JP6966755B2 - 組換え発現ベクター及び当該ベクターを封入した脂質膜構造体 - Google Patents

組換え発現ベクター及び当該ベクターを封入した脂質膜構造体 Download PDF

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Description

本発明は、動物細胞のミトコンドリア内で目的タンパク質を発現させるための組換え発現ベクター、及び当該ベクターを封入した脂質膜構造体に関する。
細胞のオルガネラの１つであるミトコンドリアは、細胞核から独立したゲノムＤＮＡを有している。このゲノムＤＮＡにおける変異と種々の疾患（脳筋症、神経変性疾患、癌、糖尿病など）との関連が多数報告されており、これらはミトコンドリア病と総称される。
ミトコンドリア病の治療方法として、治療効果が期待されるタンパク質をミトコンドリア内で発現させることを目的とした遺伝子治療が挙げられる。かかる治療を実現するための方法として、細胞核内で発現させた目的タンパク質をミトコンドリア内に移送させる方法、及びミトコンドリア内で直接的に目的タンパク質を発現させることができる外来遺伝子発現システムを利用する方法が提案されている。
細胞核内で発現させた目的タンパク質をミトコンドリア内に移送させる方法に関連して、多種多様な発現ベクターが開発されている。その多くは、細胞核ゲノムにコードされているミトコンドリアタンパク質が有する、ミトコンドリア移行性シグナルペプチド（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＭＴＳ）を利用している。具体的には、ＭＴＳを上流に有する目的タンパク質（ＭＴＳ付加タンパク質）をコードする発現ベクターを細胞核に送達し、細胞質においてＭＴＳ付加タンパク質を発現させ、ミトコンドリアに送達するというものである。
この方法はある種の目的タンパク質においては有用であり得るが、遺伝子治療への利用が期待される、ミトコンドリアゲノムＤＮＡにコードされたミトコンドリアタンパク質（ミトコンドリア内因性タンパク質）に対する適用性が低いという問題を有する。ミトコンドリア内因性タンパク質の多くは細胞質内で不溶性であるために、細胞質で発現されたミトコンドリア内因性タンパク質が凝集し、ミトコンドリアへの移行が不十分となるからである。
特許文献１は、水溶性を高めたＭＴＳと特定のミトコンドリア内因性タンパク質とからなるＭＴＳ付加タンパク質をコードする発現ベクターを用いて、目的タンパク質の細胞質での凝集を抑える方法を開示している。しかし、ミトコンドリア内因性タンパク質は、ミトコンドリア以外の細胞内オルガネラにあると細胞毒性を示すことが多いので、特許文献１に記載された方法が利用可能な目的タンパク質の範囲は制限される。
また、ＭＴＳ付加タンパク質を利用した上記方法は、本来のミトコンドリア内因性タンパク質の細胞内輸送に干渉する又はこれと競合することで細胞に致死的ダメージを与える可能性があり、遺伝子治療のツールとしては懸念が残る。
一方、ミトコンドリア内で直接的に目的タンパク質を発現させることができる外来遺伝子発現システムの利用では、第一にミトコンドリア内における必要十分な量の目的タンパク質の転写発現が要求される。かかる目的に適合するように、ミトコンドリアゲノムＤＮＡに存在する遺伝子由来のプロモーター、例えばＨＳＰ（ｈｅａｖｙ ｓｔｒａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を選択し、その制御下に目的タンパク質をコードするＤＮＡを置いた発現ベクターが幾つか設計されている。この発現ベクターには、ミトコンドリアゲノムＤＮＡにおいて利用頻度の高いトリプレットコドンを使用するといった工夫も加えられている。しかし、これまでのところ、それら発現ベクターの発現レベルは疾患治療に必要十分な領域には達していない。
例えば、非特許文献１には、ＭＴＳを付加した人工ウイルスベクターの内部にＨＳＰ制御下にあるミトコンドリア内で転写誘導されるＤＮＡを封入し、ミトコンドリアに直接的にウイルスベクターを導入して目的タンパク質を発現させようとする方法が提唱されている。この方法は、導入されたウイルスベクターからの目的タンパク質の発現レベルが比較的高いという利点を有する一方、ウイルスベクターであることに起因する安全性の問題を伴うことに加え、目的タンパク質が期待通りにミトコンドリア内で発現しているかについての検証が完全にはなされていない。
Ｙｕ，Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２０１２、１０９、Ｅ１２３８−４７
ＵＳ２０１５／０２２５７４０
本発明は、ミトコンドリアにおいて目的タンパク質を効率的に発現させ、かつミトコンドリア以外の細胞オルガネラでの目的タンパク質の望ましくない発現を抑制することのできる、新たな発現ベクターを提供することを目的とする。
本発明者らは、意外なことにミトコンドリアゲノムＤＮＡに存在する遺伝子由来のプロモーターよりも細胞核内で転写活性を有するプロモーターの方が、ミトコンドリア内においてもむしろ高い転写活性を示すことを確認し、これに細胞核内での目的タンパク質の望ましくない発現を抑制する工夫を加えることで、ミトコンドリア内で目的タンパク質を安全に発現させることができることを見いだし、下記の各発明を完成させた。
（１）動物細胞の細胞核内で転写活性を示すプロモーター配列、及び目的タンパク質をコードするコーディング領域であって、トリプトファンに対応するコドンとして１つ又は複数のＴＧＡを含むコーディング領域を前記プロモーター配列の制御下に有する、動物細胞のミトコンドリア内で目的タンパク質を発現させるための組換え発現ベクター。
（２）前記目的タンパク質をコードするコーディング領域の５’末端側に、ミトコンドリアゲノムＤＮＡのコーディング領域をさらに有する、（１）に記載の組換え発現ベクター。
（３）前記目的タンパク質をコードするコーディング領域の３’末端側にミトコンドリアｔＲＮＡに対応する塩基配列を有する、（１）又は（２）に記載の組換え発現ベクター。
（４）プロモーター配列がサイトメガロウイルスプロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター、ラウスサルコーマウイルスプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、βアクチンプロモーター及びＴ７プロモーターよりなる群から選択されるプロモーターの塩基配列である、（１）〜（３）のいずれかに記載の組換え発現ベクター。
