CN111297827B - 一种含有ccl19重组表达基因的叶酸修饰的纳米制剂及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含有CCL19重组表达基因的叶酸修饰的纳米制剂，它是以CCL19的重组表达基因为活性成分，加上叶酸修饰的聚合物形成的纳米制剂。本发明还公开了前述纳米制剂的制备方法和用途。本发明含有CCL19重组表达基因的叶酸修饰的纳米制剂可以高效地将CCL19重组表达基因转入细胞，提高CCL19表达效率，治疗结肠癌的效果优良，临床应用前景良好。

Description

一种含有CCL19重组表达基因的叶酸修饰的纳米制剂及其制 备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种含有CCL19重组表达基因的纳米制剂及其制备方法和用途。
背景技术
CCL19(Chemokine C-C motif ligand 19)属于CC类趋化因子，又称EB病毒诱导分子或人巨噬细胞炎性蛋白3β，主要在次级淋巴组织和器官如脾和淋巴结的T细胞中表达，趋化幼稚T细胞和成熟DC细胞。CCL19在抗肿瘤中起着关键作用，主要通过以下途径：诱导树突状细胞进入肿瘤组织；介导T细胞参与杀伤肿瘤细胞；肿瘤组织中表达的CCL19诱导免疫细胞浸润肿瘤，释放其他细胞因子；直接与CCR7受体结合，激活受体后通路抑制肿瘤增殖、侵袭及转移。CCL19招募免疫细胞到肿瘤部位，诱导抗原提呈和效应细胞活化，增强肿瘤局部多种免疫因子，克服肿瘤微环境的免疫抑制，在肿瘤的免疫治疗中趋化抗原提呈细胞等方面发挥重要作用。研究表明,CCL19能够明显抑制肿瘤的生长和转移,以及延长荷瘤动物的生存时间。
但是，低转染效率极大的限制了CCL19在抗癌药物中的应用。为了提高基因的转染效率，能够将基因运载进入体内的载体引起了广泛的研究。目前使用的基因载体主要包括两大类：病毒载体和非病毒载体。病毒载体包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺病毒相关载体，可高效地将治疗基因传递到细胞内，但其规模生产难度大，可递送的基因容量小，易引起免疫反应，有潜在的生物安全风险。非病毒基因载体包括脂质体、阳离子纳米粒、无机纳米粒子载体等，具有免疫原性低，安全性较好，易大规模生产等特点，是当前基因导入系统研究的热点。
但是，目前还未见报道能够将CCL19高效转染进入细胞的基因载体，含有CCL19基因的高效抗肿瘤药物也还未见报道。
发明内容
为了克服现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种含有CCL19重组表达基因的叶酸修饰的纳米制剂，它是以CCL19的重组表达基因为活性成分，加上聚合物形成的纳米制剂。
进一步地，所述CCL19重组表达基因的核苷酸酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述的聚合物是以DOTAP，MPEG-PLA和Fa-MPEG-PLA作为原料制得的聚合物。
进一步地，所述DOTAP和MPEG-PLA和Fa-MPEG-PLA的质量比为：2:14:3～4:14:3，优选3:14:3；
和/或，所述MPEG-PLA的分子量为5000，且其中MPEG嵌段的分子量为2000，PLA嵌段的分子量为3000；所述Fa-MPEG-PLA是上述MPEG-PLA接上等摩尔的叶酸后得到的。
进一步地，所述CCL19重组表达基因与聚合物的质量比为1:(25～150)；优选为1：(25～100)。
本发明还提供了一种制备上述含有CCL19重组表达基因的纳米制剂的方法，步骤如下：
a、称取原料，溶于有机溶剂；所述原料是DOTAP，MPEG-PLA和Fa-MPEG-PLA；
b、减压除去有机溶剂，再在室温高真空条件保温；
c、水化脱膜，过滤，得聚合物；
d、将CCL19的重组表达基因与聚合物混合，孵育既得。
进一步地，步骤a所述原料与有机溶剂的质量体积比为(95～105):4mg/ml；所述有机溶剂为丙酮；和/或，步骤b所述减压除去有机溶剂的温度为55℃，时间为1h；所述保温时间为6h以上。
进一步地，步骤c所述水化脱膜的溶液为葡萄糖溶液，优选5％葡萄糖溶液；所述水化脱膜的温度是55℃，时间为1h；所述过滤为用0.22μm微孔滤膜过滤；和/或，步骤d所述孵育是室温孵育30min。
本发明还提供了上述含有CCL19重组表达基因的叶酸修饰的纳米制剂在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
进一步地，所述肿瘤是结肠癌。
CCL19重组表达基因，SEQ ID NO.1；EGFP重组表达基因，SEQ ID NO.2。
