CN109876156A - 叶酸修饰的脂质体复合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及叶酸修饰的脂质体复合物及其制备方法和用途，属于医药领域。本发明提供了叶酸修饰的脂质体复合物，它是由如下重量配比的原料制备而成的：装载有BIM‑S基因的重组表达载体1份、叶酸修饰的脂质体5份以上，其中，所述叶酸修饰的脂质体是包含(2,3‑二油酰基‑丙基)‑三甲胺、胆固醇、聚乙二醇‑丁二酰‑胆固醇和叶酸‑聚乙二醇‑丁二酰‑胆固醇的原料制备而成的。本发明还提供了所述脂质体复合物的制备方法和用途。本发明提供的叶酸修饰的脂质体复合物不仅可以杀死肺癌细胞，还可以通过靶向TAM来影响肿瘤微环境，为临床治疗肺癌提供了新的用药选择。

Description

叶酸修饰的脂质体复合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及叶酸修饰的脂质体复合物及其制备方法和用途，属于医药领域。

背景技术

肺癌是最常诊断的癌症，并且是全球癌症死亡的主要原因。根据全球癌症统计数据，每年约有180万新发肺癌病例。5年生存率在男性肺癌患者为6％至14％，在女性患者为7％至18％。肺癌的分子靶向治疗在过去几年中一直是一个重要的研究领域。最广泛研究的靶向治疗类型包括阻断过度表达的基因、增加肿瘤抑制基因的激活、靶向肿瘤细胞抗原、诱导针对肿瘤细胞抗原的免疫、抑制或改变控制肿瘤细胞生长和存活的信号。目前大多数靶向癌症治疗都集中于杀死肿瘤细胞，但肿瘤微环境的免疫抑制作用是不可忽视的。

肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAM)是局部肿瘤巨噬细胞，占肿瘤微环境中免疫细胞的大部分。一旦TAM被单核细胞募集到肿瘤微环境中，它们就会极化成受各种因素影响的M1或M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞通过表达细胞因子如IL-1和IL-6而发挥抗肿瘤作用。M2型巨噬细胞促进肿瘤侵袭、转移和炎症反应。肿瘤微环境中的TAM倾向于M2表型。TAM不仅参与肿瘤侵袭、生长、血管生成、转移和免疫抑制，还参与新生血管形成和基质降解。针对TAM的治疗策略旨在减少其数量和改变TAM的功能。肺癌患者的预后也与TAM密切相关。

因此，开发一种能够靶向肺癌相关巨噬细胞的药物，对于肺癌的治疗具有重要意义。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供叶酸修饰的脂质体复合物。本发明的另一目的在于提供所述脂质体复合物的制备方法和用途。

本发明提供了叶酸修饰的脂质体复合物，它是由如下重量配比的原料制备而成的：装载有BIM-S基因的重组表达载体1份、叶酸修饰的脂质体5份以上，其中，所述叶酸修饰的脂质体是包含(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺、胆固醇、聚乙二醇-丁二酰-胆固醇和叶酸-聚乙二醇-丁二酰-胆固醇的原料制备而成的。

所述装载有BIM-S基因的重组表达载体是可以表达BIM-S的载体。

进一步地，所述的脂质体复合物是由如下重量配比的原料制备而成的：装载有BIM-S基因的重组表达载体1份、叶酸修饰的脂质体6份以上。

优选地，所述的脂质体复合物是由如下重量配比的原料制备而成的：装载有BIM-S基因的重组表达载体1份、叶酸修饰的脂质体6份。

进一步地，所述叶酸修饰的脂质体是包含如下摩尔配比的原料制备而成的：(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺40～60份、胆固醇36～54份、聚乙二醇-丁二酰-胆固醇3.8～5.7份、叶酸-聚乙二醇-丁二酰-胆固醇0.2～0.3份。

优选地，所述叶酸修饰的脂质体是包含如下摩尔配比的原料制备而成的：(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺50份、胆固醇45份、聚乙二醇-丁二酰-胆固醇4.75份、叶酸-聚乙二醇-丁二酰-胆固醇0.25份。

