JP5592897B2 - アニオン性薬物含有薬剤学的組成物及びその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、有効成分としてのアニオン性薬物と、カチオン性脂質と、両親性ブロック共重合体とを含み、前記アニオン性薬物は、前記カチオン性脂質と複合体を形成し、前記複合体が両親性ブロック共重合体のミセル構造の内部に封入されていることを特徴とするアニオン性薬物含有薬剤学的組成物及びその製造方法に関する。

アニオン性薬物、特に、核酸物質を用いた治療において、長年に亘って安全で且つ効率よい薬物伝達技術への取り組みが行われてきており、様々な伝達体及び伝達技術が開発されてきている。特に、アデノウィルスやレトロウィルスなどを用いたウィルス性伝達体、及びカチオン性脂質、カチオン性高分子などを用いた非ウィルス性伝達体を用いた伝達技術が開発されてきている。

しかしながら、ウィルスを用いた伝達体を利用する技術は、非特異的な免疫反応などの危険性に露出されており、生産工程が複雑であるため、商用化させる上で多くの問題点があることが知られている。この理由から、最近には、カチオン性脂質やカチオン性高分子を利用する非ウィルス性伝達体を用いて上述した欠点を改善するという方向に研究の流れが進んでいる。かような非ウィルス性伝達体は、ウィルス性伝達体に比べて効率性に劣っているとはいえ、生体内安全性の面で副作用が少なく、経済性の面で生産コストが安価であるというメリットを有している。

核酸物質の伝達に用いられる非ウィルス性伝達体について多くの研究が行われてきたが、その代表例としては、カチオン性脂質を用いたカチオン性脂質と核酸との複合体（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）及びポリカチオン性（ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎ）高分子と核酸との複合体（ｐｏｌｙｐｌｅｘ）が挙げられる。この種のカチオン性脂質若しくはポリカチオン性高分子は、アニオン性薬物との静電気的相互作用を通じて複合体を形成することにより、アニオン性薬物を安定化させ、細胞内伝達を増加させるという点において研究が盛んになされてきた（Ｄｅ Ｐａｕｌａ Ｄ， Ｂｅｎｔｌｅｙ ＭＶ， Ｍａｈａｔｏ ＲＩ， Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， ＲＮＡ １３ （２００７） ４３１−５６； Ｇａｒｙ ＤＪ， Ｐｕｒｉ Ｎ， Ｗｏｎ ＹＹ， Ｐｏｌｙｍｅｒ−ｂａｓｅｄ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ： Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｐｏｌｙｍｅｒ−ｂａｓｅｄ ＤＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ， Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅｌｅａｓｅ １２１ （２００７） ６４−７３）。

ところが、これまで研究されてきたカチオン性脂質又はポリカチオン性高分子は、十分な効果を得るために所要量を使用する場合に、ウィルス性伝達体よりは激しくはないが、深刻な毒性を引き起こし、医薬品として使用するには不向きであるという結果を示した。また、カチオン性脂質と核酸の結合を通じて錯化合物を形成して細胞内に核酸を伝達する脂質と核酸との複合体の場合には、細胞株実験においては非常に広範に用いられるとはいえ、血中における安定性を有し得る構造を示さないため、生体内において使用するには不向きである（米国特許第６，４５８，３８２号明細書参照）。

生体内において核酸を細胞内に伝達するために繁用される非ウィルス性伝達体の一つである核酸−カチオン性リポソーム錯体若しくは核酸を含むカチオン性リポソームは、両親性脂質、中性脂質及び溶解性脂質（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ ｌｉｐｉｄ）などから構成されており、核酸物質がリポソームの外部に静電気的結合により付着されているか、或いは、内部に捕捉されるが（米国特許第２００３−００７３６４０号明細書、国際特許公報第０５／００７１９６号パンフレット、米国特許第２００６−０２４００９３号明細書）、かようなリポソーム伝達体は網内皮系（ＲＥＳ：ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｓｙｓｔｅｍ）に容易に捕捉され、相当の毒性の副作用を示す虞があるため、全身への適用には不向きである。また、リポソーム伝達体と併せて最も多用されている非ウィルス性伝達体は、カチオン性高分子を含む伝達体であり、高分子当たりに多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）のカチオン電荷を含むポリカチオン性高分子が主として使用される。特に、繁用されている高分子は、ポリカチオン性ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）であり、かようなポリカチオン性高分子は、核酸物質との静電気的結合を通じて核酸と高分子との複合体を形成してナノ粒子を形成することとなる。しかしながら、かようなポリエチレンイミンなどのポリカチオン性高分子は、細胞の死滅を促し、このような細胞毒性は、高分子の分子量と分岐度（ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｂｒａｎｃｈｉｎｇ）が高まるにつれて増加することが知られている。低分子量のポリカチオン性高分子は低い細胞毒性を示すことが知られているが、高分子内のカチオン密度が低くて核酸と効果的な複合体を形成することができず、その結果、細胞内伝達が上手く行われず、核酸の安定性の増加に大きく寄与することができないということが知られている。

この理由から、毒性を引き起こし得るカチオン性高分子又はカチオン性脂質の使用量を極力抑えて毒性を減少させつつ、血中及び体液内において安定しており、しかも、細胞内伝達が可能であるために十分な効果が得られるアニオン性薬物伝達技術の開発が望まれる。また、核酸物質そのものに脂質若しくは高分子を直接的に接合した後、ミセルや他の高分子との複合体を形成してナノ粒子を形成する研究も進んでいるが、核酸物質に直接的に脂質若しくは高分子を接合する場合には接合効率や品質管理の面で難点があり、未だ核酸伝達の効率性が明らかに検証されていない。

一方、両親性ブロック共重合体を用いて、高分子ミセルの形態で難溶性薬物を可溶化させて水溶液上において安定化させることにより、薬物伝達体として利用しようとする努力が様々に講じられている（大韓民国登録特許第０１８０３３４号）。しかしながら、かような両親性ブロック共重合体は、内部に疎水性を帯びる高分子ミセルを形成することにより、疎水性を帯びる難溶性薬物を可溶化させることはできるとはいえ、アニオンを帯びる核酸などの親水性薬物は高分子ミセルの内部に封入することができないため、これらの核酸を含むアニオン性薬物の伝達には不向きである。

一方、多くの疾病は、各種の要因により疾病遺伝子の発現が増加したり、突然変異により非正常的な活性が現れることにより発病する。ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）は、転写後工程において配列特異的に特定の遺伝子の発現を抑えるため、遺伝子治療剤として多くの関心が寄せられている。特に、ｓｉＲＮＡの高い活性と精度よい遺伝子選択性により、既存のアンチセンスヌクレオチドやリボザイムなどの問題点を解決し得る核酸治療剤として期待されている。ｓｉＲＮＡは、１５以上３０未満のヌクレオチドからなる短い二重螺旋のＲＮＡ鎖であり、これらと塩基配列が相補的な遺伝子のｍＲＮＡを切断することにより、当該遺伝子の発現を抑える（ＭｃＭａｎｕｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ３：７３７ （２００２）； Ｅｌｂａｓｈｉｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １５：１８８ （２００１））。

しかしながら、このようなメリットにも拘わらず、ｓｉＲＮＡは血中において核酸分解酵素により速やかに分解され、腎臓を通じて速やかに体外に排泄されることが知られている。また、ｓｉＲＮＡは強い陰電荷を帯びて細胞膜を容易に通過することができないことが知られている。このため、ｓｉＲＮＡを治療剤として使用するためには、ｓｉＲＮＡを血中において安定化させ、ターゲットにする細胞内に効率よく伝達することができ、毒性を示さない伝達体の開発が望まれる。

そこで、本発明の目的は、アニオン性薬物を体内に有効に伝達することができる薬剤学的組成物を提供することである。

また、本発明の他の目的は、上述したアニオン性薬物を体内に有効に伝達することができる薬剤学的組成物の製造方法を提供することである。

本発明に係る薬剤学的組成物は、
有効成分としてのアニオン性薬物と、
カチオン性脂質と、
両親性ブロック共重合体と、
を含み、前記アニオン性薬物は、前記カチオン性脂質と複合体を形成し、このようにして形成された複合体が、前記両親性ブロック共重合体のミセル構造の内部に封入されていることを特徴とする。本発明の一具体例において、前記薬剤学的組成物は、融合性脂質をさらに含んでいてもよい。前記組成物は、有効成分として含有されたアニオン性薬物の伝達用組成物として使用され得る。

本発明の他の実施形態は、有効成分としてのアニオン性薬物と、カチオン性脂質と、両親性ブロック共重合体とを含み、前記アニオン性薬物は、前記カチオン性脂質と複合体を形成し、このようにして形成された複合体が、前記両親性ブロック共重合体のミセル構造の内部に封入されていることを特徴とする組成物のアニオン性薬物の伝達用途を提供する。

本発明のさらに他の実施形態は、有効成分としてのアニオン性薬物と、カチオン性脂質と、両親性ブロック共重合体とを含み、前記アニオン性薬物は、前記カチオン性脂質と複合体を形成し、このようにして形成された複合体が、前記両親性ブロック共重合体のミセル構造の内部に封入されていることを特徴とする組成物を、これを必要とする患者に投与する工程を含むアニオン性薬物の伝達方法を提供する。前記患者は、哺乳類、好ましくは、人間、霊長類、齧歯類などであってもよい。