本发明含有CCL19重组表达基因的纳米制剂可以高效地将CCL19重组表达基因转入细胞，能够有效治疗肿瘤结肠癌，特别是结肠癌，应用前景优良。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1各纳米制剂转染细胞的结果，其中A为显微镜观察细胞转染效率，B为流式细胞仪检测细胞转染效率，C为CCL19的表达检测。
图2各纳米制剂体内治疗结肠癌的结果图，其中A为小鼠的体重变化，B为小鼠的肿瘤图片，C为肿瘤重量，D为小鼠腹水体积，E为小于3mm的肿瘤结节，F为大于3mm的肿瘤结节，G为腹水红细胞密度。其中，*表示P小于0.05，**表示P小于0.01。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
DOTAP(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺；MPEG-PLA，分子量为2000-3000；Fa-PEG-PLA是上述分子量为2000～3000的MPEG-PLA接上等摩尔的叶酸后得到的。
实施例1含有CCL19重组表达基因的叶酸修饰的纳米制剂的制备
a、将20mg DOTAP,15mgFa-PEG-PLA和65mg MPEG-PLA溶解于4ml丙酮；
b、55℃减压除去有机溶剂，时间为1h，再于室温、高真空条件下保持6h以上；
c、用5％葡萄糖溶液水化脱膜，水浴温度55℃，时间1h；脱膜后，用0.22μm微孔滤膜过滤，制得纳米基因载体，记为F-DMA；
d、F-DMA与pCCL19(基因序列如SEQ ID NO.1所示)按质量比25:1，50：1，100：1和150：1混合，室温孵育30min，即制得质粒/纳米组合物，记为F-DMA/CCL19。
实施例2含有CCL19重组表达基因的叶酸修饰的纳米制剂的制备
a、将10mg DOTAP,15mgFa-PEG-PLA和75mgMPEG-PLA溶解在4ml丙酮；
b、55℃减压除去有机溶剂，时间为1h，再于室温、高真空条件下保持6h以上。
c、用5％葡萄糖溶液水化脱膜，水浴温度55℃，时间1h；脱膜后，用0.22μm微孔滤膜过滤，制得纳米基因载体，记为F-DMA；
d、F-DMA与pCCL19按质量比25:1，50：1，100：1和150：1混合，室温孵育30min，即制得质粒/纳米组合物，记为F-DMA/CCL19。
实施例3含有CCL19重组表达基因的叶酸修饰的纳米制剂的制备
a、将15mg DOTAP,70mgMPEG-PLA和15mgFa-PEG-PLA溶解在5ml丙酮；
b、55℃减压除去有机溶剂，时间为1h，再于室温、高真空条件下保持6h以上。
c、用5％葡萄糖溶液水化脱膜，水浴温度55℃，时间1h；脱膜后，用0.22μm微孔滤膜过滤，制得纳米基因载体，记为F-DMA；
d、F-DMA与pCCL19按质量比为25:1，50：1，100：1和150：1混合，室温孵育30min，即制得质粒/纳米组合物，记为F-DMA/CCL19。
实施例4含有EGFP重组表达基因的叶酸修饰的纳米制剂的制备
a、将15mg DOTAP,70mgMPEG-PLA和15mgFa-PEG-PLA溶解在5ml丙酮；
b、55℃减压除去有机溶剂，时间为1h，再于室温、高真空条件下保持6h以上。
c、用5％葡萄糖溶液水化脱膜，水浴温度55℃，时间1h；脱膜后，用0.22μm微孔滤膜过滤，制得纳米基因载体，记为F-DMA；
d、F-DMA与pEGFP按质量比为25:1，50：1，100：1和150：1混合，室温孵育30min，即制得质粒/纳米组合物，记为F-DMA/pEGFP。
对比例1叶酸修饰的纳米载体复合物(F-DMA)的制备
a、将15mg DOTAP,15mgFa-PEG-PLA和70mg MPEG-PLA溶解于4ml丙酮；
b、55℃减压除去有机溶剂，时间为1h，再于室温、高真空条件下保持6h以上；
c、用5％葡萄糖溶液水化脱膜，水浴温度55℃，时间1h；脱膜后，用0.22μm微孔滤膜过滤，制得纳米基因载体，记为F-DMA；
对比例2空质粒和叶酸修饰的纳米载体复合物(F-DMA/pVax)的制备
a、将15mg DOTAP,15mgFa-PEG-PLA和70mg MPEG-PLA溶解于4ml丙酮；
b、55℃减压除去有机溶剂，时间为1h，再于室温、高真空条件下保持6h以上；
c、用5％葡萄糖溶液水化脱膜，水浴温度55℃，时间1h；脱膜后，用0.22μm微孔滤膜过滤，制得纳米基因载体，记为F-DMA；
d、F-DMA与pVax按质量比为100：1混合，室温孵育30min，即制得质粒/纳米组合物，记为F-DMA/pVax。
对比例3非叶酸修饰的DMA和CCL19重组质粒(DMA/CCL19)的制备
a、将15mg DOTAP和85mg MPEG-PLA溶解于4ml丙酮；
b、55℃减压除去有机溶剂，时间为1h，再于室温、高真空条件下保持6h以上；
c、用5％葡萄糖溶液水化脱膜，水浴温度55℃，时间1h；脱膜后，用0.22μm微孔滤膜过滤，制得纳米基因载体，记为DMA；
