CN103990145A

CN103990145A - 具有肿瘤靶向的叶酸-pamam-熊果酸纳米药物及其制备方法

Info

Publication number: CN103990145A
Application number: CN201410271351.6A
Authority: CN
Inventors: 高瑜; 李志洪; 王超群; 陈海军; 贾力
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2014-06-17
Filing date: 2014-06-17
Publication date: 2014-08-20
Anticipated expiration: 2034-06-17
Also published as: CN103990145B

Abstract

本发明公开了一种具有肿瘤靶向的叶酸-PAMAM-熊果酸纳米药物及其制备方法。该纳米药物是将叶酸（FA）和熊果酸（UA）化学联接到聚酰胺-胺型树状大分子（PAMAM）上而得到的PAMAM衍生物，FA和UA的接枝率分别为0.5%-5%和0.5-10%。具体制备方法为：先将PAMAM与缩水甘油反应，将PAMAM表面的氨基置换成羟基，再将FA和UA与PAMAM表面的羟基反应，合成含有可生物降解酸敏感酯键的FA-PAMAM-UA纳米药物。本发明的纳米药物既解决了UA水溶性差的问题，又利用肿瘤组织的增强的渗透和滞留效应（EPR）使纳米药物被动靶向到肿瘤组织中，同时能利用叶酸与肿瘤细胞表面叶酸受体的主动靶向作用选择性地浓集于肿瘤细胞，从而提高了抗肿瘤活性，降低了药物毒副作用。

Description

具有肿瘤靶向的叶酸-PAMAM-熊果酸纳米药物及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种具有肿瘤靶向的叶酸-PAMAM-熊果酸纳米药物及其制备方法。

背景技术

熊果酸（ursolic acid，UA），又名乌索酸、乌苏酸，属α-香树脂醇型五环三萜类化合物。其化学名为：3-羟基-（3β）-乌索12-烯-28-酸，分子式为C₃₀H₄₈O₃，分子量为456.68，其结构式如下：

。

熊果酸在自然界分布很广，广泛存在于白花蛇舌草、女贞子、乌梅、夏枯草等植物中。熊果酸具有抗炎、抗病毒、调血脂、抗动脉粥样硬化及增强免疫等广泛的药理效应。现代药理试验表明，熊果酸还具有抗肿瘤作用，不仅对多种致癌、促癌物质有抵抗作用，而且能抑制多种恶性肿瘤细胞的生长，且其毒性低、副作用少，被认为是最有希望的肿瘤预防药物之一（Shanmugam, M. K.; Nguyen, A. H.; Kumar, A. P.; Tan, B. K.; Sethi, G. Targeted inhibition of tumor proliferation, survival, and metastasis by pentacyclic triterpenoids: potential role in prevention and therapy of cancer. Cancer Lett 2012, 320, 158-170）。

但是熊果酸在化学结构上属于三萜类皂苷，存在着水溶性差、有明显吸收外排、生物利用度低等问题（Liao Q F, Yang W, Jia Y, et al. LC-MS Determination and pharmacokinetic studies of ursolic acid in rat plasma after administration of the traditional Chinese medicinal preparation Lu-Ying extract. Yakugaku Zasshi, 2005,125(6): 509-515）。因生物利用度低，所需给药剂量较大，导致口服熊果酸及其制剂进入胃肠道刺激黏膜引起胃纳减少、恶心、呕吐等症状，患者依从性较差。这些问题使熊果酸在应用和开发上受到了极大的限制。因此，开发一种能改善水溶性和提高生物利用度的熊果酸制剂尤为必要。

