CN104548130A - 一种干扰Claudin3 基因表达的靶向脂质体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含Claudin3基因干扰序列的靶向脂质体，其以Claudin3基因干扰序列为活性成分，磷脂与叶酸偶联脂质为载体材料。该组合物可靶向递送Claudin3基因干扰序列至肿瘤细胞，通过高效干扰Claudin3基因的表达，发挥较好的抗肿瘤活性。

Description

一种干扰Claudin3 基因表达的靶向脂质体

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种叶酸受体靶向的干扰Claudin3 基因表达的靶向脂质体及其制备方法和用途。

背景技术

癌症是当今世界各国面临的一个主要的公共健康难题。在发达国家，癌症是人口死亡的首要原因；而在发展中国家，癌症也是引起人口死亡的第二位原因。据最新癌症统计学数据，全球癌症患者每年新发病例1266万，死亡病例756万。在发达国家如美国，每年癌症新发病例约166万，因癌症死亡约58万，每4人中就有1人死于癌症。据《2012中国肿瘤登记年报》，我国每年新发癌症病例约350万，因癌症死亡约250万，全国每6分钟就有1人被确证为癌症，每天有8550人成为癌症患者，每7到8人中就有1人死于癌症。

虽然在过去的近20～30年间，传统治疗手段包括放射治疗、化学治疗和手术治疗不断发展，但是新的治疗药物以及新技术的应用依旧未能改进癌症患者生存质量和存活率。因此，新的治疗手段——基因治疗——的开发可能改变癌症的治疗现状。截止目前，肿瘤基因治疗临床试验已开展近20年，仍在开放的临床试验829例，占整个基因治疗临床试验的66.85%（829/1240）。

Claudins家族是上皮细胞间紧密连接的骨架蛋白，参与紧密连接的构成，紧密连接有维持细胞极向排列和屏障功能，其表达异常而导致紧密连接结构和功能的破坏是许多疾病的病例基础。研究表明，多种上皮来源的肿瘤中Claudins家族异常表达，并与这些肿瘤的发生、发展关系密切，在诊断、治疗以及预后的判断等方面有广泛的应用前景，因此Claudins家族成为肿瘤研究的新热点。Claudin3是Claudins家族的一员，分子量为22kDa，其基因定位于人染色体7q11.23，正常表达于导管上皮和腺泡上皮的连接中。近年研究发现，Claudin3在多种肿瘤包括卵巢癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌、子宫癌、脑癌、肝癌、肺癌、头颈部癌以及结直肠癌等异常高表达，在肿瘤的生长、增殖、浸润和转移等方面都具有重要作用，并且与病人的不良预后密切相关。因此，Claudin3是肿瘤治疗的一个重要靶点。研究发现，利用RNA干扰技术（RNAi）干扰Claudin3的表达，能够抑制多种肿瘤的生长，抑制肿瘤细胞的增殖和转移。但是由于已有的RNAi缺乏肿瘤选择性，Claudin3干扰效率低，抗肿瘤的疗效有待提高，因此亟待开发新型的RNAi靶向传递系统。

文献报道，多种上皮来源的肿瘤包括卵巢癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌、宫颈癌、脑癌、肺癌、头颈部癌以及结直肠癌等都有叶酸受体的高表达。利用可靶向肿瘤细胞表面高表达的叶酸受体成分投递药物，可以实现肿瘤选择性的靶向给药，提高药物的抗肿瘤效果。

发明人拟构建一种叶酸受体靶向的干扰Claudin3 基因表达的靶向脂质体，通过与肿瘤细胞表面高表达的叶酸受体的特异性结合，实现Claudin3 基因干扰序列在肿瘤的靶向递送，提高Claudin3基因的干扰效率，使其具有较好的抗肿瘤效果。

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供一种叶酸受体靶向的干扰Claudin3 基因表达的靶向脂质体，目的在于提高Claudin3的干扰效率，从而提高抗肿瘤效果。

本发明提供的一种含Claudin3 基因干扰序列的靶向脂质体，它是以Claudin3 基因干扰序列为活性成分，加入载体材料制成的靶向脂质体；其中，所述的载体材料含有磷脂与叶酸偶联脂质。

具体地，本发明提供的靶向脂质体，Claudin3 基因干扰序列与磷脂的质量比为：1:2~1:25，叶酸偶联脂质占磷脂的摩尔百分数为：0.05~5%。

上述药物组合物中:

所述重量份可以是μg、mg、g、kg等医药领域公知的重量单位，也可以是其倍数，如1/10、1/100、10倍、100倍等；

所述Claudin3 基因干扰序列构建于质粒载体中，具体构建方法为常规方法，具体参照分子克隆实验室指南（第三版，科学出版社，2002）中所述方法，或者按照所用试剂盒的生产厂商所建议的条件。

所述Claudin3 基因干扰序列，具体通过常用RNAi设计软件，设计干扰Claudin3基因表达的RNA序列，再与 GeneBank 序列比较，不与人体其他任何 mRNA 存在同源性的序列均可作为Claudin3 基因干扰序列。例如：SEQ1，正义链为：GCAACAUCAU CACGUCGCAT T，反义链为：UGCGACGUGA UGAUGUUGCT T；SEQ2，正义链为：TCCCGCAACA TCATCACGTC GCATTCAAGA CGTGCGACGT GATGATGTTG CTTTTTTG，反义链为：AGCTCAAAAA AGCAACATCA TCACGTCGCA CGTCTTGAAT GCGACGTGAT GATGTTGC。

所述磷脂，可采用制剂领域常用于制备脂质体的磷脂类型，包括中性磷脂，负电荷磷脂或正电荷磷脂，具体可选自：大豆磷脂、卵磷脂、脑磷脂、鞘磷脂（SM）、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺(PE)、二棕榈酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰胆碱 (DSPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、磷脂酸(PA)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)、双鲸蜡磷脂酸(DCP)、硬脂酰胺(stearylamine,SA)、N-[1-(2,3-二油酰基)丙基-]-N，N，N-三甲基氯化铵[DOTMA]，N-[1-(2,3-二油酰基)丙基]-N-(2-(精氨酸基酰胺)乙基-N,N-dimethylammonium teifluoroacetate, DOSPA)，二甲基双十八烷基溴化铵（DDAB），1,2 - 二油酰-3 - 磷酸胆碱(DOPC)，1,2 - 二油酰基-3 - 三甲基铵丙烷（氯化物盐）（DOTAP）和1,2 – 二十八烷基-SN-甘油-3 - 磷酸乙醇胺（DSPE）等中的一种或几种。

所述叶酸偶联脂质，具体可以包括聚乙二醇链（分子量200～5000Da的聚乙二醇均可）或氨基己酸等为间隔基，通过酰胺键或酯键使叶酸与脂质偶联，形成“叶酸-间隔基-脂质”结构。叶酸偶联脂质的合成方法可包括多种其他任何能让二者相连的方法，并不限于以上所列方法。

所述叶酸偶联脂质，具体为叶酸偶联磷脂、叶酸偶联胆固醇、叶酸偶联胆固醇衍生物中的至少一种。

其中：

所述叶酸偶联磷脂，具体包括叶酸偶联大豆磷脂、叶酸偶联卵磷脂、叶酸偶联脑磷脂、叶酸偶联SM、叶酸偶联PC、叶酸偶联PE、叶酸偶联DPPC、叶酸偶联DSPC、叶酸偶联DMPC、叶酸偶联PA、叶酸偶联PG、叶酸偶联PI、叶酸偶联PS、叶酸偶联DCP、叶酸偶联SA、叶酸偶联DOTMA，叶酸偶联DOSPA，叶酸偶联DDAB，叶酸偶联DOPC，叶酸偶联DOTAP和叶酸偶联DSPE等中的一种或几种。

本发明提供的靶向脂质体，所述的载体材料还可加入药学上可以接受的辅料成分。具体包括胆固醇、胆固醇衍生物如N-（N'，N'-二甲基氨基乙烷） - 氨基甲酰基胆甾醇盐酸盐（DC-胆固醇）、单甲氧基聚乙二醇修饰脂质包括单甲氧基聚乙二醇修饰磷脂或单甲氧基聚乙二醇修饰胆固醇、冻干保护剂、pH调节剂、抗氧剂等中的一种或几种。

本发明提供的靶向脂质体，具体制备方法通过比较考察了薄膜法、逆向蒸发法、注入法、超声法等多种制备方法，优选出薄膜法用于制备靶向脂质体。

附图说明

图1：凝胶阻滞试验（1：DNA marker；2~8：Claudin3 基因干扰序列与磷脂质量比=1:1、1:2、1:5、1:10、1:20、1:25、1:30）

图2：不同用量叶酸偶联脂质制备的靶向脂质体体外对SKOV-3细胞的生长抑制作用

图3：靶向脂质体体外对不同人肿瘤细胞的生长抑制作用

图4：靶向脂质体下调Claudin3 基因表达及体内抗人卵巢癌试验结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

