발생 RNA 또는 DNA, 또는 이의 유도체이거나 이를 포함한다. 선택적으로, 상기 핵산 운반물은 변형된 RNA이다. 선택적으로, 상기 변형된 RNA는 변형된 mRNA, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드 및/또는 변형된 siRNA이다. 선택적으로, 상기 변형된 mRNA는 핵산 조정 조절인자를 인코딩한다.
실시형태에서, 상기 핵산 운반물은 하기 변형물 중 하나 이상을 포함한다: 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 5'-포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오티드, 콜레스테릴 유도체에 연결된 말단 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드, 5'-메톡시-변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 5'-메톡시유리딘), 2'-데옥시-변형된 뉴클레오티드, 잠긴 뉴클레오티드, 무염기 뉴클레오티드, 2'-아미노-변형된 뉴클레오티드, 2'-알킬-변형된 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포라미데이트, 뉴클레오티드를 포함하는 비천연 염기; 뉴클레오시드간 연결 또는 골격, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트, 예를 들어 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포라미데이트, 예를 들어, 3'-아미노 포스포라미데이트 및 아미노알킬포스포라미데이트, 티오노포스포라미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르 및 정상적인 3′-5′ 연결을 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2′-5′ 연결된 유사체 및 뉴클레오시드 단위의 인접 쌍이 3'-5'에서 5'-3' 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결된 반전된 극성을 갖는 것들.
특정 실시형태에서, 상기 간 조직은 간 세포, 혈관 세포(즉, 간 동양혈관), 간 성상세포, 내피 세포, 섬유아세포, 중간엽 세포, 면역 세포, 암 세포, 쿠퍼 세포(Kupffer cell), 성상교세포, 타원형 혈관 내피 세포, 간 유래 줄기/전구 세포, 및/또는 비-간 조직 유래 줄기/전구 세포 또는 암 세포이거나 이를 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 입자는 DOTAP를 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 10 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 20 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 30 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 40 mol%, 또는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 50 mol%의 수준으로 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자를 제공하며, 상기 핵산-지질 입자는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 50 mol%의 DOTAP 및 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 18 mol%로 존재하는 이온화 가능한 지질을 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 이온화 가능한 지질은 1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-히드록시도데실)아미노)에틸)(2-히드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스(도데칸-2-올)(C12-200)이다.
특정 실시형태에서, 상기 입자는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 24 mol%의 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체를 추가로 포함한다. 선택적으로, 상기 입자는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 6 mol%의, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질을 추가로 포함한다. 선택적으로, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 DOPE이다. 선택적으로, 상기 입자는 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 접합체를 추가로 포함한다. 선택적으로, 상기 PEG-지질 접합체는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 2.0 mol%를 포함한다. 선택적으로, 상기 PEG-지질 접합체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2k)이다.
본 개시내용의 추가적인 양태는 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자를 제공하며, 상기 핵산-지질 입자는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 40 mol%의 DOTAP 및 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 18 mol%로 존재하는 이온화 가능한 지질을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 입자는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 16 mol%의, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질을 추가로 포함한다.
본 개시내용의 일 양태는 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자를 제공하며, 상기 핵산-지질 입자는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 30 mol%의 DOTAP 및 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 18 mol%로 존재하는 이온화 가능한 지질을 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 입자는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 26 mol%의, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질을 추가로 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자를 제공하며, 상기 핵산-지질 입자는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 20 mol%의 DOTAP 및 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 18 mol%로 존재하는 이온화 가능한 지질을 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 입자는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 36 mol%의, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질을 추가로 포함한다.
본 개시내용의 추가적인 양태는 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자를 제공하며, 상기 핵산-지질 입자는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 10 mol%의 DOTAP 및 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 18 mol%로 존재하는 이온화 가능한 지질을 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 입자는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 46 mol%로 존재하는, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질을 추가로 포함한다.
본 개시내용의 추가적인 양태는 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자를 제공하며, 상기 핵산-지질 입자는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 50 mol%의 DOTAP; 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 18 mol%로 존재하는 이온화 가능한 지질; 및 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 7.0 mol%로 존재하는, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질을 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 입자는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 1.0 mol%의 PEG-지질 접합체를 추가로 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자를 제공하며, 상기 핵산-지질 입자는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 50 mol%의 DOTAP; 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 18 mol%로 존재하는 이온화 가능한 지질; 및 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 7.5 mol%로 존재하는, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질을 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 입자는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 0.5 mol%의 PEG-지질 접합체를 추가로 포함한다.
본 개시내용의 추가적인 양태는 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자를 제공하며, 상기 핵산-지질 입자는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 50 mol%의 DOTAP; 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 18 mol%로 존재하는 이온화 가능한 지질; 및 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 8.0 mol%로 존재하는, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질을 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 입자는 PEG-지질 접합체를 포함하지 않는다. 선택적으로, 상기 핵산-지질 입자는 PEG를 포함하지 않는다.
본 개시내용의 추가적인 양태는 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자를 제공하며, 상기 핵산-지질 입자는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 40 mol%의 DOTAP; 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 18 mol%로 존재하는 이온화 가능한 지질; 및 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 34 mol%로 존재하는 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 핵산-지질 입자는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 6.0 mol%로 존재하는, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질을 추가로 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자를 제공하며, 상기 핵산-지질 입자는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 30 mol%의 DOTAP; 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 18 mol%로 존재하는 이온화 가능한 지질; 및 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 44 mol%로 존재하는 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체를 포함한다.
본 개시내용의 추가적인 양태는 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자를 제공하며, 상기 핵산-지질 입자는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 20 mol%의 DOTAP; 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 18 mol%로 존재하는 이온화 가능한 지질; 및 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 54 mol%로 존재하는 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체를 포함한다.
본 개시내용의 추가적인 양태는 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자를 제공하며, 상기 핵산-지질 입자는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 10 mol%의 DOTAP; 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 18 mol%의 이온화 가능한 지질; 및 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 64 mol%로 존재하는 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 약학적 조성물을 제공하며, 이는 본 개시내용의 핵산-지질 입자를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 약학적 조성물은 비경구 투여용으로 제형화된다. 선택적으로, 상기 약학적 조성물은 정맥내 주사용으로 제형화된다.
실시형태에서, 상기 약학적 조성물은 간 조직으로의 직접 주사용으로 제형화된다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 핵산-지질 입자 또는 약학적 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 간 질환 또는 장애를 치료하기 위해 투여된다. 선택적으로, 상기 간 질환 또는 장애는 담도 폐쇄증, 알라질 증후군(Alagille syndrome), 알파-1 항트립신 결핍증, 티로신혈증, 신생아 간염, C형 간염 바이러스 감염, B형 간염 바이러스 감염, A형 간염 바이러스 감염, 간 세포 암종 및/또는 윌슨병(Wilson's disease)이다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 주사물을 제공하며, 이는 본 개시내용의 핵산-지질 입자 또는 약학적 조성물을 포함한다.
본 개시내용의 추가적인 양태는 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하는 방법을 제공하며, 이는 상기 대상체에게 본 개시내용의 핵산-지질 입자, 약학적 조성물 또는 주사물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 추가적인 양태는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 이는 상기 대상체에게 본 개시내용의 핵산-지질 입자, 약학적 조성물 또는 주사물을 투여하는 단계를 포함한다.
실시형태에서, 상기 핵산-지질 입자, 약학적 조성물 또는 주사물은 정맥내로 투여되고, 상기 대상체의 간 조직의 세포에서의 상기 핵산 운반물의 발현은 상기 대상체의 폐, 심장, 비장, 난소, 췌장, 신장 및/또는 기타 장기 또는 조직의 세포에서의 상기 핵산 운반물의 발현보다 적어도 2배 더 높은 수준으로 발생한다. 선택적으로, 상기 대상체의 간 조직의 세포에서의 상기 핵산 운반물의 발현은 상기 대상체의 폐, 심장, 비장, 난소, 췌장 및/또는 신장의 세포에서의 상기 핵산 운반물의 발현보다 적어도 3배 더 높고, 선택적으로, 적어도 4배 더 높고, 선택적으로, 적어도 5배 더 높고, 선택적으로, 적어도 6배 더 높고, 선택적으로, 적어도 7배 더 높고, 선택적으로, 적어도 8배 더 높고, 선택적으로, 적어도 9배 더 높고, 선택적으로, 적어도 10배 더 높고, 선택적으로, 적어도 11배 더 높고, 선택적으로, 적어도 12배 더 높고, 선택적으로, 적어도 13배 더 높고, 선택적으로, 적어도 14배 더 높고, 선택적으로, 적어도 15배 더 높고, 선택적으로, 적어도 20배 더 높다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 핵산-지질 입자, 약학적 조성물 또는 주사물은 정맥내로 투여되고, 상기 핵산-지질 입자는 상기 대상체의 하기의 다른 조직, 즉, 폐, 심장, 비장, 난소 및 췌장 중 하나 이상에서의 상기 핵산-지질 입자의 농도보다 적어도 2배 더 높은 농도로 상기 대상체의 간 조직에 국소화된다. 선택적으로, 상기 대상체의 하기의 다른 조직, 즉, 폐, 심장, 비장, 난소 및/또는 췌장 중 하나 이상에서의 상기 핵산-지질 입자의 농도와 비교하여 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 또는 적어도 6배 더 높은 농도의 상기 핵산-지질 입자가 간에 존재한다.
특정 실시형태에서, 상기 핵산-지질 입자, 약학적 조성물 또는 주사물의 투여는 하기 중 하나 이상을 치료 또는 예방하기 위해 수행된다: 간 질환 또는 장애(예를 들어, 담도 폐쇄증, 알라질 증후군, 알파-1 항트립신 결핍증, 티로신혈증, 신생아 간염, C형 간염 바이러스 감염, B형 간염 바이러스 감염, A형 간염 바이러스 감염, 간 세포 암종 및/또는 윌슨병); 관절 질환 또는 장애(예를 들어, 류마티스 관절염, 건선 관절염, 통풍, 건염, 활액낭염, 수근관 증후군 및/또는 골관절염); 염증성 질환 또는 장애(예를 들어, 염증성 장 질환, 복막염, 골수염, 악액질, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 알레르기성 비염, 낭포성 섬유증, 급성 기관지염, 급성 중증 기관지염, 골관절염, 류마티스 관절염, 감염성 관절염, 감염 후 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 관절염, 골관절염, 통풍, 척추관절병, 강직성 척추염, 혈관염 증후군과 관련된 관절염, 신경성 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스 용종증 근육통, 관절염 세포 동맥염, 칼슘 다낭성 관절병증, 가성 통풍, 비-관절염 류머티즘, 활액낭염, 건초열, 화농성 염증(예를 들어, 테니스 엘보), 신경병성 관절 질환, 출혈성 관절증, 헤노흐-쇤라인 자색반(Henoch-Schlein purpura), 비대성 골관절염, 다형 치질, 척추 측만증, 혈색소증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, COPD, 급성 호흡곤란 증후군, 급성 폐 손상, 기관지폐 이형성증 및/또는 전신 홍반성 루푸스(SLE)); 및 표피 질환 또는 장애(예를 들어, 건선, 아토피성 피부염, 경피증, 습진, 장미증, 지루성 피부염, 흑색종, 일광 각화증, 어린선, 그로버병(Grover's disease), 일반 사마귀, 각화극세포종 및/또는 지루성 각화증).
실시형태에서, 상기 핵산-지질 입자, 약학적 조성물, 또는 주사물은 비경구적으로 투여된다. 선택적으로, 상기 핵산-지질 입자, 약학적 조성물 또는 주사물은 흡입, 국소 도포 또는 주사를 통해 투여된다. 선택적으로, 상기 핵산-지질 입자, 약학적 조성물 또는 주사물은 정맥내 주사, 기관내 주사, 관절내 주사, 피하 주사, 피내 주사 및/또는 근육내 주사에 의해 투여된다.
특정 실시형태에서, 상기 핵산 운반물은 합성 또는 자연 발생 RNA 또는 DNA 또는 이의 유도체이거나 이를 포함한다. 선택적으로, 상기 핵산 운반물은 변형된 RNA이다. 선택적으로, 상기 변형된 RNA는 변형된 mRNA, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 변형된 siRNA이다. 선택적으로, 상기 변형된 mRNA는 핵산 조정 조절인자를 인코딩한다.
정의
구체적으로 언급되거나 문맥상 명백하지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 당업계의 정상적인 허용 오차 범위 이내, 예를 들어 평균의 2 표준 편차 이내인 것으로 이해된다. "약"은 언급된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 또는 0.01% 이내인 것으로 이해될 수 있다.
특정 실시형태에서, 용어 "대략" 또는 "약"은, 달리 명시되거나 문맥상 명백하지 않은 한, 언급된 기준값의 양 방향으로 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 미만 이내의(초과 또는 미만의) 값의 범위를 지칭한다(해당 숫자가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우는 제외함).
문맥상 달리 명백하지 않는 한, 본원에 제공된 모든 수치는 용어 "약"에 의해 수식된다.
용어 "지질"은, 지방산의 에스테르를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 유기 화합물의 그룹을 지칭하며, 물에는 용해되지 않지만 많은 유기 용매에는 용해되는 것을 특징으로 한다. 이들은 일반적으로 적어도 하기 3개의 부류로 나뉜다: (1) 지방과 오일뿐만 아니라 왁스도 포함하는 "단순 지질"; (2) 인지질 및 당지질을 포함하는 "복합 지질"; (3) 스테로이드와 같은 "유도 지질".
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "양이온성 지질"은 선택된 pH, 예를 들어, 생리학적 pH에서 순 양전하를 보유하는 다수의 지질 종 중 임의의 것을 지칭한다. 양이온성 지질은 1개, 2개, 3개 또는 그 초과의 지방산 또는 지방 알킬 사슬 및 pH 적정 가능한 아미노 헤드기(예를 들어, 알킬아미노 또는 디알킬아미노 헤드기)를 갖는 지질 및 이의 염을 포함한다. 상기 양이온성 지질은 전형적으로, 상기 양이온성 지질의 pKa보다 낮은 pH에서는 양성자화되고(즉, 양전하로 하전되고), 상기 pKa보다 높은 pH에서는 실질적으로 중성이다. 본원에 기술된 양이온성 지질은 적정 가능한 양이온성 지질로도 지칭될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 양이온성 지질은 양성자화 가능한 3차 아민 (예를 들어, pH 적정 가능한) 헤드기; 각각의 알킬 사슬이 독립적으로 0 내지 3개의(예를 들어, 0, 1, 2 또는 3개의) 이중 결합을 갖는 C18 알킬 사슬; 및 상기 헤드기과 알킬 사슬 사이의 에테르, 에스테르 또는 케탈 연결을 포함한다. 이러한 양이온성 지질은 DOTAP, 1,2-디스테아릴옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DSDMA), 1,2-디올레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DODMA), 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DLinDMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DLenDMA), 1,2-디-γ-리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(γ-DLenDMA), 1,2-디리놀레일옥시-케토-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DLinK-DMA), 1,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLinKC2-DMA)(DLin-C2K-DMA, XTC2, 및 C2K로도 알려짐), 2,2-디리놀레일-4-(3-디메틸아미노프로필)[1,3]-디옥솔란(DLin-K-C3-DMA), 2,2-디리놀레일-4-(4-디메틸아미노부틸)[1,3]-디옥솔란(DLin-K-C4-DMA), 1,2-디리놀레닐옥시-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(γ-DLen-C2K-DMA), 1,2-디-γ-리놀레닐옥시-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(γ-DLen-C2K-DMA), 디리놀레일메틸-3-디메틸아미노프로피오네이트(DLin-M-C2-DMA)(MC2로도 알려짐), (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노) 부타노에이트(DLin-M-C3-DMA)(MC3으로도 알려짐) 및 3-(디리놀레일메톡시)-N,N-디메틸프로판-1-아민(DLin-MP-DMA)(1-B11로도 알려짐)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, "DOTAP"는 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 또는 18:1 TAP, 이중쇄 또는 쌍둥이자리 양이온성 지질을 지칭한다.
