WO2018088719A1 - Kras를 표적으로 하는 핵산 함유 약제학적 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

Kras를 표적으로 하는 핵산 함유 약제학적 조성물 및 그 제조방법 Download PDF

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WO2018088719A1
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nucleic acid
acid
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손지연
남혜영
최지혜
이소진
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주식회사 삼양바이오팜
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Definitions

  • lipid-nucleic acid complex which combines cationic lipids with nucleic acids to form nucleic acids and delivers nucleic acids into cells, is widely used in cell line experiments. It is impossible to use in vivo because it does not show a structure that can have stability in bloodemia (see US Pat. No. 6.458.382).
  • amphiphilic block copolymer is a certified program ⁇ o molecules assuming its handmade therein the US _ i to cell type name ⁇ eu - a small number of eu castle-I stand but can solubilize insoluble drugs.
  • Hydrophilic drugs such as nucleic acids with negative ions can not be encapsulated inside the polymer micelles. It is not suitable for the delivery of anionic drugs containing these nucleic acids. Therefore.
  • Anionic drug delivery compositions have been disclosed that form complexes by electrostatic interaction of nucleic acids with cationic lipids so that the complexes are encapsulated within the micellar structure of the amphiphilic block copolymer. But. Again, there is room for improvement in the blood stability of the nucleic acids and the specific targeting to cancer tissues.
  • Korean Patent No. U296326 discloses an anionic drug as an active ingredient
  • Cationic Lipids an amphiphilic block copolymer and a polylactic acid, wherein the anionic drug forms a complex with the cationic lipid, the complex encapsulated inside a micellar structure formed by the amphiphilic block copolymer and polylactic acid
  • a composition for anionic drug delivery characterized in that it has a structure.
  • the polylactic acid used in this patent is a general polylactic acid polymer having a carboxyl group at its terminal, and has a problem of insufficient drug delivery effect.
  • siRNA shor't interfering RNA
  • siRNAs are short, double-stranded RNA strands that inhibit the expression of genes by cleaving mRNAs of genes complementary to them (McManus and Sharp. Nature Rev. Genet. 3: 737 (2002); Elbashir. et. al. Genes Dev. 15: 188 (2001)).
  • siRNAs are known to be rapidly degraded in the blood by nucleases and rapidly excreted in vitro through the kidneys.
  • siRNA is known to have a strong negative charge does not easily cross the cell membrane.
  • the siRNA during anterior ⁇ in the liquid and eu 7 ⁇ , aimed eu _ ginseng eu crude or in order to use the siRNA as a therapeutic agent years - can be passed efficiently into the capsule, there is a need for the development of not exhibiting toxic carrier.
  • Ras signaling dysregulation as a therapeutic target can cause tumor growth and metastasis (Goodsell DS. Oncologist 4: 263-4). 20-25% of all human tumors are estimated to contain activation mutations in Ras; For certain tumor types, this phenomenon is as high as 90% (Downward J. Nat Rev Cancer, 3: 11-22). Thus, Ras gene family members are attractive molecular targets for cancer therapeutic design.
  • Three human RAS genes are highly related 188-189 Amino acid protein encoded and designated H-Ras. N-Ras and K-Ras4A (KRAS subtype) and K-Ras4B (KRAS subtype b: two KRas proteins are caused by alternative gene splicing. The Ras protein functions as a binary molecular switch.
  • Ras-regulated signaling pathways regulate processes such as actin cytoskeletal integrity, proliferation, differentiation, cell adhesion, apoptosis and cell migration Ras and Ras-related proteins often Inhibits cancer (deregulated in cancers), increases invasion and metastasis, reduces apoptosis Ras activates many pathways, but one that is particularly important in tumorigenesis is another protein kinase and gene regulatory protein It appears to be a mitogen-activated protein (MAP) kinase that carries a signal downstream for.
  • MAP mitogen-activated protein
  • KRAS-related diseases using RNAi agents for therapeutically effective amounts of KRAS Such as solid or liquid cancer adenocarcinoma. Colorectal cancer, advanced and / or metastatic colorectal cancer. Colon cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer and lung adenocarcinoma. Acute myeloid lung cancer. Bladder cancer, brain cancer, breast cancer, cervical cancer, endometrial cancer. Stomach cancer. Head and neck cancer. Kidney cancer: leukemia, myelodysplastic syndrome, myeloid leukemia, liver cancer. Melanoma. Ovarian Cancer. Colon cancer. Prostate cancer. Testicular cancer.
  • RNAi agents useful in the treatment of proliferative diseases including thyroid cancer, and symptom--face-skin (CFC) syndromes and nunan syndromes, and similar and related diseases are disclosed.
  • CFC symptom--face-skin
  • the patent only describes RNAi agents for KRAS. There is no disclosure or suggestion of a carrier for delivering it in vivo. [Detailed Description of the Invention]
  • nucleic acid delivery composition for targeting KRAS which comprises a milar structure capable of effectively delivering a nucleic acid to a KRAS-targeting nucleic acid ol body.
  • the present invention provides a method for preparing a pharmaceutical composition capable of effectively delivering a nucleic acid targeting KRAS to the body.
  • Advantageous Effects A pharmaceutical composition for nucleic acid delivery targeting KRAS according to the present invention. Cationic compounds.
  • a micelle structure formed of an amphiphilic block polymer and polylactic acid to isolate the nucleic acid targeting the KRAS from the outside, it is possible to increase the stability in the blood serum or body fluid of the nucleic acid targeting the KRAS.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can enhance the stability of the blood black and white body fluids of the nucleic acid targeting KRAS when administered to the body, and particularly, the nucleic acid targeting the KRAS is effectively delivered into cells by avoiding the reticuloendothelial system.
  • the advantage is that it can be.
  • FIG. 1 is a view showing a schematic structure of a polymer micelle delivery vehicle containing a complex of a nucleic acid and a cationic compound targeting KRAS according to the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing an NMR result of polylactic acid natrim salt according to Preparation Example 8.
  • Figure 3 shows the KRAS s iRN / Vd i o—TETA / mPEG-PLA-Tocope of Example 1 / PLANa.
  • / DOPE is a graph showing the effect of polymer nanoparticles in xenograft tumor models.
  • FIG. 4 and 5 are photographs and graphs showing the effects of in situ tumor models of KRAS si RN / Vdio-TETA / mPEG-PLA—tocopherol / PLANa / DOPE polymer nanoparticles of Example 1.
  • FIG. 4 and 5 are photographs and graphs showing the effects of in situ tumor models of KRAS si RN / Vdio-TETA / mPEG-PLA—tocopherol / PLANa / DOPE polymer nanoparticles of Example 1.
  • 6 to 8 are photographs and graphs showing the effect of KRAS s iRNA s li o-TETA / mPEG-PLA-tocope in the KRAS G12D genetically engineered mouse model of / PLANa / DOPE polymer nanoparticles.
  • a nucleic acid delivery composition targeting KRAS comprising a MIEL structure according to the present invention is a structure in which a complex of a nucleic acid and a cationic compound is contained in a micelle structure of an amphiphilic block copolymer and a polylactic acid salt, specifically
  • Amphiphilic unspecific copolymers and s , ⁇ ⁇ L n
  • nucleic acid targeting the KRAS forms a complex by electrostatic interaction with the cationic compound, and the complex thus formed is encapsulated inside a micellar structure formed by an amphiphilic block copolymer and a polylactic acid salt. It is characterized by.
  • the composition is soluble in water and includes polylactic acid as a component that forms a micelle structure, thereby increasing blood stability and avoiding reticulum endothelial system (RES) during injecting the body, specifically, cancer tissue. Because the transmission efficiency to is excellent. It is also useful for avoiding reticulum endothelial system (RES) and / or enhancing targeting.
  • RES reticulum endothelial system
  • step (b) lyophilizing the mixture obtained in step (a);
  • step (c) dissolving the lyophilisate obtained in step (b) in an organic solvent
  • step (d) mixing the solution obtained in step (c) with an aqueous solvent;
  • the nucleic acid and the cationic compound that targets the KRAS is encapsulated inside a micellar structure formed of an amphiphilic block polymer and a polylactic acid salt.
  • Figure 1 shows the approximate structure of a polymer unsealed carrier in which a complex of a nucleic acid and a cationic compound targeting such KRAS is encapsulated.
  • nucleic acids targeting KRAS bind to each other through electrostatic interaction with a bistable compound to form a bistable compound complex with a nucleic acid targeting KRAS.
  • the targeted nucleic acid and cationic compound complex is enclosed in a micellar structure formed by an amphiphilic block copolymer and a polylactic acid salt.
  • the chute structure formed by the amphiphilic block copolymer and the polylactic acid salt has a hydrophilic portion of the amphiphilic block co-polymer in the aqueous environment forming the outer wall of the milar, and the hydrophobic portion of the amphiphilic block copolymer and the amphiphilic block copolymer
  • the polylactic acid salt contained as a separate component forms the inner wall of the micelle, and the nucleic acid and cationic compound complexes that target KRAS in the formed micelle are encapsulated.
  • the nucleic acid and cationic compound complexes targeting the KRAS maintain the state encapsulated in the micellar structure formed by the amphiphilic block copolymer and the polylactic acid salt, thereby improving stability in blood or body fluids.
  • the particle size of the micelles 10 to 200 nm. More specifically, it is good that it is 10-150 nm.
  • the standard charge of the micelle particles is -20 to 20 mV. More specifically, it is good that it is -10 to 10 mV.
  • the particle size and standard charge are most preferred in terms of the stability of the mial structure and the content of constituents and the absorbency of nucleic acids targeting KRAS in the body and the convenience of sterilization as pharmaceutical compositions.
  • nucleic acid deoxyribonucleic acid, ribonucleic acid.
  • a nucleic acid drug such as a backbone, a polynucleotide derivative whose sugar or base is chemically modified or modified at its ends. More specifically RNA. DNA, siRNA (short interfering RNA). Aptamer.
  • Antisense 0DN anti i sense oligonucleotide
  • It may be one or more nucleic acids selected from the group consisting of antisense RNA (ant i sense RNA), ribozyme (r ibozyme), DNAzyme (DNAzyme) and the like.
  • the nucleic acid may be chemically modified or modified at its backbone, sugar or base for the purpose of increasing blood stability or weakening immune response. Specifically, a portion of the phosphodiester bond of the nucleic acid is replaced by a phosphorothioate or boranophosphate bond, or a methyl group at the 2'-0H position of some ribose base. Methoxyethyl group. It may include one or more modified nucleotides introduced with various functional groups, such as fluorine. Also. One or more termini of the nucleic acid may be modified with one or more selected from the group consisting of cholester, tocope and fatty acids having 10 to 24 carbon atoms. For example, siRNA can be modified at the 5 'end, or 3' end, or both ends of the sense and / or antisense strand, and preferably at the end of the sense strand.
  • the cholesterol, tocope and fatty acids having 10 to 24 carbon atoms are cholester, tocopherol and each analog of fatty acid. Derivatives, and metabolites.
  • the siRNA is a double-stranded RNMduplex RNA) capable of reducing or inhibiting expression of the target gene by mediating the degradation of the niRNA complementary to the sequence of the siRNA when present in the same cell as the target gene, or inside the single stranded RNA.
  • RNMduplex RNA a double-stranded RNMduplex RNA
  • the bond between yijeung strand is made by hydrogen bonds between nucleotides and are therefore not to all nucleotides within a double-stranded be coupled to each other complementarily. Both strands may or may not be separated. In one aspect.
  • the length of the siRNA is about 15 to 60 (the number of single nucleotides of the double stranded RNA, ie, the number of base pairs. In the case of a single stranded RNA, the single group : the length of the double strand inside the stranded RNA) Nucleotides, specifically. About 15 to 30 nucleotides. More specifically, siRNA, which is about 19 to 25 nucleotides.
  • Double-stranded siRNA has an overhang of 1-5 nucleotides at the 3 'or 5' end at one end. Or at both ends. In another example, both ends may be blunt without protrusions.
  • US Patent Publication No. 2002-0086356 SiRNA disclosed in U.S. Patent No. 056.704, which is incorporated herein by reference.
  • the siRNA may have a structure in which two strands have the same length, or an asymmetric double strand structure in which one strand is shorter than the other strand.
  • Antisense of 19 to 21 nucleotides (luicleotide, nt); And a 15 to 19 nt sense: having a sequence complementary to the antisense: a double stranded siRNA As a small interfering RNA molecule.
  • the siRNA may be an asymmetric siRNA having a blunt end at the 5 'end of the antisense and a 1-5 nucleotide overhang at the 3' end of the antisense. Specifically, it may be siRNA disclosed in International Patent Publication No. 09/078685.
  • SiRNAs targeting KRAS are those described in International Publication No. W02013 / 166004. For example, but may have a sequence shown in Table 1 of WO02013 / 166004. It is not limited to that of a particular sequence (these documents are incorporated herein by reference).
  • siRNAs targeting KRAS used in the present invention consist of the sense sequence of SEQ ID NO: 1 and the antisense sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the scope of the present invention is not limited to this.
  • the nucleic acid targeting KRAS is preferably included in 0.001 to 10% by weight, specifically 0.01 to 5% by weight, based on the total weight of the composition. If the content of the nucleic acid targeting the KRAS is less than 0.001% by weight, the amount of the carrier used may be too high compared to the drug, which may have side effects due to the carrier. K) if the weight% is exceeded. The size of the scallop is too large to reduce the stability of the micelle, there is a fear that the loss rate during sterilization of the filter.
  • the bivalent silver compound binds by electrostatic interaction with a nucleic acid targeting KRAS to form a complex.
  • the complex is encapsulated within the micellar structure of the amphiphilic block copolymer.
  • the cationic compound is. Includes all forms of compounds capable of forming complexes by electrostatic interaction with nucleic acids targeting KRAS, for example. It may be a lipid and a polymer type. Cationic lipids. N, N-dialeil— N, N—dimethylammonium chloride (D0DAC).
  • DDAB N.N ⁇ distearyl -N.N-dimethylammonium bromide
  • D0TAP N.N-trimethylammonium chloride
  • D0DMA N-dimethyl- (2.3-dioleoyloxy) propylamine
  • D0TMA Monotrimethyl- (2,3-dioleoyloxy) propylamine
  • TAP 1,2-diacyl-3-trimethylammonium-propane
  • DAP 1,2-diacyl-3-dimethylammonium-propane
  • Cholesteryloxypropane-1-amine (COPA), N- (N'-aminoethane) carbamoylpropanoic tocope (AC-tocope) and ⁇ — ( ⁇ '—methylaminoethane) carbamoyl Propanoic tocope may be one or a combination of two or more selected from the group consisting of (MC-tocope).
  • MC-tocope Cholesteryloxypropane-1-amine
  • AC-tocope N- (N'-aminoethane) carbamoylpropanoic tocope
  • ⁇ — ( ⁇ '—methylaminoethane) carbamoyl Propanoic tocope may be one or a combination of two or more selected from the group consisting of (MC-tocope).
  • MC-tocope methylaminoethane
  • ⁇ It may be one or more selected from the group consisting of ⁇ , ⁇ -trimethyl-(2,, 3-dioleoyloxy) propylamine (D0TMA).
  • cationic polymers include chitosan, glycol chitosan, protamine. Polylysine. Polyarginine. Polyamidoamine (PAMAM). Polyethyleneimine (polyethylenimine), textran (dextran), hyaluronic acid, albumin (albumin). And is selected from the group consisting of high molecular polyethyleneimine (PEI), polyamine and polyvinylamine (PVAm). Preferably it may be at least one selected from the group consisting of polymer polyethyleneimine (PEI), polyamine and polyvinylamine (PVA).
  • the cationic lipid may be a cationic lipid of Formula 7:
  • n and ill are 0 to 12, respectively. 2 ⁇ n + m ⁇ 12, and a and b are each 1 to
  • R1 and R2 are each independently selected from the group consisting of saturated and unsaturated hydrocarbons having 11 to 25 carbon atoms.
  • n and m are independently 1 to 9, and 2 ⁇ n + m ⁇ 10.
  • a and b may be 2 to 4.
  • ⁇ and R2 are Each independently. Lauryl, myristyl, palmityl. Stearyl, arachidyl. Behenyl, lignoceryl. Cerotyl myristoleyl, palmi toleyl. Sapienyl. Oleyl. Linoleyl. Arachidonyl, eicosapentaenyl, erucyl, docosahexaenyl. And it may be selected from the group consisting of cerotyl (cerotyl).
  • cationic lipids are 1.6-dioleoyltriethylenetetramide,
  • It may be one or more selected from the group consisting of 1, 10- distearoyl pentaethylene nucleamide and 1,10-dioleoyl pentaethylene nucleamide.
  • the cationic compound used in the present invention may be included in an amount of 0.01 to 50% by weight, specifically 0.1 to 10% by weight, based on the total amount of the composition. If the amount of dilute lipid is less than 0.01% by weight, the amount is not sufficient to form a complex with siRNA targeting KRAS, and if it exceeds 50% by weight. The size of the micelle is too large to reduce the stability of the micelle, there is a fear that the loss rate during filter sterilization increases.
