JP2019501261A - 生分解性両親媒性ポリマー、それにより製造されるポリマーベシクル、及び肺がん標的治療薬の製造における使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
(式中、R1は以下の基から選択される1種であり、
硫化水素ナトリウム一水和物(28.25g、381.7mmol)をN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)400mLに溶解し、完全に溶解するまで50℃で加熱し、ジブロモネオペンチルグリコール(20g、76.4mmol)を一滴ずつ滴下し、48時間反応させた。反応物を減圧蒸留して溶媒であるDMFを除去し、次に蒸留水200mLで希釈し、酢酸エチル250mLで4回抽出し、最後に有機相を回転蒸発して黄色の粘稠状化合物Aを得、収率は70%であった。テトラヒドロフラン(THF)400mLに溶解した化合物Aを空気中で24時間放置し、分子間のメルカプト基をS−S結合に酸化し、化合物Bを得、収率は>98%であった。窒素ガスの保護下で、化合物B(11.7g、70.5mmol)を乾燥後のTHF(150mL)に溶解し、完全に溶解するまで攪拌した。続いて0℃までに冷却し、クロロギ酸エチル(15.65mL、119.8mmol)を加え、次にEt3N(22.83mL、120.0mmol)を一滴ずつ滴下した。滴下が完了した後、該系を氷水浴条件下で4時間反応させた。反応終了後に、生成したEt3N・HClをろ過して取り除き、ろ液を回転蒸発して濃縮し、最後にジエチルエーテルで再結晶を複数回行って、黄色の結晶であるジチオ基含有5員環官能基を有する環状カーボネートモノマー(CDC)を得、収率は64%であった。
窒素ガス雰囲気下で、CDCモノマー0.1g(0.52mmol)及びトリメチレンカーボネート(TMC) 0.4g(3.85mmol)をジクロロメタン3mLに溶解し、密閉反応器に加え、次にCH3O−PEG5000 0.1g(0.02mmol)及び触媒であるビス[ビス(トリメチルシリル)アミド]亜鉛のジクロロメタン溶液(0.1mol/L) 0.5mLを加え、続いて反応器を密閉し、グローブボックスから取出し、40℃のオイルバスで2日間反応した後、氷酢酸で反応を停止させ、ジエチルエーテルで沈殿させ、最終的にろ過して真空乾燥し、PEG5k−P(CDC4.9k−co−TMC19.0k)を得た。核磁気共鳴スペクトルは図1のとおりである。1H NMR(400MHz,CDCl3):2.08(t,−COCH2CH2CH2O−),3.08(s,−CCH2),3.30(m、−OCH3)、3.65(t、−OCH2CH2O−)、4.28(t,−COCH2CH2CH2O−),4.31(m,−CCH2)。NMR計算の結果、下記構造式中、k=114、x=26、y=186であった。GPC測定による分子量は34.5kDa、分子量分布は1.48であった。
窒素ガス雰囲気下で、CDCモノマー0.1g(0.52mmol)及びTMC 0.4g(3.85mmol)をジクロロメタン3mLに溶解し、密閉反応器に加え、次にMal−PEG6000 0.12g(0.02mmol)及び触媒であるビス[ビス(トリメチルシリル)アミド]亜鉛のジクロロメタン溶液(0.1mol/L)0.1mol/Lを添加し、続いて反応器を密閉し、グローブボックスから取出し、40℃のオイルバスで2日間反応した後、氷酢酸で反応を停止させ、ジエチルエーテルで沈殿させ、最終的にろ過して真空乾燥し、Mal−PEG6k−P(CDC4.8k−co−TMC19.2k)を得た。1H NMR(400MHz,CDCl3):2.08(t,−COCH2CH2CH2O−),3.08(s,−CCH2),3.30(m、−OCH3)、3.65(t、−OCH2CH2O−)、4.28(t,−COCH2CH2CH2O−),4.31(m,−CCH2)、及び6.70(s、Mal)。NMR計算の結果、下記構造式中、k=136、x=25、y=188であった。GPC測定による分子量は38.6kDa、分子量分布は1.42であった。
窒素ガス雰囲気下で、CDCモノマー0.1g(0.52mmol)及びTMC 0.4g(3.85mmol)を、ジクロロメタン3mLに溶解し、密閉反応器に加え、次にNHS−PEG6500 0.1g(0.015mmol)及び触媒であるビス[ビス(トリメチルシリル)アミド]亜鉛のジクロロメタン溶液(0.1mol/L)0.5mLを添加し、続いて反応器を密閉し、グローブボックスから取出し、40℃のオイルバスで2日間反応した後、氷酢酸で反応を停止させ、ジエチルエーテルで沈殿させ、最終的にろ過して真空乾燥し、NHS−PEG6.5k−P(CDC4.6k−co−TMC18.6k)を得た。1H NMR(400MHz,CDCl3):2.08(t,−COCH2CH2CH2O−),3.08(s,−CCH2),3.30(m、−OCH3)、3.65(t、−OCH2CH2O−)、4.28(t,−COCH2CH2CH2O−),4.31(m,−CCH2)、及び2.3(s、NHS)。NMR計算の結果、下記構造式中、k=145、x=24.0、y=182。GPC測定による分子量は37.6kDa、分子量分布は1.38であった。
窒素ガス雰囲気下で、CDCモノマー0.1g(0.52mmol)及びTMC 0.2g(1.93mmol)をジクロロメタン1mLに溶解し、密閉反応器に加え、次にCH3O−PEG1900 0.1g(0.05mmol)及び触媒であるビス[ビス(トリメチルシリル)アミド]亜鉛のジクロロメタン溶液(0.1mol/L)0.5mLを添加し、40℃のオイルバスで2日間反応し、後処理は実施例2と同様であり、PEG1.9k−P(CDC1.9k−co−TMC3.9k)を得た。反応式及び1H NMR特徴ピークは実施例2と同一であった。NMR計算の結果、構造式中、k=46、x=10、y=40であった。GPC測定による分子量は14.5kDa、分子量分布は1.36であった。
