CN112004559A - 用于在线粒体内表达蛋白质的核酸、包封有所述核酸的脂质膜结构体和它们的应用 - Google Patents

用于在线粒体内表达蛋白质的核酸、包封有所述核酸的脂质膜结构体和它们的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及将下述a)至d)中任一者所示的核酸包封而成的线粒体靶向性脂质膜结构体。a)一种RNA，其为依次包含第一线粒体tRNA的碱基序列、编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列和第二线粒体tRNA的碱基序列的RNA，上述mRNA的碱基序列具有作为色氨酸密码子的一个或两个以上的UGA；b)一种DNA，其包含启动子的碱基序列和与a)的RNA互补的碱基序列；c)一种RNA，其为包含编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列和存在于其3’末端侧的多聚A链的碱基序列的RNA，上述mRNA的碱基序列具有作为色氨酸密码子的一个或两个以上的UGA、作为起始密码子的AUG和作为终止密码子的UAA；d)一种DNA，其包含启动子的碱基序列和与c)的RNA互补的碱基序列。

Description

用于在线粒体内表达蛋白质的核酸、包封有所述核酸的脂质 膜结构体和它们的应用
技术领域
本发明涉及用于在线粒体内表达蛋白质的核酸、包封有上述核酸的线粒体靶向性脂质膜结构体、上述核酸或上述脂质膜结构体在药物组合物中的使用或细胞制剂的制造中的使用、以及用于对作为线粒体蛋白的ND3的点突变进行定量的引物DNA组。
背景技术
作为细胞的细胞器之一的线粒体包含在细胞核内由核基因组DNA转录翻译并被移送至线粒体内的线粒体蛋白(来源于核DNA的线粒体蛋白)、以及由独立于细胞核的线粒体基因组DNA所编码并在线粒体内进行转录翻译的线粒体蛋白(来源于线粒体DNA的线粒体蛋白)。编码这些蛋白质的基因组DNA中的突变与各种疾病(脑肌病、神经变性疾病、癌症、糖尿病等)的相关性已有很多报道，将这些疾病统称为线粒体病。以下，只要没有特别声明，本发明以人的线粒体作为代表例来进行说明。另外，只要没有特别声明，术语“线粒体蛋白”作为包含来源于核DNA的线粒体蛋白和来源于线粒体DNA的线粒体蛋白的术语来使用。
目前，正在进行研究开发的线粒体病的治疗方法之一是基因治疗，其目的在于将可期待治疗效果的蛋白质、例如与突变的线粒体蛋白对应的野生型蛋白送入线粒体内。为了实现基因治疗，提出了能够将在细胞核内转录并在细胞质中翻译的目标蛋白质移送至线粒体内的外源基因表达系统和能够在线粒体内直接表达目标蛋白质的外源基因表达系统等。
与在细胞质中表达的目标蛋白质向线粒体内的移送相关地开发了多种多样的表达载体。其中大多利用来源于核DNA的线粒体蛋白所具有的线粒体靶向信号肽(mitochondrial targeting signal peptide、MTS)。具体而言，将编码在上游具有MTS的目标蛋白质(MTS附加蛋白)的表达载体送达至细胞核中，使MTS附加蛋白在细胞质中表达，并送达至线粒体中。
该方法存在下述问题：虽然对某种目标蛋白质可能有用，但对于来源于线粒体DNA的线粒体蛋白的适用性低。这是因为，来源于线粒体DNA的线粒体蛋白大多在细胞质内为不溶性，因此在细胞质中表达的来源于线粒体DNA的线粒体蛋白会发生凝聚，向线粒体中的转移变得不充分。
专利文献1公开了使用编码由提高了水溶性的MTS和特定的来源于线粒体DNA的线粒体蛋白构成的MTS附加蛋白的表达载体来抑制目标蛋白质在细胞质中的凝聚的方法。但是，来源于线粒体DNA的线粒体蛋白在处于线粒体以外的细胞内细胞器时多会显示出细胞毒性，因此可利用专利文献1中记载的方法的目标蛋白质的范围受限。
另外，利用MTS附加蛋白的上述方法会干扰原来的线粒体蛋白的细胞内输送或者与其竞争，因此有可能给细胞造成致死性损伤，作为基因治疗的工具令人担忧。
另一方面，利用能够在线粒体内直接表达目标蛋白质的外源基因表达系统时，首先要求线粒体内的必要充分量的目标蛋白质的转录表达。为了符合该目的，选择来源于线粒体基因组DNA中存在的基因的启动子、例如HSP(重链启动子，heavy strand promoter)，设计出若干种载有在其调控下编码目标蛋白质的DNA的表达载体。还设法在该表达载体中使用线粒体基因组DNA中利用频率高的三联体密码子。但是，迄今为止，这些表达载体的表达水平尚未达到对于疾病治疗而言必要充分的区域。
例如，非专利文献1中提出了下述方法：在附加有MTS的人造病毒载体的内部包封在处于HSP调控下的线粒体内进行转录诱导的DNA，向线粒体中直接导入病毒载体，使其表达目标蛋白质。该方法具有由所导入的病毒载体表达的目标蛋白质的表达水平比较高的优点，但另一方面，伴有因病毒载体引起的安全性的问题，此外对于目标蛋白质是否如期待那样在线粒体内表达完全未进行验证。
作为能够在线粒体内直接表达目标蛋白质的外源基因表达系统之一，本发明人提出了具有在动物细胞的细胞核内显示出转录活性的启动子序列、并且在上述启动子序列的调控下具有包含一个或两个以上的TGA作为与色氨酸对应的密码子的编码目标蛋白质的编码区域的重组表达载体(专利文献2)。通过利用线粒体靶向性脂质膜结构体将该表达载体送达至线粒体内，能够避免细胞质内的不希望的目标蛋白质的翻译，进而能够进一步提高目标蛋白质在线粒体内的表达量，但对于目标蛋白质在线粒体内的高效表达的需求依然很高。
在上述的现有技术中，送达至线粒体内的核酸主要是DNA，但随着近年的RNA合成技术的进步，提出了代替DNA而将RNA直接送达至线粒体内的基因治疗策略。但是，尚未开发出能够将编码目标蛋白质的RNA送达至线粒体内的可适应临床应用的方法。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Yu,H.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2012,109:E1238-47
专利文献
专利文献1：US2015/0225740
专利文献2：WO2017/090763
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的在于提供用于在线粒体内高效地表达蛋白质的RNA和DNA以及将它们导入线粒体中的方法。
用于解决问题的方法
本发明人发现，通过将碱基序列具有一定特征的核酸、特别是RNA送达至线粒体内，能够在线粒体内进行目标蛋白质的高效表达，从而完成了以下的发明。
(1)一种线粒体靶向性脂质膜结构体，其是将下述a)至d)中任一者所示的核酸包封而成的：
a)一种RNA，其为依次包含第一线粒体tRNA的碱基序列、编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列和第二线粒体tRNA的碱基序列的RNA，上述mRNA的碱基序列具有作为色氨酸密码子的一个或两个以上的UGA；
b)一种DNA，其包含启动子的碱基序列和与a)的RNA互补的碱基序列；
c)一种RNA，其为包含编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列和存在于其3’末端侧的多聚A链的碱基序列的RNA，上述mRNA的碱基序列具有作为色氨酸密码子的一个或两个以上的UGA、作为起始密码子的AUG和作为终止密码子的UAA；
d)一种DNA，其包含启动子的碱基序列和与c)的RNA互补的碱基序列的DNA。
(2)如(1)所述的脂质膜结构体，其中，上述a)中的mRNA的碱基序列和两个线粒体tRNA的碱基序列是连续的。
(3)如(1)所述的脂质膜结构体，其中，上述c)中的mRNA的碱基序列和多聚A链的碱基序列是连续的。
(4)如(1)至(3)中任一项所述的脂质膜结构体，其中，目标蛋白质为野生型的来源于线粒体DNA的线粒体蛋白。
(5)如(1)至(4)中任一项所述的脂质膜结构体，其中，含有二油酰磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂作为脂质膜的构成脂质。
(6)如(1)至(5)中任一项所述的脂质膜结构体，其中，在脂质膜表面具有由序列号1所示的氨基酸序列构成的肽。
(7)一种用于线粒体病的治疗和/或预防的药物组合物，其含有下述a)至d)中任一者所示的核酸作为有效成分：