DOTAP은 이의 4차 구조로 인해 pH와 무관하게 양이온으로 하전된 지질이다. 이는 DNA, RNA 및 기타 음전하로 하전된 분자의 리포솜 형질감염을 위해 상업적으로 판매된다. 본 개시내용의 일부 양태에서, C12-200 지질 또는 이의 변형물과 조합된 DOTAP 지질 또는 이의 변형물이 간에 핵산을 특이적으로 전달하기 위해 지질 나노입자에 사용된다. DOTAP(C42H80NO4 +)의 구조는 하기와 같다:
Figure pct00001
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이온화 가능한 지질"은 pH가 상기 지질의 이온화 가능한 기의 pK 미만으로 낮아짐에 따라 양이온성(양성자화)이 되지만, 더 높은 pH 값에서는 점차적으로 더 중성이 되는 지질을 지칭한다. 지질-핵산 입자의 성분이 해당 pK보다 낮은 pH 값에 있을 때, 상기 지질은 음전하로 하전된 다중 핵산과 결합할 수 있다. 예시적인 이온화 가능한 지질은 C12-200; N4-콜레스테릴-스페르민 HCl 염(GL67); N1-[2-((1S)-1-[(3-아미노프로필)아미노]-4-[디(3-아미노-프로필)아미노]부틸카르복사미도)에틸]-3,4-디[올레일옥시]-벤즈아미드(MVL5); 1,2-디스테아릴옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DSDMA); 1,2-디올레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DODMA); 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DLinDMA); 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DLenDMA); 1,2-디-γ-리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(γ-DLenDMA); 1,2-디리놀레일옥시-케토-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DLinK-DMA); 1,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLinKC2-DMA)(DLin-C2K-DMA, XTC2 및 C2K로도 알려짐); 2,2-디리놀레일-4-(3-디메틸아미노프로필)[1,3]-디옥솔란(DLin-K-C3-DMA); 2,2-디리놀레일-4-(4-디메틸아미노부틸)[1,3]-디옥솔란(DLin-K-C4-DMA); 1,2-디리놀레닐옥시-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(γ-DLen-C2K-DMA); 1,2-디-γ-리놀레닐옥시-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(γ-DLen-C2K-DMA); 디리놀레일메틸-3-디메틸아미노프로피오네이트(DLin-M-C2-DMA)(MC2로도 알려짐); (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노) 부타노에이트(DLin-M-C3-DMA)(MC3으로도 알려짐); 3-(디리놀레일메톡시)-N,N-디메틸프로판-1-아민(DLin-MP-DMA)(1-B11로도 알려짐); 2-({8-[(3β)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]옥틸}옥시)-N,N-디메틸-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]프로판-1-아민(옥틸-CLinDMA); (2R) 2-({8-[(3β)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]옥틸}옥시)-N,N-디메틸-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]프로판-1-아민(R-옥틸-CLinDMA); (2S) 2-({8-[(3β)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]옥틸}옥시)-N,N-디메틸-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]프로판-1-아민(S-옥틸-CLinDMA); (2S)-1-{7-[(3β)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]헵틸옥시}-3-[(4Z)-데스-4-엔-1-일옥시]-N,N-디메틸프로판-2-아민; (2R)-1-{4-[(3β)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]부톡시}-3-[(4Z)-데스-4-엔-1-일옥시]-N,N-디메틸프로판-2-아민; 1-[(2R)-1-{4-[(3β)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]부톡시}-3-(옥틸옥시)프로판-2-일]구아니딘; 1-[(2R)-1-{7-[(3β)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]헵틸옥시}-N,N-디메틸-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]프로판-2-아민; 1-[(2R)-1-{4-[(3β)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]부톡시}-N,N-디메틸-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]프로판-2-아민; (2S)-1-({6-[(3β))-콜레스트-5-엔-3-일옥시]헥실}옥시)-N,N-디메틸-3-[(9Z)-옥타데스-9-엔-1-일옥시]프로판-2-아민; (3β)-3-[6-{[(2S)-3-[(9Z)-옥타데스-9-엔-1-일옥실]-2-(피롤리딘-1-일)프로필]옥시}헥실)옥시]콜레스트-5-엔; (2R)-1-{4-[(3β)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]부톡시}-3-(옥틸옥시)프로판-2-아민; (2R)-1-({8-[(3β)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]옥틸}옥시)-N,N-디메틸-3-(펜틸옥시)프로판-2-아민; (2R)-1-({8-[(3β)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]옥틸}옥시)-3-(헵틸옥시)-N,N-디메틸프로판-2-아민; (2R)-1-({8-[(3β)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]옥틸}옥시)-N,N-디메틸-3-[(2Z)-펜트-2-엔-1-일옥시]프로판-2-아민; (2S)-1-부톡시-3-({8-[(3β)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]옥틸}옥시)-N,N-디메틸프로판-2-아민; (2S-1-({8-[(3β)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]옥틸}옥시)-3-[2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9-헥사데카플루오로노닐)옥시]-N,N-디메틸프로판-2-아민; 2-아미노-2-{[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]메틸}프로판-1,3-디올; 2-아미노-3-({9-[(3β,8ξ,9ξ,14ξ,17ξ,20ξ)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]노닐}옥시)-2-{[(9Z,12Z)- 옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]메틸}프로판-1-올; 2-암모-3-({6-[(3β,8ξ,9ξ,14ξ,17ξ,20ξ)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]헥실}옥시)-2-{[(9Z)-옥타데스-9-엔-1-일옥시]메틸}프로판-1-올; (20Z,23Z)-N,N-디메틸노나코사-20,23-디엔-10-아민; (17Z,20Z)-N,N-디메틸헥사코사-17,20-디엔-9-아민; (16Z,19Z)-N,N-디메틸펜타코사-16,19-디엔-8-아민; (13Z,16Z)-N,N-디메틸도코사-13,16-디엔-5-아민; (12Z,15Z)-N,N-디메틸헤니코사-12,15-디엔-4-아민; (14Z,17Z)-N,N-디메틸트리코사-14,17-디엔-6-아민; (15Z,18Z)-N,N-디메틸테트라코사-15,18-디엔-7-아민; (18Z,21Z)-N,N-디메틸헵타코사-18,21-디엔-10-아민; (15Z,18Z)-N,N-디메틸테트라코사-15,18-디엔-5-아민; (14Z,17Z)-N,N-디메틸트리코사-14,17-디엔-4-아민; (19Z,22Z)-N,N-디메틸옥타코사-19,22-디엔-9-아민; (18Z,21Z)-N,N-디메틸헵타코사-18,21-디엔-8-아민; (17Z,20Z)-N,N-디메틸헥사코사-17,20-디엔-7-아민; (16Z,19Z)-N,N-디메틸펜타코사-16,19-디엔-6-아민; (22Z,25Z)-N,N-디메틸헨트리아콘타-22,25-디엔-10-아민; (21Z,24Z)-N,N-디메틸트리아콘타-21,24-디엔-9-아민; (18Z)-N,N-디메틸헵타코스-18-엔-10-아민; (17Z)-N,N-디메틸헥사코스-17-엔-9-아민; (19Z,22Z)-N,N-디메틸옥타코사-19,22-디엔-7-아민; N,N-디메틸헵타코산-10-아민; (20Z,23Z)-N-에틸-N-메틸노나코사-20,23-디엔-10-아민; 1-[(11Z,14Z)-1-노닐리코사-11,14-디엔-1-일]피롤리딘; (20Z)-N,N-디메틸헵타코스-20-엔-10-아민; (15Z)-N,N-디메틸헵타코스-15-엔-10-아민; (14Z)-N,N-디메틸노나코스-14-엔-10-아민; (17Z)-N,N-디메틸노나코스-17-엔-10-아민; (24Z)-N,N-디메틸트리트리아콘트-24-엔-10-아민; (20Z)-N,N-디메틸노나코스-20-엔-10-아민; (22Z)-N,N-디메틸헨트리아콘트-22-엔-10-아민; (16Z)-N,N-디메틸펜타코스-16-엔-8-아민; (12Z,15Z)-N,N-디메틸-2-노닐헤니코사-12,15-디엔-1-아민; (13Z,16Z)-N,N-디메틸-3-노닐도코사-13,16-디엔-1-아민; N,N-디메틸-1-[(1S,2R)-2-옥틸시클로프로필]헵타데칸-8-아민; 1-[(1S,2R)-2-헥실시클로프로필]-N,N-디메틸노나데칸-10-아민; N,N-디메틸-1-[(1S,2R)-2-옥틸시클로프로필]노나데칸-10-아민; N,N-디메틸-21-[(1S,2R)-2-옥틸시클로프로필]헤니코산-10-아민; N,N-디메틸-1-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-펜틸시클로프로필]메틸}시클로프로필]노나데칸-10-아민; N,N-디메틸-1-[(1S,2R)-2-옥틸시클로프로필]헥사데칸-8-아민; N,N-디메틸-1-[(1R,2S)-2-운데실시클로프로필]테트라데칸-5-아민; N,N-디메틸-3-{7-[(1S,2R)-2-옥틸시클로프로필]헵틸}도데칸-1-아민; 1-[(1R,2S)-2-헵틸시클로프로필]-N,N-디메틸옥타데칸-9-아민; 1-[(1S,2R)-2-데실시클로프로필]-N,N-디메틸펜타데칸-6-아민; N,N-디메틸-1-[(1S,2R)-2-옥틸시클로프로필]펜타데칸-8-아민; 및 (11E,20Z,23Z)-N,N-디메틸노나코사-11,20,23-트리엔-10-아민; 뿐만 아니라 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 전술된 것들 중 임의의 것의 입체이성질체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
상기 C12-200 양이온성 지질(1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-히드록시도데실)아미노)에틸)(2-히드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스(도데칸-2-올))은 분지형의 중합체-유사 구조에 분포된 5개의 3차 아민 구조를 갖는 이온화 가능한 지질이다. C12-200의 높은 순 양전하는 더 큰 RNA 분자를 나노입자 코어 내로 캡슐화하는 것을 향상시킬 수 있다. 이는 DNA, RNA 및 기타 음전하로 하전된 분자의 리포솜 형질감염을 위해 상업적으로 판매된다. 본 개시내용의 일부 양태에서, C12-200 지질 또는 이의 변형물과 조합된 DOTAP 지질 또는 이의 변형물이 간에 핵산을 특이적으로 전달하기 위해 지질 나노입자에 사용된다. C12-200의 구조는 하기와 같다:
Figure pct00002
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "비양이온성 지질"은 임의의 중성 지질뿐만 아니라 임의의 음이온성 지질도 지칭한다. "중성 지질"은 선택된 pH에서 비하전 또는 중성 쯔비터이온 형태로 존재하는 다수의 지질 종 중 임의의 것을 지칭한다. 생리학적 pH에서, 이러한 지질은, 예를 들어, 디아실포스파티딜콜린, 디아실포스파티딜에탄올아민, 세라미드, 스핑고미엘린, 세팔린, 콜레스테롤, 세레브로시드 및 디아실글리세롤을 포함한다. "음이온성 지질"은 생리학적 pH에서 음전하로 하전된 임의의 지질을 지칭한다. 이러한 지질은 포스파티딜글리세롤, 카디오리핀, 디아실포스파티딜세린, 디아실포스파티드산, N-도데카노일 포스파티딜에탄올아민, N-숙시닐 포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴포스파티딜에탄올아민, 리실포스파티딜글리세롤, 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG) 및 중성 지질에 결합된 기타 음이온성 변형기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용에 사용된 비양이온성 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 및/또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)이다. 실시형태에서, 상기 비양이온성 지질은 콜레스테롤(CHE) 및/또는 β-시토스테롤이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "지질 나노입자"는 나노 크기 입자의 다양한 유형의 조성물을 지칭하며, 여기서 지질을 포함하는 입자는 세포막 및 생물학적 장벽을 가로지르는 담체로서 기능하고 인간 및 기타 유기체의 표적 세포 및 조직에 화합물을 전달한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 본 개시내용의 "지질 나노입자"는 추가적인 지질 및 기타 성분을 추가로 포함할 수 있다. 지질 산화를 방지하거나 지질 나노입자 표면에 리간드를 부착하는 것과 같은 다양한 목적을 위해 다른 지질이 포함될 수 있다. 양친매성, 중성, 양이온성 및 음이온성 지질을 비롯한 다수의 지질 중 임의의 것이 본 개시내용의 지질 나노입자에 존재할 수 있다. 이러한 지질은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있고, 이중층 안정화 성분, 예를 들어, 폴리아미드 올리고머(예를 들어, 미국 특허 제6,320,017호 참조), 펩티드, 단백질, 세제, 지질 유도체, 예를 들어 포스파티딜에탄올아민에 결합된 PEG 및 세라미드에 접합된 PEG(예를 들어, 미국 특허 제5,885,613호 참조)를 또한 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 입자의 응집을 억제하는 "PEG" 접합된 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 접합체, 폴리아미드(ATTA)-지질 접합체 및 이들의 혼합물 중 하나 이상을 지칭한다. 일 양태에서, 상기 PEG-지질 접합체는 PEG-디알킬옥시프로필(DAA), PEG-디아실글리세롤(DAG), PEG-인지질, PEG-세라미드 및 이들의 혼합물 중 하나 이상이다. 일 양태에서, 상기 PEG-DAG 접합체는 PEG-디라우로일글리세롤(C12), PEG-디미리스토일글리세롤(C14), PEG-디팔미토일글리세롤(C16) 및 PEG-디스테아로일글리세롤(C18) 중 하나 이상이다. 일 양태에서, 상기 PEG-DAA 접합체는 PEG-디라우릴옥시프로필(C12), PEG-디미리스틸옥시프로필(C14), PEG-디팔미틸옥시프로필(C16) 및 PEG-디스테아릴옥시프로필(C18) 중 하나 이상이다. 일부 실시형태에서, PEG는 2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(PEG-DMG) 및/또는 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(PEG-DSG)이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "N/P 비율"은 양이온성 아미노 지질과 핵산의 음전하로 하전된 인산염기 사이의 (N)질소 대 (P)인산염 비율을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "다분산 지수" 또는 "PDI"는 크기에 기초한 샘플의 이질성의 척도이다. 다분산성은 샘플의 크기 분포 또는 분리 또는 분석 도중의 샘플의 응집으로 인해 발생할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "제타 전위" 또는 "표면 전하"는 분산액 내의 인접하고 유사하게 하전된 입자 사이의 정전기 반발의 정도를 지칭한다. 충분히 작은 분자와 입자의 경우, 높은 제타 전위가 안정성을 부여하며, 즉, 용액이나 분산액이 응집에 저항한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 핵산 "운반물"은 세포 또는 조직에 전달하기 위한 의도된 핵산(실시형태에서, 세포 또는 조직에 전달하기 위한 치료 핵산)을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "핵산-지질 나노입자"는 조직에 하나 이상의 핵산 운반물을 전달하기 위해 하나 이상의 핵산과 결합하거나 이를 캡슐화하는 전술된 지질 나노입자를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "캡슐화된"은 핵산에 완전한 캡슐화, 부분 캡슐화, 이온 힘 또는 반 데르 발스 힘에 의한 결합, 또는 전술된 것들 모두를 제공하는 핵산-지질 나노입자 제제를 지칭할 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 핵산은 상기 핵산-지질 나노입자 내에 완전히 캡슐화된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "핵산"은 합성 또는 자연 발생 RNA 또는 DNA, 또는 이의 유도체를 지칭한다. 일 실시형태에서, 본 개시내용의 운반물 및/또는 작용제는 이중 가닥 RNA(dsRNA)와 같은 핵산이다. 일 실시형태에서, 상기 핵산 또는 핵산 운반물은 단일 가닥 DNA 또는 RNA, 이중 가닥 DNA 또는 RNA, 또는 DNA-RNA 하이브리드이다. 예를 들어, 이중 가닥 DNA는 구조 유전자, 제어 및 종결 영역을 포함하는 유전자, 또는 바이러스 또는 플라스미드 DNA와 같은 자가 복제 시스템일 수 있다. 이중 가닥 RNA는 예를 들어 dsRNA 또는 또 다른 RNA 간섭 시약일 수 있다. 단일 가닥 핵산은 예를 들어 mRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 마이크로RNA 또는 삼중체 형성 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 핵산 또는 핵산 운반물은 변형된 RNA를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 변형된 RNA는 변형된 mRNA, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 변형된 siRNA 중 하나 이상이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 핵산 운반물은 핵산 조정 조절인자를 인코딩하는 변형된 mRNA이거나 또는 이를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "변형된 핵산"은 임의의 비천연 핵산을 지칭하며, 이는 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 5'-포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오티드, 콜레스테릴 유도체에 연결된 말단 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드, 5'-메톡시-변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 5'-메톡시유리딘), 2'-데옥시-변형된 뉴클레오티드, 잠긴 뉴클레오티드, 무염기 뉴클레오티드, 2'-아미노-변형된 뉴클레오티드, 2'-알킬-변형된 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포라미데이트, 뉴클레오티드를 포함하는 비천연 염기; 뉴클레오시드간 연결 또는 골격, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트, 예를 들어 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포라미데이트, 예를 들어, 3'-아미노 포스포라미데이트 및 아미노알킬포스포라미데이트, 티오노포스포라미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르 및 정상적인 3′-5′ 연결을 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2′-5′ 연결된 유사체 및 뉴클레오시드 단위의 인접 쌍이 3'-5'에서 5'-3' 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결된 반전된 극성을 갖는 것들을 포함하는 군으로부터 선택된 것들을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "핵산 조정 조절인자"는 단백질 조절인자 성분을 인코딩하는 mRNA를 지칭하지만, "핵산 조정 조절인자"에 대한 언급은 또한 mRNA-발현된 단백질 조절인자 성분 자체를 지칭할 수도 있다. 특정 실시형태에서, mRNA-인코딩된 단백질 조절인자 성분은 하나 이상의 후성유전적 조절인자 또는 뉴클레아제와 결합된(및 선택적으로, 이에 테더링된) 징크-핑거 단백질(ZFP: Zinc-Finger protein) 또는 다른 형태의 DNA 또는 RNA 결합 도메인(DBD 또는 RBD)을 포함한다(상기 후성유전적 조절인자 또는 뉴클레아제는 일반적으로 효과기, 효과기 도메인 또는 효과기 모이어티로 지칭된다). 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 본원에 기술된 핵산 조정 조절인자의 이점은 이것이 (1) 핵산 조정 조절인자-인코딩 mRNA가 발현되는 경우, (2) ZFP 또는 다른 핵산 결합 도메인의 핵산 결합이 발생하는 경우 및 (3) 결합된 효과기 도메인이 활성을 발휘할 수 있는 경우(즉, 효과기 도메인이 후성유전적 상태를 변경할 수 있는 경우(예를 들어, 후성유전적 조절인자의 경우))의 합류점에서만 내구성 있는 유전자 프로그래밍을 제공한다는 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "효과기 모이어티" 또는 "효과기 도메인"은 세포 내 적절한 부위, 예를 들어 세포의 핵에 국소화될 때 표적 유전자의 발현을 변경할 수 있는 도메인을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 효과기 모이어티는 전사 조직의 성분을 모집한다. 일부 실시형태에서, 효과기 모이어티는 전사 인자 또는 발현 억제 인자의 성분의 모집을 억제한다. 일부 실시형태에서, 효과기 모이어티는 후성유전적 변형 모이어티를 포함한다(예를 들어, 표적 DNA 서열을 후성유전적으로 변형한다). 효과기 모이어티의 구체적인 예는 특히, 크루펠-결합된 박스(KRAB: Krueppel-associated box) 도메인(KRAB은 진핵생물의 크루펠 유형 C2H2 징크 핑거 단백질(ZFP)의 약 1/3의 N-말단 부분에서 발견되는 약 75개 아미노산의 도메인임)에 결합할 수 있는 효과기 및 조작된 원핵생물 DNA 메틸트랜스퍼라제 MQ1를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "후성유전적 변형 모이어티"는, 상기 후성유전적 변형 모이어티가 (예를 들어, 표적화 모이어티에 의해) 핵산에 적절하게 국소화되는 경우, i) 염색질의 구조, 예를 들어 2차원 구조; 및/또는 ii) 후성유전적 마커(예를 들어, DNA 메틸화, 히스톤 메틸화, 히스톤 아세틸화, 히스톤 수모화, 히스톤 인산화 및 RNA 관련 침묵화 중 하나 이상)를 변경하는 도메인을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 후성유전적 변형 모이어티는 하나 이상의 후성유전적 마커에 영향을 미치는(예를 들어, 이의 수준을 증가시키거나 감소시키는) 효소, 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 후성유전적 변형 모이어티는 DNA 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 메틸트랜스퍼라제, CREB-결합 단백질(CBP), 또는 이들 중 임의의 것의 기능적 단편을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "발현 조절 서열"은 유전자의 전사를 증가 또는 감소시키는 핵산 서열을 지칭하며, 프로모터 및 인핸서를 포함한다(이에 제한되지는 않음). "인핸싱 서열(enhancing sequence)"은 발현 조절 서열의 하위 유형을 지칭하며 유전자 전사의 가능성을 증가시킨다. "침묵화 또는 억제인자 서열"은 발현 조절 서열의 하위 유형을 지칭하며 유전자 전사의 가능성을 감소시킨다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "발현 억제인자"는 세포에서 표적 유전자의 발현을 감소시키고 DNA 서열(예를 들어 표적 유전자와 연관된 DNA 서열 또는 표적 유전자에 작동 가능하게 연결된 전사 제어 요소)에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 작용성을 갖는 작용제 또는 실체를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 발현 억제인자는 적어도 하나의 표적화 모이어티 및 선택적으로, 하나의 효과기 모이어티를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "표적화 모이어티"는 게놈 서열 요소(예를 들어, 발현 조절 서열 또는 고정 서열; 프로모터, 인핸서 또는 CTCF 부위)를 특이적으로 표적화하는, 예를 들어 이에 결합하는, 작용제 또는 실체를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 상기 게놈 서열 요소는 표적 유전자(예를 들어, MYC)에 근접하고/거나 이에 작동 가능하게 연결된다.
본원에 사용된 바와 같이, "간 조직"은 간 세포, 혈관 세포, 내피 세포, 실질 세포, 비실질 세포, 섬유아세포, 중간엽 세포, 면역 세포, 암 세포, 쿠퍼 세포, 성상교세포, 타원형 혈관 내피 세포, 및 간 유래 줄기/전구 세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 간의 장기 내의 임의의 세포 또는 세포들의 집단을 지칭할 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 핵산-지질 나노입자는 간 조직을 표적화한다. 일부 다른 실시형태에서, 상기 핵산-지질 나노입자는 뇌, 신경, 피부, 눈, 인두, 후두, 심장, 혈관, 조혈(예를 들어, 백혈구 또는 적혈구), 유방, 폐, 췌장, 비장, 식도, 담낭, 위, 장, 결장, 신장, 방광, 난소, 자궁, 자궁 경부, 전립선, 근육, 뼈, 갑상선, 부갑상선, 부신 및 뇌하수체 세포 또는 조직을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 다른 세포 또는 조직을 표적화할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "국소화"는 유기체 및/또는 조직 내에서의 지질, 펩티드, 또는 본 개시내용의 지질 입자의 다른 성분의 위치를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 국소화는 개별 세포에서 검출 가능할 수 있다. 일부 실시형태에서, 국소화를 검출하기 위해 표지가 사용될 수 있으며, 예를 들어 형광 표지, 선택적으로, 형광 표지된 지질, 선택적으로, Cy7이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 지질 나노입자의 표지는 양자점, 또는 유도 라만 산란(stimulated Raman scattering)에 의해 검출 가능한 지질일 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 표지는 당업계에 알려진 임의의 형광단, 즉 자외선, 가시광선 또는 적외선 스펙트럼에서 여기 및 방출을 갖는 형광단이다. 일부 실시형태에서, 상기 국소화는 면역조직화학 또는 면역형광에 의해 검출되거나 추가로 확증된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "활성"은 본 개시내용의 성분 또는 조성물에 의해 매개되는 임의의 검출 가능한 효과를 지칭한다. 실시형태에서, 본원에서 사용된 바와 같이, "활성"은, 예를 들어 본 개시내용의 지질 입자의 운반물의, (직접적으로 또는 대용물에 의한) 측정 가능한 효과를 지칭할 수 있다. 활성의 예는 핵산 운반물(예를 들어, mRNA, CRISPR/Cas 시스템, RNAi 작용제, 핵산 조정 조절인자 등)의 세포내 발현 및 그에 따른 효과(들)를 포함하지만 이에 제한되지는 않으며, 이는, 선택적으로, 세포, 조직, 장기 및/또는 유기체 수준에서 측정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 "가속된 혈중 청소율(accelerated blood clearance)" 또는 "ABC"는 LNP 표면 상의 PEG 분자에 대한 면역계 활성화에 의해 야기되는 문서화가 잘 된 현상을 지칭한다. ABC는 반복 투여 시 전신 순환으로부터 나노입자를 제거하는 역할을 한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 지질 입자는 PEG-무함유 제제를 사용함으로써 지질 입자의 가속된 혈중 청소율을 피하거나 감소시킬 수 있으며, 이는 또한 이러한 지질 입자의 개선된(예를 들어, 독성이 덜하고/거나 더 효과적인) 반복 전신 투여를 제공할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "다중 투여"는 대상체에게 치료 요법의 일부로서 제공되는 지질 나노입자 제제의 2회 이상의 용량을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "간 질환 또는 장애"는 A형 간염, B형 간염, C형 간염, 지방간 질환, 간경변, 간암(예를 들어, 간 세포 암종), 혈색소증 및 윌슨병과 같은 질환 또는 장애를 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 인간 및 포유동물(예를 들어, 마우스, 래트, 돼지, 고양이, 개 및 말)을 포함한다. 많은 실시형태에서, 대상체는 포유동물, 특히 영장류, 특히 인간이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 소, 양, 염소, 소, 돼지 등과 같은 가축; 닭, 오리, 거위, 칠면조 등과 같은 가금류; 길들인 동물, 특히 개 및 고양이와 같은 애완동물을 포함한다. 일부 실시형태에서(예를 들어, 특히 연구의 맥락에서) 대상체 포유동물은 예를 들어 설치류(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터), 토끼, 영장류, 또는 근친교배 돼지와 같은 돼지 등이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 대상체에 대한 "투여"는, 선택적으로 정맥내 주사, 흡입, 정맥내, 동맥내, 기관내, 국소 투여를 위한, 비경구 투여를 포함하거나, 또는 조직으로의 직접 주사를 포함할 수 있다.
용어 "치료하는"는 질환(예를 들어, 종양 형성, 성장 및/또는 전이를 비롯한 암)의 증상, 합병증 또는 생화학적 징후의 발병을 예방하거나 지연시켜서 증상을 완화시키거나 질환, 병태 또는 장애의 추가적인 발생을 정지시키거나 억제하기 위한 조성물의 투여를 포함한다. 치료는 (질환의 발병을 예방 또는 지연시키거나, 이의 임상적 또는 준임상적 증상의 발현을 예방하기 위한) 예방적인 것일 수도 있고, 또는 질환 발현 후 증상의 치료적 억제 또는 완화일 수도 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "약학적 조성물"은 약리학적 유효량의 지질 입자, 선택적으로, 핵산 지질 나노입자(NLNP) 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "약리학적 유효량", "치료적 유효량" 또는 간단히 "유효량"은 의도된 약리학적, 치료적 또는 예방적 결과를 달성하는 데 효과적인 핵산의 양을 지칭한다. 예를 들어, 질환 또는 장애와 연관된 측정 가능한 매개변수가 적어도 25% 감소했을 때 특정 임상 치료가 효과적인 것으로 간주되는 경우, 상기 질환 또는 장애의 치료를 위한 약물의 치료적 유효량은 해당 매개변수에서의 적어도 25% 감소를 유도하는 데 필요한 양이다.
용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 치료제 투여를 위한 담체를 지칭한다. 이러한 담체는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
구체적으로 언급되거나 문맥상 명백하지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "또는"은 포괄적인 것으로 이해된다. 구체적으로 언급되거나 문맥상 명백하지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같이, 단수형은 단수 또는 복수인 것으로 이해된다.
