ES2832330T3 - Vector para administración pulmonar, agente inductor y usos - Google Patents

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Hideyoshi Harashima
Hidetaka Akita
Hiroto Hatakeyama
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Abstract

Una composición que comprende un péptido GALA representado por el SEQ ID NO: 1 y una sustancia prevista para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad pulmonar, en donde el péptido GALA se usa como un elemento migratorio pulmonar de un vector para administrar dicha sustancia a un pulmón.

Description

DESCRIPCIÓN
Vector para administración pulmonar, agente inductor y usos
Campo técnico
La presente invención se refiere a un agente de introducción y a un vector para administración pulmonar y a usos de los mismos.
Antecedentes de la técnica
En los últimos años, se lleva a cabo activamente el desarrollo de un liposoma que tiene una molécula funcional introducida en la superficie externa de la membrana liposómica para usarla como vector para administrar, en un sitio diana, una sustancia prevista, tal como medicamentos de bajo peso molecular, medicamentos de ácido nucleico, fármacos de anticuerpos, péptidos, proteínas, azúcares, etc. En el campo de la biomedicina, la investigación sobre medicamentos de ácido nucleico se lleva a cabo activamente como una biomedicina de última generación que sigue los pasos de los fármacos de anticuerpos y los medicamentos de proteínas. Los ejemplos de medicamentos de ácido nucleico incluyen oligonucleótidos antisentido, ribozimas, aptámeros, oligonucleótidos señuelo y ARNip. Aunque la aplicación clínica de los medicamentos de ácido nucleico se encuentra todavía en su fase inicial, el ARNip ha atraído la atención en particular, y compañías y empresas farmacéuticas de países occidentales han realizado pruebas clínicas del mismo. Sin embargo, la mayoría de estas pruebas clínicas se limitan a la administración local. Aunque las pruebas clínicas se realizan para la administración sistémica usando un sistema de administración, se han limitado a algunos órganos que se espera que muestren una acumulación pasiva, tales como el hígado. Por tanto, para expandir el rango de aplicación de un medicamento de ácido nucleico representado por ARNip, existe una demanda para establecer un sistema de administración capaz de ser dirigido de forma activa.
Los ejemplos de dicho sistema de administración que se ha desarrollado incluyen un liposoma que tiene un polímero hidrófilo (por ejemplo, polialquilenglicoles tales como polietilenglicol) introducido en la superficie externa de la membrana liposómica (véase Bibliografía de patentes 1 y Bibliografía de patentes 2). Con este liposoma, se puede mejorar el tropismo del liposoma contra las células tumorales como resultado de la mejora de la capacidad de retención en sangre del liposoma. Adicionalmente, se ha propuesto un nanodispositivo multifuncional de tipo envolvente (MEND) (en lo sucesivo, se puede abreviar como "MEND"), y este dispositivo se puede usar como un sistema de administración de fármacos para administrar selectivamente un gen o un péptido en células específicas.
Chang et al. identificaron un péptido dirigido a NSCLC que mejora la eficacia terapéutica de los fármacos anticancerosos liposómicos en modelos en ratones de cáncer de pulmón humano (véase Bibliografía no de patentes 1).
Además, se ha desarrollado un liposoma obtenido mediante la introducción de GALA en la superficie externa de la membrana liposómica usando colesterol unido a GALA (véase Bibliografía no de patentes 2). Cuando un liposoma sufre endocitosis, el liposoma queda incluido dentro de un endosoma y el liposoma dentro del endosoma se degrada cuando el endosoma se fusiona con un lisosoma. Sin embargo, con el liposoma descrito anteriormente, una sustancia encapsulada en el liposoma puede escapar del endosoma y puede liberarse en el citoplasma.
GALA es un oligopéptido formado a partir de 30 residuos de aminoácidos de básicamente una secuencia repetitiva de ácido glutámico, alanina, leucina y alanina (EALA). GALA fue sintetizado por un grupo de investigación de Szoka et al. (véase Bibliografía no de patentes 3), y hasta ahora se han realizado diversos estudios al respecto. Se sabe que aunque GALA adopta una estructura de espiral aleatoria debido a la repulsión eléctrica por el ácido glutámico en una condición de pH neutro, GALA adopta una estructura de hélice alfa que tiene una alta afinidad con la membrana lipídica mediante la resolución de la repulsión eléctrica en una condición ácida (véase Bibliografía no de patentes 2).
Adicionalmente, GALA se ha usado como un elemento de promoción del escape del endosoma, sensible al pH para mejorar la actividad MEND, ya que, cuando la superficie de MEND se modifica con un GALA unido a colesterol (Chol) (Chol-GALA), una membrana endosómica y una membrana lipídica con MEND experimentan fusión de membranas en condiciones ácidas dentro del endosoma, lo que da como resultado la liberación de una sustancia encapsulada al citoplasma (véase Bibliografía de patentes 3).
Como se ha descrito anteriormente, aunque GALA se ha usado como un elemento funcional con el fin de mejorar la cinética intracelular, no es conocido como un elemento migratorio pulmonar.
Adicionalmente, aunque se menciona el pulmón como órgano diana de cierto tipo de liposoma modificado con un péptido soluble en endosoma (véase Bibliografía de patentes 4), la configuración del péptido descrito en ese documento es muy diferente de la configuración del péptido GALA de acuerdo con la presente solicitud formado básicamente a partir de una secuencia repetitiva de ácido glutámico, alanina, leucina y alanina (EALA). Además, no hay ninguna descripción o sugerencia con respecto a un liposoma modificado con el péptido que migra específicamente al pulmón.
Lista de citas
Bibliografía de patentes
PTL 1: JP1-249717A
PTL 2: JP2004-10481A
PTL 3: JP2006-28030A
PTL 4: JP10-506001A
Bibliografía no de patentes
NPL 1: D.-K. Chang et al., PLoS ONE, 2009; 4(1): e4171
NPL 2: T. Kakudo et al., Biochemistry, 2004; 43: 5618-5623
NPL 3: N.K. Subbarao et al., Biochemistry, 1987; 26: 2964-2972
Sumario de la invención
Problema técnico
Un objetivo de la presente invención es proporcionar una tecnología para administrar específicamente una sustancia prevista al pulmón.
También es un objetivo de la presente invención proporcionar un vector que tenga una estabilidad en almacenamiento excelente y/o no se agregue o en su mayoría no se agregue después de haber sido almacenado durante un cierto período de tiempo.
Solución del problema
Los inventores de la presente invención han realizado una investigación para un vehículo que tenga la función de hacer que una sustancia prevista, tal como un medicamento, migre al pulmón con alta eficacia. Como resultado, descubrieron que un péptido GALA muestra una alta migrabilidad pulmonar y perfeccionaron la presente invención. Además, también descubrieron que la migrabilidad específica del pulmón no desaparece incluso cuando un vector (por ejemplo, liposoma modificado con un péptido GALA-lípido) que incluye el péptido GALA se modifica con PEG y perfeccionaron la presente invención.
Adicionalmente, descubrieron que la adición de un lípido auxiliar al liposoma modificado con un péptido GALA o un péptido GALA-lípido permite que el liposoma tenga propiedades físicas de excelente estabilidad en almacenamiento y/o no agregación o en su mayoría no agregación después de haber sido almacenado durante un cierto período de tiempo; y perfeccionaron la presente invención. Por tanto, la presente invención proporciona el siguiente uso de composición, agente de introducción de sustancias y vector.
1. Una composición que comprende un péptido GALA representado por el SEQ ID NO: 1 y una sustancia prevista para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad pulmonar, en donde el péptido GALA se usa como un elemento migratorio pulmonar de un vector para administrar dicha sustancia a un pulmón.
2. La composición para su uso de acuerdo con el punto 1, en donde el péptido GALA está unido a un componente del vector.
3. La composición para su uso de acuerdo con el punto 1 o 2, en donde el vector incluye un lípido y/o colesterol, y el péptido GALA está unido a un lípido catiónico y/o colesterol.
4. La composición para su uso de acuerdo con el punto 1 o 2, en donde el vector incluye un lípido catiónico y/o colesterol, y el péptido GALA está unido a un lípido catiónico y/o colesterol.
5. Un agente de introducción de sustancias cuya diana es un pulmón, teniendo el agente una sustancia prevista encapsulada en un vector e incluyendo vector un péptido GALA representado por el SEQ ID NO: 1, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad pulmonar.
6. El agente de introducción de sustancias para su uso de acuerdo con el punto 5, en donde el péptido GALA está unido a un componente del vector.
7. El agente de introducción de sustancias para su uso de acuerdo con el punto 5 o 6, en donde el vector incluye un lípido y/o colesterol, y el péptido GALA está unido a un lípido catiónico y/o colesterol.
8. Un vector y una sustancia prevista para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad pulmonar, comprendiendo el vector un péptido GALA representado por el SEQ ID NO: 1 como un elemento para administrar selectivamente la sustancia prevista a un pulmón.
9. El vector para su uso de acuerdo con el punto 8, en donde el vector incluye un lípido y/o colesterol, y el péptido GALA está unido a un lípido catiónico y/o colesterol.
10. El vector para su uso de acuerdo con el punto 8 o 9, en donde el vector incluye un lípido catiónico y el lípido catiónico incluye al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en DOTMA, DSTAP y DODAP.
11. El vector para su uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 8 a 10, en donde el vector está modificado con un polímero hidrófilo seleccionado del grupo que consiste en polialquilenglicol, dextrano, pululano, ficoll, alcohol polivinílico, copolímero alterno de estireno - anhídrido maleico, copolímero alterno de éter divinílico -anhídrido maleico, amilosa, amilopectina, quitosano, manano, ciclodextrina, pectina y carragenina.
12. El vector para su uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 8 a 11, que comprende además un lípido auxiliar, y el lípido auxiliar es EPC, DOPC, DOPE o SOPE.
13. El vector para su uso de acuerdo con el punto 8, en donde:
el vector es un liposoma que incluye, como componente de la membrana lipídica, DOTMA, Chol y EPC; una composición lipídica (relación molar) del liposoma con respecto a DOTMA/Chol/EPC es de 10 a 50/20 con respecto a de 50/20 a 70; y el liposoma incluye además STR-PEG2000 en del 1 al 15 % en moles y Chol-GALA en del 0,1 al 5 % en moles con respecto a la cantidad total de lípidos de DOTMA/Chol/EPC.
14. Un vector para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad pulmonar, comprendiendo el método administrar a un mamífero dicho vector, en donde el vector tiene encapsulada en su interior la sustancia prevista y tiene, unido a la misma, un péptido GALA representado por el SEQ ID NO: 1.
15. Uso de un péptido GALA representado por el SEQ ID NO: 1 como un elemento migratorio pulmonar de un vector para administrar una sustancia prevista a células pulmonares o a un pulmón, en donde dicho uso no está en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia.
Efectos ventajosos de la invención
Con la presente invención, se proporciona un vector o un agente de introducción de sustancias, particularmente un liposoma, para administrar específicamente una sustancia prevista a un pulmón. Adicionalmente, el vector o el agente de introducción de sustancias, particularmente el liposoma, de la presente invención pueden migrar al pulmón y también suprimir la migración del mismo al hígado, que es el principal órgano de acumulación. Adicionalmente, el vector o el agente de introducción de sustancias, particularmente el liposoma, de la presente invención ha mostrado un efecto de atenuación que supera el de los vehículos de administración de ARNip existentes particularmente en el pulmón, y ha demostrado tener un efecto de introducción extremadamente superior para una sustancia prevista.
Dado que el vector y el agente de introducción de sustancias que incluye el péptido GALA usado en la presente invención no tienen el problema de agregación, no bloquearán los vasos sanguíneos.
Breve descripción de los dibujos
[Figura 1-A] La figura 1-A muestra un resultado de evaluación de la migración pulmonar de un liposoma modificado con GALA a lo largo del tiempo.
[Figura 1-B] La figura 1-B es un gráfico en el que el eje vertical de la figura 1-A está ampliado a escala.
[Figura 2] La figura 2 muestra un resultado de evaluación de la migración hepática de un liposoma modificado con GALA a lo largo del tiempo.
[Figura 3] La figura 3 muestra el resultado de mezclar sangre y un MEND modificado con GALA a diversas relaciones para evaluar su interacción con los componentes de hemocitos.
[Figura 4] La figura 4 muestra el resultado de la administración intravenosa en la vena de la cola de un MEND modificado con GALA en el que el ARNip se marcó con [32P] y la membrana lipídica se marcó con [3H], y la medición de [32P] y [3H] en el pulmón 1 hora después de la administración para evaluar la migración del Me n D modificado con GALA al pulmón.
[Figura 5] La figura 5 muestra el resultado de la administración intravenosa en la vena de la cola de un MEND modificado con GALA que encapsula ARNip marcado fluorescente, y la evaluación de la localización del MEND modificado con GALA en el pulmón 1 hora después de la administración usando un microscopio de barrido láser confocal.
[Figura 6] La figura 6 muestra el resultado de la administración intravenosa en la vena de la cola de un MEND modificado con GALA y un MEND sin modificar con GALA, y la evaluación de los efectos de atenuación respectivos del MEND modificado con GALA y el MEND sin modificar con GALA en el pulmón 24 horas después de la administración, usando qRT-PCR.
