CN106361724B - 一种20(R)-人参皂苷Rg3缓释纳米微球组合及其制备方法 - Google Patents

一种20(R)-人参皂苷Rg3缓释纳米微球组合及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人参皂苷Rg3缓释纳米微球组合物、其制备方法及其用途。本发明方法包药基质为聚乳酸‑羟基乙酸共聚物(PLGA)，以聚乙烯醇(PVA)为乳化剂，采用溶剂挥发法，经过纯化干燥，制备出再分散性良好的Rg3‑PLGA纳米粒子。干燥后为白色粉末，可长期保存。其表面光滑圆整，颗粒间无黏连，分散度好，大小均一，平均粒径大小为97.5nm。药物对PLGA材料有较高的亲和性，包封率高(94.3％)，具有良好的缓释性能，缓释期在4天以上。本纳米粒子可通过静脉注射和局部给药方式，用于抗肿瘤治疗应用前景广阔。

Description

一种20(R)-人参皂苷Rg3缓释纳米微球组合及其制备方法
技术领域
本发明为生物技术制药领域，涉及人参皂苷Rg3的一种缓释药物包裹的方法，以PLGA为载体包裹Rg3，采用溶剂挥发法，经过分离纯化和干燥，制备再分散性好的Rg3-PLGA缓释纳米粒子。该制备技术明显改善药物的水溶性，使药物缓释，到达了延长药物半衰期的目的。
背景技术
人参皂苷是人参的主要有效成分。20(R)-人参皂甙Rg3(简称Rg3)是从红参中微量提取的一种中药单体，其具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡、抗血管生成、抗转移、逆转肿瘤细胞耐药和增强肿瘤患者的免疫力等功能，目前应用于肿瘤的临床辅助治疗。
Rg3水溶性低，在一定程度上限制了Rg3的研究和应用。因此，改善Rg3的水溶性和提高Rg3的药物效率具有重要意义。
20(R)-人参皂苷Rg3药用水溶性中间体及制备方法(专利申请号：200610046618.7)中研发了一种以2-丙羟基-β-环糊精与20(R)-人参皂苷Rg3混合制成的水溶性中间体，可完全溶于水，不含残留有机剂的粉末，生物利用度明显提高。
此外，改变药物的剂型及药物修饰可以明显改变药物的水溶性、提高药物的稳定性和生物利用度，使给药方式多样化。其中，胶囊、缓释片、乳剂、滴丸等剂型均已经在人参皂苷专利中出现，但是，聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)为囊材包被Rg3制备缓释纳米粒子目前未被研究。
利用微囊化技术制备的微球/微囊、纳米球/纳米囊是一种有效的使药物缓释的手段，可提高口服药物的活性和生物利用度、通过非胃肠道给药显著延长药效、富集于靶器官和靶组织，降低全身毒副作用，对新药研制开发具有较大应用前景。
聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)是由乳酸和α-羟基乙酸按一定比例聚合成的可降解的高分子聚合物，具有良好的成囊和成膜性能、生物相容性及无毒性。作为药物传递载体，被广泛应用于制药、医用工程材料和现代化工业等领域。PLGA已通过FDA认证，被正式作为药用辅料收录进美国药典。
包载多烯紫杉醇的PLGA纳米粒子及其制备方法(专利申请号：201210408662.3)中用PLGA包载紫杉醇，制成PLGA纳米粒子，具有良好的包封率，提高了紫杉醇的溶解度和生物利用度，粒径大小约为198.7nm,包封率约为80.35％。
本发明利用溶剂挥发法，经过分离纯化和干燥，制备再分散性好的Rg3-PLGA缓释纳米粒，提高了药物的亲水性和稳定性，平均粒径大小为97.5nm；药物对PLGA囊材亲和性好，包封率高，包封率可达94.3％；释药平稳，可延长Rg3药物的作用时间及半衰期，缓释期在4天以上。
发明内容
本发明的目的是针对现有20(R)-人参皂苷Rg3药物制剂的制备过程中存在的技术问题，提供一种20(R)-人参皂苷Rg3缓释纳米微球的制备方法及由该方法制备的Rg3缓释纳米微球组合物。本发明方法中改进对药物20(R)-人参皂苷Rg3的包裹方法，以达到缓释给药，改善药物亲水性，延长药物半衰期，靶向给药，提高药物效率的目的。纳米粒大小均一，再分散性好，可通过局部给药和静脉注射方式。
为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种20(R)-人参皂苷Rg3缓释纳米微球组合物的制备方法，包括以聚乙烯醇为乳化剂，采用溶剂挥发法将人参皂苷Rg3包裹于聚乳酸-羟基乙酸共聚物(即PLGA)内。
其中，所述包裹20(R)-人参皂苷Rg3的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(即PLGA)中聚乳酸与羟基乙酸的质量百分比为90:10-50:50；所述PLGA的分子量在5×103-6×104。
特别是，所述20(R)-人参皂苷Rg3与所述PLGA的重量份配比为1:2-10，优选位1：3-10，进一步有选为1:4-10。
尤其是，所述20(R)-人参皂苷Rg3的含量≥1％，优选为≥60％，进一步优选为≥98％。
本发明另一方面提供一种人参皂苷Rg3缓释纳米微球组合物的制备方法，包括如下顺序进行的步骤：
1)将聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)溶于有机溶剂中，形成聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液(即PLGA油相)；将聚乙烯醇(PVA)溶于水中，形成聚乙烯醇(PVA)水溶液；
其中，步骤1)中所述的溶解聚乙烯醇的水选择注射用水，优选为三蒸水。
2)将20(R)-人参皂苷Rg3加入到PLGA油相中，均匀分散成Rg3-PLGA混合液；
3)将Rg3-PLGA混合液加入到聚乙烯醇水溶液中，在搅拌状态下进行超声波处理，制得Rg3-PLGA-PVA乳化液；
4)向Rg3-PLGA-PVA乳化液中加入固化剂，在搅拌状态下进行超声波处理，PLGA固化反应，并挥发混合物中的有机化合物，得到固化的Rg3-PLGA纳米粒溶液；