a)一种RNA，其为依次包含第一线粒体tRNA的碱基序列、编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列和第二线粒体tRNA的碱基序列的RNA，上述mRNA的碱基序列具有作为色氨酸密码子的一个或两个以上的UGA；
b)一种DNA，其包含启动子的碱基序列和与a)的RNA互补的碱基序列；
c)一种RNA，其为包含编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列和存在于其3’末端侧的多聚A链的碱基序列的RNA，上述mRNA的碱基序列具有作为色氨酸密码子的一个或两个以上的UGA、作为起始密码子的AUG和作为终止密码子的UAA；
d)一种DNA，其包含启动子的碱基序列和与c)的RNA互补的碱基序列。
(8)如(7)所述的药物组合物，其中，上述a)中的mRNA的碱基序列和两个线粒体tRNA的碱基序列是连续的。
(9)如(7)所述的药物组合物，其中，上述c)中的mRNA的碱基序列和多聚A链的碱基序列是连续的。
(10)如(7)至(9)中任一项所述的药物组合物，其中，目标蛋白质为野生型的来源于线粒体DNA的线粒体蛋白。
(11)如(7)至(10)中任一项所述的药物组合物，其中，核酸被包封在线粒体靶向性脂质膜结构体中。
(12)一种用于线粒体病的治疗和/或预防的细胞制剂的制造方法，其包括在体外向来源于线粒体病患者或者有可能发生线粒体病的人的细胞中导入下述a)至d)中任一者所示的核酸：
a)一种RNA，其为依次包含第一线粒体tRNA的碱基序列、编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列和第二线粒体tRNA的碱基序列的RNA，上述mRNA的碱基序列具有作为色氨酸密码子的一个或两个以上的UGA；
b)一种DNA，其包含启动子的碱基序列和与a)的RNA互补的碱基序列；
c)一种RNA，其为包含编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列和存在于其3’末端侧的多聚A链的碱基序列的RNA，上述mRNA的碱基序列具有作为色氨酸密码子的一个或两个以上的UGA、作为起始密码子的AUG和作为终止密码子的UAA；
d)一种DNA，其包含启动子的碱基序列和与c)的RNA互补的碱基序列。
(13)如(12)所述的制造方法，其中，上述a)中的mRNA的碱基序列和两个线粒体tRNA的碱基序列是连续的。
(14)如(12)所述的制造方法，其中，上述c)中的mRNA的碱基序列和多聚A链的碱基序列是连续的。
(15)如(12)至(14)中任一项所述的制造方法，其中，目标蛋白质为野生型的来源于线粒体DNA的线粒体蛋白。
(16)如(12)至(15)中任一项所述的制造方法，其中，核酸被包封在线粒体靶向性脂质膜结构体中。
(17)一种RNA，其是包含编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列和存在于其3’末端侧的多聚A链的碱基序列的RNA，上述mRNA的碱基序列具有作为色氨酸密码子的一个或两个以上的UGA、作为起始密码子的AUG和作为终止密码子的UAA。
(18)如(17)所述的RNA，其中，mRNA的碱基序列和多聚A链的碱基序列是连续的。
(19)如(17)或(18)所述的RNA，其中，蛋白质为野生型的来源于线粒体DNA的线粒体蛋白。
(20)一种DNA，其包含启动子的碱基序列和与(17)至(19)中任一项规定的RNA互补的碱基序列。
(21)一种用于检测作为线粒体ND3基因的点突变的T10158C的试剂盒，其包含：
由包含序列号2所示的碱基序列的引物DNA与由序列号4所示的碱基序列构成的引物DNA的组合构成的野生型检测用引物DNA组；和
由包含序列号2所示的碱基序列的引物DNA与由序列号10所示的碱基序列构成的引物DNA的组合构成的突变型检测用引物DNA组。
(22)如(21)所述的试剂盒，其中，包含序列号2所示的碱基序列的引物DNA为由序列号3所示的碱基序列构成的引物DNA。
(23)如(21)所述的试剂盒，其中，包含序列号2所示的碱基序列的引物DNA为由在序列号3所示的碱基序列中使5’末端和/或3’末端的1个或2个碱基缺失而得到的碱基序列构成的引物DNA。
(24)如(21)或(23)所述的试剂盒，其中，包含序列号2所示的碱基序列的引物DNA为由序列号2所示的碱基序列构成的引物DNA。
发明效果
本发明的脂质膜结构体和核酸能够在线粒体中更高效且选择性地表达目标蛋白质，因此能够作为更安全且效果更优良的线粒体病治疗用的药物利用或者在细胞制剂的制造中利用。另外，通过使用本发明的引物DNA组进行PCR，能够简便地对作为线粒体ND3蛋白的点突变的T10158C的突变进行检测和定量。
附图说明
图1是示出作为本发明的一个方式的tRG-mRNA(ND3)-tRR的结构和对应的DNA的碱基序列的图。
图2是示出作为本发明的一个方式的ATG-mRNA(ND3)-polyA的结构和对应的DNA的碱基序列的图。
图3是对于为了检测线粒体ND3基因的点突变(T10158C)而设计的11种引物DNA组，使横轴为突变率的理论值、使纵轴为由定量PCR中实测的测定值算出的突变率来进行绘图而得到的校准曲线。
图4是对于图3所示的引物DNA组7和11，使横轴为突变率的理论值、使纵轴为由3次定量PCR中实测的测定值算出的突变率的平均值±标准误差来进行绘图而得到的校准曲线。
图5是示出在7SP细胞的线粒体中导入ATG-mRNA(ND3)-polyA/MITO时与线粒体ND3mRNA互补的cDNA中的T10158C突变率的变化的图。
图6是示出在7SP细胞的线粒体中导入ATG-mRNA(ND3)-polyA/MITO时与线粒体ND3mRNA互补的cDNA中的T10158C突变率的经时变化的图。
图7是示出在7SP细胞的线粒体中导入ATG-mRNA(ND3)-polyA/MITO时和利用市售的RNA导入试剂导入ATG-mRNA(ND3)-polyA时各自的与线粒体ND3 mRNA互补的cDNA中的T10158C突变率的经时变化的图。
图8是示出在7SP细胞的线粒体中导入ATG-mRNA(ND3)-polyA/MITO或tRG-mRNA(ND3)-tRR/MITO时和使用市售的RNA导入试剂导入ATG-mRNA(ND3)-polyA和tRG-mRNA(ND3)-tRR时各自的与线粒体ND3 mRNA互补的cDNA中的T10158C突变率的变化的图。
图9是示出导入有ATG-mRNA(ND3)-polyA/MITO或tRG-mRNA(ND3)-tRR/MITO和使用市售的核酸导入试剂导入有tRG-mRNA(ND3)-tRR或ATG-mRNA(ND3)-polyA的7SP细胞的线粒体呼吸能力测定的时序的图。
图10是示出导入有ATG-mRNA(ND3)-polyA/MITO或tRG-mRNA(ND3)-tRR/MITO和使用市售的核酸导入试剂导入有tRG-mRNA(ND3)-tRR或ATG-mRNA(ND3)-polyA的7SP细胞的线粒体呼吸能力测定结果的图。
图11是将线粒体呼吸能力分为基础呼吸(basal OCR、左上)、ATP产生(ATP-linkedOCR、右上)、最大呼吸(maximal OCR、左下)和备用呼吸能力(Spare Capacity、右下)来表示的图。
图12示出对在7SP细胞中添加有ATG-mRNA(ND3)-polyA/MITO时的细胞摄取能力进行评价的结果。
图13是示出ATG-mRNA(ND3)-polyA/MITO定位于被导入的细胞的线粒体中的荧光显微镜照片。图的左部示出荧光标记的脂质膜结构体，图的中央示出线粒体，图的右部示出它们的重合。
具体实施方式
核酸和包封有该核酸的脂质膜结构体
本发明提供下述a)至d)中任一者所示的核酸和将该核酸包封而成的线粒体靶向性脂质膜结构体：
a)一种RNA，其为依次包含第一线粒体tRNA的碱基序列、编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列和第二线粒体tRNA的碱基序列的RNA，上述mRNA的碱基序列具有作为色氨酸密码子的一个或两个以上的UGA；
b)一种DNA，其包含启动子的碱基序列和与a)的RNA互补的碱基序列；
c)一种RNA，其为包含编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列和存在于其3’末端侧的多聚A链的碱基序列的RNA，上述mRNA的碱基序列具有作为色氨酸密码子的一个或两个以上的UGA、作为起始密码子的AUG和作为终止密码子的UAA；