また、本発明に係る組成物の製造方法は、
（ａ）アニオン性薬物及びカチオン性脂質を、水混和性有機溶媒又は水溶液と有機溶媒との混合溶媒中に溶解させて相分離させる工程と、
（ｂ）前記（ａ）工程における有機溶媒層を分離する工程と、
（ｃ）前記（ｂ）工程における有機溶媒層に両親性ブロック共重合体を混合し、有機溶媒を除去する工程と、
（ｄ）前記有機溶媒の除去された混合物に水溶液を添加してミセル化させる工程と、
を含んでいてもよい。

本発明の他の具体例において、本発明に係る組成物の製造方法は、
（ａ）アニオン性薬物、カチオン性脂質及び両親性ブロック共重合体を、水混和性有機溶媒又は水溶液と有機溶媒との混合溶媒中に溶解させる工程と、
（ｂ）前記（ａ）工程における有機溶媒層を除去する工程と、
（ｃ）前記（ｂ）工程における有機溶媒の除去された混合物に水溶液を添加してミセル化させる工程と、
を含んでいてもよい。

以下、本発明をより具体的に説明する。

一実施形態において、前記アニオン性薬物及びカチオン性脂質は、静電気的な相互作用によりアニオン性薬物と脂質とが複合体を形成した状態で、両親性ブロック高分子のミセル構造の内部に封入される。

本発明の一実施形態によるアニオン性薬物及びカチオン性脂質複合体が封入された高分子ミセル伝達体の概略的な構造を図１に示す。図１に示すように、アニオン性薬物はカチオン性脂質と静電気的な相互作用を通じて結合して、アニオン性薬物とカチオン性脂質とが複合体を形成し、このようにして形成されたアニオン性薬物とカチオン性脂質との複合体は、両親性ブロック共重合体のミセル構造内に封入される。

前記アニオン性薬物とカチオン性脂質との複合体は、両親性ブロック共重合体のミセル構造内に封入された状態で、血中又は体液内における安定性が向上する。一実施形態において、前記ミセルの粒径は、１０〜２００ｎｍであり、より好ましくは、１０〜１５０ｎｍである。前記粒径は、ミセル構造の安定性及び構成成分の含量を考慮し、且つ、体内におけるアニオン性薬物の吸収度及び薬剤学的組成物としての滅菌の便宜性を考慮して選定した最適な範囲のものである。

本発明の一実施形態によるアニオン性薬物は、水溶液中において分子内に陰電荷を帯びる薬理学的活性を有するあらゆる物質を含む概念である。一実施形態において、前記アニオン性は、カルボキシ基、ホスフェート基及びスルファート基よりなる群から選ばれるいずれか一種以上の官能基から付与され得る。本発明の一実施形態において、アニオン性薬物は、多重アニオン性薬物であってもよく、核酸であってもよい。

前記核酸は、ジオキシリボ核酸、リボ核酸又はバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）、糖又は塩基が化学的に変形されたか、あるいは、末端が修飾されたポリヌクレオチド誘導体などの核酸薬物であってもよく、より具体的には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、アンチセンスＯＤＮ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、アンチセンスＲＮＡ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ）、リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）及びＤＮＡザイム（ＤＮＡｚｙｍｅ）よりなる群から選ばれるいずれか一種以上の核酸であってもよい。また、前記核酸は、血中安定性を増加させたり、免疫反応を弱化させたりするなどの目的のために、バックボーン、糖又は塩基が化学的に変形されてもよく、末端が修飾されてもよい。具体的に、核酸のホスホジエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ）結合の一部をホスホロチオアート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）又はボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）結合に置換するか、あるいは、一部のリボース塩基の２’−ＯＨ位にメチル基、メトキシエチル基、フッ素などの様々な官能基が導入された修飾ヌクレオチドをいずれか一種以上含んでいてもよい。

本発明の他の実施形態において、核酸の１以上の末端は、コレステロール、トコフェロール及び炭素数１０〜２４の脂肪酸よりなる群から選ばれるいずれか一種以上により修飾されてもよい。例えば、ｓｉＲＮＡの場合、センス及び／又はアンチセンス鎖の５’末端、又は３’末端、又は両末端に修飾されてもよく、好ましくは、センス鎖の末端に修飾されてもよい。

前記コレステロール、トコフェロール及び脂肪酸には、コレステロール、トコフェロール及び脂肪酸の各類似体、誘導体、及び代謝体が含まれる。

前記ｓｉＲＮＡとは、標的遺伝子と同じ細胞に存在する場合に、ｓｉＲＮＡの配列に相補的なｍＲＮＡの分解を媒介することにより、標的遺伝子の発現を減少若しくは抑制し得る二本鎖ＲＮＡ（ｄｕｐｌｅｘ ＲＮＡ）、又は一本鎖ＲＮＡの内部において二本鎖の形態を帯びる一本鎖ＲＮＡのことをいう。二本鎖同士の結合は、ヌクレオチド間の水素結合を通じて行われ、二本鎖の内部の全てのヌクレオチドが必ず相補的に互いに結合する必要があるとは限らず、前記二本鎖は分離されていてもよく（ｓｅｐａｒａｔｅ）、分離されていなくてもよい。一実施形態において、前記ｓｉＲＮＡの長さは、約１５〜６０個の（二本鎖ＲＮＡの片側ヌクレオチドの数、すなわち、塩基対の数を意味し、一本鎖ＲＮＡの場合には、一本鎖ＲＮＡの内部の二本鎖の長さを意味する。）ヌクレオチドであり、具体的には、約１５〜３０個のヌクレオチドであってもよく、より具体的には、約１９〜２５個のヌクレオチドであってもよい。

一実施形態において、二本鎖ｓｉＲＮＡは、３’又は５’末端に１−５ヌクレオチドの張出し（オーバーハング）を片末端に、又は両末端に有していてもよい。他の実施形態においては、両末端が張出しを有さないブラント（ｂｌｕｎｔ）の形状であってもよい。具体的には、米国出願公報第２００２００８６３５６号及び米国特許番号第７０５６７０４に開示されたｓｉＲＮＡであってもよい（前記文献はこの明細書に参照として取り込まれる）。

また、一実施形態において、ｓｉＲＮＡは、二本鎖の両方の鎖の長さが同じ対称的な構造を有していてもよく、二本鎖のうち一方の鎖が他方の鎖よりも短い非対称的な二本鎖構造であってもよい。具体的に、１９〜２１ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；ｎｔ）のアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）と、前記アンチセンスに相補的な配列を有する１５〜１９ｎｔのセンス（ｓｅｎｓｅ）とからなる二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ）のｓｉＲＮＡ分子（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）であり、前記ｓｉＲＮＡは、アンチセンスの５’方向の末端がブラント末端（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）であってもよく、アンチセンスの３’末端に１−５ヌクレオチドの張出し（オーバーハング）を有する非対称ｓｉＲＮＡであってもよい。具体的に、国際公開特許番号ＷＯ０９／０７８６８５号パンフレットに開示されたｓｉＲＮＡであってもよい（前記文献は、この明細書中に参照として取り込まれる）。

本発明のアニオン性薬物は、全体の組成物の重量を基準として、０．００１〜１０重量％、具体的には、０．０１〜５重量％にて含まれることが好ましい。前記アニオン性薬物の含量が０．００１重量％未満であれば、薬物に比べて伝達体の使用量が多過ぎて伝達体による副作用が生じる虞があり、１０重量％を超えると、ミセルのサイズが大き過ぎてミセルの安定性が低下し、しかも、フィルターの滅菌に際しての損失率が大きくなる虞がある。

本発明の一実施形態において、前記カチオン性脂質は、アニオン性薬物と静電気的な相互作用により結合されて複合体を形成し、前記複合体は、両親性ブロック共重合体のミセル構造の内部に封入される。このため、前記カチオン性脂質は、アニオン性薬物と静電気的な相互作用により複合体を形成し得るあらゆる脂質の種類であってもよく、例えば、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＴＭＡ）、１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＴＡＰ）、１，２−ジアシル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＡＰ）、３ベータ−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−トリメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＴＣ−コレステロール）、３ベータ［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−コレステロール）、３ベータ［Ｎ−（Ｎ’−モノメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＭＣ−コレステロール）、３ベータ［Ｎ−（アミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＡＣ−コレステロール）、コレステリルオキシプロパン−１−アミン（ＣＯＰＡ）、Ｎ−（Ｎ’−アミノエタン）カルバモイルプロパノイックトコフェロール（ＡＣ−トコフェロール）及びＮ−（Ｎ’−メチルアミノエタン）カルバモイルプロパノイックトコフェロール（ＭＣ−トコフェロール）よりなる群から選ばれるいずれか一種又は二種以上の組み合わせであってもよい。具体的に、カチオン性脂質から引き起こされる毒性を減少させるために、分子内のカチオン密度が高いポリカチオン性脂質を少量使用することが好ましく、より具体的には、分子当たりの水溶液上においてカチオンを示し得る官能基が一つであってもよい。具体例において、前記カチオン性脂質は、３ベータ−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−トリメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＴＣ−コレステロール）、３ベータ［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−コレステロール）、３ベータ［Ｎ−（Ｎ’−モノメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＭＣ−コレステロール）、３ベータ［Ｎ−（アミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＡＣ−コレステロール）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、及びＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＴＭＡ）よりなる群から選ばれるいずれか一種以上であってもよい。

