KR101480055B1 - 음이온성 약물 전달체의 제조 방법 - Google Patents

음이온성 약물 전달체의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

유효성분으로서 음이온성 약물; 양이온성 지질; 양친성 블록 공중합체를 포함하며, 상기 음이온성 약물은 상기 양이온성 지질과 복합체를 형성하고, 상기 음이온성 약물-양이온성 지질 복합체가 양친성 블록 공중합체가 형성하는 미셀 구조 내부에 봉입된 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 음이온성 약물 전달용 조성물의 효과적인 제조 방법이 제공된다.

Description

음이온성 약물 전달체의 제조 방법{Method of Preparing Composition for Delivering an Anionic Drug}
본 발명은 유효성분으로서 음이온성 약물; 양이온성 지질; 양친성 블록 공중합체를 포함하며, 상기 음이온성 약물은 상기 양이온성 지질과 복합체를 형성하고, 상기 음이온성 약물-양이온성 지질 복합체가 양친성 블록 공중합체가 형성하는 미셀 구조 내부에 봉입된 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 음이온성 약물 전달용 조성물의 효과적인 제조 방법에 관한 것이다.
음이온성 약물, 특히 핵산 물질을 이용한 치료에 있어서, 안전하고 효율적인 약물 전달기술은 오랫동안 연구되어 왔으며, 다양한 전달체 및 전달기술이 개발되어 왔다. 특히, 아데노바이러스나 레트로바이러스 등을 이용한 바이러스성 전달체, 및 양이온성 지질, 양이온성 고분자 등을 이용한 비바이러스성 전달체를 이용한 전달기술들이 개발되어 왔다.
그러나, 바이러스를 이용한 전달체를 이용하는 기술은, 비특이적 면역 반응 등의 위험성에 노출되어 있으며 생산 공정이 복잡하여 상용화하는 데 많은 문제점이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 최근 연구 방향은 양이온성 지질이나 양이온성 고분자를 이용하는 비바이러스성 전달체를 이용하여 그 단점을 개선하는 방향으로 진행되고 있다. 이러한 비바이러스성 전달체는, 바이러스성 전달체에 비하여 효율성에서 뒤떨어지지만, 생체 내 안전성의 측면에서 부작용이 적고, 경제성 측면에서 생산 가격이 저렴하다는 장점을 가지고 있다.
핵산 물질의 전달에 이용되는 비바이러스성 전달체에 대해서 많은 연구가 이루어졌는데, 가장 대표적인 것은 양이온성 지질을 이용한 양이온성 지질과 핵산의 복합체(lipoplex) 및 폴리양이온성(polycation) 고분자와 핵산의 복합체(polyplex)이다. 이러한 양이온성 지질 혹은 폴리양이온성 고분자는, 음이온성 약물과 정전기적 상호 작용을 통해 복합체를 형성함으로써 음이온성 약물을 안정화시키고, 세포 내 전달을 증가시킨다는 점에서 많은 연구가 진행되어 왔다 (De Paula D, Bentley MV, Mahato RI, Hydrophobization and bioconjugation for enhanced siRNA delivery and targeting, RNA 13 (2007) 431-56; Gary DJ, Puri N, Won YY, Polymer-based siRNA delivery: Perspectives on the fundamental and phenomenological distinctions from polymer-based DNA delivery, J Control release 121 (2007) 64-73).
그러나, 이제까지 개발된 양이온성 지질 또는 폴리양이온성 고분자들은, 바이러스성 전달체보다는 덜하지만, 충분한 효과를 얻기 위해 필요한 양을 사용할 경우에 심각한 독성을 유발하여 의약품으로 사용이 부적당한 결과를 나타내었다. 또한, 양이온성 지질과 핵산의 결합을 통해 착화합물을 이루어 세포 내로 핵산을 전달시키는 지질-핵산 복합체의 경우는 세포주 실험에서는 매우 광범위하게 이용되지만, 혈중에서의 안정성을 가질 수 있는 구조를 나타내지 못하기 때문에 생체 내에서 이용하기에는 불가능하다 (US6,458,382 참고).
생체 내에서 핵산을 세포내로 전달하기 위하여 사용되는 또다른 비바이러스성 전달체 중 하나는 핵산-양이온성 리포좀 착물 혹은 핵산을 포함하는 양이온성 리포좀이다. 이는 양친성 지질, 중성 지질 및 용해성 지질 (fusogenic lipid) 등으로 구성되어 있고 핵산 물질이 리포좀 외부에 정전기적 결합으로 부착되어 있거나 내부에 포획되는데 (US2003-0073640, WO05/007196, US2006-0240093), 이러한 리포좀 전달체는 세망내피계 (RES; reticuloendothelial system)에 쉽게 포획되며 상당한 독성의 부작용을 나타낼 수 있어 전신 적용에 적합하지 않거나, 대부분 간 조직에 한정된 핵산 전달효과를 나타낸다는 단점을 가지고 있다.
또한, 리포좀 전달체과 더불어 가장 많이 연구되고 있는 비바이러스성 전달체는 양이온성 고분자를 포함하는 전달체인 고분자 당 다가(multivalent)의 양이온 전하를 포함하는 폴리양이온성 고분자인데, 특히 흔히 사용되고 있는 고분자는 폴리양이온성 폴리에틸렌이민(PEI, polyethylenimine) 계열의 고분자로서, 이러한 폴리양이온성 고분자는 핵산 물질과 정전기적 결합을 통해 결합하여 핵산-고분자 복합체를 이루어 나노 입자를 형성하게 된다. 그러나 이러한 폴리양이온성 고분자들은 세포사멸을 촉진하고, 이러한 세포독성은 고분자의 분자량과 분지도(degree of branching)가 커질수록 증가하는 것으로 알려져 있다. 낮은 분자량의 폴리양이온성 고분자들은 세포독성은 낮은 것으로 알려져 있으나, 고분자 내의 양이온 밀도가 낮아 핵산과 효과적인 복합체를 형성하지 못하고, 따라서 세포내 전달이 잘 이루어지지 않으며 핵산의 안정성 증가에 크게 기여하지 못하는 것으로 알려져 있다.
또 다른 형태의 핵산 전달체로는, 핵산 물질 자체에 지질 혹은 고분자를 직접 접합시킨 후, 미셀이나 다른 고분자와 복합체를 이루게 하여 나노 입자를 형성시키는 형태가 있는데, 핵산 물질에 직접 지질 혹은 고분자를 접합시키는 경우에는 접합 효율이나 품질 관리의 측면에서 어려움을 가지고 있으며 아직까지 명확하게 핵산 전달의 효율에 있어서는 검증이 되어 있지 않다.
따라서, 독성을 유발할 수 있는 양이온성 고분자 또는 양이온성 지질의 사용량을 최소화하여 독성을 감소시키면서, 혈중 및 체액 내에서 안정하고, 세포내 전달이 가능하여 충분한 효과를 얻을 수 있는 음이온성 약물 전달 기술의 개발이 필요하다.
한편, 양친성 블록 공중합체를 이용하여 고분자 미셀의 형태로 난용성 약물을 가용화하고 수용액상에서 안정하게 함으로써 약물 전달체로서 이용하려는 노력이 다양하게 진행되었다 (한국 등록특허 제0180334호). 그러나, 이러한 양친성 블록 공중합체는 내부에 소수성을 띄는 고분자 미셀을 형성함으로써 소수성을 띄는 난용성 약물을 가용화할 수는 있지만, 음이온을 띄는 핵산 등의 친수성 약물은 고분자 미셀 내부에 봉입할 수 없으므로, 이들 핵산을 포함하는 음이온성 약물의 전달에는 적당하지 않다. 따라서 고분자 미셀의 형태로 음이온성 약물을 전달하기 위해서는 양이온성 결합 물질을 이용하여 전하를 중성화시키는 과정이 필요한데, 이러한 고안은 선행 발명 (국제공개특허 WO2010/074540)에 이미 밝힌 바 있다.
한편, 많은 질병은 여러 요인으로 인하여 질병 유전자의 발현이 증가하거나 돌연변이에 의해 비정상적인 활성이 나타남으로써 발생하게 된다. siRNA(short interfering RNA)는, 전사 후 공정에서 서열 특이적으로 특정 유전자의 발현을 억제하므로, 유전자 치료제로서 많은 관심이 집중되고 있다. 특히, siRNA의 높은 활성과 정밀한 유전자 선택성으로 인해, 기존의 안티센스 뉴클레오티드나 리보자임 등의 문제점을 해결할 수 있는 핵산 치료제로 기대되고 있다. siRNA는 15 개 이상 30 개 미만의 뉴클레오티드로 구성된 짧은 이중 나선의 RNA 가닥으로, 이들과 염기 서열이 상보적인 유전자의 mRNA를 절단함으로써 해당 유전자의 발현을 억제시킨다 (McManus and Sharp, Nature Rev. Genet. 3:737 (2002); Elbashir, et al., Genes Dev. 15:188 (2001)).
그러나, 이러한 장점에도 불구하고, siRNA는 혈중에서 핵산 분해 효소에 의해 빠르게 분해되고, 신장을 통하여 빠르게 체외로 배설되는 것으로 알려져 있다. 또한 siRNA는 강한 음전하를 띄어 세포막을 쉽게 통과하지 못하는 것으로 알려져 있다. 따라서 siRNA를 치료제로 사용하기 위해서는 siRNA를 혈액에서 안정화시키고, 목표로 삼은 조직이나 세포 안으로 효율적으로 전달할 수 있으며, 독성을 나타내지 않는 전달체 제조 기술의 개발이 필요하다.
본 발명의 일례는 음이온성 약물을 체내에 효과적으로 전달할 수 있는 미셀 구조체를 포함하는 음이온성 약물 전달용 조성물의 효과적인 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일례는 유효성분으로서 음이온성 약물; 양이온성 지질; 양친성 블록 공중합체를 포함하며, 상기 음이온성 약물은 상기 양이온성 지질과 복합체를 형성하고, 상기 음이온성 약물-양이온성 지질 복합체가 양친성 블록 공중합체가 형성하는 미셀 구조 내부에 봉입된 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조방법에 관한 것이다. 이와 같이 제조된 음이온성 약물 전달용 조성물은 음이온성 약물의 혈중 혹은 체액 내 안정성을 높이고, 세망내피계를 회피하도록 고안되어, 음이온성 약물을 조직으로 효율적으로 전달하여 약효를 발휘할 수 있는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 제조 방법은 음이온성 약물 전달용 조성물의 대량 생산에 용이하다.
본 발명은 상기 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 방법을 제공한다. 상기 음이온성 약물 전달용 조성물은 음이온성 약물; 양이온성 지질; 양친성 블록 공중합체를 포함하며, 상기 음이온성 약물은 상기 양이온성 지질과 복합체를 형성하고, 상기 음이온성 약물-양이온성 지질 복합체가 양친성 블록 공중합체가 형성하는 미셀 구조 내부에 봉입된 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 음이온성 약물 전달용 약제학적 조성물일 수 있다.
상기 제조 방법은
(1) 음이온성 약물의 수용액을 양이온성 지질이 유기용매에 용해된 용액에 가하여 유상액을 만드는 단계; 및,
(2) 상기 유상액에 수성 용매 또는 양친성 블록 공중합체의 수용액을 첨가하여 고분자 미셀을 형성하는 단계
를 포함하되,
단계 (2)에서 수성 용매를 첨가하는 경우, 양친성 블록 공중합체를 단계 (1)에서 사용되는 양이온성 지질이 유기용매에 용해된 용액에 첨가하고 단계 (1)에서 제조된 유상액으로부터 유기용매를 제거하거나, 단계 (1)에서 얻어진 유상액으로부터 유기용매를 제거한 후 양친성 블록 공중합체를 유기용매에 용해시켜 첨가한 후 유기용매를 제거하는 단계를 추가로 포함하고,
단계 (2)에서 양친성 블록 공중합체의 수용액을 첨가하는 경우, 단계 (1) 또는 단계 (2)를 수행한 후 유기용매를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 제조 방법은,
(1-i') 임의 단계로서, 하기하는 단계 (1-i) 전 또는 후에, 양친성 블록 공중합체의 일부를 유기용매에 용해시킨 후 용기에 넣고 유기용매를 제거하여 용기 내부를 양친성 블록 공중합체로 코팅하는 단계;
(1-i) 음이온성 약물의 수용액을 양이온성 지질이 유기용매에 용해된 용액에 가하여 유상액(emulsion)을 제조하는 단계;
(1-ii) 상기 단계 (1-i)에서 제조된 유상액으로부터 유기용매를 제거하는 단계로서, 상기 단계 (1-i')가 수행된 경우에는, 이 단계는 상기 단계 (1-i')의 내부가 양친성 블록 공중합체로 코팅된 용기에서 수행되며;
(1-iii) 양친성 블록 공중합체를 유기용매에 용해시킨 후 상기 단계 (1-ii)에서 얻어진 반응물에 넣고 유기용매를 제거하는 단계로서, 상기 단계 (1-i')이 수행된 경우, 이 단계는 상기 단계 (1-i')의 내부가 양친성 블록 공중합체로 코팅된 용기에서 수행되고, 상기 양친성 블록 공중합체는 단계 (1-i') 에서 사용되지 않은 여분의 양친성 블록 공중합체를 의미하며; 및
(1-iv) 상기 단계 (1-iii)에서 얻어진 유기용매가 제거된 반응물에 수성 용매를 첨가하여 고분자 미셀을 형성하는 단계
를 포함할 수 있다.
