CN105362251B - DOTAP-mPEG-PLA纳米粒及其纳米粒溶液、载药复合物和制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药领域，具体涉及DOTAP‑mPEG‑PLA纳米粒及其纳米粒溶液、载药复合物和制备方法和应用。本发明所解决的技术问题是提供一种采用DOTAP修饰两亲性mPEG‑PLA双嵌段共聚物，利用自组装的方法制备出了一种新型的可降解性基因载体，即DOTAP‑mPEG‑PLA阳离子纳米粒，可简称为DPP纳米粒。本发明DPP纳米粒具有良好的DNA结合能力，可有效地将基因质粒导入到肿瘤细胞中，具有转染率高、细胞毒性低等优点。

Description

DOTAP-mPEG-PLA纳米粒及其纳米粒溶液、载药复合物和制备 方法和应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及DOTAP-mPEG-PLA纳米粒及其纳米粒溶液、载药复合物和制备方法和应用。

背景技术

基因导入系统在基因功能研究和基因治疗中有重要应用。目前使用的基因导入系统主要包括两大类：病毒载体和非病毒载体。病毒载体包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺病毒相关载体，可高效地将治疗基因传递到细胞内，但其规模生产难度大，可递送的基因容量小，易引起免疫反应，有潜在的生物安全风险。非病毒基因载体包括脂质体、阳离子纳米粒、无机纳米粒子载体等，具有免疫原性低，安全性较好，易大规模生产等特点，是当前基因导入系统研究的热点。

甲氧基聚乙二醇-聚乳酸(Methoxy poly(ethylene glycol)-poly(lactide)，简称mPEG-PLA)双嵌段聚合物是一种可降解、生物相容性好的两亲性聚合物，在生物医学领域有重要的应用。在20世纪90年代，含有PEG或PLA传输载体装载的药物已获得了美国FDA的批准应用于临床。mPEG-PLA共聚物含有亲水嵌段PEG和疏水嵌段PLA，可在水溶液中自组装成纳米颗粒，在药物、基因导入系统中有很好的应用前景。目前，mPEG-PLA双嵌段聚合物纳米粒载体包裹的紫杉醇制剂已在韩国和欧洲应用于乳腺癌的临床治疗，在美国也已进入II期临床试验。在将PEG-PLA纳米粒用于基因导入系统时，单纯采用mPEG-PLA纳米粒装载基因的难度大，且转染效率低。进一步对mPEG-PLA纳米粒进行物理或化学修饰，可制备出具有易装载基因、转染效率高、毒性低、可降解的新型纳米粒，在基因导入中有重要的应用，在基因功能研究、基因治疗研究及临床应用中有很好的应用前景。

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供一种新的修饰手段用以修饰mPEG-PLA双嵌段共聚物，发明人采用DOTAP修饰两亲性mPEG-PLA双嵌段共聚物，利用自组装的方法制备得到新型的可降解性基因载体，即DOTAP-mPEG-PLA阳离子纳米粒，可简称为DPP纳米粒。本发明DPP纳米粒具有良好的DNA结合能力，可有效地将基因质粒导入到肿瘤细胞中，具有转染率高、细胞毒性低等优点。

本发明中所采用的两亲性阳离子物质DOTAP，化学命名为(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵，简称DOTAP。

本发明中所采用的两亲性mPEG-PLA共聚物，甲氧基聚乙二醇-聚乳酸，简称mPEG-PLA。甲氧基聚乙二醇-聚乳酸纳米颗粒具有两亲性、良好的生物可降解性和生物相容性、避免了吞噬细胞吞噬、增加了药物在血液中的循环时间和生物利用度，持续释放和靶向传递从而增加了药效、减小了副作用。mPEG-PLA纳米粒不仅可以作为化学药物、蛋白质和疫苗等的载体，同时也可以作为基因药物的载体。

本发明利用自组装的方法制备DOTAP-mPEG-PLA纳米粒，按照下述配比关系取原料、溶剂进行制备：

原料：mPEG-PLA共聚物与DOTAP的质量比为：mPEG-PLA共聚物70-99份、DOTAP1-30份；

溶剂：二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、四氯甲烷、乙醇、甲醇、乙醚、戊烷、乙酸乙酯、环己烷等易挥发的溶剂中的至少一种；