d)一种DNA，其包含启动子的碱基序列和与c)的RNA互补的碱基序列。
a)的RNA依次包含第一线粒体tRNA(以下表示为mt-tRNA)的碱基序列、编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列和第二mt-tRNA的碱基序列。
a)的RNA中，mt-tRNA的碱基序列可以从线粒体基因组中含有的对于人来说总计为22种的mt-tRNA基因的碱基序列中任意选择使用。另外，第一mt-tRNA和第二mt-tRNA的碱基序列相互可以不同，另外也可以相同。
本发明中，目标蛋白质只要是在线粒体内表达、换言之只要是期望在线粒体内发挥其功能的蛋白质即可，除了期待对线粒体病的治疗有效的蛋白质以外，还可以列举在线粒体内的表达受到学术关注的蛋白质等。从该观点出发，目标蛋白质可以是野生型的来源于核DNA的线粒体蛋白或野生型的来源于线粒体DNA的线粒体蛋白或它们的活性型突变体、任意不同种类的蛋白质等中的任意一者。特别优选的目标蛋白质为野生型的来源于核DNA的线粒体蛋白或野生型的来源于线粒体DNA的线粒体蛋白。另外，对于目标蛋白质的大小(氨基酸残基数)和化学特性(疏水性、亲水性、电荷等特性)没有特别限制。
编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列只要最终在线粒体内可被翻译成目标蛋白质即可，可以由单一的开放读码框(ORF)构成，也可以具有两个以上的外显子被内含子分割而成的构成。另外，编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列优选具有作为色氨酸(Trp)密码子的一个或两个以上的UGA。Trp密码子可以是与目标蛋白质的Trp残基对应的密码子UGG被人为地变更为UGA而得到的，另外也可以是即使将氨基酸残基置换为Trp残基也能够保持目标蛋白质的活性的位置的氨基酸残基所对应的密码子被人为地变更为UGA而得到的。这种密码子的人为变更可以利用一般的基因重组技术来进行。
在细胞质中的自mRNA的翻译中UGA相当于终止密码子，但在线粒体中的自mRNA的翻译中UGA相当于编码Trp的密码子。因此，在使用a)的RNA对动物细胞进行转化的情况下，a)的RNA即使在被送达至细胞质的脂质体时，目标蛋白质的合成也会在UGA的位置停止，因此至少无法合成目标蛋白质整体。由此，能够抑制由于在细胞质内合成了目标蛋白质整体所致的负面影响。
另一方面，在a)的RNA被送达至线粒体时，目标蛋白质的合成在UGA的位置不停止而继续进行，其结果是，适当地合成目标蛋白质整体，能够在线粒体内发挥其功能。
从抑制细胞质内的目标蛋白质的不期望的表达的观点出发，优选利用包含两个以上的UGA的碱基序列。另外，从更可靠地抑制细胞质内的目标蛋白质的不期望的功能表达的观点出发，进一步优选在更靠近5’末端(目标蛋白质的N末端)的位置含有一个或两个以上的UGA。此外，在目标蛋白质为通常在细胞质内进行翻译的蛋白质的情况下，优选对于上述UGA以外的密码子，也按照使用线粒体的密码子的方式适当改变编码序列。上述一例中，将在细胞核基因组中编码Arg残基但在线粒体基因组中编码终止密码子的AGG改造为在细胞核基因组、线粒体基因组中均编码Arg残基的CGG。
编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列优选进一步具有作为起始密码子的AUG和作为终止密码子的UAA。AUG和UAA在来源于核DNA的mRNA中主要分别作为起始密码子和终止密码子，通过在编码在线粒体内表达的目标蛋白质的mRNA中采用这些密码子，可以期待翻译效率的提高。
a)的RNA中，第一mt-tRNA的碱基序列、编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列和第二mt-tRNA的碱基序列可以经由间插序列、例如线粒体基因组中各自的5’末端侧和3’末端侧的侧翼序列等而连接，但优选不存在间插序列而直接连接、即mRNA的碱基序列和两个线粒体tRNA的碱基序列是连续的。存在间插序列的情况下，其长度为约1个碱基～约10个碱基、例如为1～6个碱基、优选为1～3个碱基。另外，a)的RNA可以在第一mt-tRNA的碱基序列的5’末端侧和第二mt-tRNA的碱基序列的3’末端侧进一步具有约1个碱基～约10个碱基、例如1～6个碱基、优选1～3个碱基的上述侧翼序列等。
a)的RNA被送达至线粒体内时，由第一mt-tRNA和第二mt-tRNA夹持的编码目标蛋白质的mRNA被翻译，合成出目标蛋白质。
需要说明的是，本发明中，a)的RNA可以是包含两个以上的编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列、并且上述mRNA的碱基序列分别在其5’末端侧和3’末端侧具有线粒体tRNA的碱基序列的RNA。在该RNA例如包含两个编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列的情况下，可以表示为：“一种RNA，其为依次包含第一线粒体tRNA的碱基序列、第一编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列、第二线粒体tRNA的碱基序列、第二编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列和第三线粒体tRNA的碱基序列的RNA，上述第一mRNA和第二mRNA的碱基序列具有作为色氨酸密码子的一个或两个以上的UGA”。该RNA的详情如以上关于a)的RNA所说明的那样，所包含的两个以上的编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列和两个以上的线粒体tRNA的碱基序列相互可以不同也可以相同。
b)的DNA为包含启动子的碱基序列和与a)的RNA即上述a)的RNA互补的碱基序列的DNA。具体而言，b)的DNA为依次包含启动子的碱基序列、与第一mt-tRNA的碱基序列互补的碱基序列、与编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列互补的碱基序列和与第二mt-tRNA的碱基序列互补的碱基序列的DNA。在此，第一mt-tRNA和第二mt-tRNA的碱基序列、目标蛋白质和编码该目标蛋白质的mRNA的碱基序列的各特征如关于a)的RNA所说明的那样。
在启动子序列的调控下具有与a)的RNA互补的碱基序列。在启动子序列的调控下具有是指，a)的RNA以可进行转录的方式与启动子序列连接，即，在利用启动子序列的转录活性开始转录的范围内存在与a)的RNA互补的碱基序列。作为示例，可以列举在距启动子序列的3’末端大概1～200个碱基的范围内存在第一mt-tRNA的情况，这样的范围根据启动子序列的种类而变化，本领域技术人员可以适当调节。
启动子只要显示出转录活性、即mRNA的转录诱导能力则没有特别限制，为了在被送达至线粒体时更高效且选择性地表达目标蛋白质，优选如专利文献WO2017/090763和US2018/0362999(这些文献的全部内容作为参考并入到本说明书中)中记载的那样在哺乳动物的细胞核内显示出转录活性的启动子。作为在哺乳动物的细胞核内显示出转录活性的启动子的示例，可以列举巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒(SV)40启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、EF1α启动子、β肌动蛋白启动子和T7启动子等，优选利用CMV启动子或RSV启动子。另外，只要不损害转录活性，这些启动子也可以是对碱基序列施加置换等突变而得到的启动子。
b)的DNA可以为单链的形态，或者也可以为与由与其互补的碱基序列构成的DNA形成的双链的形态。
通过将b)的DNA送达至线粒体，上述启动子发挥功能，a)的RNA在线粒体内被转录合成，编码目标蛋白质的mRNA被翻译，合成出目标蛋白质。
c)的RNA为包含编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列和存在于其3’末端侧的多聚A链的碱基序列的RNA，上述mRNA的碱基序列具有作为色氨酸密码子的一个或两个以上的UGA、作为起始密码子的AUG和作为终止密码子的UAA。