本発明のカチオン性脂質は、全体の組成物の重量を基準として、０．０１〜５０重量％、具体的には、０．１〜１０重量％にて含まれ得る。前記カチオン性脂質の含量が０．０１％未満であれば、アニオン性薬物と複合体を形成できる程度の十分な量にならず、５０重量％を超えると、ミセルのサイズが大き過ぎてミセルの安定性が低下し、しかも、フィルター滅菌に際しての損失率が大きくなる虞がある。

前記カチオン性脂質とアニオン性薬物は、静電気的な相互作用を通じて結合して、アニオン性薬物とカチオン性脂質との複合体を形成する。一実施形態において、前記アニオン性薬物（Ｎ）とカチオン性脂質（Ｐ）の電荷量の比（Ｎ／Ｐ；アニオン性薬物のアニオン電荷に対するカチオン性脂質のカチオン電荷の比）は、０．１〜１２８であり、具体的には、０．５〜３２であり、より具体的には、１〜１６であることが好ましい。前記比（Ｎ／Ｐ）が０．１未満である場合には、十分な量のアニオン性薬物を含む複合体を形成することが困難であるため、０．１以上であってこそ、十分な量のアニオン薬物を含む複合体を形成することができて有利である。これに対し、比（Ｎ／Ｐ）が１２８を超えると、毒性を引き起こす虞があるため、１２８以下にすることが好ましい。

一実施形態において、前記両親性ブロック共重合体は、親水性Ａブロック及び疎水性Ｂブロックを含むＡ−Ｂ型ブロック共重合体であってもよい。前記Ａ−Ｂ型ブロック共重合体は、水溶液上において、疎水性Ｂブロックがコアを形成し、且つ、親水性Ａブロックがシェルを形成するコア−シェル型の高分子ミセルを形成する。

一実施形態において、前記親水性Ａブロックは、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド及びその誘導体よりなる群から選ばれるいずれか一種以上であってもよい。より具体的には、親水性Ａブロックは、モノメトキシポリエチレングリコール、モノアセトキシポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリエチレンとプロピレングリコールの共重合体及びポリビニルピロリドンよりなる群から選ばれるいずれか一種以上であってもよい。他の実施形態において、前記親水性Ａブロックは、数平均分子量が２００〜５０，０００ダルトン、より具体的には、１，０００〜２０，０００ダルトン、さらに具体的には、１，０００〜５，０００ダルトンであるものであってもよい。

また、必要に応じて、親水性Ａブロックの末端に特定の組織や細胞に達し得る官能基やリガンド、又は細胞内伝達を促し得る官能基を化学的に結合させて高分子ミセル伝達体の体内分布を調節したり、高分子ミセル伝達体の細胞内への伝達効率を高めたりすることができる。前記官能基やリガンドは、単糖類、多糖類、ビタミン、ペプチド、タンパク質及び細胞表面受容体に対する抗体よりなる群から選ばれるいずれか一種以上であってもよい。より具体的に、アニスアミド（ａｎｉｓａｍｉｄｅ）、ビタミンＢ９（葉酸）、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ガラクトース、ラクトース、マンノース、ヒアルロン酸、ＲＧＤペプチド、ＮＧＲペプチド、トランスフェリン、トランスフェリン受容体に対する抗体などよりなる群から選ばれるいずれか一種以上であってもよい。

前記疎水性Ｂブロックは、生体適合性及び生分解性に優れた高分子であり、一実施形態において、ポリエステル、ポリアンヒドリド、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル及びポリホスファゼンよりなる群から選ばれるいずれか一種以上であってもよい。より具体的には、前記疎水性Ｂブロックは、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリカプロラクトン、ポリジオキサン−２−オン、ポリラクチドとグリコリドの共重合体、ポリラクチドとポリジオキサン−２−オンの共重合体、ポリラクチドとポリカプロラクトンの共重合体及びポリグリコリドとポリカプロラクトンの共重合体よりなる群から選ばれるいずれか一種以上であってもよい。一実施形態において、前記疎水性Ｂブロックは、数平均分子量が５０〜５０，０００ダルトン、より具体的には、２００〜２０，０００ダルトンであり、さらに具体的には、１，０００〜５，０００ダルトンであるものであってもよい。また、疎水性ブロックの疎水性を増加させてミセルの安定性を向上させるために、トコフェロール、コレステロール、又は炭素数１０〜２４の脂肪酸を疎水性ブロック末端のヒドロキシ基に化学的に結合させてもよい。

前記親水性ブロック（Ａ）と疎水性ブロック（Ｂ）を含む両親性ブロック共重合体の含量は、組成物全体の乾燥重量を基準として、４０〜９９．９８重量％であり、具体的には、８５〜９９．８重量％、より具体的には、９０〜９９．８重量％であることが好ましい。前記両親性ブロック共重合体の含量が４０重量％未満であれば、ミセルのサイズが大き過ぎてミセルの安定性が低下し、しかも、フィルターの滅菌に際しての損失率が大きくなる虞があり、含量が９９．９８重量％を超えると、取り込み可能なアニオン性薬物の含量があまりにも少量になってしまう。

さらに他の実施形態において、前記両親性ブロック共重合体において、親水性ブロック（Ａ）と疎水性ブロック（Ｂ）の組成比は、共重合体の重量を基準として、親水性ブロック（Ａ）が、４０〜７０重量％、具体的には、５０〜６０重量％の範囲であってもよい。親水性ブロック（Ａ）の比率が４０重量％未満であれば、高分子の水への溶解度が低くてミセルを形成することが困難であるため、共重合体がミセルを形成するのに十分な水への溶解度を有するために、親水性ブロック（Ａ）の比が４０重量％以上であることが好ましい。その一方、７０重量％を超えると、親水性が高過ぎて高分子ミセルの安定性が低くてアニオン性薬物とカチオン性脂質との複合体の可溶化組成物として使用することが困難であるため、ミセルの安定性を考慮して、親水性ブロック（Ａ）の比が７０重量％以下であることが好ましい。

一実施形態において、前記両親性ブロック共重合体は、水溶液上においてアニオン性薬物とカチオン性脂質との複合体をミセル構造の内部に封入するが、このとき、両親性ブロック共重合体の重量（ｂ）に対するアニオン性薬物及びカチオン性脂質複合体の重量（ａ）の比［ａ／ｂ×１００；（アニオン性薬物の重量＋カチオン性脂質の重量）／両親性ブロック共重合体の重量×１００］は、０．００１％〜１００％、具体的には、０．０１〜５０％、より具体的には、０．１〜１０％であってもよい。前記重量比が、０．００１重量％未満である場合には、アニオン性薬物及びカチオン性脂質の複合体の含量が低下してアニオン性薬物に対する有効含量を満たすことが困難であり、逆に、１００重量％を超えると、両親性ブロック共重合体の分子量と、アニオン性薬物及び脂質複合体の量を考慮するとき、適切なサイズのミセル構造を形成することができないためである。

一実施形態において、本発明の薬剤学的組成物は、アニオン性薬物の細胞内伝達効率を増加させるために、全体の組成物の重量を基準として、０．０１〜５０重量％、具体的には、０．１〜１０重量％の融合性脂質をさらに含んでいてもよい。

前記融合性脂質は、アニオン性薬物とカチオン性脂質との複合体への混入に際して、疎水性相互作用により結合してアニオン性薬物、カチオン性脂質及び融合性脂質の複合体を形成し、前記融合性脂質を含む複合体は、両親性ブロック共重合体のミセル構造の内部に封入される。一実施形態において、前記融合性脂質は、リン脂質、コレステロール、及びトコフェロールよりなる群から選ばれるいずれか一種又は二種以上の組み合わせであってもよい。

具体的に、前記リン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎ；ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ；ＰＣ）及びホスファチジン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）よりなる群から選ばれるいずれか一種以上であってもよい。前記ホスファチジルエタノールアミン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎ；ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ；ＰＣ）及びホスファチジン酸は、一つ又は二つの炭素数１０〜２４の脂肪酸と結合された形態であってもよい。前記コレステロール及びトコフェロールには、コレステロール及びトコフェロールの各類似体、誘導体、及び代謝体が含まれる。