상기 단계 (1-i')의 양친성 블록 공중합체를 유기용매에 용해시킨 용액을 용기에 넣고 유기용매를 제거시킴으로써, 용기 내부를 양친성 블록 공중합체로 코팅시키기 위한 단계로서, 나노 입자가 용기 표면에 흡착하여 수율이 낮아지는 것을 방지하기 위한 것으로, 수율을 보다 높이기 위하여 임의적으로 수행할 수 있는 단계이다. 단계 (1-i')는 단계 (1-iii)의 유기용매를 제거하는 단계 이전, 예컨대 단계 (1-i)의 전 또는 후, 또는 (1-ii)의 전 또는 후에 수행 가능하다. 이때 사용 가능한 유기용매는, 예컨대, 아세트산에틸, 아세토니트릴, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 다이옥산 등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유기용매일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단계 (1-i')에 사용되는 양친성 블록 공중합체의 양은, 단계 (1-iii)에서 사용되는 양친성 블록 공중합체와 합한 전체 양을 기준으로, 1 내지99 중량%, 구체적으로, 1 내지 50중량%, 보다 구체적으로 5 내지 50 중량% 정도일 수 있다. 만약, (1-i')에 사용되는 양친성 블록 공중합체의 양이 1 중량% 미만이면 상기 단계 (1-iv)에서 음이온성 약물과 양이온성 지질, 양친성 블록 공중합체로 이루어진 복합체를 수화하기 어려워 수율이 떨어지는 단점이 있으며, 99 중량%를 초과하면 나노 입자의 크기가 지나치게 커져서 필터 통과 이후 단계의 수율이 감소하는 단점이 있으므로, 단계 (1-i')에 사용되는 양친성 블록 공중합체의 양은 상기 범위로 하는 것이 좋다.
상기 (1-i')에 사용되는 총 유기용매의 부피는 (1-ii) 공정의 전체 부피보다 클 수 있도록 유기용매를 추가로 첨가한다. 이 때 총 유기용매의 부피는 (1-i) 공정의 결과물의 전체 부피의 1배 이상, 구체적으로는 1.2-1.5배가 되도록 사용할 수 있다. 만약 1배 미만이면 (1-iv) 공정에서의 수득률이 떨어지게 된다. 상기 모든 공정에서 유기용매를 제거하는 방법은 증발이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단계 (1-i)에서, 음이온성 약물의 수용액을 양이온성 지질이 유기용매에 용해된 용액(양이온성 지질의 유기용매 용액)과 혼합하여 유상액을 제조하는 과정은, 초음파분쇄기 (sonicator), 볼택싱 믹서(vortex mixer), 교반기 등과 같이 유상액 제조에 통상적으로 사용되는 모든 혼합기구를 이용하여 수행될 수 있으며, 이러한 내용은 이하의 모든 유상액 제조 공정에서 동일하다.
상기 음이온성 약물의 수용액 내 약물 농도는 1 ng/ml 내지 1 kg/ml, 구체적으로 1 μg/ml 내지 1 g/ml 이고, 상기 양이온성 지질이 유기용매에 용해된 용액 내의 양이온성 지질의 농도는 1 pg/ml 내지 1 kg/ml, 구체적으로 1 ng/ml 내지 1 g/ml 일 수 있다. 상기 약물 수용액과 양이온성 지질의 유기용매 용액의 혼합비는 부피 기준으로 1:1 내지 50, 구체적으로 1:2 내지 1:20, 보다 구체적으로 1:3 내지 1:10 (수용액 부피: 유기용매 용액 부피)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 수용액과 유기 용매의 혼합비는 각 용질의 농도와는 무관하고, 유상액 (emulsion)을 만들기에 적절한 부피비로서 선정된 것이다.
단계 (1-ii)에서 단계 (1-i)에서 제조된 유상액을 상기 단계 (1-i')의 내부가 양친성 블록 공중합체로 코팅된 용기에 넣고 유기용매를 제거함으로써, 음이온성 약물과 양이온성 지질 복합체로 이루어진 박막이 형성되게 된다. 이 때, 용기 내부(내벽)가 양친성 블록 공중합체로 코팅됨으로써 음이온성 약물과 양이온성 지질의 복합체가 용기 내부에 흡착되어 수득률을 저하시키는 것을 방지할 수 있다.
상기 단계 (1-iii)에서 사용되는 여분의 양친성 블록 공중합체는 앞서 설명한 바와 같이 단계 (1-i')에서 사용된 양친성 블록 공중합체를 제외한 분량을 의미하는 것으로, 단계 (1-i')에서 사용된 양친성 블록공중합체와 합한 전체 양을 기준으로 1 내지 99중량%, 구체적으로 50 내지 99중량%, 보다 구체적으로 50 내지 95중량%일 수 있다. 만약, 임의 단계인 단계 (1-i')이 생략되는 경우, 본 단계에서의 양친성 블록 공중합체는 필요한 전량이 사용된다.
단계 (1-iii)에서 양친성 블록 공중합체를 용해시키는 유기용매는, 예컨대, 아세트산에틸, 아세토니트릴, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 다이옥산 등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유기용매일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 단계 (1-i')에서 사용된 유기용매와 동일하거나 상이한 것일 수 있다. 또한, 이 때의 유기용매의 사용량은 유기용매에 용해된 용액 내의 양친성 블록 공중합체의 농도가 1 ng/ml 내지 1 kg/ml, 구체적으로 1 μg/ml 내지 1 g/ml이 되도록 하는 범위일 수 있다
단계 (1-iii)에서 양친성 블록 공중합체가 유기용매에 용해된 용액을 상기 단계 (1-ii)의 반응물, 즉 음이온성 약물과 양이온성 지질의 복합체로 이루어진 박막에 첨가한 후, 유기 용매를 제거함으로써, 상기 음이온성 약물과 양이온성 지질의 복합체로 이루어진 박막 상에 양친성 블록 공중합체 박막이 형성될 수 있다.
상기 단계 (1-iv)에서, 상기 수성 용매는 단계 (1-iii)에서 얻어진 유기용매가 제거된 혼합물을 수화시켜서 나노입자로 제조하기 위하여 사용하는 용매로서, 물(증류수) 및 완충용액으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 그 첨가량은 수성 용매 첨가 후의 음이온성 약물의 예상 농도가 1 ng/ml 내지 1 kg/ml, 구체적으로 1 μg/ml 내지 1 g/ml가 되도록 하는 범위일 수 있다.
단계 (1-iv)를 통하여 단계 (1-iii)에서 얻어진 유기용매가 제거된 반응물, 즉 음이온성 약물과 양이온성 지질의 복합체로 이루어진 박막 및 양친성 블록 공중합체 박막의 혼합물이 수화되어, 음이온성 약물, 양이온성 지질, 및 양친성 블록 공중합체를 포함하고, 음이온성 약물과 양이온성 지질 복합체가 양친성 블록 공중합체가 형성하는 미셀 구조 내부에 봉입된 구조의 나노입자로 얻어지게 된다.
또 다른 구체예에서, 상기 제조 방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다:
(2-i') 임의 단계로서, 하기하는 단계 (2-i) 전 또는 후에, 양친성 블록 공중합체의 일부를 유기용매에 용해시킨 후 용기에 넣고 유기용매를 제거하여 용기 내부를 양친성 블록 공중합체로 코팅하는 단계;
(2-i) 음이온성 약물의 수용액을 양이온성 지질이 유기용매에 용해된 용액에 가하여 유상액을 제조하는 단계;
(2-ii) 상기 단계 (2-i)에서 제조된 유상액으로부터 유기용매를 제거하는 단계로서, 상기 단계 (2-i')가 수행되는 경우, 상기 단계 (2-i)에서 제조된 유상액을 상기 단계 (2-i')의 내부가 양친성 블록 공중합체로 코팅된 용기에서 수행되며; 및
(2-iii) 양친성 블록 공중합체를 수성 용매에 용해한 후 단계 (2-ii)에서 얻어진 반응물과 혼합하여 고분자 미셀을 형성하는 단계로서, 상기 단계 (2-i')가 수행된 경우, 상기 양친성 블록 공중합체는 단계 (2-i')에서 사용되지 않은 여분의 양친성 블록 공중합체를 의미하는 것임.
상기 단계 (2-i') 내지 (2-ii)의 상세 사항은 상기 단계 (1-i') 내지 (1-ii)에서 설명한 바를 참조할 수 있으며, 단계 (2-i')는 단계 (1-i')과 동일하게 공정의 수율을 보다 높이기 위하여 임의적으로 수행할 수 있는 단계로서, 단계 (2-iii)의 유기용매를 제거하는 단계 이전, 예컨대 단계 (2-i)의 전 또는 후, 또는 (2-ii)의 전 또는 후에 수행 가능하다.
단계 (2-iii)의 여분의 양친성 블록 공중합체의 용해에 사용되는 수성 용매는 물(증류수) 및 완충용액으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 상기 수성 용매의 사용량은 음이온성 약물의 예상 농도가 1 ng/ml 내지 1 kg/ml, 구체적으로 1 μg/ml 내지 1 g/ml이 되도록 하는 범위일 수 있다. 본 단계는 단계 (2-ii)에서 얻어진 유기용매가 제거된 반응물, 즉 음이온성 약물과 양이온성 지질의 복합체로 이루어진 박막이 양친성 블록 공중합체가 수성 용매에 용해된 용액에 의하여 수화되어, 음이온성 약물, 양이온성 지질, 및 양친성 블록 공중합체를 포함하고, 음이온성 약물과 양이온성 지질 복합체가 양친성 블록 공중합체가 형성하는 미셀 구조 내부에 봉입된 구조의 나노입자로 얻어지게 된다.
또 다른 구체예에서, 상기 제조 방법은,
(3-i') 임의 단계로서, 양친성 블록 공중합체의 일부를 유기용매에 용해한 후 용기에 넣고 유기용매를 제거하여 용기 내부를 양친성 블록 공중합체로 코팅하는 단계;
(3-i) 음이온성 약물의 수용액을 양이온성 지질과 양친성 블록 공중합체가 유기용매에 용해된 용액에 가하여 유상액을 제조하는 단계로서, 상기 단계 (3-i')이 수행된 경우, 상기 양친성 블록 공중합체는 단계 (3-i') 에서 사용되지 않은 여분의 양친성 블록 공중합체를 의미하며;
(3-ii) 상기 단계 (3-i)에서 제조된 유상액에서 유기용매를 제거하는 단계로서, 상기 단계 (3-i')가 수행된 경우에는, 이 단계는 상기 단계 (3-i')의 내부가 양친성 블록 공중합체로 코팅된 용기에서 수행되며; 및
(3-iii) 상기 단계 (3-ii)에서 얻어진 유기용매를 제거한 반응물에 수성 용매를 첨가하여 고분자 미셀을 형성하는 단계
를 포함할 수 있다.
단계 (3-i'), (3-ii), 및 (3-iii)는 상기 단계 (1-i'), (1-ii), 및 (3-iii)에서 설명한 바를 참조할 수 있으며, 단계 (3-i')는 단계 (1-i')과 동일하게 공정의 수율을 보다 높이기 위하여 임의적으로 수행할 수 있는 단계로서, 단계 (3-iii)의 유기용매를 제거하는 단계 이전, 예컨대 단계 (3-i)의 전 또는 후, 또는 (3-ii)의 전 또는 후에 수행 가능하다.
단계 (3-i)는 양이온성 지질과 양친성 블록 공중합체 (또는 상기 단계 (3-i')에서 사용되지 않은 여분의 양친성 블록 공중합체)가 유기용매에 용해된 용액을 사용하여 유상액을 제조한다는 점을 제외하고는 단계 (1-i)와 동일하다. 또한, (3-i)에서 사용되는 음이온성 약물의 수용액의 농도는 상기 단계 (1-i)에서 설명한 바와 같다.
또 다른 구체예에서, 상기 제조 방법은,
(4-i) 음이온성 약물의 수용액을 양이온성 지질이 유기용매에 용해된 용액에 가하여 유상액을 제조하는 단계;
(4-ii) 상기 단계 (4-i)에서 제조된 유상액을 양친성 블록 공중합체의 수용액에 가하며 혼합하여 복합 유상액을 제조하는 단계; 및
(4-iii) 상기 단계 (4-ii)에서 제조된 복합 유상액에서 유기용매만을 선택적으로 제거하여 고분자 미셀을 형성하는 단계
를 포함할 수 있다.
상기 단계 (4-i)은 상기 단계 (1-i)에서 설명한 바를 참조할 수 있으며, 음이온성 약물의 수용액과 양이온성 지질이 유기용매에 용해된 용액(유기용매 용액)의 혼합비는 부피 기준으로 1:1 내지 1:50, 구체적으로 1:2 내지 1:20, 보다 구체적으로 1:3 내지 1:10 (수용액 부피:유기용매 용액 부피) 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 단계 (4-ii)에서의 양친성 블록 공중합체는 전량이 사용되며, 상기 양친성 블록 공중합체 수용액은 양친성 블록 공중합체가 물에 1 ng/ml 내지 1 kg/ml, 구체적으로 1 μg/ml 내지 1 g/ml의 농도로 용해된 수용액을 의미하며, 상기 용액은 음이온성 약물의 예상 농도가 1 ng/ml 내지 1 kg/ml, 구체적으로 1 μg/ml 내지 1 g/ml이 되도록 하는양으로 사용될 수 있다. 상기 단계 (4-ii)에서의 수성 용매의 종류는 앞서 설명한 바와 같고, 수성 용매의 사용량은 단계 (4-i)의 유상액 부피를 기준으로 1 내지 1,000 부피배, 구체적으로 1 내지 100 부피배로 사용할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 상기 제조 방법은,
(5-i) 음이온성 약물의 수용액을 양이온성 지질과 양친성 블록 공중합체가 유기용매에 용해된 용액을 가하여 유상액을 제조하는 단계;
(5-ii) 상기 단계 (5-i)의 유상액을 수성 용매에 가하며 혼합하여 복합 유상액을 제조하는 단계; 및
(5-iii) 상기 단계 (5-ii)의 복합 유상액에서 유기용매만을 선택적으로 제거하여 고분자 미셀을 형성하는 단계
를 포함할 수 있다.