水化溶液：双蒸水、去离子水、纯水、生理盐水；

制备方法：mPEG-PLA共聚物、DOTAP分别溶于溶剂中，然后将溶剂蒸发，加适量水化溶液水化直到完全溶解，所得溶液即为DPP纳米粒溶液。

将所述透明液体干燥即得DOTAP-mPEG-PLA纳米粒。

进一步优选的，本发明DPP纳米粒，按照下述配比关系取原料进行制备：

原料：mPEG-PLA共聚物与DOTAP的质量比为：mPEG-PLA共聚物85-95份、DOTAP 5-15份。

上述技术方案中，溶剂用量以能够溶解原料即可。

本发明DOTAP-mPEG-PLA纳米粒的平均粒径为73±6nm，平均电位为+46±2mV，具备良好的DNA结合能力。与金标转染材料PEI 25K相比，本发明DPP纳米粒具有更高的转染能力和较低的细胞毒性。

本发明DOTAP-mPEG-PLA纳米粒可用于负载活性成分，尤其是基因、化学药物、蛋白质和疫苗，得到DOTAP-mPEG-PLA纳米粒复合物。

DOTAP-mPEG-PLA纳米粒属生物可降解性阳离子纳米粒，是一种新型基因导入系统非病毒载体。该纳米粒能通过静电相互作用结合DNA，可以有效地将目的基因或化学药物、蛋白质和疫苗等活性成分导入肿瘤细胞中，其本身具有细胞毒性低、转染率高等特征。

如，可以采用DOTAP-mPEG-PLA纳米粒传递水泡口炎病毒基质蛋白(VSVMP)基因质粒，即采用DOTAP-mPEG-PLA纳米粒负载VSVMP得到VSVMP/DPP复合物。

本发明VSVMP/DPP复合物，包括下述配比关系的原料及辅料：

原料：DOTAP-mPEG-PLA纳米粒与VSVMP质量比为：DOTAP-mPEG-PLA纳米粒1-99份，VSVMP 1份；

渗透压调节剂适量，用量以配制所得VSVMP/DPP复合物达到生理渗透压即可；

溶剂：注射用水、双蒸水、去离子水、纯水或生理盐水；

制备方法如下：

将上述原料及溶剂按照渗透压调节剂、溶剂、DOTAP-mPEG-PLA纳米粒和VSVMP依次混合即得VSVMP/DPP复合物溶液，所得溶液达到生理渗透压。

进一步优化，本发明VSVMP/DPP复合物按照下述配比关系取原料进行制备：

所述VSVMP/DPP复合物，包括下述配比关系的原料及辅料：原料：DOTAP-mPEG-PLA纳米粒与VSVMP质量比为DOTAP-mPEG-PLA纳米粒90-99份，VSVMP 1-10份。

发明人发现利用DOTAP-mPEG-PLA纳米粒传递VSVMP基因质粒可应用于体外和体内治疗卵巢癌：

在体外，发明人用MTT法检测VSVMP/DPP复合物对SKOV3卵巢癌细胞生长的抑制作用，并用流式细胞术检测VSVMP/DPP复合物诱导细胞凋亡情况。发明人发现利用DPP纳米粒介导VSVMP基因质粒进入SKOV3卵巢癌细胞中，DPP/VSVMP复合物通过诱导凋亡可以明显抑制SKOV3细胞的生长。

在体内，发明人建立人卵巢癌裸鼠腹腔种植瘤模型，比较各组裸鼠腹腔肿瘤结节的重量和数目，以及腹水产生的差异。发明人发现DPP/VSVMP复合物可以显著地减少小鼠肿瘤的负荷和腹水的产生。体外体内治疗数据表明，DPP纳米粒传递VSVMP基因可以在体外和体内有效抑制人卵巢癌肿瘤细胞SKOV3的生长。

