KR102315736B1

KR102315736B1 - Apoe4 rna 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102315736B1
Application number: KR1020210027335A
Authority: KR
Inventors: 이성욱; 한승렬
Original assignee: 알지노믹스 주식회사
Priority date: 2020-02-28
Filing date: 2021-03-02
Publication date: 2021-10-22
Also published as: KR20210110234A

Abstract

본 발명은 알츠하이머병 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이의 용도에 관한 것이다. 상기 트랜스-스플라이싱 리보자임은 알츠하이머병의 발병 원인이 되거나 발병 위험을 높이는 유전자의 RNA를 질환 치료에 유익한 유전자의 RNA로 치환하여 질환 원인 유전자의 발현은 낮추고, 질환 치료에 유익한 유전자의 발현은 증가시키므로 알츠하이머병의 예방 또는 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

APOE4 RNA 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이의 용도{APOE4 RNA TARGETING TRANS-SPLICING RIBOZYME AND USE THEREOF}

본 발명은 APOE4 유전자 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이의 용도 등에 관한 것이다.

경제가 발전하면서 식생활 및 위생 상태가 좋아지고, 의료 기술 또한 개선되면서 사람들의 평균 수명이 계속 연장되고 있다. 우리나라는 2000년에 65세 이상 인구 비율이 7.2%에 이르러 고령화 사회에 진입하였고, 2017년에는 그 비중이 14%를 넘어 고령사회가 되었다. 65세 이상 노인 인구의 비중이 급격히 증가하면서 만성 노인성 질환을 앓는 노인 인구가 증가하고 있으며 이는 노인 인구 및 가족들의 삶의 질을 현저히 떨어뜨리고, 사회적 비용 또한 크게 증가시킨다. 주요 노인성 질환에는 치매, 파킨슨, 뇌졸중이 있으며, 국민건강보험 공단의 자료에 따르면 2014년부터 2018년까지 치매, 파킨슨, 뇌졸중으로 진료받은 인원은 605만 9,437명에 이른다.

알츠하이머병(Alzheimer's disease)은 치매의 주요 원인 중 하나로 아밀로이드 베타 단백질, 타우 단백질 등 이상 단백질이 뇌 속에 쌓이면서 서서히 뇌 신경세포를 손상시키는 퇴행성 뇌 질환이다. 기억력을 비롯해 인지기능이 점점 떨어지고, 더 진행하면 언어·보행 장애가 나타나며 혼자서는 일상 생활이 어려워진다.

알츠하이머병 발병 기작에 대한 연구는 대부분 아밀로이드 가설에 근거하고 있으며, 이를 기반으로 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein, APP), 베타-사이트 아밀로이드 전구체 단백질 절단 효소 (β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme, BACE), 프레셀린(Presenilin) 유전자에 대한 연구, 세포 내 다른 요인과의 상호작용 및 조절에 대한 연구, 인자들의 생성, 분해 및 신호전달에 대한 연구가 주를 이루어 왔다.

아밀로이드 가설에 인해 대부분의 알츠하이머병 치료 후보 물질은 'BACE1 억제', '아밀로이드 베타 피브릴 형성 억제'에 초점이 맞춰져 있다. 그러나 아밀로이드 베타를 겨냥한 항체인 릴리의 솔라네주맙은 경도치매 환자에서 임상 3상에 실패하였고, 노바티스와 암젠이 알츠하이머 질환을 적응증으로 공동 개발 중이던 BACE1 억제제 'CNP520' 또한 환자의 인지 기능 개선에 실패하였다. 이에 알츠하이머병의 발병 원인으로 여겨졌던 아밀로이드 가설이 흔들리고 있으며, 알츠하이머병 치료를 위해서는 표적 분자를 변경하거나, 접근 방식을 변경해야 한다는 주장이 나오고 있다.

ApoE(Apolipoprotein E)는 간 및 뇌 등에서 발현하는 단백질로서, 최근 뇌에서 발현되는 ApoE 단백질과 알츠하이머와의 관련성을 뒷받침하는 연구 결과가 다수 제시되고 있다. ApoE 단백질은 ApoE2, ApoE3, 및 ApoE4의 이형태를 가지고 있으며, ApoE2는 신경세포를 보호하는 기능을 수행하고, ApoE4는 베타 아밀로이드의 축적에 기여하고 그 자체로 신경독성을 나타냄이 알려져 있다. 또한, 매타게놈 연구를 기반으로한 통계적 분석 결과 APOE4는 알츠하이머병을 유발하는 유전적 인자인 것이 밝혀졌다. 이에, 알츠하이머병 치료를 위하여 ApoE4의 기능을 차단하고자 하는 시도가 진행되고 있으나 아직 미진한 실정이다. 한편, ApoE3 christchurch (ApoE3ch) 돌연변이는 70대의 고령의 노인에서 발견된 ApoE3의 돌연변이 형태이며, 이러한 돌연변이를 가지는 사람은, 뇌 전체에서 아밀로이드 플라크가 발견이 되지만, 인지 장애가 발생하지 않는 것이 밝혀져 있다(Nature medicine 2019;11:1680-1683.).

한편, Tetrahymena thermophila로부터의 그룹 I 인트론 리보자임이 실험관 내에서 리보자임의 3' 말단에 부착되어 있는 엑손 RNA를 트랜스하게 존재하는 5'엑손을 표적으로 한 후 부착시킴으로써 별도로 존재하는 전사체와 서로 연결시킬 수 있는 트랜스-스플라이싱 반응을 일으킬 수 있음이 보고되었다. 이는 곧 그룹 I 리보자임의 트랜스-스플라이싱 반응을 통하여 여러 유전질환과 관련있는 유전자의 전사체도 보정될 수 있음을 시사하며 실제로 최근에 겸상적혈구(sickle cell) 질병을 갖은 환자의 적혈구 전구 (erythrocyte precursor) 세포에서 β-글로빈 유전자 전사체가 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의해 항-겸상적 혈구화(anti-sickling), γ-글로빈 유전자 전사체로 전환될 수 있음이 밝혀졌다.

유전자 치료 방법으로서 트랜스 스플라이싱 리보자임은 돌연변이 유전자 RNA를 정상 RNA로 보정할 수 있으며, 마찬가지 원리로 특정 유전자의 발현을 감소와 동시에 목적 유전자를 숙주세포에서 발현시킬 수 있다. 이때 리보자임은 RNA 수준에서 작동하기 때문에 숙주세포 게놈 내 무작위 위치에서 유전자의 혼입에 의한 바람직하지 않은 면역 반응 문제 및 안전성 문제 등을 야기하지 않는 장점이 있다.

이에, 본 발명자들은 APOE4를 타겟으로 하는 트랜스-스플라이싱 리보자임을 이용한 알츠하이머병 치료 방법에 대해 예의 연구하여 본 발명을 완성하였다.