단계 (5-i), (5-ii), (5-iii)은 상기 단계 (4-i), (4-ii), (4-iii)을 참조할 수 있다. 상기 단계 (5-i)에서 음이온성 약물 수용액과 양이온성 지질과 양친성 블록 공중합체가 유기용매에 용해된 용액(유기용매 용액)의 혼합비는 부피 기준으로 1:1 내지 50, 구체적으로 1:2 내지 1:20, 보다 구체적으로 1:3 내지 10 (수용액 부피:유기용매 부피)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단계 (5-ii)에서의 수성 용매의 종류는 앞서 설명한 바와 같고, 수성 용매의 사용량은 단계 (5-i)의 유상액 부피를 기준으로 1 내지 1,000 부피배, 구체적으로 1 내지 100 부피배로 사용할 수 있다.
앞서 설명한 전 단계에 있어서, 유기용매를 제거하는 단계는 증발, 분별증류 등의 통상적인 방법에 의하여 수행될 수 있으며, 특히 단계 (4-iii)와 (5-iii)에서 유기용매만을 선택적으로 제거하는 단계는 분별증류 등의 방법으로 수행될 수 있다.
또한, 일 실시예에서, 상기 방법 4 또는 5에서 있어서, 유기용매를 제거하는 단계 이전, 예컨대, 단계 (4-i)의 전 또는 후, (4-ii)의 전 또는 후, (5-i)의 전 또는 후, 또는 (5-ii)의 전 또는 후에, 양친성 블록 공중합체의 일부를 유기용매에 용해한 후 용기에 넣고 유기용매를 제거하여 용기 내부를 양친성 블록 공중합체로 코팅하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며 (각각 단계 (4-i'), 단계 (5-i'); 상기 단계 (1-i')의 설명이 참조됨), 이 경우, 상기 단계 (4-ii) 또는 (5-i)에서 사용되는 양친성 블록 공중합체의 양은 상기 코팅 단계에서 사용되지 않은 여분의 양이며, 상기 단계 (4-iii) 또는 (5-iii)가 상기 코팅된 용기에서 수행된다.
상기 방법 1 내지 5에 있어서, 상기 양친성 블록 공중합체는 수용액 상에서 음이온성 약물과 양이온성 지질 복합체를 미셀 구조내부에 봉입시키는 역할을 하며, 본 발명의 음이온성 약물 전달체 제조를 위한 전단계에 걸쳐서 필요한 양친성 블록 공중합체의 사용량은, 양친성 블록 공중합체중량(b) 대비 음이온성 약물 및 양이온성 지질 복합체의 중량(a) 비율[a/b; (음이온성 약물 중량+양이온성 지질 중량)/양친성 블록 공중합체 중량]이 0.00001 내지 1, 구체적으로는 0.0001 내지 0.5, 보다 구체적으로는 0.001 내지 0.1이 되도록 하는 양일 수 있다. 상기 중량 비율이, 0.00001 미만인 경우에는 음이온성 약물 및 양이온성 지질 복합체의 함량이 낮아져서 음이온성 약물에 대한 유효 함량을 충족시키기 어려우며, 반대로 1 초과시에는 양친성 블록 공중합체의 분자량과 음이온성 약물 및 지질 복합체의 양을 고려할 때 적절한 크기의 미셀 구조를 형성하지 못하기 때문이다.
상기 방법 1 내지 3에 있어서, 단계 (1-i'), (2-i'), 또는 (3-i')과 같은 사전 용기 내부를 양친성 블록 공중합체 일부로 코팅하는 단계가 수행되는 경우, 사용되는 일부 양친성 블록 공중합체의 양은, 상기 양친성 블록 공중합체중량(b) 대비 음이온성 약물 및 양이온성 지질 복합체의 중량(a) 비율(a/b)로부터 산출되는 전량을 기준으로, 단계 (1-i') 부분에서 설명한 바와 같은 비율로 취해지는 양이이고, 단계 (1-iii), (2-iii), 또는 (3-ii)에서 사용되는 여분의 양친성 블록 공중합체의 양은 상기 a/b 비율로부터 산출되는 전량에서 단계 (1-i') 부분에서 설명한 바와 같은 일부를 제외한 잔량이다. 또한, 단계 (1-i'), (2-i'), 또는 (3-i')가 수행되지 않는 경우, 단계 (1-iii), (2-iii), 또는 (3-ii)에서 사용되는 양친성 블록 공중합체의 양은 상기 a/b 비율로부터 산출되는 전량이다.
상기 방법들은, 이에 의하여 제조된 음이온성 약물 전달용 조성물이 평균 입경 10 내지 400 m, 구체적으로는 50 내지 300nm의 균일한 크기를 갖는 나노입자 형태여서, 멸균 필터를 통한 여과 등의 통상적인 후속 단계 수행 후에도 수득량이 유지되어 고수율을 달성할 수 있는 이점을 갖는다.
본 발명에서 제공되는 제조 방법의 개선점을 본 출원인의 선행출원에서 제시된 기술과 비교하여 설명한다. 본 출원인의 선행 출원(WO 2010/074540)에서는 다음의 공정을 포함하는 미셀 구조체를 포함하는 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 방법을 개시한다:
(a) 음이온성 약물과 양이온성 지질을 유기용매에 용해시키는 공정;
(b) 상기 (a) 공정의 유기용매층을 분리하는 공정;
(c) 상기 (b) 공정의 유기용매층에 양친성 블록 공중합체를 혼합하고 유기용매를 제거하는 공정; 및
(d) 상기 유기용매가 제거된 혼합물에 수용액을 첨가하여 미셀화하는 공정.
상기 선행 출원에서 개시하는 또 다른 제조 방법은
(a') 음이온성 약물, 양이온성 지질 및 양친성 블록 공중합체를 유기용매에 용해시키는 공정;
(b') 상기 (a') 공정의 유기용매층를 제거하는 공정;
(c') 상기 (b') 공정의 유기용매가 제거된 혼합물에 수용액을 첨가하여 미셀화하는 공정을 포함한다.
그리고, 이렇게 나노 입자를 만든 후 멸균 필터로 멸균하는 공정을 추가로 포함할 수 있다고 기재하고 있는데, 의약품으로 사용하기 위해서는 멸균이 필수적이다.
하지만, 상기 선행 출원에 나타난 종래의 방법의 경우, 제조 후에 나노 입자에 봉입된 음이온성 약물의 수득률이 낮다는 단점을 가지고 있다. 낮은 수득률의 원인을 찾기 위하여 먼저 선행 특허의 (a') 내지 (c') 공정의 제조 방법을 통하여 나노 입자 제조 시, 멸균 필터 통과 전과 멸균 필터 통과 후의 수득률을 비교하였는데, 그 결과 멸균 필터 통과 전과 후의 수득률 차이가 크게 나타남을 확인하였다. 이는 생성된 나노 입자의 크기가 균일하지 못하여 크기가 큰 입자들이 멸균 필터 통과 과정에서 걸러진다고 해석할 수 있다. 또한, 선행 출원의 (a) 내지 (d) 공정에 따라 나노 입자를 제조하고 멸균 필터 통과 전과 후의 수득률을 비교하였는데, 이 공정을 통하여 제조된 나노 입자 역시 멸균 필터 통과 전과 후의 수득률 차이가 크게 나타남을 확인하였다.
음이온성 약물과 양이온성 지질의 복합체 형성을 위하여, 친수성인 음이온성 약물과 소수성인 양이온성 지질을 혼합시키는 과정에는, 수혼화성 유기용매 혹은 수용액과 유기용매의 혼합 용매가 사용될 수 있는데, 이 때 수용액과 유기용매 간의 층 분리가 일어나지 않도록 하기 위하여 메탄올이나 에탄올 등과 같은 저분자량의 알코올 등이 이용된다.
따라서, 본 발명자들은 나노 입자 제조 과정에 크기를 균일하게 할 수 있을 것으로 예상되는 여러 가지 방법을 시도해 보았다. 그 결과, 수혼화성 유기용매 혹은 수용액과 유기용매의 혼합 용매를 이용하는 기존 방법과 대비하여, 수용액에 용해되는 음이온성 약물과 유기용매에 용해되는 양이온성 지질의 혼합 과정, 혹은 수용액에 용해되는 음이온성 약물과 유기용매에 용해되는 양이온성 지질과 양친성 블록 공중합체의 혼합 과정에서 sonicator나 vortex mixer, 교반기 등을 이용하여 유상액 (emulsion)을 만드는 방법이 보다 균일한 크기의 입자를 형성하여 멸균 필터 통과 전과 후의 수득률 차이를 줄일 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
또한, 기존 방법에서는 유기용매를 제거하는 과정에서 음이온성 약물과 양이온성 지질의 복합체 혹은 음이온성 약물과 양이온성 지질, 양친성 블록의 복합체가 용기로 사용되는 둥근 바닥 플라스크의 표면에 흡착되어, 수화시키는 과정에서 충분히 수용액 층으로 용해되지 않음으로써, 필터 통과 전의 수득률 저하를 가져오는 결과를 나타내었다. 이러한 문제를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 양친성 블록 공중합체의 일부를, 음이온성 약물과 양이온성 지질의 혼합물의 용매를 제거하기 이전에 음이온성 약물과 양이온성 지질의 혼합물이 접촉하는 용기의 내벽에 coating함으로써, 음이온성 약물과 양이온성 지질의 복합체가 용기에 흡착되는 정도를 줄이고자 하였고, 그 결과 필터 통과 전의 수득률 저하를 감소시키는 효과를 확인하였다 (상기 단계 (1-i'), (2-i'), 및 (3-i')에 해당).
또 다른 예에서 제공되는 음이온성 약물과 양이온성 지질의 복합체, 양친성 블록 공중합체를 주성분으로 하는 나노 입자를 만드는 방법의 일례는, 음이온성 약물이 포함된 수용액을 양이온성 지질이 포함된 유기용매에 더하면서 sonicator나 vortex mixer, 교반기 등의 통상의 방법을 이용하여 유상액을 만들고, 음이온성 약물과 양이온성 지질이 포함된 유상액의 용매를 제거함으로써 음이온성 약물과 양이온성 지질의 복합체로 이루어진 박막을 만들고, 그 위에 유기용매에 녹인 양친성 블록 공중합체를 더하고 유기용매를 제거하여 양친성 블록 공중합체의 박막을 만든 후, 수성 용매를 더하여 수화시키는 과정을 포함할 수 있다 (단계 (1-i) 내지 (1-iv)).
다른 예에서 제공되는 음이온성 약물과 양이온성 지질의 복합체, 양친성 블록 공중합체를 주성분으로 하는 나노 입자를 만드는 방법은, 음이온성 약물이 포함된 수용액을 양이온성 지질이 포함된 유기용매에 더하면서 sonicator나 vortex mixer, 교반기 등의 통상의 방법을 이용하여 유상액을 만들고, 음이온성 약물과 양이온성 지질이 포함된 유상액의 용매를 제거함으로써 음이온성 약물과 양이온성 지질로 이루어진 박막을 만들고, 양친성 블록 공중합체가 포함된 수성 용매를 더하여 수화시키는 과정을 포함할 수 있다(단계 (2-i) 내지 (2-iii)).
다른 예에서 제공되는 음이온성 약물과 양이온성 지질의 복합체, 양친성 블록 공중합체를 주성분으로 하는 나노 입자를 만드는 방법은, 음이온성 약물이 포함된 수용액을 양이온성 지질과 양친성 블록 공중합체가 포함된 유기용매에 더하면서 sonicator나 vortex mixer, 교반기 등의 통상적인 방법을 이용하여 유상액을 만들고, 음이온성 약물과 양이온성 지질, 양친성 블록 공중합체가 포함된 유상액의 용매를 제거함으로써 음이온성 약물과 양이온성 지질, 양친성 블록 공중합체의 복합체로 이루어진 박막을 만들고, 수성 용매를 더하여 수화시키는 과정을 포함할 수 있다(단계 (3-i) 내지 (3-iii)).
또한, 상기의 음이온성 약물과 양이온성 지질의 복합체와 양친성 블록 공중합체를 혼합하여 나노 입자를 만드는 경우에는, 음이온성 약물과 양이온성 지질의 혼합물의 용매를 제거하여 박막을 만들기 이전에, 양친성 블록 공중합체의 일부를 용기의 내벽에 coating하는 단계를 추가로 포함함으로써, 음이온성 약물과 양이온성 지질의 복합체가 용기에 흡착되는 정도를 줄일 수 있다 (상기 단계 (1-i'), (2-i'), 및 (3-i')에 해당).
또 다른 예에서, 음이온성 약물과 양이온성 지질의 복합체와 양친성 블록 공중합체를 혼합하는 방법은, sonicator나 vortex mixer, 교반기 등의 통상적인 혼합 수단을 이용하여 만들어진, 음이온성 약물과 양이온성 지질이 포함된 유상액을, 양친성 블록 공중합체가 용해되어 있는 수성 용매에 더하면서 sonicator나 vortex mixer, 교반기 등의 통상적인 혼합 수단을 이용하여 복합 유상액 (double emulsion)을 만든 후, 분별 증류 등의 통상적인 방법을 통하여 유기용매만을 제거하고 수성 용매만을 남기는 과정을 포함할 수 있다 (단계 (4-i) 내지 (4-iii)).
