CN105641714A - 叶酸修饰的VEGFR2/Tie2双基因组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物制药领域。本发明所要解决的技术问题是提供一种叶酸修饰的VEGFR2/Tie2双基因组合物组合物及其制备方法和用途。本发明利用可靶向肿瘤细胞表面高表达的叶酸受体的叶酸修饰脂质体，将VEGFR2/Tie2双基因选择性投递到肿瘤部位，可提高VEGFR2/Tie2双基因的转染效率，利用同时表达的人VEGFR-2胞外结合区域和人Tie-2胞外结合区域，与VEGFR和Ang竞争性结合相应的受体，从而阻断血管生成的信号通路，达到较好的抗肿瘤效果。

Description

叶酸修饰的VEGFR2/Tie2双基因组合物
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种叶酸受体靶向递送VEGFR2/Tie2双基因的药物组合物及其制备方法和用途。
背景技术
新生血管生成是肿瘤发生和转移过程中的重要事件，在肿瘤直径小于1-2mm时，肿瘤可以通过周围组织间隙来获得O2和营养物质；当肿瘤直径超过1-2mm后，如果没有新生血管生成，那么大多数肿瘤将会停止生长。新生血管不仅可以为肿瘤的生长提供丰富的O2和营养物质，而且还为肿瘤提供了侵袭和远处转移的通道。肿瘤的新生血管生成受到包括血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)/血管内皮生长因子受体(VEGFreceptor,VEGFR)通路和血管生成素(angiopoietins,Ang)/Tie受体通路等多条信号通路的调控。VEGF属于VEGF/血小板源性生长因子(platelet-derivedgrowthfactor,PDGF)超家族，通过结合并激活VEGFR而刺激新生血管生成。VEGF-A是该家族分子中介导新生血管生成最主要的调节因子。它可以与内皮细胞表面的VEGFR-1、VEGFR-2结合，激活酪氨酸激酶通路，一方面能够促进内皮细胞的增殖和迁移，另一方面还能够增加新生血管的通透性。血管生成素是另一种在肿瘤新生血管生成中发挥重要作用的信号分子，主要与Tie受体结合而发挥作用。Ang-1是该家族中主要的促血管生成因子，Ang-1与Tie-2受体结合后激活该受体，然后通过一系列信号传导途径增加内皮细胞的存活率并促进新生血管生成。除以上两条通路外，其他信号因子，如成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor,FGF)，PDGF，转化生长因子β(transforminggrowthfactor-β,TGF-β)等也在肿瘤新生血管生成的调节过程中发挥着重要作用。
鉴于血管生成在肿瘤发生发展过程中的重要地位，人们逐渐认识到抑制新生血管生成可能成为一种抗肿瘤治疗新策略。2004年2月，美国FDA正式批准了贝伐珠单抗(Bevacizumab，Avastin)联合化疗用于晚期结直肠癌的治疗，成为第一个获得批准的靶向抑制肿瘤新生血管生成的药物。随后，一大批抑制血管生成的药物，如雷莫芦单抗(Ramucirumab,Cyramza)、阿柏西普(ziv-aflibercept,Zaltrap)、索拉非尼(Sorafenib,Nexavar)、舒尼替尼(Sunitinib，Sutent)等药物相继上市并应用于临床，并取得了丰硕的成果，不仅大幅度延长了患者的生存期，而且显著改善了患者的生活质量，使抗血管生成治疗成为抗肿瘤治疗中一种颇具潜力的新途径。然而，部分患者在抗肿瘤新生血管生成治疗过程中会出现对该类药物的耐药。其耐药机制多样，“交互对话”是其中主要原因之一。因此，阻断两条及以上血管生成通路可能成为逆转抗肿瘤血管药物耐药、提高抗肿瘤血管生成作用的一种新方法。
肿瘤的基因治疗一直是肿瘤生物治疗领域的研究热点，基因靶向递送至肿瘤细胞是确保基因高效转染的关键问题之一。目前，常用的基因递送载体有病毒载体、质粒和非病毒载体系统这三种，病毒载体存在免疫原性、潜在的感染性及靶向性差等问题，质粒尽管免疫原性相对较低，但其体内转染效率较低，因此，非病毒载体是比较有潜力的基因递送载体之一。非病毒基因载体体内要达到较好的基因转染效率，关键问题之一就是实现病变部位的靶向递送。