（５）プロモーター配列がサイトメガロウイルスプロモーター又はラウスサルコーマウイルスプロモーターの塩基配列である、（４）に記載の組換え発現ベクター。
（６）前記目的タンパク質をコードするコーディング領域におけるトリプトファンに対応するコドンの全てがＴＧＡである、（１）〜（５）のいずれかに記載の組換え発現ベクター。
（７）前記ミトコンドリアゲノムＤＮＡのコーディング領域がＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、サブユニット４のコーディング領域である、（２）〜（６）のいずれかに記載の組換え発現ベクター。
（８）（１）〜（７）のいずれかに記載の発現ベクターを封入した脂質膜構造体。
（９）スフィンゴミエリンを脂質膜の構成脂質として含む、（８）に記載の脂質膜構造体。
（１０）配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを脂質膜表面に有する、（８）又は（９）に記載の脂質膜構造体。
（１１）ジオレイルホスファチジルエタノールアミンとスフィンゴミエリンとを脂質膜の構成脂質として含有し、かつ配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを脂質膜表面に有する、動物細胞のミトコンドリアに核酸を導入するための脂質膜構造体。
本発明の発現ベクター及び脂質膜構造体によれば、ミトコンドリアにおいてより効率的に、かつ選択的に目的タンパク質を発現させることができる。本発明の発現ベクター及び脂質膜構造体は、より安全でかつ効果の優れたミトコンドリア病治療用の医薬として利用することができる。
本発明の発現ベクター及び比較対象となる発現ベクターにおける組換え遺伝子の構造を模式的に表した図である。 本発明の発現ベクター及び比較対象となる発現ベクターをハイドロダイナミクス法によってそれぞれ投与したマウスの肝臓における目的タンパク質（ルシフェラーゼ）の発現量（発光強度）を表したグラフである。 本発明の発現ベクター及び比較対象となる発現ベクターをハイドロダイナミクス法によってそれぞれ投与したマウスの肝臓における目的タンパク質（ルシフェラーゼ）の発現量（発光強度）を表したグラフである。 本発明の発現ベクター及び比較対象となる発現ベクターでトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞における目的タンパク質（ルシフェラーゼ）の発現量（発光強度）を表したグラフである。 本発明の発現ベクターを封入した本発明の脂質膜構造体及び比較対象となる脂質膜構造体でトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞における目的タンパク質（ルシフェラーゼ）の発現量（発光強度）を表したグラフである。 ウサギ網状赤血球を利用したインビトロ翻訳システムを用いて、本発明の発現ベクター及び比較対象となる発現ベクターから転写されるｍＲＮＡを目的タンパク質（ルシフェラーゼ）へと翻訳させたときの発現量（発光強度）を表したグラフである。 細胞核における転写を阻害する活性を有するα−アマニチン（ａｍａｎｉｔｉｎ）の存在下での、本発明の発現ベクター及び比較対象となる発現ベクターでトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞における目的タンパク質（ルシフェラーゼ）の発現量（発光強度）を表したグラフである。 各種のプロモーター配列を有する本発明の発現ベクターをハイドロダイナミクス法によってそれぞれ投与したマウスの肝臓における目的タンパク質（ルシフェラーゼ）の発現量（発光強度）を表したグラフである。 ＮＤ４配列を取り除いた本発明の発現ベクター又はヒトＮＤ４配列を組み込んだ本発明の発現ベクターをハイドロダイナミクス法によってそれぞれ投与したマウスの肝臓における目的タンパク質（ルシフェラーゼ）の発現量（発光強度）を表したグラフである。 各種のプロモーター配列を有する発現ベクターを封入した本発明の脂質膜構造体でトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞における目的タンパク質（ルシフェラーゼ）の発現量（発光強度）を表したグラフである。
本発明の第一の態様は、動物細胞の細胞核内で転写活性を示すプロモーター配列、及び目的タンパク質をコードするコーディング領域であって、トリプトファン（Ｔｒｐ）に対応するコドンとして１つ又は複数のＴＧＡを含むコーディング領域を前記プロモーター配列の制御下に有する、動物細胞のミトコンドリア内で目的タンパク質を発現させるための組換え発現ベクターに関する。換言すれば、本発明は、上記の構成を有する組換え発現ベクター、及び動物細胞のミトコンドリア内で目的タンパク質を発現させるという当該ベクターの特定の用途にかかる発明である。
本発明の発現ベクターで利用可能なプロモーター配列は、哺乳動物の細胞核内で転写活性すなわちｍＲＮＡの転写誘導能を示すものであれば特に制限はなく、その例としてはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス（ＳＶ）４０プロモーター、ラウスサルコーマウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＥＦ１αプロモーター、βアクチンプロモーター及びＴ７プロモーターなどの各塩基配列を挙げることができ、ＣＭＶプロモーター又はＲＳＶプロモーターの利用が好ましい。またこれらは、転写活性が損なわれない限り、塩基配列に置換その他の変異が加わったものであってもよい。
本発明における目的タンパク質は、ミトコンドリア内で発現させる、言い換えればその機能を発揮させることが望まれるタンパク質であればよく、ミトコンドリア病の治療に有効であると期待されるタンパク質の他に、ミトコンドリア内で発現させることに学術的な関心が持たれるタンパク質などを挙げることができる。かかる観点で、目的タンパク質は、細胞核のゲノムＤＮＡにコードされているタンパク質、ミトコンドリアゲノムＤＮＡにコードされているミトコンドリアタンパク質、本発明のベクターによってトランスフェクションされる細胞に対する異種のタンパク質などのいずれであってもよい。また、その大きさ（アミノ酸残基数）及び化学的特性（疎水性、親水性、電荷その他の特性）に特別な制限はない。