[Figura 7] La figura 7 muestra el resultado de la administración intravenosa en la vena de la cola de un MEND modificado con GALA y la evaluación del efecto de atenuación del MEND modificado con GALA en el pulmón 24 horas después de la administración, usando qRT-PCR.
[Figura 8] La figura 8 muestra el resultado de la administración intravenosa en la vena de la cola de un MEND modificado con GALA, y la evaluación del efecto de atenuación del MEND modificado con GALA en el hígado 24 horas después de la administración usando qRT-PCR.
[Figura 9] La figura 9 muestra el resultado de la administración intravenosa en la vena de la cola de un MEND modificado con GALA, y la evaluación del efecto de atenuación del MEND modificado con GALA en el bazo 24 horas después de la administración usando qRT-PCR. [Figura 10] La figura 10 muestra el efecto de atenuación de MEND cuando se usan DOTMA, DSTAP y DODAP como lípido catiónico.
[Figura 11] La figura 11 muestra los efectos de atenuación de los respectivos MEND cuando se usan EPC, DOPE y SOPE como lípido auxiliar.
[Figura 12] La figura 12 muestra un cambio de peso cuando se administra de forma continua un MEND modificado con GALA durante 4 días.
[Figura 13] La figura 13 muestra un resultado de medición de AST y ALT cuando se administra de forma continua MEND durante 4 días.
[Figura 14] La figura 14 muestra el resultado de una evaluación farmacocinética de un MEND modificado con PEG.
[Figura 15] La figura 15 muestra el efecto de atenuación de un MEND modificado con PEG.
[Figura 16] La figura 16 muestra el efecto de atenuación de un artículo MEND almacenado.
[Figura 17] La figura 17 muestra el resultado de la estabilidad en almacenamiento de un MEND modificado con GALA después de haber sido almacenado durante 1 mes a temperatura ambiente.
[Figura 18] La figura 18 muestra el resultado de la administración intravenosa en la vena de la cola de MEND con diferentes niveles de modificación con GALA, y la evaluación del efecto de atenuación de los MEND modificados con GALA en el pulmón 24 horas después de la administración, usando qRT-PCR.
[Figura 19] La figura 19 muestra el efecto de supresión de metástasis pulmonar de administrar un MEND modificado con GALA en un modelo de metástasis pulmonar.
[Figura 20] La figura 20 muestra el efecto de atenuación de la administración de un MEND modificado con GALA en un modelo de metástasis pulmonar.
Descripción de las realizaciones
Los detalles de la presente invención se describirán a continuación.
Un vector de la presente invención puede lograr una migración selectiva al pulmón al incluir un péptido GALA.
Un "péptido GALA representado por el SEQ ID NO: 1" es un péptido de 30 aminoácidos que se describe a continuación. Ala Ala Leu Ala Glu Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu His Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ala Glu Trp (SEQ ID NO: 1)
El péptido representado por el SEQ ID NO: 1 tiene, en su secuencia, 4 unidades de una estructura parcial de ácido glutámico (E) - alanina (A) - leucina (L) - alanina (A). También se divulga un péptido representado por el SEQ ID NO: 1 que puede tener deleción, sustitución o adición de aminoácidos en las partes distintas de la estructura parcial, mientras se mantienen preferentemente 3 unidades o 4 unidades, más preferentemente 4 unidades, de la estructura parcial.
Con respecto al número y posición de la deleción, sustitución o adición de aminoácidos realizada a la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 1; el número de aminoácidos es uno o más, preferentemente 1 o varios. Los intervalos específicos de los mismos incluyen: para una deleción, normalmente de 1 a 4, preferentemente de 1 a 3, incluso más preferentemente de 1 o 2; para una sustitución, normalmente de 1 a 6, preferentemente de 1 a 4, incluso más preferentemente de 1 o 2; y para una adición, normalmente de 1 a 12, preferentemente de 1 a 6, incluso más preferentemente de 1 a 4. La sustitución de aminoácidos es, preferentemente, una sustitución dentro de aminoácidos análogos, tales como aminoácidos hidrófobos (Leu, Val, Ile, Ala), aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp), aminoácidos básicos (Arg, Lys, His), aminoácidos ácidos (Glu, Asp), aminoácidos neutros (Gly, Ser, Thr, Cys, Met, Gln, Asn, Pro). Cabe señalar que, en la presente memoria descriptiva, un péptido GALA a veces se denomina simplemente "GALA".
Preferentemente, se forma un enlace entre el péptido GALA y un componente que forma el vector. Los ejemplos de los componentes que forman el vector incluyen lípidos, proteínas o péptidos, cadenas de azúcar, polímeros solubles en agua o miscibles en agua (neutros, catiónicos o aniónicos), tensioactivos. Aunque los ejemplos del enlace incluyen cualquier enlace tal como enlace covalente, enlace iónico, enlace de hidrógeno y enlace coordinado; Es preferible el enlace covalente o el enlace coordinado y el enlace covalente es más preferible.
El péptido GALA se incluye en un vehículo (vector) capaz de introducir una sustancia en una célula. Los ejemplos del vehículo (vector) capaz de introducir una sustancia en una célula incluyen reactivos de transfección basados en lípidos, partículas derivadas de virus, liposomas, poliplexos, micelas; y están modificados o unidos a un liposoma en una realización preferible. Cuando el vector es un liposoma, el péptido GALA puede unirse a cualquiera de los componentes del liposoma, tales como un fosfolípido, colesterol, un lípido (preferentemente un lípido catiónico) y un lípido auxiliar. El péptido GALA de SEQ ID NO: 1 unido al colesterol (colesteril-OH) tiene, por ejemplo, la siguiente estructura (en lo sucesivo, abreviada a veces como "Chol-GALA"): (colesteril)-O(C=O)-(WEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAA)-NH2
En la descripción anterior, "-O(C=O)-" está unido al grupo amino en el extremo N del péptido GALA, y "-NH2" significa que el grupo carboxilo en el extremo C del péptido GALA está protegido con un grupo amino. El enlace formado entre el colesterol y el péptido GALA puede ser un enlace uretano como se mostró anteriormente, o puede ser un enlace éster o un enlace éter. El grupo colesterilo puede unirse al péptido GALA en el extremo N o en el extremo C, o puede unirse a una cadena lateral de cualquier aminoácido del péptido GALA. Adicionalmente, el grupo colesterilo puede unirse al péptido GALA a través de cualquier enlazador, tal como un alquileno, un péptido o un poliéter. Adicionalmente, aunque el extremo C es una amida en la descripción anterior, el extremo C puede ser otros grupos tales como ácido carboxílico (COOH), éster o una sal de ácido carboxílico.
Cuando el péptido GALA se une a un componente lipídico tal como colesterol y fosfolípido, y se incluye en un vector o un agente de introducción de sustancias; la cantidad del péptido GALA incluido con respecto a la cantidad total de lípidos es de aproximadamente el 0,1 al 5 % en moles, preferentemente del 0,3 al 4 % en moles, más preferentemente del 0,5 al 4 % en moles, incluso más preferentemente del 1 al 4 % en moles, de forma particularmente preferente del 1,5 al 2 % en moles. Cabe señalar que, la "cantidad total de lípidos" descrita en la presente memoria descriptiva no incluye la cantidad de componentes lipídicos unidos a un componente de modificación de un liposoma. Es decir, no se incluye la cantidad de un componente lipídico unido al péptido GALA. De manera similar, cuando el vector se modifica con PEG, no se incluye la cantidad de componente lipídico unido a PEG.
Por ejemplo, cuando los componentes lipídicos (cantidad total de lípidos) no unidos al péptido GALA son 100 moles y los componentes lipídicos unidos al péptido Ga La son 5 moles, un nivel de modificación con GALA (una relación de lípidos unidos al péptido GALA con respecto a la cantidad total de lípidos) es del 5 % en moles.
Cuando el vector se forma a partir de componentes distintos de los lípidos, la cantidad del péptido GALA con respecto al peso total del vector es de aproximadamente el 0,01 al 10 % en peso, preferentemente del 0,1 al 5 % en peso, más preferentemente del 0,5 al 4 % en peso, y de forma particularmente preferente del 1 al 2,5 % en peso.
Aunque anteriormente se describió una realización en la que el péptido GALA está unido al colesterol, el péptido GALA puede unirse a componentes del vector distintos del colesterol, y sus modos son obvios para los expertos en la materia.
El potencial zeta del vector y el agente de introducción de sustancias de la presente invención es, a un pH cercano al neutro (por ejemplo, PH 7 o 7,4), de aproximadamente -100 a 100 mV, preferentemente de aproximadamente -50 a 50 mV y más preferentemente de aproximadamente -30 a 30 mV. El potencial zeta se puede medir usando un equipo Zetasizer.
Los diámetros medios de partícula del vector y el agente de introducción de sustancias de la presente divulgación no están particularmente limitados y, por ejemplo, el diámetro de partícula es de 30 a 1000 nm, preferentemente de 50 a 300 nm, más preferentemente de 50 a 200 nm, y de forma particularmente preferente de 50 a 150 nm. El diámetro medio de partícula se puede medir, por ejemplo, mediante el método de dispersión de luz dinámica, el método de dispersión de luz estática, microscopía electrónica, microscopio de fuerza atómica, etc.
El agente de introducción de la presente invención incluye el vector junto con una sustancia prevista que se administrará dentro de una célula. La sustancia prevista puede tener un enlace covalente formado con el vector, puede formar un complejo con el vector y, cuando el vector es una partícula hueca, puede estar encerrada o encapsulada dentro del vector. La sustancia prevista de la presente invención es particularmente una sustancia bioactiva que tiene efecto cuando se introduce en las células pulmonares.
El agente de introducción de sustancias de la presente invención se puede utilizar tanto in vitro como in vivo para administrar la sustancia prevista a las células pulmonares.
El tipo de sustancia prevista incluye: fármacos, ácidos nucleicos, péptidos (hormonas peptídicas, péptidos bioactivos, etc., tales como oxitocina, bradiquinina, factor de liberación de tirotropina y encefalina), proteínas (enzimas, diversas citocinas tales como interleucina, factor de transferencia celular, factor de crecimiento celular, etc.), azúcares o complejos de estos. El tipo de sustancia prevista puede seleccionarse de manera apropiada dependiendo del propósito del tratamiento, el diagnóstico, el tipo de enfermedad pulmonar, etc. Cabe señalar que "ácido nucleico" incluye, además de ADN o ARN, un análogo o un derivado de los mismos (por ejemplo, ARNip, ácido peptidonucleico (APN), ADN fosforotioato). Adicionalmente, el ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario, y puede ser lineal o circular.
Cuando la sustancia prevista es un fármaco, sus ejemplos incluyen agentes anticancerosos, fármacos vasodilatadores, agentes terapéuticos para vasculitis pulmonar, agentes antibacterianos, agentes antivirus, agentes antiinflamatorios, broncodilatadores, agentes antitusivos, inhibidores de la fibrosis pulmonar, fármacos antituberculosos. Los ejemplos específicos de agentes anticancerosos incluyen doxorrubicina, daunorrubicina, cisplatino, oxaliplatino, carboplatino, paclitaxel, irinotecán, SN-38, actinomicina D, vincristina, vinblastina, metotrexato, azatioprina, fluorouracilo, mitomicina C, docetaxel, ciclofosfamida, capecitabina, epirrubicina, gemcitabina, mitoxantrona, leucovorina, vinorelbina, trastuzumab, etopósido, estramustina, prednisona, Interferón alfa, interleucina-2, bleomicina, ifosfamida, mesna, altretamina, topotecán, citarabina, metilprednisolona, dexametasona, mercaptopurina, tioguanina, fludarabina, gemtuzumab, idarrubicina, mitoxantrona, tretinoína, alemtuzumab, clorambucilo, cladribina, imatinib, epirrubicina, dacarbazina, procarbazina, mecloretamina, rituximab, denileucina diftitox, trimetoprim/sulfametoxazol, alopurinol, carmustina, tamoxifeno, filgrastim, temozolomida, melfalán, vinorelbina, azacitidina, talidomida, mitomicina. Los ejemplos específicos de fármacos vasodilatadores incluyen bosentán, ambrisentán, beraprost sódico, sildenafilo, epoprostenol. Los ejemplos específicos de agentes terapéuticos para vasculitis pulmonar incluyen esteroide cortical suprarrenal, ciclofosfamida, azatioprina, metotrexato, aspirina. Los ejemplos específicos de agentes antibacterianos incluyen anfotericina B y similares. Los ejemplos específicos de agentes antivirus incluyen vidarabina, aciclovir, trifluorotimidina. Los ejemplos específicos de agentes antiinflamatorios incluyen fenilbutazona, acetaminofeno, ibuprofeno, indometacina, sulindaco, piroxicam, diclofenaco, prednisona, beclometasona, dexametasona.