本发明通过自组装法制备出了一种新型的可降解阳离子纳米粒：DOTAP-mPEG-PLA，该纳米粒可通过静电相互作用结合DNA，可有效地将基因导入到肿瘤细胞中，具有基因转染率高、细胞毒性低等特点，在基因导入中有重要的应用，在基因功能研究、基因治疗研究及临床应用中有很好的应用前景。DOTAP-mPEG-PLA纳米粒可介导基因等活性成分发挥疗效，如DOTAP-mPEG-PLA纳米粒介导VSVMP基因可以在体外和体内有效抑制人卵巢癌细胞的生长。DPP纳米粒是一种相对安全的可降解性非病毒基因载体，制备所得VSVMP/DPP复合物为治疗卵巢癌提供了一种新的思路和潜在的选择。

附图说明

图1(A)mPEG-PLA的分子结构式；(B)DOTAP的分子结构式。

图2 DPP纳米粒的结构示意图。

图3 DPP纳米粒的粒径及电位分布图：(A)DPP纳米粒的粒径分布图；(B)DPP纳米粒的电位分布图。

图4 DPP纳米粒的扫描透射电镜照片。

图5 DPP纳米粒凝胶阻滞分析：当DPP与DNA的质量之比为15:1时，DPP纳米粒可以完全结合DNA质粒。

图6 DPP纳米粒细胞毒性检测：(A)在293T细胞中，DPP纳米粒的细胞毒性低于PEI25K；(B)在SKOV3细胞中，DPP纳米粒的细胞毒性低于PEI 25K。

图7 DPP纳米粒与PEI 25K对293T细胞的转染率：pGFP质量为2μg，DPP纳米粒和PEI25K与pGFP质粒的质量之比为分别为25:1和1:1，DPP纳米粒对293T细胞的转染稍高于PEI25K：(A)DPP纳米粒转染293T细胞的白光图；(B)与(A)同一视野的绿色荧光图；(C)(D)DPP纳米粒与PEI 25K对293T细胞转染的流式图和转染率。

图8 DPP纳米粒与PEI 25K对SKOV3细胞的转染率：pGFP质量为2μg，DPP纳米粒和PEI 25K与pGFP质粒的质量之比为分别为25:1和1:1，DPP纳米粒对SKOV3细胞的转染率明显高于PEI 25K：(A)DPP纳米粒转染SKOV3细胞的白光图；(B)与(A)同一视野的绿色荧光图；(C)(D)DPP纳米粒与PEI 25K对SKOV3细胞转染的流式图和转染率。

图9 VSVMP/DPP复合物体外对SKOV3细胞的抗肿瘤能力：(A)VSVMP/DPP复合物可以明显抑制肿瘤细胞的生长；(B)VSVMP/DPP复合物是通过诱导细胞凋亡来抑制肿瘤细胞的生长，*：P<0.05，差异具有统计学意义。

图10 荷瘤裸鼠肿瘤结节重量和腹水产生体积统计分析:VSVMP/DPP复合物明显抑制了肿瘤的生长和腹水的产生：(A)VSVMP/DPP复合物治疗组的肿瘤重量明显低于其他三组，*：P<0.01,差异具有统计学意义；(B)VSVMP/DPP复合物治疗组的腹水体积少于其他三组，**：P<0.05,差异具有统计学意义。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，说明但不限制本发明。

mPEG-PLA和DOTAP的分子结构式见图1，DPP纳米粒通过mPEG-PLA和DOTAP自我组装的方法制备而成，结构示意图见图2。

1.实验方法

1.1 DPP纳米粒及VSVMP/DPP复合物制备方法

1.1.1 DPP纳米粒的制备

DPP纳米粒通过自组装的方法制备而成：首先将mPEG-PLA共聚物(45mg)和DOTAP(5mg)分别溶于二氯甲烷溶液中，再转入烧瓶中混匀；然后连接旋蒸器，将混合溶液置于60℃水浴锅中，真空条件下旋蒸30分钟，使二氯甲烷蒸发完全，在圆底烧瓶底部形成一层透明薄膜。加适量双蒸水水化成所需浓度，60℃水浴轻轻振荡，直到完全溶解，所得溶液即为DPP纳米粒水溶液，置于4℃冰箱保存备用。