本発明においてコーディング領域とは、開始コドンと終止コドンに挟まれた目的タンパク質に翻訳されるｍＲＮＡの鋳型となるＤＮＡの塩基配列を意味する。この場合において、コーディング領域は単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなるものでもよく、また複数のエクソンがイントロンによって分断されてなるものであってもよい。すなわち、前記プロモーター配列によって転写誘導され、後に説明するように最終的にミトコンドリア内において目的タンパク質へと翻訳されるｍＲＮＡを提供できるＤＮＡの塩基配列であればよい。
本発明の発現ベクターでは、Ｔｒｐに対応するコドンとして１つ又は複数のＴＧＡを含むコーディング領域が利用される。好ましくは、ミトコンドリアゲノムＤＮＡにおけるコーディング領域、Ｔｒｐに対応するコドンであるＴＧＧ（ｍＲＮＡ上ではＵＧＧ）がＴＧＡに人為的に変更されたコーディング領域、Ｔｒｐ残基へアミノ酸残基を置換しても目的タンパク質の活性を保持することができる位置のコドンがＴＧＡに人為的に変更されたコーディング領域などが利用される。このようなコドンの人為的な変更は、一般的な遺伝子組換え技術によって行うことができる。
細胞質におけるｍＲＮＡからの翻訳ではＴＧＡは終止コドンに相当するが、ミトコンドリアにおけるｍＲＮＡからの翻訳ではＴＧＡはＴｒｐをコードするコドンに相当する。したがって、本発明の発現ベクターを用いて動物細胞を形質転換した場合、発現ベクターが細胞核に到達してコーディング領域からｍＲＮＡが転写されたときでも、コーディング領域にコードされる目的タンパク質の合成はＴＧＡの位置で停止するので、少なくとも目的タンパク質の全体は合成されない。これによって、細胞質内において目的タンパク質の全体が合成されてしまうことによる負の影響を抑制することができる。
一方、本発明の発現ベクターがミトコンドリアに到達してコーディング領域からｍＲＮＡが転写されたときは、コーディング領域にコードされる目的タンパク質の合成はＴＧＡの位置で停止することなく進行し、その結果目的タンパク質の全体が適切に合成され、ミトコンドリア内でその機能を発揮することができる。
細胞質内における目的タンパク質の望まれない発現を抑制するという観点において、本発明では複数のＴＧＡを含むコーディング領域の利用が好ましい。また、細胞質内における目的タンパク質の望まれない機能発現をより確実に抑制するという観点において、５’末端（目的タンパク質のＮ末端）により近い位置に１つ又は複数のＴＧＡを含むコーディング領域の利用がさらに好ましい。さらに、目的タンパク質が通常は細胞質内で翻訳されるタンパク質である場合は、上記ＴＧＡ以外のコドンについても、ミトコンドリアのコドンを使用するようにコーディング配列を適宜改変することが好ましい。上記の一例は、細胞核ゲノムにおいてＡｒｇ残基をコードするがミトコンドリアゲノムにおいて終止コドンをコードするＡＧＧを、細胞核ゲノム、ミトコンドリアゲノムのいずれにおいてもＡｒｇ残基をコードするＣＧＧに改変することである。
コーディング領域をプロモーター配列の制御下に有するとは、コーディング領域がプロモーター配列に転写可能に連結されていること、すなわちプロモーター配列の転写活性によってｍＲＮＡへの転写が開始される範囲内にコーディング領域が存在することを意味する。例としては、プロモーター配列の３’末端から概ね１〜２００塩基の範囲内にコーディング領域の開始コドンがある場合を挙げることができるが、そのような範囲はプロモーター配列の種類によって変化し、当業者によって適宜調節することができる。
本発明の発現ベクターは、前記目的タンパク質をコードするコーディング領域の５’末端側に、ミトコンドリアゲノムＤＮＡのコーディング領域をさらに有するものであることが好ましい。特に、ミトコンドリアゲノムＤＮＡのコーディング領域と前記目的タンパク質をコードするコーディング領域とがインフレームで連結している、すなわちミトコンドリアゲノムＤＮＡのコーディング領域にコードされるアミノ酸配列と前記目的タンパク質のアミノ酸配列とが一続きとなったアミノ酸配列からなる融合タンパク質が合成されるように連結していることが好ましい。推論であるが、ミトコンドリアにおいて本来的に転写翻訳され、安定的に機能を発揮するタンパク質分子を一部に含むことで、発現ベクターの組換え遺伝子から転写翻訳されるタンパク質分子がミトコンドリア内で安定化されるものと考えられる。
ミトコンドリアゲノムＤＮＡには、１３種類のコーディング領域が存在することが知られており、本発明ではいずれのコーディング領域でも利用することができるが、特にＮＤ４（ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、サブユニット４）タンパク質、特にヒトのＮＤ４タンパク質に対応するコーディング領域の利用が好ましい。
本発明の発現ベクターは、コーディング領域の３’末端側にミトコンドリアｔＲＮＡに対応する塩基配列、特に当該ｔＲＮＡに対応する塩基配列に加えてその５’末端側の非翻訳領域を含む塩基配列も併せて有するものであることが好ましい。選択されるミトコンドリアｔＲＮＡの種類に特に制限はない。推論であるが、ミトコンドリアにおいて本来的に転写され、安定的に機能を発揮するＲＮＡ分子の塩基配列を一部に含むことで、発現ベクターの組換え遺伝子から転写されるＲＮＡ分子がミトコンドリア内で安定化されるものと考えられる。
本発明の第二の態様は、動物細胞のミトコンドリアに核酸を導入するための脂質膜構造体、及びこれに上で説明した発現ベクターを封入した脂質膜構造体を提供する。本発明の脂質膜構造体は、脂質膜の構成脂質としてスフィンゴミエリン（ＳＭ）を、好ましくはジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）とＳＭとを含む。本発明の脂質膜構造体はまた、脂質膜表面に配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、ＫＡＬＡペプチドと表す）を有することが好ましい。脂質膜構造体の好ましい具体例は、特許文献２（特許第５０６７７３３号公報）にその製造方法と共に詳細に記載された脂質膜構造体において、ＤＯＰＥとＳＭとを脂質膜の構成脂質として含み、かつ脂質膜表面がＫＡＬＡペプチドで修飾された脂質膜構造体である。特許文献２は、その全体が参照として本明細書に取り込まれる。