Cummings et al., Alzheimer's Disease Drug Development&Emerging Therapies, Practical Neurology, 2019 Safieh et al., ApoE4: an emerging therapeutic target for Alzheimer's disease, BMC Medicine, 2019

본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위한 것으로서, 안전성 및 발현 효율이 우수한 알츠하이머병 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이를 이용한 알츠하이머병의 치료 용도를 제공하는 데 그 목적이 있다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 APOE4 RNA를 표적으로 하는 트랜스-스플라이싱 리보자임을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 트랜스-스플라이싱 리보자임은 5'- IGS (internal guide sequence)-Ribozyme^*-엑손(exon)-3'의 구조를 가질 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 IGS 영역은 APOE4 RNA의 5' UTR 영역에 특이적으로 결합하고 G/U wobble base pair을 형성할 수 있는 5 ~ 10 nt 길이의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며, 바람직하게는, APOE4 RNA의 +21, +30, +33, +49, +56, +71, +77, +80, +82, +95, +98, +104, +128, +140, +181, +229, +255, +263, +275, +326, +368, +830, 또는 +839 위치, 바람직하게는 +21, +30, 또는 +56 위치를 포함하는 영역과 상보적으로 결합하고 G/U wobble base pair을 형성할 수 있는 5 ~ 10 nt 길이의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 IGS 영역은 서열번호 2, 4, 또는 6의 염기서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 상기 트랜스-스플라이싱 리보자임은 IGS 영역의 upstream에 APOE4 유전자의 일부와 상보적으로 결합할 수 있는 AS(antisense sequence) 영역을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 AS 영역의 길이는 10 nt 내지 200 nt, 바람직하게는 50 nt 내지 150 nt 일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 트랜스-스플라이싱 리보자임은 서열번호 2로 이루어진 IGS 영역을 포함하고, 150nt 길이의 AS 영역을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 트랜스-스플라이싱 리보자임은 서열번호 4로 이루어진 IGS 영역을 포함하고, 50nt 길이의 AS 영역을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 IGS 영역과 AS 영역 사이에는 5~10개의 무작위 뉴클레오티드가 포함될 수 있으며, 상기 무작위 뉴클레오티드 서열은 제한효소 서열일 수 있고, 상기 무작위 뉴클레오티드 서열은 바람직하게 6nt 길이일 수 있으며, 도 10에 도식화된 P1 및 P10의 일부와 상보적인 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 Ribozyme^* 영역은 서열번호 7의 염기서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 엑손 영역은 알츠하이머병 예방 또는 치료용 유전자일 수 있으며, ApoE2 또는 ApoE3 christchurch 돌연변이 (R136S)을 암호화하는 염기서열의 일부 또는 전부를 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 트랜스-스플라이싱 리보자임의 염기서열 및/또는 이와 상보적인 염기서열을 포함하는 트랜스-스플라이싱 리보자임 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 발현 벡터는 상기 리보자임 유전자와 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 프로모터는 신경세포 특이적인 프로모터일 수 있고, 상기 신경세포는 뉴런(neuron), 선상세포(astrocyte), 및 희돌기교 세포(oligodendrocyte)를 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 트랜스-스플라이싱 리보자임 발현 벡터를 포함하는 유전자 전달 시스템을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 트랜스-스플라이싱 리보자임, 이를 발현할 수 있는 벡터, 및 상기 벡터를 포함하는 유전자 전달 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 트랜스-스플라이싱 리보자임, 이를 발현할 수 있는 벡터, 및 상기 벡터를 포함하는 유전자 전달 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 알츠하이머병 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 개체는 알츠하이머병의 예방 또는 치료가 필요한 인간, 보다 구체적으로 알츠하이머병 환자, 고령자(만 60세 이상), 또는 APOE4 대립 유전자 보유자일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 방법은 개체의 인지 능력 정도를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 알츠하이머병 예방 또는 치료 약제의 제조를 위한 상기 트랜스-스플라이싱 리보자임, 이를 발현할 수 있는 벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 유전자 전달 시스템의 용도를 제공한다. 본 발명에서 상기 알츠하이머병은 아밀로이드 베타 단백질, 타우 단백질 등 이상 단백질이 뇌 속에 쌓이면서 서서히 뇌 신경세포가 손상되는 신경 퇴행성 질환이며, 알츠하이머병이 진행되어 나타나는 다른 질환들, 예를 들어 알츠하이머성 치매와 같은 질환을 포함한다.

본 발명에 따른 트랜스-스플라이싱 리보자임은 알츠하이머병의 발병 원인이 되거나 발병 위험을 높이는 유전자의 RNA를 질환 치료에 유익한 유전자의 RNA로 치환하여 질환 원인이 되거나 발병 위험을 높이는 유전자의 발현은 낮추고, 질환 치료에 유익한 유전자의 발현을 표적 유전자를 발현하는 세포 또는 조직 특이적으로 증가시키므로 알츠하이머병의 예방 또는 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 APOE4 RNA를 표적하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임의 작용 기전 모식도와(도 1a), ApoE4 RNA 표적용 트랜스-스플라이싱 리보자임을 제작하기 위해 ApoE RNA 변이체들의 서열을 비교한 결과 도면이다(도 1b).
도 2는 본 발명의 ApoE4 RNA 표적용 트랜스-스플라이싱 리보자임을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 3은 APOE4 RNA의 +56번 염기를 타겟으로 하는 +56 targeting ribozyme의 트랜스 스플라이싱 효과를 확인한 것으로서, A는 +56 targeting ribozyme 에 의한 트랜스-스플라이싱 산물 생성 여부를 확인한 결과이고, B는 생성된 트랜스-스플라이싱 산물의 서열분석 결과이다.
도 4는 트랜스 스플라이싱 효율에 있어 AS 영역의 효과를 확인한 것으로서, A는 ApoE RNA 표적용 트랜스-스플라이싱 리보자임의 5' 말단에 AS 영역을 도입한 구조를 보여주고, B는 AS 영역의 도입 및 도입된 AS 영역의 길이에 따른 리보자임의 트랜스 스플라이싱 효율을 확인한 그래프이다.
도 5는 신경세포 유래 세포주에서 AS 영역의 도입 및 도입된 AS 영역의 길이에 따른 +56 targeting ribozyme 트랜스 스플라이싱 효율을 확인한 것으로서, 도 5a는 단백질 수준에서 확인한 도면이고, 도 5b에 (A)는 유전자 수준에서 확인한 도면이이고, 도 5b에 (B)는 트랜스 스플라이싱 산물의 서열분석 결과이다.
도 6은 in vitro상에서 APOE4 RNA의 reaction site mapping 실험의 모식도 및 그 결과 도면이다.
도 7은 세포 안에서 APOE4 RNA의 reaction site mapping 실험의 모식도 및 그 결과 도면이다.
도 8은 APOE4 RNA의 표적 위치를 달리한 리보자임의 트랜스 스플라이싱 효율을 확인한 도면이다.
도 9는 AS 영역의 도입 및 도입된 AS 영역의 길이에 따른 +21 targeting ribozyme 트랜스 스플라이싱 효율을 확인한 것으로서, 도 9a는 단백질 수준에서 확인한 도면이고, 도 9b는 유전자 수준에서 확인한 도면이고, 도 9c는 트랜스 스플라이싱 산물의 서열분석 결과이다.
도 10은 본 발명의 트랜스-스플라이싱 리보자임 구조 모식도로, 도 10a 는 +21 targeting ribozyme의 구조를 나타내며, 도 10b는 +30 targeting ribozyme의 구조를 나타내고, 도 10c는 +56 targeting ribozyme의 구조를 나타낸다. 각 리보자임의 IGS 영역의 upstream에는 APOE4 RNA 와 상보적인 3개의 뉴클레오타이드 영역(P1)이 포함되어 리보자임의 타겟과의 결합 특이성 및 결합력을 증가시킬 수 있다. 또한, 각 리보자임은 도 10에 도식화한바와 같이 Ribozyme^* 영역의 downstream 위치에 상기 P1영역을 포함하는 5' 영역과 상보적인 5~10nt 길이의 P10 영역을 포함하여 리보자임의 트랜스-스플라이싱 효율을 증가시킬 수 있다. AS 영역 및 exon 영역을 제외한 리보자임의 구체적인 서열과 관련하여, +21 targeting ribozyme은 서열번호 8, +30 targeting ribozyme은 서열번호 9, +56 targeting ribozyme은 서열번호 10의 염기서열로 이루어지거나 이를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명자들은 APOE4 단백질 자체의 세포독성 및 베타 아밀로이드 축적 기능과 알츠하이머병 환자 중에서 APOE4 대립 유전자 보유자가 많은 통계적 결과로부터 APOE4를 타겟으로 하는 알츠하이머병의 예방 및 치료를 위한 유전자 치료 방법에 대해 예의 연구하여 APOE4를 타겟으로 하는 트랜스 스플라이싱 리보자임을 완성하였다.