5)对固化的Rg3-PLGA纳米粒溶液进行离心处理，接着对Rg3-PLGA纳米粒进行清洗，即得。
其中，步骤1)中所述溶解聚乳酸-羟基乙酸共聚物的有机溶剂选择三氯甲烷或二氯甲烷，优选为三氯甲烷。
特别是，所述PLGA油相中PLGA的浓度为45-100mg/ml；所述聚乙烯醇水溶液的质量体积浓度为2.5-5.0％(m/v)。
尤其是，所述PLGA的重均分子量为5×103-6×104，优选为6×103-9×104；PLGA中乳酸与羟基乙酸的质量百分比为50-90:10-50；所述聚乙烯醇(PVA)的水解度为80％-90％，聚合链节数为1750±50，重均分子量为1.0-3.0×104。
尤其是，所述20(R)-人参皂苷Rg3的含量≥1％，优选为≥60％，进一步优选为≥98％。
特别是，所述Rg3-PLGA混合液呈上下颜色均一，不分层，无沉降，无聚结。
其中，步骤2)中所述的20(R)-人参皂苷Rg3的重量与所述PLGA油相中PLGA的重量之比为1:2-10，优选位1：3-10，进一步有选为1:4-10。
特别是，将20(R)-人参皂苷Rg3加入到PLGA油相中，搅拌，均匀分散成Rg3-PLGA混合液。
尤其是，所述搅拌速率为100-500rpm，优选为200-500rpm；搅拌时间为1-4h。
其中，步骤3)中所述Rg3-PLGA混合液与所述聚乙烯醇水溶液的体积之比为1:20-50，优选为1:20～35。
特别是，步骤3)中所述超声波处理时间为2-10min，优选为3-7.5min，进一步优选为3-6.5min。
尤其是，所述超声波处理选择间隙超声处理，超声波的脉冲时间为4～10s﹕5s(on/off)，优选为10s﹕5s(on/off)，即超声波持续发生时间为(on)4～10s，超声波停止发生时间(即间歇时间)(off)为5s。
特别是，所述搅拌状态的搅拌速率为100-600r/min，优选为300-500r/min；超声波处理过程中所述超声波的频率为20kHz；超声波处理过程中超声波的功率为5-60W。
尤其是，超声波处理过程中超声温度为25-60℃，优选为30-55℃，进一步优选为40-50℃；超声波处理时间为2-10min，优选为3-7.5min，进一步有选为3-6.5min。
其中，步骤4)中所述固化剂选择丙酮水溶液、石油醚、乙醚或氯仿中的一种或多种，优选为丙酮水溶液。
特别是，所述丙酮水溶液的体积百分比浓度为0.5-10％，优选为1-3％，进一步优选为1-2％，再进一步优选为2％。
特别是，所述固化剂与所述Rg3-PLGA-PVA乳化液的体积之比为50-55:50，优选为51-52:50。
尤其是，加入固化剂的过程中，温度为室温，压力为常压。
特别是，步骤4)中所述搅拌的速率为100-600r/min，优选为300-500r/min；搅拌过程中搅拌温度为20-60℃，优选为20-40℃，进一步优选为20-30℃。
尤其是，步骤4)中所述搅拌采用磁力搅拌方式，边搅拌边挥发有机化合物，搅拌时间为2-8h，优选为3-7h，进一步优选为4-8h。
特别是，所述超声波处理选择间隙超声处理，超声波的脉冲时间为4～10s﹕5s(on/off)，优选为10s﹕5s(on/off)，即超声波持续发生时间为(on)4～10s，超声波停止发生时间(即间歇时间)(off)为5s。
尤其是，超声波处理过程中超声温度为20-60℃，优选为20-40℃，进一步优选为20-30℃；超声波处理时间为2-8h，优选为3-7h，进一步优选为4-8h。超声波处理过程中所述超声波的频率为20kHz；超声波处理过程中超声波的功率为5-60W。
其中，步骤5)中所述离心处理过程中离心速率为12000-20000rpm；离心时间≥10min；离心过程中保持温度为0℃-4℃。
特别是，清洗处理采用三蒸水洗涤Rg3-PLGA纳米粒至少2-3次，优选为3次。
特别是，还包括步骤6)对清洗后的Rg3-PLGA纳米粒子进行冷冻干燥处理。
尤其是，将Rg3-PLGA纳米粒与支架剂溶液混合均匀后，再进行所述的冷冻干燥处理，获得Rg3-PLGA缓释纳米微球。
其中，所述的支架剂选择甘露醇溶液、葡萄糖溶液、乳糖溶液、麦芽糖溶液、蔗糖溶液、泊洛沙姆188溶液或甘氨酸溶液中的一种或多种。
特别是，支架剂溶液的质量百分比浓度为3-10％；所述Rg3-PLGA纳米粒与所述支架剂溶液的质量比为1:10-50，优选为1:20-45。
尤其是，所述的冷冻干燥处理步骤为：将Rg3-PLGA纳米粒与支架剂溶液混合均匀制成Rg3-PLGA-支架剂混匀液，分装；接着将分装后的Rg3-PLGA-支架剂混匀液置于冻干机中，开启冻干机，进行冷冻干燥，冷冻干燥过程中温度-时间设置程序为：
A、预冷：降温3±0.5h左右到-50℃，再保温2±0.5h；B、用20±0.5h从-50℃升
温至-15℃；再保温2±0.5h；C、用8±0.5h从-15℃升温至0℃，再保温2±0.5h；D、
用10±0.5h从0℃升温至30℃，再保温4±0.5h。
本发明再一方面提供一种按照上述方法制备而成的20(R)-人参皂苷Rg3缓释纳米微球组合物。
本发明又一方面提供一种上述20(R)-人参皂苷Rg3缓释纳米微球组合物在肿瘤靶向给药、抑制肿瘤生长方面的用途。
本发明具有如下优点：
1、本发明方法制备的20(R)-人参皂苷Rg3缓释纳米微球表面光滑圆整，无黏连，再分散性好，溶于水后可见淡蓝色乳光；而且本发明的纳米粒粒径小，平均粒径小于100nm，并且缓释纳米粒的粒径分布均匀，可以得到更好的制剂物理稳定性，更加强的组织和血浆蛋白亲和性，膜亲和性，对酶生物转化的敏感性。同时具有很好的对肝、脾或骨髓等部位的被动靶向性。因肿瘤的血管壁间隙约为100nm，对粒径小于100nm的粒子有生物通透性，从而载药纳米粒可从肿瘤有间隙的内皮组织血管中逸出而进入肿瘤内发挥疗效。
2、本发明方法制备20(R)-人参皂苷Rg3缓释纳米粒的药物的包封率高，达到86％以上，载药量达到70％以上，提高了进入纳米微球的药物量多，利于药物发挥有效的作用。