본원에서, 범위는 "약" 하나의 특정 값 및/또는 내지 "약" 또 다른 특정 값으로 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현되는 경우, 또 다른 양태는 상기 하나의 특정 값 및/또는 내지 상기 다른 특정 값을 포함한다. 마찬가지로, 선행사 "약"을 사용하여 값이 근사치로 표현되는 경우, 상기 특정 값이 또 다른 양태를 형성하는 것으로 이해된다. 각 범위의 끝점은, 다른 끝점과 관련하여 및 다른 끝점과 독립적으로, 유의하다는 것이 추가로 이해된다. 또한, 본원에 개시된 다수의 값이 존재하며, 본원에서 각각의 값은, 그 값 자체에 더하여 "약" 해당 특정 값으로서 개시된다는 것이 또한 이해된다. 또한 본원 전반에 걸쳐 데이터는 다양한 형식으로 제공되며 이 데이터는 데이터 포인트의 임의의 조합에 대한 끝점, 시작점 및 범위를 나타낸다. 예를 들어, 특정 데이터 포인트 "10"과 특정 데이터 포인트 "15"가 개시된 경우, 10 및 15 초과, 이상, 미만, 이하, 및 해당 값 자체뿐만 아니라 10 내지 15도 개시된 것으로 이해된다. 2개의 특정 단위 사이의 각각의 단위 또한 개시된 것으로 이해된다. 예를 들어 10과 15가 개시된 경우, 11, 12, 13, 14 또한 개시된 것이다.
본원에 제공된 범위는 해당 범위 내의 모든 값을 줄여서 표현한 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50로 구성된 군으로부터의 임의의 숫자, 숫자들의 조합, 또는 하위 범위뿐만 아니라 전술된 정수 사이에 있는 모든 소수점 값, 예를 들어, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 및 1.9를 포함하는 것으로 이해된다. 하위 범위와 관련하여, 범위의 양쪽 끝점으로부터 확장되는 "내포된 하위 범위(nested sub-range)"가 구체적으로 고려된다. 예를 들어, 1 내지 50의 예시적인 범위의 내포된 하위 범위는 한쪽 방향으로는 1 내지 10, 1 내지 20, 1 내지 30, 및 1 내지 40, 또는 다른 방향으로는 50 내지 40, 50 내지 30, 50 내지 20 및 50 내지 10을 포함할 수 있다.
"포함하는(including)", "함유하는" 또는 "~을 특징으로 하는"과 동의어인 연결 용어 "포함하는(comprising)"은 포괄적이거나 개방형이며, 언급되지 않은 추가적인 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 대조적으로, 연결 어구 "~로 구성된(consisting of)"은 청구항에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 연결 어구 "본질적으로 ~로 구성된"은 청구범위의 범위를 명시된 물질 또는 단계 및 청구된 발명의 "기본적이고 신규한 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들"로 제한한다.
하기에 제시되고 청구범위에 언급된 실시형태는 상기 정의를 고려하여 이해될 수 있다.
본 개시내용의 다른 특징 및 이점은 이의 바람직한 실시형태에 대한 하기의 설명과 청구범위로부터 명백해질 것이다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질을 아래에 기술한다. 본원에 인용된 모든 공개된 외국 특허 및 특허 출원은 원용에 의해 본원에 포함된다. 본원에 인용된 기타 모든 공개된 참고문헌, 문서, 원고 및 과학 문헌은 원용에 의해 본원에 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 포함하여, 본 명세서가 우선한다. 또한, 상기 물질, 방법 및 실시예는 예시적인 것일 뿐이며 제한하려는 의도는 아니다.
예시로서 제시되지만 본 개시내용을 기술된 특정 실시형태로만 제한하려는 의도는 아닌, 하기의 상세한 설명은 첨부 도면과 결합할 때 가장 잘 이해될 수 있으며,
도 1a 내지 도 1c 는 검증된 이온화 가능한 지질 및 별개의 다가 양이온성 중합체로 제조된 초기 혼합 지질 입자의 조성 및 특성을 도시한다. 도 1a 는 DOPC, MC3, bPEI, CHE, PEG2k-DMG를 비롯한 초기 혼합 입자를 구성하는 성분뿐만 아니라 입자 크기, 제타 전위, 다분산 지수를 비롯한 혼합 지질 입자의 특성화 결과의 표를 도시한다. 도 1b 는 초기 혼합 지질 입자로 48시간 동안 연속적으로 치료한 후의 Hepa 1-6 세포의 형질감염 후 이미지를 도시한다. 도 1c 는 첨가된 혼합 지질 입자의 다양한 부피(10 μl, 5 μl 및 2.5 μl)에 걸쳐 Hepa 1-6 세포에 대해 관찰된 세포 생존율(%)의 용량-반응을 보여주는 그래프를 제시한다.
도 2a 내지 도 2c 는 혼합 지질 입자가, 전통적으로 형질감염시키기 어려운 세포 집단 내로 핵산 운반물을 형질감염시켰다는 것을 보여준다. 도 2a 는 "MbP-2" 혼합 지질 입자의 성분(표시된 수준의 DOPC, MC3, bPEI, CHE, 및 PEG2k-DMG를 포함함)뿐만 아니라 MC3-단독 지질 입자의 성분(DOPC, MC3, CHE, 및 PEG2k-DMG를 포함함)을 나열한 표를 제시한다. 도 2b 는 대조군 제제, 혼합 지질(MbP-2) 나노입자 제제, 및 MC3-단독 지질 나노입자 제제로 각각 치료된 Hepa 1-6 세포의 집단에 걸쳐 관찰된 GFP 및 Cy5 신호 발현 수준의 플롯을 도시한다. 특히, MC3-단독 지질 나노입자로 치료된 세포의 16% GFP mRNA 형질감염률과 비교하여, 혼합 지질(MbP-2) 나노입자로 치료된 세포의 50% 초과에서 효과적인 GFP mRNA 형질감염이 관찰되었다. 도 2c 는 이러한 형질감염된 세포 집단의 GFP 신호 발현 분포를 도시한다. 특히, 혼합 지질 나노입자는 MC3-단독 지질 나노입자와 비교하여 형질감염된 세포에서 평균 1.5배 증가된 GFP 신호를 생성하였으며, 혼합 지질 나노입자 치료된 세포에서 관찰된 이러한 GFP 수준은 또한 대조군 치료된 세포에서의 GFP 신호 수준보다 평균 20배 더 높았다.
도 3a 내지 도 3d 는 LNP 치료된 A549 인간 폐암 세포에서의 세포 생존율에 대한 DOTAP/C12-200(DC) 혼합 지질 나노입자(LNP: lipid nanoparticle)의 효과를 도시한다. 도 3a 는 혼합 지질 입자의 다양한 제제(믹스 C 내지 믹스 N)의 성분 및 평가된 특징의 표를 도시한다. 혼합 지질 입자 C 내지 N는 C12-200, DOTAP, DOPE, 콜레스테롤(CHE) 및 PEG2k-DMG(믹스 J가 유일한 예외임)를 포함하였다. 도 3b 는 믹스 C, 믹스 D, 믹스 E, 믹스 F, 믹스 G 및 대조군 제제를 비롯한 다양한 혼합 지질 핵산-지질 입자를 사용한 하기의 치료 후의 A549 인간 폐암 세포의 관찰된 세포 생존율을 나타내는 히스토그램을 도시하며, 여기서 혼합 지질 입자 제제 내의 C12-200의 몰농도 백분율은 18%로 유지된 반면, 이들 혼합 지질 제제 내의 DOTAP 및 DOPE의 백분율은 변경되었다. 도 3c 는 믹스 C, 믹스 H, 믹스 I 및 대조군 제제를 비롯한 다양한 혼합 지질 핵산-지질 입자를 사용한 하기의 치료 후의 A549 인간 폐암 세포의 관찰된 세포 생존율을 나타내는 히스토그램을 도시하며, 여기서 혼합 지질 입자 제제 내의 C12-200의 몰농도 백분율은 18%로 유지된 반면, 이들 혼합 지질 제제 내의 PEG-지질의 백분율은 변경되었다. 도 3d 는 믹스 K, 믹스 L, 믹스 M, 믹스 N 및 대조군 제제를 비롯한 다양한 혼합 지질 핵산-지질 입자를 사용한 하기의 치료 후의 A549 인간 폐암 세포의 관찰된 세포 생존율을 나타내는 히스토그램을 도시하며, 여기서 혼합 지질 입자 제제 내의 C12-200의 몰농도 백분율은 18%로 유지된 반면, 이들 혼합 지질 제제 내의 DOTAP에 대비한 콜레스테롤의 백분율은 변경되었다.
도 4a 내지 도 4c 는 LNP 치료된 A549 인간 폐암 세포에서의 DOTAP/C12-200(DC) 혼합 지질 나노입자(LNP)의 형질감염 효능을 도시한다. 도 4a 는 상기 도 3a에 나열된 믹스 C, 믹스 D, 믹스 E, 믹스 F, 믹스 G 및 대조군 제제를 비롯한 다양한 혼합 지질 핵산-지질 입자로 치료된 A549 인간 폐암 세포에서 관찰된 형질감염된 리포터 mCherry 신호를 나타내는 히스토그램을 도시한다. 도 4b 는 상기 도 3a에 나열된 믹스 C, 믹스 H, 믹스 I 및 대조군 제제를 비롯한 다양한 혼합 지질 핵산-지질 입자로 치료된 A549 인간 폐암 세포에서 관찰된 형질감염된 리포터 mCherry 신호를 나타내는 히스토그램을 도시한다. 도 4c 는 상기 도 3a에 나열된 믹스 K, 믹스 L, 믹스 M, 믹스 N 및 대조군 제제를 비롯한 다양한 혼합 지질 핵산-지질 입자로 치료된 A549 인간 폐암 세포에서 관찰된 형질감염된 리포터 mCherry 신호를 나타내는 히스토그램을 도시한다.
도 5 는 0.16 μg/ml의 믹스 C로 치료된 A549 인간 폐암 세포의 현미경 이미지를 도시하며, 여기서 청색 신호는 핵을 나타내고 적색 신호는 형질감염된 mCherry 리포터 발현을 나타낸다. 특히, 상기 이미지의 모든 세포는 0.16 μg/ml의 낮은 형질감염된 mRNA 농도에서도 mCherry 리포터를 명확하게 발현하였다.
도 6a 및 도 6b 는 혼합 지질 입자가 다양한 저장 조건 하에서 안정하다는 것을 보여준다. 도 6a 는 물만 함유하는 용액, 10% 수크로스를 갖는 물, HEPES 완충제 단독, 및 10% 수크로스를 갖는 HEPES 완충제 각각에 저장된 4°C 또는 -80°C에서의 35일 저장 전후의 혼합 지질 입자 특성의 표를 도시한다. 도 6b 는 4°C(컬럼 1 및 2) 또는 -80°C(컬럼 4 및 5)에서 물에 저장된, RNA 운반물을 포함하는 혼합 지질 입자에 대해 수행된 겔 전기영동의 이미지를 도시한다. 컬럼 2 및 5는 2% Triton X-100으로 치료되었으며, 이는 상기 입자를 파괴하고 유리 RNA가 겔을 가로질러 흐르도록 하였다. 특히, 모든 제제는 4°C에서 안정적으로 유지된 반면, 동결보호제(10% 수크로스)를 갖는 혼합 지질 입자만 -80°C에서 이의 특성을 보존하였다.
도 7a 내지 도 7d 는 핵 Cre 활성화된 tdTomato(tdTom) 리포터를 보유하는 마우스에 mCre mRNA를 보유하는 혼합 지질 입자를 투여하면 간에서의 선택적 전달 및 tdTom 생성이 발생함을 보여준다. 도 7a 는 생체내에서 mCre mRNA를 전달하기 위해 사용된 2개의 상이한 혼합 지질 입자의 성분 및 특성에 대한 표를 도시하며, 여기서 성분 "C"는 C12-200을 나타낸다. 도 7b 는 대조군으로서의 MC3-단독 mCre mRNA 입자(3 mg/kg으로 투여됨)와 비교하여, 두 혼합 지질 mCre mRNA 입자(1 mg/kg으로 투여됨) 모두에 대해 다양한 장기(간, 폐 및 비장)에서 관찰된 발현된 tdTom 신호의 플롯을 도시한다. 도 7c 는 다양한 장기에서의 tdTom 신호의 대표적인 이미지를 도시한다. 특히, 시험된 두 혼합 지질 입자 모두에서 매우 특이적인 간 활성이 관찰되었다. 도 7d 는 면적에 대해 정규화된 간, 폐 및 비장에서의 tdTom 신호 강도의 플롯을 도시하며, 이는 혼합 지질 mCre mRNA 입자가 MC3-단독 mCre mRNA 지질 입자 대조군보다 80 내지 100% 더 높은 비율로 생체내에서 간 세포를 형질감염시켰음을 나타냈다.
도 8 은 시험된 혼합 지질 입자(상기 도 7a에 기술된 바와 같음)의 간에서의 세포 결합을 보여준다. 간 샘플의 면역조직화학 이미지가 표시되었으며, 이는 시험된 두 입자 모두(둘 모두 갈색으로 염색됨)에 대해 tdTomato 생성 및 Cy7 표지된 입자 축적을 확인시켜 주었다.
도 9a 내지 도 9f 는 마우스에서의 혼합 지질과 DOTAP 입자의 간 기능 안전성 평가 시험을 제시하는 플롯을 도시한다. 수행된 간 기능 시험은 하기를 포함하였다: 알칼리성 포스파타제(ALP) 수준( 도 9a ), 알라닌 트랜스아미나제(ALT) 수준( 도 9b ), 아스파르테이트 트랜스아미나제(AST) 수준( 도 9c ), 직접 빌리루빈(DBILI) 수준( 도 9d ), 총 빌리루빈(TBILI) 수준( 도 9e ), 및 락테이트 탈수소효소(LDH) 수준( 도 9f ). 특히, 본 개시내용의 혼합 지질 입자는 1 mg/kg mRNA 용량에서 안전한 것으로 확인되었다.
도 10a 및 도 10b 는 핵산 조정 조절인자(VEGFa 발현을 유도하는 것으로 알려져 있음)를 보유하는 혼합 지질 입자는, 마우스에 투여되었을 때, 혈청 VEGFa 수준을 확실하게 증가시켰다는 것을 보여준다. 도 10a 는, PBS 치료된 대조군 마우스와 비교하여, 표시된 투여 농도 전반에 걸쳐, VEGFa 조정 조절인자를 보유하는 혼합 지질 입자 DC20182 및 DC50182를 투여한 후 관찰된 혈청 VEGFa 수준의 히스토그램을 제시한다. 도 10b 는, 상기 도 10a의 핵산-지질 입자에 걸쳐, PBS 대조군 수준에 대비한 VEGFa 수준에서의 관찰된 백분율 변화를 표시하는 히스토그램을 제시한다. 특히, 혼합 지질 입자 내의 VEGFa 조정 핵산 조절인자를 세 가지 다른 용량 수준으로 마우스에 정맥내 투여한 것은, 대조군 치료된 마우스와 비교하여, 특히 1 mg/kg 용량 수준에서, 혈청 VEGFa 수준의 상당한 증가를 유발하였다.
본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 대상체의 세포에 지질 입자-결합된 분자 운반물을 전달하기 위한 혼합 양이온성 지질 입자 조성물, 제제 및 관련 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 대상체의 간에, 결합된 핵산 운반물을 우선적으로 국소화하고 전달하는 핵산 지질 나노입자가 제공되며, 여기서 전달은 대상체의 간 내의 다양한 유형의 조직으로 발생한다. 특히, 본 개시내용의 입자는 이온화 가능한 지질과 하나 이상의 별개의 양이온성 지질의 혼합물을 포함하며, 또한 특정 실시형태에서는, 비양이온성 "헬퍼" 지질, 구조적 지질(예를 들어, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체) 및/또는 안정화제/항응집 지질(예를 들어, PEG-지질)을 포함한다.
핵산 요법은 유전자 수준에서 질환을 치료할 수 있는 엄청난 잠재력이 있는 것으로 잘 알려져 있다. 그러나 핵산 치료제에는 안전하고 효과적인 전달 시스템이 필수적이다. 장기와 조직으로의 비특이적 전달은 종종 부위 외 효과와 독성을 초래한다. 특정 관심 장기에 치료제를 전달하는 것은 지질 나노입자 개발뿐만 아니라 일반적으로 약물 개발에서도 잘 알려진 요구 사항이다. 신체의 다른 부위에 해를 끼치지 않으면서 질환의 원인만을 표적화한다는 개념은 120년 전 Ehrlich에 의해 설명되었다. 그러나, 현존하는 방법은 추가적인 리간드 기반 표적화 전략을 도입하지 않으면서 특정 조직을 표적화하는 나노입자를 개발하기 위한 정의되거나 잘 알려진 방법론을 제공하지 않는다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같은, 조직에 대한 지질의 구조적 친화도에 기초한 지질 나노입자의 장기 특이적 표적화는, 부위 외 효과 및 독성을 감소시키는 측면에서, 잘 확립된 요구를 충족시킨다.
전통적인 LNP는 네 가지 주요 성분으로 구성된다. mRNA 캡슐화를 위한 이온화 가능한 또는 양이온성 지질, 효능 증가를 위한 양친매성 헬퍼 인지질, 구조적 안정성을 위한 콜레스테롤, 입체 안정성을 위한 PEG 지질이다. 이러한 1세대 LNP는 "하나의 이온화 가능한 지질-단독 LNP" 또는 "단일 LNP"로 간주될 수 있다. 일반적으로, 효과적인 세포내 전달 물질은, RNA에 결합하고 이를 방출하기 위한 이온화 가능한 아민(6.0 내지 6.5의 pKa)과 나노입자 안정화 소수성의 최적 균형에 의존해 왔다. 따라서 간 및 간 세포에 대한 매우 효과적인 전달 플랫폼인 것으로 입증된 이온화 가능한 지질 개발에 대해 초점이 철저히 맞춰져 왔다. 그러나, 이온화 가능한/양이온성 지질의 화학 구조를 변경하여 다양한 pKa 값을 달성하고 라이브러리를 생성하는 것은, 검증되었음에도 불구하고, 시간 소모적이고 투자가 많이 들고 노동 집약적인 작업이다.
본원에서는, 하나 초과의 양이온성 지질을 사용하면, 증가된 세포내 전달 효능을 위해 전체 시스템의 pKa를 미세 조정함으로써 핵산 전달에 유용한 특성을 갖는 독특한 LNP를 생성할 수 있고, 또한 추가적인 지질의 구조적 친화도에 의해 단일 LNP의 방향성을 변경할 수도 있다는 것이 처음에 고려되었다. 본 개시내용의 초기 연구에서는, 혼합 이온화 가능한 지질/양이온성 중합체 제제가 제조되었으며, 이는 핵산-지질 나노입자 전달 양식과 같은 입자의 사용을 가능하게 하는 크기 및 기타 특성(시험관 내에서의 낮은 세포 독성 포함)을 갖는 것으로 확인되었다. 이어서, 이온화 가능한 지질을 다가 양이온성 중합체(분지형 폴리에틸렌이민, bPEI)와 조합한 혼합 지질 입자가 유사한 특성을 나타내는 것으로 밝혀졌으며, 이는 또한 전통적으로 형질감염시키기 어려운 세포 집단(예를 들어, 1차 T 세포)에 심지어 대형 핵산 조정 조절인자(예를 들어, 단백질 조절인자 성분을 인코딩하는 mRNA)를 효과적으로 형질감염시킬 수 있는 것으로 확인되었다.
잘 알려진 4차 아미노 지질인 DOTAP는 특정 핵산-지질 나노입자(LNP)의 구조적 성분이며, 이는 이러한 LNP에서 추가적인 활성 표적화 성분을 필요로 하지 않으면서 폐 특이적 핵산 전달을 나타내는 것으로 최근에 설명되었다. 이어서, 혼합 양이온성 지질로서 이온화 가능한 지질과 DOTAP 둘 모두를 포함하는 지질 입자를 제조하였고 핵산 운반물 전달의 효능에 대해서뿐만 아니라 (조직 특이성/특이성들이 확인될 수 있는지 여부 및/또는 어떠한 특이성/특이성들이 확인될 수 있는지에 대한 선험적 지식 없이) 조직 특이적 전달이 관찰되는지 여부에 대해서도 이를 평가하였다. C12-200이 이러한 예시된 DOTAP 함유 혼합 지질 제제에 대한 이온화 가능한 지질로 선택되었지만, 다른 이온화 가능한 지질이 여전히 효과적인 입자를 생성하면서 C12-200을 대체할 수 있는 것으로 분명히 고려된다. 예시적인 실시형태에서, 사용된 비양이온성 "헬퍼 지질"은 DOPE(1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민)였으며, 이는 역육각형 상을 형성하는 이의 능력으로 인해 엔도솜 막과 융합함으로써 엔도솜 탈출(endosomal escape)을 개선하는 이의 설명된 능력으로 인해 선택되었다. LNP의 불포화 지질 구조에 포화를 추가하면 이러한 LNP의 세포내 활성이 개선된다는 것이 이전에 확인되었다. 한편, 현재 예시된 입자에서, 콜레스테롤 및 PEG2k-DMG 수준은 이전에 기술된 입자의 수준과 유사한 수준으로 유지되었다.
본원에 제시된 데이터는 DOTAP 기반 LNP에 C12-200을 첨가하면 이러한 제제의 방향성을 폐에서 간으로 변화시킨다는 것을 구체적으로 확인시켜 주었으며, 동시에, 이로 인해, 전신 투여 시의 이러한 혼합 LNP의 장기 선택적 활성을 또한 입증하였다. 간단히 말하면, 입자 크기, 표면 전하 및 PEG화와 관계없이, 50 mol% DOTAP을 갖는 LNP는 폐 조직에 대한 DOTAP의 구조적 친화도에 기인하는 강력한 폐 표적화를 제공한다는 것이 이전에 보고되었다. 본 개시내용은 간에서의 C12-200/DOTAP 혼합 지질 입자의 특이적 활성을 발견했으며, 이는 본원에서 리포터 기반 생체분포 및 효능 연구에 의해 확인되었다. 더욱이, (C12-200의 가능한 독성을 완화하기 위해) 낮은 수준의 C12-200을 사용하는 혼합 지질 입자 제제의 라이브러리를 본원에 기술하였다. 혼합 지질 입자에 18%로 존재할 때 C12-200은 활성 표적화 리간드 없이도 간 표적화 효과를 제공할 수 있었다.