具体的には、融合性脂質は、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｌａｕｒｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルエタノールアミン（１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、１，２−ジフィタノイル−３−ｓｎ−ホスファチジルエタノールアミン（１，２−ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙｌ−３−ｓｎ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ｄｉｌａｕｒｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ｄｉｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ジリノレオイルホスファチジルコリン（ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、１，２−ジフィタノイル−３−ｓｎ−ホスファチジルコリン（１，２−ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙｌ−３−ｓｎ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ジラウロイルホスファチジン酸（ｄｉｌａｕｒｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、ジミリストイルホスファチジン酸（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、ジステアロイルホスファチジン酸（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、ジオレオイルホスファチジン酸（ｄｉｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、ジリノレオイルホスファチジン酸（ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジン酸（１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、１，２−ジフィタノイル−３−ｓｎ−ホスファチジン酸（１，２−ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙｌ−３−ｓｎ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、コレステロール及びトコフェロールよりなる群から選ばれるいずれか一種又は二種以上の組み合わせであってもよい。

好適な具体例において、前記融合性脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ；ＤＯＰＥ）、ジパルミトレオイルホスホコリン（１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ；ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスホコリン（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ；ＤＯＰＣ）、ジパルミトレオイルホスホエタノールアミン（１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ；ＤＰＰＥ）などよりなる群から選ばれるいずれか一種以上であってもよい。

また、本発明は、前記アニオン性薬物を含有する両親性二重ブロック共重合体ミセルを含む薬剤学的組成物を製造する方法を提供する。

一実施形態において、アニオン性薬物、カチオン性脂質及び両親性ブロック共重合体を含むアニオン性薬物含有薬剤学的組成物を製造する方法は、
（ａ）アニオン性薬物とカチオン性脂質を、水混和性有機溶媒又は水溶液と有機溶媒との混合溶媒中に溶解させて相分離させる工程と、
（ｂ）前記（ａ）工程における有機溶媒層を分離する工程と、
（ｃ）前記（ｂ）工程における有機溶媒層に両親性ブロック共重合体を混合し、有機溶媒を除去する工程と、
（ｄ）前記有機溶媒の除去された混合物に水溶液を添加してミセル化させる工程と、
を含む。

前記（ａ）工程において、水混和性有機溶媒、又は水溶液と有機溶媒との混合溶媒においてアニオン性薬物とカチオン性脂質を混合して複合体を形成する。具体的には、前記水混和性有機溶媒は、アセトン、エタノール、メタノール及び酢酸よりなる群から選ばれるいずれか一種以上であってもよく、前記混合溶媒の有機溶媒は、酢酸エチル、アセトニトリル、メチレンクロリド、クロロホルム及びジオキサンよりなる群から選ばれるいずれかいずれか一種以上であってもよい。前記水溶液は、蒸留水であってもよく、注射用水であってもよく、緩衝液であってもよい。前記溶媒に溶解させたアニオン性薬物とカチオン性脂質との複合体の量は、使用した溶媒量の０．１〜１００重量％、具体的には、０．１〜１０重量％、より具体的には、０．１〜１重量％になるように使用することができる。もし、１００重量％以上であれば、下記（ｂ）工程においてアニオン性薬物とカチオン性脂質との複合体を有機溶媒により抽出するとき、歩留まりが急減するという欠点がある。

前記（ｂ）工程において、相分離を通じてアニオン性薬物とカチオン性脂質との複合体を回収する。前記工程（ａ）における溶媒に水溶液と有機溶媒をさらに加えて相分離を誘導してもよい。なお、相分離時間を短縮するために、遠心分離工程をさらに行っても良い。

前記（ｃ）工程において、抽出された有機溶媒に両親性ブロック共重合体を添加して混合した後、有機溶媒を蒸発することにより除去する。

前記（ｄ）工程は、有機溶媒が蒸発されずに残留する混合物を水溶液中に溶解させることにより、アニオン性薬物とカチオン性脂質との複合体を両親性ブロック共重合体のミセル構造の内部に封入する工程である。前記水溶液は、蒸留水、注射用水、又は緩衝液であってもよく、使用量は、両親性ブロック共重合体の濃度が約１０〜３００ｍｇ／ｍＬとなるような量であってもよい。前記両親性ブロック共重合体の濃度が１０ｍｇ／ｍＬ未満であれば、水溶液の体積が嵩んで製造工程上の取扱いに難点があり、３００ｍｇ／ｍＬを超えると、水溶液の粘度が上がって円滑なミセルの製造が困難になる。

本発明の他の実施形態において、アニオン性薬物、カチオン性脂質及び両親性ブロック共重合体を含むアニオン性薬物含有薬剤学的組成物を製造する方法は、
（ａ’）アニオン性薬物、カチオン性脂質及び両親性ブロック共重合体を、水混和性有機溶媒又は水溶液と有機溶媒との混合溶媒中に溶解させる工程と、
（ｂ’）前記（ａ’）工程における有機溶媒層を除去する工程と、
（ｃ’）前記（ｂ’）工程における有機溶媒の除去された混合物に水溶液を添加してミセル化させる工程と、
を含む。

前記（ａ’）工程において、水混和性有機溶媒又は水溶液と有機溶媒との混合溶媒においてアニオン性薬物、カチオン性脂質及び両親性ブロック共重合体を混合して複合体を形成する。具体的には、前記水混和性有機溶媒は、アセトン、エタノール、メタノール及び酢酸よりなる群から選ばれるいずれか一種以上であってもよく、前記混合溶媒の有機溶媒は、酢酸エチル、アセトニトリル、メチレンクロリド、クロロホルム及びジオキサンよりなる群から選ばれるいずれか一種以上であってもよい。前記水溶液は、蒸留水、注射用水、又は緩衝液であってもよい。

前記（ｂ’）工程において、有機溶媒を蒸発させることにより除去する。

前記（ｃ’）工程は、有機溶媒が蒸発されずに残留する混合物を水溶液中に溶解させることにより、アニオン性薬物とカチオン性脂質との複合体を両親性ブロック共重合体のミセル構造の内部に封入する。前記水溶液の種類及びその使用量は、上述した通りである。

さらに他の実施形態において、融合性脂質を含む組成物の場合、前記融合性脂質は、ミセルの形成のための両親性ブロック共重合体の添加時に一緒に添加されてもよく、例えば、前記（ｃ）又は（ａ’）工程において添加されてもよい。

本発明のさらに他の実施形態において、前記（ｄ）工程、又は（ｃ’）工程後に、（ｅ）凍結乾燥補助剤を加えて凍結乾燥する工程をさらに含んでいてもよい。

一実施形態において、本発明に係る製造方法は、前記（ｅ）工程における凍結乾燥前に、（ｄ）工程、又は（ｃ’）工程において得られた高分子ミセル水溶液を滅菌フィルターにより滅菌する工程をさらに含んでいてもよい。

一実施形態において、前記凍結乾燥補助剤は、ラクトース、マンニトール、ソルビトール及びスクロースよりなる群から選ばれるいずれか一種以上であってもよい。前記凍結乾燥補助剤は、凍結乾燥された組成物をケーキ状に維持するために添加される。本発明の他の実施形態において、前記凍結乾燥補助剤の含量は、凍結乾燥組成物の全体の乾燥重量を基準として、１〜９０重量％、より具体的には、１０〜６０重量％である。

一実施形態において、本発明に係るアニオン薬物含有両親性ブロック共重合体ミセル組成物は、水溶液、粉体又は錠剤の形で製剤化されてもよい。本発明のさらに他の実施形態において、前記組成物は、注射用製剤であってもよい。例えば、前記凍結乾燥組成物は、注射用蒸留水、０．９％生理食塩水、５％デキストロース水溶液などにより再建することができる。

本発明に係る製法により形成されたミセル粒子は、血中において安定しており、粒径は１０〜２００ｎｍであり、より具体的には、１０〜１５０ｎｍである。

本発明に係るアニオン性薬物含有薬剤学的組成物は、血管、筋肉、皮下、経口、骨、経皮又は局所組織などの投与経路を経て投与されてもよく、溶液、懸濁注射剤、精製又はカプセル剤など様々な剤形に剤形化されてもよい。

本発明に係るアニオン性薬物含有薬剤学的組成物は、カチオン性脂質と両親性ブロック高分子を用いてアニオン性薬物を外部から隔離することにより、アニオン性薬物の血中若しくは体液内安定性を高めることもできる。また、本発明の組成物は、アニオン性薬物を細胞内に効率よく伝達することができる。さらに、前記両親性高分子は、生分解性及び生体適合性に優れている。

図１は、本発明の一実施形態に係るアニオン性薬物含有薬剤学的組成物の模式図である。 図２は、本発明の一実施形態に係る製造方法により製造されたＡＣ−トコフェロールに対するＮＭＲ測定結果である。 図３は、本発明の一実施形態に係る製造方法により製造されたＭＣ−トコフェロールに対するＮＭＲ測定結果である。 図４は、本発明の実施例３による製造方法により重合されたｍＰＥＧ−ＰＬＡブロック共重合体に対するＮＭＲ測定結果である。 図５は、本発明の実施例４による製造方法により重合されたｍＰＥＧ−ＰＬＡブロック共重合体に対するＮＭＲ測定結果である。 図６は、本発明の実施例５による製造方法により重合されたｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールに対するＮＭＲ測定結果である。 図７は、本発明の実施例６による製造方法により重合されたｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールに対するＮＭＲ測定結果である。 図８は、本発明の一実施形態に係る製造方法により重合されたアニスアミド−ＰＥＧ−ＰＬＡに対するＮＭＲ測定結果である。