窒素ガス雰囲気下で、CDC 0.08g(0.42mmol)及びラクチド(LA)0.3g(2.1mmol)をジクロロメタン2mLに溶解し、密閉反応器に加え、次に0.1g(0.02mmol)CH3O−PEG5000及び触媒であるビス[ビス(トリメチルシリル)アミド]亜鉛のジクロロメタン溶液(0.1mL)0.1mol/Lを添加し、40℃のオイルバスで2日間反応し、後処理は実施例2と同様であり、PEG5k−P(CDC3.7k−co−LA14.6k)を得た。核磁気共鳴スペクトルは図2のとおりである。1H NMR(400MHz,CDCl3):1.59(s,−COCH(CH3)O−),3.08(s,−CCH2),3.30(m、−OCH3)、3.65(t、−OCH2CH2O−)、4.31(m,−CCH2)、5.07(s,−COCH(CH3)O−)。NMR計算の結果、下記構造式中、k=114、x=19、y=101であった。GPC測定による分子量は24.3kDa、分子量分布は1.32であった。
窒素ガス雰囲気下で、CDC 0.1g(0.57mmol)及びLA 0.5g(3.5mmol)をジクロロメタン3mLに溶解し、密閉反応器に加え、次にCH3O−PEG6500 0.11g(0.015mmol)及び触媒であるビス[ビス(トリメチルシリル)アミド]亜鉛のジクロロメタン溶液(0.1mol/L)0.5mLを添加し、40℃のオイルバスで2日間反応し、後処理は実施例2と同様であり、PEG6.5k−P(CDC5.8k−co−LA28.3k)を得た。反応式及び1H NMR特徴ピークは実施例6と同一であった。NMR計算の結果、構造式中、k=148、x=30、y=200であった。GPC測定による分子量は42.4kDa、分子量分布は1.43であった。
窒素ガス雰囲気下で、CDC 0.1g(0.52mmol)及びLA 0.5g(5.56mmol)をジクロロメタン4mLに溶解し、密閉反応器に加え、次にMal−PEG6000 0.15g(0.025mmol)及び触媒であるビス[ビス(トリメチルシリル)アミド]亜鉛のジクロロメタン溶液(0.1mL)0.1mol/Lを添加し、40℃のオイルバスで2日間反応し、後処理は実施例2と同様であり、Mal−PEG6k−P(CDC3.6k−co−LA18.6k)を得た。1H NMR(400MHz,CDCl3):1.59(s,−COCH(CH3)O−),3.08(s,−CCH2),3.30(m、−OCH3)、3.65(t、−OCH2CH2O−)、4.31(m,−CCH2)、5.07(s,−COCH(CH3)O−)、及び6.70(s、Mal)。NMR計算の結果、下記構造式中、k=136、x=19、y=129であった。GPC測定による分子量は32.5kDa、分子量分布は1.44であった。
窒素ガス雰囲気下でTMC 0.8g(7.84mmol)及びCDC 0.16g(0.83mmol)をジクロロメタン8mLに溶解し、密閉反応器に加え、次に、HO−PEG−OH5000 0.1g(0.02mmol)及び触媒であるビス[ビス(トリメチルシリル)アミド]亜鉛のジクロロメタン溶液(0.2mol/L)1mLを添加し、40℃のオイルバスで2日間反応し、後処理は実施例2と同様であり、トリブロックポリマーP(CDC3.8k−TMC18.8k)−PEG5k−P(CDC3.8k−TMC18.8k)を得た。1H NMR特徴ピークは実施例2と同一であった。NMR計算の結果、下記構造式中、m=114、x=20、y=184であった。GPC測定による分子量は78.9kDa、分子量分布は1.54であった。
窒素ガス雰囲気下で、CDC 0.1g(0.52mmol)及びLA 0.4g(2.8mmol)をジクロロメタン3mLに溶解し、密閉反応器に加え、次にNHS−PEG7500 0.013mmol及び触媒であるビス[ビス(トリメチルシリル)アミド]亜鉛のジクロロメタン溶液(0.1mol/L)1mLを添加し、反応器を密閉し、グローブボックスから取出し、40℃のオイルバスで2日間反応し、後処理は実施例2と同様であり、NHS−PEG7.5k−P(CDC4.8k−co−LA19.0k)を得た。1H NMR(400MHz,CDCl3):1.59(s,−COCH(CH3)O−),3.08(s,−CCH2),3.30(m、−OCH3)、3.65(t、−OCH2CH2O−)、4.31(m,−CCH2)、5.07(s,−COCH(CH3)O−)及び2.3(s、NHS)。NMR計算の結果、下記構造式中、k=170、x=20、y=96であった。GPC測定による分子量は42.3kDa、分子量分布は1.45であった。
環状ポリペプチドCSNIDARAC(cc9)をカップリングしたポリマーCC9−PEG7.5k−P(CDC3.8k−co−LA13.8k)の合成は、2工程を備え、第1工程では、実施例10のようにNHS−PEG7.5k−P(CDC3.8k−co−LA13.8k)を製造し、第2工程では、アミド化反応によりCC9と結合する。まず、上記ポリマーNHS−PEG7.5k−P(CDC3.8k−co−LA13.8k)をDMFに溶解し、2倍モル量のCC9を添加し、30℃で2日間反応し、透析して凍結乾燥することで、CC9−PEG6.5k−P(CDC3.8k−co−LA13.8k)を得た。NMR及びBCAタンパク質キットにより計算した結果、CC9グラフト率は91%であった。
環状ポリペプチドc(RGDfC)(cRGD−SH)をカップリングしたポリマーcRGD−PEG6k−P(CDC3.6k−co−LA18.6k)の合成は、2工程を備え、第1工程では、実施例8のようにMal−PEG6k−P(CDC3.6k−co−LA18.6k)を製造し、第2工程では、マイケル付加反応によりcRGD−SHのメルカプト基と結合する。まず、ポリマーMal−PEG6k−P(CDC3.6k−co−LA18.6k)をDMF 0.5mLに溶解し、ホウ酸緩衝液(pH8.0)2mLを加え、さらに1.5倍モル量のcRGD−SHを添加し、30℃で2日間反応し、透析して凍結乾燥することで、最終生成物であるcRGD−PEG6k−P(CDC3.6k−co−LA18.6k)を得た。NMR及びBCAタンパク質キットにより計算した結果、cRGDグラフト率は94%であった。