또 다른 예에서, 음이온성 약물과 양이온성 지질의 복합체와 양친성 블록 공중합체를 혼합하는 방법은, sonicator나 vortex mixer, 교반기 등의 통상적인 혼합 수단을 이용하여 만들어진, 음이온성 약물과 양이온성 지질과 양친성 블록 공중합체가 포함된 유상액을, 수성 용매에 더하면서 sonicator나 vortex mixer, 교반기 등의 통상적인 혼합 수단을 이용하여 복합 유상액 (double emulsion)을 만든 후, 분별 증류 등의 통상적인 방법을 통하여 유기용매만을 제거하고 수성 용매만을 남기는 과정을 포함할 수 있다(단계 (5-i) 내지 (5-iii)).
이러한 방법은 박막을 수화시키는 과정을 생략함으로써, 그 과정에서 수득률의 감소를 막을 수 있으며, 제조 효율의 재현성을 높일 수 있다는 추가적인 장점을 가진다. 이는, 수화 과정에서 여전히 박막에 흡착된 복합체의 존재가 수득률 감소의 원인 중 하나이며, 이렇게 남아있는 복합체의 양이 제조 batch에 따라 달라지기 때문이다.
한편, 상기 단계의 (4-i)~(4-iii) 공정, 또는 (5-i)~(5-iii) 공정을 이용하는 제조 방법은 박막 수화 과정을 생략함으로써 또 다른 장점을 가지게 된다. 음이온성 약물과 양이온성 지질로 이루어진 박막을 수화시키기 위해서는 일정량 이상의 양친성 블록 공중합체가 필수적이기 때문에, 박막 수화 과정을 생략한 상기 단계의 (4-i)~(4-iii) 공정, 또는 (5-i)~(5-iii) 공정은, 박막 수화 과정을 거쳐야 하는 제조 방법에 비하여, 보다 적은 양의 양친성 블록 공중합체를 포함하는 나노 입자의 제조를 가능하게 한다.
본 발명자들은 박막 수화 과정을 생략한 제조 방법이, 보다 적은 양의 양친성 블록 공중합체를 이용한 경우에도, 음이온성 약물, 양이온성 지질, 양친성 블록 공중합체로 이루어진 나노 입자를 형성할 수 있는지 확인하였다. 그 결과, 박막 수화 과정을 생략한 제조 방법이, 박막 수화 과정을 거치는 제조 방법과 비교하여 약 1/1000의 양친성 블록 공중합체 양을 이용한 경우에도 원하는 크기의 나노 입자 형성이 가능하다는 것을 확인하였다.
본 발명의 제조 방법에 의하여 제조된 음이온성 약물 전달용 조성물은,
유효성분으로서 음이온성 약물;
양이온성 지질;
양친성 블록 공중합체을 포함하는 미셀 구조체를 포함하며,
상기 음이온성 약물은 상기 양이온성 지질과 복합체를 형성하고, 이와 같이 형성된 복합체가 양친성 블록 공중합체에 의하여 형성된 미셀 구조 내부에 봉입되는 것을 특징으로 한다.
또한 상기 음이온성 약물 전달용 조성물은 평균 입경 10 내지 400 m, 구체적으로는 50 내지 300nm의 균일한 크기를 갖는 나노입자 형태인 것을 특징으로 하여, 멸균 필터를 통한 여과 등의 후속 단계 수행 이후에도 수득량이 유지될 수 있다.
일실시예에서, 상기 음이온성 약물과 양이온성 지질은 정전기적 상호작용에 의해 음이온성 약물과 지질과의 복합체를 이룬 상태에서, 양친성 블록 고분자의 미셀 구조 내부에 봉입된다. 본 발명의 일실시예에 따른 음이온성 약물 및 양이온성 지질 복합체가 봉입된 고분자 미셀 전달체의 대략적인 구조를 도 1에 나타내었다. 도 1을 참조하면, 음이온성 약물은 양이온성 지질과 정전기적 상호작용을 통해 결합하여, 음이온성 약물과 양이온성 지질 복합체를 형성한다. 형성된 음이온성 약물과 양이온성 지질 복합체는, 양친성 블록 공중합체에 의해 형성되는 미셀 구조 내에 봉입되도록 고안되어 있다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 양친성 블록 공중합체에 의해 형성되는 미셀 구조는 수성 환경에서 양친성 블록 공중합체의 친수성 부분이 미셀의 외벽을 형성하고 양친성 블록 공중합체의 소수성 부분과 상기 양친성 블록 공중합체가 내벽을 형성하고, 그 내부에 음이온성 약물과 양이온성 지질 복합체가 봉입된 구조이다.
상기 음이온성 약물과 양이온성 지질 복합체는 본 발명 고분자의 미셀 구조 내에 봉입된 상태에서, 혈중 또는 체액 내에서 안정성이 향상된다. 일실시예에서, 상기 미셀의 입자 크기는, 10 내지 400 m이며, 더욱 구체적으로는 50 내지 300nm인 것이 좋다. 상기 입자 크기는, 미셀 구조의 안정성 및 구성성분들의 함량을 고려한 것이며, 체내에서 음이온성 약물의 흡수도 및 약제학적 조성물로서 멸균의 편의성을 고려하여 최적의 범위를 선정한 것이다.
본 발명의 일실시예에 따른 음이온성 약물은 수용액 중에서 분자 내에 음전하를 띄는 약리학적 활성을 가진 모든 물질을 포함하는 개념이다. 일실시예에서, 상기 음이온성은, 카르복시기, 포스페이트기 및 설페이트기 또는 pH 5 이상에서 음전하를 띄는 작용기들로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 작용기로부터 부여될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서 음이온성 약물은 펩타이드, 단백질 또는 핵산으로 이루어진 약물일 수 있다.
또 다른 일실시예에서, 상기 핵산 물질은, 디옥시리보 핵산, 리보 핵산, 또는 백본(backbone)이나 당, 염기가 화학적으로 변형되거나 말단이 수식된 폴리뉴클레오타이드 유도체 등의 핵산 약물일 수 있으며, 보다 구체적으로는 RNA, DNA, siRNA(short interfering RNA), 압타머(aptamer), 안티센스 ODN(antisense oligodeoxynucleotide), 안티센스 RNA(antisense RNA), 리보자임(ribozyme) 및 디엔에이자임(DNAzyme) 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산일 수 있다. 또한, 상기 핵산은 혈중 안정성을 증가시키거나 면역 반응을 약화시키는 등의 목적을 위해 백본(backbone), 당 또는 염기가 화학적으로 변형되거나 말단이 수식된 핵산일 수 있다. 구체적으로, 핵산의 포스포다이에스테르(phosphodiester) 결합의 일부를 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트 (boranophosphate) 결합으로 대체하거나, 일부 리보오스 염기의 2'-OH 위치에 메틸기, 메톡시에틸기, 불소 등의 다양한 작용기가 도입되어 수식된 뉴클레오티드를 1종 이상 포함할 수 있다.
일실시예에서 상기 양이온성 지질은, 음이온성 약물과 정전기적인 상호작용에 의해 결합되어 복합체를 형성하고, 상기 복합체는 양친성 블록 공중합체의 미셀 구조 내부에 봉입되어 나노 입자를 형성하도록 고안되어 있다. 따라서, 상기 양이온성 지질은 음이온성 약물과 정전기적 상호작용에 의해 복합체를 형성할 수 있는 모든 지질 종류일 수 있으며, 아민 기를 포함하여 pH 10 이하에서 양전하를 나타낼 수 있는 작용기를 하나 이상 가지는 지질 종류일 수 있다.
예컨대, 분자 당 수용액 상에서 양이온을 나타낼 수 있는 작용기가 하나인 N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드 (DOTAP), N,N-디메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민 (DODMA), N,N,N-트리메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민 (DOTMA), 3베타-[N-(N',N',N'-트리메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤 (TC-콜레스테롤), 3베타[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤 (DC-콜레스테롤), 3베타[N-(N'-모노메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤 (MC-콜레스테롤), 3베타[N-(아미노에탄)카바모일]콜레스테롤 (AC-콜레스테롤), 콜레스테릴옥시프로판-1-아민 (COPA), N-(N'-아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤 (AC-토코페롤) 및 N-(N'-메틸아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤 (MC-토코페롤)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 것일 수 있다.
또한 상기 양이온성 지질은 분자 당 수용액 상에서 양이온을 나타낼 수 있는 작용기가 여러 개인 지질 종류일 수 있다. 구체적으로, N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄클로라이드 (DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄브로마이드 (DDAB), 1,2-디아실-3-트리메틸암모늄-프로판 (TAP), 1,2-디아실-3-디메틸암모늄-프로판 (DAP) 으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것일 수 있다.
또한, 상기 양이온성 지질은 1 내지 12 개의 올리고에틸렌아민 (oligoethyleneamine)의 아민 작용기에 탄소수 12 내지 26 개의 포화 또는 불포화 탄화수소를 결합시킨 양이온성 지질을 포함할 수 있으며, 상기 올리고에틸렌아민은 다음의 화학식 1로 표현될 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112013029077766-pat00001
상기 식에서,
n과 m은 각각 독립적으로 0 내지 12이되, 2 ≤ n + m ≤ 12이며, a와 b는 각각 1 내지 독립적으로 6이며, R1과 R2는 각각 독립적으로 탄소수 11 내지 25개의 포화 및 불포화 탄화수소로 이루어진 군에서 선택된 것이다.
상기 식의 올리고에틸렌아민의 정의 중, n과 m은 각각 독립적으로 1 내지 9이며, 2 ≤ n+m ≤ 10일 수 있으며, 또한 상기 a와 b는 각각 독립적으로 2 내지 4일 수 있다. 예컨대, 상기 올리고에틸렌아민 (oligoethyleneamine)은 디에틸렌트리아민 (diethylenetriamine), 트리에틸렌테트라아민 (triethylenetetramine), 테트라에틸렌펜타아민 (tetraethylenepentamine), 펜타에틸렌헥사아민 (pentaethylenehexamine), 헥사에틸렌헵타아민 (hexaethyleneheptamine), 헵타에틸렌옥타아민 (heptaethyleneoctamine), 옥타에틸렌노나아민 (octaethylenenonamine), 노나에틸렌데카아민 (nonaethylenedecamine), 데카에틸렌운데카아민 (decaethyleneundecamine), 운데카에틸렌도데카아민 (undecaethylenedodecamine), 도데카에틸렌트리데카아민 (dodecaethylenetridecamine) 및 트리데카에틸렌테트라데카아민 (tridecaethylenetetradecamine)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 아민 작용기에 결합되는 포화 또는 불포화 탄화수소는 탄소수 12 내지 26 개의 라우로일 (lauroyl), 미리스토일 (myristoyl), 팔미토일 (palmitoyl), 스테아로일 (stearoyl), 아라키도일 (arachidoyl), 베헨노일 (behenoyl), 리그노세로일 (lignoceroyl), 세로토일 (cerotoyl), 미리스트올레오일 (myristoleoyl), 팔미트올레오일 (palmitoleoyl), 사피에노일 (Sapienoyl), 올레오일 (oleoyl), 리놀레오일 (linoleoyl), 아라키도노일 (arachidonoyl), 에이코사펜타에노일 (eicosapentaenoyl), 에루코일 (erucoyl), 도코사헥사에노일 (docosahexaenoyl) 기의 탄화 수소 및 불포화 탄화 수소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다.
일실시예에서, 상기 양친성 블록 공중합체는, 친수성 A 블록 및 소수성 B 블록을 포함하는 A-B 형 블록 공중합체일 수 있다. 상기 A-B 형 블록 공중합체는, 수용액 상에서, 소수성 B 블록이 코어(내벽)를 형성하고 친수성 A 블록이 쉘(외벽)을 형성하는 코어-쉘 타입의 고분자 미셀을 형성한다.
일실시예에서, 상기 친수성 A 블록은 폴리알킬렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드 및 그 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 보다 구체적으로는, 친수성 A 블록은 모노메톡시폴리에틸렌클리콜, 모노아세톡시폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌과 프로필렌글리콜의 공중합체 및 폴리비닐피롤리돈으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 또 다른 일실시예에서, 상기 친수성 A 블록은 수평균분자량이 200 내지 50,000달톤, 보다 구체적으로는 1,000 내지 20,000달톤, 보다 더 구체적으로는 1,000 내지 5,000달톤인 것일 수 있다.
상기 소수성 B 블록은, 생체적합성 생분해성 고분자로서, 일실시예에서, 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리아미노산, 폴리오르소에스테르 및 폴리포스파진으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 소수성 B 블록은 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 폴리디옥산-2-온, 폴리락타이드와 글리콜라이드의 공중합체, 폴리락타이드와 폴리디옥산-2-온의 공중합체, 폴리락타이드와 폴리카프로락톤의 공중합체 및 폴리글리콜라이드와 폴리카프로락톤의 공중합체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 또 다른 일실시예에서, 상기 소수성 B 블록은 수평균분자량이 50 내지 50,000달톤, 보다 구체적으로는 200 내지 20,000달톤, 보다 더 구체적으로는 1,000 내지 5,000달톤인 것일 수 있다. 또한, 소수성 B 블록의 소수성을 증가시켜 미셀의 안정성을 향상시키기 위하여 토코페롤, 콜레스테롤, 또는 탄소수 10 내지 30개의 포화 및 불포화 지방산을 소수성 B 블록 말단에 화학적으로 결합시킬 수 있다.