Cuando la sustancia prevista es un ácido nucleico, los ejemplos preferibles de la misma incluyen un ARN bicatenario (ARNbc) seleccionado del grupo que consiste en ARN merodúplex (ARNmd), ARNbc mellado (ARNbcm), ARNbc incompleto (ARNbci), ácido nucleico interferente pequeño (ANip), ARNip, microARN (miARN), ARN en horquilla corta (ARNhc), oligonucleótido interferente corto, oligonucleótido interferente corto sustituido, oligonucleótido interferente corto modificado, ARNbc químicamente modificado y RNA de silenciamiento de genes postranscripcional (ARNsgpt). La sustancia prevista puede usarse sola, o puede usarse una mezcla de dos o más tipos de la sustancia prevista. Por ejemplo, es posible utilizar una combinación de dos o más tipos de ARNip. Cuando el agente de introducción de sustancias incluye un ácido nucleico tal como ARNip como sustancia prevista, preferentemente también se incluye conjuntamente un catión tal como polietilenimina (PEI).
En un aspecto con una sustitución y modificación (incluyendo modificación química), el ARN bicatenario puede incluir un saliente que contiene un desoxirribonucleótido o dos desoxirribonucleótidos (por ejemplo, timidina, adenina), o un saliente de 1 a 4 nucleótidos en uno o ambos de los extremos 3' del ARN bicatenario. El a Rn bicatenario puede incluir un extremo romo en uno o ambos extremos. En algunos de los aspectos, los extremos 5' de las primera y segunda cadenas están fosforilados. En todos los aspectos con un ARN bicatenario, un saliente de nucleótidos en el extremo 3' puede incluir un desoxirribonucleótido o ribonucleótido que tiene una modificación química en la cadena principal, base o azúcar del ácido nucleico. En todos los aspectos con un ARN bicatenario, un saliente de nucleótidos en el extremo 3' puede incluir uno o más ribonucleótidos de base universal. En todos los aspectos con un ARN bicatenario, un saliente de nucleótidos en el extremo 3' puede incluir uno o más nucleótidos acíclicos. En todos los aspectos con un ARN bicatenario, el ARNbc puede incluir además un grupo fosfato terminal tal como 5',3'-difosfato o 5'-fosfato (véase Martinez et al., Cell. 110: 563-574, 2002; y Schwarz et al., Molec. Cell. 10: 537-568, 2002).
El ARN bicatenario puede incluir además una sustitución de 2'-azúcar tal como 2'-desoxi, 2'-O-metilo, 2'-O-metoxietilo, 2'-O-2-metoxietilo, halógeno y 2'-fluoro, 2'-O-alilo o cualquier combinación de los mismos. En aspectos adicionales, el ARN bicatenario puede incluir además un sustituyente de caperuza terminal tal como alquilo, abásico, desoxi abásico, glicerilo, dinucleótido, nucleótido acíclico, resto desoxinucleótido invertido o cualquier combinación de los mismos, en un extremo o en ambos extremos de la primera cadena o uno o más de la segunda cadena.
Adicionalmente, en otros aspectos, el ARN bicatenario puede incluir al menos un enlace internucleotídico modificado tal como enlace fosforotioato, fosforotioato quiral, fosforoditioato, fosfotriéster, aminoalquilfosfotriéster, metilfosfonato, alquilfosfonato, 3'-alquilenfosfonato, 5'-alquilenfosfonato, fosfonato quiral, fosfonoacetato, tiofosfonoacetato, fosfinato, fosforamidato, 3'-aminofosforamidato, aminoalquilfosforamidato, tionofosforamidato, tionoalquilfosfonato, tionoalquilfosfotriéster, selenofosfato o boranofosfato, independientemente o cualquier combinación de los mismos.
El ARN bicatenario puede sustituirse o modificarse (incluyendo modificación química) usando un análogo de ácido nucleico que incluye: 5-metilcitosina; 5-hidroximetilcitosina; xantina; hipoxantina; 2-aminoadenina; 6-metilo; 2-propilo u otros derivados de alquilo tales como adenina y guanina; adenina y guanina 8-sustituidas (8-aza-, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo, etc.); 7-metilo, 7-deaza y 3-deazaadenina y guanina; 2-tiouracilo; 2-tiotimina; 2-tiocitosina; 5-metilo, 5-propinilo, 5-halo (5-bromo, 5-fluoro), 5-trifluorometilo u otro uracilo y citosina 5-sustituidos; y 6-azo uracilo.
El ARN, tal como el ARN bicatenario (ARNbc), puede modificarse químicamente. Los ejemplos no restrictivos de dicha modificación química incluyen la introducción de enlace fosforotioato entre nucleótidos, 2'-desoxirribonucleótido, ribonucleótido de 2'-O-metilo, ribonucleótido de 2'-desoxi-2'-fluoro, nucleótido "acíclico", nucleótido de 5'-C-metilo y glicerilo y/o un residuo desoxi abásico invertido en el extremo. Estas modificaciones químicas pueden mantener la actividad de iARN dentro de una célula.
Siempre que el liposoma sea una vesícula cerrada que tiene una estructura de bicapa lipídica, el liposoma puede ser un liposoma multilaminar (MLV) o un liposoma unilaminar como una SUV (vesícula unilaminar pequeña), una LUV (vesícula unilaminar grande) y una GUV (vesícula unilaminar gigante).
El vector (vehículo) de la presente invención puede modificarse con un polímero hidrófilo.
Los ejemplos de polímero hidrófilo incluyen polialquilenglicoles (polietilenglicol, polipropilenglicol, polibutilenglicol o un copolímero de polialquilenglicoles tal como un copolímero de bloques de polietilenglicol y polipropilenglicol), dextrano, pululano, ficoll, alcohol polivinílico, copolímeros alternos de estireno-anhídrido maleico, copolímeros alternos de éter divinílico-anhídrido maleico, amilosa, amilopectina, quitosano, manano, ciclodextrina, pectina, carragenina y similares. El polímero hidrófilo es, preferentemente, un polialquilenglicol (polietilenglicol, polipropilenglicol, polibutilenglicol, o un copolímero de polialquilenglicoles tal como un copolímero de bloques de polietilenglicol y polipropilenglicol) y es de forma particularmente preferente polietilenglicol (PEG); y el vector (vehículo) se modifica preferentemente con estos polímeros hidrófilos. La longitud del PEG puede seleccionarse apropiadamente de un intervalo de peso molecular de aproximadamente 500 a 10000, y un peso molecular preferible es de 1000 a 5000, y un peso molecular más preferible es 2000. Los ejemplos de lípidos modificados con PEG incluyen DSPE (diestearoilfosfatidiletanolamina)-PEG2000, DMPE (dimiristoilfosfatidiletanolamina)-PEG2000, DSG (diestearoilglicerol)-PEG2000, DMG (dimiristoilglicerol)-PEG2000, PEG2000 colesterilado, STR (estearil)-PEG2000 o ceramida C8-PEG2000, ceramida C16-PEG2000 y similares. Entre estos, es preferible STR-PEG2000 o ceramida C8-PEG2000. El peso molecular de otros polímeros hidrófilos puede seleccionarse apropiadamente de manera similar por los expertos en la materia.
Por ejemplo, cuando un liposoma se va a modificar con PEG, es preferible el uso de PEG estearilado (STR-PEG), ceramida C8-PEG o PEG colesterilado (Chol-PEG) para obtener un vector (por ejemplo, formulación liposómica) que tiene excelente estabilidad en almacenamiento sin perjudicar la migrabilidad pulmonar y la expresión funcional de la sustancia prevista (por ejemplo, medicamento de ácido nucleico tal como ARNip). Adicionalmente, es preferible el uso de DSPE-PEG, DSG-PEG, ceramida C16-PEG o similares para mejorar la estabilidad en sangre.
Cuando el polímero hidrófilo se va a usar para modificar un liposoma, el polímero hidrófilo se usa, preferentemente, para la modificación en una relación de aproximadamente el 1 al 15 % en moles cuando los lípidos que forman el liposoma son el 100 % en moles.
En lo sucesivo, aunque el vector (vehículo) para administrar una sustancia prevista a un pulmón in vitro o in vivo se describirá usando un liposoma como ejemplo, la presente invención no se limita a un liposoma y cualquier vector (vehículo) capaz de introducir el péptido GALA en una célula está incluido en la presente invención.
En el liposoma de la presente divulgación, el tipo de lípido que forma una bicapa lipídica no está particularmente limitado, y los ejemplos específicos de los mismos incluyen: fosfolípidos tales como fosfatidilcolinas (por ejemplo, dioleoil fosfatidilcolina, dilauroil fosfatidilcolina, dimiristoil fosfatidilcolina, dipalmitoil fosfatidilcolina, diestearoil fosfatidilcolina, y similares), fosfatidilgliceroles (por ejemplo, dioleoil fosfatidilglicerol, dilauroil fosfatidilglicerol, dimiristoil fosfatidilglicerol, dipalmitoil fosfatidilglicerol y diestearoil fosfatidilglicerol), fosfatidiletanolaminas (por ejemplo, dioleoil fosfatidiletanolamina, dilauroil fosfatidiletanolamina, dimiristoil fosfatidiletanolamina, dipalmitoil fosfatidiletanolamina, y diestearoil fosfatidiletanolamina), fosfatidilserinas, fosfatidilinositoles, ácido fosfatídico, cardiolipina y similares; sus productos hidrogenados; y glucolípidos tales como esfingomielina y gangliósido. Con respecto a los lípidos, se puede usar un único lípido solo, o se puede usar una combinación de dos o más lípidos. El fosfolípido puede ser un lípido natural derivado de yema de huevo, soja u otros lípidos de animales y plantas (por ejemplo, lecitina de yema de huevo, lecitina de soja y similares); un lípido sintético; o un lípido semisintético. Con respecto a los lípidos, se puede usar un único lípido solo, o se puede usar una combinación de dos o más lípidos.
Con el fin de estabilizar física o químicamente la bicapa lipídica, o ajustar la fluidez de la membrana, la bicapa lipídica puede incluir uno o más de, por ejemplo: esteroles derivados de animales tales como colesterol, succinato de colesterol, lanosterol, dihidrolanosterol, desmosterol y dihidrocolesterol; esteroles derivados de plantas (fitosterol) tales como estigmasterol, sitosterol, campesterol y brassicasterol; esteroles derivados de microbios tales como zimosterol y ergosterol; azúcares tales como glicerol y sacarosa; y ésteres de ácidos grasos de glicerina tales como trioleína y trioctanoína. Aunque la cantidad contenida de estos no está particularmente limitada, la cantidad contenida con respecto a la cantidad total de lípido que forma la bicapa lipídica es preferentemente del 5 al 40 % (relación molar) y más preferentemente del 10 al 30 % (relación molar).
La bicapa lipídica puede incluir: antioxidantes tales como tocoferol, galato de propilo, palmitato de ascorbilo e hidroxitolueno butilado; sustancias cargadas que dan una carga positiva, tales como estearilamina y oleilamina; sustancias cargadas que dan una carga negativa como fosfato de dicetilo; y proteínas de membrana tales como proteínas de superficie de membrana y proteínas intrínsecas de membrana. La cantidad contenida de estos se puede controlar de manera apropiada.
El liposoma de la presente divulgación tiene, en su superficie, un péptido GALA formado a partir de 30 aminoácidos. Cabe señalar que, la superficie del liposoma en un liposoma unilaminar es la superficie externa de una bicapa lipídica, y la superficie del liposoma en un liposoma multilaminar es la superficie externa de una bicapa lipídica en la capa más externa. Adicionalmente, el liposoma de la presente divulgación también puede incluir el péptido en una parte (por ejemplo, la superficie interna de la bicapa lipídica) distinta de la superficie.
El vector de la presente invención incluye, preferentemente, un lípido catiónico. Los ejemplos de lípidos catiónicos incluyen DODAC (cloruro de dioctadecildimetilamonio), DOTMA (N-(2,3-dioleiloxi)propil-N,N,N-trimetilamonio), DDAB (bromuro de didodecilamonio), DOTAP (1,2-dioleoiloxi-3-trimetilamoniopropano), DC-Chol (3-beta-N-(N',N',-dimetilaminoetano)-carbamol colesterol), DMRIE (1,2-dimiristoiloxipropil-3-dimetilhidroxietilamonio), DOSPA (trifluoroacetato de 2,3-dioleiloxi-N-[2(esperminecarboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanamino), DSTAP (1,2-diestearoil-3-trimetilamoniopropano), DODAP (dioleoil-3-dimetilamonio-propano), y similares. El lípido catiónico es preferentemente DOTMA, DSTAP o DODAP, y es de forma particularmente preferente DOTMA. Con respecto al lípido catiónico, se puede usar un único lípido catiónico solo, o se puede usar una combinación de dos o más lípidos catiónicos.
De los lípidos catiónicos, DOTMA y DSTAP tienen una amina cuaternaria y tienen constantemente una carga positiva, mientras que DODAP tiene una amina terciaria y no tiene una carga en un pH fisiológico. Por tanto, cambiando el tipo y la cantidad mezclada de los lípidos catiónicos, es posible proporcionar una amplitud a la estructura y características del lípido catiónico.