3、本发明制备20(R)-人参皂苷Rg3缓释纳米粒的方法，药物释放平稳，缓释期达到4天以上，可持续给药达4天以上；并且本发明的20(R)-人参皂苷Rg3缓释纳米粒可通过被动靶向富集癌细胞附近，提高药物效率，并通过体外实验检测Rg3-PLGA纳米粒对黑色素瘤A375P细胞的增殖具有明显抑制作用，并优于Rg3单独给药。
4、本发明方法制备的20(R)-人参皂苷Rg3缓释纳米粒通过PLGA包裹Rg3可有效改善药物的水溶性，PLGA与PVA的复合结构又可以阻止药物与水或人体体液中复杂成分的接触，提高药物的稳定性。
5、本发明的20(R)-人参皂苷Rg3缓释纳米粒粒子具有EPR效应(即实体瘤的高通透性和滞留效应，enhanced permeability and retention effect)，可被动靶向富集于实体瘤周围，增加了药效并减少了毒副作用。
6、本发明制备20(R)-人参皂苷Rg3缓释纳米粒的方法中通过调节Rg3-PLGA混合液与聚乙烯醇水溶液之间的比例，使得在超声处理乳化的过程中无破乳现象的产生，减少药品及囊材的损失，提高了包封率及回收率。
7、本发明制备20(R)-人参皂苷Rg3缓释纳米粒的方法中加入固化剂，可以诱导Rg3纳米粒的形成。丙酮等固化剂的加入可以使PLGA的溶解度降低，分子间形成氢键，最后从溶液中析出而凝聚成囊。
附图说明：
图1实施例1制备的Rg3-PLGA缓释纳米粒扫描电镜图；
图2实施例1制备的Rg3-PLGA缓释纳米粒粒径分布图；
图3实施例1制备的Rg3-PLGA缓释纳米粒冻干粉剂(缓释纳米微球组合物)；
图4实施例1制备的Rg3-PLGA缓释纳米微球组合物体外释药曲线；
图5实施例1制备的Rg3-PLGA缓释纳米微球组合物对黑色素瘤A375P细胞增殖的影响.
具体实施方式：
下面通过具体实施方式来进一步描述本发明所述配方的有益效果，这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的配方思路、用途范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中使用原料如下：
Figure BDA0000920143770000061
实施例1
1、配制聚乙烯醇水溶液
将1.25g PVA(聚乙烯醇)加入到50ml三蒸水(经过三次蒸馏后，收集的水)，95℃加热2h使其充分溶解，过滤，配制成质量体积比浓度为2.5％的聚乙烯醇水溶液(50ml)，常温保存，备用；
2、配制聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液(即PLGA油相)
将精确称取的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(即PLGA，0.09g)溶于2ml的三氯甲烷中，搅拌均匀，制成浓度为45mg/ml的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液(即PLGA油相，2ml)备用，其中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物中乳酸与羟基乙酸的质量百分比为50:50；其分子量在6×103；
3、配制Rg3-PLGA混合液
将20(R)-人参皂苷Rg3(含量为98％，0.018g)加入到2ml的PLGA油相，搅拌，均匀分散制成Rg3-PLGA混合液(油相，2ml)，其中，Rg3的重量与PLGA油相中的PLGA的重量之比为1:5；搅拌速率为300rpm，搅拌时间为2h；
4、超声乳化处理
将Rg3-PLGA混合液添加到50ml的聚乙烯醇水溶液(外水相)，接着置于超声波乳化分散器(上海汗诺仪器有限公司)，边搅拌边进行间歇超声波处理，超声波的脉冲时间为10s﹕5s(on/off)，即超声波持续发生时间为(on)10s，超声波停止发生时间(即间歇时间)(off)为5s，超声波处理时间为3min，其中控制超声波处理过程中的温度为45℃；搅拌速率为500r/min；超声波频率为20KHz；超声波功率为60W，制成Rg3-PLGA-聚乙烯醇乳化液，其中，油相与外水相的体积比为1:25，即Rg3-PLGA混合液与聚乙烯醇水溶液的体积之比为1:25。
5、固化处理
向Rg3-PLGA-聚乙烯醇乳化液中加入50ml的体积百分比浓度为2％的丙酮水溶液(即固化剂)，然后在室温下、在搅拌状态下进行超声波处理，PLGA和PVA发生固化，同时将混合物料中的有机溶剂物挥发，获得固化后的Rg3-PLGA纳米粒溶液，其中，控制超声波处理过程中的温度为20℃；搅拌速率为500r/min；超声波的脉冲时间为10s﹕5s(on/off)，即超声波持续发生时间为(on)10s，超声波停止发生时间(即间歇时间)(off)为5s，超声波处理时间为6h；Rg3-PLGA-聚乙烯醇乳化液与固化剂的体积之比为52:50；
本发明加入固化剂(丙酮溶液，丙酮水溶液加入水相中，诱导Rg3纳米粒的形成。丙酮等固化剂的加入可以使PLGA的溶解度降低，分子间形成氢键，最后从溶液中析出而凝聚成囊。
6、分离处理
将固化后的Rg3-PLGA纳米粒溶液置于冷冻离心机(HITACHI(日立)，Japan，CR22GIII)，于20000g 4℃下，进行离心处理，回收纳米粒，弃上清，纳米粒沉淀用三蒸水清洗3次，获得Rg3-PLGA纳米粒，4℃保存，备用；
采用扫描电镜对制得的Rg3-PLGA纳米粒进行电镜扫描，Rg3-PLGA缓释纳米粒的扫描电镜图如图1所示，从电镜扫描图可知，本发明制备的Rg3-PLGA纳米粒的粒径小，粒径分布均匀，采用粒径分析仪测定Rg3-PLGA纳米粒的粒径，测定结果如表1、图2所示，粒径分析仪中检测得平均粒径大小为97.5nm，PDI为0.283(PDI表示粒度分布的均匀性，越小越均匀。)。
按照如下步骤测定制备的Rg3-PLGA纳米粒包封率、载药量，具体操作步骤如下：
①将步骤6中获得的Rg3-PLGA纳米粒装入已知道重量的Eppendorf管中，减压蒸干水分，称量管总重量，再减去空管重，得回收的Rg3-PLGA纳米粒重量(M1)。