进一步地，所述叶酸修饰的脂质体由薄膜水化法制备得到。

优选地，所述叶酸修饰的脂质体的制备方法为：取各摩尔配比的原料，溶解于氯仿中，然后除去氯仿，水化脱膜，将所得混悬液超声处理，过滤，即得。

优选地，所述水化脱膜采用葡萄糖溶液。

进一步地，所述装载有BIM-S基因的重组表达载体为质粒载体。

优选地，所述质粒载体为pVAX质粒载体。

本发明提供了所述脂质体复合物的制备方法：取各重量配比的原料，混合，即得。

优选地，混合30分钟以上。

本发明提供了所述脂质体复合物在制备防治肺癌的药物中的用途。

进一步地，所述药物是靶向肺癌细胞和/或肺癌相关巨噬细胞的药物。

本发明提供了防治肺癌的药物组合物，它是以所述的脂质体复合物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分，制备而成的制剂。

进一步地，所述的制剂为口服制剂或注射制剂。

本发明提供了叶酸修饰的脂质体复合物。体外实验表明，用F-PLP/pBIM体外转染LL/2细胞和MH-S细胞后能明显诱导细胞凋亡。在体内研究中，用F-PLP/pBIM治疗荷瘤小鼠，其通过促进肿瘤细胞和TAM凋亡，减少肿瘤增殖和抑制肿瘤血管生成，显著抑制体内肿瘤生长。此外，在F-PLP/pBIM处理组，FRβ阳性的M2型巨噬细胞在肿瘤微环境中明显减少。F-PLP/pBIM组FR表达和相关细胞因子水平也明显降低。最后，安全性评估证明F-PLP/pBIM作为静脉给药方式的基因治疗具有良好的安全性。

综上所述，本发明提供的叶酸修饰的脂质体复合物不仅可以杀死肺癌细胞，还可以通过靶向TAM来影响肿瘤微环境，为临床治疗肺癌提供了新的用药选择。

附图说明

图1为实施例2中凝胶电泳结果图；

图2为实施例3中LL/2细胞系的Hoechst染色和流式细胞术分析图；

图3为实施例3中MH-S细胞系的流式细胞术分析图；

图4为实施例3中支气管肺泡灌洗巨噬细胞的BIM表达图；

图5为实施例4中F-PLP/pBIM对血管生成、细胞凋亡和细胞增殖的影响结果图；

图6为实施例4小鼠肺组织中FRβ阳性的M2型巨噬细胞数量检测结果图；

图7为实施例4中F-PLP/pBIM体内治疗LL/2小鼠的效果图；

图8为实施例5中小鼠重要器官切片的HE染色图；

图9为实施例5中小鼠血常规分析结果图；

图10为实施例5中小鼠血液生化分析结果图；

图11为实施例5中AnnexinV和PI染色流式细胞术分析结果图；

图12为实施例5中细胞mtDNA释放量检测结果图。

具体实施方式

本发明提供了叶酸修饰的脂质体复合物，它是由如下重量配比的原料制备而成的：装载有BIM-S基因的重组表达载体1份、叶酸修饰的脂质体5份以上，其中，所述叶酸修饰的脂质体是包含(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺、胆固醇、聚乙二醇-丁二酰-胆固醇和叶酸-聚乙二醇-丁二酰-胆固醇的原料制备而成的。

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：叶酸受体(FR)家族由四个成员组成，包括FRα(或FOLR1)，FRβ(或FOLR2)，FRγ(或FOLR3)和FRδ(或FOLR4)。本发明首先通过组织芯片免疫组织化学分析验证了肺癌细胞中FRα过表达以及TAM中FRβ过表达。并且FR高表达与肺癌预后差明显相关。基于此，本发明合成了叶酸修饰的脂质体复合物，即包含叶酸修饰的脂质体(F-PLP)和促进细胞凋亡的BIM-S，其毒性较普通阳离子脂质体明显更低，并且可作为基因载体特异性地将BIM-S递送至肺癌细胞和肺癌相关巨噬细胞，以实现肺癌的有效治疗。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