ＫＡＬＡペプチドは、Ｓｈａｈｅｅｎら（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２０１１，３２，６３４２−６３５０）において、脂質膜同士の膜融合を促進する機能を有する脂質膜融合性ペプチドとして記載されている。本発明においては、このＫＡＬＡペプチドが脂質膜構造体の表面に置かれることで、脂質膜構造体を細胞内オルガネラであるミトコンドリアに選択的に送達させる能力が発揮されることを見いだしたことに基づき、かかるミトコンドリア送達能を利用するものである。
本発明において最も好ましい脂質膜構造体である、本発明の発現ベクターが封入され、脂質膜の構成脂質としてＤＯＰＥとＳＭとを含み、かつ脂質膜の表面にＫＡＬＡペプチドを有する脂質膜構造体は、特許文献２に記載されたステアリル化オクタアルギニン（ＳＴＲ−Ｒ８）の調製及びオクタアルギニンで修飾され、ＤＮＡを封入した脂質膜構造体の製造法に準じて、オクタアルギニンとＤＮＡをそれぞれＫＡＬＡペプチドと本発明の発現ベクターに置き換えることで製造することができる。
本発明の発現ベクター及びこれを封入した脂質膜構造体は、いずれもミトコンドリア病の治療に用いるための医薬として利用することができ、本発明の第三の態様はかかる医薬、及び有効量のかかる医薬を患者に投与することを含むミトコンドリア病の治療方法に関する。本発明の医薬は、核酸医薬又はリポソーム医薬若しくは製剤として一般に知られている剤形、用法、用量などに準じて利用することができる。
例えば、本発明の医薬は、注射剤、点滴剤などの非経口製剤の形態で用いられることができる。また、このような非経口製剤に用いることができる担体としては、例えば、生理食塩水や、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトールなどを含む等張液といった水性担体が挙げられる。
本発明の医薬はさらに、薬学的に許容される緩衝剤、安定剤、保存剤その他の添加剤といった成分を含む組成物の形態であってもよい。薬学的に許容される成分は当業者において周知であり、当業者が通常の実施能力の範囲内で、例えば第十六改訂日本薬局方その他の規格書に記載された成分から製剤の形態に応じて適宜選択して使用することができる。
本発明の医薬の投与方法は、特に制限されないが、非経口製剤である場合は、例えば血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、腸管内投与、皮下投与などを挙げることができる。好ましい実施形態の一つにおいて、本発明の治療剤は、静脈内投与により生体に投与される。
以下の実施例及び実験例によって本発明をさらに詳細に説明する。なお、実施例及び実験例では、ルシフェラーゼを目的タンパク質のモデルとして利用している。
＜実施例１＞
１）発現ベクターの構築
以下のａ）〜ｆ）のベクターを、一般的な遺伝子組換え手法を用いて構築した。
ａ）ｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）
このベクターは、ＣＭＶプロモーター配列、ミトコンドリアタンパク質ＮＤ４をコードするミトコンドリアゲノムＤＮＡのコーディング領域（ＮＤ４）、ＦＬＡＧタグをコードする塩基配列（ＦＬＡＧ）、配列番号１に示されるアミノ酸残基における４７９番目のＴｒｐ残基及び５１２番目のＡｒｇ残基をコードするコドンがそれぞれＴＧＡ及びＣＧＧであるコドン改変ルシフェラーゼをコードするコーディング領域（ｍｔＬｕｃ）、及び５’末端の非翻訳領域を含むミトコンドリアｔＲＮＡＡｓｐをコードする塩基配列をこの順序で有する組換え遺伝子（図１の（ａ）、配列番号１）をＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩで開環したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）ｖｅｃｔｏｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に組み込んだ、本発明の発現ベクターである。なお、４７９番目のＴｒｐをコードするコドンＴＧＡ及び５１２番目のＡｒｇ残基をコードするコドンＣＧＧは、野生型ルシフェラーゼにおいてはそれぞれＴＧＧ及びＡＧＧである。また、配列番号１及び配列番号２に示されるアミノ酸配列は、配列番号１の塩基配列をミトコンドリアで使用されるコドンを用いて翻訳した場合のアミノ酸配列である。
上記組換え遺伝子はルシフェラーゼをコードするコーディング領域内にＴＧＡコドンを１つ有しているので、活性型ルシフェラーゼはミトコンドリア内では発現するが、細胞核内では発現しない（翻訳されない）。
ｂ）ｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）／３×ＴＧＡ
このベクターは、ａ）のｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）と同一の構成を有するが、配列番号１に示される６０１番目及び６３０番目のＴｒｐ残基をコードするコドンがＴＧＡである（図１の（ｂ）、配列番号３）、本発明の発現ベクターである。なお、６０１番目及び６３０番目のＴｒｐ残基をコードするコドンＴＧＡは、野生型ルシフェラーゼにおいてはいずれもＴＧＧである。また、配列番号３及び配列番号４に示されるアミノ酸配列は、配列番号３の塩基配列をミトコンドリアで使用されるコドンを用いて翻訳した場合のアミノ酸配列である。
このベクターは、ルシフェラーゼをコードするコーディング領域内にＴＧＡコドンを３つ有しているので、活性型ルシフェラーゼはミトコンドリア内では発現するが、細胞核内では発現しない（翻訳されない）。
ｃ）ｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＴＡＧ）
このベクターは、ａ）のｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）と同一の構成を有するが、配列番号１に示される５１２番目のコドンがＴＡＧである（図１の（ｃ）、配列番号５）ベクターである。なお、５１２番目のコドンは、野生型ルシフェラーゼにおいてはＡＧＧである。また、配列番号５及び配列番号６に示されるアミノ酸配列は、配列番号５の塩基配列をミトコンドリアで使用されるコドンを用いて翻訳した場合のアミノ酸配列である。
このベクターは、ＴＡＧが細胞核内及びミトコンドリア内いずれにおいても終止コドンとなるので、細胞核及びミトコンドリアいずれにおいても活性型ルシフェラーゼが発現（翻訳）されない、翻訳ネガティブコントロールベクターである。
ｄ）ｐｍｔＬｕｃ
