[
발명의 요약]
본 발명의 목적은 (a) 친수성 블록과 소수성 블록의 말단 히드록시기가 토코페롤기 또는 콜레스테롤기로 치환된 소수성 블록으로 구성된 양친성 블록 공중합체, (b) 말단에 적어도 하나의 카르복시기를 갖는 폴리락트산 유도체, 및 임의로 상기 폴리락트산 유도체의 카르복시 말단기 1 당량에 대하여 0.01 내지 10 당량의 2가 금속 또는 3가 금속를 포함하는 고분자 조성물로 제조되는 고분자 약물을 이용하여 생물 활성제를 세포내로 전달하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 고분자 약물 담체 및 수용액 상에서 상기 고분자 약물 담체에 봉입된 생물 활성제를 포함하며,
상기 고분자 약물 담체는 (a) 친수성 블록과 고분자의 말단 히드록시기가 토코페롤기 또는 콜레스테롤기로 치환된 소수성 블록으로 구성된 양친성 블록 공중합체, 및 (b) 말단에 적어도 하나의 카르복시기를 갖는 폴리락트산 유도체를 포함하는 고분자 조성물로 제조되며;
상기 약물 담체가 세포와 접촉시에, 상기 고분자 약물 담체에 봉입된 생물 활성제의 더 많은 양이 세포내로 전달되도록 하는 것인, 생물 활성제의 세포내 전달 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 고분자 약물 담체 및 수용액 상에서 상기 고분자 약물 담체에 봉입된 생물 활성제를 포함하며, 상기 고분자 약물 담체는 (a) 친수성 블록과 소수성 블록의 말단 히드록시기가 토코페롤기 또는 콜레스테롤기로 치환된 소수성 블록으로 구성된 양친성 블록 공중합체, 및 (b) 말단에 적어도 하나의 카르복시기를 갖는 폴리락트산 유도체를 포함하는 고분자 조성물로 제조되며;
상기 약물 담체가 세포와 접촉시에, 상기 고분자 약물 담체에 봉입된 생물 활성제가 더 많은 양으로 세포내로 전달되도록 하는, 생물 활성제 및 수용액내에 생물활성제를 봉입한 고분자 약물 담체를 포함하는 생물 활성제의 세포내 전달용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 생물 활성제를 표적 세포로 전달할 수 있는 고분자 약물 담체에 관한 것이다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명에 따른 고분자 조성물과 그의 제조 및 사용방법을 기술하기 전에, 본 발명은 여기에 개시된 특정 형태, 제조단계와 재료로 한정되지 않으며 그러한 형태, 제조단계 및 재료는 변화될 수 있음을 이해하여야 한다. 또한 여기에 사용된 용어는 특정 구체예를 기술하기 위한 목적으로만 사용되고 첨부된 청구범위와 그의 균등물에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아님을 이해하여야 한다.
본 명세서 및 부속 청구범위에 기재된 바와 같이, 단수 형태 "a" "an" 및 "the" 는 명백히 다르게 언급하지 않는 한 복수 형태도 포함하는 의도이다. 예를 들면, "말단기(a terminal group)"를 포함하는 고분자는 그러한 말단기를 2 이상 함유하는 것도 포함하는 의도이다.
본 발명을 기술하고 청구함에 있어서, 하기 용어들은 아래 정의에 따라 사용될 것이다.
본 명세서에서, 용어 '생물 활성제(bioactive agent)'는 생체내에서 (in vivo) 바람직한 생물학적 활성, 예컨대 생물학적 효과 또는 약동역학적 효과를 갖는 유기 화합물 또는 약물을 의미한다. 예를 들면, 치료제를 함유하는 생물학적 활성제는 세포내 기능, 예를 유전자 기능 등을 변경할 수 있다. 혹은, 진단제, 예컨대 자기공명 이미지 (magnetic resonance imaging, MRI) 또는 컴퓨터 단층촬영제 (computerized tomography, CT)를 함유하는 생물 활성제등은 조직 및/또는 기관의 진단 이미지를 향상시키는 생물학적 기능을 갖는다.
본 명세서에서, 용어 "생분해성 (biodegradable)" 또는 "생분해(biodegradation)"는 용해 가수분해 (solubilization hydrolysis), 또는 효소나 생물체의 다른 산물일 수 있는 생물학적으로 형성된 물질(entities)의 작용에 의해서, 덜 복잡한 중간체에서 최종 상물로 전환하는 것을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "생체적합성(biocompatible)"은 용해 가수분해 또는 효소나 생물체의 다른 산물일 수 있는 생물학적으로 형성된 물질(entities)의 작용에 의해서, 형성되는 물질, 중간체, 또는 최종 산물을 의미한다.
"폴리(락티드)" 또는 "PLA"은 락트산의 축합반응 또는 락티드의 개환반응에 의해 생성되는 고분자를 의미한다. 용어 "락티드" 및 "락테이트" 는 서로 교환하여 사용 가능하다.
예시적인 구체예가 기준이 될 것이며, 구체적인 언어가 이들을 기술하기 위해 사용될 것이다. 그러나, 이들이 본 발명의 보호범위를 제한하는 의도는 아니다. 본 명세서에 기재된 본 발명의 특징을 변경 또는 추가적으로 변형할 수 있으며, 본 발명의 원리를 추가로 적용하는 것이 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 이해될 것이며, 이도 또한 본 발명의 범위에 속한다.
본 발명은 친수성 블록과 소수성 블록의 말단 히드록시기가 토코페롤기 또는 콜레스테롤로 치환된 소수성 블록으로 구성된 양친성 블록 공중합체, 및 말단에 적어도 하나의 카르복시기를 갖는 폴리락트산 유도체를 포함하는 고분자 조성물로 제조된 고분자 약물 담체를 사용하여 생물 활성제를 세포내로 전달하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 친수성 블록과 소수성 블록의 말단 히드록시기가 토코페롤 숙신산기 또는 콜레스테롤 숙신산기로 치환된 소수성 블록으로 구성된 양친성 블록 공중합체, 및 말단에 적어도 하나의 카르복시기를 갖는 폴리락트산 유도체, 및 상기 폴리락트산 유도체의 카르복시 말단기 1 당량에 대하여 0.01 내지 10 당량의 2가 금속 또는 3가 금속을 포함하는 고분자 조성물로 제조된 약물 담체를 사용하여 생물 활성제를 세포내로 전달하는 방법에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 고분자 약물 담체 및 수용액 상에서 상기 고분자 약물 담체에 봉입된 생물 활성제를 포함하며,
상기 고분자 약물 담체는 (a) 친수성 블록과 소수성 블록의 말단 히드록시기가 토코페롤기 또는 콜레스테롤기로 치환된 소수성 블록으로 구성된 양친성 블록 공중합체, 및 (b) 말단에 적어도 하나의 카르복시기를 갖는 폴리락트산 유도체를 포함하는 고분자 조성물로 제조되며;
상기 약물 담체가 세포와 접촉시에, 상기 고분자 약물 담체에 봉입된 생물 활성제가 더 많은 양으로 세포내로 전달되도록 하는 것인, 생물 활성제의 세포내 전달 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 구체적인 일예에서, 상기 생물 활성제는 상기 고분자 약물 담체가 없는 경우에 비해, 더 많은 양으로 그리고 바람직하게는 더 효과적인 방식으로 세포내로 전달될 수 있다.
추가로, 본 발명은 표적 세포내로 생물 활성제를 전달할 수 있는 고분자 약물 담체를 제공하는 것이다. .
자세하게는, 본 발명은 a) 적어도 1종의 생물 활성제를 선택하고;
b) 친수성 블록과 소수성 블록의 말단 히드록시기가 토코페롤기 또는 콜레스테롤로 치환된 소수성 블록으로 구성된 양친성 블록 공중합체, 및 말단에 적어도 하나의 카르복시기를 갖는 폴리락트산 유도체를 포함하는 고분자 조성물을 제조하고;
c) 용매중에 상기 고분자 조성물과 생물 활성제를 혼합 및 용해한 후, 용매를 증발시키고;
d) 수용액을 첨가하여 약물 담체내 수용액에 생물 활성제가 포집된 폴리머 약물 담체를 제조하고; 및
e) 상기 약물 담체와 세포를 접촉시켜 상기 생물 활성제를 세포내로 용이하게 전달 하는 단계를 포함하는, 생물 활성제의 세포내 전달방법을 제공한다.
적어도 1종의 생물 활성제를 선택
본 발명에 따른 생물 활성제는 바람직한 생물학적 활성을 나타내는 어떠한 유기 화하물 또는 약물일 수 있다. 이들은 단백질류, 테스토스테론, 에스트라디올, 에스트로겐, 프로게스테론, 트리암시놀론 아세테이트, 덱사메타손, 등과 같은 호르몬류, 유전자, 폴리펩티드, 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 항체, 항암제, 항염제, 항균제, 항생제, 마취제, 항고혈압제 및 당료병 치료제, 항고지혈제, 항바이러스제, 파킨스병 치료제, 진토제, 면역억제제, 항궤양 약물약물, 설사약, 항말라리아 약물, 및 진단방사선 약물과 같은 약물 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 항암제의 예로는 파클리탁셀, 에피루비신, 닥티노마이신, 블레오마이신, 미토마이신, 도세탁셀, 5-플루오로우라실, 메토트렉세이트, 캄프토테신(camptothecin), 에토포사이드(etoposide), 독소루비신, 다우소루비신(dausorubicin), 이다루비신(idarubicin), 아라-C, 사이클로스포린 A, 등 및 이들의 유도체를 포함한다.