纳米技术是在20世纪80年代开始逐步发展起来的一个前沿、交叉性新型学科领域，已经给生物医学行业带来巨大的变化。纳米技术在药物研究中的重点之一是纳米载药系统的构建。利用纳米技术可将纳米载体材料和药物一起制成纳米制剂，通过对载体系统的合理的设计和构建，药物能被有效地输送到靶部位，减少了药物在正常组织中的分布，降低了药物的毒副作用，同时大幅提高药物的生物利用度（Jabir NR, Tabrez S, Ashraf GM, Shakil S, Damanhouri GA, Kamal MA. Int J Nanomedicine. 2012, 7:4391-408）。在肿瘤治疗领域，纳米给药系统具有不可比拟的优越性。因肿瘤组织为达到快速生长的目的，血管丰富且血管壁间隙较宽，导致结构完整性差，对大分子和纳米颗粒具有高通透性，同时肿瘤组织淋巴回流系统缺失，大分子和纳米颗粒表现出滞留现象，这种肿瘤组织透过性增强及滞留效应（ERP效应）使得纳米给药系统对肿瘤组织具有被动靶向性（Grobmyer SR, Zhou G, Gutwein LG, Iwakuma N, Sharma P, Hochwald SN. Nanomedicine. 2012, 8 Suppl 1:S21-30）。此外，由于肿瘤细胞表面往往过表达与肿瘤生长增殖密切相关的一系列受体，为了加强靶向作用，可以设计具有主动靶向作用的纳米粒，通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合，使药物能够准确送到肿瘤细胞中，实现恶性肿瘤的靶向治疗（Egusquiaguirre SP, Igartua M, Hernández RM, Pedraz JL. Clin Transl Oncol. 2012, 14(2):83-93）。目前有很多改善熊果酸生物利用度的纳米制剂如熊果酸氰基丙烯酸酯纳米粒冻干粉针（CN1410065A）、熊果酸纳米载药微球（CN102670525 A）、熊果酸聚乳酸纳米粒冻干粉针剂（CN1410066A）、熊果酸脂肪乳注射剂（CN1771968A）、熊果酸磷脂复合物（CN101095684A）等都被开发出来。但这些制剂均不具备主动靶向到肿瘤组织的能力。

聚酰胺-胺型（Polyamidoamine, PAMAM）树枝状高分子是近年来出现的一类新型纳米级的合成高分子，高度分枝，末端氨基丰富，易于修饰连接抗体等生物活性物质以增加载体高分子的靶向性。同时，PAMAM 的粒径大小、电泳性质和其他一些拟生态性质与球状蛋白质非常相似，被称为“人工蛋白”，其作为新型的药物载体已经成为生物医药领域的研究热点之一。叶酸受体是一种糖蛋白，在肿瘤细胞膜表面高度表达，而在绝大多数正常组织中，几乎不表达。叶酸是一种B族维生素，对叶酸受体具有高度亲和性，利用该性质可将药物或纳米药物与叶酸偶联，将药物主动靶向至肿瘤。叶酸结构式如下：

。

为了克服现有技术的不足，本发明人制备了具有肿瘤靶向的叶酸-PAMAM-熊果酸纳米药物，既解决了UA水溶性差的问题，又利用肿瘤组织的增强的渗透和滞留效应（EPR）使纳米药物被动靶向到肿瘤组织中，同时能利用叶酸与肿瘤细胞表面叶酸受体的主动靶向作用选择性地浓集于肿瘤细胞，从而提高抗肿瘤活性，降低药物毒副作用。检索国内外相关文献和专利结果表明：具有肿瘤靶向性的叶酸-PAMAM-熊果酸纳米药物及其制备方法，尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种具有肿瘤靶向的叶酸-PAMAM-熊果酸纳米药物及其制备方法，既解决了UA水溶性差的问题，又利用肿瘤组织的增强的渗透和滞留效应（EPR）使纳米药物被动靶向到肿瘤组织中，同时能利用叶酸与肿瘤细胞表面叶酸受体的主动靶向作用选择性地浓集于肿瘤细胞，从而提高抗肿瘤活性，降低药物毒副作用。

为达到上述目的，本发明采取了如下技术方案：

本发明提出的一种叶酸-PAMAM-熊果酸纳米药物，它是熊果酸（UA）、叶酸（FA）和聚酰胺-胺树枝状大分子（PAMAM）反应得到的PAMAM衍生物，FA和UA的接枝率分别为0.5%-5%和0.5-10%。

一种制备如上所述的叶酸-PAMAM-熊果酸纳米药物的方法为：先将PAMAM表面的氨基置换成羟基，再将叶酸和熊果酸与PAMAM表面的羟基反应，合成含有可生物降解酸敏感酯键的叶酸-PAMAM-熊果酸纳米药物。