  • the cationic compound and the nucleic acid targeting KRAS are bound through electrostatic interactions. To form a complex.
  • the ratio of the charge amount of the nucleic acid (P) and the cationic compound (N) that targets the KRAS (N / P: the ratio of the positive charge of the cationic compound to the anionic charge of the nucleic acid that targets the KRAS) is 0.1 to It is 128, specifically 0.5-64, More specifically, it is 1-32, More preferably, it is 1-24, Most preferably, it is 6-24.
  • the amphiphilic block copolymer is.
  • A-B type block copolymers comprising hydrophilic A blocks and hydrophobic B blocks.
  • the A-B type unspecific copolymer is in an aqueous solution.
  • Hydrophobic B blocks form a core (inner wall) and hydrophilic A blocks form a shell (outer wall) to form a core-shell type polymer micelle.
  • the hydrophilic A block is polyalkylene glycol, polyvinyl alcohol. Composed of polyvinylpyridone, polyacrylamide and derivatives thereof It may be one or more selected from the group. More specifically.
  • the hydrophilic A block is monomethoxy polyethylene glycol, monoacetoxy polyethylene glycol. Polyethylene glycol. It may be at least one selected from the group consisting of a copolymer of polyethylene and propylene glycol and polyvinylpyridone.
  • the hydrophilic A block may have a number average molecular weight of 200 to 50, 000 Daltons, more specifically 1,000 to 20, 000 Daltons, even more specifically 1.000 to 5,000 Daltons.
  • the functional group or ligand is a monosaccharide. Polysaccharides, vitamins. Peptides. It may be one or more selected from the group consisting of antibodies to proteins and cell surface receptors. More specifically, the functional group or ligand is aniamide (anisamide), vitamin B9 (folic acid), vitamin B12. Vitamin A, galactose, lactose, mannose hyaluronic acid. RGD peptide, NGR peptide. It may be one or more selected from the group consisting of transferrin and antibodies to transferrin receptor.
  • the hydrophobic B block is a biocompatible biodegradable polymer. In one embodiment, it may be one or more selected from the group consisting of polyesters, polyanhydrides, polyamino acids, polyorthoesters, and polyphosphazines. More specifically.
  • the hydrophobic B block is polylactide. Polyglycolide. Polycaprolactone, Polydioxane— 2 zion, a copolymer of polylactide and glycolide. It may be at least one selected from the group consisting of a copolymer of polylactide and polydioxane 2-one, a copolymer of polylactide and polycaprolactone, and a copolymer of polyglycolide and polycaprolactone.
  • the hydrophobic B block has a number average molecular weight of 50 to 50.000 Daltons. More specifically 200 to 20.000 daltons. More specifically, it may be 1,000 to 5,000 Daltons. Also. Tocope, cholesterol, or to increase the hydrophobicity of the hydrophobic bltok to improve the stability of the micelles. Fatty acids having 10 to 24 carbon atoms may be chemically bonded to the hydrophilic group at the end of the hydrophobic block.
  • the content of the amphiphilic block copolymer comprising the hydrophilic block (A) and the hydrophobic block (B) is based on the total dry weight of the composition. 40 to 99.98 weight percent. Specifically, it is good that it is 85-99.8 weight%, More specifically, it is 90-99.8 weight%. If the content of the amphiphilic block copolymer is less than 40% by weight, the size of the micelle is too large to reduce the stability of the micelle and the loss rate during filter sterilization may increase, if the content exceeds 99.98% by weight KRAS that can be incorporated The target nucleic acid content becomes too low.
  • the composition ratio of hydrophilic blotok (A) and hydrophobic block (B) is. Based on the weight of the copolymer, the hydrophilic bloth (A) may range from 40 to 70 weight percent, specifically from 50 to 60 weight percent. If the ratio of the hydrophilic block (A) is less than 40% by weight, the polymer has a low solubility in water and is difficult to form Miel, so that the copolymer has a solubility in water sufficient to form micelles.
  • the ratio of is greater than or equal to 40% by weight, but if it exceeds 70% by weight, the hydrophilicity is so high that the stability of the polymer micelle is low, making it difficult to use as a solubilizing composition of the nucleic acid / cationic lipid complex that targets K AS.
  • the proportion of hydrophilic blotting (A) is preferably 70% by weight or less.
  • amphiphilic block copolymer is in an aqueous solution phase
  • the nucleic acid and cationic lipid complexes targeting KRAS are encapsulated inside the micelle structure, wherein the weight (a) ratio of the nucleic acid and cationic lipid complexes targeting KRAS to the weight of the amphiphilic block copolymer (b.). [a / b X 100; (nucleic acid weight + cationic lipid increase targeting KRAS) / amphiphilic unspecific copolymer increase X 100].
  • 0.001 to 100% by weight, specifically 0.01 to 50% by weight may be specifically 0.1 to 10% by weight.
  • the content of the nucleic acid and cationic lipid complexes targeting KRAS is too low, so that it is difficult to satisfy the effective content of the nucleic acid targeting KRAS effectively.
  • examples include the molecular weight of amphiphilic block copolymers and nucleic acids and lipids targeting KRAS. Given the amount of complexes, they do not form a Miel structure of the appropriate size.
  • the micellar structure of the composition according to the invention is characterized in that it comprises polylactic acid salt (PIlANa).
  • the polylactic acid salt is distributed in the core (inner wall) of the micelles to enhance the hydrophobicity of the cores to stabilize the micelles and to effectively avoid the reticulum endothelial system (RES) in the body.
  • RES reticulum endothelial system
  • the carboxylic acid anion of polylactic acid is more effectively combined with the cationic complex than polylactic acid to reduce the surface potential of the polymer micelles, resulting in a decrease in the positive charge of the surface potentials compared to the polymer Miel, which does not contain polylactic acid. Being less captured by. For this reason, there is an advantage in that the delivery efficiency to a desired site (eg, cancer cells, inflammatory cells, etc.) is excellent.
  • the polylactic acid salt contained as a micelle inner wall component as a separate component from the amphiphilic block copolymer has a number average molecular weight of 500 to 50, 000 Daltons. Specifically, it is preferable that it is 1,000 to 10.000 daltons. If the molecular weight is less than 500 Daltons, the hydrophobicity is so low that it is difficult to be present in the micelle core (inner wall). If the molecular weight exceeds 50.000 Daltons, there is a problem that the particles of the polymer micelles become large.
  • the polylactic acid salt is 1 to 200 parts by weight based on 100 parts by weight of the amphiphilic block polymer. Specifically it may be used in 10 to 100 parts by weight, more specifically 30 'to 60 parts by weight.
  • the content of polylactic acid salt exceeds 200 parts by weight relative to 100 parts by weight of the amphiphilic block polymer, the size of the MIEL increases. Filtration using a sterile membrane becomes difficult, and if it is less than 1 weight part, a desired effect may not be fully acquired.
  • the polylactic acid salt may be contained in an amount of 10 to 300 parts by weight, more preferably 50 to 100 parts by weight.
  • the terminal of the polylactic acid salt opposite the terminal of the carboxylate is Hydroxy, acetoxy. Benzoyloxy, decanoyloxy. It may be substituted with one selected from the group consisting of palmitoyloxy and alkoxy having 1 to 2 carbon atoms.
  • the polylactic acid salt of the invention is characterized in that at least 'one member selected from the group consisting of compounds of formula 1-6.
  • A is -C00-CHZ-;
  • B is —COO— CHY—, —COO—CHCH 2 CH 2 CH 2 CH 2 — or —C00—CH 2 CH 2 0CH 2 :
  • R is a hydrogen atom, or acetyl, benzoyl, decanoyl. Palmitoyl. methyl. Or an ethyl group;
  • Z and Y are each hydrogen atoms.
  • M is Na, K. or Li; II is an integer of 1 to 30; ni is an integer from 0 to 20.
  • R0-CHZ- [C00-CHX] p- [CHY '] CO- q- C00-CHZ-C00M X is a methyl group; Y 'is a hydrogen atom or a phenyl group: p is
  • q is an integer from 0 to 25, provided that p + q is an integer from 5 to 25;
  • R is a hydrogen atom.
  • W-CH2CO0M-CH—— CHaCOOM and pAD is or
  • D'-polylactic acid D-polylactic acid, polymandelic acid, copolymer of D'-lactic acid and glycolic acid. D'-copolymer of lactic acid and mandelic acid. A copolymer of D'-lactic acid and caprolactone and a copolymer of D'-lactic acid and 1,4-dioxane-2-one; R is a hydrogen atom. Or an acetyl, benzoyl, decanoyl, palmito or ethyl group; M is independently Na. Li.
  • S-0-PAD-COO-Q In Formula 4, S is L is -NR 'or 0-, where 1 ⁇ is a hydrogen atom or d- ⁇ ) alkyl: Q is CH 3 , CH 2 CH 3 . CH 2 CH 2 CH 3 , CH 2 CH 2 CHCH 3 . Or CH 2 C 6 H 5 ; a is an integer from 0 to 4; b is an integer from 1 to 10: M is Na, K. or Li; PAD is D'—polylactic acid. D-polylactic acid, polymandelic acid, a copolymer of D'-lactic acid and glycolic acid, a copolymer of D'-lactic acid and mandelic acid, and a copolymer of D'-lactic acid and caprolactone. And a copolymer of D-lactic acid and 1,4-dioxane-2-one.
  • R ' is -PAD-0-C (0) -CH 2 CH 2 -C (0) -0M, where PAD is
  • M is Na, K, or Li; a is an integer of 1-4.
  • X and X ' are independently hydrogen, alkyl having 1 to 10 carbon atoms or aryl having 6 to 20 carbon atoms; Y and Z are independently Na. Or Li; ni and n are independently integers from 0 to 95. 5 ⁇ m + n ⁇ 100; a and b are independently integers from 1 to 6: R is-(CH 2 ) k- , divalent alkenyl having 2 to 10 carbon atoms. Divalent aryl having 6 to 20 carbon atoms, or a combination thereof. Where k is an integer from 0 to 10.
  • the polylactic acid salt is preferably a compound of Formula 1 or Formula 2.
  • composition of the present invention is 0.01 to 50% by weight based on the weight of the total composition to increase the intracellular delivery efficiency of the nucleic acid targeting KRAS. Specifically, it may further comprise 0.1 to 10% by weight of the fusion lipid.
  • the fusible lipid common Habsi in combination with the hydrophobic interaction, and formation of a nucleic acid, a cationic lipid and a confluent lipid of i complex that the KRAS target, the fusion nucleic acid and a complex of a cationic lipid to the KRAS Targeting Complexes comprising sex lipids are encapsulated within the micellar structure of the amphiphilic block copolymer.
  • the fusion lipid may be one or a combination of two or more selected from the group consisting of phospholipids, cholesterol, and tocopheres.
  • the phospholipid is phosphatidylethane amine (phospha tidy let hano 1 am in, PE). It may be one or more selected from the group consisting of phosphatidylcholine (PC) and phosphatidic acid.
  • the phosphatidyl ethane amine (phosphat idylethanolamin. PE), phosphatidylcholine (PC) and phosphatidic acid may be in the form combined with one or two C10-24 fatty acids.
  • the cholesters and tocopes include the analogs, derivatives, and metabolites of cholesters and tocopes.
  • the fusion lipid is di lauroyl phosphat idyl ethanol amine.
  • Dimyristoyl phosphatidylethane to amine di myr istoyl phosphat i dy 1 et hano 1 am i ne).
  • Dipalmitoyl phosphatidylethaneamine dipalmi toyl phosphat idyl ethanol amine
  • distearoyl phosphatidylethanolamine dis ear oy 1 phospha tidylet hano 1 am ine
  • dioleoyl phosphatidylethane amine dio 1 eoy 1 phospha tidylet hano 1 am ine).
  • Dilinoleoyl phosphatidylethane to amine (di ⁇ no 1 eoy 1 phospha ti dy 1 et hano 1 am ine).
  • 1-palmitoyl-2-oleleoyl phosphatidylethanolamine (1-pa 1 mit oy ⁇ 2— o 1 eoy 1 phosphat idyl ethanol amine).
  • 1,2-dipitanoyl _3-sn—phosphatidylethane with amine (1, 2- (liphytanoy ⁇ 3-sn-phosphat idylethanol amine), dilauuroyl phosphatidylcholine (dilauroyl phosphat i cly 1 cho 1 ine), dimyri Dimyristoyl phospha ti dy 1 cho line.Dipalmitoyl phosphatidylcholine (lipalmitoyl phosphat idylchol ine), distearoyl phosphatidyl choline (dioleoyl phosphatidylcholine) dy 1 cho 1 i ne), dilinoleoyl phospha ti cly 1 cho 1 i ne, 1—palmitoyl— 2-oleoyl phosphatidylcholine (1— palmitoy ⁇ 2-oleoyl
  • One, two or more selected from the group consisting of 1,2-diphytanoyl-3-sii—phosphatidine acid (1,2-diphyt anoy 1-3-sn-phosphatid ic acid), cholesterol and tocophere May be a combination.
  • the fusion lipid is dioleoyl phosphatidylethane amine (di 01 eoy 1 phospha ti dy 1 et hano 1 am i ne, DOPE), dipalmitoleoyl phosphocholine (1.2-d ipalmitoleoyl- sn-g 1 ycero-3-phosphocho 1 ine.DPPC), dioleoylphosphocholine (1, 2-dio 1 eoy 1 -sn-g 1 ycero-3-phosphocho line.DOPC). Dipalmitoleoylphosphoethanolamine
  • the compound complex-containing composition is a blood vessel. Muscle, subcutaneous. Oral, bone. It can be administered via a route of administration, such as transdermal or topical tissue, and can be formulated into a variety of oral or parenteral formulations as appropriate for this route of administration.
  • the oral dosage formulation is a tablet. capsule. Powder formulation.
  • parenteral preparation such as a liquid, various preparations such as eye drops and injections can be exemplified.
  • the composition may be an injectable preparation. E.g .
  • composition When lyophilizing the composition according to the invention. This is distilled water for injection. It may be prepared in the form of an injectable preparation by reconstitution with 0.9% saline solution and 5% aqueous solution of textloss.
  • the invention also. It provides a method of preparing a pharmaceutical composition comprising an amphiphilic block copolymer micelle containing a nucleic acid targeting the KRAS.
  • Nucleic acid targeting the KRAS Cationic lipids.
  • Method for producing a nucleic acid delivery composition for targeting KRAS comprising an amphiphilic block copolymer and polylactic acid salt.
  • step (b) lyophilizing the mixture obtained in step (a):
  • step (c) dissolving the lyophilisate obtained in step (b) in an organic solvent:
  • step (d) mixing the solution obtained in step (c) with an aqueous solvent:
  • step (e) removing the organic solvent from the mixture obtained in step (cl).
  • the amphiphilic block co-polymer, the polylactic acid salt and the fusion lipid can be dissolved in the organic solvent of step (c) or the aqueous solvent of step (d).
  • the step (al volume ratio of the aqueous solution in which the cationic compound is dissolved to the aqueous solution in which the nucleic acid targeting KRAS is dissolved may be 1 to 20 days.
  • the lyophilized adjuvant used in the present invention is a lyophilized composition. Or keep the cake in shape. After lyophilizing the amphiphilic block copolymer composition. It is added to help uniformly dissolve quickly in the process of l-econstitution, specifically. Lactose Manny. At least one selected from the group consisting of trehalose, sorbbi and sucrose. The amount of the lyophilization aid is 0.1 to 90% by weight, more specifically 0.2 to 60% by weight, based on the total dry weight of the lyophilization composition.
  • a composition in which a nucleic acid and a cationic compound complex targeting KRAS is encapsulated in an amphiphilic block copolymer and a polylactic acid Myel construct is prepared.
  • micelle particles in the prepared compositions are stable in the blood. Its size is 10 to 200 nm. More specifically, it is 10-150 nni.
  • SiRNA sequences used in Comparative Examples and Examples are as shown below.
  • the sodium polylactic acid salt was obtained using the polylactic acid (number average molecular weight 4,000) obtained in the manufacture example 7 [production example 9].
  • Comparative Example 1 A composition containing Luc if erase siRNA / 1,6-dioleoyl triethylenetetramide (dio-TETA) / mPEG "PLA-tocope (2k-1.7k) / PLANa (1.7k) / DOPE Produce
  • Ethyl acetate was selectively removed by distillation under reduced pressure in hie if erase siRNA / 1,6-dioleoyl triethylenetetraamide ((lio-TETA) / niPEG-PLA-tocope (2k-1.7k) / PLANa / DOPE-containing polymer micelles were prepared.
  • Example 1-2 Preparation of a composition containing KRAS siRNA / 1,6-dioleoyl triethylenetetramide (dio-TETAVmPEG ⁇ PLA-tocope (2k-1.7k) / PLANa (1.7k) / DOPE
  • siRNA targeting KRAS consisting of the sense sequence of SEQ ID NO: 1 and the antisense sequence of SEQ ID NO: 2 (hereinafter referred to as' KRAS siRNA ') is dissolved in distilled water 94.52 / ('. ClioTETA 94.52! Ig is After dissolving in 94.52 ⁇ of 100 niM acetate buffer (pH4.2), the mixture was mixed one by one in the state of ultrasonic grinding, and the mixture was lyophilized to make a powder and then dissolved in ethyl acetate 10 / ('. Here is a solution of PLANa 300 / g dissolved in ethyl acetate 15 // ('.