상기 생물활성제를 상기 고분자 조성물에 0.1~20:80.0~99.9 중량비, 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산 유도체로 제조된 미셀이 코어에 적절한 포함될 수 있도록 첨가할 수 있다.
고분자 조성물의 제조
본 발명에 따른 양친성 블록 공중합체는 바람직하게는 친수성 A 블록 및 소수성 B 블록을 포함하는A-B 유형의 이중 블록(diblock) 공중합체 또는 B-A-B 유형 삼중 블록 공중합체일 수 있다. 수상에서 양친성 블록 공중합체는 소수성 B 블록이 코어를 형성하고, 친수성 A 블록이 쉘을 형성하여 코어-쉘 구조의 고분자 미셀을 형성한다. 바람직하게는, 친수성 A 블록는 폴리알킬렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리아크릴아미드 및 이들의 유도체로 이루어지는 군에서 선택된다. 더욱 바람직하게는, 친수성 A 블록은 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜, 모노아세톡시폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리비닐 피롤리돈으로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직하게, 친수성 A 블록은 수평균 분자량이 500 내지 50,000 달톤, 더욱 바람직하게는 1,000 내지 20,000 달톤이다.
본 발명에 따른 양친성 블록 공중합체중 소수성 B 블록은 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리아미노산, 폴리오르토에스테르, 및 폴리포스파진으로 이루어진 군에서 선택되는 높은 생분해성 및 생체적합성(biocompatible) 고분자이다. 더욱 바람직하게는, 상기 소수성 B 블록 D,L-폴리락트산, D-폴리글리콜산 폴리만델린산, D,L-락트산 및 글리콜산의 공중합체, D,L-락트산 및 만델린산의 공중합체, D,L-락트산 및 카프로락톤의 공중합체, 및 D,L-락트산 및 1,4-디옥산-2-온의 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이다. 소수성 블록의 말단기는 히드록시기이고, 상기 말단 히드록시기는 우수한 소수성을 갖는 소수성 토코페롤기 또는 콜레스테롤기로 치환될 수 있으며, 이는 소수성 B 블록의 분자량은 유지하면서 소수성을 향상시킬 목적으로 사용된다. 토코페롤 또는 콜레스테롤기는 소수성 B 블록의 말단 히드록시기에 연결제, 예컨대 디카르복시산 (숙신산, 말론산, 글루타르산, 및 아디프산)을 통해 공유결합되어 있다. 토코페롤 및 콜레스테롤은 모두 생체적합성 및 소수성 화합물로서 고리구조를 가지며, 고분자 미셀의 내부 소수성을 증가시킬 수 있어 고분자 미셀의 물리적 안정성을 향상시킨다. 바람직하게는, 양친성 블록 공중합체중 소수성 B 블록은 수평균 분자량 500 내지 50,000 달톤, 더욱 바람직하게는 1,000 내지 20,000 달톤을 가진다.
본 발명에 따른 양친성 블록 공중합체중 소수성 B 블록에 대한 친수성 A 블록의 비율은 바람직하게는 3:7 내지 8:2 중량비이고, 더욱 바람직하게는 4:6 내지 7:3이다. 친수성 A 블록의 함량이 지나치게 낮으면, 고분자가 수용액내에서 적절한 고분자 미셀을 형성할 수 없고, 너무 높으면 고분자 미셀이 안정적이지 않다.
본 발명의 일예에서, 본 발명에 따른 양친성 블록 공중합체는 하기 화학식을 갖는 화합물이다:
상기 식에서,
R2'는 토코페롤 또는 콜레스테롤기이고;
R
3'은 -CH
2CH
2-O-, -CH(OH)-CH
2-, -CH(C(=O)-NH
2)-CH
2-, 또는
이고;
R4'는 -C(=O)-CHZ'-O- 이고, 여기서 Z'은 수소 또는 메틸기이고;
R5'는 -C(=O)-CHY”-O-이고, 여기서 Y”은 수소, 메틸기, -C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-O-, 또는 -C(=O)-CH2OCH2CH2-O-이고;
l'는 4-1150의 정수이고;
m'는 1-300의 정수이고;
n'은 0-300의 정수이고; 그리고
X'는 0-4의 정수이다.
토코페롤 또는 콜레스톨로 치환된 말단 히드록시기를 갖는 소수성 블록을 포함하는 블록 공중합체를 하기 방법에 따라 제조할 수 있다. 본 발명이 일예에서, 예를 들면 숙신산, 말로닉산, 글루타르산 또는 아디프산과 같은 디카르복시산의 연결제를 토코페롤 또는 콜레스테롤의 히드록시기에 도입하고, 상기 카르복실화된 토코페롤 또는 콜레스테롤를 소수성 B 블록의 말단 히드록시기에 화학적으로 연결하는 것이다.
본 발명이 일예에서, US Patent No. 6,322,805에 따라서 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜 (mPEG; Mn=2,000) 과 폴리락티드 (PLA; Mn=1,750)을 포함하는 양친성 블록 공중합체(mPEG-PLA)를 제조하고, 진공펌프를 사용하여 120℃에서 탈수하고, 아세토니트릴 또는 메틸렌 클로라이드에 용해한다. 그런 후에, 토코페롤 숙시네이트 또는 콜레스테롤 숙시네이트를 첨가하고, 디시클로헥실카르도이미드(DCC) 및 4-디메틸아민피리딘 (DMAP)을 칭량하여 반응 개시자 및 촉매를 각각 첨가하고 실온에서 반응한다. 상기 반응물은 mPEG-PLA의 말단 히드록시기 및 소수성 화합물의 -COOH 간에 이루어지는 반응에 의해 형성된 디시클로헥실우레아(DCU)로 인해 흐려진다. 24 시간 이후에, 유리 필터로 DCU을 제거하고, DMAP를 추출하고, 염산 수용액으로 제거한다. 얻어진 정제 반응용액에 MgSO4을 첨가하여 잔류 수분을 제거한 후, 토코페롤 숙시닐 또는 콜레스테롤 숙시닐기가 연결된 양친성 블록 공중합체(여기서, 숙신산 디에스테르를 통하여 토코페롤 또는 콜레스테롤이 PLA에 결합됨)를 얻기 위해서, 침전물을 헥산/디에틸에테르 용매에서 침전물을 형성한다. 침전된 고분자 산물을 여과하고, 진공하에서 건조하여 흰색 임자로 고분자를 얻는다.
또 다른 구체예에서, 카르록실화 소수성 화합물을 촉매없이 옥살릴 클로라이드로 활성화시키고, mPEG-PLA에 말단에 결합시킨다. 즉, 토코페롤 (또는 콜레스테롤) 숙시네이트를 옥살릴 클로라이드와 반응시키고, 과량의 옥살릴 클로라이드를 실온에서 진공으로 제거한다. mPEG-PLA 무게를 달아 상기 반응물에 첨가하고, 100 ℃에서 12 시간 동안 반응시켜 mPEG-PLA-토코페롤 (또는 콜레스테롤)을 얻는다. 합성된 고분자를 아세토니트릴 또는 메틸렌 클로라이드에 용해시키고, 헥산/디에틸 에테르에서 침전시키고, 여과한다.
상기 두 가지 제조방법에서, 토코페롤 (또는 콜레스테롤) 말로네이트, 토코페롤 (또는 콜레스테롤) 글루타레이트, 또는 토코페롤 (또는 콜레스테롤) 아디페이트 등을 토코페롤 (또는 콜레스테롤) 숙신네이트 대신에 사용할 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 연결제로서 디클로라이드 화합물을 사용하여 토코페롤 또는 콜레스테롤을 mPEG-PLA 말단에 결합시킨다. 자세하게는, 토코페롤 또는 콜레스테롤의 무게를 달고, 50 ℃에서 진공펌프로 탈수한다. 과량의 연결제를 첨가하고, 12 시간 동안 반응을 수행하였다. 반응이 완료된 후에, 과량으로 첨가된 연결제를 100 ℃에서 진공펌프로 제거한다. 여기에, 상기 칭량된 mPEG-PLA를 첨가하고, 100 ℃에서 12 시간 동안 반응시킨다. 합성된 고분자를 메틸렌 클로라이드에 용해하고, 토코페롤 또는 콜레스테롤이 숙신산 디에스테르를 통해 PLA에 연결된 양친성 블록 공중합체, 즉 mPEG-PLA-토코페롤 또는 mPEG-PLA-콜레스테롤를 제조하기 위하여 헥산/디에틸 에테르에서 침전시킨다. 침전물을 여과하고, 진공하에서 건조하여 흰색 입자로 고분자를 얻는다. 상기 반응에 사용될 수 있는 연결제는 숙시닐 클로라이드, 옥살릴 클로라이드 말로닐 클로라이드, 글루타릴 클로라이드, 아디포일 클로라이드 등과 같은 디클로라이드 화합물에서 선택된다.