1.1.2 VSVMP/DPP复合物制备方法

原料：VSVMP 5μg；DOTAP-mPEG-PLA纳米粒125μg；50％葡萄糖

溶剂：双蒸水

制备方法如下：

将上述原料及溶剂按照葡萄糖、双蒸水、DOTAP-mPEG-PLA纳米粒、和VSVMP先后顺序混合在一起，且复合物最终葡萄糖浓度为5％。

1.2 DPP纳米粒的粒径、电位和形态学研究

1.2.1 DPP纳米粒的粒径、电位

DPP纳米粒的粒径和电位大小使用Zetasizer Nano ZS马尔文粒度仪(MalvernInstruments，Worcestershire，英国)检测，检测温度为25℃，检测前平衡2分钟。结果取3次测量的平均值。

1.2.2 DPP纳米粒的形态学研究

DPP纳米粒的形态学通过扫描透射电子显微镜(scanning transmissionelectron microsope,STEM)来观察。用毛细吸管吸取制备好的DPP纳米粒溶液滴在铜网膜上，经3-5分钟后，用滤纸吸去余水，然后将铜膜置于扫描透射电子显微镜下进行观察形态，并摄取照片。

1.3 DPP纳米粒与DNA结合能力的研究

用凝胶阻滞分析实验来检测DPP纳米粒的DNA结合能力。首先把不同质量比例(1:1,5:1,10:1,15:1,20:1,25:1)的DPP纳米粒和空载质粒(P-VAX)混合，质粒的质量为0.3μg，总体积为5ul，用加样枪轻轻吹打混合均匀，室温静置30分钟，上样前加入1ul DNA loadingdye。然后配制1％的琼脂糖凝胶，配胶过程中加入一定量的溴化乙锭染色剂。待琼脂糖凝胶形成后将静置完成后，上样，在100V电压下电泳30分钟。最后取出电泳条带在紫外灯的照射下进行观察并取图。

1.4 DPP纳米粒的细胞毒性检测

DPP纳米粒对SKOV3细胞、293T细胞的毒性作用通过细胞活力分析来检测。简单地说，(1)加药前一天，取对数期生长的SKOV3细胞和293T细胞，胰酶消化细胞制成细胞悬液，计数细胞，以5×10³个细胞/孔接种于96孔板，每孔加样100μl细胞悬浮液，放入37℃，5％CO₂细胞恒温培养箱中孵育24小时。(2)配制100μl一系列浓度(0μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml)的DPP纳米粒溶液和PEI 25K溶液，然后加入到96孔板中，每个浓度设6个复孔。加药完成后在37℃，5％CO₂细胞恒温培养箱中继续孵育48小时。(3)孵育完成后，每孔加入MTT试剂(5mg/ml)20μl，将细胞放入37℃，5％CO₂细胞恒温培养箱中避光孵育3-4小时后取出细胞，在倒置显微镜下观察细胞内紫蓝色结晶紫，颜色越深细胞活力越大。(4)最后弃掉培养基后，每孔加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，将96孔板置于摇床上振荡15分钟，振荡完成后将96孔板于酶标仪上在570nm波长处读取光吸收值(OD570)。

1.5 DPP纳米粒转染293T细胞和SKOV3细胞

(1)转染前一天，取对数期生长的SKOV3细胞和293T细胞，胰酶消化细胞制成细胞悬液，计数细胞，细胞密度为2-3×10⁵/孔，将SKOV3细胞和293T细胞接种于6孔板中，每孔加细胞悬浮液2ml。

(2)将2μg绿色荧光蛋白质粒(pGFP)稀释于50μl无血清无抗生素的DMEM培养基中，轻轻混匀。

(3)取制备好的DPP纳米粒50μg稀释于50μl无血清无抗生素的DMEM培养基中，轻轻混匀。取2μgPEI 25K溶液(1μg/μl)稀释于50μl无血清无抗生素的DMEM培养基中，轻轻混匀。