  • DOPE 104.2 / g dissolved in ethyl acetate 5.2 ('. NiPEG-PLA-tocope 1000 dissolved in ethyl acetate 20, "(' The melted solution was added sequentially and then mixed. The mixed solution was mixed with 100 / ('distilled water one by one to prepare a composite emulsion using an ultrasonic grinder. KRAS siRNA / dioTETA / niPEG-PLA-tocofe (2k-1.7k) / PLANa (1.7) was added to a 1-neck back-end flask and selectively removed ethyl acetate by distillation under reduced pressure in a rotary evapator. k) I DOPE containing compositions were prepared.
  • siRNA different in the same manner as in Example 1 siRNA consisting of the sense sequence of SEQ ID NO: 3 and the antisense sequence of SEQ ID NO: 4
  • KRAS siRNA / dioTETA / niPEG-PLA-tocope (2k-1.7k) / PLANa ( 1.7k) I DOPE containing compositions were prepared.
  • the compositions obtained in Examples 1 and 2 are shown in Table 3 below.
  • Example 3-6 Composition containing KRAS siRNA / 1,6-dioleoyl triethylenetetramide (dio-TETA) / mPEG "PLA-tocope (2k-1.7k) / PLANa (1.7k) / DOPE Produce
  • Polymer nanoparticles were prepared by varying the amount of DOPE in the same manner as above.
  • the compositions obtained in Examples 3 to 6 are shown in Table 4 below. TABLE 4 ⁇
  • Example 3 (; PLA-tocopherol l-ig
  • Example 7-18 Preparation of a composition containing KRAS siRNA / 1,6-dioleoyl triethylenetetramide (dio-TETAVmPEXH A-tocope (2k-1.7k) / PLANa (1.7k) / DOPE
  • the polymer nanoparticles were prepared by varying the amount of lioTETA / siRNA (N / P ratio), mPEG—PLA-tocope and PLANa in the same manner as above.
  • the compositions obtained in Examples 7 to 18 are shown in the following table. Same as 5.
  • siRNA sequences siRNA sequences. siRNA / dioTETA ratio (N / P ratio), amphiphilic block copolymer
  • Particle size was measured using a dynamic light scattering (DLS) method. Specifically, He-Ne laser was used as a light source, and MALVERN's Zetasizer Nano ZS90 instrument was operated according to the manual.
  • DLS dynamic light scattering
  • siRNA content was measured to determine how the yield of the myseal varies with each composition ratio.
  • SiRNA was quantified in siRNA / dioTETA / mPEG-PLA—tocopherol (2k-1.7k) / PLANa (1.7k) / DOPE containing polymer micelles prepared using a modified Bligh & Dyer extraction method. Put the formulation in 50 ⁇ sodium phosphate (containing 75mM NaCl (pH 7.5)). After mixing methane and chloroform at the proper ratio, make Bligh & Dyei ⁇ single phase. K mM sodium phosphate and chloroform were further added to separate the aqueous and organic layers. SiRNA of the aqueous layer was taken and quantified with Ribogreen reagent (Iiwi trogen). The size, surface charge and content of Examples 1 to 2 mials according to siRNA sequences are shown in Table 6 below.
  • Heparin sifting assay was performed. Heparin 40 / was treated in formulation 10 // ('(siRNA 300 ng) and reacted at room temperature for 10 minutes to measure the dissolved siRNA by electrophoresis.
  • Ratio of (2k-1.7k) / PLANa (1.7k) / DOPE dioTETA / siRNA N / P ratio.
  • the comparative results of the stability of the heparin competition of the particles of Examples 7 to 18 with different amounts of the amphiphilic block copolymer (2k-1.7k) and PLANa (1.7k) are shown in Table 11 below.
  • the formulations prepared in Examples 1 and 2 were administered to animals and administered 0.5 hours.
  • RT reverse transcrip ion
  • qRT-PCR quantitative reverse transcrib ion-polymer chain reaction
  • the siRNA exposed as the formulation was released was synthesized into d) NA via reverse transcription (RT) step, and QRT-PCR (Bio-Racl CFX96 Real-Time System) was performed using the synthesized cDNA. Analysis was performed using the Bio-Rad CFX Manager program.
  • Example 12 L0.342 3,50: 5 As can be seen in Table 12 above, the formulations prepared in Examples 1 and 2 of the present invention exhibited high blood plasma concentrations similar to Comparative Example 1, which were associated with siRNA sequences. Regardless of whether the nanoparticles have the same blood stability.
  • Example 1 and Comparative Example 1 together with the KRAS siRNA control in combination with a commercial vehicle product lipofectamine (Li pofect amine 3000. Invitrogen, USA) is 100 nM. 50 nM, 5 nM, 0.5 ⁇ , was added to the cell culture medium to contain siRNA at a concentration of 0.05 iM, respectively.
  • branched DNA assay (bDNA. Quant i gene 2.0 Assay kit, Panoniics. QS0009) was used to confirm m NA expression. The amount of fluorescence expression was measured using Bio—Tek, Synergy HT). Also. Cell for intracellular toxicity analysis
  • ANP refers to the formulation of Example 1
  • ANP in Tables 13 to 18, ANP (iciferase) refers to the formulation of Comparative Example 1
  • Lipo refers to the KRAS siRNA control group bound to the lipofectamine of Example 1.
  • the formulation stones prepared in the Examples of the present invention can be seen that the siRNA was efficiently delivered into cells even at very low s i RNA administration concentrations, thereby suppressing the expression of target AS mRNA.
  • the cell survival is higher while suppressing the expression of KRAS mRNA to a level similar to or enhanced with lipofectamine. This means that the composition of the present invention is more active against toxicity than lipofectamine.
  • KRAS mRNA and protein levels were analyzed. At 48 hours after the last administration, the cancer tissue was extracted and crushed, and the amounts of KRAS niRNA and protein were analyzed by branched DNA assay and western blot, respectively. Physiological saline was administered as a control. The experimental results are shown in Table 19 and FIG.
  • the 5mg / kg group gradually faded the band, indicating that KRAS protein expression was decreased.
  • the intensity of the protein band was quantified by image J and confirmed as a result.
  • the expression rate of KRAS protein in the ling / kg group was about 68% compared to the control and about 72% in the 5mg / kg group. As a result, it was observed that nanoparticles suppressed cancer growth without toxicity in lung cancer A549 xenograft model and inhibited the expression of KRASni NA and protein by more than 50%.
  • RAS siRNA / 1,6-dioleoyl triethylenetetramide (dio-TETA) / mPEG-PLA—tocopherol (2k-1.7k) / PLANa (1.7k) / DOPE polymer nanoparticles were used in vivo, Whether or not the target gene KRAS can be inhibited was confirmed in an orthotopic mouse model.
  • A549 cells expressing GFP are intravenous injected into SLC (BALB / c.nu / nu.Female) a thymic nude mice. After about two weeks, it was possible to identify cancer in the lung through fluorescence images. Two weeks after A549-GFP cells were injected into the tail of the mouse, KRAS siRNA / dio-TETA / mPEG—PLA—tocope of Example 1 / PLANa / DOPE nanoparticles were injected into cancer model mice. 1. Multiple doses were administered intravenously at a dose of 3 mg / kg. After sacrifice, tissue was sacrificed to open the lung, and GFP imaging was used to observe cancer growth. Physiological saline was administered as a control. Experimental results are shown in FIGS. 4 and 5.
  • mice knocked-in with the mutated K-ras oncogene were administered multiple times intravenously with the KRAS siRNA / dio—TETA / mPEG-PLA-tocope of Example 1 at a dose of 1 nig / kg / PLANa / DOPE nanoparticles. .
  • lung tissue of the mouse was removed and the number of cancer nodule was measured.
  • KRAS niRNA amount and protein amount were analyzed.
  • KRAS mRNA and protein levels were analyzed by branched DNA assay and western blot, respectively.
  • Physiological saline was administered as a control. Experimental results Fig. 7 and 8, and Table 20.

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Abstract

유효성분으로서 KRAS를 표적으로 하는 핵산; 양이온성 화합물; 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염을 포함하며, 상기 KRAS를 표적으로 하는 핵산은 상기 양이온성 지질과 복합체를 형성하고, 상기 복합체가 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염이 형성하는 미셀 구조 내부에 봉입되는 것을 특징으로 하는 KRAS를 표적으로 하는 핵산 전달용 약제학적 조성물과 그 제조방법이 개시된다.

Description

Ig py o teudaet adsosoo30nh fnmnalnDlnllca dstctsooebwss .h liliinion frmlnlrill.
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DNA de l i very , J Cont ro l re l ease 121 ( 2007 ) 64-73 ) .
그러나. 이제까지 연구된 양이은 ¾ 지질 또는 폴리양이온성 고분자들은. 충분한 효과를 얻기 위해 필요한 양을 사용할 경우에 , 바이러스성 전달체보다는 덜하지만. 심각한 독성을 유발하여 의약품으로 사용이 부적당하다는 결과를 나타내었다. 또한, 양이온성 지질과 핵산의 결합을 통해 착화합물을 이루어 세포 내로 핵산을 전달시키는 지질 -핵산 복합체의 경우는 세포주 실험에서는 매우 광범위하게 이용되지만. 혈증에서의 안정성을 가질 수 있는 구조를 나타내지 못하기 때문에 생체 내에서 이용하기에는 불가능하다 (미국특허 제 6.458.382호 참고) .
또한, 핵산 자체에 지질 혹은 고분자를 직접 ¾합시킨 후. 미셀이나 다른 고분자와 복합체를 이루게 하여 나노 입자를 형성시키는 연구도 진행되고 있는데. 핵산 물질에 직접 지질 혹은 고분자를 접합시키는 경우. ¾합 효율이나 품질 관리의 측면에서 어려움을 가지고 있으며 아직까지 명확하게 핵산 전달의 효율에 있어서는 검증이 되어 있지 않다.
따라서 . 독성을 유발할 수 있는 양이온성 고분자 또는 양이온성 지질의 사용량을 최소화하여 독성을 감소시키면서 , 혈중 및 체액 내에서 안정하고, 세포 내 전달이 가능하여 충분한 효과를 얻을 수 있는 음이온성 약물 전달 기술의 개발이 필요하다. 한편. 양친성 블록 공중합체를 이용하여 고분자 미셀의 형태로 난용성 약물을 가용화하고 수용액상에서 안정하게 함으로써 약물 전달체로서 이용하려는 노력이 다양하게 진행되었다 (한국등록특허 제 0180334호) . 그러나, 이러한 양친성 블록 공증합체는 내부에 손수 을 띄^ 프ᅩ분자— 미_셀을ᅵ 형ᅳ성함으로^ —소수ᅳ성을- 띄는 난용성 약물을 가용화할 수는 있지만. 음이온을 띄는 핵산 등의 친수성 약물은 고분자 미셀 내부에 봉입할 수 없으므로. 이들 핵산을 포함하는 음이온성 약물의 전달에는 적당하지 않다. 이에. 핵산과 양이온성 지질의 정전기적 상호작용에 의한 복합체를 형성하여 상기 복합체가 양친성 블록 공증합체의 미셀 구조 내부에 봉입되도록 하는 음이온성 약물 전달 조성물을 개시한 바 있다. 그러나. 이 역시 핵산의 혈중 안정성 및 암조직에 대한 특이적 표적화에 있어서 개선의 여지를 안고 있다.
한국등록특허 저 U296326호에는 유효성분으로서 음이온성 약물;
9 양이온성 지질: 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산을 포함하며, 상기 음이온성 약물은 상기 양이온성 지질과 복합체를 형성하고, 상기 복합체가 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산이 형성하는 미셀 구조 내부에 봉입된 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 음이온성 약물 전달용 조성물이 개시되어 있다. 그러나 이 특허에서 사용된 폴리락트산은 말단에 카르복시기를 갖는 일반적인 폴리락트산 고분자로서 , 약물 전달 효과가 미흡한 문제점을 가지고 있다.
한편, 많은 질병은 여러 요인으로 인하여 질병 유전자의 발현이 증가하거나 돌연변이에 의해 비정상적인 활성이 나타남으로써 발생하게 된다. siRNA(shor't interfering RNA)는, 전사 후 공정에서 서열 특이적으로 특정 유전자의 발현을 억제하므로, 유전자 치료제로서 많은 관심이 집중되고 있다. 특히 , siRNA의 높은 활성과 정밀한 유전자 선택성으로 인해, 기존의 안티센스 뉴클레오티드나 리보자임 등의 문제점을 해결할 수 있는 핵산 치료제로 기대되고 있다. siRNA는 짧은 이중 나선의 RNA 가닥으로, 이들과 염기 서열이 상보적인 유전자의 mRNA를 절단함으로써 해당 유전자의 발현을 억제시킨다 (McManus and Sharp. Nature Rev. Genet . 3:737 (2002)； Elbashir. et al.. Genes Dev. 15： 188 (2001)),.
그러나, 이러한 장점에도 불구하고, siRNA는 혈중에서 핵산 분해 효소에 의해 빠르게 분해되고, 신장을 통하여 빠르게 체외로 배설되는 것으로 알려져 있다. 또한 siRNA는 강한 음전하를 띄어 세포막을 쉽게 통과하지 못하는 것으로 알려져 있다. 따라서 siRNA를 치료제로 사용하기 위해서는 siRNA를 액에서 앞정 ^시ᅳ 7丄고, 목표ᅳ로 _삼은ᅳ 조질이나- 세―포 안으로 효율적으로 전달할 수 있으며 , 독성을 나타내지 않는 전달체의 개발이 필요하다.
치료 타겟으로 Ras 신호 조절장애는 종양 성장 및 전이를 일으킬 수 있다 (Goodsell DS. Oncologist [0005] 4： 263-4). 모든 인간 종양의 20— 25%는 Ras에 활성화 변이를 함유하는 것으로 평가되며 ; 특정 종양 타입에 있어서 , 이러한 현상은 90%만큼 높다 (Downward J . Nat Rev Cancer , 3： 11-22). 따라서 , Ras 유전자 패밀리 멤버들은 암 치료제 디자인을 위한 매력적인 분자 표적이다. 세 가지의 인간 RAS 유전자는 고도로 관련된 188 내지 189 아미노산 단백질올 코딩하고, 지정된 H-Ras. N-Ras 및 K-Ras4A(KRAS아형) 및 K-Ras4B(KRAS아형 b: 두 개의 KRas단백질은 대체 유전자 스플라이성에 의해 발생한다. Ras 단백질은 이원 (binary) 분자성 스위치로서 기능하며 . 세포내 신호전달 네트워크를 조절한다. Ras-조절 신호 경로는 액틴 세포골격 온전성 (integrity), 증식, 분화. 세포 부착. 아롭토시스 및 세포 이동과 같은 과정을 조절한다. Ras 및 Ras-관련 단백질은 종종 암에 대한 억제를 방해하여 (deregulated in cancers). 침윤 및 전이를 증가시키게 되고. 아폴토시스를 감소시킨다. Ras는 많은 경로를 활성화시키지만 특히 종양생성에 있어서 중요한 하나는 다른 단백질 키나아제 및 유전자 조절 단백질에 대한 신호 다운스트림을 전달하는 미토젠-활성화 단백질 (MAP) 키나아제인 것으로 보인다.
국제공개 제 W02013/166004호는 치료 유효량의 KRAS에 대한 RNAi 작용제를 사용하여 KRAS-관련 질환. 예컨대 고형 또는 액상 암 선암종. 결장직장암, 진행성 및 /또는 전이성 결장직장암. 결장암, 폐암, 비소세포 폐암 및 폐 선암종. 급성 골수성 폐암. 방광암, 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암. 위암. 두경부암. 신장암: 백혈병 , 골수이형성 증후군, 골수성 백혈병 , 간암. 혹색종. 난소암. 훼장암. 전립선암. 고환암. 갑상선암을 포함하는 증식성 질환, 및 심징- -얼굴 -피부 (CFC) 증후군 및 누난 증후군, 및 유사 및 관련 질환을 치료하는 방법에 유용한 RNAi 작용제를 개시하고 있다. 그러나 상기 특허에는 KRAS에 대한 RNAi 작용제를 기재하고 있을 뿐 . 이를 생체 내로 전달하기 위한 전달체에 대해서는 개시 또는 암시한 바 없다. 【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
상기와 같은 문제점을 해소하고자. 본 발명은 폴리락트산염을 함유하여 KRAS를 표적으로 하는 핵산올 체내에 효과적으로 전달할 수 있는 미앨 구조체를 포함하는 KRAS를 표적으로 하는 핵산 전달용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한. 본 발명은 상기와 같은 KRAS를 표적으로 하는 핵산을 체내에 효과적으로 전달할 수 있는 약학적 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다. 【유리한 효과】 본 발명에 따른 KRAS를 표적으로 하는 핵산 전달용 약제학적 조성물은. 양이온성 화합물. 그리고 양친성 블록 고분자 및 폴리락트산염으로 형성된 미셀 구조체를 사용하여 KRAS를 표적으로 하는 핵산을 외부로부터 격리시킴에 따라 KRAS를 표적으로 하는 핵산의 혈증 혹은 체액 내 안정성을 높일 수 있다. 따라서, 본 약제학적 조성물은 체내에 투여하였을 경우 KRAS를 표적으로 하는 핵산의 혈중 흑은 체액 내 안정성을 높일 수 있으며, 특히 세망내피계를 회피하여 KRAS를 표적으로 하는 핵산이 세포 내로 효을적으로 전달될 수 있다는 장점이 있다.