c)的RNA中，目标蛋白质和编码该目标蛋白质的mRNA的特征如a)的RNA中所说明的那样。另外，多聚A链是在真核生物的成熟mRNA中在3’非翻译区的下游确认到的A连续而成的序列，其长度为约40个～约60个碱基即可。
c)的RNA中，编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列和多聚A链的碱基序列可以伴有几个碱基～几十个碱基的间插序列、例如线粒体基因组中各自的5’末端侧和3’末端侧的侧翼序列等而连接，但优选不存在间插序列而直接连接、即编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列和多聚A链的碱基序列是连续的。存在间插序列的情况下，其长度为约1个碱基～约10个碱基、例如为1～6个碱基、优选为1～3个碱基。另外，c)的RNA可以在编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列的5’末端侧和多聚A链的碱基序列的3’末端侧进一步具有约1个碱基～约10个碱基、例如1～6个碱基、优选1～3个碱基的上述侧翼序列等。
d)的DNA为包含启动子的碱基序列和与c)的RNA互补的碱基序列的DNA。具体而言，d)的DNA为依次包含启动子的碱基序列、与编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列互补的碱基序列和与多聚A链的碱基序列互补的碱基序列的DNA。
在此，启动子如上述b)的DNA中所说明的那样，目标蛋白质和编码该目标蛋白质的mRNA的碱基序列的各特征如a)的RNA中所说明的那样，多聚A链的碱基序列的特征如c)的RNA中所说明的那样。另外，在启动子序列的调控下具有与c)的RNA互补的碱基序列，其含义如b)的DNA中所说明的那样。
通过将d)的DNA送达至线粒体，上述启动子发挥功能，c)的RNA在线粒体内被转录合成，经过mRNA的翻译，合成出目标蛋白质。
本发明的第一方式涉及将上述a)至d)中任一者的核酸包封而成的线粒体靶向性脂质膜结构体。第一方式中的线粒体靶向性脂质膜结构体中，作为脂质膜的构成脂质，包含鞘磷脂(SM)，优选包含二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和SM。另外，线粒体靶向性脂质膜结构体优选在脂质膜表面具有由序列号1所示的氨基酸序列构成的肽(以下表示为KALA肽)。
线粒体靶向性脂质膜结构体的优选的具体例为：在日本专利第5067733号和WO2006/095837中一并详细记载了其制造方法的脂质膜结构体，其包含DOPE和SM作为脂质膜的构成脂质，并且脂质膜表面由八精氨酸肽进行了修饰；或者在WO2017/090763和US2018/0362999中一并详细记载了其制造方法的脂质膜结构体，其包含DOPE和SM作为脂质膜的构成脂质，并且脂质膜表面由KALA肽进行了修饰。这些文献的全部内容作为参考并入本说明书中。
KALA肽由Shaheen等(Biomaterials,2011,32:6342-6350)作为具有促进脂质膜彼此的膜融合的功能的脂质膜融合性肽进行了记载。在上述脂质膜结构体的优选例中，利用了通过将该KALA肽置于脂质膜结构体的表面而将脂质膜结构体选择性地送达至作为细胞内细胞器的线粒体中的能力。
本发明的第一方式中最优选的脂质膜结构体为下述脂质膜结构体：包封有上述a)至d)中任一者的核酸，包含DOPE和SM作为脂质膜的构成脂质，并且在脂质膜的表面具有KALA肽。该脂质膜结构体可以通过依照WO2017/090763和US2018/0362999中记载的由KALA肽修饰且包封有DNA的脂质膜结构体的制造法，将DNA分别置换为上述a)至d)中任一者的核酸来制造。
药物组合物
作为本发明的另一方式，提供一种用于治疗和/或预防线粒体病的药物组合物，其含有具有如第一方式中所说明的特征的a)至d)中任一者所示的核酸作为有效成分。该药物组合物可以以原来的形态包含具有如第一方式中所说明的特征的a)至d)中任一者所示的核酸，但特别优选包含处于第一方式的线粒体靶向性脂质膜结构体的形态的核酸作为有效成分的药物组合物。
本方式的药物组合物可以以注射剂、点滴剂等非经口制剂的形态使用。另外，作为这样的非经口制剂中可使用的载体，可以列举例如生理盐水或包含葡萄糖、D-山梨醇等的等渗液之类的水性载体。
本方式的药物组合物可以包含药学上可接受的缓冲剂、稳定剂、防腐剂等添加剂之类的成分。药学上可接受的成分是本领域技术人员周知的，本领域技术人员可以在通常的实施能力的范围内根据制剂的形态从例如第十七次修订的日本药典等标准书籍所记载的成分中适当进行选择来使用。
本方式的药物组合物的给药方法没有特别限制，在非经口制剂的情况下，可以列举例如血管内给药(优选静脉内给药)、腹腔内给药、肠道内给药、皮下给药等。在一个优选实施方式中，本发明的治疗剂通过静脉内给药对生物体进行给药。
线粒体病是2009年被定为作为日本的难治病对策之一的特定疾病治疗研究事业的对象的难治病之一，是线粒体功能发生障碍而出现临床症状的疾病的总称。目前认为线粒体病中的功能异常的主体为能量产生的降低。线粒体病的病因分为核基因组DNA的异常和线粒体基因组DNA(mt-DNA)的异常，后者包括mt-DNA上的碱基的缺失/重复、点突变(质的变化)和mt-DNA量的减少(量的变化)。
本方式的药物组合物被期待通过向线粒体内供给编码与导致线粒体病的各个基因异常对应的野生型蛋白的mRNA而显示出治疗和/或预防线粒体病的效果。
本说明书中使用的治疗和/或预防包括以疾病的治愈、暂时的缓解或预防等为目的的医学上可接受的所有类型的治疗性和/或预防性介入。即，线粒体病的治疗和/或预防包括包含线粒体病的进展的延缓或停止、病变的消退或消失、发病的预防或复发的防止等在内的、各种目的的医学上可接受的介入。
本方式的药物组合物能够用于线粒体病的治疗和/或预防。因此，本方式的药物组合物的使用也可以表示为使用该组合物治疗和/或预防线粒体病的方法，本发明也提供这样的方法的发明。
此外，通过将本方式的药物组合物给药于线粒体病患者或者有可能发生线粒体病的人，可以期待能够治疗和/或预防线粒体病。这样，本发明还提供通过将有效量的本方式的药物组合物给药于线粒体病患者或者有可能发生线粒体病的人而治疗和/或预防线粒体病的方法。在此，“有效量”是指对于线粒体病的治疗和/或预防有效的量，该量根据线粒体病的症状的程度等医学上的主要因素进行适当调节。
细胞制剂的制造方法
作为本发明的又一方式，提供一种用于治疗和/或预防线粒体病的细胞制剂的制造方法，其包括在体外向来源于线粒体病患者或者有可能发生线粒体病的人的细胞中导入具有如第一方式中所说明的特征的a)至d)中任一者所示的核酸。
将要导入核酸的来源于线粒体病患者或者有可能发生线粒体病的人的细胞优选为从线粒体病患者或者有可能发生线粒体病的人采集的体细胞。作为这样的体细胞，可以列举例如从这些人的心脏、脑、骨骼肌等因线粒体病而受到侵害或者有可能受到侵害的组织中分离出的细胞、或者具有分化为构成该组织的细胞的能力的细胞。
导入到来源于线粒体病患者或者有可能发生线粒体病的人的细胞中的核酸可以为原来的形态，但从导入效率的观点出发，优选处于作为本发明的第一方式的线粒体靶向性脂质膜结构体的形态。
通过在体外向来源于线粒体病患者或者有可能发生线粒体病的人的细胞中导入具有如第一方式中所说明的特征的a)至d)中任一者所示的核酸，能够制造编码引起线粒体病的线粒体蛋白的线粒体mRNA(mt-mRNA)中的突变率降低的体细胞。将该细胞返回至线粒体病患者，能够作为用于治疗和/或预防线粒体病的细胞制剂来利用。
本发明中，mt-mRNA中的突变率是指，针对编码引起线粒体病的线粒体蛋白的特定的mt-mRNA的、全部mt-mRNA分子中的突变型分子的比例。
mt-mRNA中的突变率可以使用基因突变的定量中可使用的公知的方法，例如等位基因特异性PCR法、侵入法、等位基因特异性杂交法、二代测序法等进行定量。这些方法中，优选使用的方法之一为定量ARMS-PCR法(突变阻滞扩增系统PCR：AmplificationRefractory Mutation Systems PCR，例如V.Venegas et al,Methods Mol.Biol.2012,837,313-326，该文献的全部内容作为参考并入本说明书中)。该方法中，基于作为检测对象的点突变的碱基和其前后的碱基序列，设计出用于对野生型序列进行扩增的引物DNA组(野生型检测用引物DNA组)和用于对包含点突变的序列进行扩增的引物DNA组(突变型检测用引物DNA组)，使用各引物DNA组，以通过测定对象的mt-mRNA的逆转录反应得到的DNA作为模板，进行定量PCR。将由定量PCR确定的使用野生型检测用引物DNA组的情况下的CT值(CTwild)和使用突变型检测用引物DNA组的情况下的CT值(CTmut)代入下式中，由此能够算出突变率。