试验例1 凝胶阻滞试验优选Claudin3 基因干扰序列与磷脂的质量比

取由不同质量比的Claudin3 基因干扰序列与磷脂（1:1、1:2、1:5、1:10、1:20、1:25、1:30）制成的靶向脂质体各8μl，与2μl Loading buffer混匀后，于130V 1% 琼脂糖电泳分析15min，采用凝胶成像系统采集图像分析电泳结果，并记录如图1。电泳结果表明，在试验条件下，Claudin3 基因干扰序列与磷脂质量比为1:1时，基因不能完全被脂质体装载；当Claudin3 基因干扰序列与磷脂质量比增加到1:2~1:30时，基因均可被靶向脂质体全部装载。因Claudin3 基因干扰序列与磷脂质量比为1:30时，所用载体材料磷脂的量太大，给药的时候不方便，因此，优选Claudin3 基因干扰序列与磷脂的质量比1:2~1:25。

试验例2 体外抗癌效果试验优选叶酸偶联脂质材料用量

胰酶消化对数生长期的人卵巢癌SKOV-3细胞，离心沉淀后用含血清、无叶酸DMEM培养液重悬并计数，取适量重悬液用含血清、无叶酸DMEM培养液稀释至每ml含0.75×10⁵个细胞，每孔接种200μl细胞悬液，5% CO₂，37℃孵箱中培养过夜。取出96孔板弃去培养液，加入200μl无血清、无叶酸DMEM稀释制备好的含不同用量叶酸偶联脂质（占磷脂的摩尔百分数分布为：0.01%、0.05%、0.5%、1%、2.5%、5%、8%）制备的靶向脂质体（实施例15~21），阴性对照直接加入无血清、无叶酸DMEM 200μl，混匀后于孵箱中培养约5h~6h，更换正常双有培养基，于孵箱中培养约42h后，向96孔板每孔中加入5mg/ml的MTT 20μl，孵箱中继续孵育4h，弃尽培养液，加入DMSO 150μl，待溶解后于酶标仪上测定各孔在 492nm时的吸收值，计算细胞生长抑制率，结果如图2。可见，当叶酸偶联脂质占磷脂的摩尔百分数为0.01%时，靶向脂质体对SKOV-3细胞的生长抑制作用较差，抑制率仅21.52±5.24%，当叶酸偶联脂质占磷脂的摩尔百分数增加到0.05%时，平均抑制率增加到76.48%，继续增加叶酸偶联脂质用量至5%时，抑制率逐渐上升，但进一步增加到8%时，抑制率不再增加。基于辅料最小用量原则，叶酸偶联脂质占磷脂的摩尔百分数优选为0.05%~5%。

试验例3 靶向脂质体对不同人肿瘤细胞株的体外抗癌效果试验

分别取对数生长期的人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞HepG-2、人肺癌细胞A549、人结肠癌细胞HCT116、人黑色素瘤细胞A375、人胰腺癌细胞PANC-1、人前列腺癌细胞PC-3，消化制成单细胞悬液，接种至96 孔板中（3-5×10³个/孔），每孔接种200μl细胞悬液，5% CO₂，37℃孵箱中培养过夜。取出96孔板弃去培养液，加入200μl无血清、无叶酸DMEM稀释制备好的靶向脂质体（实施例23），阴性对照直接加入无血清、无叶酸DMEM 200μl，混匀后于孵箱中培养约5h~6h，更换正常双有培养基，于孵箱中培养约42h后，向96孔板每孔中加入5mg/ml的MTT 20μl，孵箱中继续孵育4h，弃尽培养液，加入DMSO 150μl，待溶解后于酶标仪上测定各孔在 492nm时的吸收值，计算细胞生长抑制率，结果见图3。靶向脂质体对多种人肿瘤细胞的生长抑制活性均大于70%，具有广谱的抗癌作用。