所述的叶酸-PAMAM-熊果酸纳米药物的制备方法，包括以下步骤：

（1）将PAMAM和缩水甘油溶于无水甲醇中，室温N₂保护下搅拌反应过夜，旋蒸除甲醇，粘稠物用纯水溶解，装入透析袋中透析，冻干，得到PAMAM-OH聚合物；

（2）将PAMAM-OH聚合物和熊果酸溶于二甲基亚砜中，放入塞有胶塞的小圆底烧瓶中，充N₂保护，边搅拌边逐滴加入碘代2-氯-1-甲基吡啶（CMPI）和对二甲氨基吡啶（DMAP），常温反应72 h；然后加入叶酸、碘代2-氯-1-甲基吡啶和对二甲氨基吡啶继续反应48 h，将反应液用纯水稀释后装入透析袋中，先用磷酸盐缓冲液透析后再用纯水透析48 h，离心除去沉淀物，将上清液冻干，得到叶酸-PAMAM-熊果酸偶联物。

步骤（1）中所采用的PAMAM的代数为3~5代。

步骤（2）中参加反应的熊果酸为游离熊果酸或酰氯化的熊果酸。

步骤（2）中PAMAM-OH：叶酸:熊果酸:碘代2-氯-1-甲基吡啶: 对二甲氨基吡啶的摩尔比为1:1~20:1~20:1.2:1.2。

步骤（2）中PAMAM-OH、叶酸、熊果酸、碘代2-氯-1-甲基吡啶、对二甲氨基吡啶在反应液中的总浓度为1~25wt%。

所述的透析袋截留分子量为2000~14000。

其中，酰氯化的熊果酸（UA）的制备方法为：将UA和乙酸酐溶于吡啶中，加入适量DMAP，放入塞有胶塞的小圆底烧瓶中，常温反应过夜；重结晶后（参照文献Meng, Y. Q.; Liu, D.; Cai, L. L.; Chen, H.; Cao, B.; Wang, Y. Z. The synthesis of ursolic acid derivatives with cytotoxic activity and the investigation of their preliminary mechanism of action. Bioorg Med Chem 2009, 17, 848-854），得3-O-乙酰熊果酸；将3-O-乙酰熊果酸与草酰氯在二氯甲烷下反应，旋干，得酰氯化的熊果酸（UA-酰氯）。

本发明的作用原理是：第一，采用PAMAM树枝状高分子作为熊果酸的载体材料，利用PAMAM在水溶液中很好的单分散性携带熊果酸能分散在水溶液中，解决熊果酸水溶性差的问题；第二，由于PAMAM具有纳米级别的尺寸，可使纳米药物利用肿瘤组织的增强的渗透和滞留效应（EPR）被动靶向到肿瘤组织中，提高熊果酸对肿瘤组织的靶向性；第三，该纳米药物能通过其表面所修饰的叶酸主动靶向到肿瘤细胞，进一步提高熊果酸对肿瘤细胞的选择性，为在患者使用中增加药物的使用剂量而又不引起过高的毒性反应提供了保证；第四，该熊果酸纳米药物能够通过肿瘤细胞的受体-配体介导的内吞作用被摄入细胞内，这种进入方式效率远大于小分子裸药逐渐渗入方式的效率，从而使熊果酸能够迅速在细胞内达到较高的药物浓度，产生更好的抗肿瘤效果。

本发明的有益效果是：

第一，本发明选用聚酰胺-胺树状大分子作为药物载体，将它与能特异性识别肿瘤细胞的叶酸和抗肿瘤药物熊果酸两种分子共价偶联，形成的叶酸-PAMAM-熊果酸纳米药物具有纳米尺度，可携带药物高度分散在水相中，不仅能被动靶向到肿瘤组织，还能通过其表面所修饰的叶酸主动靶向到肿瘤细胞，解决熊果酸水溶性差，对肿瘤组织靶向性差，生物利用度低的缺点；

第二，本发明的叶酸-PAMAM-熊果酸纳米药物的粒径小于100nm，不会形成给药栓塞，可用于患者的静脉给药或者腹腔给药，能够在肿瘤部位浓集，特异性识别并抑制肿瘤细胞，从而达到更加优越的抗肿瘤药效。

附图说明

图1实施例1制备的叶酸-PAMAM-熊果酸纳米药物的¹H-NMR谱图，其中A为第三代PAMAM（G3-NH₂）的¹H-NMR谱；B为将PAMAM与缩水甘油反应后将PAMAM表面的氨基置换成羟基的产物（G3-OH）的¹H-NMR谱；C为叶酸-PAMAM-熊果酸纳米药物（FA-G3-UA）的¹H-NMR谱；