Figure BDA0002644545980000181
ΔCT＝CTwild-CTmut
点突变检测用引物DNA
本发明进一步提供一种用于检测作为线粒体ND3基因的点突变的T10158C的试剂盒，其包含由包含序列号2所示的碱基序列的引物DNA与由序列号4所示的碱基序列构成的引物DNA的组合构成的野生型检测用引物DNA组、以及由包含序列号2所示的碱基序列的引物DNA与由序列号10所示的碱基序列构成的引物DNA的组合构成的突变型检测用引物DNA组。
点突变T10158C是作为线粒体病的原因之一的基因突变(McFarland R.et al.,Ann Neurol.2004,55(1):58-64等)，mt-DNA碱基序列(人线粒体基因组DNA的碱基序列、NCBI参考序列：NC_012920.1)的第10158位的碱基在正常情况下为胸腺嘧啶，与此相对，点突变T10158C的情况下被置换为胞嘧啶。
由包含序列号2所示的碱基序列的引物DNA与由序列号4所示的碱基序列构成的引物DNA的组合构成的野生型检测用引物DNA组通过以检测对象的mt-DNA或作为由mt-mRNA得到的逆转录反应产物的cDNA作为模板来进行PCR，能够特异性地检测第10158位的碱基为胸腺嘧啶的mt-DNA或与其对应的mt-mRNA。
另外，由包含序列号2所示的碱基序列的引物DNA与由序列号10所示的碱基序列构成的引物DNA的组合构成的突变型检测用引物DNA组通过以检测对象的mt-DNA或作为由mt-mRNA得到的逆转录反应产物的DNA作为模板来进行PCR，能够特异性地检测第10158位的碱基为胞嘧啶的mt-DNA或与其对应的mt-mRNA。
包含序列号2所示的碱基序列的引物DNA例如可以为：由序列号3所示的碱基序列构成的引物DNA；或者由在序列号3所示的碱基序列的5’末端侧和/或3’末端侧附加一个或两个以上的碱基、作为示例为1～10个、优选为1～5个、更优选为1～3个、特别是1个或2个碱基而得到的碱基序列构成的引物DNA；或者由在序列号3所示的碱基序列中使5’末端和/或3’末端的一个或两个以上的碱基、作为示例为1～5个、优选为1～3个、特别是1个或2个碱基缺失而得到的碱基序列构成的引物DNA。由在序列号3所示的碱基序列中使5’末端和/或3’末端的一个或两个以上的碱基缺失而得到的碱基序列构成的引物DNA的优选例为由序列号2所示的碱基序列构成的引物DNA。
通过使用上述的野生型检测用引物DNA组和突变型检测用引物DNA组，以mt-DNA或作为由mt-mRNA得到的逆转录反应产物的cDNA作为模板来进行PCR，能够对该mt-DNA或cDNA中含有的具有点突变T10158C的分子的比例、即突变率进行定量。突变率定量的详情如上所述。
本方式的试剂盒只要包含野生型检测用引物DNA组和突变型检测用引物DNA组即可，可以进一步包含逆转录酶、PCR反应用的试剂、缓冲液等。
通过以下的实施例进一步详细对本发明进行说明，但本发明并不限定于这些示例。
实施例
实施例1包封有mRNA的脂质体的制作
1)mRNA制备用DNA的制作
合成出依次具有T7启动子、与包含5’末端侧的20个碱基的线粒体tRNAGly对应的碱基序列、编码野生型ND3蛋白的ORF、以及与包含3’末端侧的24个碱基的线粒体tRNAArg对应的碱基序列的重组DNA盒(tRG-mRNA(ND3)-tRR、序列号11、图1)。另外，合成出具有编码将起始密码子由ATA置换为ATG、将相当于终止密码子的T置换为TAA、进而在5’末端附加有50个碱基的多聚A序列的线粒体ND3蛋白的ORF的重组DNA盒(ATG-mRNA(ND3)-polyA、序列号12、图2)。在利用限制酶EcoRI和EcoRV开环的质粒pUC57-Amp中插入各DNA盒，制备出利用T7启动子由各盒转录mRNA的两种质粒DNA(pT7-tRG-mRNA(ND3)-tRR和pT7-ATG-mRNA(ND3)-polyA)。
2)mRNA的制备
利用限制酶Eco RV处理1)中制备的质粒DNA，准备直线化的质粒DNA，通过使用RiboMAX(商标)大规模RNA制造系统-T7(PROMEGA)的体外转录反应合成由T7启动子转录的RNA(序列号13和14)，使用RNA清理浓缩试剂盒(NORGEN)进行纯化。
3)包封有mRNA的MITO-Porter的制备
一边进行涡旋一边在0.18mg/mL的鱼精蛋白/HEPES缓冲溶液中添加等量的0.3mg/mL的纯化mRNA/HEPES缓冲溶液，制备核酸纳米粒子溶液(N/P比0.9)。一边进行涡旋一边在脂质溶液(DOPE:SM:STR-R8＝9:2:1、DOPE 18μL、SM 8μL、STR-R8 20μL、EtOH 62μL)中添加核酸纳米粒子溶液65μL，制备悬浮液。一边进行涡旋一边在5mL管中的HEPES缓冲液630μL中添加悬浮液后，将其加入到Amicon Ultra-4中的HEPES缓冲液4mL中，进行离心处理(1000g、25℃、8分钟)。进一步添加HEPES缓冲液4mL，再次进行离心处理(1000g、25℃、12分钟)，回收包封有mRNA的脂质体。将包封有由pT7-tRG-mRNA(ND3)-tRR转录得到的mRNA的脂质体表示为tRG-mRNA(ND3)-tRR/MITO，将包封有由pT7-ATG-mRNA(ND3)-polyA转录得到的mRNA的脂质体表示为ATG-mRNA(ND3)-polyA/MITO。将各脂质体的粒径和ζ电位(表面电位)示于表1。
[表1]
Figure BDA0002644545980000211
实施例2.线粒体RNA中的点突变(T10158C)定量规程的确立
1)引物设计
分别合成由表2所示的碱基序列构成的引物DNA。
[表2]
Figure BDA0002644545980000221
在实施例1中制作的包含编码野生型ND3蛋白的ORF的质粒DNA(pT7-ATG-mRNA(ND3)-polyA)中导入相当于点突变(T10158C)的碱基置换，制作出具有相当于ND3的点突变(T10158C)的ORF的质粒DNA(pT7-ATG-mRNA(ND3)MT-polyA)。
2)校准曲线制作
将pT7-ATG-mRNA(ND3)-polyA与pT7-ATG-mRNA(ND3)MT-polyA以规定比例混合而成的DNA混合溶液作为模板，使用由表3所示的组合构成的引物DNA组1～11和SYBR Green实时PCR反应混合物(Master Mix)(TOYOBO)，进行定量PCR。PCR条件为将95℃/1分钟→{95℃/15秒→60℃/1分钟}的反应进行40次循环。
[表3]
组1：CTwild type：正向(F)x反向(WT1)/CTmut type：正向(F)x反向(MT1)
组2：CTwild type：正向(F)x反向(WT1)/CTmut type：正向(F)x反向(MT2)
组3：CTwild type：正向(F)x反向(WT2)/CTmut type：正向(F)x反向(MT1)
组4：CTwild type：正向(F)x反向(WT2)/CTmut type：正向(F)x反向(MT2)
组5：CTwild type：正向(F)x反向(WT1)/CTmut type：正向(F)x反向(MTO)
组6：CTwild type：正向(F)x反向(WT1)/CTmut tvpe：正向(F)x反向(长MTO)
组7：CTwild type：正向(F)x反向(WT1)/CTmut type：正向(F)x反向(长MT1)
组8：CTwild type：正向(长F)x反向(WT1)/CTmut type：正向(长F)x反向(MTO)
组9：CTwild tvpe：正向(长F)x反向(WT1)/CTmut type：正向(长F)x反向(长MTO)
组10：CTwild type：正向(长F)x反向(WT1)/cTmut type：正向(长F)x反向(MT1)
组11：CTwildt type：正向(长F)x反向(WT1)/CTmut type：正向(长F)x反向(长MT1)