试验例4 靶向脂质体对人卵巢癌的体内抗癌效果试验

将Balb/C雌性裸鼠饲养于无特定病原体（SPF）屏障环境中。4~6周龄健康小鼠腹腔接种约1×10⁷个SKOV-3细胞/只，接种3天后按照体重随机分组（每组8只）并给药，具体分组为：对照组（Control）、非靶向组（P-LP/CLDN3，制备方法同实施例24，仅将其中的0.25％的叶酸-聚乙二醇-胆固醇用0.25％的单甲氧基聚乙二醇胆固醇酯替代）和叶酸靶向组（F-P-LP/CLDN3：用的是实施例24的靶向脂质体）。给药方式为腹腔注射，每三天注射1次，给药剂量为每只小鼠5µg质粒/200µl，连续给药10次。处死裸鼠，解剖后记录腹水体积、肿瘤结节的个数及肿瘤的重量，结果见图4，叶酸受体靶向的干扰Claudin3 基因表达的药物组合物（F-P-LP/CLDN3）组跟非靶向组相比，显著提高了Claudin3的干扰效率，达到了较为理想的抗肿瘤效果。与对照组比较，叶酸受体靶向的干扰Claudin3 基因表达的药物组合物抑瘤率达90%，显著优于非叶酸受体靶向的干扰Claudin3 基因表达的药物组合物（72%）（p<0.001）；Western Blot和免疫组化分析结果显示，叶酸受体靶向的干扰Claudin3 基因表达的药物组合物几乎完全抑制Claudin3在肿瘤细胞的表达。

实施例1 干扰Claudin3基因表达的RNA序列设计

利用 Invitrogen 公司 BLOCK-iT™ RNAi Designer 在线设计软件（http：//rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/）设计干扰Claudin3基因表达的RNA序列，再与 GeneBank 序列比较，筛选出不与人体其他任何 mRNA 存在同源性的序列SEQ1，正义链为：GCAACAUCAU CACGUCGCAT T，反义链为：UGCGACGUGA UGAUGUUGCT T。

利用在线设计软件（http://sidirect2.rnai.jp/），设计干扰Claudin3基因表达的RNA序列，再与 GeneBank 序列比较，筛选出不与人体其他任何 mRNA 存在同源性的序列SEQ2，正义链为：TCCCGCAACA TCATCACGTC GCATTCAAGA CGTGCGACGT GATGATGTTG CTTTTTTG，反义链为：AGCTCAAAAA AGCAACATCA TCACGTCGCA CGTCTTGAAT GCGACGTGAT GATGTTGC。

实施例2 RNAi表达质粒载体构建

首先设计并合成编码对应靶序列的shRNA的DNA模板上下游引物；分别以30 μL退火缓冲液，溶解引物上下游片段（1 OD）。各取2 μL上述溶液+16 μL退火缓冲液混匀，加热至94℃后自然退火冷却至室温。取1 μL退火产物+99 μL水做100倍稀释。将shRNA质粒表达载体pGenesil-2.1或pGenesil2.4以Eco31I 限制性内切酶进行酶切，酶切产物以1%琼脂糖凝胶电泳，胶回收质粒大片段。CLDN3退火片段与pGenisil-2.1线性化连接。连接产物转化感受态DH5α大肠杆菌，涂布于含卡那霉素抗性（终浓度为50 μg/mL）的LB琼脂糖培养基平板上，37℃恒温培养箱培养过夜。进行小规模质粒抽提，并以SacI做酶切鉴定。挑取酶切电泳初步验证的克隆正确的质粒转化菌液测序。经测序结果分析：均为插入正确的克隆质粒，而且质量均符合设计标准。将成功构建的RNAi表达质粒载体经Qiagen公司大抽试剂盒（Plasmid extraction and purification EndoFree Plasmid Giga Kits）大规模制备，即得，记为pGenesil2.1shRNA或pGenesil2.4shRNA。

实施例3～8 以α-羧基-ω-氨基聚乙二醇或氨基己酸为间隔基制备叶酸靶向脂质

具体投料如下：

具体操作为：取α-羧基-ω-氨基聚乙二醇或氨基己酸（氨基末端保护）0.5mmol，脂质材料（胆固醇或磷脂）0.75mmol，4-二甲氨基吡啶0.75mmol和1-乙基-3–(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺0.75mmol溶于100ml二氯甲烷中，反应约72~96h。减压旋蒸除去有机溶剂，真空干燥得氨基聚乙二醇胆固醇粗产品。称取叶酸1mmol、N-羟基琥珀酰亚胺2.5mmol、1-乙基-3–(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺2.5mmol和三乙胺10mmol溶于50ml无水DMSO中，加入约0.5mmol氨基聚乙二醇胆固醇粗产品，25~30℃反应约72~96h，反应液转入透析袋（MWCO=3500 Da），分别以20%（v/v）DMSO和水为透析介质透析，透析7天后，转移透析样品至丝口瓶中，冻干，即得叶酸-聚乙二醇-胆固醇或叶酸-聚乙二醇-磷脂（即叶酸修饰脂质）。叶酸反应、纯化及冻干全程避光，产物避光保存于干燥器中。