②将纳米粒溶解于二氯甲烷中，超声破碎，使纳米粒结构破坏，药物暴露出来。减压蒸干有机溶剂，再用甲醇萃取药物20(R)-Rg3，HPLC检测药物质量(M2)。其中，HPLC检测条件为：3.9×150mm C18的色谱柱；流动相乙腈：水(45:55)；柱温：30℃；流速：0.7ml/min；检测波长：203nm；进样体积20μl。
③计算包封率和载药量。
包封率＝[M2/(M1*0.018/0.09)]*100％
载药量＝M2/M1*100％
测定Rg3-PLGA纳米粒包封率为83.3％，载药量为16.7％。
7、冷冻干燥处理
7-1)将Rg3-PLGA纳米粒加入到支架剂甘露醇水溶液(质量百分比浓度为5％)中，其中Rg3-PLGA纳米粒与支架剂溶液的质量比为1:40，混合均匀，获得Rg3-PLGA-支架剂混匀液；
7-2)将Rg3-PLGA-支架剂混匀液灌装于10ml西林瓶中，每瓶装2ml；
7-3)将灌装完毕的西林瓶置于冻干机中，开启冻干机，冷冻干燥的温度-时间程序设置为：
A、预冷：降温3h左右到-50℃，再保温2h；B、用20h从-50℃升温至-15℃；再保温2h；C、用8h从-15℃升温至0℃，再保温2h；D、用10h从0℃升温至30℃，再保温4h，获得Rg3-PLGA缓释微球，如图3。
表1 Rg3-PLGA纳米粒粒径测定结果
Z-Average(nm)：97.50278 Derived Count Rate(kcps)：18.3224391937...
Standard Deviation：0 Standard Deviation：0
％Std Deviation：0 ％Std Deviation：0
Variance：0 Variance：0
Figure BDA0000920143770000091
实施例2
1、配制聚乙烯醇水溶液
将2.5g PVA(聚乙烯醇)加入到50ml三蒸水，95℃加热2h使其充分溶解，过滤，配制成质量体积浓度为5％的聚乙烯醇水溶液(50ml)，常温保存，备用；
2、配制聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液(即PLGA油相)
将精确称取的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(即PLGA，0.1g)溶于2ml的三氯甲烷中，搅拌均匀，制成浓度为50mg/ml的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液(即PLGA油相，2ml)备用，其中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物中乳酸与羟基乙酸的百分比为60:40,共聚物分子量在7×103；
3、配制Rg3-PLGA混合液
将20(R)-人参皂苷Rg3(含量为64％，0.025g)加入到2ml的PLGA油相，搅拌，均匀分散制成Rg3-PLGA混合液(油相，2ml)，其中，Rg3的重量与PLGA油相中的PLGA的重量之比为1:4；搅拌速率为200rpm，搅拌时间为3h。
4、超声乳化处理
将Rg3-PLGA混合液添加到50ml的聚乙烯醇水溶液(外水相)，接着置于超声波乳化分散器(上海汗诺仪器有限公司)，边搅拌边进行间歇超声波处理，超声波的脉冲时间为10s﹕5s(on/off)，即超声波持续发生时间为(on)10s，超声波停止发生时间(即间歇时间)(off)为5s，超声波处理时间为4min，其中控制超声波处理过程中的温度为50℃；搅拌速率为400r/min，制成Rg3-PLGA-聚乙烯醇乳化液，其中，油相与外水相的体积比为1:25，即Rg3-PLGA混合液与聚乙烯醇水溶液的体积之比为1:25。
本发明中超声波处理过程中超声波脉冲时间除了10s﹕5s(on/off)之外，脉冲时间为4-10s﹕5s(on/off)均适用于本发明。
5、固化处理
向Rg3-PLGA-聚乙烯醇乳化液中加入50ml的体积百分比浓度为2％的丙酮水溶液(即固化剂)，然后在室温下、在搅拌状态下进行超声波处理，PLGA和PVA发生固化，同时将混合物料中的有机溶剂物挥发，获得固化后的Rg3-PLGA纳米粒溶液，其中，控制超声波处理过程中的温度为30℃；搅拌速率为400r/min；超声波的脉冲时间为10s﹕5s(on/off)，即超声波持续发生时间为(on)10s，超声波停止发生时间(即间歇时间)(off)为5s，超声波处理时间为4h；Rg3-PLGA-聚乙烯醇乳化液与固化剂的体积之比为52:50；
本发明中超声波处理过程中超声波脉冲时间除了10s﹕5s(on/off)之外，脉冲时间为4-10s﹕5s(on/off)均适用于本发明。
6、分离处理
将固化后的Rg3-PLGA纳米粒溶液置于冷冻离心机(HITACHI(日立)，Japan，CR22GIII)，于20000g 4℃下，进行离心处理，回收纳米粒，弃上清，纳米粒沉淀用三蒸水清洗3次，获得Rg3-PLGA纳米粒，4℃保存，备用；
采用扫描电镜对制得的Rg3-PLGA纳米粒进行电镜扫描，从电镜扫描图可知，本发明制备的Rg3-PLGA纳米粒的粒径小，粒径分布均匀，采用粒径分析仪测定Rg3-PLGA纳米粒的粒径,粒径分析仪中检测得平均粒径大小为95.5nm，PDI为0.272。按照实施例1所述方法测定Rg3-PLGA纳米粒的包封率为87.5％，载药量为14.0％。
7、冷冻干燥处理
7-1)将Rg3-PLGA纳米粒加入到支架剂葡萄糖水溶液(质量百分比浓度为6％)中，其中Rg3-PLGA纳米粒与支架剂溶液的质量比为1:30，混合均匀，获得Rg3-PLGA-支架剂混匀液；
7-2)将Rg3-PLGA-支架剂混匀液灌装于10ml西林瓶中，每瓶装2ml；
7-3)将灌装完毕的西林瓶置于冻干机中，开启冻干机，冷冻干燥的温度-时间程序设置为：
A、预冷：降温3h左右到-50℃，再保温2h；B、用20h从-50℃升温至-15℃；再保温2h；C、用8h从-15℃升温至0℃，再保温2h；D、用10h从0℃升温至30℃，再保温4h，获得Rg3-PLGA缓释微球。
实施例3
1、配制聚乙烯醇水溶液