以下、本発明を下記の実施例に基づいてさらに具体的に説明するが、これらは本発明を説明するためのものに過ぎず、これらによって本発明の範囲が何ら制限されることはない。

［実施例１］ＡＣ−コレステロール（３ベータ［Ｎ−（アミノエタン）カルバモイル］コレステロール）の合成
ＡＣ−コレステロールの合成のためにコレステリルクロロフォーマート（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ、シグマアルドリッチ社製）とエチレンジアミン（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ、シグマアルドリッチ社製）を下記のようにして反応させた。

コレステリルクロロフォーマート１ｇ（２．２３ｍｍｏｌ）を２０ｍｌのクロロホルムに溶かし、別の反応容器に２０倍当量のエチレンジアミンを３０ｍｌのクロロホルムで希釈し、４℃に維持した。コレステリルクロロフォーマート溶液をエチレンジアミン入り反応容器に徐々に注いだ後、常温において３時間かけて反応させた。反応終了後に、蒸留濃縮装置（ロータリーエバポレーター、Ｂｕｃｈｉ社製、Ｒ−２０５５）を用いて溶媒を除去し、さらに少量のクロロホルムに溶かした後、ＮａＣｌ飽和溶液とＮａＣＯ_３により抽出してクロロホルム層を回収した。

次いで、蒸留濃縮装置（ロータリーエバポレーター）により溶媒を除去し、クロロホルムに溶かした後、シリカゲルクロマトグラフィ（ｓｉｌｉｃａ−ｇｅｌ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）法により分離した。クロロホルム：メタノール＝９：１（ｖ／ｖ）で溶出された分画に塩酸溶液をコレステリルクロロフォーマートの５０倍当量にて添加し、単一相が形成されるまでメタノールを少量ずつ添加してＡＣ−コレステロール塩酸塩を形成した。

蒸留濃縮装置（ロータリーエバポレーター）により加温、減圧蒸留して溶媒を完全に除去した。ＡＣ−コレステロール塩酸塩を６０℃のメタノールに溶かした後、４℃まで冷却して再結晶を得た（収率：５３％）。^１Ｈ−ＮＭＲによりＡＣ−コレステロールの合成有無及び純度を確認し、その結果を図２に示す。純度は、９９％以上であった。

［実施例２］ＭＣ−コレステロール（３ベータ［Ｎ−（Ｎ’−モノメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール）の合成
エチレンジアミンの代わりに、Ｎ−メチルエチレンジアミン（Ｎ−ｍｅｔｈｅｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ、シグマアルドリッチ社製）をコレステリルクロロフォーマートの１０当量使用した以外は、実施例１の方法と同様にして、ＭＣ−コレステロールを合成及び精製した（収率：６２％）。^１Ｈ−ＮＭＲによりＭＣ−コレステロールの合成有無及び純度を確認し、その結果を図３に示す。純度は、９９％以上であった。

［実施例３］ｍＰＥＧ−ＰＬＡ（モノメトキシポリエチレングリコール−ポリラクチド）ブロック共重合体（Ａ−Ｂ）の重合（分子量２，０００−１，７５０ダルトン）
５ｇのモノメトキシポリエチレングリコール（分子量２，０００ダルトン以下、ＮＯＦ社製）を１００ｍｌの２口丸底フラスコに入れ、３時間かけて減圧（１ｍｍＨｇ）下において１００℃に加熱して脱水した。反応フラスコに乾燥窒素を満たし、反応触媒であるスタノウスオクトアート（Ｓｎ（Ｏｃｔ）_２、シグマアルドリッチ社製）を注射器を用いてラクチドの０．１ｗｔ％（５ｍｇ）にて注入した。反応混合物を３０分間攪拌し、１１０℃において１時間かけて１ｍｍＨｇまで減圧して触媒を溶かした溶媒であるトルエンを除去した。精製されたラクチド（５ｇ、Ｐｕｒａｃ）を加え、混合物を１２時間かけて１３０℃に加熱した。形成された高分子をエタノールに溶かし、ジエチルエーテルを加えて高分子を析出させた。析出された高分子を真空オーブンにおいて４８時間かけて乾燥した。

前記過程により得られたｍＰＥＧ−ＰＬＡの数平均分子量は２，０００−１，７５０ダルトンであり、図４の^１Ｈ−ＮＭＲによりＡ−Ｂタイプであることが確認された。

［実施例４］ｍＰＥＧ−ＰＬＡ（モノメトキシポリエチレングリコール−ポリラクチド）ブロック共重合体（Ａ−Ｂ）の重合（分子量５，０００−４，０００ダルトン）
モノメトキシポリエチレングリコール（分子量５，０００ダルトン以下、ＮＯＦ社製）を用い、実施例３の方法と同様にして、数平均分子量が５，０００−４，０００ダルトンであるｍＰＥＧ−ＰＬＡブロック共重合体を合成した。前記得られたｍＰＥＧ−ＰＬＡブロック共重合体に対する^１Ｈ−ＮＭＲ測定結果を図５に示す。図５から明らかなように、製造されたｍＰＥＧ−ＰＬＡブロック共重合体はＡ−Ｂタイプであることが確認された。

［実施例５］ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールの重合（分子量２，０００−１，７５０−５３０ダルトン）
反応溶媒アセトニトリル（ＡＣＮ）２００ｍｌを用い、反応物として数平均分子量が２，０００−１，７５０ダルトンである実施例３のｍＰＥＧ−ＰＬＡ２６．４ｍｍｏｌ、トコフェロールスクシナート（ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ、シグマアルドリッチ社製）３１．６８ｍｍｏｌ、触媒としてジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、シグマアルドリッチ社製）３１．６８ｍｍｏｌ及びジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、シグマアルドリッチ社製）３．１６８ｍｍを投入し、常温において２４時間かけて合成した。反応生成物が溶解されているアセトニトリル溶液をガラスフィルターによりろ過して、反応中に生成されたジシクロヘキシルカルボウレア（ＤＣＵ）を除去した。

１次精製として、ろ過されたアセトニトリル溶液を冷たいジエチルエーテル：ヘキサン＝３：７（ｖ／ｖ）混合溶媒に沈殿させて高分子を再結晶した。得られた高分子をさらにアセトニトリル溶液に溶かし、ジエチルエーテル：ヘキサン＝３：７（ｖ／ｖ）混合溶媒に沈殿させて２次精製を行った。精製された高分子は真空乾燥して、白色の粉体状粒子を得た。図６の^１Ｈ−ＮＭＲ分析結果、純度は９７％以上であり、収率は９２．７％であった。

［実施例６］ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールの重合（分子量５，０００−４，０００−５３０ダルトン）
数平均分子量が５，０００−４，０００ダルトンである実施例４のｍＰＥＧ−ＰＬＡを用いて、実施例５の方法と同様にしてｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールを重合した。図７の^１Ｈ−ＮＭＲ分析結果、純度は９７％以上であり、収率は９４．２％であった。

［実施例７］アニスアミド−ＰＥＧ−ＰＬＡ（Ａｎｉｓａｍｉｄｅ−ＰＥＧ−ＰＬＡ）の重合
アニス酸（ａｎｉｓｉｃ ａｃｉｄ、４−メトキシ安息香酸（４−ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、シグマアルドリッチ社製）０．１ｇ（６６０μｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（シグマアルドリッチ社製）０．１４６ｇ（７１０μｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、シグマアルドリッチ社製）０．０８１ｇ（７１０μｍｏｌ）をアセトニトリル：ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）＝２：１（ｖ／ｖ）混合溶媒に溶かし、２４時間かけて反応させて、アニス酸−ＮＨＳエステル（ＡＡ−ＮＨＳ）を合成した後、反応副産物であるジシクロヘキシルカルボウレアをろ過して除去した。Ｈ_２Ｎ−ＰＥＧ−ＯＨ（Ｍｎ＝２，０００、ＮＯＦ社製）０．５１９ｇ（２６０μｍｏｌ）を２ｍｌのアセトニトリルに溶かし、１．５倍当量のＡＡ−ＮＨＳを加えた後、常温において２４時間かけて反応させてアニスアミド−ＰＥＧ（ＡＡ−ＰＥＧ）を合成した。反応物を冷たいジエチルエーテルに沈殿させてＡＡ−ＰＥＧを再結晶する過程を２回繰り返し行ってＡＡ−ＰＥＧを精製した。ＡＡ−ＰＥＧからＡＡ−ＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールを重合する過程は、実施例５及び６の方法と同様にして行った。^１Ｈ−ＮＭＲ分析結果、アニスアミドの取込率は９０．２％であり、その結果を図８に示す。