보다 구체적으로, 본 발명자들은 다양한 APOE RNA 변이체의 서열분석을 통해 5'-UTR 영역에 공통서열을 확인하고, APOE4 RNA의 +56번 염기를 포함하는 영역을 타겟으로 설정하였다. APOE4 RNA와 반응 특이성을 향상시키기 위하여 상기 타겟 영역과 상보적인 서열의 내부가이드 서열(Internal Guide Sequence, IGS)을 포함한 트랜스-스플라이싱 리보자임(+56 targeting ribozyme)을 설계하고(실시예 1), +56 targeting ribozyme이 APOE4 RNA의 원하는 위치에서 정확하게 트랜스-스플라이싱함을 확인하였다 (실시예 2 및 3).

이어서, 본 발명자들은 +56 targeting ribozyme의 표적 특이성 및 트랜스 스플라이싱 효율 증대를 위하여 리보자임의 5' 말단에 APOE RNA와 상보적인 서열을 갖는 안티센스(AS) 영역을 도입하고 3' 엑손 영역에 루시퍼라아제 유전자를 도입하여 루시퍼라아제 활성 측정을 통해 트랜스 스플라이싱 활성 정도를 확인하였다. 그 결과, AS 영역의 도입과 도입된 AS 영역의 길이는 리보자임의 트랜스-스플라이싱 효율에 영향을 미침을 알 수 있었다(실시예 3-1).

신경세포에 특이적이고 보다 효율적인 트랜스 스플라이싱 리보자임 설계를 위하여 신경세포 유래 세포주에서 동일한 실험을 수행한 결과 +56 targeting ribozyme은 150nt 길이의 AS 영역이 도입되는 경우 우수한 트랜스 스플라이싱 효율을 나타냄을 알 수 있었다(실시예 3-2).

이어서, 본 발명자들은 APOE4 RNA의 +56번 염기 이외의 표적 영역을 확보하기 위하여 APOE4 RNA와 random library ribozyme을 혼합하여 생성된 트랜스 스플라이싱 산물의 서열분석을 통하여 reaction site를 확인하고, 각 reaction site를 타겟으로 하는 리보자임의 트랜스 스플라이싱 효과를 확인한 결과, +56번 염기 이외에도 APOE4 RNA의 +21, +30, +71, 및 +77 site가 효과적인 타겟 영역으로 이용될 수 있음을 알 수 있었다. 그 중에서도 특히 APOE4 RNA의 +21 및 +30을 표적으로 하는 리보자임의 트랜스 스플라이싱 효율이 우수함을 확인하였다(실시예 4).

또한, 본 발명자들은 APOE4 RNA의 타겟 위치의 변화에 따른 최적의 AS 영역길이를 탐구한 결과, +21 targeting ribozyme은 50 nt 길이의 AS 영역이 도입되는 경우 트랜스 스플라이싱 효율이 증대됨을 확인할 수 있었다(실시예 5).

상기 결과로부터 본 발명자들은 APOE4 RNA를 표적으로 하는 리보자임에 있어서 표적 부위는 +21, +30, 및 +56 번 염기를 포함하는 것이 바람직하며, 상기 영역과 상보적인 5~10 nt 길이의 IGS 서열을 포함함으로서 APOE4 RNA 특이적으로 효율적인 트랜스 스플라이싱을 발생시킬 수 있음을 알 수 있다.

또한, APOE4 RNA를 표적으로 하는 리보자임에 있어서 IGS 영역의 upstream에 APOE4 RNA와 상보적인 서열의 AS 영역이 포함되는 경우 트랜스 스플라이싱 효율을 증가시킬 수 있으나, 효율 증대를 위한 최적의 AS 영역의 길이는 표적 부위(표적 염기)와 표적 세포에 따라 상이함을 알 수 있다.

본 발명자들은 알츠하이머병 예방 및 치료를 위하여 특히 신경세포에서 APOE4 단백질 발현 저하를 위한 트랜스 스플라이싱 리보자임을 제공하며, 상기 리보자임은 5'- IGS (internal guide sequence)-Ribozyme^*-엑손(exon)-3'의 구조 또는 5'-AS(antisense) - IGS - Ribozyme^* - 엑손 -3'의 구조를 가질 수 있다.

본 발명에서 사용된 “리보자임”이라는 용어는 효소처럼 작용하는 RNA 분자 또는 그 RNA 분자를 포함하는 단백질로 구성되는 분자로 RNA 효소 또는 촉매적 RNA라고도 불린다. 명확한 3차 구조를 갖는 RNA 분자로 화학반응을 수행하며 촉매적 또는 자기촉매적 특성을 가진다. 일부 리보자임은 자기 또는 다른 RNA 분자를 절단하여 활성을 저해하고, 다른 리보자임은 리보솜의 아미노전달효소(aminotransferase) 활성을 촉매하는 것으로 알려져다. 이러한 리보자임에는 망치머리(hammerhead) 리보자임, VS 리보자임 및 헤어핀(hairpin) 리보자임 등이 포함될 수 있다.