将1.5g PVA(聚乙烯醇)加入到50ml三蒸水，95℃加热2h使其充分溶解，过滤，配制成质量体积浓度为3％的聚乙烯醇水溶液(50ml)，常温保存，备用；
2、配制聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液(即PLGA油相)
将精确称取聚乳酸-羟基乙酸共聚物(即PLGA，0.12g)溶于2.5ml的三氯甲烷中，搅拌均匀，制成浓度为48mg/ml的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液(即PLGA油相，2.5ml)备用，其中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物中乳酸与羟基乙酸的百分比为80:20,其分子量在8×103；
3、配制Rg3-PLGA混合液
将20(R)-人参皂苷Rg3(含量为79％，0.02g)加入到2.5ml的PLGA油相，搅拌，均匀分散制成Rg3-PLGA混合液(油相，2.5ml)，其中，Rg3的重量与PLGA油相中的PLGA的重量之比为1:6；搅拌速率为500rpm，搅拌时间为1h。
4、超声乳化处理
将Rg3-PLGA混合液添加到50ml的聚乙烯醇水溶液(外水相)，接着置于超声波乳化分散器(上海汗诺仪器有限公司)，边搅拌边进行间歇超声波处理，超声波的脉冲时间为10s﹕5s(on/off)，即超声波持续发生时间为(on)10s，超声波停止发生时间(即间歇时间)(off)为5s，超声波处理时间为5min，其中控制超声波处理过程中的温度为50℃；搅拌速率为400r/min，制成Rg3-PLGA-聚乙烯醇乳化液，其中，油相与外水相的体积比为1:20，即Rg3-PLGA混合液与聚乙烯醇水溶液的体积之比为1:20。
5、固化处理
向Rg3-PLGA-聚乙烯醇乳化液中加入50ml的体积百分比浓度为2％的丙酮水溶液(即固化剂)，然后在室温下、在搅拌状态下进行超声波处理，PLGA和PVA发生固化，同时将混合物料中的有机溶剂物挥发，获得固化后的Rg3-PLGA纳米粒溶液，其中，控制超声波处理过程中的温度为30℃；搅拌速率为400r/min；超声波的脉冲时间为10s﹕5s(on/off)，即超声波持续发生时间为(on)10s，超声波停止发生时间(即间歇时间)(off)为5s，超声波处理时间为5h；Rg3-PLGA-聚乙烯醇乳化液与固化剂的体积之比为52:50；；
6、分离处理
将固化后的Rg3-PLGA纳米粒溶液置于冷冻离心机(HITACHI(日立)，Japan，CR22GIII)，于12000g 4℃下，进行离心处理，回收纳米粒，弃上清，纳米粒沉淀用三蒸水清洗3次，获得Rg3-PLGA纳米粒，4℃保存，备用；
采用扫描电镜对制得的Rg3-PLGA纳米粒进行电镜扫描，从电镜扫描图可知，本发明制备的Rg3-PLGA纳米粒的粒径小，粒径分布均匀，采用粒径分析仪测定Rg3-PLGA纳米粒的粒径,粒径分析仪中检测得平均粒径大小为93.1nm，PDI为0.234。按照实施例1所述方法测定Rg3-PLGA纳米粒的包封率为88.6％，载药量为11.7％。
7、冷冻干燥处理
7-1)将Rg3-PLGA纳米粒加入到支架剂泊洛沙姆188水溶液(质量百分比浓度为3％)中，其中Rg3-PLGA纳米粒与支架剂溶液的质量比为1:45，混合均匀，获得Rg3-PLGA-支架剂混匀液；
7-2)将Rg3-PLGA-支架剂混匀液灌装于10ml西林瓶中，每瓶装2ml；
7-3)将灌装完毕的西林瓶置于冻干机中，开启冻干机，冷冻干燥的温度-时间程序设置为：
A、预冷：降温3h左右到-50℃，再保温2h；B、用20h从-50℃升温至-15℃；再保温2h；C、用8h从-15℃升温至0℃，再保温2h；D、用10h从0℃升温至30℃，再保温4h，获得Rg3-PLGA缓释微球，
实施例4
1、配制聚乙烯醇水溶液
将1.4g PVA(聚乙烯醇)加入到50ml三蒸水，95℃加热2h使其充分溶解，过滤，配制成质量体积浓度为2.8％的聚乙烯醇水溶液(50ml)，常温保存，备用；
2、配制聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液(即PLGA油相)
将精确称取聚乳酸-羟基乙酸共聚物(即PLGA，0.2g)溶于2ml的三氯甲烷中，搅拌均匀，制成浓度为100mg/ml的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液(即PLGA油相，2ml)备用，其中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物中乳酸与羟基乙酸的百分比为90:10,其分子量在9×103；
3、配制Rg3-PLGA混合液
将20(R)-人参皂苷Rg3(含量为93％，0.025g)加入到2ml的PLGA油相，搅拌，均匀分散制成Rg3-PLGA混合液(油相，2ml)，其中，Rg3的重量与PLGA油相中的PLGA的重量之比为1:8；搅拌速率为300rpm，搅拌时间为4h。
4、超声乳化处理
将Rg3-PLGA混合液添加到50ml的聚乙烯醇水溶液(外水相)，接着置于超声波乳化分散器(上海汗诺仪器有限公司)，边搅拌边进行间歇超声波处理，超声波的脉冲时间为10s﹕5s(on/off)，即超声波持续发生时间为(on)10s，超声波停止发生时间(即间歇时间)(off)为5s，超声波处理时间为5.5min，其中控制超声波处理过程中的温度为40℃；搅拌速率为300r/min，制成Rg3-PLGA-聚乙烯醇乳化液，其中，油相与外水相的体积比为1:25，即Rg3-PLGA混合液与聚乙烯醇水溶液的体积之比为1:25。
5、固化处理
向Rg3-PLGA-聚乙烯醇乳化液中加入50ml的体积百分比浓度为1％的丙酮水溶液(即固化剂)，然后在室温下、在搅拌状态下进行超声波处理，PLGA和PVA发生固化，同时将混合物料中的有机溶剂物挥发，获得固化后的Rg3-PLGA纳米粒溶液，其中，控制超声波处理过程中的温度为20℃；搅拌速率为300r/min；超声波的脉冲时间为10s﹕5s(on/off)，即超声波持续发生时间为(on)10s，超声波停止发生时间(即间歇时间)(off)为5s，超声波处理时间为8h；Rg3-PLGA-聚乙烯醇乳化液与固化剂的体积之比为52:50；