d、DMA与pCCL19按质量比为100：1混合，室温孵育30min，即制得质粒/纳米组合物，记为DMA/CCL19。
对比例4含有EGFP重组表达基因的非叶酸修饰的纳米制剂的制备
a、将15mg DOTAP和85mgMPEG-PLA溶解在5ml丙酮；
b、55℃减压除去有机溶剂，时间为1h，再于室温、高真空条件下保持6h以上。
c、用5％葡萄糖溶液水化脱膜，水浴温度55℃，时间1h；脱膜后，用0.22μm微孔滤膜过滤，制得纳米基因载体，记为DMA；
d、DMA与pEGFP按质量比,25:1，50：1，100：1和150：1混合，室温孵育30min，即制得质粒/纳米组合物，记为DMA/pEGFP。
以下用实验例的方式来说明本发明的有益效果：
实验例1 本发明纳米制剂的转染细胞实验
1、实验方法
药物：DMA/pEGFP，参照对比例4的方法制得，其中DOTAP和MPEG-PLA的质量比为3:17，DMA与pEGFP按质量比为25:1；F-DMA/pEGFP，参照实施例4的方法制得，其中DOTAP、Fa-PEG-PLA和MPEG-PLA的质量比为3:3:14，F-DMA与pEGFP按质量比为25:1；DMA/pCCL19，参照对比例3的方法制得的，其中DOTAP和MPEG-PLA的质量比为3:17，DMA与pCCL19的质量比为25:1；F-DMA/pCCL19，参照实施例1的方法制得的，其中DOTAP、Fa-PEG-PLA和MPEG-PLA的质量比为3:3:14，F-DMA与pCCL19的质量比为25:1；F-DMA，对比例1制得的；F-DMA/pVax，对比例2制得的。
将3×105个结肠癌Ct26细胞每孔的密度种植在6孔板中，第二天用1640培养基转染细胞，分别用DMA/pEGFP和F-DMA/pEGFP转染，5小时后换液，24小时后荧光显微镜观察，并用流式细胞仪检测。
将3×105个结肠癌Ct26细胞每孔的密度种植在6孔板中，第二天用1640培养基转染细胞，分别用DMA/pCCL19和F-DMA/pCCL19转染，以生理盐水(GS)、F-DMA、F-DMA/pVax作为对照。5小时后换液，48小时后Elisa检测CCL19的表达。
2、实验结果
如图1所示，从(A)、(B)可以看出体外转染小鼠结肠癌细胞ct26时，DMA/pEGFP和F-DMA/pEGFP对细胞的转染效率分别为35.1％和56.9％；从(C)可以看出，现DMA/pCCL19和F-DMA/pCCL19转染细胞后，CCL19的表达量分别为3845pg/mL和4570pg/mL。说明本发明纳米制剂可以有效将基因带入细胞中，并高效表达，并且叶酸修饰后的纳米基因载体F-DMA能够有效提高转染和表达效率。
实验例2 本发明纳米制剂治疗结肠癌实验
1、实验方法
药物：F-DMA，对比例1制得的；F-DMA/pVax，对比例2制得的；F-DMA/CCL19是参照实施例1的方法制得的，其中DOTAP、MPEG-PLA和Fa-PEG-PLA的质量比为3:14:3，F-DMA与pCCL19的质量比为100:1；DMA/CCL19，参照对比例3的方法制得的，其中DOTAP和MPEG-PLA的质量比为3:17，DMA与pCCL19的质量比为100:1。
将Balb/C雌性小鼠饲养于无特定病原体(SPF)屏障环境中。4～6周龄健康小鼠腹腔接种约2×105个结肠癌Ct26细胞/只，接种7天后按照体重随机分组(每组6只)并给药，具体分组为：对照组(NS，即生理盐水组)，空载体组(F-DMA)，空质粒和叶酸修饰的纳米载体复合物组(F-DMA/pVax)，CCL19重组质粒和纳米载体复合物组(F-DMA/CCL19)，非叶酸修饰的DMA和CCL19重组质粒组(DMA/CCL19)。给药方式为腹腔注射，每两天注射1次，给药剂量为每只小鼠20μg质粒/200μl，连续给药6次。
处死小鼠，解剖后记录肿瘤的重量、小于3mm的肿瘤结节、大于3mm的肿瘤结节、小鼠腹水体积、腹水红细胞密度。
抑瘤率＝(1-给药组肿瘤重量/对照组肿瘤重量)×100％
2、实验结果
如图2所示，跟其他对照组相比，本发明CCL19重组质粒和纳米载体复合物组(F-DMA/CCL19)达到了最佳的抗肿瘤效果。此外，DMA/CCL19组抑瘤率为53.2％,F-DMA/CCL19组抑瘤率达83.9％，说明与DMA/CCL19相比，本发明的F-DMA/CCL19组具有显著提高的抗肿瘤效果，两组具有显著性差异。
综上，本发明提供了一种含有CCL19重组表达基因的纳米制剂及其制备方法和用途。实验结果说明，本发明含有CCL19重组表达基因的纳米制剂可以高效地将CCL19重组表达基因转入细胞，提高CCL19表达效率，能够有效治疗结肠癌，应用前景优良。
SEQ ID NO.1