このベクターは、ａ）のｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）の組換え遺伝子からＣＭＶプロモーター配列を欠失させた（図１の（ｄ）、配列番号７）ベクターである。このベクターはプロモーター配列を有しないので、細胞核及びミトコンドリアいずれにおいても組換え遺伝子が転写されない、転写ネガティブコントロールベクターである。配列番号７及び配列番号８に示されるアミノ酸配列は、配列番号７の塩基配列をミトコンドリアで使用されるコドンを用いて翻訳した場合のアミノ酸配列である。
ｅ）ｐＨＳＰ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）
このベクターは、ａ）のｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）の組換え遺伝子におけるＣＭＶプロモーター配列をＨＳＰに置き換えた（図１の（ｅ）、配列番号９）、比較用発現ベクターである。配列番号９及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列は、配列番号９の塩基配列をミトコンドリアで使用されるコドンを用いて翻訳した場合のアミノ酸配列である。
ｆ）ｐＨＳＰ−ｍｔＬｕｃ（ＴＡＧ）
このベクターは、ｃ）のｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＴＡＧ）の組換え遺伝子におけるＣＭＶプロモーター配列をＨＳＰに置き換えた（図１の（ｆ）、配列番号１１）、比較用翻訳ネガティブコントロールベクターである。配列番号１１及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列は、配列番号１１の塩基配列をミトコンドリアで使用されるコドンを用いて翻訳した場合のアミノ酸配列である。
２）ベクターの細胞内導入及び発現の確認
ｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）、ｐＨＳＰ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）、ｐＨＳＰ−ｍｔＬｕｃ（ＴＡＧ）及びｐｍｔＬｕｃの４種類のベクターについて、Ｙａｓｕｚａｋｉら（Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ、２０１３、１７２（３）：８０５−１１）に記載されたハイドロダイナミクス法を参照して、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（６週齢、オス）の尾静脈内へ２７Ｇの針を用いて２ｍＬベクター溶液（１００μｇ／５％グルコース溶液）を５秒で投与した。投与６時間後に肝臓を回収し、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ社）を製造者プロトコールに従って使用し、ルシフェラーゼ発光量を測定した。その結果を図２に示す。
ｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）は、比較用ベクターのｐＨＳＰ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）と比較して著しく高いルシフェラーゼ発光量を示しており、遺伝子発現効率が高いことが確認された。
また、ｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）、ｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）３×ＴＧＡ及びｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＴＡＧ）についても同様の実験を行ったところ、ｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）３×ＴＧＡの遺伝子発現効率はｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）と同等であることが確認された（図３）。
＜実施例２＞ＨｅＬａ細胞への導入
４×１０４ｃｅｌｌｓ（０．５ｍＬ）のＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートに播種して２４時間後に、０．４μｇ又は１μｇのｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）又はｐｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）をそれぞれ含むＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００のＤＭＥＭ溶液（０．２５ｍＬ、血清及び抗生物質なし）を細胞に加え、５％ＣＯ２で３時間インキュベーションを行い、１０％血清を含む新鮮な培地に交換してさらに２１時間インキュベーションを行った。
細胞を０．５ｍＬのＰＢＳで洗い、７５μＬのｒｅｐｏｒｔｅｒ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解した。−８０℃で３０分間以上インキュベーションした後、室温で１０〜１５分程度解凍した。その後、細胞をプレートから回収しエッペンドルフチューブに移し、１５，０００ｇ、４℃、５分遠心し、上清５０μＬを回収した。ルシフェラーゼ活性は細胞ライセート２０μＬに ＮａｎｏＬｕｃ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）５０μＬを加え、ルミノメーターを用いて測定した。細胞ライセートのタンパク質量はＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ）を用いて決定し、ルシフェラーゼ活性の補正を行った。その結果を図４に示す。
ｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）のトランスフェクションによるルシフェラーゼ発光強度は、添加量増加に伴って増強することが確認された（図４）。一方、転写ネガティブコントロールのｐｍｔＬｕｃ及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を使用せずにベクターを加えた細胞（ｎａｋｅｄ）ではルシフェラーゼ発光は観察されなかった。
＜実施例３＞脂質膜構造体の構築