6、分离处理
将固化后的Rg3-PLGA纳米粒溶液置于冷冻离心机(HITACHI(日立)，Japan，CR22GIII)，于20000g 0℃下，进行离心处理，回收纳米粒，弃上清，纳米粒沉淀用三蒸水清洗3次，获得Rg3-PLGA纳米粒，4℃保存，备用；
采用扫描电镜对制得的Rg3-PLGA纳米粒进行电镜扫描，从电镜扫描图可知，本发明制备的Rg3-PLGA纳米粒的粒径小，粒径分布均匀，采用粒径分析仪测定Rg3-PLGA纳米粒的粒径,粒径分析仪中检测得平均粒径大小为95.2nm，PDI为0.272。按照实施例1的测定方法测定Rg3-PLGA纳米粒的包封率为86.0％，载药量为10.0％。
7、冷冻干燥处理
7-1)将Rg3-PLGA纳米粒加入到支架剂麦芽糖水溶液(质量百分比浓度为8％)中，其中Rg3-PLGA纳米粒与支架剂溶液的质量比为1:20，混合均匀，获得Rg3-PLGA-支架剂混匀液；
7-2)将Rg3-PLGA-支架剂混匀液灌装于10ml西林瓶中，每瓶装2ml；
7-3)将灌装完毕的西林瓶置于冻干机中，开启冻干机，冷冻干燥的温度-时间程序设置为：
A、预冷：降温3h左右到-50℃，再保温2h；B、用20h从-50℃升温至-15℃；再保温2h；C、用8h从-15℃升温至0℃，再保温2h；D、用10h从0℃升温至30℃，再保温4h，获得Rg3-PLGA缓释微球。
实施例5
1、配制聚乙烯醇水溶液
将2g PVA(聚乙烯醇)加入到50ml三蒸水，95℃加热2h使其充分溶解，过滤，配制成质量体积浓度为4％的聚乙烯醇水溶液(50ml)，常温保存，备用；
2、配制聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液(即PLGA油相)
将精确称取聚乳酸-羟基乙酸共聚物(即PLGA，0.08g)溶于1ml的三氯甲烷中，搅拌均匀，制成浓度为80mg/ml的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液(即PLGA油相，1ml)备用，其中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物中乳酸与羟基乙酸的百分比为90:10,其分子量在9×103；
3、配制Rg3-PLGA混合液
将20(R)-人参皂苷Rg3(含量为85％，0.008g)加入到1ml的PLGA油相，搅拌，均匀分散制成Rg3-PLGA混合液(油相，1ml)，其中，Rg3的重量与PLGA油相中的PLGA的重量之比为1:10；搅拌速率为200rpm，搅拌时间为3h。
4、超声乳化处理
将Rg3-PLGA混合液添加到50ml的聚乙烯醇水溶液(外水相)，接着置于超声波乳化分散器(上海汗诺仪器有限公司)，边搅拌边进行间歇超声波处理，超声波的脉冲时间为10s﹕5s(on/off)，即超声波持续发生时间为(on)10s，超声波停止发生时间(即间歇时间)(off)为5s，超声波处理时间为6.5min，其中控制超声波处理过程中的温度为45℃；搅拌速率为500r/min，制成Rg3-PLGA-聚乙烯醇乳化液，其中，油相与外水相的体积比为1:50，即Rg3-PLGA混合液与聚乙烯醇水溶液的体积之比为1:50；
5、固化处理
向Rg3-PLGA-聚乙烯醇乳化液中加入50ml的体积百分比浓度为2％的丙酮水溶液(即固化剂))，然后在室温下、在搅拌状态下进行超声波处理，PLGA和PVA发生固化，同时将混合物料中的有机溶剂物挥发，获得固化后的Rg3-PLGA纳米粒溶液，其中，控制超声波处理过程中的温度为25℃；搅拌速率为500r/min；超声波的脉冲时间为10s﹕5s(on/off)，即超声波持续发生时间为(on)10s，超声波停止发生时间(即间歇时间)(off)为5s，超声波处理时间为5h；Rg3-PLGA-聚乙烯醇乳化液与固化剂的体积之比为51:50；
6、分离处理
将固化后的Rg3-PLGA纳米粒溶液置于冷冻离心机(HITACHI(日立)，Japan，CR22GIII)，于20000g 4℃下，进行离心处理，回收纳米粒，弃上清，纳米粒沉淀用三蒸水清洗3次，获得Rg3-PLGA纳米粒，4℃保存，备用；
采用扫描电镜对制得的Rg3-PLGA纳米粒进行电镜扫描，从电镜扫描图可知，本发明制备的Rg3-PLGA纳米粒的粒径小，粒径分布均匀，采用粒径分析仪测定Rg3-PLGA纳米粒的粒径,粒径分析仪中检测得平均粒径大小为93.7nm，PDI为0.259。按照实施例1的测定方法测定Rg3-PLGA纳米粒的包封率为88.2％，载药量为7.5％。
7、冷冻干燥处理
7-1)将Rg3-PLGA纳米粒加入到支架剂乳糖水溶液(质量百分比浓度为10％)中，其中Rg3-PLGA纳米粒与支架剂溶液的质量比为1:10，混合均匀，获得Rg3-PLGA-支架剂混匀液；
7-2)将Rg3-PLGA-支架剂混匀液灌装于10ml西林瓶中，每瓶装2ml；
7-3)将灌装完毕的西林瓶置于冻干机中，开启冻干机，冷冻干燥的温度-时间程序设置为：
A、预冷：降温3h左右到-50℃，再保温2h；B、用20h从-50℃升温至-15℃；再保温2h；C、用8h从-15℃升温至0℃，再保温2h；D、用10h从0℃升温至30℃，再保温4h，获得Rg3-PLGA缓释微球。
实施例6
1、配制聚乙烯醇水溶液
将2g PVA(聚乙烯醇)加入到50ml三蒸水，95℃加热2h使其充分溶解，过滤，配制成质量体积浓度为4％的聚乙烯醇水溶液(50ml)，常温保存，备用；
2、配制聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液(即PLGA油相)