環状ポリペプチドc(RGDfK)(cRGD)をカップリングしたポリマーcRGD−PEG6.5k−P(CDC4.6k−co−TMC18.6k)の合成は、2工程を備え、第1工程では、実施例4のようにNHS−PEG6.5k−P(CDC4.6k−co−TMC18.6k)を製造し、第2工程では、アミド化反応によりcRGDのアミノ基と結合する。まず、上記ポリマーNHS−PEG6.5k−P(CDC4.6k−co−TMC18.6k)をDMFに溶解し、2倍モル量のcRGDを添加し、30℃で2日間反応した後に、透析して遊離cRGDを除去し、凍結乾燥することで、cRGD−PEG6.5k−P(CDC4.6k−co−TMC18.6k)を得た。NMR及びBCAタンパク質キットにより計算した結果、cRGDグラフト率は88%であった。
環状ポリペプチドcNGQGEQc(cNGQ)をカップリングしたポリマーcNGQ−PEG6.5k−P(CDC4.6k−co−TMC18.6k)の合成は、2工程を備え、第1工程では、実施例4のようにNHS−PEG6.5k−P(CDC4.6k−co−TMC18.6k)を製造し、第2工程では、アミド化反応によりcNGQのアミノ基と結合する。まず、上記ポリマーNHS−PEG6.5k−P(CDC4.6k−co−TMC18.6k)をDMFに溶解し、2倍モル量のcNGQを添加し、30℃で2日間反応した後に、透析し、遊離cNGQを除去し、凍結乾燥することで、cNGQ−PEG6.5k−P(CDC4.6k−co−TMC18.6k)を得た。NMR及びBCAタンパク質キットにより計算した結果、cNGQグラフト率は92%であった。
各ポリマーの製造条件、生成物のNMR及びGPCによる測定結果
溶媒置換法によりポリマーベシクルを製造した。PEG5k−P(CDC4.9k−co−TMC19k)のDMF溶液(10mg/mL)100μLをリン酸塩緩衝液(PB、10mM、pH7.4)900μLに滴下し、37℃で(200rmp)シェーカーに一晩放置し、自己架橋させ、次に、透析バッグ(MWCO7000)に入れ、一晩透析し、水を5回交換した。透析溶媒はPB(10mM、pH7.4)であった。得られた自己架橋ベシクルのサイズを動的光散乱式粒度分布測定装置(DLS)で測定した結果、図3Aに示すとおり、形成したナノベシクルは130nmであり、粒子径分布は非常に狭かった。図3Bから分かるように、TEM測定の結果、ナノ粒子は中空のベシクル構造であった。自己架橋ベシクルは、高倍率での希釈、及びウシ胎児血清の存在下で変わらない粒径及び粒子径分布を維持した(図3C)が、模擬腫瘍細胞還元環境下で速やかに放出し、解架橋した(図3D)。このことから、得られたベシクルは自己架橋なものであり、かつ還元感受性の解架橋性質を有することが分かった。
透析法によりポリマーベシクルを製造した。PEG5k−P(CDC4.9k−co−TMC19k)のDMF溶液(10mg/mL)100μLを透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、PB(10mM、pH7.4)で、37℃で(200rmp)シェーカーに一晩放置し、自己架橋させ、次にPBで24時間透析し、溶液を5回交換した。DLS測定の結果、架橋ベシクルのサイズは80nm程度であり、粒子径分布は0.08であった。
薄膜水合法によりポリマーベシクルを製造した。PEG5k−P(CDC4.9k−co−TMC19k)2mgを、0.5mLの低沸点有機溶媒、例えばジクロロメタン又はアセトニトリルに溶解し、25mLのシャープボトムフラスコ中で、回転蒸発して底部で薄膜を形成し、次に0.1mBarの真空下でさらに24時間真空抽出した。PB(10mM、pH7.4)2mLを添加し、37℃で撹拌して薄膜を表面から剥離し、かつ攪拌粉砕し、20分間(200rmp)超音波処理し、24時間撹拌し続け、得られたベシクルは自己架橋した。DLS測定の結果、自己架橋ベシクルのサイズは180nm程度であり、粒子径分布は0.25であった。
実施例15のようにポリマーベシクルを製造し、滴下終了後にDTT(濃度0.09μM)を添加し、37℃で12時間架橋させ、次に、透析バッグ(MWCO7000)に入れ、一晩透析し、溶液を5回交換した。得られた自己架橋ベシクルのサイズは109nm程度であり、粒子径分布は0.13であった。
実施例14で得られた標的ポリマーcNGQ−PEG6.5k−P(CDC4.6k−co−TMC18.6k)と実施例2で得られたPEG5k−P(CDC4.9k−co−TMC19k)を混合してDMFに溶解し、実施例15のようにcNGQをカップリングした標的自己架橋ポリマーベシクルを製造した。標的ポリマーのPEG分子量は非標的PEG分子量よりも大きく、標的分子がよりよく表面から露出することを保証する。両者を異なる配合比で混合することにより、表面に異なる標的分子を有する自己架橋ベシクルを製造することができる。好ましくは、前者の含有量が5〜30wt.%である。DLS測定により、そのサイズは90〜120nm程度であり、粒子径分布は0.05〜0.15であった。
薄膜水合法によりcRGDをカップリングした標的自己架橋ポリマーベシクルを製造した。実施例2で得られたPEG5k−P(CDC4.9k−co−TMC19k)のDMF溶液(10mg/mL)1.6mg及び実施例13で得られたcRGD−PEG6.5k−P(CDC4.6k−co−TMC18.6k)0.4mgを0.5mLの低沸点有機溶媒、例えばジクロロメタン又はアセトニトリルに溶解し、実施例17のように製造する自己架橋ベシクルのサイズは、88nm程度であり、粒子径分布は0.08であった。両者を異なる配合比で混合することにより、表面に異なる標的分子を有する自己架橋ベシクルを製造することができる。好ましくは、前者の含有量が5〜30wt.%である。