또 다른 일실시예에서, 상기 양친성 블록 공중합체에 있어서, 친수성 블록(A)과 소수성 블록(B)의 조성비는, 공중합체 중량을 기준으로, 친수성 블록(A)이 40 내지 70중량%, 구체적으로는 50내지 60중량% 범위일 수 있다. 친수성 블록(A)의 비율이 40중량% 미만이면 고분자의 물에 대한 용해도가 낮아서 미셀을 형성하기 어렵기 때문에, 공중합체가 미셀을 형성하기에 충분한 물에 대한 용해도를 갖기 위하여 친수성 블록(A)의 비율이 40중량% 이상인 것이 좋은 한편, 70중량%를 초과하면 친수성이 너무 높아서 고분자 미셀의 안정성이 낮아서 음이온성 약물/양이온성 지질 복합체의 가용화 조성물로 사용하기 어려우므로, 미셀 안정성을 고려하여 친수성 블록(A)의 비율이 70중량% 이하인 것이 좋다.
본 발명에 따른 음이온성 약물 함유 약제학적 조성물에 대한 제조 방법은 선행 발명의 제조 방법에 비하여 약물의 함량을 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라 제조 재현성을 높일 수 있다는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 음이온성 약물 전달용 조성물의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 제조방법에 의해 제조된 1,6-디올레오일 트리에틸렌테트라마이드에 대한 NMR 측정결과이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 제조방법에 의해 제조된 1,4-디미리스톨레오일 디에틸렌트리아마이드에 대한 NMR 측정결과이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 제조방법에 의해 제조된 1,8-디리놀레오일 테트라에틸렌펜타아마이드에 대한 NMR 측정결과이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 제조방법에 의해 제조된 mPEG-PLA (5k-4k)-올리에이트에 대한 NMR 측정결과이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 제조방법에 의해 제조된 mPEG-PLA (5k-4k)-리놀레이트에 대한 NMR 측정결과이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[ 제조예 1] AC -콜레스테롤 (3베타[N-( 아미노에탄 ) 카바모일 ] 콜레스테롤) 의 합성
AC-콜레스테롤의 합성을 위하여 콜레스테릴 클로로포메이트 (cholesteryl chloroformate, Sigma-Aldrich)와 에틸렌디아민 (ethylenediamine, Sigma-Aldrich)을 다음과 같이 반응시켰다.
콜레스테릴 클로로포메이트 1g (2.23 mmol)을 20 ml의 클로로포름에 녹이고, 별개의 반응용기에 20배 당량의 에틸렌디아민을 30 ml의 클로로포름으로 희석하고, 4℃로 유지하였다. 콜레스테릴 클로로포메이트 용액을 에틸렌디아민이 있는 반응용기에 천천히 넣어준 뒤, 상온에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응종료 후 증류농축장치(rotary evaporator, Buchi사, R-2055)를 이용하여 용매를 제거하고, 다시 소량의 클로로포름에 녹인 뒤, NaCl 포화용액과 NaCO3으로 추출하여 클로로포름층을 회수하였다.
이후 증류 농축 장치 (rotary evaporator)로 용매를 제거하고, 클로로포름에 녹인 뒤, 실리카겔 크로마토그래피 (silica-gel chromatography)를 실시하여 분리하였다. 클로로포름:메탄올=9:1(v/v)에서 용출된 분획에 염산 용액을 콜레스테릴 클로로포메이트의 50배 당량으로 첨가하고, 단일상이 형성될 때까지 메탄올을 조금씩 첨가하여 AC-콜레스테롤 염산염을 형성하였다.
증류농축장치(rotary evaporator)로 가온, 감압 증류하여 용매를 완전히 제거하였다. AC-콜레스테롤 염산염을 60℃의 메탄올에 녹인 후 4℃로 냉각하여 재결정을 얻었다. 수율은 53%에 달하였다. 1H-NMR로 AC-콜레스테롤의 합성 여부 및 순도를 확인하였다. 순도는 99% 이상이었다.
[ 제조예 2-4] 1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라마이드 (1,6- dioleoyl triethylenetetramide)의 합성
트리에틸렌테트라민 (triethylenetetramine)과 올레오일 클로라이드 (oleoyl chloride)간의 친핵성 첨가반응(nucleophilic addition)에 의해 다음과 같이 합성하였다.
1.12 g (7.5 mmol)의 트리에틸렌테트라민을 25 mL의 디클로로메탄에 넣고 5℃ 얼음물 중탕에서 30분 동안 교반 용해시켰다. 별개의 반응 용기에서 20 mL의 디클로로메탄에 용해된 2.00 g (6.0 mmol)의 올레오일 클로라이드 용액을 상기 용액에 천천히 적하 시키면서 5℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응이 진행되면서 생성된 염화수소에 의한 미반응 트리에틸렌테트라민 염화염이 석출되었다. 반응종료 전 상층액을 취하여 에탄올:클로로포름 (2:1) 이동상에서 박막층 크로마토그래피법 (thin layer chromatography, TLC)로 반응여부를 확인하였다.
반응 확인 후 종이필터를 이용하여 석출물을 제거하였다. 이후 여과된 상층액을 증류농축장치(rotary evaporator)를 이용하여 용매를 제거하고 콜드 트랩 (cold trap)이 장착된 진공펌프로 건조시켰다. 여기에 35 mL의 디에틸 에테르 (diethyl ether)를 넣어 용해 시킨 후 분액 깔데기에서 10 mL의 0.5 M NaOH 용액으로 2회 추출하였다. 이후 상부의 유기용매 층을 증류 농축 장치에서 가온, 감압 증류하여 용매를 완전히 제거한 후 박막층 크로마토그래피법을 이용 정제를 확인하였다. 최종적으로 얻어진 생성물의 구조 및 올레오일기의 도입 정도를 수소핵자기공명 분광기 (1H NMR spectrometer)를 이용하여 확인하였다. 얻어진 결과를 도 2에 나타내었다. 수율은 89.1%였고, 2.1 당량의 올레오일기가 트리에틸렌테트라민에 도입되었다[제조예 2]. 하기 화학식 I에서 n은 2이며 R1과 R2는 각각 탄소수 18의 불포화 (C9) 탄화수소이다.
[화학식 I]
Figure 112013029077766-pat00002
이와 유사한 방법으로 1,4-디미리스톨레오일 디에틸렌트리아마이드 (1,5-dimyristoleoyl diethylenetriamide) [제조예 3]와 1,8-디리놀레오일 테트라에틸렌펜타아마이드 (1,7-delinoleoyl tetraethylenepentaamide) [제조예 4]를 합성하였다. 이들 화합물의 1H-NMR 결과를 각각 도 3 및 도 4에 나타내었다. 각각 수율은 40.5%와 28.0% 였고, 지질 도입률은 2.24 당량과 1.82 당량이었다.
[ 제조예 5] 모노메톡시폴리에틸렌글리콜 - 폴리락타이드 ( mPEG - PLA ) 블록 공중합체 (A-B)의 중합 (분자량 5,000-4,000 달톤 )
10 g의 모노메톡시폴리에틸렌글리콜 (monomethoxy poly(ethylene glycol), 분자량 5,000 달톤)을 100 ml 2-구 환저플라스크에 넣고, 감압 (1 mmHg) 하에서 5 시간 동안 120℃에서 진공 건조하였다. 반응 플라스크에 건조 질소를 채우고, 50% 농도로 톨루엔에 용해되어 있는 스태노스 옥토에이트 (Sn(Oct)2) 반응 촉매를 주사기로 DL-락타이드 (DL-lactide)의 0.3 wt% (30 mg) 주입하였다. 반응 혼합물을 30 분간 교반하고, 120℃에서 1 시간 동안 1 mmHg로 감압하여 톨루엔을 제거하였다. 8.46 g의 정제된 락타이드(Purac)를 첨가하고, 혼합물을 6 시간 동안 130℃로 가열하였다. 상기 과정을 통해 얻어진 mPEG-PLA의 수평균분자량은 5,000-4,000 달톤이며, 1H-NMR에 의해 A-B 타입인 것으로 확인되었다.
[ 제조예 6] mPEG - PLA -토코페롤의 중합 (분자량 5,000-4,000-530 달톤 )
제조예 5에서 합성한 mPEG-PLA 5 g을 100 ml 2-구 환저플라스크에 넣고, 감압하에서 3 시간 동안 120℃에서 진공 건조하였다. 여기에 3 mL의 톨루엔에 용해되어있는 35.5 mg (645 μmol)의 토코페롤 석시닐클로라아드 (tocopherol acid succinylchloride)을 투입하여 100℃에서 8시간 동안 감압조건에서 반응시켰다. 얻어진 고분자를 디클로로메탄 (dichloromethane)에 녹이고 헵탄에 침전시켜 정제를 실시하였다. 정제된 고분자는 진공 건조하여, 백색의 가루입자 형태를 얻었다. 수율은 94.2%였고, 1H-NMR 분석에서 순도는 97.0% 이상이고 토코페롤 도입율은 99.9%였다.
[ 제조예 7-11] mPEG - PLA - 올리에이트와 mPEG - PLA - 리놀레이트의 중합
제조예 6과 동일한 방법으로, 아래의 표 1와 같이 mPEG-PLA-올리에이트와 mPEG-PLA-리놀레이트를 중합하였다.
고분자종류 분자량(달톤) 수율(%) 순도(%) 리피드도입률
제조예 7 mPEG-PLA-토코페롤 2,000-1,700-530 92.7 97 99.9
제조예 8 mPEG-PLA-올리에이트 5,000-4,000-265 64.0 99.7 99.9
제조예 9 mPEG-PLA-올리에이트 2,000-1,700-265 62.6 98.3 95.5
제조예 10 mPEG-PLA-리놀레이트 5,000-4,000-263 76.6 99.9 90.1
제조예 11 mPEG-PLA-리놀레이트 2,000-1,700-263 78.3 98.4 97.1
[ 비교예 1] siRNA / AC -콜레스테롤/ mPEG - PLA -토코페롤/ DOPE 함유 조성물의 제조 ( 수혼화 용매 이용 제법)
제조예 1에서 제조된 AC-콜레스테롤 345.0 ug(microgram) (N/P 비율 9)을 클로로포름 17.3 ul(microliter)에 녹이고 siRNA 25 ug을 증류수 20 ul에 녹였다. DOPE 340.9 ug를 클로로포름 17.0 ul에 녹이고, mPEG-PLA-토코페롤 15 mg 역시 클로로포름 0.5 ml에 녹였다. AC-콜레스테롤, siRNA, DOPE, mPEG-PLA-토코페롤을 혼합하고, 수용액: 클로로포름: 에탄올의 최종 비율을 1:1:2로 맞추었다.
이 때 사용된 siRNA는 anti-luciferase siRNA로서 21 mer double strand (2 base overhang)의 구조를 가지며 (Mol. Ther. 16: 1995-2001 (2008)), 아래의 염기 서열을 갖는다 (이하 실시예 1-21에서도 동일한 siRNA을 사용함).
센스 가닥: cuuAcGcuGAGuAcuucGAT*T (서열번호 1);
안티센스 가닥: UCGAAGUACUCAGCGUAAGT*T (서열번호 2).
(소문자는 2'-O- methyl-nucleotides를 의미하며,
'*'는 phosphorothioate linkages를 나타냄)
혼합물을 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. 플라스크에 증류수 600 ul 를 가하고, 부드럽게 흔들어 녹임으로써 siRNA/AC-콜레스테롤/mPEG-PLA-토코페롤(5k-4k)/DOPE 함유 조성물(고분자 미셀)을 제조하였다(표 2 참조).
조성물 조성비 siRNA lipid 고분자
비교예 1 siRNA/AC-콜레스테롤/mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k)/DOPE 5-9-3 25ug 345 ug 15mg
[ 실시예 1] siRNA / AC -콜레스테롤/ mPEG - PLA -토코페롤/ DOPE 함유 조성물의 제조 (유상액 제조 후 용매 제거)
제조예 1에서 제조된 AC-콜레스테롤 345.0 ug (N/P 비율 9)을 클로로포름 17.3 ul에 녹이고 siRNA 25 ug을 증류수 20 ul에 녹였다. DOPE 340.9 ug을 클로로포름 17.0 ul에 녹이고 mPEG-PLA-토코페롤 15 mg 역시 클로로포름 0.5 ml에 녹였다. AC-콜레스테롤, DOPE, 및 mPEG-PLA-토코페롤이 들어 있는 클로로포름 용액에 siRNA 수용액을 한 방울씩 가하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 유상액을 제조하였다. 제조된 유상액을 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. 플라스크에 증류수 600 ul를 가하고, 부드럽게 흔들어 녹임으로써 siRNA/AC-콜레스테롤/mPEG-PLA-토코페롤(5k-4k)/DOPE 함유 조성물(고분자 미셀)을 제조하였다.