叶酸受体(folatereceptor，FR)是一种糖基化的膜糖蛋白，通常在正常组织中有较低水平的表达，但在许多恶性肿瘤中，FR存在高水平表达。文献报道，多种上皮来源的肿瘤包括卵巢癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌、宫颈癌、脑癌、肺癌、头颈部癌以及结直肠癌等都有叶酸受体的高表达。利用可靶向肿瘤细胞表面高表达的叶酸受体成分投递药物，可以实现肿瘤选择性的靶向给药，提高药物的抗肿瘤效果。
发明人拟构建一种叶酸修饰的VEGFR2/Tie2双基因组合物，利用肿瘤部位高表达的叶酸受体将质粒选择性递送至肿瘤细胞，利用同时表达的人VEGFR-2胞外结合区域和人Tie-2胞外结合区域，与VEGFR和Ang竞争性结合相应的受体，从而阻断血管生成的信号通路，达到较好的抗肿瘤效果。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种叶酸修饰的VEGFR2/Tie2双基因组合物，目的在于靶向递送VEGFR2/Tie2双基因至肿瘤细胞，利用高效表达的抑制新生血管生成的基因产物，发挥较好的抗肿瘤作用。
该组合物含有：同时表达人VEGFR-2胞外结合区域和人Tie-2胞外结合区域的VEGFR2/Tie2质粒、叶酸修饰脂质体。可添加其他药学上可接受的成分，也可不添加其他成分。其中，VEGFR2/Tie2质粒与叶酸修饰脂质体的质量比为1:1～1:20，优选为1:2～1:15。
该药物组合物中的VEGFR2/Tie2质粒，质粒可以是任意可以获得的质粒，如实验室构建的质粒，也可以是商品化的质粒，如pVITRO2，pAAV2、pGenesil2.1、pGenesil2.4等；其中装载的目的基因即VEGFR-2胞外段cDNA序列和Tie-2胞外段cDNA序列为发明人优化的序列，该序列的表达产物体内外均显示出较高的VEGFR2和Tie2结合活性。VEGFR-2胞外段cDNA序列(942bp)为：
Tie-2胞外段cDNA序列(900bp)为：
该组合物中的叶酸修饰脂质体，含有脂质材料和叶酸修饰脂质，可添加其他药学上可接受的成分，也可不添加其他成分；其中，叶酸占总脂质摩尔数的0.01～5％，优选为0.05～2.5％。
叶酸修饰脂质体中所用的脂质材料包括磷脂及其衍生物或胆固醇及其衍生物中的一种或多种；所用的叶酸修饰脂质由叶酸与脂质材料偶联形成，中间可以使用间隔基，也可以不用间隔基团，间隔基团可选用任何能通过化学反应将叶酸与脂质材料偶联连接的基团，如常用的聚乙二醇链(PEG，分子量200～10000Da的聚乙二醇均可)、氨基己酸等。
具体地，用作脂质材料的磷脂和胆固醇种类很多，可采用制剂领域常用于制备脂质体的磷脂和胆固醇类型。具体地，制备叶酸修饰的VEGFR2/Tie2双基因组合物的脂质体时，采用的脂质材料为中性脂质，负电荷脂质或正电荷脂质材料，包括：大豆磷脂、卵磷脂、脑磷脂、鞘磷脂(SM)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、二棕榈酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰胆碱(DSPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、磷脂酸(PA)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)、双鲸蜡磷脂酸(DCP)、硬脂酰胺(stearylamine,SA)、N-[1-(2,3-二油酰基)丙基-]-N，N，N-三甲基氯化铵[DOTMA]，N-[1-(2,3-二油酰基)丙基]-N-(2-(精氨酸基酰胺)乙基-N,N-dimethylammoniumteifluoroacetate,DOSPA)，二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)，1,2-二油酰-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(氯化物盐)(DOTAP)、1,2–二十八烷基-SN-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、胆固醇、[N-(N'，N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆甾醇盐酸盐(DC-胆固醇)，以及磷脂其他衍生物或胆固醇其他衍生物，包括聚乙二醇衍生化脂质材料，等等。