１）特許文献２に記載された方法に準じて、ステアリル化オクタアルギニン（ＳＴＲ−Ｒ８）のオクタアルギニンに代えて、膜融合性ペプチドであるＫＡＬＡペプチド（Ｓｈａｈｅｅｎら，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２０１１，３２，６３４２−６３５０、配列番号１３）を用いて、ＫＡＬＡとステアリン酸との縮合体（ＳＴＲ−ＫＡＬＡ）を調製した。
２）試験管に１ｍＭの脂質溶液（１，２−ジオレイル ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）／ＳＭ／ＣＨＥＭＳ＝９／２／１）８２５μＬとクロロホルム７５０μＬを加えて混合後、減圧乾燥して脂質膜フィルムを得た。これに１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液を１．５ｍＬ加え、室温で１５分間水和させた。次いで、バスタイプソニケーター（ＡＵ−２５Ｃ；アイワ医科工業）で３０秒間及びプローブタイプソニケーターで１０分間超音波処理を行い、ｓｍａｌｌ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ（ＳＵＶ）溶液を調製した。
０．１ｍｇ／ｍＬのｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）溶液を０．１ｍｇ／ｍＬプロタミン溶液に滴下することで核酸ナノ粒子を調製し（ｎｉｔｒｏｇｅｎ／ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｎ／Ｐ）比３．０）、これと２）のＳＵＶ溶液を１：２の体積比で混合し、さらに１）のＳＴＲ−ＫＡＬＡを添加（総脂質の１０ｍｏｌ％相当量）することで、脂質構造体の表面にＫＡＬＡペプチドを有する脂質膜構造体（ＫＡＬＡ−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒ（ＳＭ））を調製した。
比較対象として、ＫＡＬＡ−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒ（ＳＭ）のＳＴＲ−ＫＡＬＡをＳＴＲ−Ｒ８に代えたＲ８−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒ（ＳＭ）、ＫＡＬＡ−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒ（ＳＭ）のＳＭを等量のホスファチジン酸（ＰＡ）に代えたＫＡＬＡ−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒ（ＰＡ）、ＫＡＬＡ−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒ（ＰＡ）のＳＴＲ−ＫＡＬＡをＳＴＲ−Ｒ８に代えたＲ８−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒ（ＰＡ）を、それぞれ調製した。
実施例２と同様にして、各脂質膜構造体を用いてＨｅＬａ細胞（８×１０４ｃｅｌｌｓ、０．５ｍＬ）を各脂質膜構造体でトランスフェクションし、ルシフェラーゼ発光を測定した。その結果を図５に示す。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００と比較して、ｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）を封入したＫＡＬＡ−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒ（ＳＭ）のルシフェラーゼ発光強度は大きく増強されるが、Ｒ８−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒ（ＳＭ）のルシフェラーゼ発光強度は殆ど観察されなかった。また、Ｒ８−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒ（ＰＡ）及びＫＡＬＡ−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒ（ＰＡ）のルシフェラーゼ発光強度は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００と実質的に差は認められなかった。
以下の実験例は、本発明の発現ベクターをトランスフェクションしたときに確認されるルシフェラーゼ発光が、細胞核内での転写翻訳を通じて行われるものではないことを確認するための実験である。
＜実験例１ インビトロ翻訳実験＞
ＣＭＶプロモーター配列の下流に野生型ルシフェラーゼをコードする遺伝子が連結されたプラスミドｐＮＬ１．１［ＣＭＶ／ｎＬｕｃ］（プロメガ社）から、ＨｅＬａＳｃｒｉｂｅＮｕｃｌｅａｒＥｘｔｒａｃｔｉｎｖｉｔｒｏＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用いて野生型ルシフェラーゼ−ｍＲＮＡを調製した。さらに、ｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）及びｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＴＡＧ）からも同様にしてｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）−ｍＲＮＡ及びｍｔＬｕｃ（ＴＡＧ）−ｍＲＮＡを調製した。
ウサギ網状赤血球を用いたインビトロ翻訳系（プロメガ社）を用いて、上記各ｍＲＮＡからタンパク質を翻訳合成させ、ルシフェラーゼ発光を測定した。その結果を図６に示す。
ウサギ網状赤血球にはミトコンドリアが存在しないため、ルシフェラーゼは野生型ＮＬｕｃ−ｍＲＮＡからは合成される一方、ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）−ｍＲＮＡからは終止コドンＴＧＡがあるので合成されず、またｍｔＬｕｃ（ＴＡＧ）−ｍＲＮＡも終止コドンＴＡＧがあるので活性型ルシフェラーゼは合成されない、と予想される。この予想のとおり、野生型ＮＬｕｃを有するｐＮＬ１．１［ＣＭＶ／ｎＬｕｃ］ではルシフェラーゼ発光は観察されるが、ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）を有するｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）及びｍｔＬｕｃ（ＴＡＧ）を有するｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＴＡＧ）ではいずれもルシフェラーゼ発光は観察されなかった。