El vector de la presente invención incluye, preferentemente, un lípido auxiliar. Los ejemplos del lípido auxiliar incluyen EPC (fosfatidilcolina de huevo), Dl PC (dilinoleoilfosfatidilcolina), DMPC (dimiristoilfosfatidilcolina), DPPC (dipalmitoilfosfatidilcolina), DSPC (distearoilfosfatidilcolina), POPC (palmitoiloleoilfosfatidilcolina), DOPC (dioleoilfosfatidilcolina), DOPE (dioleoilfosfatidiletanolamina) y SOPE (esteariloleoilfosfatidilcolina). Entre estos, EPC, DOPC, DOPE y SOPE son preferibles.
Por ejemplo, dado que un MEND que incluye DOPC como lípido auxiliar no se agrega en absoluto después de almacenarse a temperatura ambiente durante 1 mes, DOPC es excelente también en términos de estabilidad en almacenamiento.
Como modo preferible del liposoma de la presente divulgación, se puede ilustrar un liposoma en el que el péptido GALA está modificado con un grupo hidrófobo o un compuesto hidrófobo, y el grupo hidrófobo o el compuesto hidrófobo se inserta en una bicapa lipídica mientras el péptido se expone desde la bicapa lipídica. Cabe señalar que, en el presente modo, "el péptido se expone desde la bicapa lipídica" incluye un caso en el que el péptido se expone desde la superficie externa o la superficie interna de la bicapa lipídica, y un caso en el que el péptido se expone desde ambas superficies.
El grupo hidrófobo o compuesto hidrófobo no está particularmente limitado siempre que se pueda insertar en una bicapa lipídica. Los ejemplos del grupo hidrófobo incluyen: grupos de ácidos grasos saturados o insaturados tales como grupo estearilo, grupo palmitilo, grupo oleilo, grupo palmitoleilo, grupo linolilo, grupo linoleilo y similares, alcoholes alifáticos, aminas alifáticas u otros grupos (por ejemplo, grupos derivados de esterol tales como grupo colesterilo (Chol)) que incluyen grupos hidrocarbonados cuyo número de carbonos es 10 o mayor; y derivados de los mismos. Entre estos, los grupos de ácidos grasos cuyo número de carbonos es de 10 a 20 (por ejemplo, grupo palmitoilo, grupo oleilo, grupo estearilo, grupo araquidonoilo y similares) son particularmente preferibles. Además, los ejemplos del compuesto hidrófobo incluyen los fosfolípidos, glucolípidos o esteroles ilustrados anteriormente, alcoholes alifáticos de cadena larga (por ejemplo, fosfatidiletanolamina, colesterol y similares), polioxipropilen alquilo, ésteres de ácidos grasos de glicerina y similares.
El liposoma de la presente divulgación se puede crear usando un método conocido en la técnica, Incluyendo, por ejemplo, método de hidratación, ultrasonidos, método de inyección de etanol, método de inyección de éter, método de evaporación en fase inversa y método de congelación y descongelación.
A continuación se mostrará un método para producir el liposoma usando el método de hidratación.
Un lípido, que es un componente de una bicapa lipídica, y el péptido modificado con el grupo hidrófobo o el compuesto hidrófobo se disuelven en un disolvente orgánico, y después el disolvente orgánico se elimina por evaporación para obtener una membrana lipídica. En este caso, los ejemplos del disolvente orgánico incluyen: hidrocarburos tales como pentano, hexano, heptano y ciclohexano; hidrocarburos halogenados, tales como cloruro de metileno y cloroformo; hidrocarburos aromáticos tales como benceno y tolueno; alcoholes inferiores tales como metanol y etanol; ésteres tales como acetato de metilo y acetato de etilo; y cetonas tales como acetona. Con respecto a estos disolventes orgánicos, se puede usar un único disolvente orgánico solo, o se puede usar una combinación de dos o más disolventes orgánicos. A continuación, hidratando la membrana lipídica y agitando o ultrasonicando la solución, se puede producir un liposoma que tiene el péptido en su superficie.
Adicionalmente, en lo sucesivo se mostrará otro ejemplo de producción que usa el método de hidratación.
Un lípido, que es un componente de una bicapa lipídica, se disuelve en un disolvente orgánico y después el disolvente orgánico se elimina por evaporación para obtener una membrana lipídica. La membrana lipídica se hidrata y la solución se agita o se ultrasonica para producir un liposoma. A continuación, añadiendo el péptido modificado con el grupo hidrófobo o el compuesto hidrófobo a la solución externa del liposoma, el péptido puede introducirse en la superficie del liposoma. Como alternativa, añadiendo el péptido modificado con el grupo hidrófobo o el compuesto hidrófobo al disolvente orgánico que tiene disuelto en su interior el lípido, el péptido puede introducirse en la superficie del liposoma.
Por ejemplo, cuando se usa una amina cuaternaria como lípido catiónico, el liposoma se puede producir usando un método similar al del ejemplo 3-1 descrito más adelante, un método basado en el mismo, o una combinación de estos y un método comúnmente usado en la técnica; y cuando se usa una amina terciaria como lípido catiónico, el liposoma se puede producir usando un método similar al del ejemplo 3-2 descrito más adelante, un método basado en el mismo, o una combinación de éstos y un método comúnmente usado en la técnica.
Cuando se prepara el liposoma catiónico, la relación de lípido catiónico/Chol/lípido auxiliar se puede cambiar según sea apropiado. La relación de composición (relación molar) es, preferentemente, de 10 a 50/20 a 50/20 a 70, más preferentemente de 20 a 40/30 a 50/20 a 40, y de forma particularmente preferente 30/40/30. Una combinación preferible de lípido catiónico/Chol/lípido auxiliar es un lípido catiónico seleccionado de DOTMA, DODAP o DSTAP/Chol/un lípido auxiliar seleccionado de EPC, DOPE o SOPE, y es, más preferentemente, DOTMA/Chol/EPC, DODAP/Chol/EPC, DSTAP/Chol/EPC, DOTMA/Chol/DOPE o DOTMA/Chol/SOPE. Cuando el liposoma se va a modificar con Chol-GALA, la relación añadida de Chol-GALA se puede cambiar según sea apropiado, y los ejemplos de la misma con respecto a la cantidad total de lípidos (cantidad total de lípidos de lípido catiónico/Chol/lípido auxiliar) incluyen del 0,1 al 5 % en moles, preferentemente del 0,3 al 4 % en moles, más preferentemente del 0,5 al 4 % en moles, incluso más preferentemente del 1 al 4 % en moles y de forma particularmente preferente del 1,5 al 2 % en moles. Además, el liposoma se puede modificar con PEG según sea apropiado, y cuando se realiza la modificación con PEG, se puede cambiar la relación añadida de PEG según sea apropiado, y los ejemplos de la relación añadida con respecto a la cantidad total de lípidos (cantidad total de lípidos de lípido catiónico/Chol/lípido auxiliar) incluyen del 0,1 al 15 % en moles, y preferentemente del 1 al 5 % en moles. Cabe señalar que el PEG añadido es, preferentemente, un PEG unido a un lípido, más preferentemente STR-PEG o ceramida C8-PEG y, de forma particularmente preferente, STR-PEG2000 o ceramida C8-PEG2000.
Además, mediante el uso del lípido auxiliar descrito anteriormente, se puede preparar un liposoma neutro cuya composición de liposomas es lípido auxiliar/Chol, y aunque la relación de composición (relación molar) del mismo se puede cambiar según sea apropiado, la relación de composición es preferentemente de 40 a 90/10 a 60, más preferentemente 60 a 80/20 a 40, y de forma particularmente preferente 70/30. La combinación de lípido auxiliar/Chol es, preferentemente, EPC/Chol, DLPC/Chol, DMPC/Chol, DPPC/Chol, DSPC/Chol, POPC/Chol, DOPC/Chol, DOPE/Chol o SOPE/Chol, más preferentemente EPC/Chol, DOPC/Chol, DOPE/Chol o SOPE/Chol, y de forma particularmente preferente EPC/Chol. Cuando el liposoma se va a modificar con Chol-GALA, la relación añadida de Chol-GALA se puede cambiar según sea apropiado, y los ejemplos de la misma con respecto a la cantidad total de lípidos (cantidad total de lípidos de lípidos auxiliares/Chol) incluyen del 0,1 al 5 % en moles, preferentemente del 0,3 al 4 % en moles, más preferentemente del 0,5 al 4 % en moles, incluso más preferentemente del 1 al 4 % en moles y de forma particularmente preferente del 1,5 al 2 % en moles. Además, el liposoma se puede modificar con PEG según sea apropiado, y cuando se realiza la modificación con PEG, la relación añadida de p Eg se puede cambiar según sea apropiado y los ejemplos de la relación añadida con respecto a la cantidad total de lípidos (cantidad total de lípidos de lípido auxiliar/Chol) incluyen del 0,1 al 15 % en moles, y, preferentemente, del 1 al 5 % en moles. Cabe señalar que el PEG añadido es, preferentemente, un PEG modificado sobre un lípido, más preferentemente STR-PEG o ceramida C8-PEG y, de forma particularmente preferente, STR-PEG2000 o ceramida C8-PEG2000.
La composición de liposomas de la presente divulgación es, preferentemente, lípido catiónico/Chol/lípido auxiliar/STR-PEG/Chol-GALA o lípido auxiliar/Chol/STR-PEG/Chol-GALA, más preferentemente un lípido catiónico seleccionado de DOTMA, DODAP o DSTAP/Chol/un lípido auxiliar seleccionado de EPC, DOPE o SOpE/STR-PEG/Chol-GALA, o EPC/Chol/STR-PEG/Chol-GALA, y más preferentemente DOTMA/Chol/EPC/STR-PEG/Chol-GALA, DODAP/Chol/EPC/STR-PEG/Chol-GALA, DSTAP/Chol/EPC/STR-PEG/Chol-GALA, DOTMA/Chol/DOPE/STR-PEG/Chol-GALA, DOTMA/Chol/SOPE/STR-PEG/Chol-GALA o EPC/Chol/STR-PEG/Chol-GALA. Cabe señalar que, como STR-PEG, es particularmente preferible STR-PEG2000 cuyo PEG tiene un peso molecular de 2000.
El liposoma más preferible de la presente divulgación tiene una composición de DOTMA/Chol/EPC/STR-PEG2000/Chol-GALA, en donde:
preferentemente, la relación de composición (relación molar) de DOTMA/Chol/EPC en la misma es de 10 a 50/20 a 50/20 a 70 y, con respecto a la cantidad total de lípidos de DOTMA/Chol/EPC, se incluye STR-PEG2000 en del 1 al 15 % en moles y se incluye Chol-GALA en del 0,1 al 5 % en moles;
más preferentemente, la relación de composición (relación molar) de DOTMA/Chol/EPC en la misma es de 20 a 40/30 a 50/20 a 40 y, con respecto a la cantidad total de lípidos de DOTMA/Chol/EPC, se incluye STR-PEG2000 en del 1 al 5 % en moles y se incluye Chol-GALA en del 1 al 4 % en moles; y
de la manera más preferente, la relación de composición (relación molar) de DOTMA/Chol/EPC en la misma es 30/40/30 y, con respecto a la cantidad total de lípidos de DOTMA/Chol/EPC, se incluye STR-PEG2000 en del 1 al 5 % en moles y se incluye Chol-GALA en del 1,5 al 2 % en moles. Dado que STR-PEG2000 y Chol-GALA son componentes de modificación del liposoma, las cantidades añadidas de estos se representan como una relación con respecto al 100 % en moles, es decir, la cantidad total de lípidos del liposoma formado a partir de tres componentes de DOTMA/Chol/EPC.
La sustancia prevista que se va a administrar a las células pulmonares puede encapsularse dentro del liposoma de la presente divulgación.