[ 실시예 2 및 3] siRNA / AC -콜레스테롤/ mPEG - PLA -토코페롤/ DOPE 함유 조성물의 제조 ( 유상액 제조 후 용매 제거)
제조예 1에서 제조된 AC-콜레스테롤 345.0 ug (N/P 비율 9)을 클로로포름 17.3 ul에 녹이고 siRNA 25 ug을 증류수 20 ul에 녹였다. DOPE 340.9 ug을 클로로포름 17.0 ul에 녹이고 mPEG-PLA-토코페롤 15 mg 역시 클로로포름 0.5 ml에 녹였다. 얻어진 15 mg의 mPEG-PLA-토코페롤을 클로로포름에 녹인 용액 중 mPEG-PLA-토코페롤 1.5 mg (10중량%)에 해당하는 50 ul에 클로로포름 600 ul을 더한 후, 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. AC-콜레스테롤 용액과 DOPE 용액, mPEG-PLA-토코페롤 13.5 mg에 해당하는 용액을 섞어주고, siRNA 수용액을 한 방울씩 가하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 유상액을 제조하였다. 유상액을 mPEG-PLA-토코페롤 0.3 mg이 도포된 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. 플라스크에 증류수 600 ul를 가하고, 부드럽게 흔들어 녹임으로써 siRNA/AC-콜레스테롤/mPEG-PLA-토코페롤(5k-4k)/DOPE 함유 조성물(고분자 미셀)을 제조하였다 (실시예 2).
위와 유사한 방법으로 실시예 3을 제조하였다. 실시예 3은 mPEG-PLA-토코페롤 중 2중량%인 0.3 mg을 미리 도포하였고, mPEG-PLA-토코페롤 14.7 mg을 AC-콜레스테롤 및 DOPE과 혼합하는 것을 제외하고 실시예 2와 동일하게 수행하였다.
실시예 1 내지 3에서 얻어진 조성물을 아래의 표 3에 정리하였다:
조성물 조성비 siRNA lipid 고분자
실시예 1-3 siRNA/AC-콜레스테롤/mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k)/DOPE 5-9-3 25ug 345 ug 15mg
[ 실험예 1] siRNA / AC -콜레스테롤/ mPEG - PLA -토코페롤(5k-4k)/ DOPE 함유 조성물의 siRNA 함량 비교
각 제조법에 따라 나노 입자의 siRNA 함량이 어떻게 변화하는지 확인하기 위하여 비교예 1의 siRNA 함량과 실시예 1 내지 3의 siRNA 함량을 측정하였다.
변형된 Bligh & Dyer 추출법을 사용하여 제조된 siRNA/양이온성 지질 함유 양친성 블록 공중합체 미셀에서 siRNA를 정량하였다. 비교예 1 및 실시예 1 내지 3에서 제조된 고분자 미셀을 50mM 소듐 포스페이트(sodium phosphate), 75mM NaCl (pH 7.5) 용액에 녹이고, Bligh & Dyer 단일상을 만든 뒤, 100mM 소듐 포스페이트, 150mM NaCl(pH 7.5) 및 클로로포름으로 추출하여 수용액 층의 siRNA를 리보그린(Ribogreen) 시약 (Invitrogen)으로 정량하였다.
멸균 필터로 Millipore 0.45 um (micrometer) PVDF fliter를 사용하였다.
얻어진 결과를 아래의 표 4에 나타내었다:
제법 고분자종류 조성비 필터 전 함량 필터 후 함량
비교예 1 수혼화 용매 이용 siRNA/AC-콜레스테롤/mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k)/DOPE 5-9-3 99.8% 42.4%
실시예 1 유상액 제조 후 용매 제거 siRNA/AC-콜레스테롤/mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k)/DOPE 5-9-3 38.3% 34.7%
실시예 2 siRNA/AC-콜레스테롤/mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k)/DOPE 5-9-3 85.8% 63.0%
실시예 3 siRNA/AC-콜레스테롤/mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k)/DOPE 5-9-3 63.8% 49.9%
표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 수혼화 용매를 이용하는 기존 방식에 따른 고분자 미셀의 경우보다 본 발명의 유상액 제조 후 용매를 제거하는 방식에 따른 고분자 미셀의 경우가 필터 통과 후 수득량 손실이 현저하게 감소함을 확인할 수 있다. 또한, 용기 내부를 코팅하는 전처리 과정을 거치는 것이 수득률 및 수득량 손실 감소에 현저하게 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
[ 비교예 2] siRNA /1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라아마이드( dio -TETA)/mPEG-PLA-올리에이트(5k-4k)(조성비 5-15-6) 함유 조성물의 제조 ( 수혼화 용매 이용)
1,6 dio-TETA 3.43 mg을 클로로포름 171.5 ul에 녹이고 siRNA 100 ug을 증류수 80 ul에 녹였다. mPEG-PLA-올리에이트 (5k-4k) 120 mg 역시 클로로포름 400 ul에 녹였다. 1,6 dio-TETA, siRNA, mPEG-PLA-올리에이트 (5k-4k)를 혼합하고, 수용액: 클로로포름: 에탄올의 비율을 1:1:2로 맞추었다(200 ul:200 ul: 400 ul). 혼합물에 증류수 200 ul와 클로로포름 200 ul을 가하여 수층과 유기층 사이의 층분리를 유도하고, 유기층을 분리하여 1-구 둥근 플라스크에 넣었다. 1-구 둥근 플라스크를 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. 플라스크에 증류수 2.4 ml를 가하고, 부드럽게 흔들어 녹임으로써 siRNA/1,6-dioTETA/mPEG-PLA-올리에이트(5k-4k) 함유 조성물을 제조하였다(표 5).
조성물 조성비 siRNA lipid 고분자
비교예 2 siRNA/1,6-dioTETA/mPEG-PLA-올리에이트 (5k-4k) 5-15-6 100ug 3.43 mg 120 mg
[ 실시예 4] siRNA /1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라아마이드( dio -TETA)/mPEG-PLA-올리에이트(5k-4k)(조성비 5-15-6) 함유 조성물의 제조 ( 유상액 제조 후 고분자 포함 수용액과 복합 유상액 )
1,6 dio-TETA 3.43 mg을 클로로포름 400 ul에 녹이고 siRNA 100 ug을 증류수 80 ul에 녹였다. mPEG-PLA-올리에이트 (5k-4k) 120 mg을 증류수 2 ml에 녹였다. 상기 1,6 dio-TETA를 클로로포름에 녹인 용액에 siRNA를 한 방울씩 가하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 유상액을 제조하였다. 유상액을 mPEG-PLA-올리에이트 수용액에 더하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 복합 유상액을 제조하였다. 제조한 복합 유상액을 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류함으로써 클로로포름을 선택적으로 제거하여 siRNA/1,6-디올레오일 트리에틸렌테트라아마이드(dio-TETA)/mPEG-PLA-올리에이트(5k-4k) 함유 조성물을 제조하였다.
[ 실시예 5] siRNA /1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라아마이드( dio -TETA)/mPEG-PLA-올리에이트(5k-4k)(조성비 5-15-6) 함유 조성물의 제조 ( 유상액 제조 후 수용액과 복합 유상액 )
1,6 dio-TETA 3.43 mg을 클로로포름 171.5 ul에 녹이고 siRNA 100 ug을 증류수 80 ul에 녹였다. mPEG-PLA-올리에이트 (5k-4k) 120 mg을 클로로포름 400 ul에 녹였다. 1,6 dio-TETA과 mPEG-PLA-올리에이트를 클로로포름에 녹인 용액 혼합물에 siRNA를 한 방울씩 가하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 유상액을 제조하였다. 유상액을 증류수 3 ml에 더하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 복합 유상액을 제조하였다. 제조한 복합 유상액을 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류함으로써 클로로포름을 선택적으로 제거하여 siRNA/1,6-디올레오일 트리에틸렌테트라아마이드(dio-TETA)/mPEG-PLA-올리에이트(5k-4k) 함유 조성물을 제조하였다(표 6).
조성물 조성비 siRNA lipid 고분자
실시예 4 & 5 siRNA/1,6-dioTETA/mPEG-PLA-올리에이트 (5k-4k) 5-15-6 100ug 3.43 mg 120 mg
[ 실험예 2] siRNA /1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라아마이드( dio -TETA)/mPEG-PLA-올리에이트(5k-4k) 함유 조성물의 siRNA 함량 비교
각 제조법에 따라 나노 입자의 siRNA 함량이 어떻게 변화하는지 확인하기 위하여 비교예 2의 siRNA 함량과 실시예 3, 4의 siRNA 함량을 측정하였다.
변형된 Bligh & Dyer 추출법을 사용하여 상기 비교예 2 및 실시예 4 및 5에서 제조된 siRNA/양이온성 지질 함유 양친성 블록 공중합체 미셀에서 siRNA를 정량하였다. 고분자 미셀을 50mM 소듐 포스페이트(sodium phosphate), 75mM NaCl (pH 7.5) 용액에 녹이고, Bligh & Dyer 단일상을 만든 뒤, 100mM 소듐 포스페이트, 150mM NaCl(pH 7.5) 및 클로로포름으로 추출하여 수용액 층의 siRNA를 리보그린(Ribogreen) 시약 (Invitrogen)으로 정량하였다.
멸균 필터로 Millipore 0.45 um PVDF fliter를 사용하였다.
얻어진 결과를 아래의 표 7에 나타내었다:
제법 고분자종류 조성비 필터 전 함량 필터 후 함량
비교예 2 수혼화 용매 이용 siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-올리에이트 (5k-4k) 5-15-6 94.2% 28.1%
실시예 4 유상액 제조 후 복합 유상액 siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-올리에이트 (5k-4k) 5-15-6 72.8% 70.1%
실시예 5 siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-올리에이트 (5k-4k) 5-15-6 80.9% 73.8%
표 7에서 알 수 있는 바와 같이, 수혼화 용매를 이용하는 기존 방식에 따른 고분자 미셀의 경우보다 본 발명의 유상액 제조 후 용매를 제거하는 방식에 따른 고분자 미셀의 경우가 필터 통과 후 수득량 손실이 현저하게 감소함을 확인할 수 있다.
[ 실시예 6 & 7] siRNA / dioTETA / mPEG - PLA -토코페롤 (2k-1.7k) 함유 조성물의 제조 (복합 유상액 제조)
dioTETA 5.48 mg을 클로로포름 274 ul에 녹이고 siRNA 200 ug을 증류수 160 ul에 녹였다. mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k) 240 mg을 클로로포름 1 ml에 녹였다. 상기 mPEG-PLA-토코페롤 240 mg을 클로로포름에 녹인 용액 중 mPEG-PLA-토코페롤 48 mg (20중량%)에 해당하는 양인 200 ul에 클로로포름 1.3 ml을 첨가하여 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다.
상기 dioTETA 용액과 mPEG-PLA-토코페롤 192 mg 용액을 섞어주고, siRNA 수용액을 한 방울씩 가하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 유상액을 제조하였다. 유상액을 증류수 8 ml에 가하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 복합 유상액을 제조하였다. 복합 유상액을 mPEG-PLA-토코페롤 4.8 mg이 도포된 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류함으로써 클로로포름을 제거하여 siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k) 함유 조성물을 제조하였다(실시예 6, 표 8).
위와 유사한 방법으로 실시예 7을 제조하였다. 실시예 7은 mPEG-PLA-토코페롤 용액 중 mPEG-PLA-토코페롤 중량대비 50중량%인 mPEG-PLA-토코페롤 120 mg에 해당하는 용액을 미리 도포하고, mPEG-PLA-토코페롤 120 mg에 해당하는 분량을 dioTETA와 혼합하여, siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k) 함유 조성물을 제조하였다(실시예 7, 표 8).
[ 실시예 8 & 9] siRNA / dioTETA / mPEG - PLA - 리놀레이트 (5k-4k) 함유 조성물의 제조 (복합 유상액 제조)
dioTETA 6.86 mg을 클로로포름 343 ul에 녹이고 siRNA 200 ug을 증류수 160 ul에 녹였다. mPEG-PLA-리놀레이트 (5k-4k) 120 mg을 클로로포름 1 ml에 녹였다. mPEG-PLA-리놀레이트 120 mg 용액 중 mPEG-PLA-리놀레이트 24 mg (20중량%)에 해당하는 양에 클로로포름 1.3 ml을 첨가하여 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. dioTETA 용액과 mPEG-PLA-토코페롤 96 mg 용액을 섞어주고, siRNA 수용액을 한 방울씩 가하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 유상액을 제조하였다. 유상액을 증류수 8 ml에 가하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 복합 유상액을 제조하였다. 복합 유상액을 mPEG-PLA-리놀레이트 24 mg이 도포된 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류함으로써 클로로포름을 제거하여 siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k) 함유 조성물을 제조하였다(실시예 8, 표 8).
위와 유사한 방법으로 실시예 9를 제조하였다. 실시예 9는 120 mg mPEG-PLA-토코페롤 용액 중 50%인 60 mg mPEG-PLA-토코페롤에 해당하는 분량을 미리 도포하였고, 나머지 60 mg mPEG-PLA-토코페롤에 해당하는 mPEG-PLA-토코페롤 용액을 dioTETA와 혼합하여, siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k) 함유 조성물을 제조하였다(실시예 9, 표 8).
조성물 조성비 siRNA lipid 고분자
실시예 6 & 7 siRNA/1,6-dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k) 5-12-6 200ug 5.48 mg 240 mg
실시예 8 & 9 siRNA/1,6-dioTETA/mPEG-PLA-리놀레이트 (5k-4k) 5-15-3 200ug 6.86 mg 120 mg
[ 실험예 3] siRNA /1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라아마이드( dio -TETA)/mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k) 혹은 mPEG - PLA - 리놀레이트 (5k-4k) 함유 조성물의 siRNA 함량 비교
고분자 전처리 과정 시 고분자의 양에 따라 나노 입자의 siRNA 함량이 어떻게 변화하는지 확인하기 위하여 실시예 6, 7, 8, 및 9의 siRNA 함량을 측정하였다.