将使用包含野生型检测用反向引物的引物DNA组的PCR中得到的CT值(CTwild)和使用包含突变型检测用反向引物的引物DNA组的PCR中得到的CT值(CTmut)代入下式，算出各DNA混合溶液中的突变率。
Figure BDA0002644545980000231
ΔCT＝CTwild-CTmut
使横轴为突变率的理论值(正常型DNA和突变型DNA的混合比例)、使纵轴为由CT值算出的突变率来进行绘图，制作校准曲线(图3)。其结果确认到，引物DNA组7(野生型检测用组为F：序列号2和R：序列号4、突变型检测用组为F：序列号2和R：序列号10)和引物DNA组11(野生型检测用组为F：序列号3和R：序列号4、突变型检测用组为F：序列号3和R：序列号10)提供斜率大致为1、具有线性的校准曲线。对这两个引物DNA组进行3次试验，结果确认到：均得到重现性高的校准曲线，适合于T10158C突变率的定量(图4)。
实施例3.7SP细胞中的T10158C突变率的定量
1)来源于线粒体病患者的细胞的制备
由具有ND3基因的点突变(T10158C)的线粒体病(Leigh脑病)患者的皮肤活检分离皮肤成纤维细胞(7SP)细胞，传代培养后冷冻保存，制备储存细胞。
在37℃的水浴中使储存细胞1mL融解，加入DMEM(FBS+)9mL，进行离心分离(100g、4℃、7分钟)。除去上清，加入DMEM(FBS+)10mL，使细胞悬浮，全部转移至10cm培养皿中，温育(37℃、5％CO2)进行培养。在达到80～90％融合时进行传代。将培养皿用PBS(-)5mL清洗后，加入0.25％胰蛋白酶溶液，温育(37℃、5％CO2)2～3分钟，加入DMEM(FBS+)8mL，进行离心分离(100g、4℃、7分钟)。计数细胞后，以适当的浓度接种到10cm培养皿中。
2)线粒体级分和定量用DNA的制备
将7SP细胞(约1×106个细胞)悬浮于Cell Scrub缓冲液100μL中，在4℃下振荡15分钟后，进行离心分离(700g、4℃、3分钟)。除去上清后，悬浮于MIB(EDTA+)500μL中。利用注射针(27G)将细胞破碎后，进行离心分离(700g、4℃、10分钟)，回收上清，添加0.1mg/mL RNA酶溶液0.5μL，在25℃下温育10分钟。进行离心分离(700g、4℃、10分钟)，回收上清，添加到60％percoll溶液上，进行离心分离(20400g、4℃、10分钟)，回收边界面的溶液200μL。进行离心分离(20400g、4℃、15分钟)，除去上清后，加入MIB(-)500μL。再次进行离心分离(20400g、4℃、15分钟)，除去上清，得到线粒体级分。
使用RNA酶小量提取试剂盒(QIAGEN N.V)、无RNA酶的DNA酶套装(QIAGEN N.V)从线粒体级分中提取RNA，进一步使用高容量RNA-to-cDNA试剂盒(ABI)进行RNA的逆转录反应，由此制备定量用cDNA。
3)突变率的定量
使用实施例2的引物DNA组7，对与7SP细胞的线粒体ND3mRNA互补的cDNA中的T10158C的突变率进行定量，结果为82.1％。同样地对不具有T10158C的HeLa细胞的突变率进行定量，结果为0.86％，实质上为0％，由此判断使用引物DNA组7的T10158C定量系统正常地发挥出功能。
实施例4.正常mRNA向来源于线粒体病患者的细胞中的导入
向在6孔板中用2mL/孔的DMEM(FBS+)进行了约24小时预培养的7SP细胞(1×105个细胞/孔)中按照以RNA量换算为0.6、3、6、30、60ng/孔的方式分别添加ATG-mRNA(ND3)-polyA/MITO，温育3小时后，更换培养基，进一步温育48小时。温育结束后，进行与实施例3同样的操作，由7SP细胞的线粒体级分制备定量用cDNA，进行使用引物DNA组7的定量PCR，测定与ND3 mRNA互补的cDNA中的T10158C突变率的变化。其结果确认到，突变率以依赖于RNA的添加量的方式降低，通过添加60ng的RNA，突变率降低至2％(图5上)。在将培养基更换后的温育时间设定为72小时的情况下，也同样确认到与RNA添加量相应的突变率的降低(图5下)。在使用tRG-mRNA(ND3)-tRR/MITO代替ATG-mRNA(ND3)-polyA/MITO的情况下也观察到该倾向。
实施例5正常mRNA向来源于线粒体病患者的细胞中的导入
(1)仿照实施例4，按照以RNA量换算为60ng/孔的方式向7SP细胞中添加ATG-mRNA(ND3)-polyA/MITO，温育3小时后更换培养基，继续温育21天。在培养基更换起第2、3、4、5、7、14和21天回收一部分培养细胞，与实施例4同样地由线粒体级分制备定量用cDNA，测定与ND3 mRNA互补的cDNA中的T10158C突变率的经时变化。其结果确认到，到第5天为止，与对照(未处理细胞、NT)相比突变率降低(图6)。
(2)使用市售的核酸导入试剂阳离子脂质体(Lipofectamine)i MAX(LFN iMAX、ThermoFisher Scientific)，将由pT7-ATG-mRNA(ND3)-polyA转录得到的mRNA(ATG-mRNA(ND3)-polyA)按照以RNA量换算为60ng/孔的方式导入到7SP细胞中，与(1)同样地测定到第7天为止的突变率的经时变化。将该测定结果和(1)中测定的第3天～第21天的经时变化的结果合并示于图7。确认到：与使用市售的核酸导入试剂导入mRNA的情况相比，使用本发明的脂质膜结构体导入mRNA时突变率更为降低。
(3)与(1)同样地，按照以RNA量换算为30ng/孔或60ng/孔的方式将ATG-mRNA(ND3)-polyA/MITO(ATG/MITO)和tRG-mRNA(ND3)-tRR/MITO(TR/MITO)分别导入到7SP细胞中，并且使用LFN i MAX将由ATG-mRNA(ND3)-polyA和pT7-tRG-mRNA(ND3)-tRR转录得到的mRNA(tRG-mRNA(ND3)-tRR)导入到7SP细胞中，测定各细胞的3天后的突变率。将其结果示于图8。与(2)的结果同样地，确认到：与使用市售的核酸导入试剂导入mRNA的情况相比，使用本发明的脂质膜结构体导入mRNA时突变率更为降低。
实施例6线粒体功能的改善效果的确认
将7SP细胞以1×105个细胞/孔(0.5×105个细胞/mL溶液、2mL/孔)接种到6孔板中，培养24±3小时。将ATG-mRNA(ND3)-polyA/MITO或tRG-mRNA(ND3)-tRR/MITO溶液按照以RNA量换算为60ng/孔的方式用DMEM(FBS-)稀释并使其为1mL，添加到7SP细胞中，温育3小时后，将培养基更换为DMEM(FBS+)，进一步继续温育。另外，使用LFN i MAX向7SP细胞中导入tRG-mRNA(ND3)-tRR或ATG-mRNA(ND3)-polyA(RNA量60ng/孔)，温育3小时后，将培养基更换为DMEM(FBS+)，进一步继续温育。
在培养基更换起48小时后，按照图9所示的时间表依次添加寡霉素(呼吸链复合物V抑制剂；最终浓度2.0μM)、羰基氰对三氟甲氧基苯腙(FCCP、解偶联剂；最终浓度2.0μM)、鱼藤酮和抗霉素A(呼吸链复合物I和III的抑制剂；最终浓度0.5μM)，使用SeahorseXFe96Analyzer(Agilent)持续测定线粒体的耗氧率(OCR)。寡霉素添加前、寡霉素添加后、FCCP添加后、以及鱼藤酮和抗霉素A添加后的各OCR分别表示线粒体呼吸能力的评价项目中的基础呼吸(basal OCR)、ATP产生(ATP-linked OCR)、最大呼吸(maximal OCR)和备用呼吸能力(Spare Capacity)。将OCR的经时变化示于图10，将上述各评价项目的OCR示于图11。图11中，Mito1表示导入有ATG-mRNA(ND3)-polyA/MITO的细胞，Mito2表示导入有tRG-mRNA(ND3)-tRR/MITO的细胞，Mito3表示导入有不含mRNA的空脂质膜结构体NITO-Porter的细胞，Mito5表示使用LFN i MAX导入有ATG-mRNA(ND3)-polyA的细胞，Mito6表示使用LFN iMAX导入有tRG-mRNA(ND3)-tRR的细胞。
确认到：与利用不搭载mRNA的空脂质膜结构体和市售的核酸导入试剂导入mRNA的情况相比，在ATG-mRNA(ND3)-polyA/MITO和tRG-mRNA(ND3)-tRR/MITO的情况下，线粒体呼吸能力均更加升高。