(4)分别混合稀释的GFP质粒和DPP纳米粒、PEI 25K(总体积为130μl)，注意将稀释的基因质粒加入到稀释的材料中，室温静置30分钟。

(5)将6孔板中的培养基吸出，用PBS洗涤细胞2次，加无血清无抗生素的DMEM培养基1ml。

(6)将GFP/DPP复合物、GFP/PEI 25K复合物加到孔板中，然后前后左右晃动混匀。

(7)将6孔板放入37℃，5％CO₂细胞恒温培养箱中孵育8小时后，移去无血清无抗生素培养基，换成有血清有抗生素的DMEM培养基2ml，放入孵箱继续孵育40小时。

(8)转染完成后将6孔板置于倒置荧光显微镜下观察转染后细胞内绿色荧光蛋白表达情况，并取图。

(9)收集细胞，行流式细胞术检测，确定转染率。

1.6检测VSVMP/DPP复合物在体外对SKOV3细胞的抗肿瘤活性

在体外主要用两种方法检测VSVMP/DPP复合物对SKOV3细胞的抗肿瘤活性：MTT法和流式细胞术。

1.6.1用MTT法检测VSVMP/DPP复合物对SKOV3细胞生长的抑制作用

(1)SKOV3细胞接种96孔板方法详见2.4(1)

(2)取1μg VSVMP质粒和空载P-VAX质粒分别稀释于25μl无血清无抗生素的DMEM培养基中，轻轻混匀。

(3)取25μg制备好的DPP纳米粒稀释于25μl无血清无抗生素的DMEM培养基中，轻轻混匀。

(4)分别混合稀释的VSVMP质粒、P-VAX质粒和DPP纳米粒(总体积65μl)，注意将稀释的基因加入到稀释的材料中，室温静置30min。

(5)将96孔板中的培养基吸出，用PBS洗涤细胞2次，加无血清无抗生素的DMEM培养基100μl。

(6)将65μl的VSVMP/DPP复合物、P-VAX/DPP复合物加到孔板中，同时将65μl体积的DPP材料和0.9％NS也加到孔板中，每组设6个复孔，然后前后左右晃动混匀。

(7)将96孔板放入37℃，5％CO₂细胞恒温培养箱中孵育8小时后，移去孔板中的培养基，换成有血清有抗生素的DMEM培养基200μl，放入孵箱继续孵育40小时。

(8)孵育完成后，每孔加入MTT试剂(5mg/ml)20μl，将细胞放入37℃，5％CO₂细胞恒温培养箱中避光孵育3-4小时，后取出细胞，在倒置显微镜下观察细胞内紫蓝色结晶紫，颜色越深细胞活力越大。

(9)最后弃掉培养基后，每孔加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，将96孔板置于摇床上振荡15分钟，振荡完成后将96孔板于酶标仪上在570nm波长处读取光吸收值(OD570)。

1.6.2用流式细胞术检测VSVMP/DPP复合物诱导SKOV3细胞的凋亡情况

(1)SKOV3细胞接种6孔板方法详见2.5.1

(2)取2μg VSVMP质粒和空载P-VAX质粒分别稀释于50μl无血清无抗生素的DMEM培养基中，轻轻混匀。

(3)取50μg制备好的DPP纳米粒稀释于50μl无血清无抗生素的DMEM培养基中，轻轻混匀。

(4)分别混合稀释的VSVMP质粒、P-VAX质粒和DPP纳米粒(总体积约130μl)，注意将稀释的基因加入到稀释的材料中，室温静置30分钟。

(5)将6孔板中的培养基吸出，用PBS洗涤细胞2次，加无血清无抗生素的DMEM培养基1ml。

(6)将130μl的VSVMP/DPP复合物、P-VAX/DPP复合物加到孔板中，同时将130μl体积的DPP材料和0.9％NS也加到孔板中，轻轻前后左右摇晃混匀。

(7)换液孵育的方法详见2.5.7

(8)转染完成后，将细胞收集于流式管中，用冷的PBS洗2遍，1500rpm 3分钟离心，然后用100μl结合缓冲液(binding buffer)重悬。

(9)在100μl细胞悬浮液中，加入5μl annexin V-FITC，再加入10μl PI试剂，用枪轻轻混匀，避光孵育15分钟(参照Biolegend公司annexin V-FITC/PI双染试剂盒说明书进行)。