Los ejemplos de la sustancia prevista encapsulada en el agente de introducción de sustancias (en particular, liposoma) de la presente divulgación incluyen, dependiendo del tipo de enfermedad pulmonar, los fármacos descritos anteriormente (agentes anticancerosos, fármacos vasodilatadores, agentes antibacterianos), ácidos nucleicos (ADN, ARN y análogos o derivados de los mismos (por ejemplo, ARNip, ácido peptidonucleico (APN), ADN fosforotioato) y péptidos (hormonas peptídicas y péptidos bioactivos tales como oxitocina, bradiquinina, factor de liberación de tirotropina y encefalina). El tratamiento o la prevención de una enfermedad pulmonar es posible encapsulando una sustancia prevista adecuada dependiendo del tipo de enfermedad pulmonar. En la presente memoria descriptiva, "enfermedad pulmonar" incluye cáncer de pulmón, enfermedades inflamatorias del pulmón, fibrosis pulmonar, embolia pulmonar, hipertensión pulmonar, vasculitis pulmonar, síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), asbestosis/enfermedad del polvo, asma, bronquiectasia, displasia broncopulmonar (DBP), bronquitis crónica, tos crónica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), resfriado común, fibrosis quística, enfisema, hantavirus, histoplasmosis, gripe, enfermedad del legionario, linfangioleiomiomatosis, tos ferina, pleuresía, neumotórax, síndrome de hipoventilación alveolar primaria, proteinosis pulmonar alveolar, síndrome de dificultad respiratoria, virus RS, sarcoidosis, síndrome respiratorio agudo grave (SARS), tuberculosis. Una enfermedad pulmonar que es preferible como diana para el tratamiento o la prevención es una enfermedad pulmonar implicada en los vasos sanguíneos del pulmón, y ejemplos de la misma incluyen cáncer de pulmón, hipertensión pulmonar, vasculitis pulmonar; y cáncer de pulmón (incluyendo cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico) es particularmente preferible. El cáncer de pulmón no solo incluye el cáncer de pulmón primario, sino que también incluye el cáncer de pulmón metastásico con metástasis de órganos distintos del pulmón. Adicionalmente, el agente de introducción de sustancias de la presente divulgación también se puede usar para suprimir la metástasis del cáncer, que es un cáncer cuyo foco principal es el pulmón, a otros órganos (por ejemplo, glándula suprarrenal, hígado, cerebro, huesos o similares). La sustancia prevista que debe encapsularse en el agente de introducción de sustancias de la presente divulgación para tratar el cáncer de pulmón y para suprimir la metástasis del cáncer de pulmón es: preferentemente un agente anticanceroso descrito anteriormente (por ejemplo, clorhidrato de amrrubicina, gefitinib, cisplatino, vinblastina, mitomicina C, vinorelbina, paclitaxel, docetaxel, gemcitabina, carboplatino, irinotecán, tegafur, etopósido, vincristina, ciclofosfamida, doxorrubicina, ifosfamida, vindesina) o un ARNip cuya diana es un factor implicado en la angiogénesis (por ejemplo, CD31, ESAM, VEGF, VEGFR, EGF, EGFR, D11, SFRP, CD151, bFGF, TGF beta 1, PDGF, HGF); más preferentemente un ARNip cuya diana es CD31, ESAM, CD151, VEGF o EGF; y de forma particularmente preferente un ARNip anti-CD31. Dependiendo del fin, estos agentes pueden usarse individualmente o como una mezcla de dos o más.
La sustancia prevista encapsulada en el agente de introducción de sustancias de la presente divulgación para la hipertensión pulmonar es, preferentemente, un vasodilatador descrito anteriormente (por ejemplo, bosentán, ambrisentán, beraprost sódico, sildenafilo, epoprostenol) o un anti-ARNip de un factor implicado en la vasodilatación (por ejemplo, receptor de endotelina (ETa, eTb), PDE5).
La sustancia prevista encapsulada en el agente de introducción de sustancias de la presente divulgación para la vasculitis pulmonar es, preferentemente, esteroide cortical suprarrenal, ciclofosfamida, azatioprina, metotrexato, aspirina.
El agente de introducción de sustancias de la presente divulgación puede usarse individualmente o puede usarse junto con otros tratamientos para enfermedades pulmonares.
Cuando la sustancia prevista es soluble en agua, la sustancia prevista puede encapsularse en una fase acuosa dentro del liposoma añadiendo la sustancia prevista a un disolvente acuoso usado cuando se hidrata la membrana lipídica para producir el liposoma. Cuando la sustancia prevista es lipófila, la sustancia prevista puede encapsularse en la bicapa lipídica del liposoma añadiendo la sustancia prevista a un disolvente orgánico usado para producir el liposoma. En la presente memoria descriptiva, "encapsular" incluye tanto un caso en el que la sustancia prevista se incluye dentro de una partícula hueca tal como un liposoma como un caso en el que la sustancia prevista se retiene en la parte de la superficie que forma el vector, tal como una membrana de bicapa lipídica.
La especie biológica a la que se administra la sustancia prevista no está particularmente limitada siempre que la especie sea un vertebrado que tenga un pulmón, y preferentemente es un mamífero. Los ejemplos de dicho mamífero incluyen ser humano, mono, vaca, oveja, cabra, caballo, cerdo, conejo, perro, gato, rata, ratón, cobaya y similares.
El liposoma de la presente divulgación puede usarse, por ejemplo, en un estado de líquido de dispersión. Como disolvente de dispersión, por ejemplo, se puede usar un tampón tal como tampón acetato, tampón citrato, tampón fosfato o solución salina. Al líquido de dispersión, por ejemplo, aditivos tales como azúcares, alcoholes polihídricos, polímeros solubles en agua, tensioactivos no iónicos, antioxidantes, modificadores de pH, promotores de hidratación, etc., pueden añadirse.
El liposoma de la presente divulgación se puede usar en una forma obtenida secando el líquido de dispersión (por ejemplo, liofilización, secado por pulverización y similares). Se puede añadir un liposoma seco a un tampón como tampón acetato, tampón citrato, tampón fosfato o solución salina para obtener un líquido de dispersión.
Cada uno de los liposomas se puede usar tanto in vitro como in vivo. Cuando cada uno de los liposomas se usa in vivo, los ejemplos de la vía de administración incluyen inyección intravenosa, goteo intravenoso y similares; y la dosis de administración y la frecuencia de administración pueden ajustarse apropiadamente dependiendo de la cantidad y el tipo, etc., de la sustancia prevista encapsulada en el liposoma de acuerdo con la presente divulgación.
El liposoma de la presente divulgación no ha demostrado causar reducción de peso o daño hepático y puede administrarse de forma segura.
Ejemplos
Los reactivos, material, animales, etc., usados en cada uno de los ejemplos se muestran a continuación.
EPC se adquirió de NOF Corp., (Tokio, JAPÓN). DOTAP, DSTAP, DODAP, colesterol, DOPE, SOPE, DOPC y ceramida C8-PEG2000 se adquirieron de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, Estados Unidos). DOTMA se adquirió de Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Tokio, Japón). STR-PEG2000 se adquirió de Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Chol-GALA (colesteril-O(C=O)-WEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAA-NH2 ; PM 3444,0; > 71 % de pureza) se sintetizó usando un método descrito en la bibliografía de patentes 3, un método basado en el mismo, o una combinación de éstos y un método comúnmente usado en la técnica.
PEI (tipo ramificado, PM promedio 10.000) se adquirió de Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
La prueba de transaminasa CII de Wako se adquirió de Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
RNAlater se adquirió de Ambion. El kit de ARN a ADNc de alta capacidad y la mezcla maestra de expresión génica TaqMan se adquirieron de Applied Biosystems. La síntesis de ARNip y ARNip marcado con Cy5 se contrató a Hokkaido System Science Co. Ltd. La síntesis de cebadores y sondas se llevó a cabo de acuerdo con un método comúnmente usado en la técnica. A continuación, se muestran las secuencias del ARNip, los cebadores y las sondas usados. ARNip
CD31-1 sentido: GCACAGUGAUGCUGAACAATT (SEQ ID NO: 2)
CD31-1 antisentido: UUGUUCAGCAUCACUGUGCTT (SEQ ID NO: 3)
CD31-2 sentido: GUGCAUAGUUCAAGUGACATT (SEQ ID NO: 4)
CD31-2 antisentido: UGUCACUUGAACUAUGCACTT (SEQ ID NO: 5)
CD31-3 sentido: GCAAGAAGCAGGAAGGACATT (SEQ ID NO: 6)
CD31-3 antisentido: UGUCCUUCCUGCUUCUUGCTT (SEQ ID NO: 7)
Luciferasa sentido: GCGCUGCUGGUGCCAACCCTT (SEQ ID NO: 8)
Luciferasa antisentido: GGGUUGGCACCAGCAGCGCTT (SEQ ID NO: 9)
Como ARNip de CD31, los 3 tipos descritos anteriormente se mezclaron en la misma cantidad para su uso.
Cebador, Sonda
CD31 directo: CAGAGCGGATAATTGCCATTCC (SEQ ID NO: 10)
CD31 inverso: ACAGGATGGAAATCACAACTTCATC (SEQ ID NO: 11)
CD31 sonda: [FAM] ACCCTCAGGATCTCGCTGAACACCGC [TAMRA] (SEQ ID NO: 12)
CD34 directo: TCTGCCTGGAACTAAGTGAAGC (SEQ ID NO: 13)
CD34 inverso: CCTCAGACTGGGCTAGAAGCA (SEQ ID NO: 14)
CD34 sonda: [FAM] ACCAGCATCAGCCTCAGCCTCCTCC [TAMRA] (SEQ ID NO: 15)
Los ratones ICR macho de 5 semanas de edad y los ratones macho C57BL/6 que tenían 6 semanas de edad se compraron en Japan SLC, Inc.
Para otros, a menos que se mencione lo contrario, se usó un producto de calidad especial o de primera calidad disponible en el mercado, o uno similar al que se usó.
Además, los instrumentos y similares usados en cada uno de los ejemplos se muestran a continuación.
Para la preparación de una membrana lipídica, se usó una bomba DIVAC 1.2 y una trampa EVALA UNI TRAP UT-1000 (ambas de Tokyo Rikakikai Co., Ltd.).
Se usó un baño de ultrasonidos AU-25C (AIWA MEDICAL INDUSTRY Co., Ltd.) para el tratamiento con ultrasonidos. Se usó un ZETA SIZER Nano-ZS (Malvern Instruments Ltd.) para medir el potencial zeta y el diámetro de partícula con dispersión de luz dinámica (DLS).
Se usó el sistema en tiempo real ABI 7500 (Applied Biosystems) para la PCR en tiempo real.
Se usó un contador de centelleo líquido TRI-CABB 1600TR (PACKARD) para medir los rayos beta.
Como microscopio de barrido láser confocal (CLSM), se usaron A1 (Nikon), lente objetivo Plan Apo VC 20x y 60x, y láseres de láser de Ar y láser de He/Ne.
Para la transcripción inversa se usó el termociclador de PCR TP3000 (Takara Bio, Inc.).
Se usó un pHmetro Docu (Sartorius) para medir el pH.
El lípido usado se preparó en una concentración deseada (1 a 10 mM) mediante dilución con una cantidad adecuada de EtOH.
Se purificó Chol-GALA con HPLC de fase inversa usando COSMOSIL 5C4-AR-300 (tamaño: 10 x 250 mm). Se usó H2O/TFA al 0,1 % como tampón A, y se usó CH3CN/TFA al 0,1 % como tampón B. Se inyectó Chol-GALA (pureza: > 71 %) disuelto en DMF (4 mg/ml como crudo), y se aplicó un gradiente a un caudal de 2,0 ml/min, 25 °C y 50 % de B => 95 % de B (20 min) (los detalles se describen a continuación). Se recogió Chol-GALA detectando la absorbancia a 215 nm y se liofilizó. La pureza del Chol-GALA purificado se examinó usando HPLC, y a continuación el Chol-GALA purificado se dispensó como una solución de EtOH 1 mM y se almacenó a -80 °C.
<Condiciones>
Volumen de inyección: 250 |jl (4 mg/ml en DMF)
Caudal: 2 minutos
Temperatura de la columna: 25 °C:
Protocolo:
Tabla 1
Figure imgf000013_0001
El diámetro de partícula y el potencial zeta del liposoma y MEND se midieron usando Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Reino Unido).
A menos que se mencione lo contrario, los datos experimentales se describieron como valor promedio más y menos la desviación estándar de tres o más valores experimentales. Para poner a prueba la significación, se realizó una prueba ANOVA de una vía y se realizó una comparación múltiple con el método de Dunnett, y un valor con P <0,05 se consideró significativo.
Ejemplo 1 Preparación de liposomas
1) Preparación de la membrana lipídica
En un tubo de ensayo de vidrio, se prepararon EPC (solución en EtOH) y Chol (solución en EtOH) en una relación molar de 70/30 (liposoma a), se añadió STR-PEG2000 (solución en EtOH) para que fuera el 5 % en moles con respecto a la cantidad total de lípidos del liposoma a, se le añadió una cantidad adecuada de EtOH y a continuación se secó el tubo de ensayo a presión reducida en un desecador para destilar los disolventes y preparar una membrana lipídica cuya composición lipídica fue EPC/Chol/STR-PEG2000 (abreviado como "Liposoma" en la figura 1). Adicionalmente, al modificar EPC/Chol/STR-PEG2000 con Chol-GALA, se añadió el 2 % molar del mismo con respecto a la cantidad total de lípidos del liposoma a en la solución lipídica para preparar una membrana lipídica cuya composición lipídica fue EPC/Chol/STR-PEG2000/Chol-GALA (en la figura 1, abreviado como "GALA-Liposoma"). Adicionalmente, cuando se prepara una membrana lipídica descrita como "liposoma catiónico" en la figura 1, se añadieron DOTMA (solución en EtOH), Chol y EPC en una relación molar de 30/40/30, y se realizó una operación similar a la descrita anteriormente para preparar una membrana lipídica (liposoma b) cuya composición lipídica fue DOTMA/Chol/EPC.
2) Preparación de liposomas
A la membrana lipídica preparada en 1) descrita anteriormente, se le añadió tampón HEPES 10 mM con glucosa al 5 % (HBG) (experimento in vivo) o tampón HEPES 10 mM (HB) (experimento in vitro) para obtener una concentración de lípidos de 2,64 mM (experimento in vivo) o 0,55 mM (experimento in vitro), y la hidratación se realizó a temperatura ambiente durante 15 minutos o más. A continuación, se preparó un liposoma mediante ultrasonidos de aproximadamente 1 minuto en un baño de ultrasonidos.
Ejemplo 2 Evaluación farmacocinética de liposomas
1) Administración de liposomas, recogida de órganos y medición de [3H]
Una membrana lipídica del liposoma preparado en 2) descrito anteriormente se marcó con [3H] para obtener una muestra de administración.