본 발명에 따른 폴리락트산 유도체의 하나 이상의 말단은 적어도 하나의 카르복실산 또는 카르복실산 염에 공유결합되어 있다. 본 발명에 따른 폴리락트산 유도체의 다른 말단은 히드록시기, 아세톡시, 벤조일옥시, 데카노일옥시, 및 팔미토일옥시기로 이루어지는 군에서 선택된 그룹에 공유결합으로 연결되어 있다. 상기 카르복시산 또는 카르복시산 염은 pH 4 이상의 수용액에서 친수성기로 작용하여, 폴리락트산 유도체가 고분자 미셀을 형성할 수 있도록 한다. 본 발명에 따른 폴리락트산 유도체를 수용액에 용해시킨 경우, 고분자 미셀을 형성하기 위해서는 폴리락트산 유도체에 존재하는 친수성 및 소수성 부분이 평형을 이루어야 한다. 따라서, 본 발명에 따른 폴리락트산 유도체의 수평균 분자량은 500 내지 2,500 달톤인 것이 바람직하다. 제조과정중에 반응온도, 시간 등을 조절함으로써 폴리락트산 유도체의 분자량을 조절할 수 있다.
상기 폴리락트산 유도체는 하기 화학식을 갖는 화합물이 바람직하다:
상기 식에서, A는 -COO-CHZ-이고;
B 는 -COO-CHY-, -COO-CH2CH2CH2CH2CH2- 또는 -COO-CH2CH2OCH2이고;
R 는 수소, 아세틸, 벤조일, 데카노일, 팔미토일, 메틸 또는 에틸기이고;
Z 및 Y 는 각각 수소, 메틸 또는 페닐기이고;
M 는 H, Na, K, 또는 Li이고;
n 는 1 내지 30의 정수이고, m 은 0 내지 20의 정수이다.
상기 폴리락트산 유도체의 한쪽 말단은 카르복시기 또는 이들의 알칼리금속염에 공유결합으로 연결되어 있다. 바람직하게는, 알칼리 금속염에 연결되어 있다. 알칼리 금속염의 금속 이온은 1가 금속, 예컨대 나트륨, 칼륨 또는 리튬이다. 금속이온염의 폴리락트산 유도체는 상온에서 고체이고, 상대적으로 중성 pH로서 매우 안정하다.
더욱 바람직하게는, 상기 폴리락트산 유도체는 하기 화학식을 갖는 화합물이다:
상기 식에서,
X는 메틸기이고;
Y'은 수소원자 또는 페닐기이고;
P는 0 내지 25의 정수이고;
q는 p와 q의 합이 5 내지 25의 정수를 만족하는 조건하에서, 0 내지 25의 정수이고;
R, Z, 및 M은 화학식(I)에서 정의한 것과 같다.
상기 폴리락트산 유도체는 하기 화학식 III, IV, 및 V를 갖는 화합물로서 본 발명에 적합하게 사용할 수 있다:
PAD는 D,L-폴리락트산, D-폴리글리콜산 폴리만델린산, D,L-락트산 및 글리콜산의 공중합체, D,L-락트산 및 만델린산의 공중합체, D,L-락트산 및 카프로락톤의 공중합체, 및 D,L-락트산 및 1,4-디옥산-2-온의 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 것이고; R,및 M은 상기 화학식 (I)에서 정의한 것과 동일하다.
L 은 -NR1- 또는 -O-이고
R1 는 수소원자 또는 C1 -10 알킬기이고
Q는 CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH2CH2CH2CH3, 또는 CH2C6H5이고;
a는 0 내지 4의 정수이고;
b는 1 내지 10의 정수이고;
R과 M은 상기 화학식(I)에서 정의한 것과 동일하고, PAD는 상기 화학식 (III)에서 정의한 것과 동일하다.
상기 식에서,
R'은 -PAD-O-C(O)-CH2CH2-C(O)-OM이고,
PAD는 D,L-폴리락트산, D-폴리락트산, 폴리만델린산, D,L-락트산 및 글리콜산의 공중합체, D,L-락트산 및 말델린산의 공중합체, D,L-락트산 및 카프로락톤의 공중합체, 및 D,L-락트산 및 1,4-이옥산-2-온의 공중합체로 이루어진 군에서 선택되며;
M은 상기 화학식 I에서 정의한 것과 같고; PAD는 상기 화학식 (III)에서 정의한 것과 동일하고; a는 1 내지 4의 정수이다 (a=1이면 3-arm PLA-COONa이고, a=2이면 4-arm PLA-COONa이고, a=3이면 5-arm PLA-COONa이고, a=4이면 6-arm PLA-COONa임).
고분자 합성의 출발물질 (화학식 V)는 글리세롤, 에리쓰리톨(erythritol), 쓰레톨(threltol), 펜타에리쓰리톨, 자일리톨, 아도니톨(adonitol), 솔비톨 및 만니톨을 포함한다.
본 발명의 고분자 조성물은 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산 유도체을 포함한 전체 중량에 대하여 0.1 내지 99.9 wt% 의 양친성 블록 공중합체 및 0.1 내지 99.9 wt%의 폴리락트산 유도체, 바람직하게는, 20 내지 95 wt%의 양친성 블록 공중합체 및 5 내지 80 wt%의 폴리락트산 유도체, 더욱 바람직하게는 50 내지 90 wt% 의 양친성 블록 공중합체 및 10 내지 50 wt%의 폴리락트산 유도체를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리락트산 유도체는 pH 4 이상의 수용액에서는 단독으로 미셀을 형성할 수 있고, 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산 유도체를 포함하는 고분자 조성물도 용액의 pH와 무관하게 수용액에서 미셀을 형성할 수 있으며, 본 발명의 고분자 조성물을 pH 1 내지 10 범위에서, 바람직하게는 pH 4 내지 8에서 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 고분자 조성물로 제조되는 미셀 또는 나노입자의 입자크기는 1 내지 400 nm, 바람직하게는 5 내지 200 nm 일 수 있으며, 고분자의 분자량 및 양친성 블록 공중합체에 대한 폴리락트산 유도체의 비율에 의존적이다.
본 발명의 구체예에서, 폴리락트산 유도체의 카르복시 말단기는 2가 또는 3가 금속이온에 결합 또는 고정되어 있다. 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산 유도체를 포함하는 고분자 조성물에 2가 금속 또는 3가 금속을 첨가하여 상기 금속이온-고정 고분자를 제조할 수 있다. 폴리락트산 유도체의 카르복시 말단기에 결합 또는 고정시키기 위해 첨가되는 2가 또는 3가 금속이온의 양을 변화시켜 상기 고분자 미셀 또는 나노입자를 제조할 수 있다.
2가 또는 3가 금속 이온은 Ca2 +, Mg2 +, Ba2 +, Cr3 +, Fe3 +, Mn2 +, Ni2 +, Cu2 +, Zn2+, 및 Al3 +로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다. 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산 유도체를 포함하는 고분자 조성물에 상기 2가 또는 3가 금속이온을 황산염, 염산염, 탄산염, 인산염 또는 수산염(hydroxylate)형태, 바람직하게는 CaCl2, MgCl2, ZnCl2, AlCl3, FeCl3, CaCO3, MgCO3, Ca3(PO4)2, Mg3(PO4)2, AlPO4, MgSO4, Ca(OH)2, Mg(OH)2, Al(OH)3, 또는 Zn(OH)2형태로 첨가할 수 있다.
첨가되는 금속이온의 당량수를 변화시켜 고분자 미셀 또는 나노입자를 제조할 수 있다. 구체적으로, 2가 금속을 카르복시기 당량에 대해 0.5 당량 이하로 첨가하면, 폴리락트산 유도체의 카르복시 말단기와 결합할 수 있는 금속이온이 불충분하다. 따라서, 고분자 미셀이 형성된다. 2가 금속을 카르복시기 1당량에 대해 0.5 당량 이상으로 첨가하면, 폴리락트산 유도체의 카르복시 말단기와 결합할 수 있는 금속이온이 충분하여 미셀를 단단히 고정하고, 따라서 나노입자가 형성된다.
추가로, 첨가되는 금속 이온의 당량수를 조절함으로써 고분자 미셀 또는 나노입자로부터 약물의 방출속도를 조절할 수 있다. 2가 금속을 카르복시기 당량에 대해 1 당량 이하로 첨가하면, 폴리락트산 유도체의 카르복시 말단기와 결합에 사용될 수 있는 수가 감소하기 때문에, 약물 방출속도가 증가하게 된다. 만약 금속이온이 1 당량이상으로 존재하면, 폴리락트산 유도체의 카르복시 말단기와 결합에 사용될 수 있는 수가 증가하기 때문에, 약물 방출속도가 감소한다. 따라서,혈액내 약물 발출속도를 증가시키기 위해서는 금속이온 사용 당량수가 적어야 하고, 약물 방출속도를 감소시키기 위해서는 금속이온의 사용 당량수가 커야 한다.