＜実験例２＞α−アマニチン添加実験
４×１０４ｃｅｌｌｓ（０．５ｍＬ）のＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートに播種し、０．０００１〜１μｇ／ｍＬのα−アマニチンの存在下で２４時間インキュベートした。その後、実施例２の操作と同様にして、ｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）及びｐＮＬ１．１［ＣＭＶ／ｎＬｕｃ］を用いて細胞をトランスフェクションし、ルシフェラーゼ発光強度を測定した。その結果を図７に示す。
α−アマニチンは細胞核内での転写を阻害するため、細胞核内での転写を経て産生されるｍＲＮＡをコードするｐＮＬ１．１［ＣＭＶ／ｎＬｕｃ］を用いた際には、転写が阻害されルシフェラーゼ活性は低下する事が予想される。この予想の通り、ｐＮＬ１．１［ＣＭＶ／ｎＬｕｃ］でトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞におけるα−アマニチン存在下でのルシフェラーゼ発光強度は、α−アマニチンを添加しないコントロールと比較して大幅に低下した。一方、ｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）はミトコンドリア内においてｍＲＮＡが転写されるため、α−アマニチンの有無に関わらずルシフェラーゼ活性が維持されると予想される。この予想の通り、α−アマニチンは、細胞毒性が観察されない０．０００１〜０．１μｇ／ｍＬの添加量において、ｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）でトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼ発光強度を低下させなかった。
＜実施例４＞プロモーター配列の変更
実施例１の１）ａ）のｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）におけるＣＭＶプロモーター配列を、ｐＲｃ／ＲＳＶ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み込まれているＲＳＶプロモーター配列、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に組み込まれているＴ７プロモーター配列又はｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に組み込まれているＳＶ４０プロモーター配列にそれぞれ置換した発現ベクター（ｐＲＳＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）、ｐＴ７−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）及びｐＳＶ４０−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ））を構築した。
ｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）、ｐＲＳＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）、ｐＴ７−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）及びｐＳＶ４０−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）の４種類の発現ベクターについて、実施例１の２）と同様に、Ｙａｓｕｚａｋｉら（Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ、２０１３、１７２（３）：８０５−１１）に記載されたハイドロダイナミクス法を参照して、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（６週齢、オス）の尾静脈内へ２７Ｇの針を用いて２ｍＬベクター溶液（１００μｇ／５％グルコース溶液）を５秒で投与した。投与６時間後に肝臓を回収し、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ社）を製造者プロトコールに従って使用し、ルシフェラーゼ発光量を測定した。その結果を図８に示す。
上記４種類の発現ベクターを投与したマウスにおいて、いずれも肝臓におけるルシフェラーゼの発現を確認することができた。特に、ｐＲＳＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）を投与したマウスにおいて最も高い発現が観察された。
＜実施例５＞ＮＤ４配列の変更
実施例１の１）ａ）のｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）におけるＮＤ４配列及びＦＬＡＧ配列を取り除いてＣＭＶプロモーター配列の直後にｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）配列を連結させた発現ベクター（ｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）［−ＮＤ４］を構築した。さらに、実施例１の１）ａ）のｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）におけるＮＤ４配列を、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＣ＿０１２９２０として登録されている塩基配列の１０，７６０−１２，１３６番目までの塩基配列（ヒトのＮＤ４配列）に置換した発現ベクター（ｐＣＭＶ−ｍｔＤＮＡ（ｈｕｍａｎ））をそれぞれ構築した。
ｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）、ｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）［−ＮＤ４］及びｐＣＭＶ−ｍｔＤＮＡ（ｈｕｍａｎ）を、実施例１の２）と同様に、Ｙａｓｕｚａｋｉら（Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ、２０１３、１７２（３）：８０５−１１）に記載されたハイドロダイナミクス法を参照して、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（６週齢、オス）の尾静脈内へ２７Ｇの針を用いて２ｍＬベクター溶液（１００μｇ／５％グルコース溶液）を５秒で投与した。投与６時間後に肝臓を回収し、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ社）を製造者プロトコールに従って使用し、ルシフェラーゼ発光量を測定した。その結果を図９に示す。
上記３種類の発現ベクターを投与したマウスにおいて、いずれも肝臓におけるルシフェラーゼの発現を確認することができた。特に、ｐＣＭＶ−ｍｔＤＮＡ（ｈｕｍａｎ）を投与したマウスにおいて、ｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）と比較してより高いルシフェラーゼの発現が観察された。
＜実施例６＞脂質構造体を用いた形質転換
実施例１の１）ａ）のｐＣＭＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）、実施例４のｐＲＳＶ−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）、ｐＴ７−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）、ＳＶ４０−ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）及び実施例５のｐＣＭＶ−ｍｔＤＮＡ（ｈｕｍａｎ）を、実施例３に記載の方法に従ってＫＡＬＡ−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒ（ＳＭ）又はＲ８−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒ（ＳＭ）に封入し、実施例２と同様にして、ＨｅＬａ細胞（８×１０４ｃｅｌｌｓ、０．５ｍＬ）を各脂質膜構造体でトランスフェクションし、ルシフェラーゼ発光を測定した。その結果を図１０に示す。
使用した全てのベクターに関して、ベクターを封入したＫＡＬＡ−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒでトランスフェクションされた細胞においてベクターを封入したＲ８−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒでトランスフェクションされた細胞よりも高いルシフェラーゼ発光強度が観察された。また、ｐＣＭＶ−ｍｔＤＮＡ（ｈｕｍａｎ）を封入したＫＡＬＡ−ＭＩＴＯ−Ｐｏｒｔｅｒでトランスフェクションされた細胞において、最も高いルシフェラーゼ発光強度が観察された。
本発明の発現ベクター及び脂質膜構造体は、いずれもミトコンドリア病の遺伝子治療を行うための医薬として、及びリサーチツールとして、産業上の利用可能性を有する。

Claims (10)

  1. プロモーター配列、及び目的タンパク質をコードするコーディング領域であって、トリプトファンに対応するコドンとして１つ又は複数のＴＧＡを含むコーディング領域を前記プロモーター配列の制御下に有する領域を含み、前記プロモーター配列は、動物細胞の細胞核内でｍＲＮＡの転写誘導能を有するものであり、但し、前記プロモーター配列はＴ７プロモーターでもＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターでもない、動物細胞のミトコンドリア内で目的タンパク質を発現させるための組換え発現ベクター。
  2. 前記プロモーター配列が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス（ＳＶ）４０プロモーター、ラウスサルコーマウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＥＦ１αプロモーター、およびβアクチンプロモーターからなる群から選択されるプロモーターの塩基配列を有する、請求項１に記載の組換え発現ベクター。
  3. プロモーター配列がサイトメガロウイルスプロモーター又はラウスサルコーマウイルスプロモーターの塩基配列である、請求項２に記載の組換え発現ベクター。
  4. 前記目的タンパク質をコードするコーディング領域の５’末端側に、ミトコンドリアゲノムＤＮＡのコーディング領域をさらに有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
  5. 前記目的タンパク質をコードするコーディング領域の３’末端側にミトコンドリアｔＲＮＡに対応する塩基配列を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
  6. 前記目的タンパク質をコードするコーディング領域におけるトリプトファンに対応するコドンの全てがＴＧＡである、請求項１〜５のいずれかに記載の組換え発現ベクター。
  7. 前記ミトコンドリアゲノムＤＮＡのコーディング領域がＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、サブユニット４のコーディング領域である、請求項４〜６のいずれかに記載の組換え発現ベクター。
  8. 請求項１〜７のいずれかに記載の発現ベクターを封入した脂質膜構造体。
  9. ジオレイルホスファチジルエタノールアミンとスフィンゴミエリンとを脂質膜の構成脂質として含有し、かつ配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを脂質膜表面に有する、動物細胞のミトコンドリアに核酸を導入するための脂質膜構造体。
  10. 動物細胞のミトコンドリア内で目的タンパク質を発現させるための組換え発現ベクターを内包する、請求項９に記載の脂質膜構造体であって、ベクターは、動物細胞の細胞核内で転写活性を示すプロモーター配列、及び目的タンパク質をコードするコーディング領域であって、トリプトファンに対応するコドンとして１つ又は複数のＴＧＡを含むコーディング領域を前記プロモーター配列の制御下に有するものである、脂質膜複合体。
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