변형된 Bligh & Dyer 추출법을 사용하여 실시예 6, 7, 8, 및 9에서 제조된 siRNA/양이온성 지질 함유 양친성 블록 공중합체 미셀에서 siRNA를 정량하였다. 고분자 미셀을 50mM 소듐 포스페이트(sodium phosphate), 75mM NaCl (pH 7.5) 용액에 녹이고, Bligh & Dyer 단일상을 만든 뒤, 100mM 소듐 포스페이트, 150mM NaCl(pH 7.5) 및 클로로포름으로 추출하여 수용액 층의 siRNA를 리보그린(Ribogreen) 시약 (Invitrogen)으로 정량하였다.
멸균 필터로 Millipore 0.45 um PVDF filter를 사용하였다.
얻어진 결과를 아래의 표 9에 나타내었다:
제법 (전처리 고분자 비율) 고분자종류 조성비 필터 전 함량 필터 후 함량
실시예 6 20% siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k) 5-12-6 75.6% 63.2%
실시예 7 50% siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k) 5-12-6 82.1% 77.8%
실시예 8 20% siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-리놀레이트 (5k-4k) 5-15-3 98.1% 96.2%
실시예 9 50% siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-리놀레이트 (5k-4k) 5-15-3 87.0% 85.9%
[ 실시예 10] siRNA /1,4- 디미리스톨레오일 디에틸렌트리아민 (dimyDETA)/mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 함유 조성물의 제조 ( 유상액 제조 후 용매 제거)
dimyDETA 830 ug을 클로로포름 41.5 ul에 녹이고 siRNA 25 ug을 증류수 20 ul에 녹였다. mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 15 mg 역시 클로로포름 130 ul에 녹였다. mPEG-PLA-토코페롤 15 mg 용액 중 mPEG-PLA-토코페롤 3 mg (20중량%)에 해당하는 양에 클로로포름 1 ml을 첨가하여 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. dimyDETA 용액과 mPEG-PLA-토코페롤 12 mg 용액을 섞어주고, siRNA 수용액을 한 방울씩 가하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 유상액을 제조하였다. 유상액을 mPEG-PLA-토코페롤 3 mg이 도포된 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. 플라스크에 증류수 600 ul를 가하고, 부드럽게 흔들어 녹임으로써 siRNA/dimyDETA/mPEG-PLA-토코페롤(5k-4k) 함유 조성물을 제조하였다.
[ 실시예 11] siRNA /1,4- 디미리스토레오일 디에틸렌트리아민 (dimyDETA)/mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 함유 조성물의 제조 (복합 유상액 제조 후 유기용매 선택 제거)
dimyDETA 830 ug을 클로로포름 41.5 ul에 녹이고 siRNA 25 ug을 증류수 20 ul에 녹였다. mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 15 mg 역시 클로로포름 130 ul에 녹였다. mPEG-PLA-토코페롤 15 mg 용액 중 mPEG-PLA-토코페롤 3 mg (20중량%)에 해당하는 양에 클로로포름 1 ml을 첨가하여 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. dimyDETA 용액과 mPEG-PLA-토코페롤 12 mg 용액을 섞어주고, siRNA 수용액을 한 방울씩 가하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 유상액을 제조하였다. 유상액을 증류수 1 ml에 한 방울씩 가하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 복합 유상액을 제조하였다. 복합 유상액을 mPEG-PLA-토코페롤 3 mg이 도포된 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류를 통하여 유기용매를 제거하여 siRNA/dimyDETA/mPEG-PLA-토코페롤(5k-4k) 함유 조성물을 제조하였다.
[ 실시예 12] siRNA /1,8- 디리놀레오일 테트라에틸렌펜타아민 (diliTEPA)/mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 함유 조성물의 제조 ( 유상액 제조 후 용매 제거)
diliTEPA 367.3 ug을 클로로포름 91.8 ul에 녹이고 siRNA 25 ug을 증류수 20 ul에 녹였다. mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 15 mg 역시 클로로포름 100 ul에 녹였다. mPEG-PLA-토코페롤 15 mg 용액 중 mPEG-PLA-토코페롤 3 mg (20중량%)에 해당하는 양에 클로로포름 1 ml을 첨가하여 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. diliTEPA 용액과 mPEG-PLA-토코페롤 12 mg 용액을 섞어주고, siRNA를 한 방울씩 가하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 유상액을 제조하였다. 유상액을 mPEG-PLA-토코페롤 3 mg이 도포된 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. 플라스크에 증류수 600 ul를 가하고, 부드럽게 흔들어 녹임으로써 siRNA/diliTEPA/mPEG-PLA-토코페롤(5k-4k) 함유 조성물을 제조하였다.
[ 실시예 13] siRNA /1,8- 디리놀레오일 테트라에틸렌펜타아민 (diliTEPA)/mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 함유 조성물의 제조 (복합 유상액 제조 후 유기용매 선택 제거)
diliTEPA 367.3 ug을 클로로포름 91.8 ul에 녹이고 siRNA 25 ug을 증류수 20 ul에 녹였다. mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 15 mg 역시 클로로포름 100 ul에 녹였다. mPEG-PLA-토코페롤 15 mg 용액 중 mPEG-PLA-토코페롤 3 mg (20중량%)에 해당하는 양에 클로로포름 1 ml을 첨가하여 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. diliTEPA 용액과 mPEG-PLA-토코페롤 12 mg 용액을 섞어주고, siRNA 수용액을 한 방울씩 가하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 유상액을 제조하였다. 상기 얻어진 유상액을 증류수 1 ml에 한 방울씩 가하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 복합 유상액을 제조하였다. 복합 유상액을 mPEG-PLA-토코페롤 3 mg이 도포된 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류를 통하여 유기용매를 제거하여 siRNA/diliTEPA/mPEG-PLA-토코페롤(5k-4k) 함유 조성물을 제조하였다.
[ 실험예 4] siRNA / mPEG - PLA -토코페롤(5k-4k)/ dimyDETA 혹은 diliTEPA 함유 조성물의 siRNA 함량 비교
제법에 따라 나노 입자의 siRNA 함량이 어떻게 변화하는지 확인하기 위하여 실시예 10, 11, 12, 및 13의 siRNA 함량을 측정하였다.
변형된 Bligh & Dyer 추출법을 사용하여 실시예 10, 11, 12, 및 13에서 제조된 siRNA/양이온성 지질 함유 양친성 블록 공중합체 미셀에서 siRNA를 정량하였다. 고분자 미셀을 50mM 소듐 포스페이트(sodium phosphate), 75mM NaCl (pH 7.5) 용액에 녹이고, Bligh & Dyer 단일상을 만든 뒤, 100mM 소듐 포스페이트, 150mM NaCl(pH 7.5) 및 클로로포름으로 추출하여 수용액 층의 siRNA를 리보그린(Ribogreen) 시약 (Invitrogen)으로 정량하였다.
멸균 필터로 Millipore 0.45 um PVDF filter를 사용하였다.
얻어진 결과를 아래의 표 10에 나타내었다:
제법 고분자종류 조성비 필터 후 함량
실시예 10 유상액 후
용매 제거		 siRNA/dimyDETA/mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 5-18-3 60.0%
실시예 11 복합 유상액
유기용매 제거		 siRNA/dimyDETA/mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 5-18-3 66.2%
실시예 12 유상액 후
용매 제거		 siRNA/diliTEPA/mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 5-18-3 12.8%
실시예 13 복합 유상액
유기용매 제거		 siRNA/diliTEPA/mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 5-18-3 64.1%
[ 실시예 14] siRNA /1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라아민 ( dioTETA )/ mPEG -PLA-토코페롤 (5k-4k) 함유 조성물의 제조 ( 유상액 제조 후 용매 제거)
dioTETA 6.98 mg을 클로로포름 350 ul에 녹이고 siRNA 200 ug을 증류수 160 ul에 녹였다. mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 40 mg을 클로로포름 133 ul에 녹였다. mPEG-PLA-토코페롤 40 mg 용액 중 mPEG-PLA-토코페롤 8 mg (20중량%)에 해당하는 양에 클로로포름 800 ul을 첨가하여 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. dioTETA 용액과 mPEG-PLA-토코페롤 32 mg 용액을 섞어주고 클로로포름 1 ml를 더한 후, siRNA 수용액을 한 방울씩 가하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 유상액을 제조하였다. 유상액을 mPEG-PLA-토코페롤 8 mg이 도포된 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류를 통하여 용매를 제거하였다. 플라스크에 증류수 2 ml를 가하고, 부드럽게 흔들어 녹임으로써 siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤(5k-4k) 함유 조성물을 제조하였다.
[ 실시예 15] siRNA /1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라아민 ( dioTETA )/ mPEG -PLA-토코페롤 (5k-4k) 함유 조성물의 제조 (복합 유상액 제조 후 유기용매 선택 제거)
dioTETA 6.98 mg을 클로로포름 350 ul에 녹이고 siRNA 200 ug을 증류수 160 ul에 녹였다. mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 40 mg을 증류수 4 ml에 녹였다. dioTETA 용액에 클로로포름 450 ul을 첨가한 후, siRNA 수용액을 한 방울씩 가하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 유상액을 제조하였다. 유상액을 상기 mPEG-PLA-토코페롤 40 mg을 증류수에 용해시킨 용액에 한 방울씩 가하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 복합 유상액을 제조하였다. 복합 유상액을 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류를 통하여 유기용매를 제거함으로써 siRNA/diliTEPA/mPEG-PLA-토코페롤(5k-4k) 함유 조성물을 제조하였다.
[ 실시예 16] siRNA /1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라아민 ( dioTETA )/ mPEG -PLA-토코페롤 (5k-4k) 함유 조성물의 제조 (복합 유상액 제조 후 유기용매 선택 제거)
dioTETA 6.98 mg을 클로로포름 350 ul에 녹이고 siRNA 200 ug을 증류수 160 ul에 녹였다. mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 8 mg을 클로로포름 3 ml에, mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 32 mg을 증류수 4 ml에 녹였다(총 mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k)양: 40mg). 클로로포름에 용해된 mPEG-PLA-토코페롤 8 mg (20중량%) 용액을 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. dioTETA 용액에 클로로포름 450 ul을 첨가한 후, siRNA 수용액을 한 방울씩 가하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 유상액을 제조하였다. 유상액을 mPEG-PLA-토코페롤 32 mg 수용액에 가하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 복합 유상액을 제조하였다. 복합 유상액을 mPEG-PLA-토코페롤 8 mg이 도포된 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류를 통하여 유기용매를 선택적으로 제거함으로써 siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤(5k-4k) 함유 조성물을 제조하였다.
[ 실험예 5] siRNA / mPEG - PLA -토코페롤(5k-4k)/ dimyDETA 혹은 diliTEPA 함유 조성물의 siRNA 함량 비교
제법에 따라 나노 입자의 siRNA 함량이 어떻게 변화하는지 확인하기 위하여 실시예 14, 15, 및 16의 siRNA 함량을 측정하였다.
변형된 Bligh & Dyer 추출법을 사용하여 실시예 14, 15, 및 16에서 제조된 siRNA/양이온성 지질 함유 양친성 블록 공중합체 미셀에서 siRNA를 정량하였다. 고분자 미셀을 50mM 소듐 포스페이트(sodium phosphate), 75mM NaCl (pH 7.5) 용액에 녹이고, Bligh & Dyer 단일상을 만든 뒤, 100mM 소듐 포스페이트, 150mM NaCl(pH 7.5) 및 클로로포름으로 추출하여 수용액 층의 siRNA를 리보그린(Ribogreen) 시약 (Invitrogen)으로 정량하였다.
멸균 필터로 Millipore 0.45 um PVDF filter를 사용하였다.
얻어진 결과를 아래의 표 11에 나타내었다:
제법 고분자종류 조성비 필터 전 함량 필터 후 함량
실시예 14 유상액
용매 제거		 siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 5-15-1 25.9% 14.7%
실시예 15 복합 유상액
유기용매 제거		 siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 5-15-1 67.1% 65.0%
실시예 16 복합 유상액
유기용매 제거		 siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 5-15-1 67.8% 65.4%
[ 실시예 17] siRNA /1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라아민 ( dioTETA )/ mPEG -PLA-토코페롤 (5k-4k) 함유 조성물의 제조 ( 유상액 제조 후 용매 제거)
dioTETA 827.5 ug을 클로로포름 100 ul에 녹이고 siRNA 25 ug을 증류수 20 ul에 녹였다. mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 5 mg을 클로로포름 500 ul에 녹였다. mPEG-PLA-토코페롤 5 mg 용액 중 mPEG-PLA-토코페롤 1 mg (20중량%)에 해당하는 양을 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. dioTETA 용액과 mPEG-PLA-토코페롤 4 mg 용액을 섞어주고, siRNA 수용액을 한 방울씩 가하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 유상액을 제조하였다. 유상액을 mPEG-PLA-토코페롤 1 mg이 도포된 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류를 통하여 용매를 제거하였다. 플라스크에 증류수 600 ul를 가하고, 부드럽게 흔들어 녹임으로써 siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤(5k-4k) 함유 조성물을 제조하였다.
조성물 조성비 siRNA lipid 고분자
실시예 17 siRNA/1,6-dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 5-15-1 25 ug 872.5 ug 5 mg
[ 실시예 18 내지 21] siRNA /1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라아민 (dioTETA)/mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 함유 조성물의 제조 (복합 유상액 제조 후 유기용매 선택 제 거)
dioTETA 872.5 ug을 클로로포름 100 ul에 녹이고 siRNA 25 ug을 증류수 20 ul에 녹였다. mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 5 mg을 증류수 500 ul에 녹였다. dioTETA 용액에 siRNA 수용액을 한 방울씩 가하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 유상액을 제조하였다. 유상액을 mPEG-PLA-토코페롤 5 mg 수용액에 가하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 복합 유상액을 제조하였다. 복합 유상액을 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류를 통하여 유기용매를 선택적으로 제거함으로써 siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤(5k-4k) 함유 조성물을 제조하였다 (실시예 18).