实施例9～14 以双氨基聚乙二醇为间隔基制备叶酸偶联脂质

具体投料如下：

具体操作为：将脂质（胆固醇或磷脂）(10 mmol) ，丁二酸酐(50mmol) ，DMAP(5mmol)溶于50 mL 二氯甲烷中，45 ℃剧烈回流，搅拌48 h，得丁二酰化脂质（胆固醇或磷脂）。取丁二酰化脂质（4mmol），1-乙基-3–(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺（10mmol），N-羟基琥珀酰亚胺（10mmol）溶于少量二氯甲烷中，滴加至100ml的双氨基聚乙二醇（5mmol）二氯甲烷溶液中，室温搅拌反应约72h~96h。反应液用60目~80目硅胶拌样，300目~400目硅胶湿法装柱，干法上样。以二氯甲烷-甲醇体系为洗脱剂，比例从80:1，60:1，40:1到20:1（体积比，v/v），收集含有目标产物的洗脱液，合并浓缩除去有机溶剂，得氨基聚乙二醇-胆固醇。将叶酸（0.42mmol）、NHS（0.5mmol）、EDCI（0.5mmol）和三乙胺（4mmol）溶于5ml无水二甲亚砜中，滴加氨基聚乙二醇-胆固醇（0.21mmol）的DMSO溶液。25℃~30℃反应约120h~144h后，将反应液转入透析袋（MWCO=1000Da），分别以20%（v/v）DMSO和水为透析介质透析，透析14天后，转移透析样品至丝口瓶中，冻干，即得叶酸-聚乙二醇-胆固醇或叶酸-聚乙二醇-磷脂（即叶酸修饰脂质）。叶酸反应、纯化及冻干全程避光，产物避光保存于干燥器中。

实施例15～21 叶酸修饰的质粒/脂质体组合物制备

取叶酸靶向脂质，先用5%葡萄糖溶液溶解，制得1mg/ml的叶酸靶向脂质的胶束溶液。再取20mg脂质材料，加入氯仿使溶解，37℃减压除去氯仿，时间为1h，然后于室温、高真空条件下保持6h以上，葡萄糖溶液水化脱膜，水浴温度60℃，时间1h；脱膜后的混悬液转入西林瓶中，趁热水浴超声，水浴温度60℃，超声15min，0.22μm微孔滤膜过滤，滤液与pGenesil2.4 shRNA按质量比混合，室温孵育 30min，记为P-LP/CLDN3。取叶酸修饰脂质的胶束溶液与P-LP/CLDN3按上表摩尔比混合，并置于37℃恒温空气浴振荡器中，100rpm振摇1h后，即得叶酸修饰的质粒/脂质体组合物，记为F-P-LP/CLDN3。

实施例22～27 叶酸修饰的质粒/脂质体组合物制备

取脂质材料于茄形烧瓶中，氯仿-甲醇混合溶剂溶解，37℃减压除去有机溶剂，时间为1h，然后于室温、高真空条件下保持6h以上，葡萄糖溶液水化脱膜，水浴温度60℃，时间1h；脱膜后的混悬液转入西林瓶中，趁热水浴超声，水浴温度60℃，超声1min，0.22μm微孔滤膜过滤，制得叶酸靶向空白脂质体，记为F-P-LP。F-P-LP与pGenesil2.1shRNA按上表质量比混合，室温孵育30min，即制得叶酸修饰的质粒/脂质体组合物，记为F-P-LP/CLDN3。

Claims (6)

1.一种含Claudin3 基因干扰序列的靶向脂质体，其特征在于：它是以Claudin3 基因干扰序列为活性成分，加入载体材料制成的靶向脂质体；其中，所述的载体材料含有磷脂与叶酸偶联脂质。

2.根据权利要求1所述的靶向脂质体，其特征在于，Claudin3 基因干扰序列与磷脂的质量比为：1:2~1:25，叶酸偶联脂质占磷脂的摩尔百分数为：0.05~5%。

3.根据权利要求1所述的靶向脂质体，其特征在于，Claudin3 基因干扰序列构建于质粒载体中。

4.根据权利要求1所述的靶向脂质体，其特征在于，叶酸偶联脂质为叶酸偶联磷脂、叶酸偶联胆固醇、叶酸偶联胆固醇衍生物中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的靶向脂质体，其特征在于，所述的载体材料还可加入药学上可以接受的辅料成分。

6.权利要求1-5任一项所述的制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。