La administración se llevó a cabo en una condición de 10 |jl de liposoma/g de ratón a las venas de la cola de los ratones (ICR, 5 semanas de edad, macho). Los ratones se eterizaron 1, 5 y 15 minutos, y 1 y 6 horas después de la administración, se les realizó una laparotomía, se les extrajo sangre de la vena cava inferior y se les extirparon los pulmones y el hígado. Los órganos se enjuagaron, cada uno, minuciosamente con solución salina, se pesaron (para los hígados, los hígados se trituraron, se mezclaron minuciosamente y se usaron 0,2 g de hígado), se colocaron en un vial de plástico y se añadieron 2 ml de Soluene-350 y la solución se incubó durante la noche a 50 °C para disolver el tejido. A la solución se le añadieron 10 ml de Hionic-Fluor, se mezcló minuciosamente, se dejó reposar durante la noche a 4 °C y tuvo un recuento de [3H] de los mismos medido usando un contador de centelleo líquido. Adicionalmente, para evaluar la dosis de administración de [3H], se añadieron 10 ml de Hionic-Fluor a 10 j l de la muestra de liposoma administrada y la mezcla se mezcló minuciosamente. La mezcla se dejó reposar durante la noche a 4 °C y un recuento de [3H] se midió de manera similar.
2) Evaluación de la cantidad de migración a órganos
El recuento de [3H] (valor medido) de cada muestra de órgano se dividió por el peso del órgano proporcionado para la medición para calcular el contenido de [3H] por 1 g de cada órgano, y a continuación esto se dividió por el [3H] contenido en el liposoma administrado para calcular una cantidad de migración a órganos como una relación con respecto a la dosis de administración.
Los resultados de la evaluación de la migración pulmonar y hepática del liposoma modificado con GALA (Liposoma-GALA) a lo largo del tiempo se muestran en la figura 1-A, la figura 1-B y la figura 2.
Como se muestra en la figura 1-A, la figura 1-B y la figura 2, se observó que el liposoma modificado con GALA migraba al pulmón. Además, se confirmó que la migración al hígado se había reducido debido a la mejora en la migración pulmonar del liposoma modificado con GALA.
Ejemplo 3-1 Preparación de MEND1
1) Preparación de la membrana lipídica
De manera similar al método del ejemplo 1, en un tubo de ensayo de vidrio, se añadieron DOTMA (solución en EtOH), Chol (solución en EtOH) y EPC (solución en EtOH) en una relación molar de 30/40/30, se le añadió una cantidad adecuada de EtOH, y el tubo de ensayo se secó a presión reducida en un desecador para destilar los disolventes y preparar una membrana lipídica (liposoma b) cuya composición lipídica fue DOTMA/Chol/EPC. Al llevar a cabo la modificación con STR-PEG2000 (solución en EtOH), a la solución lipídica se le añadió el 5 % molar del mismo con respecto a la cantidad total de lípidos del liposoma b para preparar una membrana lipídica cuya composición lipídica fue DOTMA/Chol/EPC/STR-PEG2000 (en lo sucesivo, abreviado a veces como "MEND1"). Al llevar a cabo la modificación con Chol-GALA, se añadió el 2 % en moles del mismo con respecto a la cantidad total de lípidos del liposoma b a la solución lipídica para preparar una membrana lipídica cuya composición lipídica fue DOTMA/Chol/EPC/STR-PEG2000/Chol-GALA (en lo sucesivo, abreviado en ocasiones como "GALA-MEND1").
2) Preparación de complejo de ARNip (partícula central de ARNip)
Se preparó un complejo de PEI/ARNip de manera que se obtuvo una relación de carga (+/-) = 1,8. Se preparó goteando 0,125 mg/ml de una solución de PEI con respecto a 0,333 mg/ml de una solución de ARNip (relación en volumen de la solución de ARNip:solución de PEI = 6:4) mientras se colocaba la solución en un vórtice, y la solución se incubó durante 15 minutos o más a temperatura ambiente. Como solución de ARNip y solución de PEI, se usaron las diluidas con HBG.
3) Preparación de MEND
La solución de partículas centrales de ARNip se añadió al tubo de ensayo en el que se preparó la membrana lipídica obtenida en 1) descrita anteriormente de manera que la concentración de lípidos fuera 2,64 mM, y la hidratación se realizó a temperatura ambiente durante 15 minutos o más. A continuación, se realizó el tratamiento con ultrasonidos en un baño de ultrasonidos durante aproximadamente 1 minuto para preparar MEND, y se crearon GALA-MEND1 y MEND1 que encapsulan la partícula central de ARNip.
Ejemplo 3-2 Preparación de MEND2
1) Preparación de la membrana lipídica
Basándose en el método de preparación descrito en el ejemplo 1, en un tubo de ensayo de vidrio, se añadieron DODAP (solución en EtOH), Chol (solución en EtOH) y EPC (solución en EtOH) en una relación molar de 30/40/30 para preparar una solución lipídica (liposoma c) cuyos componentes son DODAP/Chol/EPC. A la solución lipídica obtenida, se le añadió un 5 % en moles de STR-PEG2000 (solución en EtOH) con respecto a la cantidad total de lípidos del liposoma c para preparar una membrana lipídica cuya composición lipídica fue DODAP/Chol/EPC/STR-PEG2000 (en lo sucesivo, a veces abreviado como "MEND2"). Al llevar a cabo la modificación con Chol-GALA, se añadió el 2 % en moles del mismo con respecto a la cantidad total de lípidos del liposoma c a la solución lipídica de MEND2, se añadió una cantidad adecuada de EtOH y el tubo de ensayo se secó a presión reducida en un desecador para destilar los disolventes para preparar una membrana lipídica cuya composición lipídica fue DODAP/Chol/EPC/STR-PEG2000/Chol-GALA (en lo sucesivo, abreviado a veces como "GALA-MEND2").
2) Preparación de complejo de ARNip (partícula central de ARNip)
Se preparó un complejo de PEI/ARNip de manera que se obtuvo una relación de carga (+/-)=1,8. Se preparó goteando 0,125 mg/ml de una solución de PEI con respecto a 0,333 mg/ml de una solución de ARNip (relación en volumen de la solución de ARNip:solución de PEI = 6:4) mientras se colocaba la solución en un vórtice, y la solución se incubó durante 15 minutos o más a temperatura ambiente. Como solución de ARNip y solución de PEI, se usaron las diluidas con HBG (pH sin ajustar (pH 5,0)) para preparar la partícula central de la solución ácida.
3) Preparación de MEND
La solución de partículas centrales de ARNip se añadió al tubo de ensayo en el que se preparó la membrana lipídica obtenida en 1) descrita anteriormente de manera que la concentración de lípidos fuera 2,64 mM, y la hidratación se realizó a temperatura ambiente durante 15 minutos o más. A continuación, se llevó a cabo el tratamiento con ultrasonidos en un baño de ultrasonidos durante aproximadamente 1 minuto y se añadió HBG (pH 8,1) en una cantidad igual de la solución de partículas del núcleo de ARNip de manera que la solución preparada se volvió neutra para preparar MEND, y se crearon GALA-MEND2 y MEND2 que encapsulan la partícula central de ARNip.
Ejemplo 4 Interacción con hemocitos
Se mezclaron sangre de ratón (que contenía heparina a 20 unidades/ml) y solución de GALA-MEND1 en una relación de volumen de 1:1, y la mezcla se mezcló usando un agitador a 37 °C durante 5 minutos (muestra 1). Se añadió más sangre a esta mezcla en una relación de volumen de 10:1 y la mezcla se mezcló usando las mismas condiciones (muestra 2). Se añadieron 10 |jl de cada una de las muestras 1 y 2 a un portaobjetos de vidrio, se colocó un cubreobjetos sobre ellas y se observaron las muestras usando un microscopio.
La figura 3 muestra los resultados de mezclar sangre y el GALA-MEND1 obtenido en diversas relaciones para evaluar su interacción con los componentes de los hemocitos.
Como se muestra en la figura 3, se observó que la agregación de MEND modificado con GALA y sangre era reversible.
Ejemplo 5 Evaluación farmacocinética de MEND
La membrana lipídica de MEND se marcó con pH], y el ARNip se marcó con [32P] para obtener una muestra de administración.
Se administró una solución de MEND1 o GALA-MEND1 (2 mg de ARNip/kg de ratón) a las venas de la cola de ratones (ICR, 5 semanas de edad, macho). Se eterizó a los ratones 1 hora después de la administración, se les realizó una laparotomía, se les extrajo sangre de la vena cava inferior y se les extirparon los pulmones. Se pesaron los pulmones, se colocaron aproximadamente 0,1 mg de los mismos en un vial de plástico y se le añadieron 2 ml de Soluene-350 y la solución se incubó durante la noche a 50 ° C para disolver el tejido.
A esta solución, se le añadieron 200 j l (100 j l x2) de H2O2 para decoloración, se le añadieron 10 ml de Hionic-Fluor y la mezcla se mezcló minuciosamente. La mezcla se dejó en reposo durante la noche a 4 °C y se midieron recuentos de [3H] y [32P] usando un contador de centelleo líquido. Adicionalmente, se creó una curva patrón añadiendo una cantidad conocida de la solución MEND1 a un pulmón extirpado de un ratón no administrado y realizando una operación similar, y se calcularon cantidades de migración de [3H] y [32 P] para cada órgano.
La figura 4 muestra el resultado de la administración intravenosa en la vena de la cola de GALA-MEND1 o MEND1 en la que el ARNip se marcó con [32P] y la membrana lipídica se marcó con [3H], y midiendo [32P] y [3H] en el pulmón 1 hora después de la administración para evaluar la migración del MEND modificado con GALA al pulmón.
Como se muestra en la figura 4, la migración de MEND1 al pulmón había mejorado significativamente mediante la modificación con GALA.
Ejemplo 6 Localización intrapulmonar de MEND con CLSM
Se usaron como muestras de administración MEND1 y GALA-MEND1 preparados usando ARNip marcado con Cy5. La solución de MEND1 o GALA-MEND1 (2 mg de ARNip/kg de ratón) obtenida en el ejemplo 3-1 se administró a las venas de la cola de los ratones (ICR, 5 semanas de edad, macho). Se anestesió a los ratones 1 hora después de la administración intravenosa en la vena de la cola y se les extirpó el pulmón para crear trozos de tejido pulmonar de aproximadamente varios milímetros. Los trozos creados de tejido pulmonar se colocaron en una solución de conjugado GSL I-B4 Isolectina FITC (fabricada por Funakoshi Corp.) (diluida a 20 |jg/ml usando solución salina) durante 30 minutos para permitir que la solución penetre a su través, y se observaron con CLSM.
La figura 5 muestra el resultado de la administración intravenosa en la vena de la cola de MEND1 o GALA-MEND1 que encapsulan ARNip marcado fluorescente, y evaluando la localización del MEND modificado con GALA en el pulmón 1 hora después de la administración usando un microscopio de barrido láser confocal.
Como se muestra en la figura 5, se observó que MEND modificado con GALA se acumulaba en gran medida en el pulmón y estaba co-localizado con células endoteliales vasculares.
Ejemplo 7-1 efecto de atenuación in vivo en función de la presencia o ausencia de modificación con GALA
El efecto de atenuación de tener una modificación con GALA se investigó usando MEND modificado con GALA y MEND sin modificar con GALA.
1) Preparación de la solución MEND
Usando un método similar al del ejemplo 3-1, se prepararon una solución de GALA-MEND1 y una solución de MEND1 sin modificar con GALA. Más específicamente, MEND1 se obtuvo modificando un liposoma preparado para tener una composición lipídica de DOTMA/Chol/EPC = 30/40/30, usando un 5 % en moles de STR-PEG2000 con respecto a la cantidad total de lípidos del liposoma; y GALA-MEND1 se obtuvo modificando adicionalmente MEND1 usando un 2 % en moles de Chol-GALA con respecto a la cantidad total de lípidos.
2) transfección in vivo
Las soluciones MEND (0,5-4 mg de ARNip/kg de ratón) obtenidas en 1) descritas anteriormente se administraron a las venas de la cola de los ratones (C57BL/6, 6 semanas, macho). Se eterizó a los ratones 24 horas después de la administración intravenosa en la vena de la cola, se les realizó una laparotomía y se les extirparon sus respectivos órganos (pulmón, hígado y bazo). Los órganos extirpados se sumergieron en RNAlater, se mantuvieron a 4 °C durante la noche y se almacenaron a -20 °C.
3) extracción de ARNm
Las muestras de órganos almacenadas a -20 °C se volvieron a poner a temperatura ambiente, se les ajustó su peso a 20-30 mg y se usaron para la extracción de ARN usando un mini kit de ARN y un QIAcube (fabricado por Qiagen de acuerdo con los protocolos adjuntos.
4) Transcripción inversa
Se preparó ADNc a partir de 1 jg de ARN total usando un kit de ARN a ADNc de alta capacidad de acuerdo con un protocolo adjunto. La desnaturalización y la transcripción inversa se realizaron usando un termociclador con condiciones de desnaturalización (65 °C, 5 min => 4 °C parada) y transcripción inversa (42 °C, 60 min => 95 °C, 5 min => 4 °C, parada).