본 명세서에서 “트랜스-스플라이싱(trans-splicing)”은 서로 다른 유전자로부터의 RNA를 서로 연결하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 리보자임은 APOE4 RNA를 절단하고 자기 RNA(특히, 리보자임의 3' exon 영역)로 치환하여 숙주세포 내에서 APOE4 단백질의 발현을 저해하고 exon 영역에 암호화된 유전자의 발현을 유도하는 트랜스-스플라이싱 리보자임을 의미한다. 본 발명에서 리보자임은 5'- IGS (internal guide sequence)-Ribozyme^*-엑손(exon)-3' 또는 5'-AS(antisense) - IGS - Ribozyme^* - 엑손 -3' 구조를 가질 수 있다. 상기 구조 내의 Ribozyme^* 영역은 트랜스-스플라이싱 리보자임 내에서 APOE4 RNA의 절단 및/또는 exon 영역으로의 치환의 기능을 수행하는 영역을 의미하고, 서열번호 7의 염기서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있다. 본 명세서 내에서 특별한 언급이 없는 한 리보자임은 실질적 기능 수행 영역인 Ribozyme^* 영역을 포함한 상기 전체 구조를 포함한 트랜스-스플라이싱 리보자임을 지칭한다.

본 발명에서 리보자임의 3' 엑손(exon) 영역에 암호화되는 유전자는 신경세포 보호 활성이 있는 것으로 알려진 공지의 단백질(또는 펩타이드)를 암호화하는 유전자일 수 있으며, 바람직하게는 APOE2 또는 APOE3 christchurch 유전자일 수 있다.

본 명세서에서 “벡터”는 적당한 숙주세포에서 트랜스 스플라이싱 리보자임을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 벡터 내에 포함된 리보자임 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 구조물을 말한다.

본 명세서에서 “작동 가능하게 연결된(operably linked)”은 일반적 기능을 수행하는 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 유전자를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다.

예를 들어, 리보자임 암호화 서열을 프로모터에 작동 가능하게 연결시키면 리보자임 암호화 서열의 발현은 프로모터의 영향 또는 조절 하에 있게 된다. 2개의 핵산 서열(리보자임 암호화 서열 및 이 서열의 5' 말단의 프로모터 부위 서열)은 프로모터 작용이 유도되어 리보자임 암호화 서열이 전사되면 작동 가능하게 연결된 것이며, 상기 두 서열 사이의 연결 특성이 프레임 변경 돌연변이(frameshift mutation)를 유도하지 않고, 발현 조절 서열이 리보자임의 발현을 저해하지 않으면 작동 가능하게 연결된 것으로 볼 수 있다. 재조합 벡터와의 작동 가능한 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서와 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.

본 발명에 따른 벡터는 바람직하게는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 또는 바이러스 벡터 등일 수 있고, 가장 바람직하게는 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 바람직하게는 레트로바이러스(Retrovirus), 예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스(Human immunodeficiency virus, HIV), 마우스 백혈병 바이러스(Murine leukemia virus, MLV), 조류 육종/백혈병 바이러스(Avian sarcoma/leucosis virus, ASLV), 비장 괴사 바이러스(Spleen necrosis virus, SNV), 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus, RSV), 마우스 유방 종양 바이러스(Mouse mammary tumor virus, MMTV) 등, 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated virus, AAV), 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus, HSV) 등에서 유래한 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 재조합 벡터는 가장 바람직하게는 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터일 수 있다.

본 발명에서 사용된 “프로모터”라는 용어는 DNA의 일부분으로 전사를 개시할 수 있도록 RNA 중합효소의 결합에 관여한다. 일반적으로 표적 유전자에 인접하여 이의 상류에 위치하며, RNA 중합효소 또는 RNA 중합효소를 유도하는 단백질인 전사 인자(transcription factor)가 결합하는 자리로서 상기 효소 또는 단백질이 올바른 전사 시작 부위에 위치하도록 유도할 수 있다. 즉, 센스 가닥(sense strand)에서 전사하고자 하는 유전자의 5' 부위에 위치하여 RNA 중합효소가 직접 또는 전사인자를 통해 해당 위치에 결합하여 표적 유전자에 대한 mRNA 합성을 개시하도록 유도하는 것으로 특정한 유전자 서열을 갖는다.

본 발명에 따른 프로모터는 신경세포에서 유전자의 발현을 높이기 위한 관점에서 신경세포 타입 특이적인 프로모터일 수 있으며, 상기 신경세포는 뉴런, 성상세포, 및 희돌기교 세포를 포함한다.

본 명세서에서 “유전자 전달 시스템(gene delivery system)”은 리보자임 유전자 및/또는 핵산 서열의 세포 내부로의 전달 효율을 높여 발현 효율을 증가시킬 수 있는 시스템을 의미하며, 바이러스 매개 시스템 및 비바이러스 시스템으로 분류될 수 있다.

바이러스 매개 시스템은 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련바이러스 벡터와 같은 바이러스성 벡터를 사용하며, 인간 세포에 감염을 일으키는 바이러스 고유의 세포 내 침투 기전을 이용하므로 비바이러스성 시스템보다 세포내 유전자 전달 효율이 비교적 높은 것으로 알려져 있다. 또한, 세포 내로 들어간 다음 비바이러스성 벡터는 엔도솜이 리소좀과 융합된 다음 엔도리소좀에서 유전자들이 분해되는 문제점이 있으나, 바이러스성 벡터는 리소좀을 통과하지 않고 핵 내로 유전자를 전달하는 기전에 의하여 유전자의 손실이 작아서 유전자 전달 효율이 높은 장점이 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 바이러스성 벡터는 상기 재조합 벡터에서 설명한 바와 같이 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스 등에서 유래한 벡터일 수 있다. 이러한 바이러스성 벡터는 바이러스 입자에 조립된 후 감염(infection)과 같은 형질도입(transduction) 방법으로 세포 내부로 도입될 수 있다.

상기 비바이러스성 시스템은 핵산 및/또는 유전자의 전달 매개체로 양이온성 지질 전달체 또는 양이온성 고분자 전달체 등을 이용하거나, 전기 천공법을 사용하는 방법이다.

양이온성 지질 전달체는 주로 양이온성 지질로 이루어진 나노미터 크기의 리포좀이나 지질 소재 나노입자의 양전하를 이용하여 음전하인 유전자, 유전자를 포함하는 발현 벡터 또는 핵산과 복합체를 형성시킨 후 이 복합체를 탐식 작용으로 세포 내로 전달하는 방법이다. 세포 내로 전달된 복합체는 엔도솜에서 리소좀으로 1차 전달된 다음 세포질로 빠져나와 발현된다. 양이온성 고분자 전달체는 지질 대신 고분자를 사용하는 것을 제외하면 양이온성 지질 전달체와 유사한 방식으로 유전자를 전달하며, 대표적인 양이온성 고분자로는 폴리에틸렌이민 (polyethyleneimine), 폴리라이신(poly-L-lysine), 키토산(chitosan) 등이 있다.