(10)孵育完成后，行流式细胞术检测治疗组、空载组、材料组和生理盐水组的SKOV3细胞的凋亡情况。

1.7检测VSVMP/DPP复合物体内抗肿瘤能力

(1)人卵巢癌裸鼠腹腔种植瘤模型的建立：购买6-8周龄的雌性裸鼠20只，饲养在本实验室SPF级裸鼠房中。收集对数期生长的SKOV3细胞，用无血清无抗生素的DMEM培养基洗2遍，进行细胞计数，计数完成后用无血清无培养基的DMEM培养基制成细胞悬浮液。每只小鼠接种细胞量为1×10⁷细胞，腹腔注射细胞悬浮液200μl。

(2)随机分组：接种后的第3天，将裸鼠随机分为4组，每组5只，分别为实验组、空载组、材料组、生理盐水组。

(3)腹腔给药：分别取5μgVSVMP质粒和P-VAX空载质粒稀释于50％的葡萄糖溶液中(最终浓度为5％)，然后将稀释的VSVMP质粒和P-VAX质粒加入到制备好的DPP纳米粒溶液中，轻轻晃动摇匀，给药体系为200μl。制药完成后，将VSVMP/DPP复合物溶液、EP/DPP复合物溶液、DPP纳米粒溶液和生理盐水溶液(200μl)注射入小鼠腹腔内。

(4)每3天给药一次，共治疗8次。

(5)治疗完成后2周，用颈椎脱位法将小鼠处死，解剖小鼠腹腔，收集腹腔肿瘤和腹水，称量瘤重。

1.8统计学分析

实验数据以平均数±标准误来表示(mean±SD)，用SPSS17.0统计软件进行数据分析，主要运用求均值、t检验进行均数比较分析。P<0.05统计学有差异。

2结果

2.1 DPP纳米粒的特征

2.1.1 DPP纳米粒的粒径、电位和形态学

制备好的DPP纳米粒在扫描透射电镜下观察形态学。在扫描透射电镜下，DPP纳米粒是大小较为均一的球型颗粒，直径大小约45nm(图4)。DPP纳米粒的平均粒径为73±6nm，平均电位为+46±2mV。纳米粒的粒径分布和电位分布见图3A、3B。

2.1.2 DPP纳米粒与DNA的结合能力

我们用凝胶阻滞分析实验检测了DPP纳米粒的DNA结合能力，其结果见图5。当DPP与DNA的质量之比为15:1的时候，DNA质粒可以被DPP纳米粒完全结合。通过静电相互作用，带负电荷的DNA质粒被吸附在DPP纳米粒的表面，形成DNA/DPP复合物。由于表面带强大的正电荷，所以DPP纳米粒可以有效地结合DNA质粒。所以，当DPP与DNA的质量之比为15:1时，DPP纳米粒可以完全结合DNA。

2.2 DPP纳米粒的细胞毒性检测

为了检测DPP纳米粒的细胞毒性，我们将其与金标准转染材料PEI 25K的细胞毒性进行比较。在293T细胞和SKOV3细胞中，PEI 25K对两种细胞的毒性都很大，IC50<10μg/mL。而DPP纳米载体对这两种细胞的毒性要小很多，IC50>200μg/mL，结果见图6A、6B。

2.3 DPP纳米粒转染293T细胞和SKOV3细胞

同样，我们用DPP纳米粒转染了293T细胞和SKOV3细胞，并与PEI 25K进行了比较，选取绿色荧光蛋白质粒(pGFP)作为报告基因。

将转染后的293T细胞置于倒置荧光显微镜下观察，可以看出绝大部分细胞发出较强的绿色荧光，表明DPP纳米粒成功地将GFP质粒传递到了这些细胞中，结果见图7A、7B。然后将细胞收集行流式细胞术检测，从流式图和统计结果中可以看出DPP纳米粒的转染率稍高于PEI 25K的转染率(82.80±1.0％VS 78.96±0.9％)，结果见图7C、7D。