실시예 18에서 제조한 방법과 유사한 방법으로 실시예 19, 20, 21의 조성물을 제조하였다. 구체적으로, 실시예 19는 500 ug, 실시예 20은 50 ug, 실시예 21은 5 ug의 mPEG-PLA-토코페롤을 증류수 500 ul에 각각 녹여 이용하였다.
조성물 조성비 siRNA lipid 고분자
실시예 18 siRNA/1,6-dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 5-15-1 25 ug 872.5 ug 5 mg
실시예 19 siRNA/1,6-dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 5-15-0.1 25 ug 872.5 ug 500 ug
실시예 20 siRNA/1,6-dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 5-15-0.01 25 ug 872.5 ug 50 ug
실시예 21 siRNA/1,6-dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 5-15-0.001 25 ug 872.5 ug 5 ug
[ 실험예 6] siRNA / mPEG - PLA -토코페롤(5k-4k)/ dioTETA 함유 조성물의 siRNA 함량 비교
제법 및 양친성 블록 공중합체의 양에 따라 나노 입자의 siRNA 함량이 어떻게 변화하는지 확인하기 위하여 실시예 17, 18, 19, 20 및 21의 siRNA 함량을 측정하였다.
변형된 Bligh & Dyer 추출법을 사용하여 실시예 17, 18, 19, 20 및 21에서 제조된 siRNA/양이온성 지질 함유 양친성 블록 공중합체 미셀에서 siRNA를 정량하였다. 고분자 미셀을 50mM 소듐 포스페이트(sodium phosphate), 75mM NaCl (pH 7.5) 용액에 녹이고, Bligh & Dyer 단일상을 만든 뒤, 100mM 소듐 포스페이트, 150mM NaCl(pH 7.5) 및 클로로포름으로 추출하여 수용액 층의 siRNA를 리보그린(Ribogreen) 시약 (Invitrogen)으로 정량하였다.
멸균 필터로 Millipore 0.45 um PVDF filter를 사용하였다.
얻어진 결과를 아래의 표 14에 나타내었다:
제법 고분자종류 조성비 필터 전 함량 필터 후 함량
실시예 17 유상액
용매 제거		 siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 5-15-1 33.86% 22.33%
실시예 18 복합 유상액
유기용매 제거		 siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 5-15-1 89.19% 85.18%
실시예 19 복합 유상액
유기용매 제거		 siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 5-15-0.1 90.19% 77.28%
실시예 20 복합 유상액
유기용매 제거		 siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 5-15-0.01 79.00% 66.06%
실시예 21 복합 유상액
유기용매 제거		 siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 5-15-0.001 94.89% 81.40%
[ 실험예 7] siRNA / mPEG - PLA -토코페롤(5k-4k)/ dioTETA 함유 조성물의 입자 크기 비교
제법 및 양친성 블록 공중합체의 양에 따른 나노 입자 형성 여부를 확인하기 위하여 실시예 18, 19, 20 및 21의 입자 크기와 미셀 내부에 봉입되지 않은 free siRNA의 존재 여부를 확인하였다.
동적 광산란 (DLS; dynamic light scattering) 방법을 이용하여 입자의 크기를 측정하였다. 구체적으로, He-Ne 레이져를 광원으로 사용하였으며, Photal Otsuka Electronics 사의 ELS-8000 기기를 매뉴얼에 따라 작동하였다.
미셀 내부에 봉입되지 않은 free siRNA의 존재 여부는 agarose gel electrophoresis를 이용한 gel retardation 방법을 통하여 확인하였다.
얻어진 결과를 아래의 표 15에 나타내었다:
제법 고분자종류 조성비 입자 크기 Free siRNA
실시예 18 복합 유상액
유기용매 제거		 siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 5-15-1 95.6 nm 없음
실시예 19 복합 유상액
유기용매 제거		 siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 5-15-0.1 89.9 nm 없음
실시예 20 복합 유상액
유기용매 제거		 siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 5-15-0.01 96.2 nm 없음
실시예 21 복합 유상액
유기용매 제거		 siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (5k-4k) 5-15-0.001 101.8 nm 없음
<110> Samyang Biopharmaceuticals Corporation <120> Method of Preparing Composition for Delivering an Anionic Drug <130> DPP20131419KR <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense strand of si-Luc, wherein n is T, and two Ts are linked by phosphorothioate linkage <400> 1 cuuacgcuga guacuucgan n 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense strand of si-Luc, wherein n is T, and two Ts are linked by phosphorothioate linkage <400> 2 ucgaaguacu cagcguaagn n 21

Claims (19)

  1. (1) 음이온성 약물의 수용액을 양이온성 지질이 유기용매에 용해된 용액에 가하여 유상액을 만드는 단계; 및,
    (2) 상기 유상액에 수성 용매 또는 양친성 블록 공중합체의 수용액을 첨가하여 고분자 미셀을 형성하는 단계
    를 포함하되,
    단계 (2)에서 수성 용매를 첨가하는 경우, 양친성 블록 공중합체를 단계 (1)에서 사용되는 양이온성 지질이 유기용매에 용해된 용액에 첨가하고 단계 (1)에서 제조된 유상액으로부터 유기용매를 제거하거나, 단계 (1)에서 얻어진 유상액으로부터 유기용매를 제거한 후 양친성 블록 공중합체를 유기용매에 용해시켜 첨가한 후 유기용매를 제거하는 단계를 추가로 포함하고,
    단계 (2)에서 양친성 블록 공중합체의 수용액을 첨가하는 경우, 단계 (1) 또는 단계 (2)를 수행한 후 유기용매를 제거하는 단계를 추가로 포함하는,
    음이온성 약물이 양이온성 지질과 복합체를 형성하고, 상기 복합체가 양친성 블록 공중합체에 의하여 형성된 미셀 구조 내부에 봉입되는, 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    (1-i) 음이온성 약물의 수용액을 양이온성 지질이 유기용매에 용해된 용액에 가하여 유상액을 제조하는 단계;
    (1-ii) 상기 단계 (1-i)에서 제조된 유상액으로부터 유기용매를 제거하는 단계;
    (1-iii) 양친성 블록 공중합체를 유기용매에 용해시킨 후 상기 단계 (1-ii)에서 얻어진 반응물에 넣고 유기용매를 제거하는 단계; 및
    (1-iv) 상기 단계 (1-iii)에서 얻어진 유기용매가 제거된 반응물에 수성 용매를 첨가하여 고분자 미셀을 형성는 단계
    를 포함하는, 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    (2-i) 음이온성 약물의 수용액을 양이온성 지질이 유기용매에 용해된 용액에 가하여 유상액을 제조하는 단계;
    (2-ii) 상기 단계 (2-i)에서 제조된 유상액으로부터 유기용매를 제거하는 단계; 및
    (2-iii) 양친성 블록 공중합체의 수용액을 단계 (2-ii)에서 얻어진 반응물과 혼합하여 고분자 미셀을 형성하는 단계
    를 포함하는, 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    (3-i) 음이온성 약물의 수용액을 양이온성 지질과 양친성 블록 공중합체가 유기용매에 용해된 용액에 가하여 유상액을 제조하는 단계;
    (3-ii) 상기 단계 (3-i)에서 제조된 유상액으로부터 유기용매를 제거하는 단계; 및
    (3-iii) 상기 단계 (3-ii)에서 얻어진 유기용매를 제거한 반응물에 수성 용매를 첨가하여 고분자 미셀을 형성하는 단계
    를 포함하는, 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    (4-i) 음이온성 약물의 수용액을 양이온성 지질이 유기용매에 용해된 용액에 가하여 유상액을 제조하는 단계;
    (4-ii) 상기 단계 (4-i)에서 제조된 유상액을 양친성 블록 공중합체의 수용액에 가하여 복합 유상액을 제조하는 단계; 및
    (4-iii) 상기 단계 (4-ii)에서 제조된 복합 유상액에서 유기용매만을 선택적으로 제거하여 고분자 미셀을 형성하는 단계
    를 포함하는, 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    (5-i) 음이온성 약물의 수용액을 양이온성 지질과 양친성 블록 공중합체가 유기용매에 용해된 용액을 가하여 유상액을 제조하는 단계;
    (5-ii) 상기 단계 (5-i)의 유상액을 수성 용매에 가하여 복합 유상액을 제조하는 단계; 및
    (5-iii) 상기 단계 (5-ii)의 복합 유상액에서 유기용매만을 선택적으로 제거하여 고분자 미셀을 형성하는 단계
    를 포함하는, 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 방법.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    양친성 블록 공중합체의 일부를 유기용매에 용해한 후 용기에 넣고 유기용매를 제거하여 용기 내부를 양친성 블록 공중합체로 코팅하는 단계를 추가로 포함하고,
    상기 단계 (1-iii), (2-iii), (3-i), (4-ii), 또는 (5-i)에서 사용되는 양친성 블록 공중합체의 양은 상기 코팅 단계에서 사용되지 않은 여분의 양이며,
    상기 단계 (1-ii), (2-ii), (3-ii), (4-iii), 또는 (5-iii)가 상기 코팅된 용기에서 수행되는 것을 특징으로 하는,
    음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 코팅 단계에서 사용되는 양친성 블록 공중합체의 일부는 상기 전체 사용량의 1 내지 50 중량%이고,
    상기 단계 (1-iii), (2-iii), (3-i), (4-ii), 또는 (5-i)에서 사용되는 양친성 블록 공중합체의 양은 전체 사용량에서 코팅 단계에서 사용되는 상기 양친성 블록 공중합체의 일부를 제외한 양인,
    음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 방법.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    양이온성 지질을 용해시키기 위하여 사용되는 유기용매는 아세트산에틸, 아세토니트릴, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 및 다이옥산으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인,
    음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 방법.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 음이온성 약물의 수용액 내 약물 농도는 1 ng/ml 내지 1 kg/ml 이고, 상기 양이온성 지질이 유기용매에 용해된 용액 내의 양이온성 지질의 1 pg/ml 내지 1 kg/ml이고,
    상기 약물 수용액과 양이온성 지질의 유기용매 용액의 혼합비는 부피 기준으로 1:1 내지 50인,
    음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 방법.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    성가 음이온성 약물은 펩타이드, 단백질 또는 핵산인 것을 특징으로 하는, 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 방법.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 핵산은 RNA, DNA, siRNA(short interfering RNA), 압타머(aptamer), 안티센스 ODN(antisense oligodeoxynucleotide), 안티센스 RNA(antisense RNA), 리보자임(ribozyme), 및 디엔에이자임(DNAzyme)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인, 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 방법.
  13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 양이온성 지질은 N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄클로라이드 (DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄브로마이드 (DDAB), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드 DOTAP), N,N-디메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민 (DODMA), 1,2-디아실-3-트리메틸암모늄-프로판 (TAP), 1,2-디아실-3-디메틸암모늄-프로판 (DAP), 3베타-[N-(N',N',N'-트리메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤 (TC-콜레스테롤), 3베타[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤 (DC-콜레스테롤), 3베타[N-(N'-모노메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤 (MC-콜레스테롤), 3베타[N-(아미노에탄)카바모일]콜레스테롤 (AC-콜레스테롤), 콜레스테릴옥시프로판-1-아민 (COPA), N-(N'-아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤 (AC-토코페롤) 및 N-(N'-메틸아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤 (MC-토코페롤)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 방법.
  14. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 양이온성 지질은 하기 화학식 1의 양이온성 지질인, 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 방법:
    [화학식 1]
    Figure 112013029077766-pat00003

    상기 식에서,
    n과 m은 각각 0 내지 12이되, 2 ≤ n + m ≤ 12이며, a와 b는 각각 1 내지 6이며, R1과 R2는 각각 독립적으로 탄소수 11 내지 25개의 포화 및 불포화 탄화수소로 이루어진 군에서 선택된 것이다.
  15. 제 14항에 있어서, n과 m은 독립적으로 1 내지 9이며, 2 ≤ n+m ≤ 10인, 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 방법.
  16. 제15항에 있어서, a와 b가 2 내지 4인, 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 방법.
  17. 제14항에 있어서, R1과 R2는, 각각 독립적으로, 라우릴 (lauryl), 미리스틸 (myristyl), 팔미틸 (palmityl), 스테아릴 (stearyl), 아라키딜 (arachidyl), 베헨닐 (behenyl), 리그노세릴 (lignoceryl), 세로틸 (cerotyl), 미리스트올레일 (myristoleyl), 팔미트올레일 (palmitoleyl), 사피에닐 (sapienyl), 올레일 (oleyl), 리놀레일 (linoleyl), 아라키도닐 (arachidonyl), 에이코사펜타에닐 (eicosapentaenyl), 에루실 (erucyl), 도코사헥사에닐 (docosahexaenyl), 및 세로틸 (cerotyl)로 이루어진 군에서 선택된 것인, 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 방법.
  18. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 양친성 블록 공중합체는 친수성 A 블록과 소수성 B 블록으로 구성되는 A-B 형 이중 블록 공중합체인, 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 친수성 A 블록은 폴리알킬렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드 및 그 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이며,
    상기 소수성 B 블록은 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리아미노산, 폴리오르소에스테르 및 폴리포스파진으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인,
    음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 방법.
KR20130036371A 2012-04-04 2013-04-03 음이온성 약물 전달체의 제조 방법 KR101480055B1 (ko)

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KR20120035087 2012-04-04

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