따라서, 본 발명의 재조합 벡터가 양이온성 지질 전달체 또는 양이온성 고분자 전달체와 결합하여 형성된 복합체는 유전자 전달체로 사용될 수 있다.

본 발명에서, 상기 유전자 전달 시스템은 상기 설명한 재조합 벡터를 포함하며, 바이러스 매개 시스템 및 비바이러스 시스템 모두 사용될 수 있으나, 바이러스 매개 시스템을 사용하는 것이 바림직하다.

한편, 본 발명의 트랜스-스플라이싱 리보자임은 신경세포에서 APOE4 RNA를 타겟으로 하여 APOE4 단백질 발현을 저해할 수 있고, APOE4는 알츠하이머병의 주요 발병 위험 유발 유전자로 알려져 있는바, 본 발명의 트랜스-스플라이싱 리보자임, 상기 리보자임 발현 벡터, 및 상기 벡터를 포함하는 유전자 전달 시스템은 알츠하이머병의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물에 이용될 수 있다.

본 발명에서 사용된 "예방"이라는 용어는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여로 알츠하이머병을 억제하거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용된 "치료"라는 용어는 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 조성물의 투여로 알츠하이머병이 호전되거나 그 증상을 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 칼슘 카보네이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으나, 비경구로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 정맥내, 동맥내, 뇌조직 내, 피하 투여 또는 intracisternal injection 수 있다. 본 발명에 따른 주사제는 환자에게 투여시 그대로 이용될 수 있도록 멸균 매질에 분산된 형태일 수 있으며, 투여시 주사용 증류수를 가해 적절한 농도로 분산시킨 다음 투여하는 형태일 수도 있다. 또한, 주사제로 제조될 때 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등과 혼합될 수 있고, 단위 투약 앰플 또는 다중 투약 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 단독으로 사용되거나, 또는 타 알츠하이머 치료제 또는 치료 방법과 병행하여 사용될 수 있다.

본 발명에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

이하, 본 명세서를 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세히 설명한다. 그러나, 본 명세서에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 명세서의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지는 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 명세서를 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1. ApoE4 RNA +56 targeting 트랜스-스플라이싱 리보자임 설계 및 제작

타겟 RNA 부위를 선정하기 위해 NCBI에 공개된 APOE RNA 변이체들 (V1 내지 V5)의 서열을 비교하고, 5'-UTR의 공통서열(23 bp) 중에서 리보자임과 G-U 워블 염기쌍(wobble base pair)을 형성할 수 있는 우라실(U) 염기가 포함된 서열(GCCAAU: 서열번호 1)을 타겟 부위로 선정하였다(도 1).

상기 타겟 부위는 APOE4 RNA(서열번호 11)의 +56 위치의 염기를 포함하고, 5' 말단에 상기 타겟 부위를 표적할 수 있는 IGS (GUUGGC: 서열번호 2) 과 3' 말단에는 치환하고자 하는 목적 유전자인 ApoE2를 도입된 ApoE4 RNA를 표적하는 트랜스-스플라이싱 리보자임(이하, '+56 targeting ribozyme'이라 함)을 제작하였다(도 2).

상기 +56 targeting ribozyme을 pcDNA 벡터에 클로닝하여 트랜스-스플라이싱 리보자임 발현용 벡터를 제작하였다.

실시예 2. +56 targeting 리보자임의 트랜스 스플라이싱 효과 확인

상기 실시예 1에서 제작한 +56 targeting ribozyme의 효과를 하기와 같이 확인하였다.

리보자임 1 pmole 및 ApoE4 RNA 1 pmole을 트랜스-스플라이싱 반응버퍼 (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5mM MgCl 2, pH 7.0)와 섞은 후 부피를 9 ㎕로 맞추고, 95℃에서 1분 동안 가열하였다. 37℃에서 3분 동안 방치한 뒤 1mM GTP 1 ㎕ 를 첨가하여 부피를 10 ㎕로 맞추고, 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 RNA 산물은 페놀 추출/에탄올 침전 방법으로 회수하여 DEPC(diethyl pyrocarbonate)가 처리된 증류수(D.W) 10 ㎕에 녹였다. 회수한 RNA에 RY-RT 프라이머 (5'-ATGTGCTGCAAGGCGATT―3') 10 pmole을 넣어 95℃에서 1분 동안 가열하고 상온에서 10분 동안 방치하였다. 이후 RNA에 10mM dNTP 1 ㎕, 5x RTase buffer 4 ㎕, RTase 1 ㎕ 및 DEPC가 처리된 D.W를 첨가하여 부피를 20 ㎕로 맞추고, 42℃에서 50분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다.

합성한 cDNA 2 ㎕, 5X PCR 버퍼 10 ㎕, 10mM dNTP 1 ㎕, ApoE4 전방향 프라이머 (5'- CTACTCAGCCCCAGCGGAGGTGAAGG - 3') 10 pmole, RY-TS 프라이머 (5'-TGTAAAACGACGGCCAGTG-3') 10 pmole 및 Phusion DNA taq polymerase 0.2 ㎕를 혼합하였다. 여기에 D.W를 첨가하여 부피를 50 ㎕로 맞추고, 98℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 15초 조건으로 30 사이클을 증폭시켜 트랜스-스플라이싱 산물 DNA를 수득하였다. PCR 산물 5 ㎕를 2% TBE 아가로스 젤에서 전기영동하여 트랜스-스플라이싱 산물의 생성 여부를 확인하고, 생성물의 서열분석을 수행하였다.

전기영동 결과, ApoE4 RNA가 리보자임의 3' 엑손 RNA로 치환되었을 때 생성되는 트랜스-스플라이싱 산물(131 bp)을 확인할 수 있었고, 서열분석(sequencing) 결과 생성물은 ApoE4 RNA의 5'-UTR에 리보자임의 3' 엑손 RNA가 연결된 것임을 알 수 있었다(도 3).

실시예 3. +56 targeting 트랜스-스플라이싱 리보자임 최적화

3-1. 안티센스(anti-sense: AS) 영역 도입의 효과 확인

실시예 1에서 제작한 +56 targeting ribozyme의 표적 특이성 및 트랜스-스플라이싱 효율 증가를 위해 리보자임의 5' 말단에 APOE4 RNA와 상보적인 서열을 갖는 안티센스(AS) 영역을 도입하였다. 상기 AS 영역의 길이에 따른 트랜스 스플라이싱 효율을 확인하기 위하여 상기 리보자임의 3' 엑손 영역에 루시퍼라아제 유전자를 도입하였다. AS 영역의 길이가 0nt, 50nt, 100nt, 또는 150nt일 때 루시퍼라아제 활성을 측정하였다.