전술된 바와 같이, C12-200은 높은 순 양전하를 보유하며, 이는 (분자당 하나의 아민만을 제시하는 DOTAP 및 MC3와 같은 다른 양이온성 지질과 비교하여) 나노입자의 코어 내로의 더 큰 RNA 분자의 캡슐화를 향상시킬 수 있다. 따라서, 강력한 RNA/C12-200 패킹은, 이러한 입자의 전체 직경에 큰 영향을 주지 않으면서, C12-200 함유 입자의 나머지 지질 성분과 표면 전하를 미세 조정할 수 있다. 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 엔도솜 산성 pH에서의 C12-200 함유 입자의 높은 순 양전하는 또한, 양성자 스폰지 효과로 인해, 표적 세포의 세포질 내로의 운반물 전달을 개선할 수 있다. 따라서, 이러한 입자는 더 낮은 치료 용량에서 효율적인 mRNA 형질감염을 제공할 수 있다. 본 개시내용의 입자는 또한 혼합 지질 입자의 더 큰 라이브러리를 개발하기 위한 기초를 제공하며, 이는, 이러한 혼합 지질 입자의 성분을 미세 조정함으로써, 활성 표적화 리간드를 사용할 필요가 없이, 현재 설명된 것들(가장 특히, 비경구적으로 투여될 수 있는 폐 특이적 입자와 간 특이적 입자 각각)과 상이한 장기/조직 표적화를 허용할 것으로 예상될 수 있다.
따라서, 본 개시내용은, 제한 없이, 하기의 특징 및 이점을 제공한다: (1) 이온화 가능한 지질(본원에 구체적으로 예시된 C12-200)의 도입을 통해 DOTAP 기반 입자의 주요 표적 장기를 폐에서 간으로 변경함; (2) 이러한 DOTAP 기반 입자의 사용을 통한 핵산 운반물/치료제의 간 특이적 전달; (3) 표적 외 독성의 예방(예시된 C12-200 수준을, C12-200 관련 세포독성 효과가 발생할 것으로 예상되는 수준보다 높은 약 20% 미만으로 유지함으로써 독성을 감소/예방하는 것을 포함함); (4) (예시된 바와 같이, IV에 의한) 전신 투여 시 효능을 증가시켜 DLin-MC3-DMA를 사용하는 널리 사용되는 간 표적화 LNP에 대한 개선된 대안을 제공함; 및 (5) 입자 형성 공정이 확장 가능하고 일관성이 있어 직접 투여를 위한 인간 치료 제제에 사용할 수 있음.
본 개시내용의 DOTAP/이온화 가능한 지질 입자는 간 조직에 운반물을 선택적으로 전달하는 것으로 확인되었으며, 일부 양태에서는, 본 개시내용의 DOTAP/이온화 가능한 지질 입자 또는 이의 변형물을 사용한, 관절 및/또는 염증 부위 및/또는 비장과 같은 누출성 또는 유창 모세혈관이 있는 다른 영역으로의 전달이 또한 고려된다. 또한, 흡입, 국소 도포 또는 비-정맥내 주사를 통한 본 개시내용의 입자의 투여 또한 분명히 고려된다. 제한 없이, 본 개시내용의 핵산-지질 입자, 약학적 조성물 또는 주사물은 비-정맥내 경로, 예를 들어 기관내 주사, 관절내 주사, 피하 주사, 피내 주사 및/또는 근육내 주사를 통해 투여될 수 있다.
본 개시내용의 특정 조성물 및 방법의 다양한 분명히 고려되는 성분이 하기에서 추가로 상세하게 고려된다.
DOTAP/C12-200 기반 지질 나노입자("DC LNP") 조성물
1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판, DOTAP 또는 18:1 TAP는 양이온성 지질이다. DOTAP는 이의 4차 구조로 인해 pH와 관계없이 양이온으로 하전된다. DOTAP(C42H80NO4 +)의 구조는 상기에 제시되어 있다.
C12-200(1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-히드록시도데실)아미노)에틸)(2-히드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스(도데칸-2-올))은 분지형의 중합체-유사 구조에 분포된 5개의 3차 아민 구조를 갖는 이온화 가능한 지질이다. C12-200의 구조 또한 상기에 제시되어 있다.
본 개시내용의 지질 입자의 특정 실시형태 및 본 개시내용의 관련 방법에서, 본 개시내용의 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 또는 약 10% 내지 50%(몰 기준)가 DOTAP이다. 본 개시내용의 지질 입자의 특정 실시형태 및 본 개시내용의 관련 방법에서, 총 지질의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 약 5% 내지 약 20%, 약 20% 미만, 약 12% 내지 약 45%, 또는 약 18%(몰 기준)이 이온화 가능한 지질(예를 들어, C12-200)이다. 본 개시내용의 지질 입자의 특정 실시형태 및 본 개시내용의 관련 방법에서, 총 지질의 적어도 약 0.1%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 40%, 적어도 약 60%, 약 24% 내지 약 64%, 약 24%, 약 34%, 약 44%, 약 54% 또는 약 64%(몰 기준)는 콜레스테롤, β-시토스테롤 및/또는 이의 유도체이다. 특정 실시형태에서, 총 지질의 적어도 약 0.1%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 40%, 약 6% 내지 약 46%, 약 6%, 약 7%, 약 7.5%, 약 8%, 약 16%, 약 26%, 약 36% 또는 약 46%(몰 기준)는 기타 비양이온성 지질, 예를 들어, DOPE, DOPC 및/또는 DSPC이다. 본 개시내용의 지질 입자의 특정 실시형태 및 본 개시내용의 관련 방법에서, 상기 입자는 존재하는 총 지질의 0.01 mol% 내지 약 3 mol%, 약 0.5 mol %, 약 1.0 mol%, 약 1.5 mol%, 또는 약 2.0 mol%로 존재하는, 입자의 응집을 억제하는 접합된 지질을 포함한다. 이러한 접합된 지질의 예는 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 접합체, 예를 들어 PEG2000-지질 접합체, 예를 들어 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2k) 및 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DSG-PEG2k)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
임의의 크기의 지질 나노입자가 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다. 본 개시내용의 특정 실시형태에서, 지질 나노입자는 직경이 약 0.02 마이크론 내지 약 0.4 마이크론, 약 0.05 내지 약 0.2 마이크론, 또는 0.07 내지 0.12 마이크론 범위인 크기를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 상기 LNP는 또한, 양성자화 가능한 3차 아민 (예를 들어, pH 적정 가능한) 헤드기; 각각의 알킬 사슬이 독립적으로 0 내지 3개의(예를 들어, 0, 1, 2 또는 3개의) 이중 결합을 갖는 C18 알킬 사슬; 및 상기 헤드기과 알킬 사슬 사이의 에테르, 에스테르 또는 케탈 연결을 포함하는 것들을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 다른 양이온성 지질을 포함할 수 있다. 이러한 양이온성 지질은 1,2-디스테아릴옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DSDMA), 1,2-디올레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DODMA), 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DLinDMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DLenDMA), 1,2-디-γ-리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(γ-DLenDMA), 1,2-디리놀레일옥시-케토-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DLinK-DMA), 1,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLinKC2-DMA)(DLin-C2K-DMA, XTC2, 및 C2K로도 알려짐), 2,2-디리놀레일-4-(3-디메틸아미노프로필)[1,3]-디옥솔란(DLin-K-C3-DMA), 2,2-디리놀레일-4-(4-디메틸아미노부틸)[1,3]-디옥솔란(DLin-K-C4-DMA), 1,2-디리놀레닐옥시-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(γ-DLen-C2K-DMA), 1,2-디-γ-리놀레닐옥시-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(γ-DLen-C2K-DMA), 디리놀레일메틸-3-디메틸아미노프로피오네이트(DLin-M-C2-DMA)(MC2로도 알려짐), (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노) 부타노에이트(DLin-M-C3-DMA)(MC3으로도 알려짐) 및 3-(디리놀레일메톡시)-N,N-디메틸프로판-1-아민(DLin-MP-DMA)(1-B11로도 알려짐)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 입자는 중성 지질, 예를 들어 디아실포스파티딜콜린, 디아실포스파티딜에탄올아민, 세라미드, 스핑고미엘린, 세팔린, 콜레스테롤, 세레브로시드 및 디아실글리세롤을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, LNP는 포스파티딜글리세롤, 카디오리핀, 디아실포스파티딜세린, 디아실포스파티드산, N-도데카노일 포스파티딜에탄올아민, N-숙시닐 포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴포스파티딜에탄올아민, 리실포스파티딜글리세롤, 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG) 및 중성 지질에 결합된 기타 음이온성 변형기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 음이온성 지질을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용에 사용된 비양이온성 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 및/또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)이다. 일부 양태에서, 본 입자의 하나 이상의 비양이온성 지질은 콜레스테롤(CHE), β-시토스테롤 및/또는 이의 유도체이다.
PEG-접합된 지질을 사용하는 일부 실시형태에서, 상기 PEG-접합된 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 접합체, 폴리아미드(ATTA)-지질 접합체 및 이들의 혼합물 중 하나 이상이다. 일 양태에서, 상기 PEG-지질 접합체는 PEG-디알킬옥시프로필(DAA), PEG-디아실글리세롤(DAG), PEG-인지질, PEG-세라미드 및 이들의 혼합물 중 하나 이상이다. 일 양태에서, 상기 PEG-DAG 접합체는 PEG-디라우로일글리세롤(C12), PEG-디미리스토일글리세롤(C14), PEG-디팔미토일글리세롤(C16) 및 PEG-디스테아로일글리세롤(C18) 중 하나 이상이다. 일 양태에서, 상기 PEG-DAA 접합체는 PEG-디라우릴옥시프로필(C12), PEG-디미리스틸옥시프로필(C14), PEG-디팔미틸옥시프로필(C16) 및 PEG-디스테아릴옥시프로필(C18) 중 하나 이상이다. 일부 실시형태에서, PEG는 2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(PEG-DMG) 및/또는 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(PEG-DSG)이다.
일부 실시형태에서, 양친매성 지질이 본 개시내용의 입자에 포함된다. 양친매성 지질은, 지질 물질의 소수성 부분은 소수성 상으로 배향되는 반면, 친수성 부분은 수성 상으로 배향되는 임의의 적합한 물질을 지칭할 수 있다. 이러한 화합물은 인지질, 아미노지질 및 스핑고지질을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 대표적인 인지질은 스핑고미엘린, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티드산, 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 또는 디리놀레오일포스파티딜콜린을 포함한다. 스핑고지질, 글리코스핑고지질 계열, 디아실글리세롤 및 β-아실옥시산과 같은 기타 인-결여 화합물 또한 사용될 수 있다. 또한, 이러한 양친매성 지질은 트리글리세리드 및 스테롤과 같은 다른 지질과 쉽게 혼합될 수 있다.
또한 본 개시내용의 지질 입자에 포함되기에 적합한 것은 프로그래밍 가능한 융합 지질 제제이다. 이러한 제제는 특정 신호 이벤트가 발생할 때까지는 세포막과 융합하여 운반물을 전달하는 경향이 거의 없다. 이는 상기 지질 제제로 하여금, 유기체 또는 질환 부위에 주사된 후 세포와 융합되기 시작하기 전에, 보다 균일하게 분포되도록 허용한다. 상기 신호 이벤트는 예를 들어 pH, 온도, 이온 환경 또는 시간의 변화일 수 있다. 후자의 경우, ATTA-지질 접합체 또는 PEG-지질 접합체와 같은 융합 지연 또는 "은폐(cloaking)" 성분은 시간이 지남에 따라 지질 나노입자 막 밖으로 간단히 이동할 수 있다. 상기 제제가 체내에 적절하게 분포될 때쯤에는, 융합을 일으킬 만큼 충분한 은폐제(cloaking agent)가 손실된다. 다른 신호 이벤트의 경우, 염증 부위의 온도 상승과 같은 질환 부위 또는 표적 세포와 관련된 신호를 선택하는 것이 바람직하다.
특정 실시형태에서, 세포 유형 또는 조직에 특이적인 표적화 모이어티를 사용하여 본 개시내용의 지질 입자를 추가로 표적화하는 것이 바람직할 수 있다. 리간드, 세포 표면 수용체, 당단백질, 비타민(예를 들어, 리보플라빈) 및 단일클론 항체와 같은 다양한 표적화 모이어티를 사용하여 지질 나노입자를 표적화하는 것은 이전에 기술되었다(예를 들어, 미국 특허 제4,957,773호 및 제4,603,044호 참조). 상기 표적화 모이어티는 전체 단백질 또는 이의 단편을 포함할 수 있다.
표적화 메커니즘은 일반적으로, 표적 모이어티가 표적, 예를 들어 세포 표면 수용체와 상호작용할 수 있는 방식으로 표적화제가 지질 나노입자의 표면에 위치할 것을 요구한다. 다양한 표적화제 및 방법이 당업계에 알려져 있고 이용 가능하며, 이는 예를 들어 문헌[Sapra, P. and Allen, T M, Prog. Lipid Res. 42(5):439-62 (2003)]; 및 문헌[Abra, R M et al., J. Lipid nanoparticle Res. 12:1-3, (2002)]에 기술된 것들을 포함한다.
표적제를 결합시키는 표준 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 표적제의 부착을 위해 활성화될 수 있는, 포스파티딜에탄올아민, 또는 지질 유도체화된 블레오마이신과 같은 유도체화된 친유성 화합물이 사용될 수 있다. 항체 표적화된 지질 나노입자는, 예를 들어, 단백질 A를 포함하는 지질 나노입자를 사용하여 구축될 수 있다(문헌[Renneisen, et al., J. Bio. Chem., 265:16337-16342 (1990)] 및 문헌[Leonetti, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 87:2448-2451 (1990)] 참조). 항체 접합의 다른 예는 미국 특허 제6,027,726호에 개시되어 있으며, 이의 교시 내용은 원용에 의해 본원에 포함된다. 표적화 모이어티의 예는 또한, 신생물 또는 종양과 관련된 항원을 비롯한 세포 성분에 특이적인 다른 단백질을 포함할 수 있다. 표적화 모이어티로 사용되는 단백질은 공유 결합을 통해 상기 지질 나노입자에 부착될 수 있다(문헌[Heath, Covalent Attachment of Proteins to Lipid nanoparticles, 149 Methods in Enzymology 111-119 (Academic Press, Inc. 1987)] 참조). 다른 표적화 방법은 비오틴-아비딘 시스템을 포함한다.
지질 나노입자를 제조하는 다양한 방법이 당업계에 알려져 있으며, 이는 예를 들어, 문헌[Szoka, et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9:467 (1980)]; 미국 특허 제4,186,183호, 제4,217,344호, 제4,235,871호, 제4,261,975호, 제4,485,054호, 제4,501,728호, 제4,774,085호, 제4,837,028호, 제4,946,787호; PCT 국제공개 WO 91/17424호; 문헌[Deamer and Bangham, Biochim. Biophys. Acta, 443:629-634 (1976)]; 문헌[Fraley, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3348-3352 (1979)]; 문헌[Hope, et al., Biochim. Biophys. Acta, 812:55-65 (1985)]; 문헌[Mayer, et al., Biochim. Biophys. Acta, 858:161-168 (1986)]; 문헌[Williams, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85:242-246 (1988)]; 문헌[Lipid nanoparticles, Marc J. Ostro, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1983, Chapter 1]; 문헌[Hope, et al., Chem. Phys. Lip., 40:89 (1986)]; 및 문헌[Lipid nanoparticles: A Practical Approach, Torchilin, V. P. et al., ed., Oxford University Press (2003)], 및 이들 문헌에 인용된 참고문헌에 기술된 것들을 포함한다. 적합한 방법은 초음파처리, 압출, 고압/균질화, 미세유동화, 세제 투석, 소형 지질 나노입자 소포의 칼슘 유도 융합 및 에테르 주입 방법을 포함하지만 이에 제한되지는 않으며, 이들 모두는 당업계에 잘 알려져 있다.
본 개시내용의 일부 실시형태에서, DOTAP/C12-200 기반 LNP는 미세유체 혼합 공정을 사용하여 제조되었다. 간단히 말하면, DOTAP, C12-200, DOPE, CHE 및 PEG-DMG의 지질 스톡을 에탄올에서 20 mg/ml 농도로 제조하였다(예를 들어 동물 연구의 경우, 20 mg/ml 내지 80 mg/ml의 지질 스톡이 쉽게 사용될 수 있음에 유의한다). 다양한 PEG화 수준(0 내지 2%) 및 지질 조성(지질 간의 몰비)을 준비하고 평가하였다. 모든 제제에서, DOTAP mol%는 10 내지 50으로 다양했으며, DOTAP 수준의 변화는 DOPE 및/또는 콜레스테롤 수준을 변경함으로써 상쇄되었으며, C12-200 mol%는 18로 유지하였다. 지질은, 시험관내 연구의 경우 6.5 내지 8.5 mg/mL의 최종 지질 농도로, 동물 연구의 경우 15 내지 120 mg/mL의 최종 지질 농도로, 특정 조성에 대해 에탄올에서 함께 혼합되었다. mCherry 단백질 인코딩 mRNA(mCherry)를 0.25 내지 2 mg/ml의 농도로 수성 상에서 mRNA로 사용하였다. 2개 상의 혼합과 LNP 제조는, 2:1 또는 3:1의 수성 대 유기 부피비를 사용하여, 엇갈린 헤링본 구조를 갖는 미세유체 칩에서 8 또는 12 ml/분의 유속으로 수행되었다. 생성된 LNP는 분자생물학 등급의 물에 대한 접선 유동 여과(TFF: tangential flow filtration)를 사용한 정제 및 완충제 교환을 거쳤다. 대안적으로, 생성된 LNP는 MWCO 범위가 8 내지 300 kDa인 막을 사용하여 분자생물학 등급의 물에 대해 투석되었다. 상기 제제의 특성화 매개변수를 하기 및 도 3a에 요약하였다. 특성화 매개변수의 정밀한 제어는 70 내지 100 nm의 크기 범위, 3 내지 16 mV의 표면 전하(제타 값), 0.22 미만의 PDI를 갖는 DOTAP/C12-200 기반 LNP의 제조를 가능하게 하였다.
본원에 개시되고 당업계에 알려진 방법에 따라 제조된 지질 입자는, 특정 실시형태에서, 약물 로딩 및 환자에게의 투여 이전에 상당한 기간 동안 저장될 수 있다. 예를 들어, 지질 나노입자는, 투여 전에, 탈수되고, 저장되고, 이어서 재수화되고, 하나 이상의 활성제가 로딩될 수 있다. 지질 나노입자는 또한, 하나 이상의 활성제가 로딩된 후 탈수될 수 있다. 탈수는, 예를 들어 미국 특허 제4,880,635호, 제5,578,320호, 제5,837,279호, 제5,922,350호, 제4,857,319호, 제5,376,380호, 제5,817,334호, 제6,355,267호, 및 제6,475,517호에, 기술된 탈수 및 동결건조 절차를 비롯한 당업계에서 이용 가능한 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 일 실시형태에서, 지질 나노입자는 표준 동결건조 장치를 사용하여 탈수되며, 즉, 이는 저압 조건 하에서 탈수된다. 또한, 상기 지질 나노입자는 탈수 전에, 예를 들어 액체 질소에서, 동결될 수 있다. 탈수 전에, LNP 환경에, 예를 들어 상기 지질 나노입자를 함유하는 완충제에 당을 첨가하여, 탈수 동안의 상기 지질 나노입자의 온전함을 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,077,056호 또는 제5,736,155호를 참조한다.
지질 나노입자는, 예를 들어 크기 조정 후 또는 pH 구배 생성 후를 비롯한, 제조 도중의 임의의 시점에서 통상적인 방법에 의해 멸균될 수 있다.
운반물 로딩된 지질 입자 조성물
다양한 실시형태에서, 본 개시내용의 지질 입자는 세포, 조직, 장기 또는 대상체로의 활성제의 전달을 비롯한 다양한 응용 분야를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 지질 나노입자는 혈류를 통해 전신적으로 치료제를 전달하거나 피부에 미용제를 전달하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 지질 나노입자 및 운반물(들)로서의 하나 이상의 활성제가 본 개시내용에 포함된다.
지질 입자 운반물
본 개시내용은 운반물로서의 활성제와 조합된 혼합 양이온성 지질 나노입자(즉, 이온화 가능한 지질(예를 들어 C12-200) 및 또 다른 양이온성 지질(예를 들어 DOTAP)을 포함하는 지질 나노입자)를 기술한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 활성제는 세포, 조직, 장기 또는 대상체에 원하는 효과를 발휘할 수 있는 임의의 분자 또는 화합물을 포함한다. 이러한 효과는 예를 들어 생물학적, 생리학적 또는 미용적일 수 있다. 활성제는 임의의 유형의 분자 또는 화합물일 수 있으며, 이는 핵산, 예를 들어 단일 가닥 또는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 안티센스 RNA, RNA 간섭 작용제, 예를 들어, DNA-DNA 하이브리드, DNA-RNA 하이브리드, RNA-DNA 하이브리드, RNA-RNA 하이브리드, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로 RNA(mRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(shRNA); 펩티드 및 폴리펩티드, 예를 들어 항체, 예를 들어 다중클론 항체, 단일클론 항체, 항체 단편; 인간화 항체, 재조합 항체, 재조합 인간 항체 및 Primatized™ 항체, 사이토카인, 성장 인자, 세포사멸 인자, 분화 유도 인자, 세포 표면 수용체 및 이들의 리간드; 호르몬; 및 소분자, 예를 들어 소형 유기 분자 또는 화합물을 포함한다.
LNP와 결합되거나 이에 의해 캡슐화된 핵산은 하기 군으로부터 선택된 변형물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 변형물을 함유할 수 있다: 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 5'-포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오티드, 콜레스테릴 유도체에 연결된 말단 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드, 5'-메톡시-변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 5'-메톡시유리딘), 2'-데옥시-변형된 뉴클레오티드, 잠긴 뉴클레오티드, 무염기 뉴클레오티드, 2'-아미노-변형된 뉴클레오티드, 2'-알킬-변형된 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포라미데이트, 뉴클레오티드를 포함하는 비천연 염기; 뉴클레오시드간 연결 또는 골격, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트, 예를 들어 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포라미데이트, 예를 들어, 3'-아미노 포스포라미데이트 및 아미노알킬포스포라미데이트, 티오노포스포라미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르 및 정상적인 3′-5′ 연결을 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2′-5′ 연결된 유사체 및 뉴클레오시드 단위의 인접 쌍이 3'-5'에서 5'-3' 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결된 반전된 극성을 갖는 것들.
특정 실시형태에서, 상기 활성제는 mRNA 또는 세포에서 mRNA를 발현할 수 있는 벡터이다.