実施例8で製造されたMal−PEG6k−P(CDC3.6k−LA18.6k)及びP(CDC3.8k−LA18.8k)−PEG4k−P(CDC3.8k−LA18.8k)を混合し、実施例16に記載の透析方法に従ってベシクルを製造した。次に4Mホウ酸緩衝液(pH8.0)0.5mLを添加し、溶液をpH7.5〜8.0に調整し、さらにMalモル量の1.5倍でCC9を加え、マイケル付加反応により結合し、30℃で2日間反応した後に、透析した。DLS測定の結果、そのサイズは110nmであり、粒子径分布は0.16であった。NMR及びBCAタンパク質キットにより計算した結果、ポリペプチドのグラフト率は90%であった。2種のポリマーを異なる配合比で混合することにより、表面に異なる標的分子を有する自己架橋ベシクルを製造することができる。好ましくは、前者の含有量が5〜30wt.%である。
自己架橋ポリマーベシクル及び標的自己架橋ポリマーベシクルの製造及び特性
溶媒置換法によりポリマーベシクルを製造し、DOX・HClの担持はpH勾配法により行い、ベシクル内外のpH差により、親水性薬物DOX・HClを封入した。PEG5k−P(CDC4.9k−co−TMC19k)のDMF溶液(10mg/mL)100μLをクエン酸ナトリウム/クエン酸緩衝液(10mM、pH4.0)900μLに滴下し、37℃で(200rmp)シェーカーに5時間放置し、次にPB(4M、pH8.1)0.05mLを添加してpH勾配を確立し、その後、DOX・HClを直ちに加え、シェーカーに5〜10時間放置することで薬物がベシクルへ進入するとともに、自己架橋することができた。最後に透析バッグ(MWCO 7000)に入れて一晩透析し、水を5回交換した。透析溶媒はPB(10mM、pH7.4)であった。異なる比率(10%〜30%)の薬物を担持した自己架橋ベシクルの粒径は105〜124nm、粒子径分布は0.10〜0.15であった。蛍光分光光度計により測定したDOX・HClの封入効率は63%〜77%であった。DOX・HClの生体外放出実験は、37℃の恒温シェーカーで振とう(200rpm)しながら行われ、1組につき3つの並列サンプルがある。第1組は、DOX・HCl担持自己架橋ベシクルがGSH 10mMを加えた模擬細胞内還元環境PB(10mM,pH7.4)中で、第2組は、DOX・HCl担持自己架橋ベシクルがPB(10mM,pH7.4)中である。薬物担持自己架橋ベシクルの濃度が30mg/Lであり、0.6mLを取って透析バッグ(MWCO:12000)に入れ、各チューブに対応の透析溶媒25mLを加え、所定の時間間隔で測定用として5.0mL透析バッグ外部媒体を取って、それに応じてチューブに対応の媒体を5.0mL追加した。蛍光計により溶液に含まれる薬物の濃度を測定した。図4はDOX・HClの累積放出量と時間との関係であり、図から分かるように、腫瘍細胞内の還元環境を模擬するためのGSHを添加した後、GSHを添加していないサンプルより明らかに速く放出された。このことから、薬物担持自己架橋ベシクルは、10mMのGSHの存在下で効果的に薬物を放出できることが分かった。
溶媒置換法によりポリマーベシクルを製造した。パクリタキセルPTXのDMF溶液(10mg/mL)10μL及びAlly−PEG6k−P(CDC2.9k−CL14.2k)のDMF溶液(10mg/mL)90μLを混合し、次に、リン酸塩緩衝液(10mM、pH7.4、PB)900μLに滴下し、37℃で(200rmp)シェーカーに一晩放置し、自己架橋させ、次に、透析バッグ(MWCO7000)に入れ、一晩透析し、水を5回交換した。透析溶媒はPB(10mM、pH7.4)であった。PTXの含有量は0〜20wt.%であった。得られた自己架橋ベシクルのサイズは130〜170nm、粒子径分布は0.1〜0.2であった。TEM測定の結果、ベシクル構造であり、還元感受性の解架橋性質を有する。PTXの封入効率は50%〜70%であった。生体外放出実験の設計は実施例22と同一であり、GSH添加後の疎水性薬物は、GSH未添加のサンプルより明らかに速く放出された。
薄膜水合法によりポリマーベシクルを製造し、pH勾配法によりDOX・HClを担持した。PEG5k−P(CDC4.9k−co−TMC19k)1.6mg及びcRGD−PEG6.5k−P(CDC4.6k−co−TMC18.6k)0.4mgを0.5mLの低沸点有機溶媒、例えばジクロロメタン又はアセトニトリルに溶解し、25mLのシャープボトムフラスコ中で、回転蒸発して底部で薄膜を形成し、次に0.1mBarの真空下でさらに24時間真空抽出した。クエン酸ナトリウム/クエン酸緩衝液(10mM、pH4.0)2mLを添加し、37℃で撹拌して薄膜を表面から剥離し、かつ攪拌粉砕し、20分間(200rmp)超音波処理し、24時間撹拌し続け、自己架橋した。DLS測定の結果、架橋ベシクルのサイズは90nm程度であり、粒子径分布は0.10であった。上記ベシクル溶液にPB(4M、pH8.1)0.05mLを添加し、pH勾配を確立し、その後、DOX・HClを直ちに加え、シェーカーに5〜10時間放置した。次に透析バッグ(MWCO 7000)に入れてPBを一晩透析し、溶液を5回交換した。異なる比率(10%〜30%)の薬物を担持した後、粒径は112〜121nmであり、粒子径分布は0.10〜0.15であり、DOX・HClの封入効率は61%〜77%であった。生体外放出実験の設計は実施例22と同一であり、図5から分かるように、GSH 10mM添加後に薬物が効果的に放出され、その速度はGSH未添加のサンプルより明らかに速かった。