ATGGCCCCCCGTGTGACCCCACTCCTGGCCTTCAGCCTGCTGGTTCTCTGGACCTTCCCAGCCCCAACTCTGGGGGGTGCTAATGATGCGGAAGACTGCTGCCTGTCTGTGACCCAGCGCCCCATCCCTGGGAACATCGTGAAAGCCTTCCGCTACCTTCTTAATGAAGATGGCTGCAGGGTGCCTGCTGTTGTGTTCACCACACTAAGGGGCTATCAGCTCTGTGCACCTCCAGACCAGCCCTGGGTGGATCGCATCATCCGAAGACTGAAGAAGTCTTCTGCCAAGAACAAAGGCAACAGCACCAGAAGGAGCCCTGTGTCTGA
SEQ ID NO.2
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学
<120> 一种含有CCL19重组表达基因的叶酸修饰的纳米制剂及其制备方法和用途
<130> GYKH1432-2019P018332CCZ
<150> 2018113692598
<151> 2018-11-16
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 326
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atggcccccc gtgtgacccc actcctggcc ttcagcctgc tggttctctg gaccttccca 60
gccccaactc tggggggtgc taatgatgcg gaagactgct gcctgtctgt gacccagcgc 120
cccatccctg ggaacatcgt gaaagccttc cgctaccttc ttaatgaaga tggctgcagg 180
gtgcctgctg ttgtgttcac cacactaagg ggctatcagc tctgtgcacc tccagaccag 240
ccctgggtgg atcgcatcat ccgaagactg aagaagtctt ctgccaagaa caaaggcaac 300
agcaccagaa ggagccctgt gtctga 326
<210> 2
<211> 720
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFP基因序列
<400> 2
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

Claims (9)

1.一种含有CCL19重组表达基因的叶酸修饰的纳米制剂，其特征在于：它是以CCL19的重组表达基因为活性成分，加上聚合物形成的纳米制剂；所述CCL19重组表达基因与聚合物的质量比为1：100；
所述的聚合物是以DOTAP，MPEG-PLA和Fa-MPEG-PLA作为原料制得的聚合物，所述DOTAP和MPEG-PLA和Fa-MPEG-PLA的质量比为：3:14:3。
2.根据权利要求1所述的纳米制剂，其特征在于：所述CCL19重组表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的纳米制剂，其特征在于：所述MPEG-PLA的分子量为5000，且其中MPEG嵌段的分子量为2000，PLA嵌段的分子量为3000；所述Fa-MPEG-PLA是上述MPEG-PLA接上等摩尔的叶酸后得到的。
4.一种制备权利要求1～3任意一项所述含有CCL19重组表达基因的纳米制剂的方法，步骤如下：
a、称取原料，溶于有机溶剂；所述原料是DOTAP，MPEG-PLA和Fa-MPEG-PLA；
b、减压除去有机溶剂，再在室温高真空条件保温；
c、水化脱膜，过滤，得聚合物；
d、将CCL19的重组表达基因与聚合物混合，孵育既得。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤a所述原料与有机溶剂的质量体积比为(95～105):4mg/ml；所述有机溶剂为丙酮；步骤b所述减压除去有机溶剂的温度为55℃，时间为1h；所述保温时间为6h以上。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤c所述水化脱膜的溶液为葡萄糖溶液；所述水化脱膜的温度是55℃，时间为1h；所述过滤为用0.22μm微孔滤膜过滤；步骤d所述孵育是室温孵育30min。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述葡萄糖溶液为5％葡萄糖溶液。
8.权利要求1～3任意一项所述含有CCL19重组表达基因的叶酸修饰的纳米制剂在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述肿瘤是结肠癌。
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