본 발명에 따라 금속이온이 고정된 고분자 조성물은 5 내지 95wt%의 양친성 블록 공중합체, 5 내지 95wt% 의 폴리락트산 유도체 및 폴리락트산 유도체의 카르복시 말단기의 당량수에 대해 0.01 내지 10 당량의 2가 또는 3가 금속이온을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 고분자 조성물은 조성물은 20 내지 80wt%의 양친성 블록 공중합체, 20 내지 80wt% 의 폴리락트산 유도체 및 폴리락트산 유도체의 카르복시 말단기의 당량수에 대해 0.1 내지 5 당량의 2가 또는 3가 금속이온을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 조성물은 20 내지 60wt%의 양친성 블록 공중합체, 20 내지 60wt% 의 폴리락트산 유도체 및 폴리락트산 유도체의 카르복시 말단기의 당량수에 대해 0.2 내지 2 당량의 2가 또는 3가 금속이온을 포함할 수 있다.
용매중에서
상기 고분자 조성물과 생물 활성제를 혼합 및 용해하고, 용매를 증발시키고,
봉입된
생물 활성제를 약물
담체
용액으로 제제화
상기 고분자 약물 담체는 친수성 블록과 소수성 블록의 히드록시기가 토코페롤기 또는 콜레스테롤기로 치환된 소수성 블록으로 구성된 양친성 블록 공중합체, 및 말단에 적어도 하나의 카르복시기를 갖는 폴리락트산 유도체를 포함하는 고분자 조성물로 제조되는 고분자 미셀 또는 나노입자일 수 있다.
본 발명에 따른 나노입자 또는 미셀은 친수성 블록과 말단 히드록시기가 토코페롤 숙신산기 또는 콜레스테롤 숙신산기로 치환된 소수성 블록으로 구성된 양친성 블록 공중합체, 2가 금속 또는 3가 금속 고정되거나 결합된, 말단에 적어도 하나의 카르복시기를 갖는 폴리락트산 유도체, 2가 금속 또는 3가 금속을 포함하는 고분자 조성물로 제조될 수 있다.
상기 생물 활성제가 본 발명에 따른 나노입자 또는 미셀에 봉입될 수 있으며, 생물 활성제에 따라서는 생분해성 폴리락트산 유도체의 카르복시기와 안정한 이온복합체를 셩성하여 미셀 또는 나노입자에 함유될 수 있다.
상기 양친성 블록 공중합체, 폴리락트산 유도체, 및 낮은 수불용성 약물을 특정 비율로 아세톤, 에탄올, 메탄올, 에틸 아세테이트, 아세토니트릴, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 아세트산 및 딕소산으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이 유기용매에 용해할 수 있다. 상기 유기 용매를 제거하여 수난용성 약물과 고분자의 균일한 혼합물을 제조할 수 있다. 수난용성 약물과 고분자의 균일한 혼합물을 0 내지 80 ℃온도에서 pH 4 내지 8의 수용액에 첨가하여 수난용성 약물과 고분자 미셀 수용액을 얻는다. 상기 약물-함유 고분자 미셀 수용액를 동결건조하여 고형의 고분자 미셀을 제조한다.
0.001 내지 2 M의 2가 또는 3가 금속이온을 포함하는 수용액을 수난용성 약물과 고분자 미셀 수용액에 첨가한다. 상기 혼합물을 실온에서 0.1 내지 1 시간동안 천천히 저은 후에, 동결건조하여 금속이온-고정 고분자 미셀 또는 나노입자를 고형으로 얻는다.
상기 약물
담체와
세포의 접촉
생물 활성제의 경구 또는 비경구 투여를 위해서, 상기 생물 활성제는 약물 담체에 봉입해야 안정해진다. 특히, 금속이온-고정 고분자 미셀 또는 나노입자는 장기간 혈류내에 유지되며, 표적영역에 축적된다. 생물 활성제는 미셀이 분해되는 동안 미셀의 소수성 코어로부터 방출되어 약동역학적 효과를 나타낸다.
비경구 전달용으로, 상기 고분자 조성물을 경피, 근육내, 복강내, 비강내, 직장내, 안구내, 및 폐내로 투여할 수 있다. 경구 전달용으로는, 상기 생물 활성제를 본 발명의 약물 담체와 혼합하여 정제, 캡슐, 또는 수용액 형태로 투여할 수 있다. 구체적 약물의 요건에 따라서, 본 발명의 고분자 조성물을 다양한 함량 범위로 투여할 수 있다. 의약 분야에서 알려진 바와 같이, 환자에 투여되는 투여량은 환자의 체중, 표면적, 투여 약물, 성별, 시간, 투여경로, 및 건강상태등 여러 가지 인자에 따라 결정되며, 동시에 다른 약물과 같이 투여할 수도 있다.
생물 활성제의
세포내
전달(
Cellular
internalization
)
약물 함유 조성물을 사용하여 세포유동 분석기와 공촛점 현미경을 사용하여 생물 활성제의 세포내 전달에 대해 연구할 수 있다. 본 발명의 일예로서, 사람 자궁암 세포주 (MES-SA; MES-SA/Dx-5) 및 사람 유방암 세포주 (MCF-7; MCF-7/ADR)를 본 발명의 조성물로 처리하였다. 세포주 MES-SA 및 MCF-7를 독소루비신-민감성이고, 및 세포주 MES-SA/Dx-5 및 MCF-7/ADR를 독소루비신-저항성이다.
도 2a 내지 3B, 및 표 2A와 2B에 나타낸 바와 같이, 약물은 종래 용액 제제(Free-Dox)보다 본 발명의 조성물로부터 세포로 더욱 효과적으로 전달된다 (조성물 1). 더욱 바람직하게는, 약물을 흡수하는 세포의 수가 종래 제제에 비해 본 발명의 경우 5배 더 높다. 특히, 독소루비신의 세포내 전달은 약물 저항성 세포주에 비해 매우 탁월하다. 따라서 화학요법에서 다약제 내성문제를 극복하기 위해서, 본 발명의 약물 조성물을 사용할 가능성이 높다.
도 4A 내지 4H에 나타낸 공촛점 현미경 이미지는 세포유도 분석결과를 시각화해 보여준다. 본 발명의 약물 조성물로 세포를 처리한 경우에, 세포가 더 많은 양의 약물을 흡수함을 알 수 있다. 도 4A 내지 4H에 나타낸 바와 같이, 왼쪽 사진은 종래 용액 제제로 처리한 후 얻은 공촛점 현미경 이미지이고, 오른쪽 사진은 본 발명의 조성물로 처리한 후 얻은 것이다. 도 4B, 4D, 4F, 및 4H에 나타낸 것과 같이, 미셀 또는 나노입자를 세포질 및 핵 구획에서 탐지하였다.
더욱이, MTT 분석결과를 도 5A 내지 5B 및 표3에 나타냈으며, 이는 세포유동분석 및 공촛점 현미경 결과를 뒷받침한다. MTT 분석을 위해, 본 발명에 따른 독소루비신-함유 조성물 (조성물 1) 및 종래 독소루비신 제제 (Free-Dox)를 사람 자궁한 세포주 MES-SA (독소루비신-민감성 세포주) 및 MES-SA/Dx-5 (독소루비신-저항성 세포주)에서 시험하였다. 독소루비신-민감성 세포에서 세포독성은 두가지 조성물 모두 유사하였으며, 결과를 도 5A에 나타냈다. 그러나, 도 5B에 나타낸 바와 같이, 독소루비신-저항성 세포주에 처리하고 3일 경과후에, 종래 제제에 비해 본 발명의 약물 조성물이 6.7배 높은 활성을 나타냈다. 상기 활성의 차이는 P-당단백질 (P-gp)이 과다발견되어 세포독성 약물을 세포로부터 계속 배출하는, 약물-저항성 세포주의 특성에 기인한다. 유리된 약물는 약물-저항성 세포내에 농축되지 않기 때문에, 이러한 결과는 약물 담체에 봉입된 약물과 함께 본 발명의 약물 담체가 세포로 전달되는 것을 제시한다.
본 발명에 따른 약물 담체의 물리적 안정성과 세포내 봉입 연구결과로부터, 본 발명에 따라 생물 활성제-함유 조성물의 대부분은 미셀 또는 나노입자 형태로 그 구조의 파괴없이 내포작용(endocytosis)에 의해 세포질내로 전달된다고 결론지을 수 있다. 이러한 세포내 봉입과정의 모식도를 도 1에 나타냈다: 1 약물; 2 미셀 또는 나노입자의 내부 코어; 3 미셀 또는 나노입자의 외부 쉘; 4 세포외 체액; 5 세포막; 및 6 세포질.
본 발명에 따른 독소루비신-함유 조성물 (조성물 1 내지 5) 및 종래 독소루비신 제재 (Free-Dox)를 사용하여 Sprague-Dawley 래트(200~250g)에서 약동역학 실험을 수행하였다. 도 6 및 표4에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물은 종래 독소루비진 제제에 비해 더 긴 혈액 순환시간을 나타냈다. 본 발명에 따른 조성물 1 혈중 농도-시간 곡선 (AUC) 아래의 면적으로부터 계산된 생체이용율은 종래 독소루비신 제제에 비해 63배나 더 높았다.