실시형태에서, 상기 활성제는 CRISPR/Cas 시스템이다. 선택적으로, 본 개시내용의 LNP는 예를 들어, 운반물로서의 가이드 가닥(gRNA) 및 Cas 효소 둘 모두를 포함하도록 제형화될 수 있으며, 이로써 표적 세포의 유전자의 CRISPR 매개 표적화를 달성하고 조절할 수 있는 자급식 전달(self-contained delivery) 비히클을 제공할 수 있다.
특정한 특징적인 실시형태에서, 상기 활성제는 핵산 조정 조절인자(예를 들어, 전술된 바와 같은, 단백질 조절인자 성분을 인코딩하는 mRNA)이다.
일부 실시형태에서, 상기 활성제는 치료제, 또는 이의 염 또는 유도체이다. 치료제 유도체는 그 자체로 치료적으로 활성일 수 있거나, 또는 이는 추가적인 변형 시 활성이 되는 전구약물일 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 치료제 유도체는 비변형된 작용제와 비교하여 치료 활성의 일부 또는 전부를 유지하는 반면, 또 다른 실시형태에서 치료제 유도체는 치료 활성이 결여되어 있다.
다양한 실시형태에서, 치료제는 항염증 화합물, 마취제, 진정제, 항우울제, 각성제, 환각제, 진통제, 항생제, 피임약, 해열제, 혈관 확장제, 항혈관신생제, 세포혈관제(cytovascular agent), 신호 전달 억제제, 혈관수축제, 호르몬, 및 스테로이드와 같은 작용제 및 약물을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 활성제는 종양학 약물이며, 이는 항종양 약물, 항암 약물, 종양 약물, 항신생물제 등으로도 지칭될 수 있다. 본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 종양학 약물의 예는 아드리아마이신, 알케란, 알로푸리놀, 알트레타민, 아미포스틴, 아나스트로졸, araC, 삼산화비소, 아자티오프린, 벡사로텐, biCNU, 블레오마이신, 정맥내 부설판, 경구 부설판, 카페시타빈(Xeloda), 카보플라틴, 카르무스틴, CCNU, 셀레콕시브, 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 시클로스포린 A, 시타라빈, 시토신 아라비노시드, 다우노루비신, 시톡산, 다우노루비신, 덱사메타손, 덱스라족산, 도데탁셀, 독소루비신, 독소루비신, DTIC, 에피루비신, 에스트라무스틴, 에토포시드 포스페이트, 에토포시드 및 VP-16, 엑세메스탄, FK506, 플루다라빈, 플루오로우라실, 5-FU, 젬시타빈(Gemzar), 젬투주맙-오조가미신, 고세렐린 아세테이트, 히드레아, 히드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이마티닙 메실레이트, 인터페론, 이리노테칸(Camptostar, CPT-111), 레트로졸, 류코보린, 류스타틴, 류프롤리드, 레바미솔, 리트레티노인, 메가스트롤, 멜팔란, L-PAM, 메스나, 메토트렉세이트, 메톡살렌, 미트라마이신, 미토마이신, 미톡산트론, 질소 머스타드, 파클리탁셀, 파미드로네이트, 페가데마제, 펜토스타틴, 포르피머 나트륨, 프레드니손, 리툭산, 스트렙토조신, STI-571, 타목시펜, 탁소테레, 테모졸아미드, 테니포시드, VM-26, 토포테칸(Hycamtin), 토레미펜, 트레티노인, ATRA, 발루비신, 벨반, 빈블라스틴, 빈크리스틴, VP16 및 비노렐빈을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 종양학 약물의 다른 예는 엘립티신 및 엘립티신 유사체 또는 유도체, 에포틸론, 세포내 키나제 억제제 및 캄프토테신이다.
본 개시내용의 LNP 조성물은 일반적으로 단일 활성제를 포함하지만, 특정 실시형태에서, 이는 하나 초과의 활성제를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 지질 나노입자는 적어도 0.5, 0.8, 1.2, 1.5, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0 또는 12시간의 혈장 순환 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 적어도 0.5, 0.8, 1.2, 1.5, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0 또는 12시간의 혈장 약물 반감기를 갖는다. 순환 및 혈액 또는 혈장 제거 반감기는 예를 들어 미국 특허출원공개 US 2004-0071768-A1에 기술된 바와 같이 측정될 수 있다.
본 개시내용은 또한 키트 형태의 지질 나노입자 및 이의 변형물을 제공한다. 상기 키트는 기성 제제(ready-made formulation) 또는 투여 전 혼합이 필요한 제제를 포함할 수 있다. 상기 키트는 전형적으로, 상기 키트의 다양한 요소를 담기 위한 구획화된 용기를 포함한다. 상기 키트는, 수화 또는 탈수 형태의, 본 개시내용의 지질 나노입자 조성물 또는 이의 성분을 이들의 재수화 및 투여에 대한 지침과 함께 함유한다. 특정 실시형태에서, 키트는 활성제가 로딩된 본 개시내용의 지질 나노입자를 함유하는 적어도 하나의 구획을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 키트는 적어도 2개의 구획을 포함하며, 하나는 본 개시내용의 지질 나노입자를 함유하고 다른 하나는 활성제를 함유한다. 물론, 이들 키트 중 임의의 것은 추가적인 구획, 예를 들어, 미국 특허출원공개 US 2004-0228909-A1호에 기술된 것들과 같은, 완충제를 포함하는 구획을 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 혼합 양이온성 지질(예를 들어, C12-200과 같은 이온화 가능한 지질 및 DOTAP와 같은 다른 양이온성 지질)을 포함하는 지질 나노입자를 포함하는 본 개시내용의 키트는 또한 미국 특허출원공개 US 2004-0228909 A1호에 기술된 키트의 다른 특징을 함유할 수 있다. 또한, 상기 키트는 하나의 구획에 약물 로딩된 지질 나노입자를 함유하고 제2 구획에 빈 지질 나노입자를 함유할 수 있다. 대안적으로, 상기 키트는 본 개시내용의 지질 나노입자, 제2 구획 내의 본 개시내용의 지질 나노입자 내에 로딩될 활성제, 및 제3 구획 내의 빈 지질 나노입자를 함유할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 키트는 C12-200 및 DOTAP 둘 모두를 포함하는 혼합 지질 나노입자 - 여기서 C12-200은 상기 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 5 내지 20%(몰 기준)를 구성하고 DOTAP는 상기 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 10 내지 50%(몰 기준)를 구성함 -에 캡슐화된 치료 화합물뿐만 아니라 빈 지질 나노입자도 포함한다. 일 실시형태에서, 치료 화합물을 함유하는 지질 나노입자 및 상기 빈 지질 나노입자는 상기 키트의 서로 다른 구획에 존재한다.
지질 입자 매개된 운반물 전달의 효능
특정 실시형태에서, 본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 18% C12-200 지질 입자와 혼합된 10 내지 50%(mol/중량) DOTAP를 함유하는 입자가 다른 조직에 비해 간의 세포로 활성 핵산 운반물(심지어 대형 핵산 조정 조절인자도 포함함)을 전달하는 데 매우 효과적이라는 놀라운 결과에 기초한다. 또한, 캡슐화된 활성제(운반물), 예를 들어 mRNA의 리포터 활성은 다른 조직에 비해 간 조직에서 거의 독점적으로 발생했으며, 이러한 운반물의 핵 국소화 및 효능 또한 입증되었다. 지질 입자의 국소화 효능은 상기 대상체의 하나 이상의 다른 조직의 것에 대비한 상기 대상체의 특정 조직으로의 상기 핵산-지질 입자의 국소화에 있어서의 배수 차이(증가 또는 감소)로서 기술될 수 있다. 전달을 평가하는 데 있어서의 추가적인 성분으로서의 활성 효능은 상기 대상체의 하나 이상의 다른 조직의 세포에서 관찰된 것에 대비한 상기 대상체의 특정 조직의 세포 내에서의 상기 활성제, 예를 들어 핵산 운반물 또는 기타 화합물의 활성에 있어서의 배수 차이(증가 또는 감소)로서 기술될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 상기 배수 차이는 세포 수준에서 검출될 수 있거나, 또는 세포 수준에서 발생하는 이벤트에 대한 적절한 대용물에 의해 검출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 영향을 받는 간 조직의 세포는 간 세포, 혈관 세포(즉, 간 동양혈관), 간 성상세포, 내피 세포, 섬유아세포, 중간엽 세포, 면역 세포, 암 세포, 쿠퍼 세포, 성상교세포, 타원형 혈관 내피 세포, 간 유래 줄기/전구 세포, 및 비-간 조직 유래 줄기/전구 세포 또는 암 세포 중 하나 이상이다. 일부 실시형태에서, 효과/활성의 배수 차이는 세포 이하 수준에서 검출될 수 있으며, 즉, 여기서 활성은 표적 세포의 핵에서 검출 가능하다.
LNP 국소화의 효능을 측정하기 위해, 표지되거나 검출된 관심 분자의 특성에 따라 분석이 수행될 수 있다. 본 개시내용의 예시적인 실시형태에서, 형광 표지된 지질을 사용하여 LNP 국소화가 측정되었다. 다른 실시형태에서, 표지된 펩티드, 또는 지질 입자의 다른 성분이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 국소화는 개별 세포에서 검출 가능하다. 일부 실시형태에서, 상기 표지는 형광 표지, 즉 Cy7과 같은 형광 표지된 지질이다. 다른 실시형태에서, 상기 지질 나노입자의 표지는 양자점, 또는 유도 라만 산란에 의해 검출 가능한 지질일 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 표지는 당업계에 알려진 임의의 형광단, 즉 자외선, 가시광선 또는 적외선 스펙트럼에서 여기 및 방출을 갖는 형광단이다. 일부 실시형태에서, 상기 국소화는 면역조직화학 또는 면역형광 방법에 의해 검출되거나 추가로 확증된다.
국소화 효능은 상기 대상체의 하나 이상의 다른 조직에 대비한 상기 대상체의 조직, 즉, 간 조직으로의 상기 핵산-지질 입자의 국소화에 있어서의 배수 차이(증가 또는 감소)로서 기술될 수 있다. 본 개시내용의 예시적인 실시형태에서, Cy7 표지된 지질이 생체내에서 영상화되었고, 형광 광도가 Cy7-LNP 농도의 지표로 작용하였다(하기 실시예 6 참조). Cy7-DOPE 표지된 DOTAP/C12-200 핵산 LNP는 다른 조직에 비해, 특히 폐, 심장 및 비장에 비해 간에 대한 국소화의 증가된 효능을 나타냈다. 본 개시내용의 일부 실시형태에서, Cy7 표지된 핵산 LNP는 폐, 심장 또는 비장에 비해 간에 대해 적어도 2배의 국소화를 나타냈다. 일부 실시형태에서 Cy7 표지된 핵산 LNP는, 폐, 심장, 및 비장의 것에 대비해, 간에 대해 적어도 3배의 국소화를 나타냈고, 일부 실시형태에서 Cy7 표지된 핵산 LNP는 간에 대해 적어도 4배의 국소화를 나타냈고, 일부 실시형태에서 Cy7 표지된 핵산 LNP는 간에 대해 적어도 5배의 국소화를 나타냈고, 일부 실시형태에서 Cy7 표지된 핵산 LNP는 간에 대해 적어도 6배의 국소화를 나타냈고, 일부 실시형태에서 Cy7 표지된 핵산 LNP는 적어도 10배의 국소화를 나타냈고, 일부 실시형태에서 Cy7 표지된 핵산 LNP는 간에 대해 적어도 15배의 국소화를 나타냈고, 일부 실시형태에서, Cy7 표지된 핵산 LNP는 간에 대해 적어도 20배의 국소화를 나타냈다.
상기 지질 입자에 의해 캡슐화된 활성제의 활성 효능을 측정하기 위해, 상기 활성제의 특성에 따라 분석이 수행될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 혼합 지질 입자 내의 활성제는 핵산이다. 다른 실시형태에서, 상기 혼합 지질 입자 내의 활성제는 소분자 또는 다른 화합물이다.
일부 실시형태에서, 상기 혼합 지질 입자 내의 활성제는 mRNA이다. 예시적인 실시형태에서, 리포터 mRNA, 즉 mCherry의 국소화된 발현은 상기 활성제/운반물로서의 mRNA에 대한 세포내 전달 효능의 지표로서 작용하였다. 다른 실시형태에서, 상기 mRNA는 Cre 효소(본원의 실시예 6의 tdTomato 리포터 시스템을 통해 운반물 mRNA의 핵 전달 및 활성을 확인하는 데 사용됨), 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 황색 형광 단백질 또는 청색 형광 단백질을 인코딩할 수 있다. 또는 치료적 실시형태에서, 상기 mRNA는 대상체의 LNP-표적화된 세포에서 치료적 세포내 발현(핵산 조정 조절인자의 전달 및 발현 포함)을 위한 단백질을 인코딩할 수 있으며, 선택적으로, 여기서 전달된 mRNA 또는 인코딩된 단백질의 세포내 수준은 전달되는 치료 mRNA에 적합한 당업계에 알려진 방법을 통해 검출될 수 있다. 다른 실시형태에서, 리포터 mRNA는 Lyt2 세포 표면 마커와 같은 세포 표면 마커를 인코딩한다. 다른 실시형태에서, 상기 리포터는 β-갈락토시다제, α-락타마제, 알칼리성 포스파타제 또는 서양고추냉이 퍼옥시다제일 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 리포터 mRNA는 티미딘 키나제(tk), HRPT 또는 APRT와 같은 음성 선택 마커를 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 상기 리포터 mRNA의 활성을 검출하거나 확증하기 위해 면역조직화학 또는 면역형광이 사용된다.
특정 실시형태에서, 운반물 전달에 있어서의 본 개시내용의 지질 입자의 효과는 지질 입자-표적화된 조직 내에서 세포내에서 상기 운반물(활성제)에 대해 관찰된 활성 수준에 기초하여 평가된다. 이러한 효과는 적절한 대조군 제제 및/또는 조직에 대비한 활성에 있어서의 배수 차이로 확인될 수 있으며, 예를 들어, 핵산 운반물을 갖는 LNP의 전달 효능은, 상기 대상체의 하나 이상의 다른 조직에 대비한, 상기 대상체의 표적 조직, 즉 간 조직의 세포에서의 상기 핵산 운반물의 활성에 있어서의 배수 차이(증가 또는 감소)로서 기술될 수 있다. 따라서, 특정 핵산 운반물의 경우, LNP 제제의 전달 효능은, 예를 들어, 상기 핵산 운반물을 포함하지 않는 LNP 제제에 비해, 비표적 조직 세포에서보다 표적 조직 세포에서 핵산 페이로드의 2배 더 큰 세포내 활성을 달성하는 LNP로서 확인될 수 있다. 선택적으로, 핵산 운반물 전달을 위한 효과적인 LNP 제제는 상기 핵산 운반물을 포함하지 않는 LNP 제제에 비해, 비표적 조직 세포에서보다 표적 조직 세포에서 예를 들어, 핵산 페이로드의 적어도 3배 더 큰, 선택적으로 적어도 4배 더 큰, 선택적으로 적어도 5배 더 큰, 선택적으로 적어도 6배 더 큰, 선택적으로 적어도 7배 더 큰, 선택적으로 적어도 8배 더 큰, 선택적으로 적어도 9배 더 큰, 선택적으로 적어도 10배 더 큰, 선택적으로 적어도 20배 더 큰, 선택적으로 적어도 50배 더 큰, 선택적으로 적어도 100배 더 큰 세포내 활성을 달성하는 것으로서 기술될 수 있다. 본 개시내용의 예시적인 실시형태에서, 혼합 지질 입자는 상기 대상체의 폐, 심장 및 비장 세포의 수준보다 상당히 높은 수준으로 상기 대상체의 간 조직 세포에서 발현된 mCre mRNA를 전달하였다(하기 실시예 6 참조). mCre를 발현하는 세포는 Cre 발현 반응성 tdTomato 리포터의 영상화를 통해 검출되었다. 일부 실시형태에서, 상기 Cre mRNA는 상기 대상체의 폐, 심장 및 비장 세포에서의 mRNA 발현보다 적어도 2배 더 높은 수준으로 상기 대상체의 간 조직 세포에서 발현되었다. 일부 실시형태에서, 운반물 mRNA는 상기 대상체의 폐, 심장 및 비장 세포에서의 mRNA 발현보다 적어도 3배 더 높은 수준으로 상기 대상체의 간 조직 세포에서 발현되었다. 일부 실시형태에서, 루시퍼라제 mRNA는, 상기 대상체의 폐, 심장 및 비장 세포에서의 운반물 mRNA의 발현에 대비해, 간에서 적어도 4배 더 높게 발현되었으며, 일부 실시형태에서, 루시퍼라제 mRNA는 간에서 적어도 5배 더 높게 발현되었으며, 일부 실시형태에서, 간에서 적어도 6배 더 높게 발현되었으며, 일부 실시형태에서, 간에서 적어도 7배 더 높게 발현되었으며, 일부 실시형태에서, 간에서 적어도 8배 더 높게 발현되었으며, 일부 실시형태에서, 간에서 적어도 9배 더 높게 발현되었으며, 일부 실시형태에서, 간에서 적어도 10배 더 높게 발현되었으며, 일부 실시형태에서, 간에서 적어도 11배 더 높게 발현되었으며, 일부 실시형태에서, 간에서 적어도 12배 더 높게 발현되었으며, 일부 실시형태에서, 간에서 적어도 13배 더 높게 발현되었으며, 일부 실시형태에서, 간에서 적어도 14배 더 높게 발현되었으며, 일부 실시형태에서, 간에서 적어도 15배 더 높게 발현되었으며, 일부 실시형태에서, 간에서 적어도 20배 더 높게 발현되었다.
다른 실시형태에서, 혼합 지질 입자는 조직에, 즉, 간 조직에 RNAi 작용제(예를 들어, siRNA)를 전달하는 데 사용될 수 있다. siRNA 또는 기타 RNAi 작용제의 경우, 전달 및 활성 효능 측정은, 예를 들어, 전사체 수준을 검출하기 위한 표적 특이적 PCR, 표적 단백질 수준을 검출하기 위한 면역흡착제 또는 기타 면역학적 방법 및/또는 유세포 분석(FACS)을 사용할 수 있다(문헌[Testoni et al., Blood 1996, 87:3822]). 일부 실시형태에서, siRNA는 상기 대상체의 폐, 심장, 비장, 난소, 췌장, 신장 및/또는 기타 비-간 장기 또는 조직의 세포에서보다 적어도 2배 더 높은 수준으로 상기 대상체의 간 조직의 세포에서 활성을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, siRNA는 상기 대상체의 폐, 심장, 비장, 난소, 췌장, 신장 및/또는 기타 비-간 장기 또는 조직의 세포에서보다 적어도 3배 더 높은 수준으로 상기 대상체의 간 조직의 세포에서 활성을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, siRNA는, 상기 대상체의 폐, 심장, 비장, 난소, 췌장, 신장 및/또는 기타 비-간 장기 또는 조직의 세포에서의 siRNA의 활성에 대비해, 예를 들어, 간에서 적어도 4배 더 높은 수준으로 활성을 가졌으며, 일부 실시형태에서, siRNA는 간에서 적어도 5배 더 높은 수준으로 활성을 가졌으며, 일부 실시형태에서, siRNA는 간에서 적어도 6배 더 높은 수준으로 활성을 가졌으며, 일부 실시형태에서, siRNA는 간에서 적어도 7배 더 높은 수준으로 활성을 가졌으며, 일부 실시형태에서, siRNA는 간에서 적어도 8배 더 높은 수준으로 활성을 가졌으며, 일부 실시형태에서, siRNA는 간에서 적어도 9배 더 높은 수준으로 활성을 가졌으며, 일부 실시형태에서, siRNA는 간에서 적어도 10배 더 높은 수준으로 활성을 가졌으며, 일부 실시형태에서, siRNA는 간에서 적어도 11배 더 높은 수준으로 활성을 가졌으며, 일부 실시형태에서, siRNA는 간에서 적어도 12배 더 높은 수준으로 활성을 가졌으며, 일부 실시형태에서, siRNA는 간에서 적어도 13배 더 높은 수준으로 활성을 가졌으며, 일부 실시형태에서, siRNA는 간에서 적어도 14배 더 높은 수준으로 활성을 가졌으며, 일부 실시형태에서, siRNA는 간에서 적어도 15배 더 높은 수준으로 활성을 가졌으며, 일부 실시형태에서, siRNA는 간에서 적어도 20배 더 높은 수준으로 활성을 가졌다. 관련 실시형태에서, 간에 RNAi 운반물을 우선적으로 전달하는 혼합 지질 입자는, 예를 들어, 비표적 조직의 세포와 비교하여 또는 일부 다른 적절한 대조군(예를 들어, 치료되지 않은 간 조직 세포의 표적 전사체 수준)과 비교하여, 표적 간 조직의 세포에서 표적 전사체 및/또는 단백질 수준의 20% 초과의 감소를 나타낼 수 있다. 선택적으로, 간에 RNAi 운반물을 우선적으로 전달하는 혼합 지질 입자는, 예를 들어, 비표적 조직의 세포와 비교하여 또는 일부 다른 적절한 대조군(예를 들어, 치료되지 않은 간 조직 세포의 표적 전사체 수준)과 비교하여, 표적 간 조직의 세포에서 표적 전사체 및/또는 단백질 수준의 30% 초과의 감소, 40% 초과의 감소, 50% 초과의 감소, 60% 초과의 감소, 70% 초과의 감소, 80% 초과의 감소, 90% 초과의 감소, 95% 초과의 감소, 97% 초과의 감소, 97% 초과의 감소, 98% 초과의 감소, 또는 99% 초과의 감소를 나타낼 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 혼합 지질 입자는 조직에, 즉 간 조직에 CRISPR-Cas9 시스템을 전달하는 데 사용될 수 있다. CRISPR-Cas9 전달 및 활성 효능 측정은, 예를 들어, Cas9을 검출하기 위한 PCR, 표적 영역의 게놈 구조 및/또는 표적 전사체 수준, Cas9 또는 표적 단백질의 녹인, 녹아웃 또는 다른 변형물을 검출하기 위한 면역흡착제 또는 기타 면역학적 방법 및/또는 유세포 분석(FACS)을 필요로 할 수 있다(문헌[Testoni et al., Blood 1996, 87:3822]). 일부 실시형태에서, CRISPR-Cas9 매개 효과는 상기 대상체의 폐, 심장, 비장, 난소, 췌장, 신장 및/또는 기타 비-간 장기 또는 조직의 세포에서보다 적어도 2배 더 높은 수준으로 상기 대상체의 간 조직의 세포에서 확인될 수 있다. 일부 실시형태에서, CRISPR-Cas9 매개 효과는 상기 대상체의 폐, 심장, 비장, 난소, 췌장, 신장 및/또는 기타 비-간 장기 또는 조직의 세포에서보다 적어도 3배 더 높은 수준으로 상기 대상체의 간 조직의 세포에서 확인될 수 있다. 일부 실시형태에서, CRISPR-Cas9 매개 효과는 상기 대상체의 폐, 심장, 비장, 난소, 췌장, 신장 및/또는 기타 비-간 장기 또는 조직의 세포에서의 CRISPR-Cas9 매개 효과에 대비해, 간에서 적어도 4배 더 높은 수준의 세포에서 확인될 수 있으며, 일부 실시형태에서, CRISPR-Cas9 매개 효과는 간에서 적어도 5배 더 높은 수준의 세포에서 확인될 수 있으며, 일부 실시형태에서, CRISPR-Cas9 매개 효과는 적어도 6배 더 높은 수준의 세포에서 확인될 수 있으며, 일부 실시형태에서, CRISPR-Cas9 매개 효과는 적어도 7배 더 높은 수준의 세포에서, 일부 실시형태에서, 적어도 8배 더 높은 수준의 세포에서, 일부 실시형태에서, 적어도 9배 더 높은 수준의 세포에서, 일부 실시형태에서, 적어도 10배 더 높은 수준의 세포에서, 일부 실시형태에서, 적어도 11배 더 높은 수준의 세포에서, 일부 실시형태에서, 적어도 12배 더 높은 수준의 세포에서, 일부 실시형태에서, 적어도 13배 더 높은 수준의 세포에서, 일부 실시형태에서, 적어도 14배 더 높은 수준의 세포에서, 일부 실시형태에서, 적어도 15배 더 높은 수준의 세포에서, 일부 실시형태에서, 적어도 20배 더 높은 수준의 세포에서 확인될 수 있다.