［実施例８］ｓｉＲＮＡ／カチオン性脂質複合体の製造
ブライ‐ダイアー抽出法（Ｂｌｉｇｈ， ＥＧ．， Ｄｙｅｒ， ＷＪ， Ａ ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｌｉｐｉｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｃａｎ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓｉｏｌ ３７ （１９５９） ９１１−９３７）を用いてｓｉＲＮＡ／カチオン性脂質複合剤を製造した。ｓｉＲＮＡは５μｇを使用し、カチオン性脂質として実施例１及び２のＡＣ−コレステロール、ＭＣ−コレステロール及びＴＣ−コレステロール（シグマアルドリッチ社製）をそれぞれｓｉＲＮＡリン酸基モル数の０、１、２、４、８及び１６倍使用した（Ｎ／Ｐ比（ｓｉＲＮＡのリン酸基に対するカチオン性脂質のカチオンの比）＝０、１、２、４、８及び１６）。

ＧＦＰｓｉＲＮＡ配列（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）：
センス鎖：５’−ＧＣＡＡＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵｄＴｄＴ−３’（配列番号１）
アンチセンス鎖：５’−ＡＡＣＵＵＣＡＧＧＧＵＣＡＧＣＵＵＧＣｄＴｄＴ−３’（配列番号２）

前記Ｎ／Ｐ比になるようにｓｉＲＮＡ水溶液１００μｌ、カチオン性脂質クロロホルム溶液１００μｌ及びメタノール２１０μｌを混合して単一相（Ｂｌｉｇｈ ＆ Ｄｙｅｒ ｍｏｎｏｐｈａｓｅ）を形成し、蒸留水１００μｌ、クロロホルム１００μｌを加えて相分離させた。水溶液層とクロロホルム層のｓｉＲＮＡ量はリボグリーン（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ、インビトロジェン社製）試薬により定量した。定量結果は、下記表１に示す。

表１を参照すれば、カチオン性脂質がｓｉＲＮＡと複合体を形成してｓｉＲＮＡ／カチオン性脂質の複合体が有機溶媒層に相移動されていることが確認できた。

［実施例９］ｓｉＲＮＡ／ＡＣ−コレステロール／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ高分子ミセルの製造
実施例８の方法に従い、ｓｉＲＮＡ／カチオン性脂質の複合剤を製造した。ｓｉＲＮＡのリン酸基に対するＡＣ−コレステロールのカチオンの比（Ｎ／Ｐ比）は、６にした。相分離後に、クロロホルム層のみを別に回収してｍＰＥＧ−ＰＬＡ（分子量２，０００−１，７５０ダルトン）に対するｓｉＲＮＡ／ＡＣ−コレステロール複合体の比が０．５１ｗｔ％になるように実施例３のｍＰＥＧ−ＰＬＡを添加した後、１口丸フラスコに移し、蒸留濃縮装置（ロータリーエバポレーター）において減圧蒸留して溶媒を除去した。フラスコに蒸留水３００μＬを加え、柔らかく振とうして溶かすことにより、ｓｉＲＮＡ／ＡＣ−コレステロール／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ高分子ミセル伝達体を製造した。

［実施例１０］ｓｉＲＮＡ／ＡＣ−コレステロール／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール高分子ミセルの製造
実施例９と同じ方法を利用するが、ｍＰＥＧ−ＰＬＡの代わりに、実施例５のｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（分子量２，０００−１，７５０−５３０ダルトン）を用いて、ｓｉＲＮＡ／ＡＣ−コレステロール／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール高分子ミセル伝達体を製造した。このとき、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールに対するｓｉＲＮＡ／ＡＣ−コレステロール複合体の比が０．５１ｗｔ％になるようにした。

［実施例１１］ｓｉＲＮＡ／ＡＣ−コレステロール／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール高分子ミセルの製造
１口丸フラスコにＡＣ−コレステロール４６μｇ（Ｎ／Ｐ比＝６）とエタノールを入れ、室温において完全に溶かした後、実施例８のｓｉＲＮＡ５μｇを添加して混合した。ここに実施例６のｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール（分子量５，０００−４，０００−５３０ダルトン）９ｍｇを入れ、６０℃において５分間攪拌した。このとき、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールに対するｓｉＲＮＡ／ＡＣ−コレステロール複合体の比が０．５７ｗｔ％になるようにした。

混合物を蒸留濃縮装置（ロータリーエバポレーター）において減圧蒸留して溶媒を除去した。フラスコに蒸留水３００μＬを加え、柔らかく振とうして溶かすことにより、ｓｉＲＮＡ／ＡＣ−コレステロール／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ高分子ミセル伝達体を製造した。

［実施例１２］ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ−コレステロール／ＡＣ−コレステロール／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール高分子ミセルの製造
下記の配列番号３及び４のＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ及び前記配列と同じ配列を有するが、センス鎖の３’末端にコレステロールが共有結合されたＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ−コレステロールを三千里製薬（韓国）から購買して、実施例１１と同じ組成を有するように、且つ、実施例１１と同じ方法により、ＶＥＦＧ ｓｉＲＮＡ及びＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ−コレステロール高分子ミセル伝達体を製造した。

ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）：
センス鎖：５’−ＧＧＡＧＵＡＣＣＣＵＧＡＵＧＡＧＡＵＣｄＴｄＴ−３’（配列番号３）、
アンチセンス鎖：５’−ＧＡＵＣＵＣＡＵＣＡＧＧＧＵＡＣＵＣＣｄＴｄＴ−３’（配列番号４）

［実施例１３］ｓｉＲＮＡ／ＡＣ−コレステロール／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール／ジオレイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＯＰＥ）高分子ミセルの製造
実施例１１の組成において、さらにＤＯＰＥ（Ａｖａｎｔｉ ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄｓ）３４μｇを高分子と一緒に添加し、実施例１１の方法と同様にしてＤＯＰＥ含有ｓｉＲＮＡ高分子ミセル伝達体を製造した。

［実験例１］ｓｉＲＮＡ／カチオン性脂質／両親性ブロック共重合体ミセルのサイズ測定及びｓｉＲＮＡの封入確認
ｓｉＲＮＡ／カチオン性脂質含有両親性ブロック共重合体がナノ粒子を形成するかどうかを確認するために、動的光散乱（ＤＬＳ；Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）方法により、水溶液においてｓｉＲＮＡ／ＡＣ−コレステロール／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ高分子ミセルと、ｓｉＲＮＡ／ＡＣ−コレステロール／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール高分子ミセルのサイズを測定して表２に記載した。

光源として出力１０ｍＶ、波長６３８ｎｍのヘリウム−ネオンレーザーを使用し、９０℃の入射光を使用し、実験は２５℃において行った。測定と分析は、大塚電子株式会社製のＥＬＳ−８０００装備を用いて行った。

変形されたブライ‐ダイアー抽出法を用いて製造されたｓｉＲＮＡ／カチオン性脂質含有両親性ブロック共重合体ミセルにおいてｓｉＲＮＡを定量した。

各実施例に従い製造された高分子ミセル伝達体を５０ｍＭソジウムホスファート（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、７５ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．５）溶液に溶かし、ブライ‐ダイアー単一相を形成した後、１００ｍＭソジウムホスファート、１５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．５）及びクロロホルムにより抽出して水溶液層のｓｉＲＮＡをリボグリーン（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ）試薬（インビトロジェン社製）により定量した。

測定の結果、製造時に使用したｓｉＲＮＡ量の９０％以上を抽出することができた。

［実験例２］ｓｉＲＮＡ／ＡＣ−コレステロール／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール高分子ミセルに対する血中安定性評価
ｓｉＲＮＡ／ＡＣ−コレステロール／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール高分子ミセルがｓｉＲＮＡを血中においていかに安定的に保護するかを調べるために、血清においてｓｉＲＮＡの半減期を測定した。３７℃、５０％血清において実施例１０の高分子ミセル（高分子ミセル１）及び実施例１１の高分子ミセル（高分子ミセル２）を表３に記載した時間をかけて培養した後、次の方法によりｓｉＲＮＡの量を定量して半減期を計算した。

高分子ミセルのｓｉＲＮＡ総量を測定するために、実験例１における変形されたブライ‐ダイアー抽出法を行った。測定結果は、下記表３に示す。

表３を参照すれば、未封入ｓｉＲＮＡの半減期は２８．４分であるのに対し、実施例１０の高分子ミセル１に封入されたｓｉＲＮＡの半減期は１２６分、実施例１１の高分子ミセル２に封入されたｓｉＲＮＡの半減期は１９２．５分であり、未封入の場合と比較して半減期がそれぞれ４．４倍、６．８倍増加していることが確認できた。表３から、ｓｉＲＮＡを高分子ミセルに封入することにより、ｓｉＲＮＡを血中において安定化させることができるということが確認できた。

［実験例３］ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ−コレステロール／ＡＣ−コレステロール／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール高分子ミセルのＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）に対する安定性評価
ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ−コレステロール／ＡＣ−コレステロール／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール含有組成物が、ｓｉＲＮＡをＲＮａｓｅからいかに安定的に保護するかを調べてみた。実施例１１の高分子ミセル（高分子ミセル２）及び実施例１２のｓｉＲＮＡ−コレステロール高分子ミセル（高分子ミセル３）を１０ＵのＲＮａｓｅ Ｖ１（プロメガ社製）と表４に記載の時間をかけて培養後、実験例１の方法と同様にしてｓｉＲＮＡの量を定量した。測定結果は、下記表４に示す。