图2 实施例4制备的叶酸-PAMAM-熊果酸纳米药物的体外细胞毒性，A为Hela细胞，B为HepG2细胞。

图3 实施例8制备的FITC标记的叶酸-PAMAM-熊果酸纳米药物的细胞摄取情况，A为Hela细胞，B为HepG2细胞。

具体实施方式

下面，将通过实施例，对本发明进行进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例，在本发明权利要求所阐明的范围内，可进行各种改变或等同替换。

实施例1

称取100 mg 第三代PAMAM（G3-NH₂）溶于10 mL无水甲醇中，逐滴加入缩水甘油（85mg）的无水甲醇溶液，室温N₂保护下搅拌反应过夜。旋蒸除甲醇，粘稠物用纯水溶解，装入透析袋中透析2天，冻干，得到PAMAM-OH聚合物（G3-OH）。称取100mg G3-OH、4.9 mg熊果酸溶于5mL DMSO中，装入圆底烧瓶中，充氮气保护。称取87 mg碘代2-氯-1-甲基吡啶（CMPI）和83 mg对二甲氨基吡啶（DMAP）溶于DMSO中，将此DMSO溶液逐滴加入到含G3-OH的圆底烧瓶中，常温反应72 h后加入2.4mg叶酸、20 mg CMPI和20 mg DMAP继续反应48 h。将反应液用纯水稀释后装入透析袋中，先用磷酸盐缓冲液（PBS）透析后再用纯水透析48 h，离心除去沉淀物，将上清液冻干，得到FA-PAMAM-UA偶联物（FA-G3-UA）。用重水作为¹H-NMR谱的测试溶剂，从图1可知，叶酸和熊果酸已成功偶联到PAMAM上。

实施例2

称取100 mg 第五代PAMAM（G5-NH₂）溶于10 mL无水甲醇中，逐滴加入缩水甘油（85mg）的无水甲醇溶液，室温N₂保护下搅拌反应过夜。旋蒸除甲醇，粘稠物用纯水溶解，装入透析袋中透析2天，冻干，得到PAMAM-OH聚合物（G5-OH）。称取100mg G5-OH、4.9 mg熊果酸溶于5mL DMSO中，装入圆底烧瓶中，充氮气保护。称取87 mg碘代2-氯-1-甲基吡啶（CMPI）和83 mg对二甲氨基吡啶（DMAP）溶于DMSO中，将此DMSO溶液逐滴加入到含G5-OH的圆底烧瓶中，常温反应72 h加入2.4mg叶酸、20 mg CMPI和20 mg DMAP继续反应48 h。将反应液用纯水稀释后装入透析袋中，先用磷酸盐缓冲液（PBS）透析后再用纯水透析48 h，离心除去沉淀物，将上清液冻干，得到FA-PAMAM-UA偶联物（FA-G5-UA）。

实施例3

称取100 mg 第三代PAMAM（G3-NH₂）溶于10 mL无水甲醇中，逐滴加入缩水甘油（85mg）的无水甲醇溶液，室温N₂保护下搅拌反应过夜。旋蒸除甲醇，粘稠物用纯水溶解，装入透析袋中透析2天，冻干，得到PAMAM-OH聚合物（G3-OH）。称取100mg G3-OH、20 mg熊果酸溶于5mL DMSO中，装入圆底烧瓶中，充氮气保护。称取87 mg碘代2-氯-1-甲基吡啶（CMPI）和83 mg对二甲氨基吡啶（DMAP）溶于DMSO中，将此DMSO溶液逐滴加入到含G3-OH的圆底烧瓶中，常温反应72 h后加入8.0 mg叶酸、20 mg CMPI和20 mg DMAP继续反应48 h。将反应液用纯水稀释后装入透析袋中，先用磷酸盐缓冲液（PBS）透析后再用纯水透析48 h，离心除去沉淀物，将上清液冻干，得到FA-PAMAM-UA偶联物（FA-G3-UA）。

通过核磁谱图分析，在一定范围内，提高FA和UA的投料比，可提高FA和UA在PAMAM表面的接枝率。

实施例4

称取100 mg 第五代PAMAM（G5-NH₂）溶于10 mL无水甲醇中，逐滴加入缩水甘油（85mg）的无水甲醇溶液，室温N₂保护下搅拌反应过夜。旋蒸除甲醇，粘稠物用纯水溶解，装入透析袋中透析2天，冻干，得到PAMAM-OH聚合物（G3-OH）。称取100mg G5-OH、20 mg熊果酸溶于5mL DMSO中，装入圆底烧瓶中，充氮气保护。称取87 mg碘代2-氯-1-甲基吡啶（CMPI）和83 mg对二甲氨基吡啶（DMAP）溶于DMSO中，将此DMSO溶液逐滴加入到含G5-OH的圆底烧瓶中，常温反应72 h后加入8.0 mg叶酸、20 mg CMPI和20 mg DMAP继续反应48 h。将反应液用纯水稀释后装入透析袋中，先用磷酸盐缓冲液（PBS）透析后再用纯水透析48 h，离心除去沉淀物，将上清液冻干，得到FA-PAMAM-UA偶联物（FA-G5-UA）。