【도면의 간단한'설명】
도 1은 본 발명에 따른 KRAS를 표적으로 하는 핵산 및 양이온성 화합물의 복합체가 봉입된 고분자 미셀 전달체의 개략적인 구조를 나타낸 도면이다.
도 2는 제조예 8에 따른 폴리락트산 나트름염의 NMR 결과를 나타낸 도면이다. .
도 3은 실시예 1의 KRAS s iRN/Vd i o— TETA/mPEG-PLA-토코페를 /PLANa
/DOPE 고분자 나노입자의 이종이식 종양 모델에서의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4 및 도 5는 실시예 1의 KRAS s i RN/Vdio-TETA/mPEG-PLA—토코페롤 /PLANa /DOPE 고분자 나노입자의 동소 종양 모델에서의 효과를 보여주는 사진 및 그래프이다.
도 6 내지 도 8은 KRAS s iRNA八 l i o-TETA/mPEG-PLA-토코페를 /PLANa /DOPE 고분자 나노입자의 KRASG12D 유전자 조작 마우스 모델에서의 효과를 보여주는 사진 및 그래프이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
본 발명에 따른 미엘 구조체를 포함하는 KRAS를 표적으로 하는 핵산 전달용 조성물은, 양친성 블록 공중합체와 폴리락트산염의 미셀 구조체에 핵산 및 양이온성 화합물의 복합체가 포함된 구조로서 , 구체적으로는
유효성분으로서 KRAS를 표적으로 하는 핵산;
양이온성 화합물:
양친성 블특 공중합체: 및 s ，一ᄂ L n
을 포함하며 , 상기 KRAS를 표적으로 하는 핵산은 상기 양이온성 화합물과 정전기적 상호작용에 의해 복합체를 형성하고, 이와 같이 형성된 복합체가 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염에 의하여 형성된 미셀 구조 내부에 봉입되는 것을 특징으로 한다.
상기 조성물은 물에 용해가 가능하고, 미셀 구조체를 형성하는 한 성분으로서 폴리락트산염을 포함함으로써 , 체내 주입시 혈중 안정성 증가 및 세망내피계 (RES)를 회피하는 것을 통하여 표적 부위 , 구체적으로 암조직으로의 전달 효율이 우수하므로. 세망내피계 (RES) 회피 및 /또는 표적화 증진 용도로도 유용하다.
또 다른 본 발명의 일 양태로서. 상기 KRAS를 표적으로 하는 핵산 전달용 조성물의 제조방법은,
(a) KRAS를 표적으로 하는 핵산과 양이온성 화합물을 각각 수성 용매에 용해시켜 흔합하는 단계: 및.
( b) 단계 (a)에서 얻어진 혼합물을 동결건조하는 단계;
( c ) 단계 (b)에서 얻어진 동결건조물을 유기 용매에 용해시키는 단계;
( d) 단계 ( c )에서 얻어진 용액을 수성 용매와 흔합하는 단계; 및
(e ) 단계 (d)에서 얻어진 흔합물로부터 유기용매를 제거하는 단계 를 포함할 수 있다. 이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 본 발명에 따른 조성물의 구성성분 중. 상기 KRAS를 표적으로 하는 핵산과 양이온성 화합물은, 양친성 블록 고분자와 폴리락트산염에 의하여 형성된 미셀 구조 내부에 봉입되고. 이러한 KRAS를 표적으로 하는 핵산 및 양이온성 화합물의 복합체가 봉입된 고분자 미씰 전달체의 대략적인 구조를 도 1에 나타내었다. 도 1을 참조하면, KRAS를 표적으로 하는 핵산은 양이은성 화합물과 정전기적 상호작용을 통해 서로 결합하여 , KRAS를 표적으로 하는 핵산과 양이은성 화합물 복합체를 형성한다. 형성된 KRAS를 표적으로 하는 핵산과 양이온성 화합물 복합체는, 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염에 의해 형성되는 미셀 구조 내에 봉입된다.
도 1에 나타낸 바와 같이 . 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염에 의해 형성되는 미썰 구조체는 수성 환경에서 양친성 블록 공증합체의 친수성 부분이 미앨의 외벽을 형성하고 양친성 블록 공중합체의 소수성 부분과 상기 양친성 블록 공중합체와 별도의 성분으로 함유된 폴리락트산염이 미씰의 내벽을 형성하고, 그 형성된 미셀의 내부에 KRAS를 표,적으로 하는 핵산과 양이온성 화합물 복합체가 봉입된 구조이다.
상기 KRAS를 표적으로 하는 핵산과 양이은성 화합물 복합체는 상기 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염에 의해 형성되는 미셀 구조체 내에 봉입된 상태를 유지하여 혈중 또는 체액 내에서의 안정성이 향상된다. 일 실시예에서 , 상기 미쎌의 입자 크기는. 10 내지 200 nm이며 . 더욱 구체적으로는 10 내지 150nm인 것이 좋다. 또한, 상기 미셀 입자의 표준 전하는 -20 내지 20 mV 이며 . 더욱 구체적으로 -10 내지 10 mV인 것이 좋다. 상기 입자 크기 및 표준 전하는, 미앨 구조의 안정성 및 구성성분들의 함량과 체내에서 KRAS를 표적으로 하는 핵산의 흡수도 및 약제학적 조성물로서 멸균의 편의성면에서 가장 바람직하다. 또한, 상기 핵산은, 데옥시리보핵산, 리보핵산. 또는 백본 ( backbone ), 당 또는 염기가 화학적으로 변형되거나 말단이 수식된 폴리뉴클레오타이드 유도체 등의 핵산 약물일 수 있으며. 보다 구체적으로는 RNA. DNA, siRNA( short interfering RNA). 압타머 (aptamer) . 안티센스 0DN( ant i sense oligonucleotide). 안티센스 RNA( ant i sense RNA), 리보자임 ( r ibozyme) 및 디엔에이자임 (DNAzyme) 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산일 수 있다. 나아가. 상기 핵산은 혈중 안정성을 증가시키거나 면역 반웅을 약화시키는 등의 목적을 위해 백본 (backbone), 당 또는 염기가 화학적으로 변형되거나 말단이 수식될 수 있다. 구체적으로, 핵산의 포스포다이에스테르 (phosphodiester) 결합의 일부를 포스포로티오에이트 (phosph이ᅳ othioate) 또는 보라노포스페이트 (boranophosphate) 결합으로 대체하거나, 일부 리보오스 염기의 2'-0H 위치에 메틸기. 메톡시에틸기 . 불소 등의 다양한 작용기자 도입된 수식된 뉴클레오티드를 1종 이상 포함할 수 있다. 또한. 상기 핵산의 하나 이상의 말단은 콜레스테를, 토코페를 및 탄소수 10 내지 24개의 지방산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 수식될 수 있다. 예를 들어 , siRNA의 경우 센스 및 /또는 안티센스 가닥의 5' 말단, 또는 3' 말단, 또는 양 말단에 수식될 수 있으며 , 바람직하게 센스 가닥의 말단에 수식될 수 있다.
상기 콜레스테롤, 토코페를 및 탄소수 10 내지 24개의 지방산에는 콜레스테를, 토코페롤 및 지방산의 각 유사체. 유도체, 및 대사체가 포함된다.
상기 siRNA는, 표적 유전자와 동일한 세포에 존재하는 경우에 siRNA의 서열에 상보적인 niRNA의 분해를 매개함으로써, 표적 유전자의 발현을 감소시키거나 억제할 수 있는 이중가닥 RNMduplex RNA), 또는 단일가닥 RNA 내부에서 이중가닥의 형태를 띄는 단일가닥 RNA를 지칭한다. 이증가닥 사이의 결합은, 뉴클레오티드 간의 수소 결합을 통해 이루어지며 , 이중가닥 내부의 모든 뉴클레오티드가 상보적으로 서로 결합해야 하는 것은 아니며 . 상기 양 가닥은 분리되어 있거나 (separate) 분리되어 있지 않을 수 있다. 일 양태로서 . 상기 siRNA의 길이는 약 15 내지 60 개의 (이중 가닥 RNA의 한쪽 뉴클레오티드의 갯수 . 즉 . 염기쌍의 갯수를 의미하며 . 단일 가닥 RNA인 경우에는 단일 기 :닥 RNA 내부의 이중 가닥의 길이를 의미한다 ) 뉴클레오티드이며 , 구체적으로는. 약 15내지 30개의 뉴클레오티드이고. 보다 구체적으로는 약 19 내지 25 개의 뉴클레오티드인 siRNA를 포함한다.
일 양태로서 . 이중가닥 siRNA는 3' 또는 5' 말단에 1-5뉴클레오티드의 돌출부 (overhang)를 한쪽 말단에. 또는 양쪽 말단에 가질 수 있다. 또 다른 예에서는 양 말단이 돌출부를 갖지 않는 블런트 (blunt) 형태일 수 있다. 구체적으로는 미국특허공개 제 2002-0086356호. 미국특허 제그 056.704에 개시된 siRNA일 수 있다 (상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함된다).
또한, 상기 siRNA는 두 가닥의 길이가 동일한 대 ¾적인 구조를 갖거나, 한 가닥이 다른 가닥보다 짧은 비대칭적인 이중가닥 구조일 수 있다. 구체적으로. 19 내지 21 뉴클레오티드 (luicleotide, nt)의 안티센스 (antisense); 및 상기 안티센스에 상보적인 서열을 갖는 15 내지 19nt의 센스 (sense):로 구성되는 이중가닥 (double strand)의 siRNA 분자 (small interfering RNA molecule)로서 . 상기 siRNA는 안티센스의 5' 방향의 말단이 블런트 말단 (blunt end)이고 안티센스의 3' 말단에 1-5 뉴클레오타이드 돌출부 (overhang)를 갖는 비대칭 siRNA일 수 있다. 구체적으로 국제특허공개 제 09/078685호에 개시된 siRNA일 수 있다.
일 양태로서. KRAS를 표적으로 하는 siRNA는 국제공개 제 W02013/166004호에 기재된 것. 예를 들어 국제공개 제 W02013/166004호의 표 1에 기재된 서열을 갖는 것일 수 있으나. 특정 서열의 것으로 제한되는 것은 아니다 (상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함된다).
본 발명에서 사용되는 KRAS를 표적으로 하는 siRNA의 구체적인 예는 서열번호 1의 센스 서열과 서열번호 2의 안티센스 서열로 이루어진 것이나. 본 발명의 범위가 이것으로 한정되는 것은 아니다.
또한 센스 서열과 안티센스 서열에 2' 가 변형된 뉴클레오티드를 도입할 수 있고, 특히 2'ᅳ메틸 뉴클레오티드를 도입할 수 있으나, 본 발명의 범위가 이것으로 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서, KRAS를 표적으로 하는 핵산은, 전체 조성물의 중량을 기준으로, 0.001 내지 10 중량 %, 구체적으로는 0.01 내지 5중량 %로 포함되는 것이 좋다. 상기 KRAS를 표적으로 하는 핵산의 함량이 0.001 중량 % 미만이면 약물에 비하여 사용되는 전달체의 양이 너무 많아서 전달체에 의한 부작용이 있을 수 있고. K) 중량 %을 초과하면. 미썰의 크기가 너무 커져 미셀의 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있다.
구체적인 일 양태에서 . 상기 양이.은성 화합물은, KRAS를 표적으로 하는 핵산과 정전기적 상호작용에 의해 결합되어 복합체를 형성하고. 상기 복합체는 양친성 블록 공중합체의 미셀 구조 내부에 봉입된다. 따라서 , 상기 양이은성 화합물은. KRAS를 표적으로 하는 핵산과 정전기적 상호작용에 의해 복합체를 형성할 수 있는 모든 형태의 화합물을 포함하며 , 예를 들어. 지질과 고분자 종류일 수 있다. 양이온성 지질은. N , N-디을레일— N , N—디메틸암모늄클로라이드 ( D0DAC ) .
N.Nᅳ디스테아릴 -N.N-디메틸암모늄브로마이드 (DDAB).
N - (1 - ( 2ᅳ 3 -디을레오일옥시)프로필 -N , N . N -트리메틸암모늄클로라이드 ( D0TAP ) . N , N-디메틸 -(2.3-디올레오일옥시)프로필아민 ( D0DMA) .
1이트리메틸-(2,3-디올레오일옥시 )프로필아민 (D0TMA).
1 , 2-디아실 -3-트리메틸암모늄—프로판 ( TAP ) ,
1 , 2-디아실 -3-디메틸암모늄-프로판 ( DAP ) ,
3베타— [N-( N ' , N ' , N ' 트리메틸아미노에탄 )카바모일 ]콜레스테를 (TC-콜레스테 를),
3베타 -[N— (Ν' ,Ν'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테를 (DC-콜레스테롤), 3베타— [ N— ( N ' -모노메틸아미노에탄)카바모일 ]콜레스테를 ( MC-콜레스테롤 ) , 3베타- [ N-(아미노에탄 )카바모일 ]콜레스테롤 ( AC-콜레스테롤),
콜레스테릴옥시프로판 - 1-아민 ( COPA ), N- ( N ' -아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페를 (AC—토코페를) 및 Ν—(Ν'—메틸아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페를 (MC-토코페를)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 조합일 수 있다. 이러한 양이온성 지질을 사용하는 경우, 양이온성 지질로부터 유발되는 독성을 감소시키기 위하여 분자 내의 양이온 밀도가 높은 폴리양이온성 지질을 적게 사용하는 것이 바람직하고. 보다 구체적으로는 분자당 수용액 상에서 양이온을 나타낼 수 있는 작용기가 하나일 수 있다. 이에 따라. 보다 바람직한 일 양태에서, 상기 양이온성 지질은
3베타— [ Ν- ( Ν ' . Ν ' , Ν ' -트리메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤 (TC-콜레스데 를), 3베타 [Ν-(Ν' .Ν'- 디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤 ( DC—콜레스테를), 3베타 [ N- ( N ' - 모노메틸아미노에탄)카바모일 ]콜레스테를 ( MC—콜레스테롤).
,3베타 [N- (아미노에탄)카바모일 ]콜레스테를 ( AC—콜레스테를),
N-(l-(2,3-디을레오일옥시) 프로필 N.N.N—트리메틸암모늄클로라이드 (D0TAP). Ν,Ν-디메틸 -(2.3—디올레오일옥시)프로필아민(1)00 ), 및
Ν . Ν , Ν-트리메틸 -(2 , ,3-디올레오일옥시 )프로필아민 (D0TMA )으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다.
한편, 양이온성 고분자는 키토산 (chitosan), 글라이콜 키토산 (glycol chi tosan) , 프로타민 (protamine) . 폴리라이신 (polylysine) . 폴리아르기닌 (polyarginine). 폴리아미도아민 (PAMAM) . 폴리에틸렌이민 (polyethylenimine) , 텍스트란 (dextran) , 히알루론산 (hyaluronic acid), 알부민 (albumin). 고분자폴리에틸렌이민 (PEI ) , 폴리아민 및 폴리비닐아민 (PVAm)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하며 . 바람직하게는 고분자폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리아민 및 폴리비닐아민 (PVA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 것일 수 있다.
구체적인 일 양태에서 . 양이온성 지질은 하기 화학식 7의 양이온성 지질일 수 있다:
[화학식 7]
Figure imgf000013_0001
상기 식에서.
n과 ill은 각각 0내지 12이되 . 2≤ n + m≤ 12이며 , a와 b는 각각 1내지
6이며 , R1과 R2는 각각 독립적으로 탄소수 11 내지 25개의 포화 및 불포화 탄화수소로 이루어진 군에서 선택된 것이다.
바람직하게는-, n과 m은 독립적으로 1 내지 9이며, 2 ≤ n+m < 10일 수 있다.
바람직하게는, a와 b가 2 내지 4일 수 있다.
바람직하게는, ^과 R2는. 각각 독립적으로. 라우릴 (lauryl), 미리스틸 (myristyl ), 팔미틸 (palmityl ). 스테아릴 (stearyl), 아라키딜 (arachidyl). 베헨닐 (behenyl ) , 리그노세릴 ( lignoceryl). 세로틸 (cerotyl ) 미리스트올레일 (myristoleyl), 팔미트을레일 (palmi toleyl ) . 사피에닐 (sapienyl). 을레일 (oleyl). 리놀레일 (linoleyl). 아라키도닐 (arachidonyl ) , 에이코사펜타에닐 (eicosapentaenyl ) , 에루실 (erucyl ) , 도코사핵사에닐 (docosahexaenyl). 및 세로틸 (cerotyl)로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
양이온성 지질의 구체적인 예는 1.6-디올레오일트리에틸렌테트라마이드 ,
1.8-디리놀레오일테트라에틸렌펜타마이드.