透析法によりベシクルを製造し、pH勾配法によりエピルビシン塩酸塩(Epi・HCl)を担持した。PEG5k−P(CDC4.9k−co−TMC19k)のDMF溶液(10mg/mL)80μL及びcNGQ−PEG6.5k−P(CDC4.6k−co−TMC18.6k)のDMF溶液(10mg/mL)20μLを均一に混合した後に、直接的に透析バッグ(MWCO 7000)に入れ、クエン酸ナトリウム/クエン酸緩衝液(10mM、pH4.0)中で、37℃でシェーカーに4時間放置し、自己架橋させ、その後に同じ媒体に対して12時間透析し、溶液を5回交換した。DLS測定の結果、自己架橋ベシクルのサイズは96nmであり、粒子径分布は0.18であった。上記ベシクル溶液にPB(4M、pH8.5)0.05mLを添加してpH勾配を確立し、その後、Epi・HClを直ちに加え、シェーカーに5〜10時間放置した。次に透析バッグ(MWCO 7000)に入れてPBを一晩透析し、溶液を5回交換した。異なる比率(10%〜30%)の薬物を担持し、粒径は98〜118nmであり、粒子径分布は0.10〜0.15であり、Epi・HClの封入効率は64%−79%であった。Epi・HCl生体外放出実験の設計は実施例22と同一であった。
親水性薬物を担持した自己架橋ポリマーベシクル及び標的自己架橋ポリマーベシクルの薬物担持量、封入率
MTT法により中空ベシクルの細胞毒性を測定し、A549ヒト肺がん細胞を使用した。5×104個/mLでA549細胞を96ウェルプレートに1ウェルにつき100μLで播種し、24時間後に細胞の密集度が70%になるまで培養した。次に、実験群の各ウェルにそれぞれ濃度の異なる(0.0001〜1.5mg/mL)ベシクルサンプル(実施例15の中空自己架橋ベシクル及び実施例19の中空標的自己架橋ベシクルcRGD/PEG6.5k−P(CDC4.6k−co−TMC18.6k)を例として)を加え、また、細胞ブランク対照ウェル及び培地ブランクウェル(重複4ウェル)を別途設置した。24時間培養後、各ウェルにMTT(5.0mg/mL)10μLを加え、続いて4時間培養した後、各ウェルにDMSO 150μLが溶解して生成した結晶子を加え、マイクロプレートリーダーにより492nmにおいて吸光度(A)を測定し、培地ブランクウェルをゼロにし、細胞生存率を計算した。図6は自己架橋ベシクルの細胞毒性結果であり、架橋ベシクルの濃度が0.75から1.5mg/mLまでに増えた時に、A549の生存率が依然として90%より高かったため、該架橋ベシクルは良好な生体適合性を有することが分かった。
MTT法によりベシクルのA549細胞に対する毒性を測定した。細胞の培養は、実験群の各ウェルにサンプルを加える際に、薬物担持架橋ベシクル及び薬物担持標的自己架橋ベシクル、実施例22のDOX・HCl担持自己架橋ベシクル、実施例24のDOX・HCl担持標的自己架橋ベシクルcRGD/PEG6.5k−P(CDC4.6k−co−TMC18.6k)及び実施例25のDOX・HCl担持標的自己架橋ベシクルcNGQ/PEG6.5k−P(CDC4.6k−co−TMC18.6k)をそれぞれ対応するウェルに加え、DOX・HClの濃度範囲を0.01、0.1、0.5、1、5、10、20及び40μg/mLとし、標的分子含有量が10%、20%から30%であり、非標的薬物担持自己架橋ベシクル群、及び遊離DOX・HCl群を対照群とした以外は、実施例26と同一であった。共同で4時間培養した後に、サンプルを吸引し、新鮮な培地に交換し、続いて44時間インキュベートした。その後のMTT添加、処理及び吸光度の測定は実施例26と同一であった。図7は薬物担持自己架橋ベシクルcRGD/PEG6.5k−P(CDC4.6k−co−TMC18.6k)のA549細胞に対する毒性測定である。DOX・HCl担持の30%cRGD標的自己架橋ベシクルのA549細胞に対する半数致死濃度(IC50)が2.13μg/mLであり、非標的対照ベシクルよりも顕著に低く、遊離薬物(4.89μg/mL)よりも低いことから、本発明の薬物担持標的自己架橋ベシクルは、効果的に肺がん細胞を標的とし、細胞内で薬物を放出し、最終的にがん細胞を殺すことができると分かった。
MTT法によりベシクルのH460ヒト肺がん細胞に対する毒性を測定した。細胞の培養は、実験群の各ウェルにサンプルを加える際に、異なるcc−9含有量、異なる薬物担持量の薬物担持標的架橋ベシクルを、対応するウェルに加え、例えば、CPT・HCl担持標的自己架橋ベシクルCC9/P(CDC3.8k−LA18.8k)−PEG4k−P(CDC3.8k−LA18.8k)を例として、CPT・HClの濃度範囲が0.01、0.1、0.5、1、5、10、20及び40μg/mLであり、また、標的分子含有量が10%、20%から30%であり、非標的薬物担持架橋ベシクル及遊離CPT・HCl群を対照群とした以外は、実施例26と同一であった。共同で4時間培養した後に、サンプルを吸引し、新鮮な培地に交換し、続いて44時間インキュベートした。その後のMTT添加、処理及び吸光度の測定は実施例26と同一であった。その結果、非標的薬物担持自己架橋ベシクルのH460細胞に対するIC50は4.85μg/mLであり、特にDOX・HCl担持の30%CC9標的架橋ベシクルのH460細胞に対するIC50は2.17μg/mLであり、ドキソルビシン塩酸塩リポソーム注射液DOX−LPs(Libod DOX−LPs、35.2μg/mL)よりも顕著に低く、遊離薬物(3.09μg/mL)よりも低いことから、本発明の薬物担持標的架橋ベシクルは、効果的に肺がん細胞を標的とし、細胞内で薬物を放出し、最終的にがん細胞を殺すことができると分かった。