通过核磁谱图分析，提高FA和UA的投料比，可提高FA和UA在PAMAM表面的接枝率。

实施例5

称取100 mg 第五代PAMAM（G5-NH₂）溶于10 mL无水甲醇中，逐滴加入缩水甘油（85mg）的无水甲醇溶液，室温N₂保护下搅拌反应过夜。旋蒸除甲醇，粘稠物用纯水溶解，装入透析袋中透析2天，冻干，得到PAMAM-OH聚合物（G5-OH）。称取100mg G5-OH和20 mg熊果酸溶于5mL DMSO中，装入圆底烧瓶中，充氮气保护。称取87 mg碘代2-氯-1-甲基吡啶（CMPI）和83 mg对二甲氨基吡啶（DMAP）溶于DMSO中，将此DMSO溶液逐滴加入到含G5-OH的圆底烧瓶中，常温反应72 h。将反应液用纯水稀释后装入透析袋中，先用磷酸盐缓冲液（PBS）透析后再用纯水透析48 h，离心除去沉淀物，将上清液冻干，得到PAMAM-UA偶联物（G5-UA）。

实施例6

为提高UA的取代度，可先将对UA 3-位上的羟基进行乙酰化保护而生成3-O-乙酰熊果酸，再将3-O-乙酰熊果酸与草酰氯反应，将3-O-乙酰熊果酸的羧基变成酰氯，再将该产物（UA-酰氯）与PAMAM-OH反应。

称取100 mg 第三代PAMAM（G3-NH₂）溶于10 mL无水甲醇中，逐滴加入缩水甘油（85mg）的无水甲醇溶液，室温N₂保护下搅拌反应过夜。旋蒸除甲醇，粘稠物用纯水溶解，装入透析袋中透析2天，冻干，得到PAMAM-OH聚合物（G3-OH）。称取100mg G3-OH、20 mgUA-酰氯溶于5mL DMSO中，装入圆底烧瓶中，充氮气保护。称取87 mg碘代2-氯-1-甲基吡啶（CMPI）和83 mg对二甲氨基吡啶（DMAP）溶于DMSO中，将此DMSO溶液逐滴加入到含G3-OH的圆底烧瓶中，常温反应72 h后加入8.0 mg叶酸、20 mg CMPI和20 mg DMAP继续反应48 h。将反应液用纯水稀释后装入透析袋中，先用磷酸盐缓冲液（PBS）透析后再用纯水透析48 h，离心除去沉淀物，将上清液冻干，得到FA-PAMAM-UA偶联物（FA-G3-UA）。

通过核磁谱图分析，将UA的羧基酰氯化后，UA与PAMAM-OH的反应效率增加，取代度增加。

实施例7

称取100 mg 第五代PAMAM（G5-NH₂）溶于10 mL无水甲醇中，逐滴加入缩水甘油（85mg）的无水甲醇溶液，室温N₂保护下搅拌反应过夜。旋蒸除甲醇，粘稠物用纯水溶解，装入透析袋中透析2天，冻干，得到PAMAM-OH聚合物（G3-OH）。称取100mg G5-OH、20 mg UA-酰氯溶于5mL DMSO中，装入圆底烧瓶中，充氮气保护。称取87 mg碘代2-氯-1-甲基吡啶（CMPI）和83 mg对二甲氨基吡啶（DMAP）溶于DMSO中，将此DMSO溶液逐滴加入到含G5-OH的圆底烧瓶中，常温反应72 h后加入8.0 mg叶酸、20 mg CMPI和20 mg DMAP继续反应48 h。将反应液用纯水稀释后装入透析袋中，先用磷酸盐缓冲液（PBS）透析后再用纯水透析48 h，离心除去沉淀物，将上清液冻干，得到FA-PAMAM-UA偶联物（FA-G5-UA）。