表４を参照すれば、未封入ｓｉＲＮＡはＲＮａｓｅを処理してから４０分以内に完全に分解されるのに対し、ｓｉＲＮＡを高分子ミセルに封入すれば、ＲＮａｓｅを処理してから１３０分が経過しても約４０％が安定的に残留していることが分かった。一方、ｓｉＲＮＡ−コレステロールは、未封入の状態でｓｉＲＮＡよりもやや安定性が高く、ｓｉＲＮＡ−コレステロールを高分子ミセル（高分子ミセル３）に封入する場合にｓｉＲＮＡを高分子ミセルに封入（高分子ミセル２）したときよりも安定性が大幅に増加することが分かった。表４から、ｓｉＲＮＡを高分子ミセルに封入することにより、ｓｉＲＮＡをＲＮａｓｅから安定化させることができ、この効果は、ｓｉＲＮＡ−コレステロールの場合に一層高いことが分かる。

［実験例４］ｓｉＲＮＡ／ＡＣ−コレステロール／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール高分子ミセルに対する活性（タンパク質レベル）評価
ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ；緑色蛍光タンパク質）を発現するＡ５４９ＧＦＰ細胞株［通常、Ａ５４９細胞株（ＡＴＣＣ）から製造される］に実施例１０及び１１のＧＦＰ ｓｉＲＮＡ／ＡＣ−コレステロール／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール高分子ミセルを処理した。しかる後、ＧＦＰタンパク質の発現により現れる蛍光を測定することにより、高分子ミセルの細胞内伝達能を測定した。

ＧＦＰ ｓｉＲＮＡ／ＡＣ−コレステロール／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール含有組成物の組成は、下記表５に示す通りである。

９６ウェル細胞培養板に１×１０^４個の細胞を分株し、２４時間後に、１０％血清の存在下において３０ｎＭのｓｉＲＮＡを２４時間かけて処理した後、培地を交換した。さらに２４時間後に、ＧＦＰ蛍光をＥＬＩＳＡリーダー器により測定（励起波長：４８５／２０ｎｍ、放射波長：５２８／２０ｎｍ）した。測定結果は下記表６に示す。対照群は、リン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）のみを処理したものである。

表６は、ＧＦＰ蛍光を測定した後にＳＲＢアッセイにより細胞生存率（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を求め、ＧＦＰ蛍光値を細胞生存率で割って補正した結果である。表６から、ＧＦＰタンパク質発現を約３０〜４０％抑えたことが分かった。

［実験例５］ｓｉＲＮＡ／ＡＣ−コレステロール／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール高分子ミセルに対する活性（ｍＲＮＡレベル）評価
実験例４の組成物１〜３に対して、ｓｉＲＮＡ／ＡＣ−コレステロール／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール高分子ミセルの活性をｍＲＮＡレベルにおいて確認した。高分子ミセルを実験例４と同じ条件下で処理するが、ｓｉＲＮＡの投与濃度を１５ｎＭ及び３０ｎＭと異ならせた。細胞に高分子ミセルを処理し、４８時間が経過したタイミングにおいて、ＧＦＰ ｍＲＮＡとＧＡＰＤＨｍＲＮＡを定量ＲＴ−ＰＣＲしてＧＦＰ ｍＲＮＡを比較定量した。対照群は、リン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）のみを処理したものである。定量した結果は、下記表７に示す。

表７には、ｍＲＮＡの発現量に基づくｓｉＲＮＡ／ＡＣ−コレステロール／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール高分子ミセル伝達体の活性を示す。表７から、投与量に比例してＧＦＰ ｍＲＮＡの量が減少し、特に、３０ｎＭにおいてＧＦＰ ｍＲＮＡを９０％以上抑制したことが分かった。

［実験例６］ｓｉＲＮＡ高分子ミセルとリポフェクタミンの活性比較実験
ｓｉＲＮＡ／ＡＣ−コレステロール／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール高分子ミセルの活性と、核酸の細胞伝達のために商業的に広く使われる試薬であるリポフェクタミン（インビトロジェン社製）の活性をタンパク質レベルにおいて比較した。実験は、実験例４の組成物１に対して実験例４の方法と同様にして行った。対照群は、リン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）のみを処理したものである。実験結果は、下記表８に示す。

表８は、タンパク質発現量に基づくｓｉＲＮＡ高分子ミセル伝達体とリポフェクタミンの活性比較を示す結果である。表８から、ｓｉＲＮＡ高分子ミセル伝達体は、リポフェクタミンとほとんど同じレベルまでＧＦＰタンパク質の発現を抑制しつつも、さらに高い細胞生存率を示すことが分かった。これは、ｓｉＲＮＡ高分子ミセル伝達体の方が、リポフェクタミンよりも毒性に対する活性に一層優れていることを意味する。

［実験例７］ｓｉＲＮＡ／ＡＣ−コレステロール／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール高分子ミセルの生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）活性
ｓｉＲＮＡ／ＡＣ−コレステロール／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール高分子ミセルが、生体内において、使用したｓｉＲＮＡの対象遺伝子血管内皮増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）を抑え得るかどうかを確認した。

無毛マウス（財団法人実験動物中央研究所から提供）にＡ５４９肺ガン細胞株（ＡＴＣＣ）を皮下に注入して癌誘発マウスを製造した。実施例１２のＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ／ＡＣ−コレステロール／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール高分子ミセルを癌モデルマウスに１．５ｍｇ／ｋｇの容量にて静脈投与した後、４８時間後に癌組織を摘出した。摘出された癌組織を粉砕して、ＶＥＧＦタンパク質の量をＥＬＩＳＡにより分析した。ＥＬＩＳＡ分析方法は、キット製造社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）の指示に準拠した。対照群としては、生理食塩水を投与した。実験結果は、表９に示す。

表９は、ｓｉＲＮＡ高分子ミセル伝達体を癌モデルマウスに静脈注射した後、癌組織におけるターゲット遺伝子の抑制率を示すものである。ｓｉＲＮＡ高分子ミセル伝達体は、癌組織においてＶＥＧＦタンパク質の量を約４３％抑えた。表９から、ｓｉＲＮＡ高分子ミセル伝達体を用いたｓｉＲＮＡの全身伝達が可能であることが分かった。

［実験例８］ｓｉＲＮＡ−コレステロール／ＡＣ−コレステロール／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール高分子ミセルの生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）活性
実施例１２のＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ−コレステロール／ＡＣ−コレステロール／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール高分子ミセルを使用した以外は、実験例７の方法と同様にして実験を行った後、ＶＥＧＦの濃度を分析した。対照群としては、生理食塩水を使用した。実験結果は、表１０に示す。

表１０は、ｓｉＲＮＡ−コレステロール高分子ミセル伝達体を癌モデルマウスに静脈注射した後、癌組織におけるターゲット遺伝子の抑制率を示すものである。ｓｉＲＮＡ−コレステロール高分子ミセル伝達体は、癌組織においてＶＥＧＦタンパク質の量を約６８％抑制した。表１０から、ｓｉＲＮＡ−コレステロール高分子ミセル伝達体を用いたｓｉＲＮＡの全身伝達が可能であることが分かった。

［実験例９］ｓｉＲＮＡ／ＡＣ−コレステロール／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール／ＤＯＰＥ高分子ミセルに対する活性（タンパク質レベル）評価
ｓｉＲＮＡ／ＡＣ−コレステロール／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール高分子ミセルにＤＯＰＥを添加したときに活性に及ぼす影響を調べてみた。実施例１２のＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ配列を用い、実施例１３の方法と同様にして、ＤＯＰＥを含む高分子ミセルを製造した。前記ミセルと実施例１２のＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ／ＡＣ−コレステロール／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール高分子ミセルをそれぞれＡ５４９細胞株に実験例４の方法と同様にして処理した。培地を回収して培地内に放出されたＶＥＧＦの濃度を実験例７に記載の方法により測定し、リン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）のみを処理した対照群に対して補正した。測定結果は、下記表１１に示す。

表１１は、ｓｉＲＮＡ高分子ミセルを処理した後、培地内に放出されたＶＥＧＦタンパク質の濃度を定量したものである。表１１から、ｓｉＲＮＡ高分子ミセルにＤＯＰＥを添加することにより、ｓｉＲＮＡ活性が２０．９％から６１．２％へと大幅に増加することが分かった。

Claims (20)