同样，将转染后的SKOV3细胞置于倒置荧光显微镜下观察，可以看出大部分细胞发出了较强的绿色荧光，表明DPP纳米粒成功地将GFP质粒传递到了这些细胞中，结果见图8A、8B。然后将细胞收起行流式细胞术检测，从流式图和统计结果中均可以看出DPP纳米粒的转染率明显高于PEI 25K的转染率(72.25±3.2％VS 37.7±0.6％)，结果见图8C、8D。从这些数据中可以看出，DPP纳米粒是一种新型的非病毒基因载体，具有可降解性、细胞毒性低且转染率高的特征，在基因治疗中有潜在的应用前景。

2.4 VSVMP/DPP复合物在体外对SKOV3细胞的抗肿瘤能力

为了检测VSVMP/DPP复合物在体外对SKOV3细胞的抗肿瘤能力，我们首先用MTT法检测VSVMP/DPP复合物是否抑制SKOV3细胞生长，结果见图9A，可以看出VSVMP/DPP复合物可以明显抑制肿瘤细胞的生长。当VSVMP/DPP复合物转染SKOV3细胞48小时后，我们用annexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂来检测VSVMP/DPP复合物是否是通过诱导细胞凋亡从而抑制肿瘤细胞的生长，通过流式细胞术检测结果，结果见图9B，可以看出在SKOV3细胞中，VSVMP/DPP实验组、EP/DPP空载组、DPP纳米粒材料组、生理盐水组诱导凋亡细胞百分比分别是30％、7.28％、6.73％和5.63％，VSVMP/DPP复合物诱导凋亡细胞数明显高于其他三组(空载组、材料组和生理盐水组)(P<0.05)。从体外抗肿瘤活性结果可以看出，DPP纳米粒可以有效地将VSVMP基因质粒有效转染到SKOV3细胞中，通过诱导凋亡从而抑制肿瘤细胞的增殖。

2.5 VSVMP/DPP复合物在体内对SKOV3细胞的抗肿瘤作用：VSVMP/DPP复合物抑制裸鼠腹腔移植瘤的生长

在小鼠SKOV3卵巢癌腹腔种植瘤模型中，经腹腔注射进行治疗，达到预期实验期间后，将老鼠处死。我们将小鼠腹腔的肿瘤结节取下，并进行肿瘤称重，结果见图10A，实验组、空载质粒组、材料组、对照组四个组的平均肿瘤重量分别是0.13g、0.50g、1.51g、1.88g，实验组的平均肿瘤重量明显低于空载质粒组、材料组和对照组(P<0.01)。同时收集小鼠腹腔腹水，并测量腹水体积，实验组、空载质粒组、材料组、对照组四个组的平均腹水体积分别是1.0±0.05ml、0.89±0.1ml、0.6±0.08ml、0.05±0.2ml，实验组的平均腹水产生体积也低于空载质粒组、材料组和对照组(P<0.05)，结果见图10B。

3.前期筛选试验：

3.1.在前期实验过程中，发明人将mPEG-PLA与DOTAP的重量比定为：99:1，90:10，,85:15，80:20，70:30，60:40制备DOTAP-mPEG-PLA纳米粒。然后对这些纳米粒进行细胞转染实验，发现DOTAP-mPEG-PLA的原料mPEG-PLA共聚物70-99份、DOTAP 1-30份在99:1～70:30的比例范围内有较好的转染效率。在此基础上进一步将mPEG-PLA与DOTAP的比例缩小至95:5～85:15的比例范围，然后进行细胞转染实验发现在此范围内有更高的转染效率。

3.2.在前期纳米基因药物的制备过程中，将基因在基因药物中的含量定为1％～50％，进行凝胶阻滞分析和细胞转染实验发现，在这个比例范围内基因能够有效结合DPP纳米粒并有较好的转染效率。

3.3.在前期的基础上，进一步将基因含量缩小至1％～10％，再次进行凝胶阻滞分析和细胞转染实验发现，在这个比例范围内基因能够高效的结合DPP纳米粒并有更好的转染效率。