すべての動物実験は、蘇州大学動物実験センターの規定に準じている。実験では体重が18〜20g程度、4〜6週齢のBalb/Cヌードマウスを使用した。ベシクルは、PEG5k−P(CDC4.9k−co−TMC19k)、及び異なる配合比で混合されたcRGD−PEG6.5k−P(CDC4.6k−co−TMC18.6k)とPEG5k−P(CDC4.9k−co−TMC19k)からなり、cRGDの割合が20%であるときに、粒径が100nm、粒子径分布が0.10であり、cRGD20/CLPsと命名され、薬物はDOX・HClであった。DOX・HCl担持した、非標的ベシクルCLPs、標的ベシクルcRGD20/CLPs、非架橋標的ベシクルcRGD20/PEG−PTMC及びDOX・HClを、尾静脈を介してマウス体内に注射し(DOX薬物量が10mg/kg)、0、0.25、0.5、1、2、4、8、12及び24時間に約10μL定時採血し、差量法により血液重量を正確に計算し、さらに、血液に濃度1%のトリトン100μL及びDMF500μLを添加して抽出した(なお、20mMのDTT、1MのHClを含有する)。次に遠心分離(20000回転/分、20分間)した後、上澄みを取り、蛍光により各時点でのDOX・HCl量を測定した。図8は横軸が時間であり、縦軸が、血液1gあたりの、DOX・HCl量のDOX全注射量に占める割合(ID%/g)である。図から分かるように、DOX・HClの循環時間は非常に短く、2時間でDOXがすでに検出困難となるが、架橋ベシクルは24時間後に依然として8ID%/gであった。計算すれば、標的薬物担持自己架橋ベシクル、薬物担持自己架橋ベシクル及び非架橋標的ベシクルのマウス体内での半減期はそれぞれ4.49、4.26及び1.45時間であったが、DOX・HClのほうはわずか0.27であった。したがって、標的薬物担持自己架橋ベシクルはマウス体内で安定しており、より長い循環時間を有すると分かった。その他の薬物担持標的自己架橋ベシクル、薬物担持自己架橋ベシクルの血液循環実験の操作及び計算方法は同じである。その結果を表4に示す。
実施例25のように、cNGQ−PEG6.5k−P(CDC4.6k−co−TMC18.6k)及びPEG5k−P(CDC4.9k−co−TMC19k)からなる標的自己架橋ベシクルcNGQ20/CLPs、及び非標的自己架橋ベシクルCLPにDOX・HClを担持した後に、尾静脈を介してBalb/Cヌードマウスに注射し、実施例29と同じようにその血液循環を検討し、DOX・HCl及びドキソルビシン塩酸塩リポソームDOX−LPsを対照群とした。その結果、図9に示すとおり、cNGQ20/CLPs及びCLPsは48時間後に依然として5.0ID%/gであった。計算すれば、標的自己架橋ベシクル及び自己架橋ベシクルのマウス体内での半減期はそれぞれ4.99及び4.79時間であったため、マウス体内で安定しており、より長い循環時間を有すると分かった。結果を表4に示す。
in vivoイメージング実験では、体重が18〜20g程度、4〜6週齢のBalb/Cヌードマウスを使用し、5×106個のA549ヒト肺がん細胞を皮下注射し、約3〜4週間後に、腫瘍の大きさが100〜200mm3となった時から実験を開始した。cRGD−PEG6.5k−P(CDC4.6k−co−TMC18.6k)及びPEG5k−P(CDC4.9k−co−TMC19k)から製造された自己架橋ベシクルcRGD20/CLPs及び非標的自己架橋ベシクルCLPsを例とした。蛍光物質cy−7で標識されたcRGD20/CLPs及び非標的CLPsを尾静脈を介してマウス体内に注射し、次に異なる時間点である1、2、4、6、8、12、24、48時間に小動物生体内イメージャーによりベシクルの所在を追跡した。実験結果から分かるように、cRGD20/CLPsが腫瘍部位に速やかに蓄積し、かつ48時間後にも蛍光が依然として強かった。cRGD20/CLPsは腫瘍部位に自発的に標的化及び濃縮化することができると分かった。その他の標的自己架橋ベシクル、自己架橋ベシクルのin vivoイメージング実験の操作及び計算方法は同じである。結果を表4に示す。
in vivoイメージング実験では、腫瘍の接種及び尾静脈による投与は実施例31と同一であった。実施例25と同じように製造された、Epi・HClを担持し且つcy−7で標識されたCLPs及びcNGQ20/CLPsは、両者とも腫瘍部位に速やかに蓄積し、CLPsが4〜6時間で消失したが、cNGQ20/CLPsが48時間後にも腫瘍部位の蛍光が依然として強かったことから、cNGQ20/CLPsは腫瘍部位に自発的に標的化及び濃縮化することができると分かった。結果を表4に示す。
in vivoイメージング実験では、体重が18〜20g程度、4〜6週齢のBalb/Cヌードマウスを使用し、5×106個のH460ヒト肺がん細胞を皮下注射し、約3〜4週間後に、腫瘍の大きさが100〜200mm3となった時から実験を開始した。CC9−PEG6.5k−P(CDC3.8k−co−LA13.8k)及びPEG5k−P(CDC3.7k−co−LA14.6k)から製造された標的自己架橋ベシクルCC9/CLPs及び薬物担持自己架橋ベシクルCLPsをcy−5で標識し、疎水性薬物であるドセタキセルDTXを担持し、実施例32と同じように操作し、in vivoイメージングを検討した。実験結果から分かるように、DTX担持CC9/CLPsが腫瘍部位に速やかに蓄積し、かつ48時間後にも腫瘍部位の蛍光が依然として強かった。CC9/CLPsは腫瘍部位に自発的に標的化及び濃縮化することができるが、薬物担持非標的自己架橋ベシクルは腫瘍に進入してから2時間後にすぐに代謝し、かつ強度が低かったことが分かった。結果を表4に示す。
in vivoイメージング実験では、腫瘍の接種及び尾静脈による投与は実施例31と同一であった。cRGD−PEG6.5k−P(CDC4.6k−co−TMC18.6k)及びPEG5k−P(CDC4.9k−co−TMC19k)から製造されたDOX・HCl担持標的自己架橋ベシクルcRGD20/CLPs及び非標的自己架橋ベシクルCLPsを、尾静脈を介してマウス体内に注射し(DOX・HCl:10mg/kg)、12時間後にマウスを殺し、腫瘍及び心臓、肝臓、脾臓、肺臓、腎臓組織を取り出し、洗浄して重量を量った後、1%のトリトン500μLを加え、ホモジナイザーにより粉砕し、更にDMF900μLを加えて抽出した(20mMのDTT、1MのHClを含有する)。遠心分離(20000回転/分、20分間)した後、上澄みを取り、蛍光により各時点でのDOX・HCl量を測定した。図10では、横軸が器官組織であり、縦軸が腫瘍又は組織1gあたりのDOX・HClの、DOX・HCl全注射量に占める割合(ID%/g)である。cRGD20/CLPs、CLPs及びDOX・HClを12時間注射し、腫瘍での蓄積量がそれぞれ6.54、2.53及び1.02ID%/gであり、cRGD20/CLPsはCLPs及びDOX・HClの3及び6倍であり、薬物担持cRGD20/CLPsは自発的な標的化により腫瘍部位でより多く蓄積したことが分かった。結果を表4に示す。