1. 有効成分としてのアニオン性薬物と、
   カチオン性脂質と、
   両親性ブロック共重合体と、
   を含み、
   水溶液上において両親性ブロック共重合体のミセル粒子を形成し、
   前記アニオン性薬物は、前記カチオン性脂質と複合体を形成し、前記複合体は、両親性ブロック共重合体のミセル構造の内部に封入されていることを特徴とし、前記両親性ブロック共重合体は、親水性Ａブロック及び疎水性ＢブロックからなるＡ−Ｂ型二重ブロック共重合体であり、前記親水性Ａブロックは、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド及びその誘導体よりなる群から選ばれるいずれか一種以上のものであり、疎水性Ｂブロックは、ポリエステル、ポリアンヒドリド、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル及びポリホスファゼンよりなる群から選ばれるいずれか１種以上のものである、アニオン性薬物伝達用組成物。
2. 前記アニオン性薬物は核酸物質であることを特徴とする請求項１に記載のアニオン性薬物伝達用組成物。
3. 前記核酸物質は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、アンチセンスＯＤＮ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、アンチセンスＲＮＡ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ）、リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）及びＤＮＡザイム（ＤＮＡｚｙｍｅ）よりなる群から選ばれるいずれか一種以上であることを特徴とする請求項２に記載のアニオン性薬物伝達用組成物。
4. 前記核酸物質は、１以上の末端が、コレステロール、トコフェロール及び炭素数１０〜２４の脂肪酸よりなる群から選ばれるいずれか一種以上により修飾されていることを特徴とする請求項２に記載のアニオン性薬物伝達用組成物。
5. 前記カチオン性脂質は、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＴＡＰ）、１，２−ジアシル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＡＰ）、３ベータ−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−トリメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＴＣ−コレステロール）、３ベータ［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−コレステロール）、３ベータ［Ｎ−（Ｎ’−モノメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＭＣ−コレステロール）、３ベータ［Ｎ−（アミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＡＣ−コレステロール）、コレステリルオキシプロパン−１−アミン（ＣＯＰＡ）、Ｎ−（Ｎ’−アミノエタン）カルバモイルプロパノイックトコフェロール（ＡＣ−トコフェロール）及びＮ−（Ｎ’−メチルアミノエタン）カルバモイルプロパノイックトコフェロール（ＭＣ−トコフェロール）よりなる群から選ばれるいずれか一種以上である請求項１に記載のアニオン性薬物伝達用組成物。
6. 前記アニオン性薬物（Ｎ）とカチオン性脂質（Ｐ）との電荷量の比（Ｎ／Ｐ）は，０．１〜１２８であることを特徴とする請求項１に記載のアニオン性薬物伝達用組成物。
7. 前記親水性Ａブロックの数平均分子量は２００〜５０，０００ダルトンであり、疎水性Ｂブロックの数平均分子量は５０〜５０，０００ダルトンであることを特徴とする請求項１に記載のアニオン性薬物伝達用組成物。
8. 前記両親性ブロック共重合体の重量（ｂ）に対するアニオン性薬物及びカチオン性脂質複合体の重量（ａ）の比（ａ／ｂ×１００）は、０．００１〜１００重量％であることを特徴とする請求項１に記載のアニオン性薬物伝達用組成物。
9. リン脂質、コレステロール及びトコフェロールよりなる群から選ばれるいずれか一種以上の融合性脂質をさらに含む請求項１から請求項８のいずれかに記載のアニオン性薬物伝達用組成物。
10. 前記リン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ；ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ；ＰＣ）及びホスファチジン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）よりなる群から選ばれるいずれか一種以上であることを特徴とする請求項９に記載のアニオン性薬物伝達用組成物。
11. 前記融合性脂質は、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｌａｕｒｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルエタノールアミン（１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、１，２−ジフィタノイル−３−ｓｎ−ホスファチジルエタノールアミン（１，２−ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙｌ−３−ｓｎ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ｄｉｌａｕｒｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ｄｉｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ジリノレオイルホスファチジルコリン（ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、１，２−ジフィタノイル−３−ｓｎ−ホスファチジルコリン（１，２−ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙｌ−３−ｓｎ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ジラウロイルホスファチジン酸（ｄｉｌａｕｒｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、ジミリストイルホスファチジン酸（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、ジステアロイルホスファチジン酸（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、ジオレオイルホスファチジン酸（ｄｉｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、ジリノレオイルホスファチジン酸（ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジン酸（１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、１，２−ジフィタノイル−３−ｓｎ−ホスファチジン酸（１，２−ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙｌ−３−ｓｎ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、コレステロール及びトコフェロールよりなる群から選ばれるいずれか一種以上であることを特徴とする請求項９に記載のアニオン性薬物伝達用組成物。
12. （ａ）アニオン性薬物及びカチオン性脂質を、水混和性有機溶媒又は水溶液と有機溶媒との混合溶媒中に溶解させて相分離させる工程と、
    （ｂ）前記（ａ）工程における有機溶媒層を分離する工程と、
    （ｃ）前記（ｂ）工程における有機溶媒層に両親性ブロック共重合体を混合し、有機溶媒を除去する工程と、
    （ｄ）前記有機溶媒の除去された混合物に水溶液を添加してミセル化させる工程と、
    を含むことを特徴とするアニオン性薬物、カチオン性脂質及び両親性ブロック共重合体を含むアニオン性薬物伝達用組成物の製造方法であって、前記両親性ブロック共重合体は、親水性Ａブロック及び疎水性ＢブロックからなるＡ−Ｂ型二重ブロック共重合体であり、前記親水性Ａブロックは、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド及びその誘導体よりなる群から選ばれるいずれか一種以上のものであり、疎水性Ｂブロックは、ポリエステル、ポリアンヒドリド、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル及びポリホスファゼンよりなる群から選ばれるいずれか１種以上のものである、アニオン性薬物伝達用組成物の製造方法。
13. （ａ’）アニオン性薬物、カチオン性脂質及び両親性ブロック共重合体を、水混和性有機溶媒又は水溶液と有機溶媒との混合溶媒中に溶解させる工程と、
    （ｂ’）前記（ａ’）工程における有機溶媒層を除去する工程と、
    （ｃ’）前記（ｂ’）工程における有機溶媒の除去された混合物に水溶液を添加してミセル化させる工程と、
    を含むことを特徴とするアニオン性薬物、カチオン性脂質及び両親性ブロック共重合体を含むアニオン性薬物伝達用組成物の製造方法であって、前記両親性ブロック共重合体は、親水性Ａブロック及び疎水性ＢブロックからなるＡ−Ｂ型二重ブロック共重合体であり、前記親水性Ａブロックは、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド及びその誘導体よりなる群から選ばれるいずれか一種以上のものであり、疎水性Ｂブロックは、ポリエステル、ポリアンヒドリド、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル及びポリホスファゼンよりなる群から選ばれるいずれか１種以上のものである、アニオン性薬物伝達用組成物の製造方法。
14. 前記（ｄ）工程又は（ｃ’）工程後に、
    （ｅ）凍結乾燥補助剤を加えて凍結乾燥させる工程をさらに含むことを特徴とする請求項１２又は請求項１３に記載のアニオン性薬物伝達用組成物の製造方法。
15. 前記（ｃ）工程又は（ａ’）工程において融合性脂質を添加するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１２又は請求項１３に記載のアニオン性薬物伝達用組成物の製造方法。
16. 前記アニオン性薬物は、核酸物質であることを特徴とする請求項１２又は請求項１３に記載のアニオン性薬物伝達用組成物の製造方法。
17. 前記カチオン性脂質は、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジアシル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＴＡＰ）、１，２−ジアシル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジアシル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＡＰ）、３ベータ−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−トリメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＴＣ−コレステロール）、３ベータ［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−コレステロール）、３ベータ［Ｎ−（Ｎ’−モノメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＭＣ−コレステロール）、３ベータ［Ｎ−（アミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＡＣ−コレステロール）、コレステリルオキシプロパン−１−アミン（ＣＯＰＡ）、Ｎ−（Ｎ’−アミノエタン）カルバモイルプロパノイックトコフェロール（ＡＣ−トコフェロール）及びＮ−（Ｎ’−メチルアミノエタン）カルバモイルプロパノイックトコフェロール（ＭＣ−トコフェロール）よりなる群から選ばれるいずれか一種以上であることを特徴とする請求項１２又は請求項１３に記載のアニオン性薬物伝達用組成物の製造方法。
18. 前記アニオン性薬物（Ｎ）とカチオン性脂質（Ｐ）との電荷量の比（Ｎ／Ｐ）は、０．１〜１２８であることを特徴とする請求項１２又は請求項１３に記載のアニオン性薬物伝達用組成物の製造方法。
19. 前記両親性ブロック高分子の重量（ｂ）に対するアニオン性薬物及びカチオン性脂質複合体の重量（ａ）の比（ａ／ｂ×１００）は、０．００１〜１００重量％であることを特徴とする請求項１２又は請求項１３に記載のアニオン性薬物伝達用組成物の製造方法。
20. 有効成分としてのアニオン性薬物と、
    カチオン性脂質と、
    両親性ブロック共重合体と、
    を含み、
    前記アニオン性薬物は、前記カチオン性脂質と複合体を形成し、前記複合体は、両親性ブロック共重合体のミセル構造の内部に封入されていることを特徴とする組成物のアニオン性薬物の伝達用薬剤製造のための使用であって、前記両親性ブロック共重合体は、親水性Ａブロック及び疎水性ＢブロックからなるＡ−Ｂ型二重ブロック共重合体であり、前記親水性Ａブロックは、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド及びその誘導体よりなる群から選ばれるいずれか一種以上のものであり、疎水性Ｂブロックは、ポリエステル、ポリアンヒドリド、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル及びポリホスファゼンよりなる群から選ばれるいずれか１種以上のものである使用。