1 , 4-디미리스를레오일디에틸렌트리아마이드 .
1 , 10-디스테아로일펜타에틸렌핵사마이드 및 1,10-디올레오일펜타에틸렌핵사마이드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 양이온성 화합물은, 전체 조성물의 증량을 기준으로, 0.01내지 50중량 %, 구체적으로는 0.1내지 10증량 %포함될 수 있다. 상기 양이은성 지질의 함량이 0.01 중량 % 미만이면 KRAS를 표적으로 하는 siRNA와 복합체를 형성할 수 있는 충분한 양이 되지 못하고, 50중량 %을 초과하면. 미셀의 크기가 너무 커져 미셀의 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있다.
상기 양이온성 화합물과 KRAS를 표적으로 하는 핵산은 , 정전기적 상호작용을 통해 결합하여 . 복합체를 형성한다. 구체적인 일 양태로서 . 상기 KRAS를 표적으로 하는 핵산 (P)과 양이온성 화합물 (N)의 전하량의 비율 (N/P: KRAS를 표적으로 하는 핵산의 음이온 전하에 대한 양이온성 화합물의 양이은 전하 비율)은, 0.1 내지 128이며 , 구체적으로는 0.5내지 64, 더 구체적으로는 1 내지 32이고, 보다 더 구체적으로는 1 내지 24, 가장 구체적으로는 6 내지 24인 것이 좋다. 상기 비율 (N/P)이 0.1 미만인 경우에는 충분한 양의 KRAS를 표적으로 하는 핵산을 포함하는 복합체를 형성하기 어렵기 때문에 , 0.1 이상이어야 충분한 양의 KRAS를 표적으로 하는 핵산을 포함하는 복합체를 형성할 수 있어서 유리하다. 반면. 비율 (N/P)이 128초과시에는 독성을 유발할 우려가 있으므로. 128이하로 하는 것이 좋다. 구체적인 일 양태에서. 상기 양친성 블록 공중합체는. 친수성 A 블록 및 소수성 B 블록을 포함하는 A-B 형 블록 공중합체일 수 있다. 상기 A-B 형 블특 공중합체는, 수용액 상에서 . 소수성 B 블록이 코어 (내벽)를 형성하고 친수성 A 블록이 쉘 (외벽)을 형성하는 코어-쉘 타입의 고분자 미셀을 형성한다 .
이와 관련하여. 상기 친수성 A 블록은 폴리알킬렌글리콜, 폴리비닐알콜. 폴리비닐피를리돈, 폴리아크릴아미드 및 그 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 보다 구체적으로. 친수성 A 블록은 모노메특시폴리에틸렌클리콜, 모노아세톡시폴리에틸렌글리콜. 폴리에틸렌글리콜. 폴리에틸렌과 프로필렌글리콜의 공중합체 및 폴리비닐피를리돈으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 친수성 A 블록은 수평균분자량이 200 내지 50, 000달톤, 보다 구체적으로는 1,000 내지 20, 000달톤, 보다 더 구체적으로는 1.000 내지 5, 000달톤인 것일 수 있다.
또한, 필요에 따라 친수성 A 블록의 말단에 특정 조직이나 세포에 도달할 수 있는 작용기 . 리간드. 또는 세포내 전달을 촉진할 수 있는 작용기를 화학적으로 결합시켜 양친성 블록 공중합체와 폴리락트산염으로 형성된 고분자 미셀 전달체의 체내 분포를 조절하거나 상기 미썰 전달체가 세포 내로 전달되는 효율을 높일 수 있다. 상기 작용기나 리간드는 단당류. 다당류, 비타민. 펩타이드. 단백질 및 세포 표면 수용체에 대한 항체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 작용기나 리간드는 아니사마이드 (anisamide), 비타민 B9(엽산) , 비타민 B12. 비타민 A, 갈락토오스, 락토오스, 만노오스 히알루론산. RGD 펩타이드, NGR 펩타이드. 트랜스페린 및 트랜스페린 수용체에 대한 항체 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 소수성 B 블록은, 생체적합성 생분해성 고분자로서 . 일실시예에서 , 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리아미노산, 폴리오르소에스테르 및 폴리포스파진으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 보다 구체적으로는. 상기 소수성 B 블록은 폴리락타이드. 폴리글리콜라이드. 폴리카프로락톤, 폴리디옥산— 2ᅳ온, 폴리락타이드와 글리콜라이드의 공중합체. 폴리락타이드와 폴리디옥산ᅳ 2—온의 공중합체, 폴리락타이드와 폴리카프로락톤의 공중합체 및 폴리글리콜라이드와 폴리카프로락톤의 공중합체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 또 다른 일실시예에서 , 상기 소수성 B 블록은 수평균분자량이 50 내지 50.000달톤. 보다 구체적으로는 200 내지 20.000달톤. 보다 더 구체적으로는 1,000 내지 5, 000달톤인 것일 수 있다. 또한. 소수성 블톡의 소수성을 증가시켜 미셀의 안정성을 향상시키기 위하여 토코페를, 콜레스테를, 또는 탄소수 10 내지 24개의 지방산을 소수성 블록 말단의 히드특시기에 화학적으로 결합시킬 수 있다.
상기 친수성 블록 (A )과 소수성 블록 ( B )을 포함하는 양친성 블록 공중합체의 함량은, 조성물 전체 건조중량을 기준으로. 40 내지 99.98중량 %이며. 구체적으로는 85 내지 99.8중량% , 더 구체적으로는 90 내지 99.8중량%인 것이 좋다. 상기 양친성 블록 공중합체의 함량이 40 중량 % 미만이면 미셀의 크기가 너무 커져 미셀의 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있고, 함량이 99.98 증량 %를 초과하면 함입할 수 있는 KRAS를 표적으로 하는 핵산의 함량이 너무 적어지게 된다.
또 다른 일실시예에서 , 상기 양친성 블록 공중합체에 있어서, 친수성 블톡 (A )과 소수성 블록 (B)의 조성비는. 공중합체 중량을 기준으로, 친수성 블톡 (A)이 40 내지 70중량 구체적으로는 50 내지 60중량 % 범위일 수 있다. 친수성 블록 (A )의 비을이 40중량 % 미만이면 고분자의 물에 대한 용해도가 낮아서 미엘을 형성하기 어렵기 때문에 , 공중합체가 미셀을 형성하기에 충분한 물에 대한 용해도를 갖기 위하여 친수성 블록 ( A)의 비율이 40중량 % 이상인 것이 좋은 한편, 70중량 %를 초과하면 친수성이 너무 높아 고분자 미셀의 안정성이 낮아져서 K AS를 표적으로 하는 핵산 /양이은성 지질 복합체의 가용화 조성물로 사용하기 어려우므로, 미셀 안정성을 고려하여 친수성 블톡 ( A)의 비율이 70증량 % 이하인 것이 좋다.
구체적인 일 양태에서, 상기 양친성 블록 공중합체는 수용액 상에서
KRAS를 표적으로 하는 핵산과 양이은성 지질 복합체를 미쎌 구조 내부에 봉입시키는데, 이 때 양친성 블록 공중합체의 중량 ( b.) 대비 KRAS를 표적으로 하는 핵산 및 양이온성 지질 복합체의 중량 ( a ) 비율 [ a/b X 100； (KRAS를 표적으로 하는 핵산 중량 +양이온성 지질 증량) /양친성 블특 공중합체 증량 X 100]은. 0.001 내지 100중량 구체적으로는 0.01 내지 50중량 보다 구체적으로는 0. 1 내지 10중량 %일 수 있다. 상기 중량 비율이 , 0.001중량 % 미만인 경우에는 KRAS를 표적으로 하는 핵산 및 양이온성 지질 복합체의 함량이 지나치게 낮아져서 KRAS를 표적으로 하는 핵산이 효과적으로 작용할 수 있는 유효 함량을 충족시키기 어려우며 , 반대로 100증량 % 초과시에는 양친성 블록 공중합체의 분자량과 KRAS를 표적으로 하는 핵산 및 지질 복합체의 양을 고려할 때 적절한 크기의 미엘 구조를 형성하지 못하기 때문이다.
본 발명에 따른 조성물 중 미셀 구조체는 폴리락트산염 ( PIlANa)를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 폴리락트산염은 미셀의 코어 (내벽 )에 분포하여 코어의 소수성을 강화시켜 미셀을 안정시킴과 동시에 체내에서 세망내피계 (RES )를 효과적으로 회피하는 역할을 한다. 즉, 폴리락트산염의 카르복실산 음이온이 폴리락트산보다 효과적으로 양이온성 복합체와 결합하여 고분자 미셀의 표면전위를 감소시켜 폴리락트산염을 포함하지 않는 고분자 미엘에 비해 표면전위의 양성 전하가 감소하여 세망내피계에 의해 덜 포획되고. 이로 인하여 목적하는 부위 (예컨대, 암세포, 염증세포 등)로의 전달 효율이 우수하다는 장점이 있다.
상기 양친성 블록 공중합체와 별도의 성분으로 미셀 내벽 성분으로 포함되는 폴리락트산염은 수평균분자량이 500 내지 50 , 000달톤 . 구체적으로 1 .000 내지 10.000달톤인 것이 좋다. 분자량이 500달톤 미만이면 소수성이 너무 낮아 미셀의 코어 (내벽)에 존재하기 어렵고. 분자량이 50.000달톤을 초과하면 고분자 미셀의 입자가 커지는 문제가 있다.
상기 폴리락트산염은 양친성 블록 고분자 100중량부에 대하여 1내지 200중량부. 구체적으로 10 내지 100중량부, 더 구체적으로 30' 내지 60중량부로 사용될 수 있다. 폴리락트산염의 함량이 양친성 블록 고분자 100 중량부 대비 200중량부를 초과하면 미엘의 크기가 증가하여 . 멸균막을 사용한 여과가 어렵게 되고, 1중량부 미만이면 목적하는 효과를 충분히 얻을 수 없다.
일 구체예에서. KRAS를 표적으로 하는 핵산 1 중량부 대비 양친성 블록 공중합체를 10 내지 1 , 000 중량부. 폴리락트산염을 5 내지 500 중량부로 함유할 수 있다. 바람직하게는 양친성 블톡 공중합체를 50 내지 800 중량부, 보다 바람직하게는 100 내지 500 중량부로 함유할 수 있다. 바람직하게는. 폴리락트산염을 10내지 300중량부, 보다 바람직하게는 50내지 100증량부로 함유할 수 있다.
한 구체예에서 , 상기 폴리락트산염의 말단 중 카르복실산나트롬의 반대편의 말단은. 히드록시, 아세특시 . 벤조일옥시 , 데카노일옥시. 팔미토일옥시 및 탄소수 1 내지 2개의 알콕시로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나로 치환될 수 있다.
바람직한 하나의 양태로서 , 본 발명의 폴리락트산염은 하기 화학식 1 내지 6의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 '하나 이상인 것을 특징으로 한다.
[화학식 1]
R0-CHZ-[A]n-[B]m-C00M
상기 식 1에서 . A는 -C00-CHZ-이고; B는 -COO— CHY-, -COO-CHCH2CH2CH2CH2- 또는 -C00-CH2CH20CH2이며 : R은 수소원자, 또는 아세틸, 벤조일, 데카노일. 팔미토일. 메틸. 또는 에틸기이고; Z와 Y는 각각 수소원자. 또는 메틸 또는 페닐기이며 : M은 Na, K. 또는 Li이고; II은 1 내지 30의 정수이며 ; ni은 0 내지 20의 정수이다.
[화학식 2]
R0-CHZ- [ C00-CHX ] p- [ CO으 CHY' ] q-C00-CHZ-C00M 상기 식 2에서 . X는 메틸기이고; Y'는 수소원자 또는 페닐기이며 : p는
0 내지 25의 정수이고. q는 0 내지 25의 정수이되 , 단 p+q는 5 내지 25의 정수이고; R은 수소원자. 또는 아세틸, 벤조일, 데카노일. 팔미토일, 메틸 또는 에틸기이며; M은 Na, K, 또는 Li이고; Z 는 수소 원자. 메틸 또는 페닐기이다.
[화학식 3]
R0-PAD-C00-W-M'
圓
C—— CH2COOM COOM
상기 식 3에서 , W- CH2CO0M -CH—— CHaCOOM이고 : pAD는 또는
D丄-폴리락트산. D-폴리락트산, 폴리만델릭산, D丄-락트산과 글리콜산의 공중합체. D丄―락트산과 만델릭산의 공중합체. D丄-락트산과 카프로락론의 공중합체 및 D丄-락트산과 1,4-디옥산 -2-온의 공중합체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이며; R은 수소원자. 또는 아세틸, 벤조일, 데카노일, 팔미토이 또는 에틸기이고; M은 독립적으로 Na. Li이다.
[화학식 4]
S-0-PAD-COO-Q 상기 식 4에서 , S는
Figure imgf000019_0001
L은 -NR厂 또는 0-이며 , 여기서 1^은 수소원자 또는 d-κ)알킬이고: Q는 CH3, CH2CH3. CH2CH2CH3, CH2CH2CHCH3. 또는 CH2C6H5이고; a는 0 내지 4의 정수이며; b는 1 내지 10의 정수이고: M은 Na, K. 또는 Li이며; PAD는 D丄—폴리락트산. D-폴리락트산, 폴리만델릭산, D丄-락트산과 글리콜산의 공중합체, D丄-락트산과 만델릭산의 공중합체, D丄―락트산과 카프로락톤의 공중합체. 및 D丄―락트산과 1,4-디옥산 -2-온의 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이다.
[화학식 5]
Figure imgf000019_0002
CH2-O-R' 또는 CH2-0-R' 상기 식 5에서 '. R'는 -PAD-0-C(0)-CH2CH2-C(0)-0M이고, 여기서 PAD는
D丄-폴리락트산, D-폴리락트산, 폴리만델릭산, D丄-락트산과 글리콜산의 공중합체. D丄-락트산과 만델릭산의 공중합체, D丄-락트산과 카프로락톤의 공중합체. D丄―락트산과 1,4-디옥산 -2—온의 공중합체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이고. M은 Na, K, 또는 Li이며 ; a는 1 내지 4의 정수이다.
[화학식 6]
Y0-[-C(0)-(CHX)a-0-]m-C(0)-R-C(0)-[-0-(CHX')b-C(0)-]n-0Z
상기 식 6에서 . X 및 X'은 독립적으로 수소 , 탄소수가 1~10인 알킬 또는 탄소수가 6~20인 아릴이고; Y 및 Z는 독립적으로 Na. , 또는 Li이며 ; ni 및 n은 독립적으로 0 내지 95의 정수이되 . 5 < m + n < 100이고; a 및 b는 독립적으로 1 내지 6의 정수이며: R은 -(CH2)k-, 탄소수가 2~10인 2가 알케닐 (divalent alkenyl). 탄소수가 6~20인 2가 아릴 (divalent aryl ) 또는 이들의 조합이고. 여기서 k는 0 내지 10의 정수이다. 상기 폴리락트산염은 상기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물인 것인 바람직하다.
일 구체예에서. 본 발명의 조성물은 KRAS를 표적으로 하는 핵산의 세포 내 전달효율을 증가시키기 위하여 전체 조성물의 중량을 기준으로 0.01 내지 50중량 %. 구체적으로는 0.1 내지 10중량 %의 융합성 지질을 추가로 포함할 수 있다.
상기 융합성 지질은 KRAS를 표적으로 하는 핵산과 양이온성 지질의 복합체에 흔합시 , 소수성 상호작용으로 결합하여 KRAS를 표적으로 하는 핵산, 양이온성 지질 및 융합성 지질의ᅵ복합체를 형성하고, 상기 융합성 지질을 포함하는 복합체는 양친성 블톡 공중합체의 미셀 구조 내부에 봉입된다. 일 구체예에서. 상기 융합성 지질은 인지질, 콜레스테롤, 및 토코페를로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 조합일 수 있다.
구체적으로. 상기 인지질은 포스파티딜에탄을아민 ( phospha tidy let hano 1 am in, PE). 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine, PC) 및 포스파티딘산 (phosphat idic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 포스파티딜에탄을아민 (phosphat idylethanolamin. PE), 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine. PC) 및 포스파티딘산은 하나 또는 2 개의 C10-24 지방산과 결합된 형태일 수 있다. 상기 콜레스테를 및 토코페를에는 콜레스테를 및 토코페를의 각 유사체, 유도체, 및 대사체가 포함된다.