다른 실시형태에서, 혼합 지질 입자는 조직에, 즉, 간 조직에 mRNA 또는 다른 핵산 운반물을 전달할 수 있으며, 여기서 핵에서 발현 및 가능하게는 활성이 발생한다. 본 개시내용에서, 일부 실시형태는 상기 활성제의 핵 활성에 대한 리포터로서 Cre 재조합효소를 사용하였다(하기 실시예 6 참조). Cre 재조합효소는 인코딩된 단백질을 핵으로 전위해야 하므로 핵 전위의 리포터 역할을 할 수 있다. Cre 재조합효소는 loxP 부위 사이의 DNA의 부위 특이적 재조합을 촉매한다. Cre 재조합효소 활성 발현 시, loxP 재조합으로 인해, 리포터 형광 단백질이 발현된다. 일 실시형태에서, Ai14 마우스 계열은 Gt(ROSA)26Sor 유전자좌에 삽입된 CAG 프로모터 구동 적색 형광 단백질 변이체(tdTomato)의 전사를 방지하는 Cre 리포터 loxP-측면 STOP 카세트를 사용하였다. Ai14 마우스에 mCre 로딩된 DOTAP-LNP를 정맥내 주사하였고, 이는 Cre 효소의 전달 및 발현, Cre 효소의 핵 전위, 및 이후, tdTomato 프로모터의 Cre 매개 재조합 이후에, 간 세포의 핵에서 강력한 tdTomato 형광을 발현하기 시작하였다. 예시적인 실시형태에서, 활성 효능, 즉, 핵에서의 검출 가능한 mRNA의 발현은 폐, 심장 및 비장의 세포의 것보다 적어도 2배 더 높은 수준으로 간 세포의 핵에서 관찰 가능하였다. 일부 실시형태에서, 핵에서의 검출 가능한 mRNA의 발현은 폐, 심장 및 비장의 세포의 것보다 적어도 3배 더 높은 수준으로 간 세포의 핵에서 관찰 가능하였다. 일부 실시형태에서, 핵에서의 검출 가능한 mRNA의 발현은 폐, 심장 및 비장의 세포의 핵에서의 관찰 가능한 mRNA의 활성보다 적어도 4배 더 높은 수준으로 간 세포의 핵에서 관찰 가능하였으며, 일부 실시형태에서, 그 수준은 5배 더 높았으며, 일부 실시형태에서, 그 수준은 6배 더 높았으며, 일부 실시형태에서, 그 수준은 7배 더 높았으며, 일부 실시형태에서, 그 수준은 8배 더 높았으며, 일부 실시형태에서, 그 수준은 9배 더 높았으며, 일부 실시형태에서, 그 수준은 10배 더 높았으며, 일부 실시형태에서, 그 수준은 11배 더 높았으며, 일부 실시형태에서, 그 수준은 12배 더 높았으며, 일부 실시형태에서, 그 수준은 13배 더 높았으며, 일부 실시형태에서, 그 수준은 14배 더 높았으며, 일부 실시형태에서, 그 수준은 15배 더 높았으며, 일부 실시형태에서, 그 수준은 20배 더 높았다.
다른 실시형태에서, 혼합 지질 입자는 조직에, 즉, 간 조직에 소분자 또는 다른 화합물을 전달할 수 있다. 소분자의 국소화 또는 활성의 효능은 다양한 생체내 영상화 방법(예를 들어, PET/CT), 질량 분석법뿐만 아니라 표적 효과의 면역조직화학 및 면역형광법에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 간에서의 소분자의 혼합 지질 입자 매개 국소화 및/또는 활성은 다른 조직의 것, 예를 들어 폐, 심장, 신장, 난소, 췌장 또는 다른 조직의 것, 선택적으로, 비장의 것보다 2배 더 높을 수 있다. 일부 실시형태에서, 간에서의 소분자의 혼합 지질 입자 매개 국소화 및/또는 활성은 다른 조직의 것, 예를 들어 폐, 심장, 신장, 난소, 췌장 또는 다른 조직의 것, 선택적으로, 비장의 것보다 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 또는 20배 더 높을 수 있다.
특정 실시형태에서, 간 전달용으로 제형화된 지질 입자는, 대상체의 하나 이상의 다른 조직의 세포에 비해, 간 세포에 대한 운반물의 우선적인 국소화 및 세포내 전달(직접적으로 또는 대용물에 의한 세포내 활성의 평가에 기초함)을 나타내는 지질 입자를 지칭한다. 예를 들어, 간 전달을 위한 지질 입자는 대상체의 다른 조직에서보다 대상체의 간 세포에서 운반물(예를 들어 핵산 운반물, 예를 들어 mRNA, CRISPR/Cas 시스템, 핵산 조정 조절인자 등)의 적어도 2배 더 큰 활성을 유도할 수 있는 것이다. 대상체의 간 세포에서의 이러한 효과는, 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 간의 하나 이상의 세포 유형 내에서 평가될 수 있다. 특정 실시형태에서, 간 전달을 위한 지질 입자는 대상체의 다른 조직에서보다 대상체의 간 세포에서 운반물(예를 들어 핵산 운반물, 예를 들어 mRNA, CRISPR/Cas 시스템, 핵산 조정 조절인자 등)의 예를 들어 적어도 3배 더 큰, 적어도 4배 더 큰, 적어도 5배 더 큰, 적어도 6배 더 큰, 적어도 7배 더 큰, 적어도 8배 더 큰, 적어도 9배 더 큰, 적어도 10배 더 큰, 적어도 15배 더 큰, 적어도 20배 더 큰, 적어도 30배 더 큰, 적어도 40배 더 큰, 적어도 50배 더 큰, 적어도 60배 더 큰, 적어도 70배 더 큰, 적어도 80배 더 큰, 적어도 90배 더 큰, 적어도 100배 더 큰, 적어도 1000배 더 큰 활성을 유도할 수 있는 것이다.
다른 실시형태에서, PEG 변형된 지질 없이 제형화된 혼합 지질 입자는 가속된 혈중 청소율(ABC)를 감소시키거나 피할 수 있으며, 여기서 면역계는 제거를 위해 PEG를 표적화한다.
LNP 매개 운반물 전달
본원에 개시된 지질 입자 조성물은 이를 필요로 하는 대상체 또는 환자에게로의 활성제 또는 치료제 또는 화합물의 전달을 비롯한 다양한 목적을 위해 사용될 수 있다. 대상체는 인간과 비인간 동물 둘 모두를 포함한다. 특정 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다. 다른 실시형태에서, 대상체는 예를 들어 인간, 마우스, 래트, 개, 고양이, 소, 돼지, 양 또는 새를 비롯한 하나 이상의 특정 종 또는 품종이다.
따라서, 본 개시내용은 또한 다양한 질환 및 장애에 대한 치료 방법뿐만 아니라 미용상의 이점을 제공하기 위한 방법도 제공한다.
치료 방법
본 개시내용의 LNP 조성물은 매우 다양한 질환 또는 장애 중 임의의 것을 치료하는 데 사용될 수 있으며, 이는 염증성 질환, 심혈관 질환, 신경계 질환, 종양, 탈수초성 질환, 소화기 질환, 내분비계 질환, 생식기 질환, 혈액 및 림프계 질환, 면역 질환, 정신 질환, 근골격계 질환, 신경 질환, 신경근 질환, 대사 질환, 성병, 피부 및 결합 조직 질환, 비뇨기과 질환 및 감염을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시형태에서, 상기 LNP 조성물은 하기로부터 선택된 질환 또는 장애를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 간 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다: 담도 폐쇄증, 알라질 증후군, 알파-1 항트립신 결핍증, 티로신혈증, 신생아 간염, C형 간염 바이러스 감염, B형 간염 바이러스 감염, A형 간염 바이러스 감염, 간 세포 암종 및 윌슨병.
다른 실시형태에서, 본 발명의 LNP 조성물은 하기로부터 선택된 질환 또는 장애를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 관절 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다: 류마티스 관절염, 건선 관절염, 통풍, 건염, 활액낭염, 수근관 증후군 및 골관절염.
다른 실시형태에서, 본 발명의 LNP 조성물은 하기로부터 선택된 질환 또는 장애를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 염증성 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다: 염증성 장 질환, 복막염, 골수염, 악액질, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 알레르기성 비염, 낭포성 섬유증, 급성 기관지염, 급성 중증 기관지염, 골관절염, 류마티스 관절염, 감염성 관절염, 감염후 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 관절염, 골관절염, 통풍, 척추관절병, 강직성 척추염, 혈관염 증후군과 관련된 관절염, 신경성 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스 용종증 근육통, 관절염 세포 동맥염, 칼슘 다낭성 관절병증, 가성 통풍, 비-관절염 류머티즘, 활액낭염, 건초열, 화농성 염증(예를 들어, 테니스 엘보), 신경병성 관절 질환, 출혈성 관절증, 헤노흐-쇤라인 자색반, 비대성 골관절염, 다형 치질, 척추 측만증, 혈색소증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, COPD, 급성 호흡곤란 증후군, 급성 폐 손상, 기관지폐 이형성증 및 전신 홍반성 루푸스(SLE).
다른 실시형태에서, 본 발명의 LNP 조성물은 건선, 아토피성 피부염, 경피증, 습진, 장미증, 지루성 피부염, 흑색종, 일광 각화증, 어린선, 그로버병, 일반 사마귀, 각화극세포종 및 지루성 각화증을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 표피 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 LNP 조성물은 암의 한 유형을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다. 특히, 이러한 방법은 림프종, 백혈병, 및 골수종을 비롯한 혈액 및 림프계의 암에 적용될 수 있다. 본 개시내용에 따라 치료될 수 있는 특정 암의 예는 호지킨 림프종 및 비호지킨 림프종(NHL), 예를 들어, 다양한 분류 시스템, 예를 들어 작업 제제(Working formulation), Rappaport 분류, 바람직하게는 REAL 분류 중 임의의 것에 따라 정의된 임의의 유형의 NHL을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 이러한 림프종은 저등급, 중등급, 고등급 림프종뿐만 아니라 B 세포 및 T 세포 림프종을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 이러한 범주에는 다양한 유형의 소세포, 대세포, 분할 세포, 림프구, 여포성, 미만성, 버킷, 맨틀 세포, NK 세포, CNS, AIDS 관련, 림프모구, 성인 림프모구, 무통성, 공격성, 변형 및 기타 유형의 림프종이 포함된다. 본 개시내용의 방법은 성인 또는 소아 형태의 림프종뿐만 아니라 임의의 단계, 예를 들어 단계 I, II, III 또는 IV의 림프종에도 사용될 수 있다. 다양한 유형의 림프종은 당업자에게 잘 알려져 있고, 예를 들어 미국 암 협회(American Cancer Society)(예를 들어 www3.cancer.org 참조)에 의해 기술되어 있다.
본원에 기술된 조성물 및 방법은 또한 성인 및 소아 형태의 백혈병을 비롯한 임의의 형태의 백혈병에 적용될 수 있다. 예를 들어, 임의의 급성, 만성, 골수성 및 림프구성 형태의 상기 질환이 본 개시내용의 방법을 사용하여 치료될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 상기 방법은 급성 림프구성 백혈병(ALL)을 치료하는 데 사용된다. 다양한 유형의 백혈병에 대한 추가적인 정보는 특히 미국 백혈병 협회(Leukemia Society of America)(예를 들어, www.leukemia.org 참조)에서 찾을 수 있다.
추가적인 유형의 종양, 예를 들어 신경모세포종, 골수종, 전립선암, 소세포폐암, 결장암, 난소암, 비소세포폐암, 뇌종양, 유방암 등도 본원에 기술된 방법을 사용하여 치료될 수 있다.
본 개시내용의 LNP 조성물은 1차 치료로서 또는 2차 치료로서 투여될 수 있다. 또한, 이들은 1차 화학요법 치료로서 투여되거나 또는 보조 또는 신보조 화학요법으로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 재발성, 무통성, 변형 및 공격성 형태의 비호지킨 림프종에 대한 치료는 화학요법 및/또는 방사선 요법과 같은 1차 항암 치료 중 적어도 한 과정 후에 투여될 수 있다.
LNP 조성물의 투여
본 개시내용의 LNP 조성물은 비경구, 정맥내, 전신, 국소, 경구, 종양내, 근육내, 피하, 복강내, 흡입 또는 임의의 이러한 전달 방법을 비롯한 다양한 방식 중 임의의 것으로 투여된다. 일 실시형태에서, 상기 조성물은 비경구적으로, 즉 관절내, 정맥내, 복강내, 피하 또는 근육내 투여된다. 특정 실시형태에서, 상기 LNP 조성물은 정맥내 주입에 의해 투여되거나 볼루스 주사에 의해 복강내 투여된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 환자에게는, 예를 들어 5 내지 10분, 15 내지 20분, 30분, 60분, 90분 또는 그 초과에 걸쳐, 계속되는 정맥내 라인을 통해 지질 나노입자-캡슐화된 활성제의 정맥내 주입이 제공된다. 일 실시형태에서, 60분 주입이 사용된다. 다른 실시형태에서, 6 내지 10분 또는 15 내지 20분 범위의 주입이 사용된다. 이러한 주입은 주기적으로, 예를 들어 1, 3, 5, 7, 10, 14, 21 또는 28일 또는 그 초과마다 1회, 바람직하게는 7 내지 21일마다 1회, 바람직하게는 7 또는 14일마다 1회 제공될 수 있다.
본 개시내용의 LNP 조성물은 대상체에게 전달하기에 적합한 약학적 조성물로서 제형화될 수 있다. 본 개시내용의 약학적 조성물은 종종 하나 이상의 완충제(예를 들어, 중성 완충 식염수 또는 인산염 완충 식염수), 탄수화물(예를 들어, 글루코스, 만노스, 수크로스, 덱스트로스 또는 덱스트란), 만니톨, 단백질, 폴리펩티드 또는 아미노산, 예를 들어 글리신, 항산화제, 세균 발육 저지제, 킬레이트제, 예를 들어 EDTA 또는 글루타티온, 보조제(예를 들어, 수산화알루미늄), 상기 제제를 수용자의 혈액과 등장성, 저장성 또는 약한 고장성으로 만드는 용질, 현탁화제, 증점제 및/또는 방부제를 추가로 포함한다. 대안적으로, 본 개시내용의 조성물은 동결건조물로서 제형화될 수 있다.
상기 약학적 제제 내의 약물 및 지질 나노입자의 농도는 광범위하게, 즉 약 0.05 중량% 미만, 일반적으로, 약 2 내지 5 중량% 또는 적어도 약 2 내지 5 중량% 내지 최대 10 내지 30 중량%까지 다양할 수 있으며, 사용되는 특정 약물, 치료되는 질환 상태 및 담당 임상의의 판단에 따라 선택된다. 또한, 약물 및 지질 나노입자의 농도는 투여된 유체 부피, 투여된 용액의 삼투압, 약물 및 지질 나노입자의 내약성도 고려한다. 어떤 경우에는, 주입 관련 부작용의 발생률이나 중증도를 줄이기 위해 더 낮은 약물 또는 지질 나노입자 농도를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
본 개시내용에 사용하기에 적합한 제제는 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th Ed. (1985)]에서 찾아볼 수 있다. 종종, 정맥내 조성물은 수성 담체와 같은 허용 가능한 담체에 현탁된 지질 나노입자의 용액을 포함한다. 다양한 수성 담체 중 임의의 것, 예를 들어 물, 완충수, 0.4% 식염수, 0.9% 등장성 식염수, 0.3% 글리신, 5% 덱스트로스 등이 사용될 수 있으며, 이는 향상된 안정성을 위한 당단백질, 예를 들어 알부민, 지단백질, 글로불린 등을 포함할 수 있다. 종종 일반 완충 식염수(135 내지 150 mM NaCl) 또는 5% 덱스트로스가 사용된다. 이들 조성물은 여과와 같은 통상적인 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 생성된 수용액은 사용을 위해 포장되거나 또는 무균 조건 하에 여과되고 동결건조될 수 있으며, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 수용액과 조합된다. 상기 조성물은 또한 생리학적 조건을 근사화하는 데 필요한 약학적으로 허용 가능한 보조 물질, 예를 들어 pH 조절제 및 완충제, 등장성 조절제 등, 예를 들어 아세트산나트륨, 젖산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 등을 함유할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 저장 시 자유 라디칼 및 지질 과산화 손상으로부터 지질을 보호하는 지질 보호제를 포함할 수 있다. α-토코페롤과 같은 친유성 자유 라디칼 제거제 및 페리옥사민과 같은 수용성 철-특이적 킬레이트제가 적합하다.
용량당 투여되는 활성제의 양은 최소 치료 용량보다 높지만 독성 용량보다 낮도록 선택된다. 용량당 양의 선택은 환자의 병력, 다른 요법의 사용 및 질환의 성격과 같은 여러 요인에 따라 결정된다. 또한, 투여되는 활성제의 양은 치료에 대한 환자의 반응 및 임의의 치료 관련 부작용의 존재 또는 중증도에 따라 치료 전반에 걸쳐 조정될 수 있다. 특정 실시형태에서, LNP 조성물의 용량 또는 투여 빈도는, 상응하는 유리 활성제를 사용하는 치료의 용량 및 일정과 대략 동일하다. 그러나, 특히 상기 LNP 조성물이 감소된 독성을 나타내는 경우, 용량이 유리 약물 치료와 비교하여 더 높거나 더 자주 투여될 수 있는 것으로 이해된다. 특히 상기 LNP 조성물이 유리 약물과 비교하여 증가된 효능을 나타내는 경우, 용량이 유리 약물 치료에 비해 더 낮거나 덜 자주 투여될 수 있다는 것도 이해된다. 다양한 화학요법 화합물(유리 약물)에 대한 예시적인 용량 및 치료법은 알려져 있고 당업자에게 이용 가능하며, 예를 들어 문헌[Physician's Cancer Chemotherapy Drug Manual, E. Chu and V. Devita (Jones and Bartlett, 2002)]에 기술되어 있다.
환자는 전형적으로 치료에 대한 환자의 반응에 따라 적어도 두 가지, 및 잠재적으로 더 많은, 이러한 치료 과정을 받는다. 단일 제제 요법에서는, 관찰된 반응과 독성에 기초하여 환자와 의사가 전체 치료 과정을 결정한다.
병용 요법
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 LNP 조성물은 하나 이상의 추가적인 화합물 또는 요법, 예를 들어 수술, 방사선 치료, 화학요법, 또는 전술된 것 중 임의의 것을 비롯한 기타 활성제와 조합하여 투여될 수 있다. LNP 조성물은, 효능 증가 또는 바람직하지 않은 부작용 감소를 비롯한 다양한 이유를 위해, 제2 활성제와 조합하여 투여될 수 있다. 상기 LNP 조성물은 추가적인 치료 전에, 이후에 또는 이와 동시에 투여될 수 있다. 또한, 본 개시내용의 LNP 조성물(제1 활성제를 포함함)이 제2 활성제와 조합하여 투여되는 경우, 상기 제2 활성제는 유리 약물로서, 독립적인 LNP 제제로서, 또는 상기 제1 약물을 포함하는 LNP 조성물의 성분으로서 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 다중 활성제가 동일한 지질 나노입자에 로딩된다. 다른 실시형태에서, 활성제를 포함하는 지질 나노입자는 하나 이상의 유리 약물과 조합하여 사용된다. 특정 실시형태에서, 활성제를 포함하는 LNP 조성물은 개별적으로 형성되고 후속적으로 단일 공동-투여를 위한 다른 화합물과 조합된다. 대안적으로, 특정 요법이 미리 결정된 순서에 따라 순차적으로 투여된다. 따라서, 본 개시내용의 LNP 조성물은 하나 이상의 활성제를 포함할 수 있다.
당업자에게 알려진 다른 병용 요법이 본 개시내용의 방법과 함께 사용될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질을 아래에 기술한다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 그 전체가 원용에 의해 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 포함하여, 본 명세서가 우선한다. 또한, 상기 물질, 방법 및 실시예는 예시적인 것일 뿐이며 제한하려는 의도는 아니다.
이제 본 개시내용의 예시적인 실시형태를 상세히 참조할 것이다. 본 개시내용은 예시적인 실시형태와 함께 설명될 것이지만, 본 개시내용을 그러한 실시형태로 제한하려는 의도는 없다는 것이 이해될 것이다. 반대로, 첨부된 청구범위에 의해 정의된 본 개시내용의 사상 및 범위 내에 포함될 수 있는 대안, 변형 및 등가물을 포괄하도록 의도된다. 당업계에 잘 알려진 표준 기술 또는 하기에 구체적으로 설명된 기술이 사용되었다.