将精确称取聚乳酸-羟基乙酸共聚物(即PLGA，0.08g)溶于1ml的二氯甲烷中，搅拌均匀，制成浓度为80mg/ml的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液(即PLGA油相，1ml)备用，其中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物中乳酸与羟基乙酸的百分比为90:10,其分子量在9×103；
3、配制Rg3-PLGA混合液
将20(R)-人参皂苷Rg3(含量为53％，0.008g)加入到1ml的PLGA油相，搅拌，均匀分散制成Rg3-PLGA混合液(油相，1ml)，其中，Rg3的重量与PLGA油相中的PLGA的重量之比为1:5；搅拌速率为300rpm，搅拌时间为2h。
4、超声乳化处理
将Rg3-PLGA混合液添加到50ml的聚乙烯醇水溶液(外水相)，接着置于超声波乳化分散器(上海汗诺仪器有限公司)，边搅拌边进行间歇超声波处理，超声波的脉冲时间为10s﹕5s(on/off)，即超声波持续发生时间为(on)10s，超声波停止发生时间(即间歇时间)(off)为5s，超声波处理时间为6.5min，其中控制超声波处理过程中的温度为45℃；搅拌速率为500r/min，制成Rg3-PLGA-聚乙烯醇乳化液，其中，油相与外水相的体积比为1:50，即Rg3-PLGA混合液与聚乙烯醇水溶液的体积之比为1:50；
5、固化处理
向Rg3-PLGA-聚乙烯醇乳化液中加入50ml的体积百分比浓度为3％的丙酮水溶液(即固化剂)，然后在室温下、在搅拌状态下进行超声波处理，PLGA和PVA发生固化，同时将混合物料中的有机溶剂物挥发，获得固化后的Rg3-PLGA纳米粒溶液，其中，控制超声波处理过程中的温度为40℃；搅拌速率为500r/min；超声波的脉冲时间为10s﹕5s(on/off)，即超声波持续发生时间为(on)10s，超声波停止发生时间(即间歇时间)(off)为5s，超声波处理时间为4h；Rg3-PLGA-聚乙烯醇乳化液与固化剂的体积之比为51:50；
6、分离处理
将固化后的Rg3-PLGA纳米粒溶液置于冷冻离心机(HITACHI(日立)，Japan，CR22GIII)，于20000g 4℃下，进行离心处理，回收纳米粒，弃上清，纳米粒沉淀用三蒸水清洗3次，获得Rg3-PLGA纳米粒，4℃保存，备用；
采用扫描电镜对制得的Rg3-PLGA纳米粒进行电镜扫描，从电镜扫描图可知，本发明制备的Rg3-PLGA纳米粒的粒径小，粒径分布均匀，采用粒径分析仪测定Rg3-PLGA纳米粒的粒径,粒径分析仪中检测得平均粒径大小为89.3nm，PDI为0.269。按照实施例1的测定方法测定Rg3-PLGA纳米粒的包封率为94.3％，载药量为5.0％。
7、冷冻干燥处理
7-1)将Rg3-PLGA纳米粒加入到支架剂蔗糖水溶液(质量百分比浓度为5％)中，其中Rg3-PLGA纳米粒与支架剂溶液的质量比为1:30，混合均匀，获得Rg3-PLGA-支架剂混匀液；
7-2)将Rg3-PLGA-支架剂混匀液灌装于10ml西林瓶中，每瓶装2ml；
7-3)将灌装完毕的西林瓶置于冻干机中，开启冻干机，冷冻干燥的温度-时间程序设置为：
A、预冷：降温3h左右到-50℃，再保温2h；B、用20h从-50℃升温至-15℃；再保温2h；C、用8h从-15℃升温至0℃，再保温2h；D、用10h从0℃升温至30℃，再保温4h，获得Rg3-PLGA缓释微球。
试验例1Rg3-PLGA缓释纳米粒体外释药测试试验
1、精确称取实施例1制备的Rg3-PLGA缓释纳米微球(0.05g)，加入1ml水中，超声分散于Eppendorf管中，放于37℃孵箱内，分别于2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、48h、96h离心回收上清，4℃保存；
2、将回收的上清液用0.45μm水性滤器过滤后采用HPLC检测样品中Rg3的含量(外标法)，其中，HPLC检测条件为：3.9×150mm C18的色谱柱；流动相乙腈：水(45:55)；柱温：30℃；流速：0.7ml/min；检测波长：203nm；进样体积20μl；
3、以时间为横坐标，Rg3百分浓度为纵坐标绘制药物释放曲线，如图4所示。
由图4可知，本发明的20(R)-人参皂苷Rg3缓释纳米粒的第4天的累计释放量是19.364％，释放介质为水，从图中可以看出药物可以缓慢释放，时间为4天以上。(从图4可知Rg3-PLGA缓释微球在0小时到2小时期间有突释现象，释放出的Rg3可以马上发挥药效作用，2小时到6小时期间，释放的Rg3平稳下降，6小时以后Rg3的释放均在一定的范围内，Rg3缓慢释放，持续发挥作用，达到了缓释的设计目的。)
试验例2 Rg3-PLGA缓释纳米粒对黑色素瘤影响试验
1材料与仪器
1.1药物
Rg3-PLGA缓释纳米微球(实施例1制备)
20(R)-人参皂苷Rg3(含量＞98％)，大连富生天然药物开发有限公司生产，批号：20140209；以中国药品生物制品检定所提供的人参皂苷Rg3标准品对照并进行HPLC标定，含量为99.1％；1.2肿瘤细胞株
恶性黑色素瘤A375细胞株(由大连医科大学免疫学实验室提供)。
1.3试剂及仪器
1.3.1试剂
乙醇，分析纯(科龙化学试剂)；新生小牛血清(兰州明海)；RPMI-1640培养液(美国GIBCO)；四甲基偶氮唑盐(MTT，Serva公司)；AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技)。
1.3.2仪器
RE252AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；STC2500E二氧化碳孵箱(无锡科达)；酶联免疫检测仪(华东电子管厂)；倒置显微镜(日本OLYMPUS)；Coulter-X流式细胞仪(美国贝克曼公司)。
2方法
2.1细胞培养
黑色素瘤细胞株A375培养于RPMI-1640培养液(含体积分数为10％新生小牛血清)，置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中连续传代培养。
2.2MTT实验