구체적으로는 융합성 지질은 디라우로일 포스파티딜에탄올아민 (di lauroyl phosphat idyl ethanol amine) . 디미리스토일 포스파티딜에탄을아민 ( d i myr istoyl phosphat i dy 1 e t hano 1 am i ne ) . 디팔미토일 포스파티딜에탄을아민 (dipalmi toyl phosphat idyl ethanol amine) , 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민 ( d i s t ear oy 1 phospha tidylet hano 1 am ine) , 디올레오일 포스파티딜에탄을아민 ( d i o 1 eoy 1 phospha tidylet hano 1 am ine). 디리놀레오일 포스파티딜에탄을아민 ( d i Π no 1 eoy 1 phospha t i dy 1 e t hano 1 am ine) . 1-팔미토일 -2-을레오일 포스파티딜에탄올아민 ( 1-pa 1 m i t oy卜 2— o 1 eoy 1 phosphat idyl ethanol amine) . 1,2-디피타노일 _3-sn—포스파티딜에탄을아민 ( 1 ,2-(liphytanoy卜 3-sn-phosphat idylethanol amine) , 디라우로일 포스파티딜콜린 (dilauroyl phosphat i cly 1 cho 1 ine) , 디미리스토일 포스파티딜콜린 (dimyristoyl phospha t i dy 1 cho line). 디팔미토일 포스파티딜콜린 ((lipalmitoyl phosphat idylchol ine ) , 디스테아로일 포스파티딜콜린 (distearoyl phosphat i dy 1 cho 1 i ne ) . 디올레오일 포스파티딜콜린 (dioleoyl phosphat i dy 1 cho 1 i ne ) , 디리놀레오일 포스파티딜콜린 (dilinoleoyl phospha t i cly 1 cho 1 i ne ) , 1—팔미토일— 2-을레오일 포스파티딜콜린 (1— palmitoy卜 2-oleoyl phosphat idylchol ine) , 1 ,2-디피타노일 -3- sn—포스파티딜콜린 ( 1 , 2-d i phy t anoy 1 -3-sn-phosphat i cly 1 ch oline), 디라우로일 포스파티딘산 (di lauroyl phosphat i die acid), 디미리스토일 포스파티딘산 (dimyristoyl phosphat i die acid). 디팔미토일 포스파티딘산 ((lipalmitoyl phosphat i die acid) , 디스테아로일 포스파티딘산 (distearoyl phosphat i die acid) , 디올레오일 포스파티딘산 (dioleoyl phospha tidic acid), 디리놀레오일 포스파티딘산 (di linoleoyl phosphat i die acid), 1-팔미토일 -2-을레오일 포스파티딘산 (l-palmitoyl- 2-oleoyl phosphat idic acid) ,
1 , 2-디피타노일 -3-sii—포스파티딘산 ( 1 , 2-d i phy t anoy 1 -3-sn-phosphat id ic acid), 콜레스테롤 및 토코페를로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 조합일 수 있다.
바람직한 구체예에세 상기 융합성 지질은 디올레오일 포스파티딜에탄을아민 ( d i 01 eoy 1 phospha t i dy 1 et hano 1 am i ne , DOPE ) , 디팔미토올레오일포스포콜린 ( 1.2-d ipalmitoleoyl -sn-g 1 ycero-3-phosphocho 1 ine. DPPC), 디올레오일포스포콜린 ( 1 , 2-d i o 1 eoy 1 -sn-g 1 ycero-3-phosphocho line. DOPC ) . 디팔미토을레오일포스포에탄올아민
( 1 , 2-d ipalmi tol eoy 1 -sn-g 1 ycer ο-3-phosphoe t hano 1 am i ne . DPPE ) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
구체적인 일 양태로서. 본 발명에 따른 양친성 블톡 공중합체 및 폴리락트산염 미셀 구조체에 봉입된 KRAS를 표적으로 하는 핵산-양이온성 lS 화합물 복합체 함유 조성물은, 혈관. 근육, 피하. 경구, 뼈. 경피 또는 국소 조직 등의 투여 경로를 통하여 투여될 수 있고, 이러한 투여 경로에 적합하게, 다양한 경구 또는 비경구 투여 제제로 제형화될 수 있다. 상기 경구 투여 제제로는 정제. 캡슐. 분체 제제. 액제 등, 비경구 투여 제제로는 점안제, 주사제 등 다양한 제제를 예시할 수 있는데. 바람직한 일 양태로서 . 상기 조성물은 주사용 제제일 수 있다. 예를 들어 . 본 발명에 따른 조성물을 동결건조하는 경우. 이를 주사용 증류수. 0.9% 생리식염수 및 5% 텍스트로스 수용액 등으로 재건하여 주사용 제제 형태로 제조할 수 있다. 본 발명은 또한. 상기 KRAS를 표적으로 하는 핵산을 함유하는 양친성 블록 공중합체 미셀을 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
구체적인 일 양태로서. 상기 KRAS를 표적으로 하는 핵산. 양이온성 지질. 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염을 포함하는 KRAS를 표적으로 하는 핵산 전달용 조성물을 제조하는 방법은.
(a) KRAS를 표적으로 하는 핵산과 양이온성 화합물을 각각 수성 용매에 용해시켜 흔합하는 단계:
(b) 단계 (a)에서 얻어진 흔합물을 동결건조하는 단계:
(c) 단계 (b)에서 얻어진 동결건조물을 유기 용매에 용해시키는 단계:
(d) 단계 (c)에서 얻어진 용액을 수성 용매와 흔합하는 단계: 및
(e) 단계 (cl)에서 얻어진 혼합물로부터 유기용매를 제거하는 단계: 를 포함하고. 이때. 양친성 블록 공증합체, 폴리락트산염 , 융합성 지질. 또는 양친성 블록 공증합체와 폴리락트산염과 융합성 지질을 단계 (c)의 유기 용매 또는 단계 (d)의 수성 용매에 용해시킬 수 있다. 일 양태에서 , 상기 단계 (a l서 KRAS를 표적으로 하는 핵산이 용해된 수용액에 대한 양이온성 화합물이 용해된 수용액의 부피비 (양이온성 화합물 수용액 /KRAS를 표적으로 하는 핵산 수용액)가 1 내지 20일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 동결건조 보조제는 동결건조된 조성물이 케이크 형태를 유지할 수 있도록 하거나. 양친성 블록 공중합체 조성물을 동결건조 후. 재건 (l-econstitution)하는 과정에서 빠른 시간 내에 균일하게 녹는 것을 도와주기 위해 첨가하는 것으로 , 구체적으로 . 락토스 만니를. 트레할로스, 솔비를 및 슈크로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 동결건조 보조제의 함량은, 동결건조 조성물 전체 건조중량을 기준으로, 0.1 내지 90 중량 더 구체적으로 0.2 내지 60% 중량이다
이러한 본 발명에 따른 제조방법을 통해 KRAS를 표적으로 하는 핵산과 양이온성 화합물 복합체가 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염 미엘 구조체에 봉입된 형태의 조성물이 제조된다. 구체적으로 제조된 조성물 내의 미셀 입자는 혈중에서 안정하며 . 그 크기는 10내지 200 nm이며. 더욱 구체적으로는 10 내지 150 nni이다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하. 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 자세하게 설명하나. 이들은 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 이들에 의하여 본 발명의 범위가 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.
비교예 및 실시예에서 사용되는 siRNA 서열은 아래 나타내는 바와 같다.
[표 1]
Figure imgf000023_0001
Ant i sense CTACCCCATCACCTCCMCTT 서열번호 4
(서열번호 4)
[제조예 1] 1，6-디올레오일 트리에틸렌테트라마이드 (1,6-dioleoyl triethylenetetramide)의 합성
한국등록특허 제 1308591호의 실시예 1에 기재된 공정에 따라 표제 화합물을 합성 및 확인하였다.
[제조예 2 및 3] 모노메특시폴리에틸렌글리콜-폴리락타이드 (mPEG-PLA) 블록 공중합체 (A-B)의 중합
한국등록특허 제 1308591호의 제조예 1에 기재된 공정에 따라 수평균 분자량은 5.000—4.000 달톤의 niPEG-PLA를 합성하였다 [제조예 2] . 동일한 방법으로 모노메특시폴리에틸렌글리콜 (분자량 2,000 달톤 이하. NOF corporation)을 사용하여 수평균 분자량이 2,000-1,750 달톤인 mPEG-PLA 블록 공중합체를 합성하였다 [제조예 3] ,
[제조예 4및 5] mPEG-PLA-토코페를의 중합
한국등록특허 제 130S591호의 제조예 5에 기재된 공정에 따라 mPEG-PLA-토코페를 (수평균 분자량 5,000-4.000-530 달톤) 을 얻었다 [제조예 4] .
동일한 방법으로 수평균 분자량이 2,000-1,750-530 달른인 mPEG-PLA-토코페를을 얻었다 [제조예 5] .
[제조예 6 및 7] 폴리락트산 (PLA) 합성
한국등록특허 제 1296326호의 제조예 8에 기재된 공정에 따라 PLA (수평균 분자량 1,700 달톤) 이며 , 수율은 87% 였다 [제조예 6] .
동일한 방법으로 24 시간 반응하여 수평균 분자량이 4,000 달톤인 폴리락트산을 중합하였다. 정제된 폴리락트산은 ^ᅳ NMR 을 통해 확인하였고. 수율은 85% 였다 [제조예 7] . [제조예 8 및 9] D,L-폴리락트산 나트륨염 (PLANa) 합성
제조예 6에서 얻어진 폴리락트산 (수평균 분자량 1,700) 100 g에 아세토니트릴 150 ml를 첨가하여 용해시켰다. 그런 다음, 탄산수소나트룸 수용액 (0.1 g/ml) 150 ml를 서서히 첨가하고, 60oC에서 2 시간 동안 100 rpiii에서 교반하였다. 상온에서 염화나트륨 15 g을 첨가하고 교반하면서 용해시킨 후. 분별 깔대기를 이용하여 수용액층을 제거하였다.
남아있는 유기용매층에 증류수 100 ml와 염화나트륨 10 g을 첨가하여 교반하면서 용해시켰다. 다시 분별 ·대기를 이용하여 유기용매층만 회수한 후. 얻어진 유기용매층을 80oC에서 진공조건으로 2시간 동안 분별 증류하여 , 유기용매와 증류수를 완전히 제거하였다.
그런 다음, 무수 아세톤 150 nil를 첨가하여 고분자를 용해시키고, 용해되지 않은 침전물은 여과 분리하여 제거하였다. S0°C에서 진공조건으로
2 시간 동안 분별 증류하여 , 아세톤을 제거하였다. 그 결과. 정제된 폴리락트산 나트륨염 69 g을 얻었다. 정제된 폴리락트산 나트륨염은 NMR 을 통하여 확인되었다 [제조예 8].
제조예 7에서 얻어진 폴리락트산 (수평균 분자량 4, 000)을 이용하여 폴리락틱산 나트륨염을 얻었다 [제조예 9].
[비교예 1] Luc if erase siRNA/1,6-디올레오일 트리에틸렌테트라미드 (dio-TETA)/mPEG"PLA-토코페를 (2k-1.7k) /PLANa (1.7k) /DOPE 함유 조성물 제조
상기 표 1에 개시된 서열번호 5의 센스 서열과 서열번호 6의 안티센스 서열로 이루어지는 Luc if erase siRNA 5 /g 은 증류수 94.52 //('에 녹이고, dioTETA 94.52 !ig 은 94.52 /d 의 100 ηιΜ 아세테이트버퍼 (pH4.2) 에 녹인 후 초음파 분쇄 상태에서 한 방울씩 섞어주었다. 이 혼합물을 동결건조시켜 분말 상태로 만들어 준 후 에틸아세테이트 10 // ('로 분말을 녹여주었다. 여기에 PLANa 300/ 을 에틸 아세테이트 15 / 에 녹인 용액 , DOPE 104.2/zg을 에틸 아세테이트 5.2 //.()에 녹인 용액. mPEG-PLA-토코페롤 1000 /g을 20 ,«('에 녹인 용액을 차례로 넣어준 후 섞어 주었다. 본 흔합액을 증류수 100/ ('에 한 방을씩 가하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 복합 유상액을 제조하였다. 제조한 복합 유상액을 1-구 등근 플라스크에 넣고 증류농축장치 (r0tary evap0rator)에서 감압 증류함으로써 에틸 아세테이트를 선택적으로 제거하여 hie if erase siRNA/1,6-디올레오일 트리에틸렌테트라아마이드 ((lio-TETA)/niPEG-PLA-토코페를 (2k-1.7k) /PLANa /DOPE 함유 고분자 미셀을 제조하였다.
표 2]
Figure imgf000026_0001
[실시예 1-2] KRAS siRNA/1,6-디올레오일 트리에틸렌테트라미드 (dio-TETAVmPEG^PLA-토코페를 (2k-1.7k) /PLANa (1.7k) /DOPE 함유 조성물 제조
상기 표 1의 서열번호 1의 센스 서열과 서열번호 2의 안티센스 서열로 이루어지는 KRAS를 표적으로 하는 siRNA (이하 'KRAS siRNA'라 함) 5 g 은 증류수 94.52 / ('에 녹이고. clioTETA 94.52 !ig 은 94.52 μί 의 100 niM 아세테이트버퍼 (pH4.2) 에 녹인 후 초음파 분쇄 상태에서 한 방을씩 섞어주었다. 이 흔합물을 동결건조시켜 분말 상태로 만들어 준 후 에틸아세테이트 10 / ('로 분말을 녹여주었다. 여기에 PLANa 300/g 을 에틸 아세테이트 15 // ('에 녹인 용액. DOPE 104.2/g을 에틸 아세테이트 5.2 ('에 녹인 용액. niPEG-PLA-토코페를 1000 을 에틸 아세테이트 20 ,"('에 녹인 용액을 차례로 넣어준 후 섞어 주었다. 본 흔합액을 증류수 100/ ('에 한 방을씩 가하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 복합 유상액을 제조하였다. 제조한 복합 유상액을 1-구 등근 플라스크에 넣고 증류농축장치 (rotary evap이—ator)에서 감압 증류함으로써 에틸 아세테이트를 선택적으로 제거하여 KRAS siRNA/dioTETA/ niPEG-PLA-토코페를 (2k- 1.7k) /PLANa (1.7k) I DOPE 함유 조성물을 제조하였다.
실시예 1과 동일한 방법으로 siRNA를 달리하여 (서열번호 3의 센스 서열과 서열번호 4의 안티센스 서열로 이루어지는 siRNA) KRAS siRNA/dioTETA/niPEG-PLA-토코페를 (2k-1.7k)/PLANa (1.7k) I DOPE 함유 조성물을 제조하였다. 실시예 1 및 2에서 얻어진 조성물은 아래의 표 3과 같다.
[표 3]
Figure imgf000027_0001
[실시예 3-6] KRAS siRNA/1,6-디올레오일 트리에틸렌테트라미드 (dio-TETA)/mPEG"PLA-토코페를 (2k-1.7k) /PLANa (1.7k) /DOPE 함유 조성물 제조
위와 동일한 방법으로 DOPE 양을, 달리하여 고분자 나노입자를 제조하였다. 실시예 3 내지 6에서 얻어진 조성물은 아래의 표 4와 같다. [표 4] ·α
조성 ¾- 조성 siRNA Cat ionic 고분 고분 He 1 per 비 lipid 자 1 자 2 lipid 실시 siRNA/dioTETA/mPE 5 i.ig 94.5 jig 1000 300 fig 208.4 예 3 (；- PLAᅳ토코페롤 l-ig
(2k- 1.7k) /PLANa
(1.7k) /DOPE
실시 siRNA/dioTETA/mPE o 5 94..5 /ig 1000 300 ug 52.1
l
예 4 G-PLA-토코페를 US
(2k- 1.7k) /PLANa
(1.7k)
실시 siRNA/dioTETA/mPE 5-18- 5 .g 94.5 f.ig 1000 20.84 예 5 G-PLA-토코페를 1-0.3 /-/g
(2k- 1.7k) /PLANa 一 0.2
(1.7k)
실시 siRNA/dioTETA/mPE 5 fig 94.5 iig 1000 300 !ig 10.42 예 6 G-PLA-토코페롤 /-¾' .
(2k- 1.7k) /PLANa
Figure imgf000028_0001
So.
(1.7k) /DOPE
[실시예 7-18] KRAS siRNA/1,6-디올레오일 트리에틸렌테트라미드 (dio-TETAVmPEXH A-토코페를 (2k-1.7k) /PLANa (1.7k) /DOPE 함유 조성물 제조
위와 동일한 방법으로 (lioTETA/siRNA 비율 (N/P ratio), mPEG— PLA-토코페를의 양 및 PLANa 양을 달리하여 고분자 나노입자를 제조하였다. 실시예 7 내지 18에서 얻어진 조성물은 아래의 표 5와 같다.