실시예
실시예 1: 미세유체 접근법을 이용한 혼합 지질 나노입자(LNP) 제제의 제조
LNP 제제는 이온화 가능한 지질, 양이온성 지질, 비양이온성 지질(예를 들어, 헬퍼 지질), 콜레스테롤(예를 들어, 구조적 지질) 및 선택적으로, 운반물로서의 올리고뉴클레오티드를 캡슐화하기 위한 접합된 지질(예를 들어, PEG-지질)을 사용하여 제조되었다. 파일럿 단계 제제에서는, 검증되고 널리 허용 가능한 이온화 가능한 지질인 헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트(MC3)가 제1 성분으로 사용되었으며, 제2 성분으로서의 양이온성 분지형 폴리에틸렌이민(bPEI)과 조합되었다. 제2 성분인 bPEI는 MC3 분자당 하나의 양전하로 하전된 질소 원자와 비교하여, 분자당 하나 초과의 양전하로 하전된 질소 원자를 갖는 분지형 구조를 갖는다. 이들 두 성분을 다양한 몰비로 다른 유형의 지질과 혼합하여(도 1a 참조) 에틸 알코올(EtOH)에서 제형화된 LNP의 유기상을 형성하였다. LNP는 또한 유기상 중의 Cy5-지질 접합체를 포함시킴으로써 형광 표지되었다. 올리고뉴클레오티드 운반물의 경우, GFP 단백질 및 핵산 조정 조절인자를 인코딩하는 8870 bp의 대형 원형 플라스미드를 pH 4.5 시트르산 완충제(50 mM)에 0.27 mg/ml 농도로 혼합하였다. 두 상의 혼합과 LNP 제조는 미세유체 혼합 장치를 사용하여 2:1 부피비(수성:유기)를 사용하여 수행되었다. LNP는 추가적인 정제 및 농축 없이 사용되었다. 입자 크기, 제타 전위 및 다분산 지수(PDI)를 DLS-PALS로 측정하고, 특성화 결과를 표로 작성하였다(도 1a). 100 nm 입자 크기의 혼합 LNP는 주어진 조성과 지질을 사용하여 성공적으로 제조될 수 있었다. Hepa 1-6 뮤린 간 세포 암종 세포를 96-웰 흑색 벽 마이크로플레이트에 20,000개 세포/웰/100 μl로 접종하였다. 세포를 5% CO2 하에서 37°C에서 배양하고, 밤새 배양 및 부착시켰다. 다음날, 총 100 μl 세포 배양 배지/웰에서, 500 내지 125 ng 플라스미드/웰에 상응하는 세 가지 다른 부피의 LNP를 사용하여, MbP로 표지된 혼합 LNP 제제로 세포를 치료하였다. 세포를 상기 제제로 48시간 동안 연속적으로 치료하였다. 그런 다음 웰을 페놀 레드가 없는 완전 세포 배양 배지로 세척하고 세포 핵을 Hoechst로 염색하였다. 살아있는 세포에서 Cy5(적색), Hoechst(청색) 및 GFP(녹색)를 검출하기 위해 영상화를 수행하였다. 48시간 치료 후 Hepa 1.6 세포의 성공적인 형질감염이 관찰되었다(도 1b). 치료된 세포의 100%가 Cy5 양성이었으며(도 1b), 이는 이들 세포가 LNP 양성임을 나타낸다. 본 개시내용의 혼합 LNP는 또한, 동시에 분석된 MC3 기반 LNP와는 달리, 상기 대형 플라스미드 운반물로 세포를 형질감염시킬 수 있었다. 본 실시예의 혼합 LNP는 또한, 시험된 농도에서 세포에 대해 유의미한 세포독성을 발휘하지 않았으며, 이는 bPEI의 첨가가 MbP 혼합 LNP의 안전성에 부정적인 영향을 미치지 않았음을 나타낸다(도 1c).
실시예 2: 혼합 양이온성 지질 입자는, 역사적으로 형질감염시키기 어려운 세포주를 형질감염시키는 데 효과적인 것으로 확인되었다
1차 T 세포는 역사적으로 비-바이러스 벡터로 형질감염시키기 어려웠고, 폴리플렉스의 세포내이입이 매우 낮다. 더욱이, T 세포의 세포내 pH는 다른 세포 유형보다 높고 MC3(pKa: 6.4)와 같은 대부분의 이온화 가능한 지질의 pKa에 더 가깝다. 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 이는 LNP의 내재화 시 엔도솜 구획에서의 감소된 양전하 전환을 일으키는 것으로 여겨지며, 따라서 양성자 스폰지 효과 및 엔도솜 탈출을 방지하는 것으로 보인다. 형질감염을 위해 양이온성이 높은 지질과 중합체를 사용하면, 세포독성과 자가포식소체 형성을 또한 유도할 수 있다. 혼합 입자와 전술된 과제에 대한 이의 성능을 평가하려는 초기 시도에서, MC3, bPEI, DOPC, 콜레스테롤 및 PEG2k-DMG로 구성된, "MbP-2"로 표지된, 혼합 LNP 제제를 개발하였다(비율은 도 2a에 표시됨). 상응하는 비율의 다른 지질 성분의 MC3-단독 제제도 제조하여, 비교를 위한 기준 제제로 사용하였다. 대표적인 올리고뉴클레오티드 운반물로서, GFP mRNA를 두 가지 형태의 LNP 모두로 캡슐화하고, 각각의 LNP 제제의 특성/능력을 평가하였다. MbP-2 및 MC3 제제 둘 모두가 100% Cy5 양성 세포를 유발하였고, 이는 두 LNP가 모두 성공적으로 내재화되었음을 나타내는 반면, MbP-2 혼합 LNP 제제는 세포의 >50%를 GFP mRNA로 형질감염시키는 것으로 관찰되었다(도 2b). 대조적으로, MC3 제제는 동일한 조건 하에서 세포의 16%만을 형질감염시키는 것으로 관찰되었다. 그 결과, MbP-2 혼합 LNP 제제는 MC3-단독 LNP와 비교하여 형질감염된 세포에서의 1.5배 증가된 GFP 신호를 생성했을 뿐만 아니라, 대조군 치료된 세포와 비교하여 형질감염된 세포에서의 20배 증가된 GFP 신호를 생성하였다(도 2c). 이러한 결과는, MC3-단독 LNP에 대비한, mRNA의 캡슐화 및 세포 내로의 전달에 대한 혼합 LNP의 효과를 입증하였다.
실시예 3: 다양한 제제 매개변수를 갖는 혼합 C12-200/DOTAP 입자의 제조
C12-200과 DOTAP 지질을 다양한 상대 농도로 혼합한 일련의 DOTAP/C12-200 혼합 지질 나노입자("DC LNP")를 제조하였고, 이에 의해 불포화 및 포화 지질 사슬 둘 모두를 개별 LNP 제제에 도입하였다. DC LNP는 미세유체 혼합 공정을 사용하여 생성되었다. DOTAP, C12-200, DOPE, CHE 및 PEG2k-DMG의 지질 스톡을 에탄올에서 20 내지 80 mg/mL 농도로 제조하였다. C12-200의 몰농도 백분율(mol%)과 총 지질 대 mRNA 질량비를 일정하게 유지하면서, DOPE, DOTAP 및 PEG의 몰농도 백분율(mol%) 변화를 조사하였다. 더 높은 C12-200 수준에서 예상되는 독성을 완화하기 위해, C12-200의 농도는 20 mol% 미만으로 유지되었다. mCherry mRNA(996개 뉴클레오티드 길이)가 0.25 mg/mL 농도로 수성 상 중의 핵산 운반물로 사용되었다. 유기 상과 수성 상의 혼합은 3:1(수성 대 유기) 부피비를 사용하여 8 mL/분 유속으로 수행되었다. 제제의 특성화 매개변수를 도 3a에 요약하였다.
C12-200의 높은 순 양전하는 입자 크기의 정밀 제어를 허용하였으며, 시험된 12개 제제 중 11개에서 72 내지 97 nm로 변화하였다. 표면 전하는 4 내지 15 mV로 유지되었고 PDI는 0.2 미만으로 유지되었다. 제제의 안정성을 증가시킬 뿐만 아니라 전신 투여 시 예상되는 스텔스(stealth) 특성을 갖는 입자를 제공하기 위해, PEG2k-DMG가 포함되었다.
실시예 4: 혼합 C12-200/DOTAP 입자 형질감염된 폐암 세포주 A549
A549 인간 폐암 세포를 선택된 혼합 C12-200/DOTAP 입자로 시험관내에서 치료하였다(도 3a). C12-200/DOTAP 입자로 치료된 웰당 20,000개의 세포에서 37°C, 5% CO2에서 24시간 동안 mCherry mRNA 형질감염을 유도하였다. mRNA의 용량은 완전 배지에서 5 내지 0.16 μg/mL로 변경되었다. 선택된 제제의 세포독성을 초기에 평가하였다. 하기의 세 가지 다른 실험 조건에서, 세포를 혼합 C12-200/DOTAP 입자로 구체적으로 치료하였다: (i) DOTAP 및 DOPE의 몰농도 백분율을 변경하면서 C12-200의 몰농도 백분율을 18%로 유지하여(도 3b) DOTAP 몰농도 백분율의 영향을 조사함, (ii) C12-200 몰농도 백분율을 18%로 유지하면서 PEG-지질 비율을 변화시킴(도 3c), (iii) C12-200의 몰농도 백분율을 18%로 유지하고 DOTAP와 콜레스테롤의 몰농도 백분율을 변화시켜(도 3d) 특정 입자 내의 DOPE와 콜레스테롤의 각각의 역할을 조사함, 24시간 치료에서는 분석된 입자에서의 최대 내약 mRNA 용량이 0.63 μg/ml인 것으로 나타났다. 다양한 입자에 대해 관찰된 형질감염된 세포의 백분율도 평가되었다(도 4a 내지 도 4c). 모든 혼합 C12-200/DOTAP 입자는 내약 용량 수준(여기서 적어도 80%의 세포가 생존 가능하였음)에서 세포의 100%를 형질감염시켰다. 결과는, C12-200의 몰농도 백분율이 일정하게 유지되고 DOTAP %의 감소된 수준이 증가된 콜레스테롤 농도에 의해 상쇄될 때, 낮은 치료제 농도에서 이러한 더 적은 DOTAP 입자의 형질감염 효능이 감소하였음을 추가로 나타냈다. 또한, 제제에 PEG-지질을 포함시키는 것은, 아마도 입자 안정성을 향상시킴으로써, 형질감염 효율을 증가시키는 것으로 확인되었다. 가장 낮은 시험 농도에서 치료된 세포에 대한 상세한 현미경 분석 또한 수행되었으며, 이는 모든 세포가 매우 낮은 mRNA 농도에서도 mCherry 리포터 단백질을 명확하게 발현한다는 것을 나타냈다(도 5).
실시예 5: 혼합 C12-200/DOTAP 입자는 -80°C에서 저장 후에도 안정적이었다
혼합 C12-200/DOTAP 입자는 전술된 미세유체 혼합 공정을 사용하여 생성되었다. 혼합 C12-200/DOTAP 입자를 제조하기 위해 DOTAP, C12-200, DOPE, CHE 및 PEG-DMG의 지질 스톡을 에탄올에서 20 내지 80 mg/mL 농도로 제조하였다. 입자의 최종 지질 농도는 DOTAP, C12-200, DOPE, 콜레스테롤(CHE) 및 PEG-DMG에 대해 각각 50, 18, 6, 24 및 2 mol%로 유지되었다. 핵산 조정 조절인자를 인코딩하는(즉, 단백질 조절인자 성분을 인코딩하는) 4598개 뉴클레오티드 길이의 mRNA를 수성 상 중의 핵산 운반물로서 0.20 mg/mL 농도로 사용하였다. 유기 상과 수성 상의 혼합은, 통상적인 엇갈린 헤링본 모델과 비교하여, 증가된 작업량을 허용하는 미세유체 흐름 경로 설계에서 8 mL/분 유속으로 3:1(수성 대 유기) 부피비를 사용하여 수행되었다. 생성된 입자를 물 또는 4 mM HEPES 완충제(pH 6.5)에서의 접선 유동 여과에 의한 정제 및 완충제 교환에 적용하였다. 입자를 그대로, 또는 최종 10% 수크로스를 첨가하여, 4°C 및 -80°C에서 35일 동안 저장하였다. 수크로스는 냉동 과정에서 입자의 구조를 보존할 수 있는 동결보호제 역할을 한다. 저장 전후의 입자 제제의 특성화 매개변수를 측정하였다(도 6a). 모든 제제는 수크로스를 첨가하거나 첨가하지 않고 4°C에서 안정하게 유지되었다. 냉동된 경우, 동결보호제(여기서는 10% 수크로스)가 포함된 LNP만 특성이 보존되었다. 냉동 저장은 조기 mRNA 방출 또는 해동 시 불안정성의 증거를 나타내지 않았다(도 6b). 따라서 본 개시내용의 입자는 냉동 저장에 적합할 가능성이 높으며, 운반물 핵산(긴 mRNA 또는 핵산 조정 조절인자 운반물 포함)에 대한 보호를 제공할 수 있는 강력한 내부 구조를 보유한다.
실시예 6: 혼합 C12-200/DOTAP 입자는 DOTAP-단독 입자에 대비해 방향성을 변경하여 간 표적화를 가능하게 한다
간 조직 표적화를 위한 본 개시내용의 입자의 효능을 측정하기 위해, 신호를 생성하기 위해 핵에서의 운반물 핵산 활성이 필요한 Ail4 마우스를 사용하였으며, 혼합 C12-200/DOTAP 입자의 생체분포를 Ai14 마우스(B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze /J; Ail4는, 모두 Gt(ROSA)26Sor 유전자좌에 삽입되는 CAG 프로모터 구동 적색 형광 단백질 변이체(tdTomato)의 전사를 방지하는 loxP-측면 STOP 카세트를 갖도록 설계된 Cre 리포터 도구 균주이다; Ai14 마우스는 Cre 매개 재조합 후 강력한 tdTomato 형광을 나타낸다(Cre 재조합효소(mCre에 의해 인코딩됨)는 loxP 부위 간의 DNA의 부위 특이적 재조합을 촉매함으로써 활성을 나타냄))에서 평가하였다. 입자의 장기 분포에 대한 DOTAP의 기여도를 조사하기 위해 높고 낮은 mol%의 DOTAP(50 및 10%)를 시험하였다. 50 mol% DOTAP를 갖는 DOTAP-단독 입자가 폐에서 강력하고 고도로 장기-제한된 활성을 제공한다는 것이 이전에 확인되었다. 본 생체분포 연구에서는, DOTAP mol%를 50%로 유지하면서, 포화 지질 사슬 C12-200의 포함이 본 입자의 장기 방향성에 미치는 영향을 평가하였다. 본 개시내용의 입자는 Cy7-DOPE(0.25 mol%)로 형광 표지되고 mCre mRNA가 로딩되었다. 입자 제제는 정맥내 경로를 통해 1 mg/kg 용량으로 투여되었다. 본 입자를 별개의 간 표적화 제제(mCre가 로딩된 MC3 함유 제제)와 비교하였으며, 이 제제 또한 제조되어 3 mg/kg 용량으로 투여되었다. 투여 후 48시간째에, tdTomato에 대한 생체외 장기 영상화가 수행되었다. 모든 제제에서 매우 특이적인 간 활성이 관찰되었다(도 7a 내지 도 7c). 본 개시내용의 혼합 C12-200/DOTAP 입자는 DOTAP-단독 LNP의 특이적 활성을 폐에서 간으로 전환시킬 수 있었다. 혼합 C12-200/DOTAP 입자에 대해 관찰된 단백질 발현 정도는, 3배 더 높은 용량에서 대조군으로 사용된, MC3 함유 입자에 대해 관찰된 효과보다 80 내지 100% 더 높았다(도 7d). 간 샘플의 면역조직화학 이미지는 tdTomato 생성 및 Cy7 표지된 입자 축적을 확인시켜 주었다(둘 모두 갈색으로 염색됨; 도 8). 추가로, 간 기능 시험은 1 mg/kg mRNA 용량에서의 분석된 혼합 지질 입자의 안전성을 확인시켜 주었다(도 9a 내지 도 9f).
실시예 7: 혼합 C12-200/DOTAP 입자는 간 조직에 핵산 조정 조절인자를 효과적으로 전달한다
혼합 C12-200/DOTAP 입자의 생체분포를 평가한 후, 핵산 조정 조절인자를 함유하는 이러한 입자를 간 조직에서의 생체내 효능에 대해 평가하였다. 특히, 야생형 C57Bl6/J 마우스를, 각각 VEGFa mRNA를 보유하는 두 개의 서로 다른 혼합 C12-200/DOTAP 입자 제제로 치료하였다. 3가지 별개의 용량 수준으로 이들 제제를 마우스에 정맥내 투여한 결과, 혼합 C12-200/DOTAP 입자의 시험된 두 가지 형태 모두, 적절한 대조군과 비교하여, 특히 1 mg/kg 용량 수준에서, 혈청 VEGFa 수준을 유의하게 증가시킨 것으로 나타났다(도 10a 내지 도 10b). 이들 데이터는, 핵산 조정 조절인자를 비롯한 대형 핵산을 캡슐화하고 이를 높은 선택성, 특이성 및 효능으로 간에 전달함으로써 낮은 용량 수준에서도 생리학적 반응을 생성하는 데 있어서의 본 발명의 혼합 C12-200/DOTAP 입자의 효능을 추가로 확인시켜 주었다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 간행물은 본 개시내용이 속하는 기술 분야의 당업자의 기술 수준을 나타낸다. 본 개시내용에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 참고문헌이 그 전체가 개별적으로 원용에 의해 포함된 것과 동일한 정도로 원용에 의해 포함된다.
당업자는 본 개시내용이 목적을 수행하고 언급된 목적 및 이점뿐만 아니라 그에 내재된 목적 및 이점을 달성하도록 양호하게 적응된다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 바람직한 실시형태를 현재 대표하는 것으로서 본원에 기술된 방법 및 조성물은 예시적인 것이며, 본 개시내용의 범위를 제한하려는 의도는 아니다. 그 안에서의 변경 및 다른 용도가 당업자에게 떠오를 것이며, 이는 본 개시내용의 사상 내에 포함되며 청구범위의 범위에 의해 정의된다.
또한, 본 개시내용의 특징 또는 양태가 마쿠쉬 그룹 또는 대안의 다른 그룹화에 관하여 기술되는 경우, 당업자는 본 개시내용이 이에 의해 마쿠쉬 그룹 또는 다른 그룹의 임의의 개별 구성원 또는 구성원들의 하위 그룹에 관해서도 기술되어 있다는 것을 인식할 것이다.
본 개시내용을 기술하는 맥락에서(특히 하기 청구범위의 맥락에서) 단수형 및 유사한 지시 대상의 사용은, 본원에 달리 명시되거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 단수 및 복수 둘 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 용어 "포함하는(comprising, including)", "갖는",및 "함유하는"은, 달리 명시되지 않는 한, 개방형 용어(즉, "포함하지만 이에 제한되지는 않는"을 의미함)로 해석된다. 본원에서의 값의 범위의 언급은, 본원에 달리 명시되지 않는 한, 단지 상기 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 언급하는 약식 방법의 역할을 하도록 의도되었으며, 각각의 개별 값은 본원에서 개별적으로 언급된 것처럼 본 명세서에 포함된다.
본원에 기술된 모든 방법은. 본원에 달리 명시되거나 문맥상 명확하게 모순되지 않는 한. 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 및 모든 예 또는 예시적인 언어(예를 들어, "~와 같은")의 사용은, 달리 청구되지 않는 한, 단지 본 개시내용을 더 잘 설명하기 위한 것이며, 본 개시내용의 범위를 제한하지 않는다. 본 명세서의 어떤 언어도 청구되지 않은 요소를 본 개시내용의 실시에 필수적인 것으로 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
개시된 발명을 수행하기 위한 본 발명자들에게 알려진 최상의 모드를 비롯한, 본 개시내용의 실시형태를 본원에 기술하였다. 이러한 실시형태의 변형은 전술된 설명을 읽음으로써 당업자에게 명백해질 수 있다.
본원에 예시적으로 기술된 개시내용은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들 없이 적절하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본원의 각각의 경우에서, 용어 "포함하는", "본질적으로 ~로 구성된" 및 "~로 구성된"은 다른 두 용어 중 하나로 대체될 수 있다. 사용된 용어와 표현은 제한이 아닌 설명의 용어로 사용되었고, 이러한 용어와 표현의 사용에 있어서, 표시되고 기술된 특징 또는 이의 일부의 임의의 등가물을 배제하려는 의도는 없으며, 청구된 발명의 범위 내에서 다양한 변형이 가능하다는 것으로 인식된다. 따라서, 본 개시내용은 바람직한 실시형태를 제공하지만, 본원에 개시된 개념의 선택적인 특징, 수정 및 변형이 당업자에 의해 활용될 수 있으며, 이러한 수정 및 변형은 본 설명 및 첨부된 청구범위에 의해 정의된 본 개시내용의 범위 내에 속하는 것으로 간주된다는 것이 이해되어야 한다.
본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않으면서 본원에 개시된 발명에 대해 다양한 치환 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 용이하게 명백할 것이다. 따라서, 이러한 추가적인 실시형태는 본 개시내용 및 하기 청구범위의 범위 내에 속한다. 본 개시내용은 당업자에게 개선된 대비, 진단 및/또는 영상화 활성을 갖는 접합체를 생성하기 위한 본원에 기술된 화학적 변형의 다양한 조합 및/또는 치환을 시험하는 것을 교시한다. 따라서, 본원에 기술된 특정 실시형태는 제한하기 위한 것이 아니며, 당업자는 개선된 대비, 진단 및/또는 영상화 활성을 갖는 접합체를 확인하기 위한 과도한 실험 없이 본원에 기술된 변형의 특정 조합을 시험할 수 있다는 것을 쉽게 이해할 수 있다.