5) Cuantificación de ARNm usando PCR en tiempo real
La cuantificación del ARNm (CD31) se realizó mediante el método de cuantificación relativa (método delta-delta Ct) basado en el método TaqMan. Con respecto a 5 pl de ADNc diluido a la concentración deseada, se añadieron 0,25 pl de cebador superior 100 pM, 0,25 pl de cebador inferior 100 pM, 0,0625 pl de sonda 100 pM, 6,9375 pl de DDW filtrado y 12,5 pl de 2x TaqMan M.M. A continuación, la desnaturalización inicial se llevó a cabo a 95 °C durante 10 min, la reacción de desnaturalización de PCR se llevó a cabo a 95 °C durante 15 segundos, y se llevaron a cabo 40 ciclos de PCR en los que la reacción de hibridación/extensión se llevó a cabo como un solo ciclo de 60 °C durante 1 min. Usando CD34 como un gen estándar interno, se calculó el nivel de ARNm de CD31 a partir de la cuantificación relativa usando el método delta-delta Ct.
La figura 6 muestra el resultado de la administración intravenosa en la vena de la cola de GALA-MEND1 y MEND1, y la evaluación de los respectivos efectos de atenuación de GALA-MEND1 y MEND1 en el pulmón 24 horas después de la administración usando qRT-PCR. Cabe señalar que, en la figura 6, GALA (+) muestra el resultado de GALA-MEND1 y GALA (-) muestra el resultado de MEND1.
Como se muestra en la figura 6, el efecto de atenuación en el pulmón mejoró significativamente modificando MEND con GALA.
Ejemplo 7-2 evaluación de atenuación in vivo
1) Usando un método similar al del ejemplo 7-1 de transfección in vivo, extracción de ARNm, transcripción inversa y cuantificación de ARNm con PCR en tiempo real; MEND modificado con GALA (cuya composición de lípidos en relación molar fue DOTMA/Chol/EPC = 30/40/30, y cuyo nivel de modificación de GALA fue del 2 % en moles con respecto a la cantidad total de lípidos) creado con un método similar al del ejemplo 3-1, se administró por vía intravenosa a través de las venas de la cola, y el efecto de atenuación de MEND modificado con GALA en el pulmón, el hígado y el bazo 24 horas después de la administración se evaluó con qRT-PCR.
La figura 7 muestra el resultado de la administración intravenosa en la vena de la cola del MEND modificado con GALA y la evaluación del efecto de atenuación del MEND modificado con GALA en el pulmón 24 horas después de la administración usando qRT-PCR.
La figura 8 muestra el resultado de la administración intravenosa en la vena de la cola del MEND modificado con GALA y la evaluación del efecto de atenuación del MEND modificado con GALA en el hígado 24 horas después de la administración usando qRT-PCR.
La figura 9 muestra el resultado de la administración intravenosa en la vena de la cola del MEND modificado con GALA y la evaluación del efecto de atenuación del MEND modificado con GALA en el bazo 24 horas después de la administración usando qRT-PCR.
Como se muestra en la figura 7, en comparación con AtuPLEX, que es un vehículo existente, el MEND modificado con GALA mostró un efecto de atenuación significativamente más fuerte en el pulmón.
Como se muestra en la figura 8, en comparación con AtuPLEX, que es un vehículo existente, aunque el MEND modificado con GALA mostró un efecto de atenuación en el hígado cuando se administraron 1,0-4,0 mg/kg del mismo, en comparación con la figura 7, el efecto de atenuación en el pulmón fue mucho más fuerte que en el hígado.
Adicionalmente, como se muestra en la figura 9, el MEND modificado con GALA no mostró ningún efecto de atenuación significativo en el bazo.
Ejemplo 7-3 Efectos de atenuación de MEND que tienen diferentes lípidos catiónicos
Se prepararon GALA-MEND que tenían diferentes lípidos catiónicos y se compararon los efectos de atenuación de cada uno de los GALA-MEND.
1) Preparación de los MEND
La preparación de GALA-MEND1 (cuya composición lipídica fue DOTMA/Chol/EPC/STR-PEG2000/Chol-GALA) usando DOTMA como lípido catiónico se llevó a cabo mediante un método similar al del ejemplo 3-1. La preparación de GALA-MEND3 (cuya composición lipídica fue DSTAP/Chol/EPC/STR-PEG2000/Chol-GALA) usando DSt Ap como lípido catiónico se llevó a cabo basándose en el método de preparación descrito en el ejemplo 3-1, excepto por el cambio de DOTMA a DSTAP. Adicionalmente, la preparación de GALA-MEND2 (cuya composición lipídica fue DODAP/Chol/EPC/STR-PEG2000/Chol-GALA) usando DODAP como lípido catiónico se llevó a cabo mediante un método similar al del ejemplo 3-2.
2) evaluación de atenuación in vivo
Se evaluaron los efectos de atenuación de cada uno de los GALA-MEND que tenían diferentes lípidos catiónicos obtenidos en 1) descritos anteriormente. La evaluación se llevó a cabo con un método similar al del ejemplo 7-1. La figura 10 muestra los efectos de atenuación de los GALA-MEND 1 a 3 cuando DOTMA, DODAP y DSTAP se usan como lípidos catiónicos. Cabe señalar que la dosis de administración fue de 0,5 mg de ARNip/kg.
Como se muestra en la figura 10, sin importar si el lípido catiónico era una amina terciaria o una amina cuaternaria, se demostró que los MEND tenían altos efectos de atenuación. Entre estos, se demostró que el MEND que tenía DOTMA como lípido catiónico tenía el efecto de atenuación más alto.
Ejemplo 7-4 Efectos de atenuación de MEND que tienen diferentes lípidos auxiliares
Se prepararon MEND que tenían diferentes lípidos auxiliares y se compararon los efectos de atenuación de cada uno de los MEND.
1) Preparación de los MEND
La preparación de MEND que incluyen lípidos auxiliares se llevó a cabo con un método similar al del ejemplo 3-1. Más específicamente, se prepararon liposomas que tenían DOTMA/Chol/lípido auxiliar en una relación molar de 30/40/30, y después se prepararon MEND modificados con GALA modificando los liposomas con un 5 % en moles de STR-PEG2000 y un 2 % en moles de Chol-GALA con respecto a la cantidad total de lípidos de cada uno de los liposomas.
2) evaluación de atenuación in vivo
Se evaluaron los efectos de atenuación de cada uno de los MEND modificados con GALA que tenían diferentes lípidos auxiliares. La evaluación se llevó a cabo con un método similar al del ejemplo 7-1.
La figura 11 muestra los efectos de atenuación de cada uno de los MEND modificados por GALA cuando se usaron EPC, DOPE y SOPE como lípido auxiliar. Cabe señalar que, en la figura 11, "EPC", "DOPE" y "SOPE", respectivamente, muestran MEND modificados con GALA cuyas composiciones lipídicas son DOTMA/Chol/EPC/STR-PEG2000/Chol-GALA, DOTMA/Chol/DOPE/STR-PEG2000/Chol-GALA y DOTMA/Chol/SOPE/STR-PEG2000/Chol-GALA. Adicionalmente, la dosis de administración fue de 0,5 mg de ARNip/kg.
Como se muestra en la figura 11, independientemente del tipo de lípido auxiliar, se demostró que los MEND modificados con GALA que incluyen los lípidos auxiliares tuvieron efectos de atenuación altos.
Ejemplo 8-1 Cambio de peso a partir de la administración continua de MEND durante 4 días
1) Preparación de la solución MEND
Se preparó una solución de MEND modificada con GALA de acuerdo con el método del ejemplo 3-1. Más específicamente, se estableció que la composición lipídica era DOTMA/Chol/EPC = 30/40/30 (relación molar), y el nivel de modificación con GALA con respecto a la cantidad total de lípidos se estableció en el 2 % en moles.
La solución MEND modificada con GALA creada en 1) descrita anteriormente se administró (usando una aguja hipodérmica de 27G) de forma continua durante 4 días en las venas de la cola de ratones (C57BL/6, 6 semanas, macho). El peso de cada uno de los ratones se midió todos los días desde el día de inicio de la administración hasta un día después de la administración final, y se calcularon los cambios de peso de los mismos debido a la administración continua. Cabe señalar que la dosis de administración fue de 1 o 2 mg de ARNip/kg/día.
La figura 12 muestra el cambio de peso cuando se administra de forma continua un MEND modificado con GALA durante 4 días.
Como se muestra en la figura 12, no se observó reducción de peso cuando se administraron 1 o 2 mg/kg de MEND modificado con GALA de forma continua durante 4 días.
Ejemplo 8-2 AST y ALT después de la administración continua de MEND durante 4 días
A los ratones se les administró por vía intravenosa el MEND modificado con GALA usado en el ejemplo 8-1 a través de las venas de la cola de forma continua durante 4 días, se les eterizó y se les realizó una laparotomía 24 horas después de la administración final para recoger su sangre de la vena cava caudal usando una aguja hipodérmica 23G y una jeringa de 1 ml. La sangre se dejó reposar durante 4 horas a 4 °C y se centrifugó (4 °C, 12000 rpm, 2 min) para recoger su sobrenadante como suero. Se midieron AST y ALT en el suero usando 5 pl del suero y un kit de medición de AST y ALT (prueba de la transaminasa CII, de Wako) con un método adjunto al mismo. Los resultados se muestran en la figura 13.
Como se muestra en la figura 13, dado que no se observaron cambios en AST y ALT, se consideró que el MEND modificado por GALA no causaba daño hepático un día después de la administración continua de 4 días.
Ejemplo 9 Evaluación farmacocinética de MEND modificado con PEG
Se comparó la farmacocinética del MEND modificado con GALA dependiendo de la presencia o ausencia de la modificación con PEG usando un MEND sin modificar con PEG/modificado con GALA y un MEND modificado con PEG/modificado con GALA.
Se usó el MEND creado con el método del ejemplo 3-1. El nivel de modificación de PEG con respecto a la cantidad total de lípidos se estableció como el 1 % en moles o el 5 % en moles.
La evaluación farmacocinética de MEND se llevó a cabo de acuerdo con el ejemplo 5. Cabe señalar que, las evaluaciones farmacocinéticas se llevaron a cabo mediante N = 2 para MEND sin modificar con PEG (composición lipídica: DOTMA/Chol/EPC), MEND modificado con STR-PEG2000 al 1 % (composición lipídica: DOTMA/Chol/EPC/STR-PEG2000) y MEND modificado con ceramida C8-PEG2000 al 1 % (composición lipídica: DOTMA/Chol/EPC/ceramida C8-PEG2000).
La figura 14 muestra una comparación de las tasas de migración pulmonar del MEND no modificado con PEG/modificado con GALA (composición lipídica: DOTMA/Chol/EPC/Chol-GALA) y el MEND modificado con PEG/modificado con GALA (composición lipídica: DOTMA/Chol/EPC/STR-PEG2000/Chol-GALA y DOTMA/Chol/EPC/C8 ceramida-PEG2000/Chol-GALA).
Como se muestra en la figura 14, se observó un alto nivel de migración pulmonar incluso cuando MEND modificado con GALA se modificó con STR-PEG y ceramida C8-PEG.
Ejemplo 10 Efecto de atenuación de MEND modificado con PEG
Los efectos de atenuación del MEND modificado con GALA dependiendo de la presencia o ausencia de modificación con PEG se compararon usando el MEND sin modificar con PEG/modificado con GALA y el MEND modificado con PEG/modificado con GALA.
Como MEND, se usaron MEND sin modificar con PEG/modificado con GALA y MEND modificado con PEG/modificado con GALA usados en el ejemplo 9. Más específicamente, se usaron STR-PEG2000 y ceramida C8-PEG2000 como PEG, y el nivel de modificación con PEG con respecto a la cantidad total de lípidos fue del 1 % en moles y el 5 % en moles. Se usó un método similar al del ejemplo 7-1 para la evaluación de atenuación por MEND. Cabe señalar que la dosis de administración fue de 1 mg de ARNip/kg. La figura 15 muestra una comparación de los efectos de atenuación del MEND no modificado con PEG/modificado con GALA y el MEND modificado con PEG/modificado con GALA.
Como se muestra en la figura 15, se obtuvo un alto efecto de atenuación incluso cuando el MEND modificado con GALA se modificó con STR-PEG2000 y ceramida C8-PEG2000; y fue posible suprimir la agregación del MEND modificado con GALA mediante la modificación con PEG.
Ejemplo 11 Efecto de atenuación de MEND modificado con PEG después de haber sido almacenado durante cierto período de tiempo
A continuación, se compararon los efectos de atenuación del MEND no modificado con PEG/modificado con GALA y el MEND modificado con PEG/modificado con GALA después de haber sido almacenados durante un cierto período de tiempo.