[표 5]
Figure imgf000028_0002
Figure imgf000029_0001
O LUO/LlOZW^/lDd 6 880/8I0Z OAV 실시 siRNA/dioTETA/mP 5 /g 5 94.52 lmg 0.3mg 예 16 EG-PLA-토코페롤
(2k- 1.7k) /PLANa
(1.7k) /DOPE
실시 siRNA/dioTETA/mP 5-24-1- 5 .g 5 lmg 0.4mg 예 17 EG-PLA-토코페를 0.3-1
(2k- 1.7k) /PLANa
Ύ
( 1.7k) /DOPE
실시 siRNA/dioTETA/mP 5 5 ！ 110.2 lmg 0.4mg 예 1S EG-PLA—토코페롤 7/g
(2k- 1.7k) /PLANa
(1.7k) /DOPE
[실험예 1] KRAS siRNA/1,6-디올레오일 트리에틸렌테트라미드 (dio-TETA)/mPEG"PLA-토코페를 (2k-1.7k) /PLANa (1.7k) /DOPE고분자 미셀의 유전자에 따른 입자크기 및 표면 전하 및 함량 비교
siRNA서열. siRNA/dioTETA의 비율 (N/P비율), 양친성 블록 공중합체
(2k- 1.7k) 양. PLANa (1.7k) 양 및 DOPE 양에 따른 미엘형성 여부를 환인하기 위하여 제형의 크기 , 표면 전하와 함량를 확인하였다.
동적 광산란 (DLS: dynamic light scattering) 방법을 이용하여 입자의 크기를 측정하였다. 구체적으로, He-Ne 레이져를 광원으로 사용하였으며 , MALVERN사의 Zetasizer Nano ZS90 기기를 매뉴얼에 따라 작동하였다.
또한. 각 조성비에 따라 미씰의 수득를이 어떻게 변화하는지 확인하기 위하여 siRNA 함량을 측정하였다. 변형된 Bligh & Dyer 추출법을 사용하여 제조된 siRNA/dioTETA/mPEG-PLA—토코페롤 (2k- 1.7k) /PLANa (1.7k) /DOPE 함유 고분자 미셀에서 siRNA를 정량하였다. 50ιιιΜ 소듐 포스페이트 (75mM NaCl 함유 (pH 7.5))에 제형을 넣고. 메탄을과 클로로포름을 적정 비율로 섞은 후 Bligh &Dyeiᅳ단일상을 만들고. K mM소듐 포스페이트와 클로로포름을 추가로 넣어 수층과 유기층을 분리한다. 수용액 층의 siRNA를 취하여 리보그린 (Ribogreen) 시약 ( Iiwi trogen)으로 정량 하였다. siRNA서열에 따른 실시예 1내지 2미앨의 크기 , 표면 전하 및 함량은 아래의 표 6에 나타내었다.
[표 6]
Figure imgf000031_0001
DOPE 양을 달리한 실시예 3
함량은 아래의 표 7에 나타내었다.
표 7]
Figure imgf000031_0002
실시예 5 siRNA/dioTETA/mPEG-PL 5-18-1-0.3-0. 27nm -6.64mV 81% A-토코페를 5 2
(2k- 1.7k) /PLANa
(1.7k)
실시여 16 siRNA/dioTETA/mPEG-PL 5-18-1-0.3-0. 29nm -4.25niV 68%
A-토코페를 1
(2k- 1.7k) /PLANa
(1.7k) /DOPE dioTETA/siRNA 의 비율 (N/P 비율). 양친성 블톡 공중합체 (2k- 1.7k) 양 및 PLANa (1.7k) 양을 달리한 실시예 7 내지 18의 입자의 크기 , 표면 전하 및 함량은 아래의 표 8에 나타내었다.
[표 8]
Figure imgf000032_0001
1U C |O1 LA-토코페를
스
(2k-1.7k)/PLANa
(1.7k) /DOPE
siRNA/dioTETA/mPEG-P 5-21- L-0.4-1 37 nm 73% LA-토코페를
(2k-1.7k)/PLANa
(1.7k) /DOPE
실시예 siRNA/dioTETA/mPEG-P 5-24-1-0.5-1 43nm -2.2mV 71%
13 LA-토코페를 >
(2k-1.7k)/PLANa
(1.7k) /DOPE
실시예 siRNA/dioTETA/mPEG-P
Figure imgf000033_0001
CO 65nm -2.4mV 89% 14 LA-토코페를
(2k-1.7k)/PLANa
(1.7k) /DOPE
실시예 siRNA/dioTETA/mPEG-P 5-18-2-0.3-1 26nm -5.4mV 44% 15 LA-토코페를
(2k-1.7k)/PLANa
(1.7k) /DOPE
실시예 siRNA/di으 1'ETA/mPEG-P 5-24-0.5-0.3- 70nm 1. SmV 71% 6 LA-토코페를 1
(2k-1.7k)/PLANa
(1.7k) /DOPE
실시예 siRNA/dioTETA/mPEG-P 5-24-1-0.3-1 29nm 0.3mV 76% 7 LA-토코페롤
(2k-1.7k)/PLANa
(1.7k) /DOPE
siRNA/dioTETA/mPFX,-P 5-24-2-0.3-1 26nin -4. SmV 50% LA-토코페롤
(2k-1.7k)/PLANa
(1.7k) /DOPE
[실험예 2] KRAS siRNA/l,6-dioTETA/mPEG"PLA-토코페를 (2k-1.7k)/PLANa (1.7k) /DOPE 고분자 나노 입자의 in vitro 안정성 비교 (헤파린 경쟁 분석법)
각 조성비에 따른 in vitro 안정성을 살펴보기 위해 해파린 경댕분석법을 실시하였다. 제형 10 //(' (siRNA 300 ng) 에 헤파린 40 / 을 처리하여 10분간 상온에 반응시킨 후 전기영동을 통해 와해된 siRNA를 측량하였으며 , siRNA 와해도가 낮을수록 안정성이 우수한 제형이다.
실시예 1 내지 18의 나노 입자에 대한 안정성 비교 결과는 아래의 표 9, 10 및 11과 같다. 표 9의 siRNA서열에 따른 헤파린 경댕 분석 결과 siRNA 서열에 상관없이 헤파린에 의한 와해도가 낮음을 알 수 있다. 표 10 및 11의 각 조성물 비율에 따른 해파린 경쟁 분석 결과 dioTETA와 PLANa 양이 증가할 수록, mPEG-PLA-토코페를 양은 감소할수록 헤파린에 의해 와해되는 siRNA의 양이 적은 경향을 관찰할 수 있다. 비교적 높은 양의 헤파린을 사용했음에도 불구하고 헤파린에 의한 siRNA 와해도는 적으며, 이러한 결과는 siRNA 가 고분자 나노 입자 안에 안정적으로 봉입되어 혈중 또는 체내에서도 안정성이 유지 될 수 있음을 나타낸다.
siRNA 서열에 따른 실시예 1 내지 2의 나노 입자에 대한 안정성 비교 결과는 아래의 표 9와 같다.
[표 9]
Figure imgf000034_0001
DOPE 양을 달리한 실시예 3 내지
안정성 비교 결과는 아래의 표 10과 같다.
[표 10] 조성물 조성비 siRNA 와해도
(%)
실시예 3 s i RNA/d i oTETA/mPEG-PLA-토코페롤 5-18-1-0.3-2 15.3 %
(2k- 1.7k) /PLANa (1.7k) /DOPE
실시예 4 s i RNA/d i oTETA/mPE (厂 PLA—토코페를 5-18-1-0.3-0.5 11.21 %
(2k- 1.7k) /PLANa (1.7k)
실시예 5 s i RNA/d ί으 ΓΕΤΑ/mPEG-PLA-토코페를 5-18-1-0.3-0.2
(2k- 1.7k) /PLANa (1.7k)
실시예 6 s i RNA/d ioTETA/mPEG-PLA—토코페를 5-18-1-0.3-0.1 13.23 %
(2k- 1.7k) /PLANa (1.7k) /DOPE dioTETA/siRNA 의 비율 (N/P 비율). 양친성 블록 공중합체 (2k- 1.7k) 및 PLANa (1.7k) 양을 달리한 실시예 7 내지 18의 입자의 해파린 경쟁을 한 안정성 비교 결과는 아래의 표 11에 나타내었다.
[표 11]
Figure imgf000035_0001
14 를 (2k- 1.7k) /PLANa (1.7k) /DOPE 1
실시예 s i RNA/d i oTETA/mPEG-PLA-토코페 5-18-2-0.3-1 37 %
15 를 (2k- 1.7k) /PLANa (1.7k) /DOPE
s i RNA/d i oTETA/mPEG-PLA-토코페 5-24-0.5-0.3- 19 % 롤 (2k_1.7k)/PLANa (1.7k) /DOPE 1
실시예 si RNA/d i oTETA/mPEG_PLA-토코페 5-24-1-0.3-1 36 %
17 롤 (2k- 1.7k) /PLANa (1.7k) /DOPE
실시예 s i RNA/d i oTETA/mPEG-PLA-토코페 5-24-2-0.3-1 68 %
18 를 (2k- 1.7k) /PLANa (1.7k)/D0PK
[실험예 3] KRAS siRNA/1,6-디올레오일 트리에틸렌테트라미드 (dio-TETA)/mPEG"PLA-토코페를 (2k-1.7k) /PLANa (1.7k) /DOPE고분자 미셀의 혈중 농도 비교
실시예 1과 2에서 제조된 제형을 동물에 투여하고 투여 0.5시간.
6시간 후에 채혈을 하여 RT (Reverse Transcrip ion) 와 qRT-PCR (quantitative Reverse Transcr ipt ion-Polymerase Chain React i on ) 방법百 이용해 아래와 같은 방법으로 미셀의 혈중 농도를 분석하였다.
제형을 lmg/kg로 Balb/c마우스에 정맥 주사하여 0.5시간. 6시간 후에 각각 채혈한다. 혈액을 13000 rpm, 4에서 15분간 원심분리기를 돌려 상층 부분만 새 튜브에 모으고, 스탠다드용 제형의 농도는 4 μΜ에서 0.00256 μΜ까지 총 11개의 농도로 PBS에 희석하여 준비한다. PCR용 96웰 플레이트에 스랜다드용으로 희석한 제형을 1 넣고 9 fd$ Balb/c 마우스 혈청과 90 의 0.25% triton X-100을 넣어준다. 실험군 혈액 샘플 10 에 90 의 0.25% Triton X-100 를 넣어준 후 전달체를 풀어주는 전처리 단계를 거친다. 제형이 풀어짐으로써 노출된 siRNA를 역전사 (RT) 단계를 거쳐 d)NA로 합성하고 합성된 cDNA를 이용하여 QRT-PCR (Bio-Racl CFX96 Real-Time System) 을 수행하였다. 분석은 Bio-Rad CFX Manager 프로그램을 이용하여 분석하였다.
[표 12]
Figure imgf000036_0001
0.5시간 6시간
비교예 1 9.046 3,021
11,551 4,561
실시여 12 L0.342 3,50:5 상기 표 12에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 실시예 1 및 2에서 제조된 제형은 비교예 1과 유사하게 높은 혈증 농도를 보이며, 이는 siRNA 서열과 상관없이 나노 입자의 혈중 안정성이 동일함을 확인할 수 있다.
[실험예 4] K AS siRNA/1,6-디올레오일 트리에틸렌테트라미드 (dio-TETAVmPEG^PLA-토코페를 (2k-1.7k) /PLANa (1.7k) /DOPE고분자 미셀의 세포별 효능 및 독성 비교
비교예 1과 실시예 1에서 제조된 KRAS siRNA/1,6-디을레오일 트리에틸렌테트라미드 (dio-TETA)/mPEG-PLA-토코페를 (2k-1.7k) /PLANa (1.7k) /DOPE 고분자 미셀에 대해 KRAS siRNA에 의한 세포 내 전달 효능을 세포 별로 확인하였다. 대표적인 폐암 세포인 A549 세포를 비롯하여 H23과 Calu-6 세포주에 대한 siRNA 전달 효능을 niRNA 수준에서 각각 확인하였다.
96웰 세포 배양판에 웰당 5000개의 세포를 분주하고 24 이간 후 각 웰의 세포가 50~60 % 정도 균일하게 성장한 것을 확인 후 웰 안의 배지를 제거하고 최종 부피의 10%의 혈청을 함유하는 새 배지를 9() 씩 첨가하였다. 여기에 상업적 전달체 제품인 리포펙타민 (Li pofect amine 3000. Invitrogen, USA)과 결합한 KRAS siRNA 대조군과 함께 실시예 1과 비교예 1의 조성물을 100 nM. 50 nM, 5 nM, 0.5 ιιΜ, 0.05 iM 의 농도로 siRNA가 함유되도록 상기의 세포 배양 배지에 각각 가하였다. 37 t의 5 % CO 배양기에서 24시간, 48시간 동안 배양 후 배양액을 제거하고 cell lysis mixture 100/ 를 넣어 50t:에서 1시간 동안 반응시켜 주었다. 그 후 m NA 발현 확인을 위해 Branched DNA assay (bDNA. Quant i gene 2.0 Assay kit , Panoniics. QS0009)을 이용하였고, 프로토콜에 따라 2.0 substrate를 넣고 상은에서 5분간 반웅入 1킨 mi crop late fluorescence reader (Bio—Tek, Synergy HT)를 이용하여 형광 발현양을 측정하였다. 또한. 세포 내 독성 분석을 위해 Cell
Titer一 Glo luminescent cell viabi 1 i ty assay (Pr omega, G7571)을 이용하였고 프로토콜에 따라 상은화시킨 cell plate 에 분석샘플 (100 )과 Cell titer assay reagent (50 )를 넣고 30분간 반웅시켜준 후 microplate fluorescence reader (Βίο-Tek. Synergy HT)기를 이용하여 값을 측정하였다. A549세포주. H23세포주 Calu-6세포주에 대한 효능 독성 평가 결과는 각각 표 13과 14(A549 세포주) 및 15와 16(H23 세포주) 및 17과 18(Calu-6 세포주)에 나타내었다. 표 13 내지 18에서 ANP(KRAS)는 실시예 1의 제형， ANP( iciferase)는 비교예 1의 제형을, Lipo(KRAS)는 실시예 1의 리포펙타민과 결합한 KRAS siRNA 대조군을 가리킨다.
[표 13]
Figure imgf000038_0001
[표 14]
Figure imgf000038_0002
[표 15]
Figure imgf000038_0003
[표 16] Efficacy (bDNA, mRNA expression %) nM 24h 48h
ANP( RAS) ANP(NC#34) Lipo(KRAS) ANP(KRAS) ANP(NC#34) Lipo(KRAS)
100 15.7 76.7 16.0 114 114.2 19.9
50 10.5 84.2 36.2 9.1 102.9 36.3
5 44.3 97.2 89.3 44.4 104.7 94.2
0.5 86.2 102.9 108.9 97.8 94.2 97.0
0.05 95.9 110.7 125.0 97.0 99.0 105.7
[표 17]
Figure imgf000039_0001
[표 18]
Figure imgf000039_0002
상기 표에서와 같이 본 발명의 실시예에서 제조된 제형돌은 매우 낮은 s i RNA 투여 농도에서도 siRNA를 효율적으로 세포 내로 전달하여 표적 AS mRNA의 발현을 억제하였음을 알 수 있다. 특히 리포펙타민과 유사하거나 향상된 수준으로 KRAS mRNA의 발현을 억제하면서도 세포 생존를이 더 높음을 알 수 있다. 이는 본 발명의 조성물이 리포펙타민보다 독성 대비 활성이 더 뛰어남을 의미한다.
[실험예 5] KRAS siRNA/1 ,6-디을레오일 트리에틸렌테트라미드 (dio-TETAVmPEG^PLA-토코페를 (2k-1.7k) /PLANa (1.7k) /DOPE고분자 미셀의 생체 내 (이종이식 종양 모델 ( in vivo xenograft tumor model )) 활성 평가
KRAS si NA/1.6-디을레오일 트리에틸렌테트라미드
(dio-TETA)/mPEG— PLA-토코페를 (2k-1.7k) /PLANa ( 1.7k) /DOPE 고분자 나노입자가 생체 내에서 . 사용한 siRNA의 대상 유전자 KRAS를 억제할 수 있는지를 이종이식 (xenograf t ) 동물 모델에서 단백질 수준을 확인하였다. 누드 마우스 (중앙실험동물 제공)에 A549 폐암 세포주 (ATCC)를 피하에 주입하여 암이 유발된 생쥐를 제조하였다. 실시예 1의 KRAS siRNA/dio— TETA/mPEG-PLA-토코페롤 /PLANa /DOPE 나노입자를 암 모델 생쥐에 1 nig/kg, 5 nig/kg 의 용량으로 다회 정맥 투여한 후 암 크기 측정 . KRAS mRNA 양과 단백질양을 분석하였다. 마지막 투여 후 48시간에 암조직을 적출 후 분쇄하여 KRAS niRNA와 단백질의 양을 각각 branched DNA assay 와 western blot으로 분석하였다. 대조군으로는 생리식염수를 투여하였다. 실험 결과는 표 19 및 도 3에 나타내었다.