腫瘍の接種、尾静脈による投与及び動物の操作は実施例34と同一であった。DOX・HCl担持cNGQ20/CLPs、非標的CLPs及びドキソルビシン塩酸塩リポソームDOX−LPsを尾静脈を介してマウス体内に注射した(DOX・HCl:10mg/kg)。6時間後に、cNGQ20/CLPs、CLPs及びDOX−LPが腫瘍で蓄積したDOX・HCl量がそれぞれ8.63、3.52及び1.82ID%/gであった。cNGQ20/CLPsは後者の2倍及び5倍であり、薬物担持cNGQ20/CLPsは自発的な標的化により腫瘍部位でより多く蓄積したことが分かった。結果を図11に示す。
H460肺がん担持マウスのモデル構築は実施例33と同一であり、尾静脈による投与及び動物の操作は実施例34と同一であった。DTX担持CC9/CLPs、非標的CLPs及びDOX−LPsを尾静脈を介して投与した。6時間後にCC9/CLPs、CLPs及びDOX−LPsが腫瘍で蓄積したDTX量がそれぞれ9.02、2.42及び1.82ID%/gであった。CC9/CLPsはCLPs及びDOX−LPsの4及び5倍であり、薬物担持CC9/CLPsは自発的な標的化により腫瘍部位で蓄積したことが分かった。結果を表4に示す。
実験では、体重が18〜20g程度、4〜6週齢のBalb/Cヌードマウスを使用し、5×106個のA549ヒト肺がん細胞を皮下注射し、約2週間後に、腫瘍の大きさが30〜50mm3となった時から実験を開始した。cRGD−PEG6.5k−P(CDC4.6k−co−TMC18.6k)及びPEG5k−P(CDC4.9k−co−TMC19k)を1:5で混合して製造したDOX・HCl担持標的自己架橋ベシクルcRGD20/CLPs、CLPs、遊離DOX・HCl及びPBSをそれぞれ0、4、8及び12日に尾静脈を介してマウス体内に注射した(DOX薬物量が10mg/kg)。0〜18日目の期間で、2日毎にマウスの体重を量り、ノギスにより腫瘍体積を測定した。腫瘍体積の計算方法はV=(L×W×H)/2(式中、Lは腫瘍の長さであり、Wは腫瘍の幅であり、Hは腫瘍の厚さである。)である。マウスの生存を45日間観察し続けた。図12から分かるように、cRGD20/CLPs治療群は18日目に腫瘍を顕著に阻害したが、薬物担持CLPs群は腫瘍がある程度増殖した。遊離DOX・HClも腫瘍の増殖を抑制できたが、そのマウスの体重が12日目に21%低減したことから、マウスへの有毒な副作用が大きいことが分かった。これに対して、cRGD20/CLPs及びCLPs群のマウスは体重がほぼ変わらなかったことから、薬物担持自己架橋ベシクルはマウスに有毒な副作用を有しないことが分かった。cRGD20/CLPs治療群は60日間後に全部生存していたが、DOX・HCl群は42日目に全部死亡し、PBS群も43日目に全部死亡した。したがって、本発明の標的自己架橋ベシクルは、薬物を担持した後に、腫瘍の増殖を効果的に阻害でき、マウスへの有毒な副作用がなく、さらに腫瘍担持マウスの生存時間を延ばすこともできると分かった。
皮下A549腫瘍のモデル構築、尾静脈による投与方法及びデータ収集は実施例37と同一であった。cNGQ−PEG6.5k−P(CDC4.6k−co−TMC18.6k)及びPEG5k−P(CDC4.9k−co−TMC19k)を1:5で混合して製造したDOX・HCl担持標的自己架橋ベシクルcNGQ20/CLPs、非標的CLPs、DOX−LPs及びPBSを尾静脈を介して注射した。図13から分かるように、cNGQ20/CLPs治療群は18日目に、腫瘍の増殖を効果的に阻害できたが、薬物担持CLPs群は腫瘍が増殖し、マウス体重がほぼ変わらなかった。DOX−LPsも腫瘍の増殖を抑制できたが、DOX−LPs群のマウスの体重が12日目に18%低減したことから、マウスへの有毒な副作用が大きいことが分かった。cNGQ20/CLPs治療群は68日間後に全部生存していたが、DOX・HCl群は32日目に全部死亡し、PBS群も42日目に全部死亡した。したがって、薬物担持標的自己架橋ベシクルは、腫瘍を効果的に抑制でき、マウスへの有毒な副作用がなく、腫瘍担持マウスの生存時間を延ばすことができると分かった。
皮下H460腫瘍のモデル構築は実施例33と同一であり、尾静脈による投与方法及びデータ収集は実施例37と同一であった。腫瘍の大きさが30〜50mm3となった時から実験を開始し、CC9−PEG6.5k−P(CDC3.8k−co−LA13.8k)及びPEG5k−P(CDC3.7k−co−LA14.6k)を1:5で混合して製造したCPT・HCl担持標的自己架橋ベシクルCC9/CLPs、非標的CLPs、遊離CPT・HClを尾静脈を介して注射した。その結果、CC9/CLPs治療の18日目に、腫瘍の増殖を効果的に阻害できたが、薬物担持CLPs群は腫瘍が少々増え、マウス体重がほぼ変わらなかった。CPT・HClとPBSも腫瘍の増殖を抑制できたが、CPT・HCl群のマウスの体重が10日目に18%低減した。CC9/CLPs治療群は72日間後に全部生存していたが、CPT・HCl群は28日目に全部死亡し、PBS群も37日目に全部死亡した。