Como MEND modificado con GALA, se usaron MEND sin modificar con PEG/modificado con GALA y MEND modificado con PEG/modificado con GALA usados en el ejemplo 9. Cabe señalar que se usó STR-PEG2000 como PEG, y el nivel de modificación con PEG con respecto a la cantidad total de lípidos fue del 5 % en moles. Los MEND se almacenaron durante 16 días a temperatura ambiente en una solución de HBG (pH 7,4). Se usó un método similar al del ejemplo 7-1 para la evaluación de atenuación de los MEND. Cabe señalar que la dosis de administración fue de 1 mg de ARNip/kg. La evaluación de atenuación de los MEND almacenados durante 16 días se realizó mediante N=2. La figura 16 muestra los efectos de atenuación del MEND no modificado con PEG/modificado con GALA y el MEND modificado con PEG/modificado con GALA almacenados a temperatura ambiente durante 16 días.
Como se muestra en la figura 16, se demostró que el MEND modificado con STR-PEG2000/modificado con GALA tenía un alto efecto de atenuación en el pulmón incluso después de haber sido almacenado a temperatura ambiente durante 16 días.
Ejemplo 12 Estabilidad en almacenamiento de MEND modificado con GALA
A continuación, se examinó la influencia de cambiar el lípido auxiliar sobre las propiedades físicas del MEND modificado con GALA usando la presencia o ausencia de agregación del MEND modificado con GALA después de haber sido mantenido a temperatura ambiente durante 1 mes.
El MEND modificado con GALA usado se creó mediante el método del ejemplo 3-1, un método basado en el mismo, 0 una combinación de éstos y un método comúnmente usado en la técnica. El MEND se almacenó en solución de HBG durante 1 mes a temperatura ambiente. Las características del MEND después de mantenerse a temperatura ambiente durante 1 mes se muestran en la figura 17. Cabe señalar que, en la figura 17, "EPC", "DLPC", "DMPC", "DPPC", "DSPC", "POPC", "DOPC" y "DOPE", respectivamente, muestran liposomas que tienen composiciones lipídicas de DOTMA/Chol/EPC/STR-PEG2000/Chol-GALA, DOTMA/Chol/DLPC/STR-PEG2000/Chol-GALA, DOTMA/Chol/DMPC/STR-PEG2000/Chol-GALA, DOTMA/Chol/DPPC/STR-PEG2000/Chol-GALA, D0TMA/Chol/DSPC/STR-PEG2000/Chol-GALA, DOTMA/Chol/POPC/STR-PEG2000/Chol-GALA, DOTMA/Chol/DOPC/STR-PEG2000/Chol-GALA y DOTMA/Chol/DOPE/STR-PEG2000/Chol-GALA.
Como se muestra en la figura 17, cuando se usó EPC, DLPC, POPC o DOPC como lípido auxiliar, no se observó agregación del MEND modificado con GALA después de haber sido mantenido a temperatura ambiente durante 1 mes; y cuando se usó DOPE como lípido auxiliar, solo se observó una ligera agregación del MEND modificado con GALA después de haber sido mantenido a temperatura ambiente durante 1 mes.
Ejemplo 13 Influencia del nivel de modificación con GALA sobre la atenuación in vivo
Usando MEND que tienen diferentes niveles de modificación con GALA, se evaluó la influencia del nivel de modificación con GALA sobre el efecto de atenuación. Más específicamente, usando un método similar al del ejemplo 7-1 de transfección in vivo, extracción de ARNm, transcripción inversa y cuantificación de ARNm con PCR en tiempo real; MEND modificados con GALA, (cuya composición lipídica en relación molar fue DOTMA/Chol/EPC = 30/40/30, y, con respecto a la cantidad total de lípidos del liposoma, cuyo nivel de modificación con STR-PEG2000 fue del 5 % molar y cuyos niveles de modificación con GALA fueron del 1 al 4 % en moles) creados con un método similar al del ejemplo 3-1, se administraron por vía intravenosa a través de las venas de la cola y los efectos de atenuación de los MEND modificados con GALA en el pulmón 24 horas después de la administración se evaluaron con qRT-PCR. La figura 18 muestra el resultado de la administración intravenosa en la vena de la cola de MEND con diferentes niveles de modificación con GALA, y la evaluación de los efectos de atenuación de cada uno de los MEND con diferentes niveles de modificación con GALA en el pulmón 24 horas después de la administración, usando qRT-PCR.
Como se muestra en la figura 18, el efecto de atenuación en el pulmón mejoró mediante la modificación con GALA del 1 al 4 % en moles y, en particular, el efecto de atenuación en el pulmón tuvo la mejora más alta mediante la modificación con GALA del 1,5 al 2 % en moles.
Ejemplo 14 Efecto antitumoral de la administración de MEND en un modelo de cáncer con metástasis pulmonar de melanoma
1) Preparación de soluciones MEND
Usando un método similar al del ejemplo 3-1, se prepararon una solución de MEND modificada con GALA y una solución de MEND sin modificar con GALA. Su composición lipídica en relación molar fue DOTMA/Chol/EPC = 30/40/30 y, con respecto a la cantidad total de lípidos del liposoma, el nivel de modificación con STR-PEG2000 fue del 5 % en moles y el nivel de modificación con GALA fue del 2 % en moles.
2) Creación de un modelo para el cáncer con metástasis pulmonar de melanoma
Células de melanoma de ratón B16-F10 (B16-F10-luc2: Caliper Life Sciences, MA, Estados Unidos.) con expresión estable de luciferasa (GL4) se cultivaron durante 48 horas en un medio RPMI-1640 que contenía FBS al 10 %. A los ratones (C57BL/6, 6 semanas, macho) se les administraron las células B16-F10-luc2 (2x105 células/100 |jl) a través de las venas de la cola para crear un modelo de cáncer con metástasis pulmonar de melanoma (día 0).
3) Administración de MEND al modelo de cáncer con metástasis pulmonar melanoma
Se administró MEND modificado con GALA que encapsula ARNip de control (anti-Luc (GL3)) o ARNip anti-CD31 (1 mg de ARNip/kg de ratón) a los ratones modelo cada tres días a partir del día siguiente después del trasplante de células B16-F10-luc2. A los ratones se les realizó una laparotomía 17 días después del trasplante del tumor y se les extirparon los pulmones. Los pulmones extirpados se dividieron cada uno en dos partes, una para la evaluación de la metástasis pulmonar del tumor y otra para la evaluación del nivel de expresión del ARNm de CD31. Cabe señalar que se controló el peso corporal de los ratones durante el período de administración de MEND.
4) Evaluación cuantitativa de metástasis pulmonar tumoral
La muestra pulmonar extirpada se colocó en un tubo auxiliar, se le había añadido 1 ml de tampón de lisis in vivo, y se homogeneizó usando un homogeneizador POLYTRON (fabricado por KINEMATICA AG). El homogeneizado se recuperó en un tubo de muestra y se centrifugó (4 °C, 13.000 rpm, 10 minutos). Se mezclaron 50 j l de sustrato de ensayo de luciferasa con 20 pl del sobrenadante y se midió la actividad de luciferasa usando un luminómetro (Luminescencer-PSN, fabricado por ATTO Corp.). La actividad de luciferasa (URL/pulmón) se calculó como unidades relativas de luz (URL) con respecto a todo el pulmón. Los resultados se muestran en la figura 19.
5) Evaluación del nivel de expresión de ARNm de CD31
Usando un método similar al del ejemplo 7-1, se calcularon los niveles de ARNm de CD31 en los pulmones extirpados. El resultado se muestra en la figura 20.
Como se muestra en la figura 19, mediante la administración del MEND modificado con GALA que encapsula ARNip anti-CD31, el progreso de la metástasis pulmonar se suprimió significativamente en comparación con el grupo no tratado y el grupo al que se administró ARNip de control. Adicionalmente, como se muestra en la figura 20, mediante la administración del MEND modificado con GALA que encapsula ARNip anti-CD31, el nivel de expresión del ARNm de CD31 se suprimió significativamente en comparación con el grupo no tratado y el grupo al que se administró ARNip de control.
Hasta el momento, se ha informado que la inactivación de CD31 o la administración de anticuerpos anti CD31 inhibe la angiogénesis en los tejidos tumorales, lo que da como resultado la supresión de la progresión de la metástasis pulmonar del melanoma (Proc Natl Acad Sci U S A.26 de octubre de 2010; 107 (43): 18616-21). Se cree que el efecto de supresión de la progresión de la metástasis pulmonar obtenido al administrar el MEND modificado con GALA obtenido aquí se atribuye a la inhibición de la angiogénesis en los tejidos tumorales de metástasis pulmonar debido a la atenuación del ARNm de CD31.
Cabe señalar que, dado que no se ha observado reducción de peso causada por la administración de MEND modificado con GALA al ratón modelo para metástasis pulmonar, se sugirió que el MEND modificado con GALA puede usarse para tratar metástasis pulmonar sin mostrar toxicidad.
A partir de estos resultados, se observó que un liposoma modificado con GALA migra específicamente al pulmón.
Adicionalmente, se observó que un liposoma modificado con GALA que encapsula ARNip tiene un efecto de atenuación eficaz en el pulmón.
Adicionalmente, dado que no se observaron reducción de peso ni daño hepático incluso cuando se administró el MEND modificado con GALA, se confirmó que la administración se puede realizar de forma segura.
A partir de los resultados anteriores, quedó claro que el vector modificado con el péptido GALA es útil como vehículo para administrar específicamente una sustancia prevista al pulmón y como vehículo para administrar específicamente, preferentemente, un medicamento, y más preferentemente un medicamento de ácido nucleico tal como ARNip al pulmón.
Los liposomas (MEND) obtenidos en los ejemplos como agente de introducción de sustancias tenían un tamaño medio de aproximadamente 90 a 170 nm y un potencial zeta dentro de un intervalo de -50 a 50 mV.
Los tamaños y el potencial zeta de los liposomas preparados en los ejemplos 1 y 3 se muestran, respectivamente, en la tabla 2 y la tabla 3.
Tabla 2
Tamaño y potencial zeta de liposomas preparados en el ejemplo 1.
Tipo de Liposoma Composición lipídica Propiedades fisicoquímicas Tamaño potencial Z (mV) (nm)
Liposoma EPC/Colesterol = 7:3 100 ± 3 -7±1
GALA-Liposoma EPC/Colesterol=7:3. GALA 2% en 67±3 -23±3
moles

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende un péptido GALA representado por el SEQ ID NO: 1 y una sustancia prevista para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad pulmonar, en donde el péptido GALA se usa como un elemento migratorio pulmonar de un vector para administrar dicha sustancia a un pulmón.
2. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el péptido GALA está unido a un componente del vector.
3. La composición para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde el vector incluye un lípido y/o un colesterol, y el péptido GALA está unido a un lípido catiónico y/o un colesterol.
4. La composición para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde el vector incluye un lípido catiónico y/o un colesterol, y el péptido GALA está unido a un lípido catiónico y/o un colesterol.
5. Un agente de introducción de sustancias cuya diana es un pulmón, teniendo el agente una sustancia prevista encapsulada en un vector e incluyendo vector un péptido GALA representado por el SEQ ID NO: 1, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad pulmonar.
6. El agente de introducción de sustancias para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el péptido GALA está unido a un componente del vector.
7. El agente de introducción de sustancias para uso de acuerdo con las reivindicaciones 5 o 6, en donde el vector incluye un lípido y/o un colesterol, y el péptido GALA está unido a un lípido catiónico y/o un colesterol.
8. Un vector y una sustancia prevista para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad pulmonar, comprendiendo el vector un péptido GALA representado por el SEQ ID NO: 1 como un elemento para administrar selectivamente la sustancia prevista a un pulmón.
9. El vector para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el vector incluye un lípido y/o un colesterol, y el péptido Ga La está unido a un lípido catiónico y/o un colesterol.
10. El vector para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 8 o 9, en donde el vector incluye un lípido catiónico y el lípido catiónico incluye al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en DOTMA, DSTAP y DODAP.
11. El vector para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde el vector está modificado con un polímero hidrófilo seleccionado del grupo que consiste en polialquilenglicol, dextrano, pululano, ficoll, alcohol polivinílico, copolímero alterno de estireno - anhídrido maleico, copolímero alterno de éter divinílico -anhídrido maleico, amilosa, amilopectina, quitosano, manano, ciclodextrina, pectina y carragenina.
12. El vector para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, que comprende además un lípido auxiliar, y el lípido auxiliar es EPC, DOPC, DOPE o SOPE.
13. El vector para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde:
el vector es un liposoma que incluye, como componente de la membrana lipídica, DOTMA, Chol y EPC; una composición lipídica (relación molar) del liposoma con respecto a DOTMA/Chol/EPC es de 10 a 50/20 con respecto a de 50/20 a 70; y el liposoma incluye además STR-PEG2000 en del 1 al 15 % en moles y Chol-GALA en del 0,1 al 5 % en moles con respecto a la cantidad total de lípidos de DOTMA/Chol/EPC.
14. Un vector para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad pulmonar, comprendiendo el método administrar a un mamífero dicho vector, en donde el vector tiene encapsulada en su interior la sustancia prevista y tiene, unido a la misma, un péptido GALA representado por el SEQ ID NO: 1.
15. Uso de un péptido GALA representado por el SEQ ID NO: 1 como un elemento migratorio pulmonar de un vector para administrar una sustancia prevista a células pulmonares o a un pulmón, en donde dicho uso no es un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia.
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