본 발명에 따른 약물 담체는 작은 입자 크기 (<100nm)로 인해 지연된 전신 순환시간을 제공하며, 소수성 쉘은 MPS에 의해 섭취를 최소화하고, 높은 분자량으로 인해 소변으로 배출되는 것을 방지한다. 본 발명에 따른 약물 담체는 수난용성 약물뿐만 아니라 수용성 약물, 펩티드, 및 단백질에도 적용할 수 있다. 세포봉입 연구에서 예시한 바와 같이, 본 발명에 따른 생물 활성제-함유 조성물은 수성 매질에서 안정한 미셀 또는 나노입자를 형성하기에, 구조의 파괴없이 내포작용으로 미셀 또는 나노입자의 형태로 세포질로 전달될 수 있다. 더욱이, 본 발명에 따른 조성물은 암조직에서 생물 활성제가 더 높은 농도로 축적되도록 할 수 있다.
하기 실시예는 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 본 발명을 좀더 명확하게 이해하고 본 발명을 수행하는 방법을 제공할 것이다. 하기 바람직한 구체예와 함께 본 발명을 기술하나, 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 보호범위가 이에 한정되는 것을 아니다. 본 발명은 다른 일면은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 명백할 것이다.
제조예
1
PEG
및
PLA
(
mPEG
-
PLA
)로 구성된
양친성
블록 공중합체
20g 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜 (분자량 2,000의 mPEG), 에틸 아세테이트로부터 재결정화된 D,L-락티드 20g, 및 주석 옥토에이트 0.2g의 혼합물을 5ml 톨루엔에 용해하고, 이를 기계 교반기 및 증류기 세트가 장착된 반응기에 주입하였다. 잔류 톨루엔을 120?에서 증발시켰다. 반응을 진공하에서 (25mmHg) 수행하였다. 중합반응을 6시간 진행한 후에, 얻어진 고분자를 디클로로메탄에 용해시키고, 찬 디에틸에테르 (4 ℃) 에 주입하여 고분자를 침전시켰다. 침전된 고분자를 디에틸에테르로 2회 세척하고 진공하에서(0.1mmHg) 24시간 건조시켰다. 핵자기공명분광법으로 측정한 블록 공중합체의 분자량이 2,000-1,800 이었다(2,000 은 PEG 블록에 대한 것이고, 1,800 은 PLA 블록에 과한 것이다).
제조예
2
PEG
및
PLGA
(
mPEG
-
PLGA
)로 구성된
양친성
블록 공중합체
제조예 1에 기재된 방법과 동일한 방법에 따라, 20g D,L-락티드 대신에, 14g D,L-락티드 및 6g 글리콜리드를 사용하여 2중 블록 공중합체 (mPEG-PLGA, LA:GA=70:30 중량비)를 제조하였다. NMR로 측정한 블록 공중합체의 분자량은 2,000-1,750 (2,000 은 PEG 블록, 1,750은 PLGA 블록 값이다).
제조예
3
PEG
및
PCL
(
mPEG
-
PCL
)로 구성된
양친성
블록 공중합체
제조예 1에 기재된 방법과 동일한 방법에 따라, D,L-락티드 대신에, 20g ε-카프로락톤을 사용하여 2중 블록 공중합체(mPEG-PCL)를 제조하였다. NMR로 측정한 블록 공중합체의 분자량은 2,000-1,800이었다 (2,000은 PEG 블록, 1,800 은 PCL 블록 값이다).
제조예
4
PEO
및
PLA
(
PLA
-
PEO
-
PLA
)로 구성된
양친성
블록 공중합체
제조예 1에 기재된 방법과 동일한 방법에 따라, 20g 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜 (분자량 2,000 PEG) 대신에 20g 폴리에틸렌 글리콜(분자량 2,000 PEG) 을 사용하여 3중 블록 공중합체(PLA-PEO-PLA)를 제조하였다. NMR로 측정한 블록 공중합체의 분자량은 850-2,000-850이었다 (2,000: PEO 블록, 900 : 각 PLA 블록).
제조예
5
토코페롤
숙시네이트
기계 교반기가 장착된 반응기에서, 8.6g 토코페롤, 2.4g 숙시닉 언하이드라이드, 및 2.9g 4-(디메틸아미노)피리딘 (DMAP)의 혼합물을 100 ml 1,4-디옥산에 용해시켰다. 반응은 실온에서 수행하였다. 24시간 교반한 후에, 반응물을 HCl 용액에 첨가하여 토코페롤 숙시네이트를 침전시켰다 (10.2 g; 수율 = 96%).
제조예
6
콜레스테릴
숙시네이트
제조예 5와 실질적으로 동일한 방법에 따라, 토코페롤 대신에, 7.7g 의 콜레스테롤을 사용하여 콜레스테릴 숙시네이트를 제조하였다 (9.1 g; 수율 = 94%).
제조예
7
소수성 블록의 말단에
토코페롤기를
갖는
양친성
블록 공중합체
(
mPEG
-
PLA
-
Toco
)
기계 교반기가 장착된 반응기에서, 제조예 1에서 제조한 10.0 g (2.6mmole) mPEG-PLA 및 제조예 5에서 제조한 1.7 g (3.2mmole) 토코페롤 숙시네이트의 혼합물을 50 ml 아세토니트릴에 용해시켰다. 0.78g (3.8mmole) 디시클로헥실카르보디미드 (DCC) 및 0.046 g (0.38mmole) 4-(디메틸아미노)피리딘 (DMAP) 을 촉매로 사용하였다. 실온에서 24 시간 동안 교반한 후에, 상기 혼합물을 유리 필터로 여과하여 디 시클로헥실카르보우레아를 제거하였다. 수성 HCl 용액으로 잔류 촉매를 제거하고 황산마그네슘을 고분자 용액에 첨가하여 물을 제거하였다. 얻어진 사물 (mPEG-PLA-Toco)을 n-헥산/디에틸 에테르 (6/4, v/v) 용매로부터 재결정화하였다. 재결정화된 산물을 여과하고, 진공하에 건조하여 흰색분말의 산물을 얻었다(9.9 g; 수율 = 87%).
제조예
8
소수성 블록의 말단에
토코페롤기를
갖는
양친성
블록 공중합체
(
mPEG
-
PLGA
-
Toco
)
제조예 7에 기재된 방법과 동일한 방법에 따라, 제조예 1에서 얻은 mPEG-PLA 대신에, 제조예 2에서 얻은 9.8g (2.6mmole)의 mPEG-PLGA를 사용하여 양친성 블록 공중합체(mPEG-PLGA-Toco)를 제조하였다(9.5 g; 수율 = 83%).
제조예
9
소수성 블록의 말단에
토코페롤기를
갖는
양친성
블록 공중합체
(
mPEG
-
PCL
-
Toco
)
제조예 7에 기재된 방법과 동일한 방법에 따라, 제조예 1에서 얻은 mPEG-PLA 대신에, 제조예 3에서 얻은 10.0g (2.6mmole)의 mPEG-PCL를 사용하여 양친성 블록 공중합체(mPEG-PCL-Toco)을 제조하였다 (10.1 g; 수율 = 89%).
제조예
10
소수성 블록의 말단에
토코페롤기를
갖는
양친성
블록 공중합체
(
Toco
-
PLA
-
PEO
-
PLA
-
Toco
)
제조예 7에 기재된 방법과 동일한 방법에 따라, 제조예 1에서 얻은 mPEG-PLA 대신에, 제조예 4에서 얻은 9.6g (2.6mmole) 의 PLA-PEO-PLA를 사용하여 양친성 블록 공중합체(Toco-PLA-PEO-PLA-Toco)를 제조하였다 (9.2 g; 수율 = 84%).
제조예
11
소수성 블록의 말단에
콜레스테롤기를
갖는
양친성
블록 공중합체
(
mPEG
-
PLA
-
Chol
)
제조예 7에 기재된 방법과 동일한 방법에 따라, 제조예 5에서 얻은 토코페롤 숙시네이트 대신에 1.6 g (3.2mmole)의 제조예 6에서 제조한 콜레스테릴 숙시네이트를 사용하여 양친성 블록 공중합체(mPEG-PLA-Chol)를 제조하였다 (9.7 g; 수율 = 86%).
제조예
12
생분해성 폴리에스테르 (
PLMA
-
COONa
)
(1) PLMA-COOH의 제조
7.5g D,L-락트산 (0.083mole) 및 2.5g D,L-만델린산 (0.016mole) 의 혼합물을 기계 교반기와 증류기 세트가 장착된 반응기에 주입하였다. 흡입기로 감 압(25mmHg) 하에서 80℃ 1시간 동안 수분을 증발시켰다. 가열하여 180 ℃에서 5 시간 동안 진공(10mmHg)하에서 반응을 수행하였다. 반응 산물을 증류수에 첨가하고, 침전된 고분자를 증류수로 세척하였다. 고분자 상물을 0.1 L 증류수에 첨가하고, 상기 수용액에 탄산수소나트륨을 첨가하여 pH 6 내지 8로 조절하여 고분자를 용해시켰다. 상기 수불용성 고분자를 원심분리 또는 여과로 제거하였다. 1 N 염산용액을 적가하여 수용액중에 고분자를 침전시켰다. 침전된 고분자를 증류수로 2회 세척하고, 분리하고, 감압하에 건조하여 카르복시 말단기를 갖는 고분자를 제조하였다(6.7 g 의 PLMA-COOH, 수율 = 67%). NMR로 측정한 고분자의 수평균 분자량은 1,100이었다.