보다 구체적으로, ApoE를 발현하는 Huh-7.5 세포주와 이를 발현하지 않는 293A 세포주에 각각의 리보자임 발현 벡터를 형질주입 시키고, 루시퍼라제 어세이를 진행하였다. 루시퍼라제 신호를 확인한 결과, Huh-7.5 세포주에서는 안티센스 서열 50개를 도입한 트랜스-스플라이싱 리보자임의 트랜스-스플라이싱 효율이 현저히 우수하나, 293A 세포주에서는 각 리보자임의 트랜스-스플라이싱 효율에 별 차이가 없는 것을 확인할 수 있었다(도 4의 B).

상기 결과로부터, AS 영역의 도입과 AS 영역의 길이는 리보자임의 트랜스-스플라이싱 효율에 영향을 미침을 확인할 수 있었다.

3-2. 타겟 세포주에 따른 AS 영역 길이 최적화

알츠하이머의 예방 및 치료 타겟으로서 APOE4 유전자 발현 감소를 위해 상기 트랜스-스플라이싱 리보자임은 신경세포에서 효과적으로 트랜스-스플라이싱을 수행할 수 있어야한다. 이에, 신경세포 유래 세포주에서 상기 실시예 3-1의 실험을 반복 수행하여, AS 영역의 길이에 따른 트랜스-스플라이싱 효율을 확인하였다.

보다 구체적으로, 1x10⁵ 개의 CCF-STTG1 (E3/E4, astrocyte) 세포를 12 well plate에 24시간 동안 배양하고, 서로 다른 길이(0nt, 50nt, 100nt, 또는 150nt)의 AS 영역을 포함하는 +56 targeting ribozyme을 발현하는 plasmid 벡터 500ng와 pTK-renilla luciferase plasmid 벡터 50ng을 48시간 동안 co-transfection하였다. 이어서, 배양액을 모두 제거한 뒤에 1xPBS 500ul로 1회 세척하고 passive lysis buffer (Promega, E1980, Dual-Luciferase Reporter Assay System) 100ul를 각 well에 넣어 준 뒤, 상온에서 15분간 shaking하여 세포를 용해시켰다. 용해물을 회수하고 13000 rpm으로 1분 동안 원심분리한 뒤 10ul의 상층액을 취하여 luciferase activity를 측정하였다(Promega, E1980, Dual-Luciferase Reporter Assay System). Positive control (CF)는 CMV promoter-Firefly luciferase를 사용하였다.

그 결과, AS 영역의 도입 유무와 AS 영역의 길이와 무관하게 CCF-STTG1 세포에서 리보자임에 의한 APOE4 RNA의 트랜스 스플라이싱이 유도됨을 확인할 수 있었으며, 특히 150 nt 길이의 AS 영역을 포함하는 리보자임에 의한 트랜스 스플라이싱 효율이 우수함을 확인할 수 있었다(도 5a).

상기 결과를 유전자 수준에서 재검증하기 위하여, 전기영동을 수행하여 트랜스 스플라이싱 산물(trans-splicing product)을 검출하였다. 보다 구체적으로, 2x10⁵개의 CCF-STTG1 또는 U118MG(E2/E4) 세포를 6 well plate에 24시간 동안 배양하고 2.5ug의 +56 targeting ribozyme 발현 벡터로 형질전환을 유도하였다. 48시간 경과 후 배양액을 모두 제거하고, 1xPBS 1mL로 1회 세척하여 회수된 세포와 chloroform 100uL을 혼합하여 total RNA를 추출하였다. 추출한 total RNA 1ug에 RT primer (5’ - CCCATATCGTTTCATAGCTTCTGCC - 3’)를 넣어 준 뒤 20uL volume 조건에서 역전사를 수행하여 cDNA를 생성하였다. 상기 cDNA 2uL를 정방향 프라이머 (5’ - CAGCGGAGGTGAAGGACGT - 3’), 역방향 프라이머 (5’ - ATGTTCACCTCGATATGTGCATC - 3’)과 혼합하여 95 ℃ 30 sec, 58 ℃ 30 sec, 72 ℃ 30 sec 조건으로 30 cycle PCR을 수행하고, 2% TBE agarose gel에서 PCR band를 확인하였다. 그 결과 Trans-splicing product로 예상되는 211bp PCR DNA band를 확인할 수 있었으며, 특히 150 nt 길이의 AS 영역을 포함하는 리보자임이 형질전환된 세포에서 가장 진한 밴드를 확인할 수 있었다(도 5b의 (A)).

이어서, 원하는 위치에서 트랜스 스플라이싱이 수행되었는지 확인하기 위하여 상기 211bp PCR DNA 서열분석을 수행한 결과, 트랜스 스플라이싱 예상 site에서 정확하게 트랜스 스플라이싱이 일어나 APOE RNA+reporter RNA (Firefly luciferase) fusion RNA가 생성되었음을 확인할 수 있었다(도 5b의 (B)).

실시예 4. IGS 영역 최적화

4-1. in vitro mapping

신경세포에서 APOE4 단백질 제거를 위한 다양한 툴 확보를 위하여, test tube에서 APOE4 RNA와 random library ribozyme을 혼합하여 반응시킨 뒤 RT-PCR을 수행한 후 트랜스 스플라이싱 산물로 예상되는 PCR DNA band의 서열분석을 통해 트랜스 스플라이싱이 발생한 APOE4 RNA site를 확인하였다.

보다 구체적으로, APOE4 RNA를 in-vitro transcription 과정을 통해 합성하고, 5’ end에 random한 서열을 (GNNNNN) 가지는 trans-splicing ribozyme RNA library를 in vitro transcription 과정을 통해 합성하였다. APOE4 RNA 0.1 pmole, ribozyme library RNA 1 pmole을 1X in vitro trans-splicing reaction buffer (50mM Hepes (pH 7.0), 150mM NaCl, 5mM MgCl₂)와 섞어 total 9uL로 만든 뒤, 95℃ 1 min, 37℃ 3 min에서 반응시키고, 1mM GTP 1uL를 넣어 주어, final 0.1mM GTP로 농도를 맞춘 뒤, 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응액을 phenol extraction/EtOH precipitation 과정을 거쳐 RNA를 회수한 뒤 RT-PCR을 수행하였다. 이어서, Ribozyme specific RT primer (5'- ATGTGCTGCAAGGCGATT-3’) 을 넣어 준 뒤, 20uL volume 조건에서 reverse transcription으로 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA 2uL를 사용하여 APOE4 RNA specific 5’ primer (5’- CTACTCAGCCCCAGCGGAGG-3’), ribozyme specific 3’ primer (RY-TS)(5’- TGTAAAACGACGGCCAGTG-3’)을 각각 10pmole씩 사용하여 95 ℃ 30 sec, 55 ℃ 30 sec, 72 ℃ 30 sec 조건으로 35 cycle PCR을 수행하고, 2% TBE agarose gel에서 PCR band를 확인하고, 확인된 모든 PCR band를 gel extraction 과정을 거쳐 elution 한 뒤, APOE4 RNA의 어느 부위에서 trans-splicing 반응이 일어났는지 염기서열 분석을 통해 확인하였다. 그 결과, APOE4 RNA(서열번호 11)에서 트랜스 스플라이싱이 발생한 reaction site와 발생 빈도는 하기 표 1과 같다.