本发明提供的叶酸修饰脂质体，具体制备方法可用常规脂质体的制备方法，包括薄膜法、逆向蒸发法、注入法、超声法、冻融法等多种制备方法。
附图说明
图1.叶酸修饰的VEGFR2/Tie2双基因组合物(F-LP/V-T)能显著减少腹腔转移瘤数目，降低腹腔转移瘤重量。
图2.叶酸修饰的VEGFR2/Tie2双基因组合物(F-LP/V-T)能显著降低肿瘤组织中微血管密度。
具体实施方式
以下通过对本发明具体实施方式的描述说明但不限制本发明。
实施例1～5不加间隔基的叶酸修饰脂质制备
具体投料如下：
实施例编号 1 2 3 4 5
氨基修饰胆固醇 + － － － －
DSPE － + － － －
SA － － + － －
PE － － － + －
PS － － － － +
具体操作为：将叶酸(0.42mmol)、NHS(0.5mmol)、EDCI(0.5mmol)和三乙胺(4mmol)溶于5ml无水二甲亚砜中，滴加至含有氨基的磷脂或其衍生物(DSPE、SA、0.5mmol)的DMSO溶液。25℃～30℃反应约120h～144h后，将反应液转入透析袋(MWCO＝1000Da)，分别以20％(v/v)DMSO和水为透析介质透析，透析14天后，转移透析样品至丝口瓶中，冻干，即得叶酸-胆固醇或叶酸-磷脂(即叶酸修饰脂质)。叶酸反应、纯化及冻干全程避光，产物避光保存于干燥器中。
实施例6～10以α-羧基-ω-氨基聚乙二醇为间隔基的叶酸修饰脂质制备
具体投料如下：
具体操作为：取α-羧基-ω-氨基聚乙二醇(氨基末端保护)或氨基己酸(氨基末端保护)0.5mmol，脂质材料(胆固醇或磷脂)0.75mmol，4-二甲氨基吡啶0.75mmol和1-乙基-3–(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺0.75mmol溶于100ml二氯甲烷中，反应约72～96h。减压旋蒸除去有机溶剂，真空干燥得氨基聚乙二醇胆固醇粗产品。称取叶酸1mmol、N-羟基琥珀酰亚胺2.5mmol、1-乙基-3–(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺2.5mmol和三乙胺10mmol溶于50ml无水DMSO中，加入约0.5mmol氨基聚乙二醇胆固醇粗产品，25～30℃反应约72～96h，反应液转入透析袋(MWCO＝3500Da)，分别以20％(v/v)DMSO和水为透析介质透析，透析7天后，转移透析样品至丝口瓶中，冻干，即得叶酸-聚乙二醇-胆固醇或叶酸-聚乙二醇-磷脂(即叶酸修饰脂质)。叶酸反应、纯化及冻干全程避光，产物避光保存于干燥器中。
实施例11～15以双氨基聚乙二醇为间隔基的叶酸修饰脂质制备
具体投料如下：
实施例编号 11 12 13 14 15
双氨基聚乙二醇分子量(道尔顿) 400 2000 5000 1000 1500
胆固醇 + － + － －
羟基修饰DOPC － + － + +
具体操作为：将脂质(胆固醇或磷脂)(10mmol)，丁二酸酐(50mmol)，DMAP(5mmol)溶于50mL二氯甲烷中，45℃剧烈回流，搅拌48h，得丁二酰化脂质(胆固醇或磷脂)。取丁二酰化脂质(4mmol)，1-乙基-3–(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(10mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(10mmol)溶于少量二氯甲烷中，滴加至100ml的双氨基聚乙二醇(5mmol)二氯甲烷溶液中，室温搅拌反应约72h～96h。反应液用60目～80目硅胶拌样，300目～400目硅胶湿法装柱，干法上样。以二氯甲烷-甲醇体系为洗脱剂，比例从80:1，60:1，40:1到20:1(体积比，v/v)，收集含有目标产物的洗脱液，合并浓缩除去有机溶剂，得氨基聚乙二醇-胆固醇。将叶酸(0.42mmol)、NHS(0.5mmol)、EDCI(0.5mmol)和三乙胺(4mmol)溶于5ml无水二甲亚砜中，滴加氨基聚乙二醇-胆固醇(0.21mmol)的DMSO溶液。25℃～30℃反应约120h～144h后，将反应液转入透析袋(MWCO＝1000Da)，分别以20％(v/v)DMSO和水为透析介质透析，透析14天后，转移透析样品至丝口瓶中，冻干，即得叶酸-聚乙二醇-胆固醇或叶酸-聚乙二醇-磷脂(即叶酸修饰脂质)。叶酸反应、纯化及冻干全程避光，产物避光保存于干燥器中。