(2) PLMA-COONa 의 제조
기계 교반기와 증류기 세트가 장착된 반응기에서, 아세톤에 5g PLMA-COOH 고분자 용액을 용해시켰다. 실온에서 용액을 천천히 교반하고, 1 N 탄산수소나트륨을 천천히 첨가하여 pH 7로 맞추었다. 무수 황산마그네슘을 첨가하여 잔류 수분을 제거하였다. 상기 혼합물을 여과하고, 잔류 아세톤을 로터리 증발기로 증발시켜 제거하여, 흰색 고형 산물을 얻었다. 상기 고형 산물을 무수 아세톤에 용해하고, 여과하여 불용성 입자를 제공하고, 아세톤을 증발시켜 최종산물, PLMA-COONa을 흰색 고체로 얻었다 (수율: 95%).
제조예
13
생분해성 폴리에스테르 (3
arm
-
PLA
-
COOK
)
(1) 3arm-PLA-OH의 제조
1.0g (0.011mole) 글리세롤을 기계 교반기와 증류기 세트가 장착된 반응기에 주입하였다. 80 ℃에서 30 분간 수분을 제거하였다. 톨루엔에 용해된 0.036g (0.089mmole) 주석 옥토에이트를 첨가하고, 잔류 톨루엔을 120℃에서 제거하고, 에틸 아세테이트로부터 재결정화된 36g (0.25mole) D,L-락티드를 반응기에 도입하였다. 130℃, 진공(20mmHg)하에서 반응하였다. 중합반응 6시간 후에, 얻어진 고분자를 아세톤에 용해시키고, NaHCO3 수용액 (0.2 N)을 적가하여 고분자를 침전시켰다. 침전된 고분자를 증류수로 3회 세척하고, 감압하에 건조하여 흰색의 고분자를 얻었다(3arm-PLA-OH). NMR로 측정한 고분자의 수평균 분자량은 3,050이었다.
(2) 3arm-PLA-COOH의 제조
상기에서 제조한10g (3.28mmole) 3arm-PLA-OH 기계 교반기와 증류기 세트가 장착된 반응기에 주입하였다. 120 ℃ 에서 1시간 동안 수분을 제거하였다. 1.96g (19.6mmole) 숙시닉 언하이드라이드를 첨가하고, 125 ℃에서 6 시간 동안 반응을 수행하였다. 얻어진 고분자를 아세톤에 용해하고, 증류수를 적가하여 고분자를 침전시켰다. 침전된 고분자를 NaHCO3수용액(0.2 N)에 60 ℃에서 첨가하고, HCl 수용 액(1N)을 적가하여 고분자를 침전시켰다. 침전된 고분자를 증류수로 3회 세척하고, 진공하여 건조하여 흰색 분말의 고분자를 얻었다 (3arm-PLA-COOH). NMR로 측정한 고분자의 분자량은 3,200이었다.
(3) 3arm-PLA-COOK의 제조
마지막으로, 제조예 12에 기재된 방법과 동일한 방법으로 PLMA-COOH 고분자 및 탄산수소나트륨 수용액 (1 N)대신에 상기에서 제조한3arm-PLA-COOH 5g 과 탄산수소칼륨 수용액 (1 N)을 사용하여 생분해성 폴리에스테르 (3arm-PLA-COOK)를 제조하였다 (수율 = 90%).
제조예
14
생분해성 폴리에스테르(4
arm
-
PLA
-
COONa
)
(1) 4arm-PLA-OH 제조
제조예 13에 기재된 방법과 동일한 방법에 따라, 글리세롤 대신에 펜타에리쓰리톨 1.5g (0.011mole) 을 사용하여 4arm-PLA-OH 고분자를 제조하였다. 상기 고분자의 수평균 분자량을 NMR로 결정하였으며 3,100이었다.
(2) 4arm-PLA-COOH의 제조
제조예 13에 기재된 방법과 동일한 방법에 따라, 10g (3.28mmole) 의 3arm-PLA-OH 고분자 및 1.96g (19.6mmole)의 숙시닉 언하이드라이드 대신에 10g (3.23 mmole) 4arm-PLA-OH 고분자 및 2.58g (25.8mmole) 의 숙신닉 언하이드라이드를 사용하여 4arm-PLA-COOH 고분자를 제조하였다.
(3) 4arm-PLA-COONa의 제조
마지막으로, 제조예 12에 기재된 방법과 동일한 방법에 따라, PLMA-COOH 고분자 대신에 상기 4arm-PLA-COOH 5g을 사용하여 생분해성 폴리에스테르 (4arm-PLA-COONa)를 제조하였다 (수율 = 92%)
제조예
15
생분해성 폴리에스테르 (
PLA
-
COONa
)
(1) PLA-COOH의 제조
제조예 12에 기재된 방법과 동일한 방법에 따라, 10g D,L-락트산(0.11mmole). 를 사용하여 PLA-COOH 를 제조하였다 (수율 = 78%). 상기 고분자의 수평균 분자량을 NMR로 결정하였으며 1,100이었다.
(2) PLA-COONa의 제조
제조예 12에 기재된 방법과 동일한 방법에 따라, PLMA-COOH 고분자 대신에 상기 5g PLA-COOH를 사용하여 생분해성 폴리에스테르 (PLA-COONa)를 제조하였다 (수율 = 92%) .
실시예
1
약물 함유 조성물
(조성물 1: 독소루비신 /
mPEG
-
PLA
-
Toco
/
PLMA
-
COONa
)
환저 플라스크에서10mg의 독소루비신 하이드로클로라이드를 5ml의 에탄올-물 혼합물 (9:1 v/v)에 용해하였다. 제조예 7에서 얻은 양친성 블록 공중합체(mPEG-PLA-Toco) 810mg 및 제조예 12에서 얻은 생분해성 폴리에스테르(PLMA-COONa) 180mg을 첨가하고, 투명한 용액이 될 때까지 완전히 용해하였다. 상기 용매를 로터리 증발기를 사용하여 진공하에서 60℃에서 증발시켰다. 락토스 수용액 3ml (20 중량%)를 첨가하고, 로터리 증발기를 사용하여 60℃에서 100 rpm으로 회전시켜 수성 매질중 미셀 또는 나노입자를 형성하였다. 상기 용액을 0.22㎛ 기공의 PVDF 막필터를 사용하여 여과하였다. 여액을 동결건조하고 사용할 때까지 냉장고에 보관하였다. 여액의 미셀 또는 나노입자의 입자크기를 동적광산산법 (DLS, ZetaPlus, Brookhaven Instruments Ltd.)으로 측정하였다. 표준물질로서 다우노루비신을 사용하여 HPLC로 측정한 독소루비신 함량으로부터 약물 적재 효율(loading efficiency, 최초 사용한 약물에 대한 미셀 또는 나노입자에 봉입된 약물의 중량%)을 계산하였다. HPLC 분석조건은 다음과 같다:
주입용량: 75㎕
유속: 1.0ml/min
이동상: 용매 B의 농도구배 :15% 내지 85%, 40 분간
(용매 A: 1% 아세트산; 용매 B:아세토니트릴)
온도: 실온
칼럼: C-18 (Vydac, multi-ring, pore size : 5㎛)
파장: 485nm; 및
입자크기 측정은 Dynamic Light Scattering (DLS) 방법에 따라 수행하였다.
상기 실험결과는 표 1에 요약하였다.
실시예
2
약물 함유 조성물
(조성물 2: 독소루비신 /
mPEG
-
PLGA
-
Toco
/
PLMA
-
COONa
)
실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로, mPEG-PLA-Toco 대신에 제조예 8의 mPEG-PLGA-Toco를 사용하여 약물 함유 조성물(조성물 2)를 제조하였다. 상기 실험결과는 표 1에 요약하였다.
실시예
3
약물 함유 조성물
(조성물 3: 독소루비신 /
mPEG
-
PCL
-
Toco
/ 3
arm
-
PLA
-
COOK
)
실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로, mPEG-PLA-Toco 및 PLMA-COONa 대신에 제조예 9에서 얻은 mPEG-PCL-Toco 및 제조예 13에서 얻은 3arm-PLA-COOK를 사용하여 약물 함유 조성물(조성물 3)를 제조하였다 상기 실험결과는 표 1에 요약하였다.
실시예
4
약물 함유 조성물
(조성물 4: 독소루비신 /
Toco
-
PLA
-
PEO
-
PLA
-
Toco
/ 4
arm
-
PLA
-
COONa
)
실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로, mPEG-PLA-Toco 및 PLMA-COONa 대신에 제조예 4에서 얻은 4arm-PLA-COONa와 제조예 10에서 얻은 Toco-PLA-PEO-PLA-Toco를 사용하여 약물 함유 조성물(조성물 4)를 제조하였다. 상기 실험결과는 표 1에 요약하였다.
실시예
5
약물 함유 조성물
(조성물 5: 독소루비신 /
mPEG
-
PLA
-
Chol
/
PLMA
-
COONa
)
실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로, mPEG-PLA-Toco 대신에 제조예 11에서 얻은 mPEG-PLA-Chol를 사용하여 약물 함유 조성물(조성물 5)를 제조하였다.