본 발명자들은 숙련된 기술자가 이러한 변형을 적절하게 사용할 것으로 기대하며, 본 발명자들은 본 개시내용이 본원에 구체적으로 기술된 것과 달리 실시되기를 의도한다. 따라서 본 개시내용은, 해당 법률이 허용하는 대로, 본원에 첨부된 청구범위에 언급된 기술 요지의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 더욱이, 본원에 달리 명시되거나 문맥상 명확하게 모순되지 않는 한, 그 모든 가능한 변형 내의 전술된 요소들의 임의의 조합이 본 개시내용에 포함된다. 당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본원에 기술된 개시내용의 특정 실시형태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 포함되도록 의도된다.

Claims (63)

  1. 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자로서, 상기 핵산-지질 입자는,
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 10 mol% 내지 약 50 mol%를 구성하는 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP); 및
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 5 mol% 내지 약 50 mol%를 구성하는 이온화 가능한 지질을 포함하는, 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질은 1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-히드록시도데실)아미노)에틸)(2-히드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스(도데칸-2-올)(C12-200), N4-콜레스테릴-스페르민 HCl(GL67), N1-[2-((1S)-1-[(3-아미노프로필)아미노]-4-[디(3-아미노-프로필)아미노]부틸카르복사미도)에틸]-3,4-디[올레일옥시]-벤즈아미드(MVL5) 및 중합체성 분지형 폴리에틸렌이민(bPEI)으로 구성된 군으로부터 선택되는, 핵산-지질 입자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 지질-핵산 입자에 존재하는 총 지질의 약 25 mol% 내지 약 85 mol%를 구성하는 하나 이상의 비양이온성 지질을 포함하고, 선택적으로, 상기 하나 이상의 비양이온성 지질은 콜레스테롤, β-시토스테롤 및 이의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 구조적 지질을 포함하는, 핵산-지질 입자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 10 mol% 내지 약 75 mol%의 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체를 포함하고, 선택적으로, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 20 mol% 내지 약 65 mol%의 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체를 포함하고, 선택적으로, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 24 mol% 내지 약 64 mol%의 콜레스테롤 또는 이의 유도체를 포함하고, 선택적으로, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체를 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 24 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 24 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 34 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 38 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 44 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 54 mol%, 및 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 64 mol%로 구성된 군으로부터 선택된 수준으로 포함하는, 핵산-지질 입자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질을 포함하고, 선택적으로, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 상기 지질-핵산 입자에 존재하는 총 지질의 약 5 mol% 내지 약 50 mol%를 구성하며, 선택적으로, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 상기 지질-핵산 입자에 존재하는 총 지질의 약 5 mol% 내지 약 30 mol%를 구성하며, 선택적으로, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 상기 지질-핵산 입자에 존재하는 총 지질의 약 5 mol% 내지 약 10 mol%를 구성하는, 핵산-지질 입자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질을 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 6 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 7 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 7.5 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 8 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 9 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 10 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 16 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 26 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 36 mol%, 및 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 46 mol%로 구성된 군으로부터 선택된 수준으로 포함하는 핵산-지질 입자.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)으로 구성된 군으로부터 선택된 비양이온성 지질을 포함하고, 선택적으로, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)인, 핵산-지질 입자.
  8. 제1항에 있어서, PEG-지질 접합체를 포함하지 않고, 선택적으로, PEG를 포함하지 않는 핵산-지질 입자.
  9. 제8항에 있어서, 다중 용량 요법의 성분인 핵산-지질 입자.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 총 지질의 0.01 내지 3%를 구성하는, 입자의 응집을 억제하는 접합된 지질을 포함하고, 선택적으로, 상기 접합된 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 접합체를 포함하고, 선택적으로, 상기 PEG-지질 접합체의 PEG는 550 달톤 내지 3000 달톤의 평균 분자량을 갖고, 선택적으로, 상기 PEG-지질 접합체는 PEG2000-지질 접합체이고, 선택적으로, 상기 PEG2000-지질 접합체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2k) 및 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DSG-PEG2k) 중 하나 이상을 포함하고, 선택적으로, 상기 PEG2000-지질 접합체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2k)이고, 선택적으로, 상기 핵산-지질 입자는 PEG-지질 접합체를 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 0.5 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 1.0 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 1.5 mol%, 및 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 2.0 mol%로 구성된 군으로부터 선택된 수준으로 포함하는, 핵산-지질 입자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 운반물은 합성 또는 자연 발생 RNA 또는 DNA, 또는 이의 유도체를 포함하고, 선택적으로, 상기 핵산 운반물은 변형된 RNA이고, 선택적으로, 상기 변형된 RNA는 변형된 mRNA, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 변형된 siRNA로 구성된 군으로부터 선택되고, 선택적으로, 상기 변형된 mRNA는 핵산 조정 조절인자를 인코딩하는, 핵산-지질 입자.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 운반물이 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 5'-포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오티드, 콜레스테릴 유도체에 연결된 말단 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드, 5'-메톡시-변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 5'-메톡시유리딘), 2'-데옥시-변형된 뉴클레오티드, 잠긴 뉴클레오티드, 무염기 뉴클레오티드, 2'-아미노-변형된 뉴클레오티드, 2'-알킬-변형된 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포라미데이트, 뉴클레오티드를 포함하는 비천연 염기; 뉴클레오시드간 연결 또는 골격, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트, 예를 들어 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포라미데이트, 예를 들어, 3'-아미노 포스포라미데이트 및 아미노알킬포스포라미데이트, 티오노포스포라미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르 및 정상적인 3′-5′ 연결을 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2′-5′ 연결된 유사체 및 뉴클레오시드 단위의 인접 쌍이 3'-5'에서 5'-3' 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결된 반전된 극성을 갖는 것들로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형물을 포함하는, 핵산-지질 입자.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간 조직은 간 세포, 혈관 세포(즉, 간 동양혈관), 간 성상세포, 내피 세포, 섬유아세포, 중간엽 세포, 면역 세포, 암 세포, 쿠퍼 세포(Kupffer cell), 성상교세포, 타원형 혈관 내피 세포, 간 유래 줄기/전구 세포, 및 비-간 조직 유래 줄기/전구 세포 또는 암 세포로 구성된 군으로부터 선택되는, 핵산-지질 입자.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, DOTAP를 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 10 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 20 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 30 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 40 mol%, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 50 mol%로 구성된 군으로부터 선택된 수준으로 포함하는 핵산-지질 입자.
  15. 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자로서, 상기 핵산-지질 입자는,
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 50 mol%를 구성하는 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP); 및
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 18 mol%를 구성하는 이온화 가능한 지질을 포함하는, 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자.
  16. 제15항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질은 1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-히드록시도데실)아미노)에틸)(2-히드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스(도데칸-2-올)(C12-200)인, 핵산-지질 입자.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 24 mol%의 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체를 포함하고, 선택적으로, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 6 mol%의, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질을 추가로 포함하고, 선택적으로, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)이고, 선택적으로, 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 접합체를 추가로 포함하고, 선택적으로, 상기 PEG-지질 접합체는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 2.0 mol%를 구성하고, 선택적으로, 상기 PEG-지질 접합체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2k)인, 핵산-지질 입자.
  18. 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자로서, 상기 핵산-지질 입자는,
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 40 mol%를 구성하는 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP); 및
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 18 mol%를 구성하는 이온화 가능한 지질을 포함하는, 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자.
  19. 제18항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질은 1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-히드록시도데실)아미노)에틸)(2-히드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스(도데칸-2-올)(C12-200)인, 핵산-지질 입자.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 24 mol%의 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체를 포함하고, 선택적으로, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 16 mol%의, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질을 추가로 포함하고, 선택적으로, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)이고, 선택적으로, 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 접합체를 추가로 포함하고, 선택적으로, 상기 PEG-지질 접합체는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 2.0 mol%를 구성하고, 선택적으로, 상기 PEG-지질 접합체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2k)인, 핵산-지질 입자.
  21. 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자로서, 상기 핵산-지질 입자는,
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 30 mol%를 구성하는 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP); 및
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 18 mol%를 구성하는 이온화 가능한 지질을 포함하는, 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자.
  22. 제21항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질은 1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-히드록시도데실)아미노)에틸)(2-히드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스(도데칸-2-올)(C12-200)인, 핵산-지질 입자.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 24 mol%의 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체를 포함하고, 선택적으로, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 26 mol%의, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질을 추가로 포함하고, 선택적으로, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)이고, 선택적으로, 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 접합체를 추가로 포함하고, 선택적으로, 상기 PEG-지질 접합체는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 2.0 mol%를 구성하고, 선택적으로, 상기 PEG-지질 접합체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2k)인, 핵산-지질 입자.
  24. 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자로서, 상기 핵산-지질 입자는,
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 20 mol%를 구성하는 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP); 및
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 18 mol%를 구성하는 이온화 가능한 지질을 포함하는, 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자.
  25. 제24항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질은 1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-히드록시도데실)아미노)에틸)(2-히드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스(도데칸-2-올)(C12-200)인, 핵산-지질 입자.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 24 mol%의 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체를 포함하고, 선택적으로, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 36 mol%의, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질을 추가로 포함하고, 선택적으로, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)이고, 선택적으로, 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 접합체를 추가로 포함하고, 선택적으로, 상기 PEG-지질 접합체는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 2.0 mol%를 구성하고, 선택적으로, 상기 PEG-지질 접합체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2k)인, 핵산-지질 입자.
  27. 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자로서, 상기 핵산-지질 입자는,
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 10 mol%를 구성하는 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP); 및
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 18 mol%를 구성하는 이온화 가능한 지질을 포함하는, 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자.
  28. 제27항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질은 1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-히드록시도데실)아미노)에틸)(2-히드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스(도데칸-2-올)(C12-200)인, 핵산-지질 입자.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 24 mol%의 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체를 포함하고, 선택적으로, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 46 mol%의, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질을 추가로 포함하고, 선택적으로, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)이고, 선택적으로, 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 접합체를 추가로 포함하고, 선택적으로, 상기 PEG-지질 접합체는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 2.0 mol%를 구성하고, 선택적으로, 상기 PEG-지질 접합체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2k)인, 핵산-지질 입자.
  30. 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자로서, 상기 핵산-지질 입자는,
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 50 mol%를 구성하는 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP);
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 18 mol%를 구성하는 이온화 가능한 지질; 및
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 7.0 mol%로 존재하는, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질을 포함하는, 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자.
  31. 제30항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질은 1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-히드록시도데실)아미노)에틸)(2-히드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스(도데칸-2-올)(C12-200)인, 핵산-지질 입자.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 24 mol%의 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체를 포함하고, 선택적으로, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)이고, 선택적으로, 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 접합체를 추가로 포함하고, 선택적으로, 상기 PEG-지질 접합체는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 1.0 mol%를 구성하고, 선택적으로, 상기 PEG-지질 접합체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2k)인, 핵산-지질 입자.
  33. 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자로서, 상기 핵산-지질 입자는,
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 50 mol%를 구성하는 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP);
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 18 mol%를 구성하는 이온화 가능한 지질; 및
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 7.5 mol%의, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질을 포함하는, 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자.
  34. 제33항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질은 1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-히드록시도데실)아미노)에틸)(2-히드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스(도데칸-2-올)(C12-200)인, 핵산-지질 입자.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 24 mol%의 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체를 추가로 포함하고, 선택적으로, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)이고, 선택적으로, 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 접합체를 추가로 포함하고, 선택적으로, 상기 PEG-지질 접합체는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 0.5 mol%를 구성하고, 선택적으로, 상기 PEG-지질 접합체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2k)인, 핵산-지질 입자.
  36. 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자로서, 상기 핵산-지질 입자는,
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 50 mol%를 구성하는 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP);
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 18 mol%를 구성하는 이온화 가능한 지질; 및
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 8.0 mol%의, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질을 포함하는, 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자.
  37. 제36항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질은 1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-히드록시도데실)아미노)에틸)(2-히드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스(도데칸-2-올)(C12-200)인, 핵산-지질 입자.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 24 mol%의 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체를 포함하고, 선택적으로, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)이고, 선택적으로, 상기 핵산-지질 입자는 PEG-지질 접합체를 포함하지 않고, 선택적으로, 상기 핵산-지질 입자는 PEG를 포함하지 않는, 핵산-지질 입자.
  39. 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자로서, 상기 핵산-지질 입자는,
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 40 mol%를 구성하는 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP);
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 18 mol%를 구성하는 이온화 가능한 지질; 및
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 34 mol%의 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체를 포함하는, 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자.
  40. 제39항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질은 1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-히드록시도데실)아미노)에틸)(2-히드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스(도데칸-2-올)(C12-200)인, 핵산-지질 입자.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 6.0 mol%의, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질을 추가로 포함하고, 선택적으로, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)이고, 선택적으로, 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 접합체를 추가로 포함하고, 선택적으로, 상기 PEG-지질 접합체는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 2.0 mol%를 구성하고, 선택적으로, 상기 PEG-지질 접합체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2k)인, 핵산-지질 입자.
  42. 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자로서, 상기 핵산-지질 입자는,
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 30 mol%를 구성하는 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP);
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 18 mol%를 구성하는 이온화 가능한 지질; 및
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 44 mol%의 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체를 포함하는, 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자.
  43. 제42항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질은 1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-히드록시도데실)아미노)에틸)(2-히드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스(도데칸-2-올)(C12-200)인, 핵산-지질 입자.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 6.0 mol%의, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질을 추가로 포함하고, 선택적으로, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)이고, 선택적으로, 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 접합체를 추가로 포함하고, 선택적으로, 상기 PEG-지질 접합체는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 2.0 mol%를 구성하고, 선택적으로, 상기 PEG-지질 접합체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2k)인, 핵산-지질 입자.
  45. 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자로서, 상기 핵산-지질 입자는,
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 20 mol%를 구성하는 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP); 및
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 18 mol%를 구성하는 이온화 가능한 지질; 및
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 54 mol%의 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체를 포함하는, 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자.
  46. 제45항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질은 1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-히드록시도데실)아미노)에틸)(2-히드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스(도데칸-2-올)(C12-200)인, 핵산-지질 입자.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 6.0 mol%의, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질을 추가로 포함하고, 선택적으로, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)이고, 선택적으로, 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 접합체를 추가로 포함하고, 선택적으로, 상기 PEG-지질 접합체는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 2.0 mol%를 구성하고, 선택적으로, 상기 PEG-지질 접합체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2k)인, 핵산-지질 입자.
  48. 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자로서, 상기 핵산-지질 입자는,
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 10 mol%를 구성하는 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP); 및
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 18 mol%를 구성하는 이온화 가능한 지질; 및
    상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 64 mol%의 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체를 포함하는, 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하기 위한 핵산-지질 입자.
  49. 제48항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질은 1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-히드록시도데실)아미노)에틸)(2-히드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스(도데칸-2-올)(C12-200)인, 핵산-지질 입자.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서, 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 6.0 mol%의, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질을 추가로 포함하고, 선택적으로, 콜레스테롤, β-시토스테롤 또는 이의 유도체 이외의 하나 이상의 비양이온성 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)이고, 선택적으로, 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질 접합체를 추가로 포함하고, 선택적으로, 상기 PEG-지질 접합체는 상기 핵산-지질 입자에 존재하는 총 지질의 약 2.0 mol%를 구성하고, 선택적으로, 상기 PEG-지질 접합체는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2k)인, 핵산-지질 입자.
  51. 약학적 조성물로서, 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 핵산-지질 입자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 비경구 투여용으로, 선택적으로, 정맥내 주사용으로 제형화되는 약학적 조성물.
  53. 제51항에 있어서, 간 조직으로의 직접 주사용으로 제형화되는 약학적 조성물.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 간 질환 또는 장애를 치료하기 위해 투여되고, 선택적으로, 상기 질환 또는 장애는 담도 폐쇄증, 알라질 증후군(Alagille syndrome), 알파-1 항트립신 결핍증, 티로신혈증, 신생아 간염, C형 간염 바이러스 감염, B형 간염 바이러스 감염, A형 간염 바이러스 감염, 간 세포 암종 및 윌슨병(Wilson's disease)으로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산-지질 입자 또는 약학적 조성물.
  55. 주사물로서, 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항의 핵산-지질 입자, 약학적 조성물 또는 PEG 무함유 지질-핵산 입자를 포함하는 주사물.
  56. 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하는 방법으로서, 상기 대상체에게 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 핵산-지질 입자, 약학적 조성물 또는 주사물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 간 조직에 핵산 운반물을 전달하는 방법.
  57. 대상체에서 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 대상체에게 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 핵산-지질 입자, 약학적 조성물 또는 주사물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 핵산-지질 입자, 약학적 조성물 또는 주사물은 정맥내로 투여되고, 상기 대상체의 간 조직의 세포에서의 상기 핵산 운반물의 발현은 상기 대상체의 폐, 심장 및 비장의 세포에서의 상기 핵산 운반물의 발현보다 적어도 2배 더 높은 수준으로 발생하고, 선택적으로, 상기 대상체의 간 조직의 세포에서의 상기 핵산 운반물의 발현은 상기 대상체의 폐, 심장 및 비장의 세포에서의 상기 핵산 운반물의 발현보다 적어도 3배 더 높고, 선택적으로, 적어도 4배 더 높고, 선택적으로, 적어도 5배 더 높고, 선택적으로, 적어도 6배 더 높고, 선택적으로, 적어도 7배 더 높고, 선택적으로, 적어도 8배 더 높고, 선택적으로, 적어도 9배 더 높고, 선택적으로, 적어도 10배 더 높고, 선택적으로, 적어도 11배 더 높고, 선택적으로, 적어도 12배 더 높고, 선택적으로, 적어도 13배 더 높고, 선택적으로, 적어도 14배 더 높고, 선택적으로, 적어도 15배 더 높고, 선택적으로, 적어도 20배 더 높은, 방법.
  59. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산-지질 입자, 약학적 조성물, 또는 주사물은 정맥내로 투여되고, 상기 핵산-지질 입자는 폐, 심장, 비장, 난소 및 췌장으로 구성된 군으로부터 선택된 상기 대상체의 하나 이상의 다른 조직에서의 상기 핵산-지질 입자의 농도보다 적어도 2배 더 높은 농도로 상기 대상체의 간 조직에 국소화되고, 선택적으로, 폐, 심장, 비장, 난소 및 췌장으로 구성된 군으로부터 선택된 상기 대상체의 하나 이상의 다른 조직과 비교하여 적어도 3배, 선택적으로, 적어도 4배, 선택적으로, 적어도 5배, 선택적으로, 적어도 6배 더 높은 농도의 상기 핵산-지질 입자가 간에 존재하는, 방법.
  60. 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는,
    간 질환 또는 장애 - 여기서, 선택적으로, 상기 간 질환 또는 장애는 담도 폐쇄증, 알라질 증후군, 알파-1 항트립신 결핍증, 티로신혈증, 신생아 간염, C형 간염 바이러스 감염, B형 간염 바이러스 감염, A형 간염 바이러스 감염, 간 세포 암종 및 윌슨병으로 구성된 군으로부터 선택됨 -;
    관절 질환 또는 장애 - 여기서, 선택적으로, 상기 관절 질환 또는 장애는 류마티스 관절염, 건선 관절염, 통풍, 건염, 활액낭염, 수근관 증후군 및 골관절염으로 구성된 군으로부터 선택됨 -;
    염증성 질환 또는 장애 - 여기서, 선택적으로, 상기 염증성 질환 또는 장애는 염증성 장 질환, 복막염, 골수염, 악액질, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 알레르기성 비염, 낭포성 섬유증, 급성 기관지염, 급성 중증 기관지염, 골관절염, 류마티스 관절염, 감염성 관절염, 감염 후 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 관절염, 골관절염, 통풍, 척추관절병, 강직성 척추염, 혈관염 증후군과 관련된 관절염, 신경성 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스 용종증 근육통, 관절염 세포 동맥염, 칼슘 다낭성 관절병증, 가성 통풍, 비-관절염 류머티즘, 활액낭염, 건초열, 화농성 염증(예를 들어, 테니스 엘보), 신경병성 관절 질환, 출혈성 관절증, 헤노흐-쇤라인 자색반(Henoch-Schlein purpura), 비대성 골관절염, 다형 치질, 척추 측만증, 혈색소증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, COPD, 급성 호흡곤란 증후군, 급성 폐 손상, 기관지폐 이형성증 및 전신 홍반성 루푸스(SLE)로 구성된 군으로부터 선택됨 -; 및
    표피 질환 또는 장애 - 여기서, 선택적으로, 상기 표피 질환 또는 장애는 건선, 아토피성 피부염, 경피증, 습진, 장미증, 지루성 피부염, 흑색종, 일광 각화증, 어린선, 그로버병(Grover's disease), 일반 사마귀, 각화극세포종 및 지루성 각화증으로 구성된 군으로부터 선택됨 -로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  61. 제56항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산-지질 입자, 약학적 조성물 또는 주사물은 비경구적으로 투여되고, 선택적으로, 상기 핵산-지질 입자, 약학적 조성물 또는 주사물은 흡입, 국소 도포 및 주사로 구성되는 군으로부터 선택된 경로를 통해 투여되고, 선택적으로, 상기 주사는 정맥내 주사, 기관내 주사, 관절내 주사, 피하 주사, 피내 주사 및 근육내 주사로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  62. 제56항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 운반물은 합성 또는 자연 발생 RNA 또는 DNA, 또는 이의 유도체를 포함하고, 선택적으로, 상기 핵산 운반물은 변형된 RNA이고, 선택적으로, 상기 변형된 RNA는 변형된 mRNA, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 변형된 siRNA로 구성된 군으로부터 선택되고, 선택적으로, 상기 변형된 mRNA는 핵산 조정 조절인자를 인코딩하는, 방법.
  63. 제56항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 운반물이 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 5'-포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오티드, 콜레스테릴 유도체에 연결된 말단 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드, 5'-메톡시-변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 5'-메톡시유리딘), 2'-데옥시-변형된 뉴클레오티드, 잠긴 뉴클레오티드, 무염기 뉴클레오티드, 2'-아미노-변형된 뉴클레오티드, 2'-알킬-변형된 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포라미데이트, 뉴클레오티드를 포함하는 비천연 염기; 뉴클레오시드간 연결 또는 골격, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트, 예를 들어 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포라미데이트, 예를 들어, 3'-아미노 포스포라미데이트 및 아미노알킬포스포라미데이트, 티오노포스포라미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르 및 정상적인 3′-5′ 연결을 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2′-5′ 연결된 유사체 및 뉴클레오시드 단위의 인접 쌍이 3'-5'에서 5'-3' 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결된 반전된 극성을 갖는 것들로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형물을 포함하는, 방법.
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