상기 표 1에서 확인되는 바와 같이 APOE4 RNA의 +21번 부위에서 가장 많은 trans-splicing이 일어남을 확인하였다. 상기 결과로부터, APOE4 RNA의 +21번 염기를 타겟으로 하는 트랜스 스플라이싱 리보자임(이하, '+21 targeting ribozyme'이라 함)이 APOE4 단백질 발현 감소에 효과적임을 알 수 있다.

4-2. Cell mapping

Test tube 상에서 APOE4 RNA의 trans splicing reaction site mapping 결과에 이어서, 이와 동일한 실험을 APOE4 RNA와 random library ribozyme을 co-transfection하여 293A 세포 안에서 수행하였다(도 7). 그 결과, APOE4 RNA(서열번호 11)에서 트랜스 스플라이싱이 발생한 reaction site와 발생 빈도는 하기 표 2와 같다

4-3. 각 reaction site를 타겟으로 하는 리보자임의 트랜스 스플라이싱 효과 확인

In vitro 및 cell mapping을 통해 확인된 target site들 중에서 중복되어 확인된 +30, +71, +77, +80, +82 site와 in vitro mapping에 가장 트랜스 스플라이싱 빈도가 높은 +21 site를 선별하여 상기 각 site를 타겟으로 하는 리보자임을 제작하고 in vitro trans-splicing reaction을 수행하여 trans-splicing여부를 확인하였다. +56 targeting ribozyme은 대조군으로 사용하였다.

보다 구체적으로, APOE4 RNA 0.1 pmole을 각 trans-splicing ribozyme library RNA 1 pmole과 혼합하여 trans-splicing reaction을 유도하였다. 각 반응액에서 RNA를 회수하여 RT-PCR을 수행하고 제작된 cDNA를 APOE4 RNA specific 5’ primer (5’- CTACTCAGCCCCAGCGGAGG-3’), ribozyme specific 3’ primer (5’- TGTAAAACGACGGCCAGTG-3’)을 이용하여 PCR 증폭하였고(95 ℃ 30 sec, 55 ℃ 30 sec, 72 ℃ 30 sec, 35 cycle), 각 증폭산물을 agarose gel에서 전기영동을 통해 확인하였다.

그 결과, APOE4 RNA의 +21, +30, +71, 및 +77 site를 타겟으로 하는 리보자임에 의한 트랜스 스플라이싱 효율이 우수하였으며, 특히 +21 targeting ribozyme과 +30 targeting ribozyme의 효율이 각별히 우수함을 확인할 수 있었다(도 8).

APOE4 RNA에서 +21번 염기를 포함한 타겟 영역은 5’-GGAGGU-3’(서열번호 3)이고, +21 targeting ribozyme의 IGS는 5’-GCCUCC-3’(서열번호 4)을 갖는다. 또한, APOE4 RNA에서 +30번 염기를 포함한 타겟 영역은 5’-GGACGU-3’(서열번호 5)이고, +30 targeting ribozyme의 IGS는 5’-GCGUCC-3’(서열번호 6)을 갖는다.

실시예 5. +21 targeting 트랜스-스플라이싱 리보자임 최적화

이어서, APOE4 RNA의 표적 부위를 달리한 트랜스-스플라이싱 리보자임의 표적 특이성 및 트랜스-스플라이싱 효율 증가를 위하여 상기 실시예 3과 동일하게 길이를 달리한 AS 영역을 도입한 리보자임을 제작한 후 Huh-7.5 세포, CCF-STTG1 세포, 및 U118MG 세포에 형질전환한 후 트랜스 스플라이싱 발생 정도를 단백질 수준 및 유전자 수준에서 확인하였다.

단백질 수준에서 확인 결과, APOE4 RNA의 +21 염기를 타겟으로 하는 리보자임은 AS 영역 도입 여부 및 AS 영역의 길이와 무관하게 APOE4를 발현하는 세포에서 APOE4 RNA의 트랜스 스플라이싱을 유도하였고, 특히, 50nt 길이의 AS 영역이 도입된 리보자임에서 현저하게 우수한 트랜스 스플라이싱 효율을 확인할 수 있었다(도 9a).