실시예
6
약물 함유 조성물
(조성물 6:
에피루비신
/
mPEG
-
PLA
-
Toco
/
PLMA
-
COONa
)
실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로, 독소루비신 대신에 에피루비신을 사용하여 약물 함유 조성물(조성물 6)을 제조하였다. 상기 실험결과는 표 1에 요약하였다.
실시예
7
약물 함유 조성물
(조성물 7:
Ca
2
+
-고정
파클리탁셀
/
mPEG
-
PLA
-
Toco
/
PLA
-
COONa
)
(1) 파클리탁셀-함유 수용액의 제조
제조예 15에서 얻은 PLA-COONa 248.1, 7.5 mg 의 파클리탁셀, 제조예 7에서 얻은 mPEG-PLA-Toco 744.3 mg의 혼합물을 5 ml 에탄올에 완전히 용해하여 투명한 용액을 얻었다. 에탄올을 제거하여 파클리탁셀-함유 고분자 조성물을 얻었다. 증류수 (6.2 ml)을 첨가하고, 60C에서 30분간 교반하여 파클리탁셀-함유 수용액을 얻었다.
(2) 2가 금속이온의 고정
0.121 ml (0.109 mmol)의 0.9 M의 무수 염화칼슘 수용액을 상기 파클리탁셀-함유 수용액에 첨가하고, 혼합물을 실온 20분간 교반하였다. 상기 혼합물을 0.22㎛ 기공크기를 갖는 PVDF 막필터를 사용하여 여과하고, 여액을 동결건조하여 사용할 때까지 냉장고에 보관하였다. 상기 실험결과는 표 1에 요약하였다.
실시예
8
약물 함유 조성물
(조성물 8:
Mg
2
+
-고정
파클리탁셀
/
mPEG
-
PLGA
-
Toco
/
PLMA
-
COONa
)
제조예 12에서 얻은 PLMA-COONa (Mn: 1,096) 248.1mg, 7.5 mg 파클리탁셀, 제조예 8의 mPEG-PLGA-Toco 744.3 mg 및 염화마그네슘 6수화물(Mw:203.31)의 0.5M 수용액을 사용하여, 실시예 7에 기재된 방법과 동일한 방법에 따라, Mg2 +- -고정 파클리탁셀-함유 조성물을 제조하였다. 상기 실험결과는 표 1에 요약하였다.
실시예
9
약물 함유 조성물
(조성물 9:
Ca
2
+
-고정
파클리탁셀
/
mPEG
-
PLA
-
Toco
/
PLMA
-
COONa
)
제조예 12에서 얻은 PLMA-COONa (Mn: 1,096) 248.1mg, 7.5 mg 파클리탁셀, 제조예 7 에서 얻은 mPEG-PLA-Toco의 744.4 mg, 및 0.9 M 무수 염화칼슘 수용액 0.230 ml (0.113 mmol)를 사용하여, 제조예7에 기재된 방법과 동일한 방법에 따라, Cg2+ -고정 파클리탁셀-함유 조성물을 제조하였다. 상기 실험결과는 표 1에 요약하였다.
실시예
10
약물 함유 조성물
(조성물 10:
Ca
2
+
-고정
파클리탁셀
/
mPEG
-
PLA
-
Chol
/
PLMA
-
COONa
)
제조예 12에서 얻은 PLMA-COONa 248.1mg, 7.5 mg의 파클리탁셀, 제조예 11에 서 얻은 mPEG-PLA-Chol 744.4 mg 및 0.9 M 무수 염화칼슘 수용액 0.230 ml (0.113 mmol)를 사용하여, 제조예7에 기재된 방법과 동일한 방법에 따라, Cg2 + -고정 파클리탁셀-함유 조성물을 제조하였다.상기 실험결과를 하기 표 1에 나타냈다.
[표 1]
|
약물 |
양친성 블록 공중합체 |
생분해성 폴리에스테르 |
봉입율 (%) |
입자크기 (nm) |
초기 중량 |
10 mg |
810 mg |
180 mg |
- |
- |
실시예 1 |
독소루비신 |
mPEG-PLA-Toco |
PLMA-COONa |
98 |
32 |
실시예 2 |
독소루비신 |
mPEG-PLGA-Toco |
PLMA-COONa |
97 |
28 |
실시예 3 |
독소루비신 |
mPEG-PCL-Toco |
3arm-PLA-COOK |
95 |
41 |
실시예 4 |
독소루비신 |
Toco-PLA-PEO-PLA-Toco |
4arm-PLA-COONa |
95 |
57 |
실시예 5 |
독소루비신 |
mPEG-PLA-Chol |
PLMA-COONa |
96 |
35 |
실시예 6 |
에피루비신 |
mPEG-PLA-Toco |
PLMA-COONa |
97 |
38 |
실시예 7 |
파클리탁셀 |
mPEG-PLA-Toco |
PLA-COONa |
99 |
29 |
실시예 8 |
파클리탁셀 |
mPEG-PLGA-Toco |
PLMA-COONa |
101 |
30 |
실시예 9 |
파클리탁셀 |
mPEG-PLA-Toco |
PLMA-COONa |
100 |
34 |
실시예 10 |
파클리탁셀 |
mPEG-PLA-Chol |
PLMA-COONa |
99 |
34 |
실시예
11
약물의
세포내
전달 평가:
세포유동분석법
생물 활성제의세포내 전달을 측정하기 위하여, 본 발명에 따른 독소루비신-함유 조성물 (실시예 1에서 얻은 조성물 1) 및 종래 독소루비신 제재(독소루비신 하이드로클로라이드 수용액, Free-Dox)을 사람 자궁암 세포주, MES-SA (독소루비신-민감성 세포주) 및 MES-SA/Dx-5 (독소루비신-저항성 세포주)에 처리하였다.
Walker 등(Experimental Cell Research 207: 142(1993))등에 기재된 방법에 따라 FACStarPlus (Becton Dickinson)를 사용하여 세포유동 분석을 수행하였다. 상 기 방법을 요약하면, 세포(1.0 x 106)를 10% 우태아 혈청 및 1% 페니실린 스트렙토마이신을 첨가한 McCoy's 5A 배지 (Invitrogen Corp.)에서 배양하였다. 24시간 배양후에, 1.0㎍/ml 용량으로 약물 조성물로 상기 세포를 처리하였다. 12 x 75 Falcon 튜브에 포함된 FACStarPlus에 두고, 488 nm(여기) 및 519 nm(방출) 파장에서 형광을 측정하였다. 실험 데이터를 소프트웨어로 분석하였으며, 결과를 도 3A 내지 4B 및 요약된 표 2A 및 2B에 나타냈다.
[표 2A]
약물을 흡수한 세포의 수 (%)
시간 (hr) |
MES-SA |
MES-SA/Dx-5 |
Free-Dox |
실시예 1 |
비율* |
Free-Dox |
실시예 1 |
비율* |
0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1 |
4.0 |
16.3 |
4.0 |
1.8 |
10.4 |
5.8 |
4 |
11.3 |
68.9 |
6.1 |
3.2 |
22.7 |
7.1 |
8 |
35.1 |
92.3 |
2.6 |
5.3 |
29.3 |
5.5 |
*비율= 조성물 1 / Free-Dox
[표 2B]
형광세기의 변화량 (△)
시간(hr) |
MES-SA |
MES-SA/Dx-5 |
Free-Dox |
실시예 1 |
비율 * |
Free-Dox |
실시예 1 |
비율* |
0 |
0.0 |
0.0 |
- |
0.0 |
0.0 |
- |
1 |
7.6 |
25.6 |
3.4 |
2.6 |
23.4 |
9.0 |
4 |
20.6 |
68.6 |
3.3 |
7.1 |
37.6 |
5.3 |
8 |
40.6 |
108.3 |
2.7 |
9.2 |
46.2 |
5.0 |
* 비율 = 조성물 1 / Free-Dox
도 2a 내지 3B 및 표 2A 및 2B에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물로부터 세포로 상기 약물 (조성물 1)이 종래 용액 제재(Free-Dox)에 비해 더욱 효과적으로 전달되었다. 특히, 독소루비신이 세포내 전달은 약물-저항성 세포주에서 현저하였다.
실시예
12A
공촛점
현미경 분석:
MES
-
SA
세포내의
독소루비신-함유 조성물
생물 활성제의 세포내 전달을 시각화하기 위해서, 본 발명의 독소루비신-함유 조성물 (실시예 1에서 얻은 조성물 1) 및 종래 독소루비신 제재(독소루비신 하이드로클로라이드, Free-Dox) 을 사람의 자궁암 세포주, MES-SA (독소루비신-민감성 세포주) 및 MES-SA/Dx-5 (독소루비신-저항성 세포주)에 대해서 시험하였다.
역상 형광 현미경이 장착된 Zeiss (Thornwood,NY) LSM 510 공촛점 이미지분석 시스템상에서 세포를 이미지화하였다. 간략히 설명하면, 세포(3 x 105)를 10% 우태아 혈청 및 1% 페니실린 스트렙토마이신을 첨가한 McCoy's 5A 배지 (Invitrogen Corp.)에서 37℃에서 하룻밤 동안 유리 커버슬라이드에서 배양하였다. 배양후에, 1.0㎍/ml 용량으로 약물 조성물로 상기 세포를 처리하였다. 상기 커버슬라이드를 현미경에 올려놓고 일정한 시간 간격으로 484nm 여기파장에서 형광을 측정하였다. 결과를 도 4A 내지 4D에 나타냈다.