実験では、体重が18〜20g程度、4〜6週齢のBalb/Cヌードマウスを使用し、肺に5×106個の生物発光A549ヒト肺がん細胞(A549−Luc)を直接的に注射し、約10日間後に、小動物in vivoイメージングシステムによる観察において、マウスの肺に蛍光が発見され、A549同所性肺がんモデルの構築が成功した。次に、実施例20のように、cRGD−PEG6.5k−P(CDC4.6k−co−TMC18.6k)及びPEG5k−P(CDC4.9k−co−TMC19k)を1:5で混合して製造したDOX・HCl担持標的自己架橋ベシクルcRGD20/CLPs、CLPs、DOX・HCl及びPBSをそれぞれ、0、4、8及び12日目に尾静脈を介してマウス体内に注射した(DOX・HCl:10mg/kg)。0〜16日目の期間で、4日毎にマウスの体重を量り、小動物生体内イメージャーにより、マウス肺における腫瘍の生物発光の強さをモニタニングし、マウスの生存を45日間観察した。図14に示すとおり、cRGD20/CLPs治療群では、16日間以内に、肺における腫瘍の生物発光の強度が低減し続けた一方、薬物担持CLPs群では、肺における腫瘍の生物発光の強度がある程度増加した。なお、両方とも体重がほぼ変わらなかった。DOX・HClも腫瘍の増殖を抑制できたが、DOX・HCl群のマウスの体重が4日目に21%低減したことから、マウスへの有毒な副作用が大きいことが分かった。cRGD20/CLPs治療群は45日間後に全部生存していたが、DOX・HCl群は30日目に全部死亡し、PBS群も20日目に全部死亡した。したがって、薬物担持標的自己架橋ベシクルcRGD20/CLPsは、同所性肺がん腫瘍の増殖を効果的に阻害でき、マウスへの有毒な副作用がなく、腫瘍担持マウスの生存時間を効果的に延ばすことができると分かった。
A549同所性肺がんのマウスモデル構築、投与方法及び測定方法は実施例40と同一であった。cNGQ−PEG6.5k−P(CDC4.6k−co−TMC18.6k)及びPEG5k−P(CDC4.9k−co−TMC19k)を1:5で混合して製造したDOX・HCl担持標的自己架橋ベシクルcNGQ20/CLPs、非標的CLPs、DOX−LPs及びPBSを尾静脈を介して注射した。その結果は図15に示すとおり、cNGQ20/CLPs治療群では、16日間以内に、腫瘍の生物発光の強度が低減し続けたが、薬物担持CLP群では、腫瘍の生物発光の強度がある程度増加し、マウスの体重がほぼ変わらなかった。DOX−LPsも腫瘍の増殖を抑制できたが、DOX−LPsのマウスの体重が4日目に21%低減した。cNGQ20/CLPs治療群は45日間後に全部生存していたが、DOX−LPs群は32日目に全部死亡し、PBS群も23日目に全部死亡した。したがって、薬物担持標的自己架橋ベシクルcNGQ20/CLPsは同様に、同所性肺がん腫瘍の増殖を効果的に阻害でき、マウスへの有毒な副作用がなく、さらに腫瘍担持マウスの生存時間を延ばすことができると分かった。
A549同所性肺がんのマウスモデル構築、投与方法及び測定方法は実施例40と同一であった。cc9−PEG6.5k−P(CDC3.8k−co−LA13.8k)及びPEG5k−P(CDC3.7k−co−LA14.6k)を1:5で混合して製造したCPT・HCl担持標的自己架橋ベシクルCC9/CLP、非標的CLPs、CPT・HCl及びPBSをマウスに注射した。CC9/CLPs治療群では、16日目に、腫瘍の生物発光の強度が低減したが、薬物担持CLPs群では、腫瘍の生物発光の強度がある程度増加し、マウスの体重がほぼ変わらなかった。CPT・HClも腫瘍の増殖を抑制できたが、CPT・HCl群のマウスの体重が3日目に21%低減したことから、マウスへの有毒な副作用が大きいことが分かった。CC9/CLPs治療群は40日間後に全部生存していたが、CPT・HCl群は34日目に全部死亡し、PBS群は21日目に全部死亡した。したがって、薬物担持標的自己架橋ベシクルCC9/CLPsは同所性肺がん腫瘍の増殖を効果的に阻害でき、有毒な副作用がなく、さらに腫瘍担持マウスの生存時間を延ばすことができると分かった。
AA−PEG3k−P(CDC3.9k−PDSC4.8k)及びPEG1.9k−P(CDC3.6k−PDSC4.6k)を1:5で混合してPTX担持自己架橋ベシクルを製造した。次に、実施例21のように、ベシクル表面におけるアクリレート(AA)及びcRGDfCのメルカプト基のマイケル付加反応によりPTX担持標的自己架橋ベシクルcRGD/CLPを製造した。DLS測定の結果、85nmであり、粒子径分布は0.10であった。NMR及びBCAタンパク質キット計算の結果、ポリペプチドのグラフト率は92%であった。
薬物担持自己架橋ポリマーベシクル及び薬物担持標的自己架橋ポリマーベシクルの肺がんに対する体内外抗腫瘍結果
Claims (10)
- 化学構造式は、下記構造式のいずれか1つであることを特徴とする、生分解性両親媒性ポリマー。
- 前記R1は以下の基から選択される1種であり、
- 請求項1又は2に記載の生分解性両親媒性ポリマーが標的分子に結合して得られることを特徴とする、腫瘍特異的標的生分解性両親媒性ポリマー。
- 前記標的分子はcRGD、cNGQ又はcc−9であることを特徴とする、請求項3に記載の肺がん標的生分解性両親媒性ポリマー。
- ポリマーベシクルであって、その製造方法は、
(1)請求項1又は2に記載の生分解性両親媒性ポリマーから製造する方法、
(2)請求項3に記載の腫瘍特異的標的生分解性両親媒性ポリマーから製造する方法、
(3)請求項1又は2に記載の生分解性両親媒性ポリマーと、請求項3に記載の腫瘍特異的標的生分解性両親媒性ポリマーとから製造する方法、
(4)請求項1又は2に記載の生分解性両親媒性ポリマーから製造したベシクルの表面に標的分子をカップリングさせた後に得られる方法、
のいずれか1種であることを特徴とする、ポリマーベシクル。 - 自己架橋ポリマーベシクルであって、粒径が40〜180nmであることを特徴とする、請求項5に記載のポリマーベシクル。
- 請求項5に記載のポリマーベシクルの、肺がんを治療するための医薬品の担体としての使用。
- 前記肺がんを治療するための医薬品は、親水性抗がん剤又は疎水性抗がん剤であることを特徴とする請求項7に記載の使用。
- 請求項1又は2に記載の生分解性両親媒性ポリマーの、肺がんを治療するためのナノ医薬品の製造のための使用。
- 請求項5に記載のポリマーベシクルの、肺がんを治療するためのナノ医薬品の製造のための使用。
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