[표 19] KRAS niRNA와 단백질 발현율 측정
Figure imgf000040_0001
도 3에서 알 수 있는 바와 같이. Control을 투여한 마우스는 처음 실험을 시작 할 때 보다 50일 후 약 30배 암이 커겼지만, lmg 의 나노입자 (IcPNP)를 투여한 마우스의 암은 약 11배 암이 커졌다. 즉 control 그룹보다 약 70% tumor delayed growth 효과를 얻었다. 한편 표 19에 나타난 바와 같이, KRAS niRNA의 발현율을 bDNA를 통해 측정한 결과. Control을 100으로 기준하였을 때 , lmg/kg투여군에서는 약 49%의 knock down을 , 5mg/kg 투여군에서는 약 84%의 knock clown을 확인하였다. 또한. 암 조직을 분쇄하여 KRAS 단백질의 발 ：을 ^ten Jilot을―통해ᅳ관찰한ᅵ 결과, contmL 그룹ᅳ은 band 의 intensity, 두께 등을 비교 할 때, KRAS 가 많이 발현 되는 것을 볼 수 있고, lnig/kg. 5mg/kg 그룹은 점차 band 가 희미해 진 것을 보아 KRAS 단백질 발현 양이 줄어들었음을 확인할 수 있었다. Protein band 의 intensity를 image J 로 정량하여 수치로 확인하였으며 그 결과. ling/kg투여 군의 KRAS protein 발현율은 Control 대비 약 68%, 5mg/kg투여군은 약 72%의 발현 억제율을 보였다. 결과적으로, 나노입자가 폐암 A549이종이식 모델에서 독성 없이 암의 성장을 억제하고, KRASni NA및 protein의 발현량을 50%이상 억제하는 것을 관찰 하였다.
[실험예 6] KRAS siRNA/1,6-디올레오일 트리에틸렌테트라미드 (dio-TETAVmPEG^PLA-토코페롤 (2k-1.7k) /PLANa (1.7k) /DOPE 고분자 나노입자의 생체 내 (동소이식 종양 모델 (in vivo orthotopic tumor model)) 활성 평가
RAS siRNA/1,6-디올레오일 트리에틸렌테트라미드 (dio-TETA)/mPEG-PLA—토코페롤 (2k-1.7k) /PLANa (1.7k) /DOPE 고분자 나노입자가 생체 내에서 , 사용한 siRNA의 대상 유전자 KRAS를 억제할 수 있는지를 동소이식 마우스 (orthotopic mouse) 모델에서 확인하였다.
GFP가 발현된 A549세포. A549-GFP세포를 SLC(BALB/c. nu/nu. Female) a thymic nude mice 에 intravenous inject ion 한다. 약 2주 후 폐에 암이 생성된 것을 형광 이미지를 통해 확인 가능 하였다. A549-GFP 세포를 마우스의 꼬리로 주입하여 2주 후부터 실시예 1의 KRAS siRNA/dio-TETA/mPEG— PLA—토코페를 /PLANa /DOPE 나노입자를 암 모델 생쥐에 0.5. 1. 3mg/kg의 용량으로 다회 정맥 투여하였다. 마지막 투여 후 조직을 sacrifice하여 폐 부분을 개복하고 GFP imaging machine으로 GFP imaging을 통해 암의 성장을 관찰 하였다. 대조군으로는 생리식염수를 투여하였다. 실험 결과는 도 4 및 도 5에 나타내었다.
도 4 및 5에서 대조군은 GFP가 많이 발현 되는 것으로 보아, A549 폐암세포가 폐에 많이 포진 되어있음을 알 수 있다. 실제로 육안으로도 폐에 많은 폐암 조직이 생겨난 것을 발견할 수 있었다. 나노입자 (ANP)를 투여한 그룹에서는 약한 GFP signal 을 보였으며 , 이로부터 KRAS 를 넉다운 시킴으로써 암의 성장을 막았음을 알 수 있다. 0.5. 1. 3mg/kg 중 3mg/kg 의 암 생성 억제 효능이 가장 좋았으며 0.5 와 lmg/kg 의 효능은 비슷한 수준으로 관찰되었다. . [실험예 7] KRAS siRNA/1,6-디올레오일 트리에틸렌테트라미드
(dio-TETAVmPEXHlA-토코페를 (2k-1.7k) /PLANa (1.7k) /DOPE 고분자 나노입자의 생체 내 (KRASG12D Genetic engineered mouse model) 활성 평가
KRAS siRNA/1,6—디을레오일 트리에틸렌테트라미드
(dio-TETA)/mPEG— PLA-토코페를 (2k- 1.7k) /PLANa (1.7k) /DOPE 고분자 나노입자가 생체 내에세 사용한 siRNA의 대상 유전자 KRAS를 억제할 수 있는지를 K ASG12D Genetic engineered mouse model에서 단백질 수준을 확인하였다.
Mutated K-ras 암유전자가 knock— in 되어 있는 마우스에 실시예 1의 KRAS siRNA/dio— TETA/mPEG-PLA-토코페를 /PLANa /DOPE 나노입자를 1 nig/kg 의 용량으로 다회 정맥 투여하였다. 투여 후 마우스의 폐 조직을 적출하여 암 nodule 개수를 측정하고. KRAS niRNA 양과 단백질 양을 분석하였다. KRAS mRNA와 단백질의 양을 각각 branched DNA assay 와 western blot으로 분석하였다. 대조군으로는 생리식염수를 투여하였다. 실험 결과는 도 6. 7 및 8, 및 표 20에 나타내었다.
[표 20] 폐에서의 KRAS mRNA, 단백질 발현율
Figure imgf000042_0001
도 6 및 도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이 , 모든 마우스에서 폐에 종양 결¾( tunior nodule)이 관찰 되었다. 특히 대조군 (CTRL/Control )의 경우에는 많은 마우스에서 폐의 많은 면적이 암 조직화된 것을 확인하였다. 또한, 대조군은 폐 한쪽이 모두 암 조직화되어 색이 변하고 딱딱해진 것을 확인 할 수 있었다. 나아가. 표 20에 나타난 바와 같이, 대조군에 비해 나노입자 (ANP) 투여 군의 KRAS mRNA 발현율이 약 40 %, 단백질은 약 50% 억제된 것을 확인 하였다. 또한. 도 8에 나타난 바와 같이 , 대조군과 나노입자 (ANP/IcPNP) 투여 군을 비교 하였을 때 KRAS의 발현뿐 아니라 KRAS pathway 의 pMEK, pERK 의 signal 이 억제 된 것을 확인 하였다. 또한. 세포의 성장을 조껄하는 pMT 의 발현도 대조군과 비교해 약 74% 억제되었다.

Claims

【청구의 범위】 【청구항 1】 유효성분으로서 KRAS를 표적으로 하는 핵산: 양이은성 화합물: 양친성 블록 공중합체: 및 하기 화학식 1 내지 6의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 폴리락트산염을 포함하며 . 상기 KRAS를 표적으로 하는 핵산은 상기 양이은성 화합물과 정전기적 상호작용에 의해 복합체를 형성하고, 상기 복합체는 양친성 블록 공증합체 및 폴리락트산염이 형성하는 미셀 구조 내부에 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는. KRAS를 표적으로 하는 핵산 전달용 조성물:
[화학식 1]
R0-CHZ-[A]n-[B]m-C00M
상기 식 1에서 , A는 -COO— CHZ-이고; B는 C00-CHY— .
-COO-CH2CH2CH2CH2CH2- 또는 -C00-CH2CH20CH2이며 ; R은 수소원자. 또는 아세틸. 벤조일, 데카노일. 팔미토일, 메틸. 또는 에틸기이고; Z와 Y는 각각 수소원자, 또는 메틸 또는- 페닐기이며 : M은 Na, K, 또는 Li이고: n은 1 내지 30의 정수이며; m은 0 내지 20의 정수이다 .
[화학식 2]
R0-CHZ- [ C00-CHX ] p- [ C00-CHY' ] q—C00-CHZ-COOM 상기 식 2에서 , X는 메틸기이고: Y'는 수소원자 또는 페닐기이며 ; p는 0 내지 25의 정수이고, q는 0 내지 25의 정수이되, 단 p+ci는 5 내지 25의 정수이고: R은 수소원자. 또는 아세틸, 벤조일. 데카노일. 팔미토일, 메틸 또는 에틸기이며 : M은 Na, K, 또는 Li이고: Z 는 수소 원자. 메틸 또는 페닐기이다.
[화학식 3]
R0-PAD-C00-W-M' 상기 식 3에서 , W-M'는
Figure imgf000044_0001
CHaCOOM이고: pAD
D丄-폴리락트산, D-폴리락트산, 폴리만델릭산, D丄―락트산과 글리콜산의 공중합체, D丄-락트산과 만델릭산의 공중합체. D丄-락트산과 카프로락톤의 공중합체 및 D丄-락트산과 1 , 4-디옥산 -2-은의 공중합체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이며 ; R은 수소원자. 또는 아세틸, 벤조일, 데카노일 , 팔미토일 . 메틸 또는 에틸기이고; M은 독립적으로 Na . K , 또는 Li이다.
[화학식 4]
S-0-PAD-C00-Q 상기 식 4에서, S는
Figure imgf000044_0002
L은 NR! -또는 -0—이며, 여기서 ！^은 수소원자 또는 d— 10알킬이고: Q는 CH3. CH2CH3 . CH2CH2CH3 , CH2CH2CH2CH3 , 또는 CH2C6H5이고; a는 0 내지 4의 정수이며 ; b는 1 내지 10의 정수이고; M은 Na . K. 또는 Li이며; PAD는 D丄—폴리락트산, D-폴리락트산, 폴리만델릭산.' D丄 -락트산과 글리콜산의 공중합체. D丄―락트산과 '만델릭산의 공중합체, D丄―락트산과 카프로락톤의 공중합체. 및 D丄-락트산과 1 , 4-디옥산 -2-온의 공중합체로 이루어진' 군에서 선택되는 하나 이상이다.
[화학식 5]
'
Figure imgf000044_0003
상기 식 5에서. R'는 -PAD— 0-C(0)_CH2CH2— C(0)-0M이고, 여기서 PAD는 D丄-폴리락트산, D-폴리락트산, 폴리만델릭산. D丄-락트산과 글리콜산의 공중합체. D丄-락트산과 만델릭산의 공중합체, D丄ᅳ락트산과 카프로락톤의 공중합체. D丄-락트산과 1,4 디옥산 -2—온의 공중합체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이고. M은 N . K. 또는 Li이며: a는 1 내지 4의 정수이다.
[화학식 6]
YO-[-C(0)-(CHX)a-0-]m-C(0)-R-C(0)-[-0-(CHX')b-C(0)-]n-OZ
상기 식 6에서, X 및 X'은 독립적으로 수소, 탄소수가 1~10인 알킬 또는 탄소수가 6~20인 아릴이고: Y 및 Z는 독립적으로 Na, K, 또는 Li이며 : m 및 n은 독립적으로 0 내지 95의 정수이되 , 5 < in + n < 100이고; a 및 b는 독립적으로 1 내지 6의 정수이며 ; R은 -(CH2)k-. 탄소수가 2~10인 2가 알케닐 (divalent alkenyl), 탄소수가 6~20인 2가 아릴 (divalent aryl) 또는 이들의 조합이고. 여기서 k는 0 내지 10의 정수이다.
【청구항 2】
제 1항에 있어서 .
상기 KRAS를 표적으로 하는 핵산은 KRAS를 표적으로 하는 siRNM short interfering RNA)인 것을 특징으로 하는, KRAS를 표적으로 하는 핵산 전달용 조성물.
【청구항 31 '
저 U항에 있어서 .
상기 핵산 또는 상기 양친성 블록 공증합체는 하나 이상의 말단이 콜레스테롤. 토코페를. 및 탄소수 10 내지 24개의 지방산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 수식된 것을 특징으로 하는. KRAS를 표적으로 하는 핵산 전달용 조성물.
【청구항 4]
제 1항에 있어서.
상기 양이온성 화합물은 양이온성 지질 및 양이온성 고분자로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 KRAS를 표적으로 하는 핵산 전달용 조성물.
【청구항 5]
저 14항에 있어서 .
상기 양이온성 지질은 N . N-디을레일 -N . N-디메틸암모늄클로라이드 ( DODAC ) .
N , N-디스테아릴 -N , N-디메틸암모늄브로마이드 ( DDAB ) .
N一 (1— (2,3-디올레오일옥시)프로필-1^1^—트리메틸암모늄클로라이드(0 1/\?). N , N-디메틸— ( 2 , 3-디올레오일옥시 )프로필아민 (D0DMA ) ,
1,2—디아실 -3-트리메틸암모늄—프로판 (TAP).
1,2-디아실 -3-디메틸암모늄—프로판 (DAP).
3베타 -[Ν-(Ν' ,Ν' ,Ν'-트리메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테를 (TC
콜레스테를),
3베타 [Ν-(:Ν' ,Ν'—디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테를 (DC-콜레스테롤). 3베타 [ N- ( N '―모노메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테를 ( MC-콜레스테를). 3베타 [ N- (아미노에탄)카바모일]콜레스테를 ( AC-콜레스테를),
콜레스테릴옥시프로판 -1ᅳ아민 (C0PA). Ν-(Ν'-아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페를 (AC-토코페를) 및 Ν-(Ν'ᅳ메틸아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤 (MC-토코페롤)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인. KRAS를 표적으로 하는 핵산 전달용 조성물.
【청구항 6】
저 항에 있어서 ,
상기 양이온성 지질은 하기 화학식 7의 양이온성 지질인 . KRAS를 표적으로 하는 핵산 전달용 조성물:
[화학식 기
Figure imgf000046_0001
상기 식에서 ,
η과 m은 각각 0 내지 12이되 , 2 ≤ n + m ≤ 12이며 , a와 b는 각각 1 내지
6이며 , R1과 R2는 각각 독립적으로 탄소수 11 내지 25개의 포화 및 불포화 탄화수소로 이루어진 군에서 선택된 것이다.
【청구항 7]
저 16항에 있어서. n과 HI은 독립적으로 1 내지 9이며 , 2 < η+ιιι < 10인 . KRAS를 표적으로 하는 핵산 전달용 조성물.
【청구항 8】
제 6항에 있어서 . a와 b가 2 내지 4인, KRAS를 표적으로 하는 핵산 전달용 조성물.
【청구항 9】
제 6항에 있어서. R1과 R2는. 각각 독립적으로, 라우릴 (lauryl). 미리스틸 (myristyl), 팔미틸 (palniityl), 스테아릴 (stearyl). 아라키딜 (arachidyl ), 베헨닐 (behenyl ). 리그노세릴 (lignoceryl). 세로틸 (cerotyl). 미리스트을레일 (myristoleyl), 팔미트올레일 (paliiii toleyl ) , 사피에닐 (sa ienyl). 올레일 (oleyl). 리놀레일 (linoleyl). 아라키도닐 (arachiclonyl ) , 에이코사펜타에닐 (eicosapentaenyl) . 에루실 (enacyl). 도코사핵사에닐 (docosahexaenyl), 및 세로틸 (cerotyl)로 이루어진 군에서 선택된 것인, KRAS를 표적으로 하는 핵산 전달용 조성물.
【청구항 10]
제 4항에 있어서.
상기 KRAS를 표적으로 하는 핵산 (P)과 양이은성 지질 (N)의 전하량의 비율 (N/P)은 0.1 내지 128인 것을 특징으로 하는 KRAS를 표적으로 하는 핵산 전딜용 조성물.
【청구항 11】
제 1항에 있어서.
상기 양친성 블록 공중합체는 친수성 A 블록과 소수성 B 블록으로 구성되는 Aᅳ B 형 이중 블록 공중합체이며 . 상기 친수성 A 블록은 폴리알킬렌글리콜. 폴리비닐알콜, 폴리비닐피를리돈, 폴리아크릴아미드 및 그 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이며 . 상기 소수성 B 블록은 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리아미노산ᅳ 폴리오르소에스테르 및 . 폴리포스파진으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, KRAS를 표적으로 하는 핵산 전달용 조성물.
【청구항 12]
제 11항에 있어서,
상기 친수성 A 블톡의 수평균 분자량은 200 내지 50.000달톤이고. 친수성 B 블톡의 수평균 분자량은 50 내지 50.000달톤인 것을 특징으로 하는, KRAS를 표적으로 하는 핵산 전달용 조성물.
【청구항 13]
제 1항에 있어서 , 상기 폴리락트산염의 수평균 분자량이 500 내지 50 , 000달톤인 것을 특징으로 하는. KRAS를 표적으로 하는 핵산 전달용 조성물.
【청구항 14]
저 U항에 있어서 ,
KRAS를 표적으로 하는 핵산 1 중량부 대비 양친성 블록 공중합체를 10 내지 1 , 000 증량부 및 폴리락트산염을 5 내지 500 중량부로 함유하는 것을 특징으로 하는, KRAS를 표적으로 하는 핵산 전달용 조성물.
【청구항 15]
제 1항에 있어서. 미앨의 표면 전하가 —20 내지 20 niV인 것을 특징으로 하는. KRAS를 표적으로 하는 핵산 전달용 조성물.
PCT/KR2017/011740 2016-11-09 2017-10-23 Kras를 표적으로 하는 핵산 함유 약제학적 조성물 및 그 제조방법 WO2018088719A1 (ko)

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