实施例8

为进行细胞摄取实验，先将聚合物进行荧光染料标记。为不影响后面的取代反应，聚合物与荧光染料的投料比为摩尔比1:1，保证荧光染料在聚合物表面的取代度小于1个染料分子/1个聚合物。称取100 mg 第五代PAMAM（G5-NH₂）溶于PBS溶液（pH 7.4）中，加入异硫氰酸荧光素（FITC，0.88 mg，0.0026 mmol），常温避光搅拌过夜。用超滤管超滤，除去游离FITC，收集产物，冻干，得G5-FI。称取100 mg G5-FI溶于10 mL无水甲醇中，逐滴加入缩水甘油（85mg）的无水甲醇溶液，室温N₂保护下搅拌反应过夜。旋蒸除甲醇，粘稠物用纯水溶解，装入透析袋中透析2天，冻干，得到PAMAM-OH聚合物（G5-FI-OH）。称取100mg G5-FI-OH、20 mg熊果酸溶于5mL DMSO中，装入圆底烧瓶中，充氮气保护。称取87 mg碘代2-氯-1-甲基吡啶（CMPI）和83 mg对二甲氨基吡啶（DMAP）溶于DMSO中，将此DMSO溶液逐滴加入到含G5-FI-OH的圆底烧瓶中，常温反应72 h后加入8.0 mg叶酸、20 mg CMPI和20 mg DMAP继续反应48 h。将反应液用纯水稀释后装入透析袋中，先用磷酸盐缓冲液（PBS）透析后再用纯水透析48 h，离心除去沉淀物，将上清液冻干，得到FI-FA-G5-UA。

实施例9

称取100 mg 第五代PAMAM（G5-NH₂）溶于PBS溶液（pH 7.4）中，加入异硫氰酸荧光素（FITC，0.88 mg，0.0026 mmol），常温避光搅拌过夜。用超滤管超滤，除去游离FITC，收集产物，冻干，得G5-FI。称取100 mg G5-FI溶于10 mL无水甲醇中，逐滴加入缩水甘油（85mg）的无水甲醇溶液，室温N₂保护下搅拌反应过夜。旋蒸除甲醇，粘稠物用纯水溶解，装入透析袋中透析2天，冻干，得到PAMAM-OH聚合物（G5-FI-OH）。称取100mg G5-FI-OH、20 mg熊果酸溶于5mL DMSO中，装入圆底烧瓶中，充氮气保护。称取87 mg碘代2-氯-1-甲基吡啶（CMPI）和83 mg对二甲氨基吡啶（DMAP）溶于DMSO中，将此DMSO溶液逐滴加入到含G5-FI-OH的圆底烧瓶中，常温反应72 h。将反应液用纯水稀释后装入透析袋中，先用磷酸盐缓冲液（PBS）透析后再用纯水透析48 h，离心除去沉淀物，将上清液冻干，得到FI-G5-UA。

实施例10

以人宫颈癌细胞系Hela细胞（叶酸受体过表达细胞）和人肝癌细胞系HepG2细胞（叶酸受体低表达）为测试细胞系（细胞购自中国科学院上海生命科学研究所细胞资源中心）。

细胞培养方法：取出液氮中冻存的Hela细胞，在37℃的温水中解冻，将细胞悬液移入15 ml离心管中，加5 ml DMEM完全培养液，轻轻吹打均匀，置于离心机中，3000 rpm离心5 min，弃去上清液，加入2 ml DMEM完全培养液，轻轻吹打均匀，将细胞悬液加入培养皿中，补加6 ml DMEM完全培养液，将培养皿置于5% CO₂、37℃培养箱中培养。取出液氮中冻存的HepG2细胞，在37℃的温水中解冻，将细胞悬液移入15 ml离心管中，加5 ml RPMI 1640完全培养液，轻轻吹打均匀，置于离心机中，3000 rpm离心5 min，弃去上清液，加入2 ml RPMI 1640完全培养液，轻轻吹打均匀，将细胞悬液加入培养皿中，补加6 ml RPMI 1640完全培养液，将培养皿置于5% CO₂、37℃培养箱中培养。