实施例7.ATG-mRNA(ND3)-polyA/MITO的线粒体定位性的确认
仿照实施例1的3)制作脂质膜中包含用NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑、绿色荧光色素)标记的DOPE的荧光标记的ATG-mRNA(ND3)-polyA/MITO(F-mRNA/MITO)和不包含mRNA的NBD标记脂质膜结构体(F/MITO)。向在6孔板中用2mL/孔的DMEM(FBS+)进行了约24小时预培养的7SP细胞(1×105个细胞/孔)中按照以RNA量换算为60ng/孔的方式分别添加F-mRNA/MITO和F/MITO，温育1小时。使用FACS检测被摄取到细胞中的荧光，结果确认到：F-mRNA/MITO和F/MITO均被摄取到7SP细胞中；并且，即使搭载mRNA，向细胞中的摄取量也没有变化(图12)。
按照Abe等(J.Pharm.Sci.2016,105,734-740)的方法，将摄取F-mRNA/MITO后的7SP细胞的线粒体染色为红色后，使用共聚焦激光扫描型显微镜观察细胞内的F-mRNA/MITO的定位。其结果是，观察到绿色(F-mRNA/MITO)与红色(线粒体)重合而成的黄色，确认到F-mRNA/MITO定位于7SP细胞内的线粒体(图13)。
序列表自由文本
序列号1：KALA肽
序列号2：正向引物F
序列号3：正向引物长F
序列号4：反向引物WT1
序列号5：反向引物WT2
序列号6：反向引物MT1
序列号7：反向引物MT2
序列号8：反向引物MT0
序列号9：反向引物长MT0
序列号10：反向引物长MT1
序列号11：tRG-mRNA(ND3)-tRR DNA盒
序列号12：ATG-mRNA(ND3)-polyA DNA盒
序列号13：tRG-mRNA(ND3)-tRR RNA
序列号14：ATG-mRNA(ND3)-polyA RNA
序列表
<110> 卢卡科学株式会社（LUCA SCIENCE INC.）
<120> 用于在线粒体内表达蛋白质的核酸、包封有所述核酸的脂质膜结构体和它们的应用
（NUCLEIC ACID FOR EXPRESSION OF PROTEIN IN MITOCHONDRIA, LIPID
MEMBRANE STRUCTURE HAVING SAID NUCLEIC ACID ENCAPSULATED THEREIN
AND THEIR USE）
<130> P17HU09WO
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 1
Trp Glu Ala Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys His
1 5 10 15
Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Ala
20 25
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 2
caacaccctc ctagccttac 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 3
atcaacaccc tcctagcctt acta 24
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 4
ccgcactcgt aaggggtgca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 5
ccgcactcgt aaggggtcca 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 6
ccgcactcgt aaggggtgcg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 7
ccgcactcgt aaggggtccg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 8
ccgcactcgt aaggggtggg 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 9
agccgcactc gtaaggggtg gg 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 10
agccgcactc gtaaggggtg cg 22
<210> 11
<211> 552
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 11
gaattctaat acgactcact atagggcatc tattgatgag ggtcttactc ttttagtata 60
aatagtaccg ttaacttcca attaactagt tttgacaaca ttcaaaaaag agtaataaac 120
ttcgccttaa ttttaataat caacaccctc ctagccttac tactaataat tattacattt 180
tgactaccac aactcaacgg ctacatagaa aaatccaccc cttacgagtg cggcttcgac 240
cctatatccc ccgcccgcgt ccctttctcc ataaaattct tcttagtagc tattaccttc 300
ttattatttg atctagaaat tgccctcctt ttacccctac catgagccct acaaacaact 360
aacctgccac taatagttat gtcatccctc ttattaatca tcatcctagc cctaagtctg 420
gcctatgagt gactacaaaa aggattagac tgaaccgaat tggtatatag tttaaacaaa 480
acgaatgatt tcgactcatt aaattatgat aatcatattt accaaatgcc cctcatttac 540
ataaatgata tc 552
<210> 12
<211> 430
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 12
gaattctaat acgactcact atagggatga acttcgcctt aattttaata atcaacaccc 60
tcctagcctt actactaata attattacat tttgactacc acaactcaac ggctacatag 120
aaaaatccac cccttacgag tgcggcttcg accctatatc ccccgcccgc gtccctttct 180
ccataaaatt cttcttagta gctattacct tcttattatt tgatctagaa attgccctcc 240
ttttacccct accatgagcc ctacaaacaa ctaacctgcc actaatagtt atgtcatccc 300
tcttattaat catcatccta gccctaagtc tggcctatga gtgactacaa aaaggattag 360
actgaaccga ataaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420
aaaagatatc 430
<210> 13
<211> 520
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 13
caucuauuga ugagggucuu acucuuuuag uauaaauagu accguuaacu uccaauuaac 60
uaguuuugac aacauucaaa aaagaguaau aaacuucgcc uuaauuuuaa uaaucaacac 120
ccuccuagcc uuacuacuaa uaauuauuac auuuugacua ccacaacuca acggcuacau 180
agaaaaaucc accccuuacg agugcggcuu cgacccuaua ucccccgccc gcgucccuuu 240