도 4A 내지 4D에 나타낸 공촛점 이미지는 세포유동 분석결과를 시각화한 것 이다: 본 발명에 따른 독소루비신 함유 조성물로 처리한 경우에, 훨씬 더 많은 양의 독소루비신이 세포내로 전달되었다. 도 4A 내지 4D에 나타낸 바와 같이, 왼쪽 사진은 종래 용액 제재로 처리한 후에 얻은 공촛점 이미지이고, 오른쪽 사진은 본 발명에 따른 조성물로 처리한 후 얻은 공촛점 이미지이다. 도4B 및 4D에 나타낸 바와 같이, 미셀 또는 나노입자가 세포질 및 핵구획에서 탐지되었다.
실시예
12B
공촛점
현미경분석:
MCF
-7
세포내의
에피루비신
-함유 조성물
생물 활성제의 세포내 전달을 시각화하기 위해서, 본 발명의 에피루비신 -함유 조성물 (실시예 6에서 얻은 조성물 6) 및 종래 독소루비신 제재(에피루비신 하이드로클로라이드)을 사람의 유방암 세포주, MCF-7 (에피루비신-민감성 세포주) 및 MCF-7/ADR (에피루비신-저항성 세포주)에 처리하였다.
McCoy's 5A 배지 (Invitrogen Corp.) 대신에, RPMI 배지 (Invitrogen Corp.)를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 12A에 기재된 방법과 동일한 방법으로 공촛점 이미지를 얻었다. 실험결과를 도 4E 내지 4H에 나타냈다.
도 4E 내지 4H 에 나타낸 공촛점 이미지는 세포유도 분석결과를 시각화한 것이다: 본 발명에 따른 에피루비신 함유 조성물로 처리한 경우에, 훨씬 더 많은 양의 에피루비신이 세포내로 전달되었다. 도 4E 내지 4H 에 나타낸 바와 같이 왼쪽 사진은 종래 용액 제재로 처리한 후에 얻은 공촛점 이미지이고, 오른쪽 사진은 본 발명에 따른 조성물로 처리한 후 얻은 공촛점 이미지이다. 도 4F 및 4H 에 나타낸 바와 같이, 미셀 또는 나노입자가 세포질 및 핵구획에서 탐지되었다.
실시예
13
시험관내(In vitro)세포독성
본 발명에 따른 조성물의 시험관내 세포독성을 연구하고자, 본 발명에 따른 독소루비신-함유 조성물(실시예 1에 따른 조성물 1, Doxo-PNP) 및 종래 독소루비신 제재(독소루비신의 염산 수용액, Free-Dox)를 사람의 자궁암 세포주, MES-SA (독소루비신-민감성 세포주) 및 MES-SA/Dx-5 (독소루비신-저항성 세포주)에 처리하였다. 세포독성을 시험하는 잘 알려진 방법은 MTT 분석법이다. MTT (methylthiazoletetrazolium)로 세포를 처리한 경우, 오직 살아있는 세포에 존재하는 효소에 의해 MTT-테트라졸륨이 환원되어 MTT-포르마잔이 생성된다(죽은 세포는 MTT-테트라졸륨을 MTT-포르마잔으로 환원할 수 없다). 형광 판독기로 MTT- 포르마잔의 형광을 탐지하며, 상기 광학밀도는 세포수와 상관성이 있다. 이러한 과정은 자동화도어 있으며, 세포 생존성 및 IC50 (50% 세포성장 저해농도) 수치를 마이크로플레이트 리더에 장착된 소프트웨어로 계산한다.
각 조성물의 세포독성을 사람 암 세포주에서, 상기 조성물을 0.01 내지 100㎍/ml 농도범위가 되도록 희석하여 시험하였다. 이후 3일간 노출시키고, 세포를 MTT 로 처리하였다. 살아있는 세포내에 존재하는 효소에 의해 생성된 MTT-포르마잔를 형광 판독기로 측정하였다. 상기 광학밀도는 세포수와 상관성이 있다. 2회의 독 립적 실험의 결과를 각 세포주의 IC50 (50% 저해농도)로 나타냈다. Carmichael등(Cancer Research 47: 936(1987))의 방법에 따라 MTT 실험을 수행하였다. 요약하면, 10% 우태아 혈청 및 1% 페니실린 스트렙토마이신을 첨가한 McCoy's 5A 배지 (Invitrogen Corp.)에서 배양한 대수기 세포를 수확하고, 계수하고, 96 웰 평판마이크로 플레이트에 깔았다 (100 세포 현탁액, 각 세포주에 대해 5 x 104 세포/ml 농도). 세포가 대수증식을 다시 시작하도록 24시간 동안 방치한 후에, 배양배지 (플레이트당 24 대조 웰) 또는 약물을 포함하는 배양배지를 상기 웰에 첨가하였다. 각 약물농도로 3회 수행하였다. 3일간 지속적으로 약물에 노출한 후에, 세포를 멸균수중 25㎕ 의 MTT 용액(2mg/ml) 으로 처리하였다. 549nm 파장에서 자동 마이크로플레이트 판독기(automatic microplate reader, SpectraMax 190, Molecular Devices)로 형광을 측정하고, 생존 세포의 수를 광학 밀도로 계산하였다. 세포 생존연구의 결과를 도 5A 및 5B에 나타냈고, 각 세포주의 IC50 값을 표 3에 요약하였다.
[표 3]
MTT 분석 (IC50, μg/ml)
Time (hr) |
MES-SA |
MES-SA/Dx-5 |
Free-Dox |
실시예 1 |
비율* |
Free-Dox |
실시예 1 |
비율* |
24 |
0.30 |
0.14 |
2.1 |
54.0 |
0.95 |
56.8 |
48 |
0.087 |
0.068 |
1.3 |
0.92 |
0.28 |
3.3 |
72 |
0.031 |
0.018 |
1.7 |
0.75 |
0.14 |
5.4 |
* 비율 = Free-Dox / 조성물 1
도 5A 에 나타낸 바와 같이, 독소루비신-민감성 세포에 대한 세포독성은 두 조성물에 대해서 유사하였으나, 도 5B에 나타낸 바와 같이, 독소루비신-저항성 세포주에 처리하고 3일 경과후에, 종래 제제에 비해 본 발명의 약물 조성물이 6.7배 높은 활성을 나타냈다. 상기 활성의 차이는 P-당단백질 (P-gp)이 과다발견되어 세포독성 약물을 세포로부터 계속 배출하는, 약물-저항성 세포주의 특성에 기인한다. 유리된 약물는 약물-저항성 세포내에 농축되지 않기 때문에, 이러한 결과는 약물 담체에 봉입된 약물과 함께 본 발명의 약물 담체가 세포로 전달되는 것을 제시한다.
실시예
14
래트에서
약동역학 실험
본 발명에 따른 독소루비신-함유 조성물(실시예 1 내지 5에서 얻은 조성물 1 내지 5) 및 종래 독소루비신 제재(독소루비신 하이드로클로라이드 수용액, Free-Dox)을 7- 내지 8-주령 Sprague-Dawley 래트(200~250g)에 정맥주사하고 혈장내 약물농도를 측정하였다.
래트(각 제재당 5 마리)에 5mg/kg 용량으로 꼬리를 통해 정맥주사하였다. 약물 주입후 1, 5, 15, 30 분, 및 1, 2, 4, 8, 및 24 시간 경과 후에 꼬리 정맥으로부터 혈액 샘플를 얻었다. 상기 혈액샘플을 즉시 원심분리하고, 혈장을 분리하였다. The 혈장 샘플을 분석할 때까지 -50℃에 보관하였다. 독소루비신 분석은 실시예 1에 기재된 HPLC 분석법에 의해 수행하였다.
혈액농도-시간 곡선 (C-t curve)을 도 6에 나타냈으며, 선형 사다리꼴 공식 을 사용하여 상기 곡선아래 면적 (AUC) 을 계산하였으며, 결과를 표 4에 요약하였다.
[표 4]
래트에서 약동역학
|
농도(㎍*hr/mL) |
AUC (㎍*hr/mL) |
1hr |
4hr |
8hr |
24hr |
Free-Dox |
0.23 |
0.07 |
0.04 |
0.03 |
1.3 |
조성물 1 |
7.41 |
4.69 |
3.85 |
1.99 |
85.6 |
조성물 2 |
5.23 |
2.59 |
1.57 |
0.85 |
42.0 |
조성물 3 |
1.47 |
0.85 |
0.63 |
0.31 |
14.7 |
조성물 4 |
2.10 |
1.35 |
0.95 |
0.60 |
23.2 |
조성물 5 |
3.54 |
2.35 |
1.96 |
1.16 |
44.2 |
상기 언급된 예는 본 발명의 일례로서 제시한 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고서 다양한 변형과 변화를 수행할 수 있다. 가장 실용적이고 바람직한 예와 함께 도면 및 상세한 설명에 자세히 본 발명을 기술하고 있으나 제시된 원리 및 기본개념에서 벗어나지 않으면서 다양한 변형을 수행할 있음은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 명백할 것이다.