取处于对数生长期的黑色素瘤A375细胞株，用含2％EDTA的0.25％胰蛋白酶消化，再用含10％新生小牛血清的RPMI-1640培养液吹打培养瓶底部,制成单细胞悬液。用RPMI-1640培养液调整细胞浓度为2×108/L，每孔接种细胞悬液50μl于96孔培养板中，分别加入RPMI-1640空白培养液，PLGA的RPMI-1640培养液溶液，浓度为100mg/ml的Rg3及100mg/mlRg3-PLGA缓释纳米微球的RPMI-1640培养液各50μl，作为空白组，PLGA组，Rg3组和Rg3-PLGA组，在37℃，5％CO2条件下培养24h，48h，72h后，每孔中加入5g/LMTT溶液20μl，再孵育4h，弃去上清液，再于每孔加入150μl DMSO(二甲基亚砜)充分振荡至结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪上选择570nm波长，用空白孔调零，测定各孔光密度(OD值)。每组重复3复孔，实验重复3次。按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率。
肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100％
其中实验组为PLGA组，Rg3组、Rg3-PLGA组。
2.3形态学观察
倒置显微镜观察PLGA组，Rg3组和Rg3-PLGA组对黑色素瘤A375细胞72h后，与空白对照组比较，各组试验对黑色素瘤A375细胞形态的影响。
2.4统计学处理
本实验数据采用SPSS15.0进行数据处理，数据以
Figure BDA0000920143770000181
表示，两组间的均数比较采取t检验。试验结果如表2所示。
表2 Rg3-PLGA缓释纳米微球对黑色素瘤A375细胞增殖的抑制作用(
Figure BDA0000920143770000182
n＝9)
Figure BDA0000920143770000183
Figure BDA0000920143770000191
注：与对照组比较，**p<0.01。
2.5试验结论
1、经统计分析结果显示，浓度为100mg/ml的Rg3组和100mg/ml的Rg3-PLGA组和空白对照组之间有明显差异(p<0.01)，说明人参皂苷Rg3和Rg3-PLGA能有限抑制A375细胞的增殖，并随着作用时间的延长，对细胞增殖的抑制率增加，Rg3-PLGA组与Rg3组比较，可以看出Rg3-PLGA组各个时间点对A375细胞的增殖抑制率均高于Rg3组，说明Rg3制成PLGA缓释微球具有协同增效的作用。
2、空白组、PLGA组、Rg3组和Rg3-PLGA组作用黑色素瘤细胞A375后，倒置光学显微镜观察可见，空白组和PLGA组黑色素瘤A375细胞生长布满培养板底部，细胞排列紧密胞核、胞仁较大。而Rg3组和Rg3-PLGA组与空白组相比，细胞数量减少，部分细胞体积变小，更多细胞变成圆形，细胞表面突起多个小球状凋亡小体(如图5)。Rg3-PLGA组与Rg3组进行比较，可以看出，Rg3-PLGA组细胞数量更少，细胞体积变小及细胞表面突起多个小球状凋亡小体现象更加明显，说明了Rg3制成PLGA缓释微球具有协同增效的作用，同时也印证了表2中的实验结果。

Claims (7)

1.一种20(R)-人参皂苷Rg3缓释纳米微球组合物的制备方法，其特征是，包括如下顺序进行的步骤：
1）将聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）溶于有机溶剂中，形成聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液，即PLGA油相，其中所述有机溶剂选择三氯甲烷；将聚乙烯醇溶于水中，形成聚乙烯醇水溶液；
2）将20(R)-人参皂苷Rg3加入到PLGA油相中，均匀分散成Rg3-PLGA混合液；
3）将Rg3-PLGA混合液加入到聚乙烯醇水溶液中，在搅拌状态下进行超声波处理，制得Rg3-PLGA-聚乙烯醇乳化液；
4）向Rg3-PLGA-聚乙烯醇乳化液中加入固化剂，在搅拌状态下进行超声波处理，PLGA固化反应，并挥发混合物中的有机溶剂，得到固化的Rg3-PLGA纳米粒溶液，其中所述固化剂选择体积百分比浓度为1-3%的丙酮水溶液；Rg3-PLGA-聚乙烯醇乳化液与所述固化剂的体积之比为50-55:50；
5）对固化的Rg3-PLGA纳米粒溶液进行离心处理，然后对获得的纳米粒子进行清洗；
6）将清洗后的Rg3-PLGA纳米粒与支架剂溶液混合均匀后，再进行冷冻干燥处理，即得。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征是，步骤1）中所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液中PLGA的浓度为45 -100mg/ml；所述聚乙烯醇水溶液的浓度为2.5-5.0%。
3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是，步骤2）中所述的20(R)-人参皂苷Rg3的重量与所述PLGA油相中PLGA的重量之比为1:2-10。
4.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是，步骤3）中所述Rg3-PLGA混合液与所述聚乙烯醇水溶液的体积之比为1:20-50。
5.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是，步骤3）中所述超声波处理时间为2-10min。
6.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是，步骤3）中所述超声波处理过程中超声温度为30-55℃。
7.一种20(R)-人参皂苷Rg3缓释纳米微球组合物，其特征是，按照如权利要求1-6任意一项所述方法制备而成。
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