유전자 수준에서 트랜스 스플라이싱 산물 확인 결과도 단백질 수준 확인 결과와 동일하였으며(도 9b), 트랜스 스플라이싱 산물의 서열분석 결과 모두 트랜스 스플라이싱 예상 위치에서 정확하게 반응이 일어났음을 확인하였다(도 9c).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Rznomics Inc. <120> APOE4 RNA TARGETING TRANS-SPLICING RIBOZYME AND USE THEREOF <130> DHP20-K141-P1 <150> KR 10-2020-0025332 <151> 2020-02-28 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 6 <212> RNA <213> Homo sapiens_+56 targeting region <400> 1 gccaau 6 <210> 2 <211> 6 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGS region of +56 targeting ribozyme <400> 2 guuggc 6 <210> 3 <211> 6 <212> RNA <213> Homo sapiens_+21 targeting region <400> 3 ggaggu 6 <210> 4 <211> 6 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGS region of +21 targeting ribozyme <400> 4 gccucc 6 <210> 5 <211> 6 <212> RNA <213> Homo sapiens_+30 targeting region <400> 5 ggacgu 6 <210> 6 <211> 6 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGS region of +30 targeting ribozyme <400> 6 gcgucc 6 <210> 7 <211> 387 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ribozyme* region <400> 7 aaaaguuauc aggcaugcac cugguagcua gucuuuaaac caauagauug caucgguuua 60 aaaggcaaga ccgucaaauu gcgggaaagg ggucaacagc cguucaguac caagucucag 120 gggaaacuuu gagauggccu ugcaaagggu augguaauaa gcugacggac augguccuaa 180 ccacgcagcc aaguccuaag ucaacagauc uucuguugau auggaugcag uucacagacu 240 aaaugucggu cggggaagau guauucuucu cauaagauau agucggaccu cuccuuaaug 300 ggagcuagcg gaugaaguga ugcaacacug gagccgcugg gaacuaauuu guaugcgaaa 360 guauauugau uaguuuugga guacucg 387 <210> 8 <211> 408 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> +21 targeting ribozyme <400> 8 gagaauucgc cuccaaaagu uaucaggcau gcaccuggua gcuagucuuu aaaccaauag 60 auugcaucgg uuuaaaaggc aagaccguca aauugcggga aaggggucaa cagccguuca 120 guaccaaguc ucaggggaaa cuuugagaug gccuugcaaa ggguauggua auaagcugac 180 ggacaugguc cuaaccacgc agccaagucc uaagucaaca gaucuucugu ugauauggau 240 gcaguucaca gacuaaaugu cggucgggga agauguauuc uucucauaag auauagucgg 300 accucuccuu aaugggagcu agcggaugaa gugaugcaac acuggagccg cugggaacua 360 auuuguaugc gaaaguauau ugauuaguuu uggaguacuc gcaauucu 408 <210> 9 <211> 410 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> +30 targeting ribozyme <400> 9 aaaacagggc guccaaaagu uaucaggcau gcaccuggua gcuagucuuu aaaccaauag 60 auugcaucgg uuuaaaaggc aagaccguca aauugcggga aaggggucaa cagccguuca 120 guaccaaguc ucaggggaaa cuuugagaug gccuugcaaa ggguauggua auaagcugac 180 ggacaugguc cuaaccacgc agccaagucc uaagucaaca gaucuucugu ugauauggau 240 gcaguucaca gacuaaaugu cggucgggga agauguauuc uucucauaag auauagucgg 300 accucuccuu aaugggagcu agcggaugaa gugaugcaac acuggagccg cugggaacua 360 auuuguaugc gaaaguauau ugauuaguuu uggaguacuc gacuguuuug 410 <210> 10 <211> 409 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> +56 targeting ribozyme <400> 10 caaacguggu uggcaaaagu uaucaggcau gcaccuggua gcuagucuuu aaaccaauag 60 auugcaucgg uuuaaaaggc aagaccguca aauugcggga aaggggucaa cagccguuca 120 guaccaaguc ucaggggaaa cuuugagaug gccuugcaaa ggguauggua auaagcugac 180 ggacaugguc cuaaccacgc agccaagucc uaagucaaca gaucuucugu ugauauggau 240 gcaguucaca gacuaaaugu cggucgggga agauguauuc uucucauaag auauagucgg 300 accucuccuu aaugggagcu agcggaugaa gugaugcaac acuggagccg cugggaacua 360 auuuguaugc gaaaguauau ugauuaguuu uggaguacuc gaacguuug 409 <210> 11 <211> 1186 <212> RNA <213> Homo sapiens_ApoE4 mRNA <400> 11 cuacucagcc ccagcggagg ugaaggacgu ccuuccccag gagccgacug gccaaucaca 60 ggcaggaaga ugaagguucu gugggcugcg uugcugguca cauuccuggc aggaugccag 120 gccaaggugg agcaagcggu ggagacagag ccggagcccg agcugcgcca gcagaccgag 180 uggcagagcg gccagcgcug ggaacuggca cugggucgcu uuugggauua ccugcgcugg 240 gugcagacac ugucugagca ggugcaggag gagcugcuca gcucccaggu cacccaggaa 300 cugagggcgc ugauggacga gaccaugaag gaguugaagg ccuacaaauc ggaacuggag 360 gaacaacuga ccccgguggc ggaggagacg cgggcacggc uguccaagga gcugcaggcg 420 gcgcaggccc ggcugggcgc ggacauggag gacgugcgcg gccgccuggu gcaguaccgc 480 ggcgaggugc aggccaugcu cggccagagc accgaggagc ugcgggugcg ccucgccucc 540 caccugcgca agcugcguaa gcggcuccuc cgcgaugccg augaccugca gaagcgccug 600 gcaguguacc aggccggggc ccgcgagggc gccgagcgcg gccucagcgc cauccgcgag 660 cgccuggggc cccuggugga acagggccgc gugcgggccg ccacuguggg cucccuggcc 720 ggccagccgc uacaggagcg ggcccaggcc uggggcgagc ggcugcgcgc gcggauggag 780 gagaugggca gccggacccg cgaccgccug gacgagguga aggagcaggu ggcggaggug 840 cgcgccaagc uggaggagca ggcccagcag auacgccugc aggccgaggc cuuccaggcc 900 cgccucaaga gcugguucga gccccuggug gaagacaugc agcgccagug ggccgggcug 960 guggagaagg ugcaggcugc cgugggcacc agcgccgccc cugugcccag cgacaaucac 1020 ugaacgccga agccugcagc caugcgaccc cacgccaccc cgugccuccu gccuccgcgc 1080 agccugcagc gggagacccu guccccgccc cagccguccu ccuggggugg acccuaguuu 1140 aauaaagauu caccaaguuu cacgcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1186

Claims

APOE4 RNA 서열을 표적으로 하는 트랜스-스플라이싱 리보자임에 있어서,
상기 트랜스-스플라이싱 리보자임은 5'- IGS (internal guide sequence)-Ribozyme^*-엑손(exon)-3'의 구조를 가지며,
상기 IGS 영역은 APOE4 RNA의 +21, +30, +56, +71, +77, 또는 +80 염기를 포함하는 영역과 상보적으로 결합할 수 있는 5~10 nt 길이의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 트랜스-스플라이싱 리보자임.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 IGS 영역은 서열번호 2, 4, 또는 6의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 트랜스-스플라이싱 리보자임.
제1항에 있어서,
상기 트랜스-스플라이싱 리보자임은 IGS 영역의 upstream에 APOE4 RNA의 일부와 상보적으로 결합할 수 있는 10 nt 내지 200 nt 길이의 AS(antisense sequence) 영역을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 트랜스-스플라이싱 리보자임.
제5항에 있어서,
상기 IGS 영역은 서열번호 2의 염기서열을 포함하고, 상기 AS 영역은 150 nt 길이인 것을 특징으로 하는, 트랜스-스플라이싱 리보자임.
제5항에 있어서,
상기 IGS 영역은 서열번호 4의 염기서열을 포함하고, 상기 AS 영역은 50 nt 길이인 것을 특징으로 하는, 트랜스-스플라이싱 리보자임.
제5항에 있어서,
상기 IGS 영역과 AS 영역은 5~10 nt 길이의 무작위 염기서열로 연결된 것을 특징으로 하는, 트랜스-스플라이싱 리보자임.
제1항에 있어서,
상기 Ribozyme^* 영역은 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 트랜스-스플라이싱 리보자임.
제1항에 있어서,
상기 엑손 영역은 ApoE2 또는 ApoE3 christchurch 돌연변이(R136S)를 암호화하는 염기서열의 일부 또는 전부를 포함하는 것을 특징으로 하는, 트랜스-스플라이싱 리보자임.
제1항의 트랜스-스플라이싱 리보자임을 발현할 수 있는 발현 벡터.
제11항에 있어서,
상기 발현 벡터는 상기 리보자임 유전자와 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 발현 벡터.
제12항에 있어서,
상기 프로모터는 신경세포 타입 특이적인 프로모터인 것을 특징으로 하는, 발현 벡터.
제13항에 있어서,
상기 신경세포 타입 특이적인 프로모터는 뉴런(neuron)-, 성상세포(astrocyte)- 또는 희돌기교 세포(oligodendrocyte)- 특이적 프로모터인 것을 특징으로 하는, 발현 벡터.
제1항의 트랜스-스플라이싱 리보자임; 제11항의 발현 벡터; 및 상기 발현 벡터를 포함하는 유전자 전달 시스템;으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머 예방 또는 치료용 약학적 조성물.