实施例16～21叶酸修饰的VEGFR2/Tie2双基因组合物的制备
取叶酸修饰脂质，先用5％葡萄糖溶液溶解，制得1mg/ml的叶酸修饰脂质的胶束溶液。再取20mg脂质材料，加入氯仿使溶解，37℃减压除去氯仿，时间为1h，然后于室温、高真空条件下保持6h以上，葡萄糖溶液水化脱膜，水浴温度60℃，时间1h；脱膜后的混悬液转入西林瓶中，趁热水浴超声，水浴温度60℃，超声15min，0.22μm微孔滤膜过滤，滤液与VEGFR2/Tie2按质量比混合，室温孵育30min，记为P-LP/VEGFR2/Tie2。取叶酸修饰脂质的胶束溶液与P-LP/VEGFR2/Tie2按上表摩尔比混合，并置于37℃恒温空气浴振荡器中，100rpm振摇1h后，即得叶酸修饰的质粒/脂质体组合物，记为F-P-LP/VEGFR2/Tie2。
实施例22～27叶酸修饰的VEGFR2/Tie2双基因组合物制备
取脂质材料于茄形烧瓶中，氯仿-甲醇混合溶剂溶解，37℃减压除去有机溶剂，时间为1h，然后于室温、高真空条件下保持6h以上，葡萄糖溶液水化脱膜，水浴温度60℃，时间1h；脱膜后的混悬液转入西林瓶中，趁热水浴超声，水浴温度60℃，超声1min，0.22μm微孔滤膜过滤，制得叶酸靶向空白脂质体，记为F-P-LP。F-P-LP与VEGFR2/Tie2按上表质量比混合，室温孵育30min，即制得叶酸修饰的VEGFR2/Tie2双基因组合物，记为F-P-LP/VEGFR2/Tie2。
试验例1VEGFR2/Tie2质粒的构建、扩增和提取纯化
使用PCR克隆方法突变载体Tie-2胞外段基因，添加5’BglII，Kozak，ATG，IL-2，3’TAA和3’XhoI，通过酶切位点5’BglII和3’XhoI将基因Tie-2-mut克隆至质粒载体中，构建中间质粒。扩增VEGFR-2胞外段，添加5’BamHI，ATG，Kozak，IL-2，3’TAA和3’SalI，通过酶切位点5’BamHI和3’SalI将基因克隆至中间质粒即得VEGFR2/Tie2双基因质粒。再将重组质粒转入大肠杆菌，扩增培养后，用高纯度质粒大量提取试剂盒提取纯化VEGFR2/Tie2双基因质粒。用紫外分光光度计测定其浓度，通过A260/A280的测定和琼脂糖凝胶电泳分析VEGFR2/Tie2双基因质粒的纯度，制备的VEGFR2/Tie2双基因质粒260/A280＝1.8～2.0；同时经琼脂糖凝胶电泳检测，无染色体DNA、蛋白质及RNA污染，条带整齐清晰。
试验例2VEGFR2/Tie2质粒与叶酸修饰脂质体的质量比筛选
取VEGFR2/Tie2质粒与叶酸修饰脂质体，按不同质量比(1:0.5、1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30)等体积混合，即得叶酸修饰的VEGFR2/Tie2双基因组合物。将生长状态良好的人口腔鳞癌KB细胞铺六孔板，使接种后六孔板内细胞密度约40％-50％，用含10％FBS的DMEM培养基培养细胞；待细胞密度为60％左右时，用无叶酸无血清的DMEM培养基漂洗细胞2次，加入800μl无叶酸无血清DMEM培养基，37℃培养1h后再分别加入上述组合物(每孔加约2μg质粒)，37℃继续培养6h后，用Westernblotting检测蛋白表达情况。具体操作位：弃去细胞培养基，加入新鲜的含10％FBS的DMEM，2ml/孔，37℃继续培养48h后，弃去培养基；每孔加入100μl裂解液，然后将细胞悬液转移至事先预冷无菌Ep管中；用细胞破碎仪超声5s，间隔5s，重复2次；将超声后的细胞裂解液置于100℃水浴锅中水浴5min使蛋白变性，然后冰上静置5min；取2μl蛋白样品于核酸蛋白定量仪上测定蛋白的浓度；向所得蛋白样品中加入蛋白loadingbuffer，再用SDS-PAGE蛋白凝胶电泳分离，转膜、封闭、免疫杂交并显色。结果显示：VEGFR2/Tie2质粒与叶酸修饰脂质体的质量比为1:1～1:30时制得的组合物均有蛋白表达产物，但1:0.5几乎没有检测到蛋白表达产物，1:2时表达产物相对较少；1:25～1:30的组合物对细胞的毒性较大，细胞死亡较多，1:20的组合物有轻微毒性，细胞有少许死亡。因此，综合考虑基因表达效率和细胞毒性两方面，VEGFR2/Tie2质粒与叶酸修饰脂质体的质量比最终确定为1:1～1:20，优选为1:2～1:15。