cuccauaaaa uucuucuuag uagcuauuac cuucuuauua uuugaucuag aaauugcccu 300
ccuuuuaccc cuaccaugag cccuacaaac aacuaaccug ccacuaauag uuaugucauc 360
ccucuuauua aucaucaucc uagcccuaag ucuggccuau gagugacuac aaaaaggauu 420
agacugaacc gaauugguau auaguuuaaa caaaacgaau gauuucgacu cauuaaauua 480
ugauaaucau auuuaccaaa ugccccucau uuacauaaau 520
<210> 14
<211> 398
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 14
augaacuucg ccuuaauuuu aauaaucaac acccuccuag ccuuacuacu aauaauuauu 60
acauuuugac uaccacaacu caacggcuac auagaaaaau ccaccccuua cgagugcggc 120
uucgacccua uaucccccgc ccgcgucccu uucuccauaa aauucuucuu aguagcuauu 180
accuucuuau uauuugaucu agaaauugcc cuccuuuuac cccuaccaug agcccuacaa 240
acaacuaacc ugccacuaau aguuauguca ucccucuuau uaaucaucau ccuagcccua 300
agucuggccu augagugacu acaaaaagga uuagacugaa ccgaauaaaa aaaaaaaaaa 360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 398

Claims (24)

1.一种线粒体靶向性脂质膜结构体，其是将下述a)至d)中任一者所示的核酸包封而成的：
a)一种RNA，其为依次包含第一线粒体tRNA的碱基序列、编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列和第二线粒体tRNA的碱基序列的RNA，所述mRNA的碱基序列具有作为色氨酸密码子的一个或两个以上的UGA；
b)一种DNA，其包含启动子的碱基序列和与a)的RNA互补的碱基序列；
c)一种RNA，其为包含编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列和存在于其3’末端侧的多聚A链的碱基序列的RNA，所述mRNA的碱基序列具有作为色氨酸密码子的一个或两个以上的UGA、作为起始密码子的AUG和作为终止密码子的UAA；
d)一种DNA，其包含启动子的碱基序列和与c)的RNA互补的碱基序列。
2.如权利要求1所述的脂质膜结构体，其中，所述a)中的mRNA的碱基序列和两个线粒体tRNA的碱基序列是连续的。
3.如权利要求1所述的脂质膜结构体，其中，所述c)中的mRNA的碱基序列和多聚A链的碱基序列是连续的。
4.如权利要求1至3中任一项所述的脂质膜结构体，其中，目标蛋白质为野生型的来源于线粒体DNA的线粒体蛋白。
5.如权利要求1至4中任一项所述的脂质膜结构体，其中，含有二油酰磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂作为脂质膜的构成脂质。
6.如权利要求1至5中任一项所述的脂质膜结构体，其中，在脂质膜表面具有由序列号1所示的氨基酸序列构成的肽。
7.一种用于线粒体病的治疗和/或预防的药物组合物，其含有下述a)至d)中任一者所示的核酸作为有效成分：
a)一种RNA，其为依次包含第一线粒体tRNA的碱基序列、编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列和第二线粒体tRNA的碱基序列的RNA，所述mRNA的碱基序列具有作为色氨酸密码子的一个或两个以上的UGA；
b)一种DNA，其包含启动子的碱基序列和与a)的RNA互补的碱基序列；
c)一种RNA，其为包含编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列和存在于其3’末端侧的多聚A链的碱基序列的RNA，所述mRNA的碱基序列具有作为色氨酸密码子的一个或两个以上的UGA、作为起始密码子的AUG和作为终止密码子的UAA；
d)一种DNA，其包含启动子的碱基序列和与c)的RNA互补的碱基序列。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其中，所述a)中的mRNA的碱基序列和两个线粒体tRNA的碱基序列是连续的。
9.如权利要求7所述的药物组合物，其中，所述c)中的mRNA的碱基序列和多聚A链的碱基序列是连续的。
10.如权利要求7至9中任一项所述的药物组合物，其中，目标蛋白质为野生型的来源于线粒体DNA的线粒体蛋白。
11.如权利要求7至10中任一项所述的药物组合物，其中，核酸被包封在线粒体靶向性脂质膜结构体中。
12.一种用于线粒体病的治疗和/或预防的细胞制剂的制造方法，其包括在体外向来源于线粒体病患者或者有可能发生线粒体病的人的细胞中导入下述a)至d)中任一者所示的核酸：
a)一种RNA，其为依次包含第一线粒体tRNA的碱基序列、编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列和第二线粒体tRNA的碱基序列的RNA，所述mRNA的碱基序列具有作为色氨酸密码子的一个或两个以上的UGA；
b)一种DNA，其包含启动子的碱基序列和与a)的RNA互补的碱基序列；
c)一种RNA，其为包含编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列和存在于其3’末端侧的多聚A链的碱基序列的RNA，所述mRNA的碱基序列具有作为色氨酸密码子的一个或两个以上的UGA、作为起始密码子的AUG和作为终止密码子的UAA；
d)一种DNA，其包含启动子的碱基序列和与c)的RNA互补的碱基序列。
13.如权利要求12所述的制造方法，其中，所述a)中的mRNA的碱基序列和两个线粒体tRNA的碱基序列是连续的。
14.如权利要求12所述的制造方法，其中，所述c)中的mRNA的碱基序列和多聚A链的碱基序列是连续的。
15.如权利要求12至14中任一项所述的制造方法，其中，目标蛋白质为野生型的来源于线粒体DNA的线粒体蛋白。
16.如权利要求12至15中任一项所述的制造方法，其中，核酸被包封在线粒体靶向性脂质膜结构体中。
17.一种RNA，其是包含编码目标蛋白质的mRNA的碱基序列和存在于其3’末端侧的多聚A链的碱基序列的RNA，所述mRNA的碱基序列具有作为色氨酸密码子的一个或两个以上的UGA、作为起始密码子的AUG和作为终止密码子的UAA。
18.如权利要求17所述的RNA，其中，mRNA的碱基序列和多聚A链的碱基序列是连续的。
19.如权利要求17或18所述的RNA，其中，蛋白质为野生型的来源于线粒体DNA的线粒体蛋白。
20.一种DNA，其包含启动子的碱基序列和与权利要求17至19中任一项规定的RNA互补的碱基序列。
21.一种用于检测作为线粒体ND3基因的点突变的T10158C的试剂盒，其包含：
由包含序列号2所示的碱基序列的引物DNA与由序列号4所示的碱基序列构成的引物DNA的组合构成的野生型检测用引物DNA组；和
由包含序列号2所示的碱基序列的引物DNA与由序列号10所示的碱基序列构成的引物DNA的组合构成的突变型检测用引物DNA组。
22.如权利要求21所述的试剂盒，其中，包含序列号2所示的碱基序列的引物DNA为由序列号3所示的碱基序列构成的引物DNA。
23.如权利要求21所述的试剂盒，其中，包含序列号2所示的碱基序列的引物DNA为由序列号3所示的碱基序列中使5’末端和/或3’末端的1个或2个碱基缺失而得到的碱基序列构成的引物DNA。
24.如权利要求21或23所述的试剂盒，其中，包含序列号2所示的碱基序列的引物DNA为由序列号2所示的碱基序列构成的引物DNA。
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