细胞毒性实验：将Hela或HepG2细胞以2×10⁴个细胞/孔的密度接种到96孔培养板中，培养24 h后，更换培养液为新鲜血清培养液，加入25μM实施例4中得到的FA-G5-UA、实施例5中得到的G5-OH和G5-UA，不加纳米药物的孔设为空白对照，孵育24 h后，吸弃孔中溶液，用PBS洗涤3遍，加入新鲜培养液180 μl，同时每孔加入20 μl MTT 溶液(5 mg/ml)，继续在37 ℃、5% CO₂（相对湿度90%）培养箱中培养4 h后，终止培养，小心吸弃上清液，每孔加入150 μl DMSO，避光振荡10 min使结晶物充分溶解。以酶标仪检测570 nm处的吸收度（A），按照以下公式计算：细胞存活率%=（试验组平均A值/空白对照组平均A值）× 100%。

纳米药物的细胞毒性结果如图2所示。从图2中可以看出，G5-OH对细胞毒性很小，G5-UA和FA-G5-UA均会有效杀死细胞。在Hela细胞中，FA-G5-UA 的毒性比G5-UA强，而在HepG2细胞中，FA-G5-UA 与G5-UA毒性相当，表明叶酸的修饰可增加纳米药物对叶酸受体过表达肿瘤细胞的毒性，从而提高抗肿瘤选择性。

实施例11

细胞摄取实验：将Hela或HepG2细胞以1×10⁵个细胞/孔的密度接种到24孔培养板中，培养24 h后，更换培养液为新鲜血清培养液，加入25μM实施例8中得到的FA-G5-UA、实施例9中得到的G5-OH和G5-UA，不加纳米药物的孔设为空白对照，孵育2 h后，吸弃孔中溶液，用PBS洗涤3遍，胰酶消化，收集细胞离心，PBS重悬。用流式细胞仪测定每组细胞（10000个）的平均荧光强度。

纳米药物的细胞摄取结果如图3所示。从图3中可以看出，在Hela细胞中，FA-G5-UA 的平均荧光强度比G5-UA显著增强，而在HepG2细胞中，FA-G5-UA 的平均荧光强度与G5-UA的平均荧光强度相当，表明叶酸的修饰可增加叶酸受体过表达肿瘤细胞株对纳米药物的摄取。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种具有肿瘤靶向性的叶酸-PAMAM-熊果酸纳米药物，其特征在于：所述的纳米药物是由熊果酸、叶酸和聚酰胺-胺型树枝状大分子反应得到的PAMAM衍生物，叶酸和熊果酸的接枝率分别为0.5%-5%和0.5-10%。

2.一种制备如权利要求1所述的叶酸-PAMAM-熊果酸纳米药物的方法，其特征在于：先将PAMAM表面的氨基置换成羟基，再将叶酸和熊果酸与PAMAM表面的羟基反应，合成含有可生物降解酸敏感酯键的叶酸-PAMAM-熊果酸纳米药物。

3.根据权利要求2所述的叶酸-PAMAM-熊果酸纳米药物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（2）将PAMAM-OH聚合物和熊果酸溶于二甲基亚砜中，放入圆底烧瓶中，充N₂保护，边搅拌边逐滴加入碘代2-氯-1-甲基吡啶和对二甲氨基吡啶，常温反应72 h；然后加入叶酸、碘代2-氯-1-甲基吡啶和对二甲氨基吡啶继续反应48 h，将反应液用纯水稀释后装入透析袋中，先用磷酸盐缓冲液透析后再用纯水透析48 h，离心除去沉淀物，将上清液冻干，得到叶酸-PAMAM-熊果酸偶联物。

4.根据权利要求3所述的叶酸-PAMAM-熊果酸纳米药物的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所采用的PAMAM的代数为3~5代。

5.根据权利要求3所述的叶酸-PAMAM-熊果酸纳米药物的制备方法，其特征在于：步骤（2）中参加反应的熊果酸为游离熊果酸或酰氯化的熊果酸。

6.根据权利要求3所述的叶酸-PAMAM-熊果酸纳米药物的制备方法，其特征在于：步骤（2）中PAMAM-OH:叶酸:熊果酸:碘代2-氯-1-甲基吡啶: 对二甲氨基吡啶的摩尔比为1:1~20:1~20:1.2:1.2。

7.根据权利要求3所述的叶酸-PAMAM-熊果酸纳米药物的制备方法，其特征在于：步骤（2）中PAMAM-OH、叶酸、熊果酸、碘代2-氯-1-甲基吡啶、对二甲氨基吡啶在反应液中的总浓度为1~25wt%。

8.根据权利要求3所述的叶酸-PAMAM-熊果酸纳米药物的制备方法，其特征在于：所述的透析袋截留分子量为2000~14000。