3.4.制备纳米粒时，考察了溶解mPEG-PLA和DOTAP的溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、四氯甲烷、乙醇、甲醇、乙醚、戊烷、乙酸乙酯、环己烷等易挥发的溶剂，发现均可使mPEG-PLA和DOTAP完全溶解。

3.5.用于水化mPEG-PLA和DOTAP混合物的水化溶液可以为双蒸水、去离子水，纯水，生理盐水等，最终均可得到DPP纳米粒溶液。但优选采用双蒸水为水化溶液。

3.6.制备DPP纳米粒所需的mPEG-PLA共聚物中，mPEG和PLA的分子量比例为1:1，mPEG-PLA的总分子量范围为4000Da～8000Da。

综上，本发明提供了一种新的修饰手段用以修饰mPEG-PLA双嵌段共聚物，发明人采用带正电荷的两亲性物质DOTAP修饰两亲性mPEG-PLA双嵌段共聚物，利用自组装的方法制备出了一种新型的可降解性基因载体，即DOTAP-mPEG-PLA阳离子纳米粒。该纳米粒具有良好的DNA结合能力，可有效地将基因质粒导入到肿瘤细胞中，具有转染率高、细胞毒性低的优点。由DOTAP-mPEG-PLA纳米粒制备的DPP/VSVMP复合物可以显著地减少小鼠肿瘤的负荷和腹水的产生。体外体内治疗数据表明，DPP纳米粒传递VSVMP基因可以在体外和体内有效抑制人卵巢癌肿瘤细胞SKOV3的生长。在体外和体内有效抑制人卵巢癌细胞的生长。DPP纳米粒是一种相对安全的可降解性非病毒基因载体，制备所得VSVMP/DPP复合物为治疗卵巢癌提供了一种新的思路和潜在的选择。

Claims (4)

1.DOTAP-mPEG-PLA纳米粒复合物，其特征在于：将DOTAP-mPEG-PLA纳米粒负载基因，得到DOTAP-mPEG-PLA纳米粒复合物；所述基因为编码水泡口炎病毒基质蛋白的质粒VSVMP；DOTAP-mPEG-PLA纳米粒与VSVMP质量比为：DOTAP-mPEG-PLA纳米粒90-99份，VSVMP 1-10份；所述DOTAP-mPEG-PLA纳米粒由下述方法制备得到：

原料：mPEG-PLA共聚物与DOTAP的质量比为：mPEG-PLA共聚物70-99份、DOTAP 1-30份，所述mPEG-PLA共聚物中mPEG和PLA的分子量比例为1:1，mPEG-PLA的总分子量范围为4000Da～8000Da；

溶剂：二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、四氯甲烷、乙醇、甲醇、乙醚、戊烷、乙酸乙酯、环己烷中的至少一种；

水化溶液：双蒸水、去离子水、纯水、生理盐水；

制备方法：将mPEG-PLA共聚物、DOTAP分别溶于溶剂中，然后将溶剂蒸发，加适量水化溶液水化直到完全溶解，所得溶液即为DPP纳米粒溶液；干燥，即得DOTAP-mPEG-PLA纳米粒。

2.根据权利要求1所述的DOTAP-mPEG-PLA纳米粒复合物，其特征在于：所述原料：mPEG-PLA共聚物与DOTAP的质量比为：mPEG-PLA共聚物85-95份、DOTAP 5-15份。

3.权利要求1或2所述的DOTAP-mPEG-PLA纳米粒复合物的制备方法，其特征在于：

采用DOTAP-mPEG-PLA纳米粒负载VSVMP得到VSVMP/DPP复合物，所述VSVMP/DPP复合物，包括下述原料及辅料：原料：DOTAP-mPEG-PLA纳米粒与VSVMP；渗透压调节剂适量；

溶剂：注射用水、双蒸水、去离子水、纯水、生理盐水；

制备方法如下：

将上述原料及溶剂按照渗透压调节剂、溶剂、DOTAP-mPEG-PLA纳米粒和VSVMP依次混合即得VSVMP/DPP复合物溶液，所得溶液达到生理渗透压。

4.权利要求1或2所述DOTAP-mPEG-PLA纳米粒复合物在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。