试验例3叶酸修饰脂质材料的用量筛选
取不同摩尔比例的脂质材料(叶酸占总脂质摩尔数分别为：0、0.01％、0.05％、0.1％、0.25％、0.5％、1％、2.5％、5％、8％)混合，采用薄膜法制备叶酸修饰脂质体。叶酸占总脂质摩尔数为0～5％，均能成功制得脂质体，外观呈淡蓝色半透明胶体溶液，但高达8％时，制得的脂质体胶体溶液为白色无乳光，且沉淀较多；叶酸修饰脂质用量为5％制得的脂质体，4℃放置2周以后，有沉淀生成，稳定性略差，其他用量比例制备的脂质体稳定性均较好。取对数生长期的人宫颈癌Hela细胞铺板，待贴壁24h后，弃去培养液，加入无血清、无叶酸DMEM稀释制备好的不同脂质体(叶酸占总脂质摩尔数分别为：0、0.01％、0.05％、0.1％、0.25％、0.5％、1％、2.5％)培养4h。然后按试验例2方法，用Westernblotting检测蛋白表达情况。结果显示，未加叶酸修饰脂质的脂质体未检出有蛋白表达，加入0.01％叶酸修饰脂质的脂质体有目标蛋白检出，但检出量相对较少，加入0.05％～2.5％叶酸修饰脂质的脂质体组，目标蛋白条带均较清晰。因此，综合考虑脂质体的成型、稳定性及基因表达效率，叶酸修饰脂质体的叶酸修饰脂质用量最终确定为：叶酸占总脂质摩尔数的0.01～5％，优选为0.05～2.5％。
试验例4F-P-LP/VEGFR2/Tie2对SKOV3腹腔转移瘤的治疗及新生血管抑制作用研究
4～6周龄Balb/C雌性裸鼠腹腔接种约3×106个SKOV-3细胞/只，接种后随机分为7组(每组5只)，7天后给药，具体分组为：对照组(GS)、非叶酸修饰的空白脂质体组(P-LP)、叶酸修饰的空白脂质体组(F-LP)、非叶酸修饰的空质粒组(P-LP/P)、叶酸修饰的空质粒组(F-LP/P)、非叶酸修饰的VEGFR2/Tie2双基因组合物(P-LP/V-T)和叶酸修饰的VEGFR2/Tie2双基因组合物(F-LP/V-T)。每3天给药1次，治疗10次后，处死裸鼠，取出裸鼠的肿瘤组织，计数每只裸鼠腹腔内肿瘤结节数并测量肿瘤结节重量；测量完毕后肿瘤组织用4％多聚甲醛固定(≥48h)，固定好的组织用石蜡包埋，免疫组化检测肿瘤组织中CD31，比较各组间肿瘤微血管密度(MVD)。结果见图1和图2。图1结果显示，与对照组和其它试验组相比，叶酸修饰的VEGFR2/Tie2双基因组合物(F-LP/V-T)能够显著减少腹腔肿瘤结节数目(图1A)，降低腹腔肿瘤重量(图1B)，表明叶酸修饰的VEGFR2/Tie2双基因组合物具有显著抑制肿瘤生长的作用，且具有明显的抗肿瘤效果。图2结果显示，与对照组和其它试验组相比，叶酸修饰的VEGFR2/Tie2双基因组合物(F-LP/V-T)能够显著降低肿瘤组织中CD31表达，表明叶酸修饰的VEGFR2/Tie2双基因组合物具有显著抗肿瘤血管生成的作用。

Claims (8)

1.一种叶酸修饰的VEGFR2/Tie2双基因组合物，其特征在于：含有VEGFR2/Tie2质粒和叶酸修饰脂质体。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述的VEGFR2/Tie2质粒与叶酸修饰脂质体的质量比为1:1~1:20。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于所述的VEGFR2/Tie2质粒与叶酸修饰脂质体的质量比为1:2~1:15。
4.根据权利要求1～3所述的药物组合物，其特征在于所述叶酸修饰脂质体，含有脂质材料和叶酸修饰脂质。
5.根据权利要求4所述的叶酸修饰脂质，叶酸占总脂质摩尔数的0.01～5%，优选为0.05～2.5%。
6.根据权利要求4所述的叶酸修饰脂质，由叶酸与脂质材料偶联形成。
7.根据权利要求4所述的脂质材料，包括磷脂及其衍生物或胆固醇及其衍生物中的一种或多种。
8.权利要求1~3任一项所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
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