以下实验采用的统计分析方法为：使用SPSS统计软件(SPSS V19.0，IBM Corp.，NewYork，USA)中的单向ANOVA和Student's t-检验进行统计分析。P值<0.05被认为具有统计学意义。使用Kaplan-Meier曲线和对数秩检验分析存活率。

实施例1组织微阵列分析

1、实验方法

在数据提取和组织微阵列(tissue microarray，TMA)构建之前，从上海芯超生物科技有限公司伦理委员会获得了该研究的批准。在本实验研究中，选择了在2004年至2009年间被诊断患有原发性肺鳞癌和肺腺癌的184名患者。从手术病理和医疗记录中提取临床和病理数据。组织学名称遵循世界卫生组织的分类，分级和分期基于美国癌症联合委员会(AJCC)第8版。

来自184个被病理学证实的肺癌患者的原发性肿瘤用福尔马林固定后进行石蜡包埋，用于排列。首先将组织芯片放入烘箱中，温度调至63度，烘蜡一小时。在用二甲苯进行脱蜡，梯度酒精脱水。使用柠檬酸(PH＝6.0)高压修复5min或EDTA(PH＝9.0)热修复20min。用内源性过氧化物酶阻断剂(H₂O₂)阻断后血清封闭。将FRα的一抗(Cat#ab67422，Abcam，Cambridge，MA，USA)和FRβ一抗(SAB1307181，Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO，USA)以1：100和1：50稀释。滴加一抗后4℃过夜。再滴加酶标记的二抗，室温孵育30分钟。滴加显色剂DAB显色5分钟后自来水充分冲洗15分钟。苏木素复染2分钟，后在0.25％的盐酸酒精中浸没2秒，用自来水冲洗2分钟。最后脱水、封片。使用ImageScope软件接口的摄像机捕获并存储每个核心的数字图像。

FRα表达由两位观察者独立评分，而不知道临床结果数据。评分考虑了染色强度和染色阳性率。评分分为阴性(0)，弱(1+)，中(2+)和强(3+)。统计学分析用于评估FRα染色强度和临床病理学特征以及与预后的差异。通过将阴性和弱染色组合成单独一组，并将中等和强染色组合成单独一组，将FRα染色强度转换成二分变量。然后将已知的临床和病理变量与FRα染色强度进行比较，并使用Pearson's Chi平方检验评估变量之间的关联以进行单变量分析。通过单变量分析显著的变量被引入多变量逻辑回归模型。通过Kaplan和Meier的方法评估FRα表达，无疾病和疾病特异性存活之间的关联，并通过对数秩检验确定统计学差异。p值小于0.05被认为有显著差异。

2、结果

本实验使用组织芯片技术分析了FRα和FRβ在肺癌细胞和巨噬细胞中的表达情况。由两名研究者分别评价。根据染色阳性率和染色强度分别评分。一个染色点随机选择三个高倍镜视野，根据Image J软件行染色阳性率评分，染色阳性率<5％评价为0分，5％-25％为1分，25％-75％为2分，75％以上为3分。根据染色点的染色强度评分，阴性为0分，淡黄为1分，棕黄为2分，棕褐为3分。按照染色强度和阳性细胞数的两者之和分为：0-3分为阴性；＞3分为阳性。

结果观察到FRα在人肺腺癌细胞、鳞状细胞癌细胞中过表达，FRβ在这些肺癌亚型的巨噬细胞中高表达。肺腺癌FRα和FRβ的表达率分别为52.2％和92.4％，肺鳞癌FRα和FRβ的表达率分别为37.8％和97.8％。肺鳞癌和肺腺癌患者的基线特征无明显差异。FRα和FRβ低表达患者的生存期较高表达患者生存期显著延长(P<0.05)。

实施例2叶酸脂质体和脂质体复合物的制备及表征

本实验利用薄膜水合方法制备脂质体(PLP)和叶酸修饰的脂质体(F-PLP)，并与BIM-S基因复合以形成叶酸修饰的脂质体复合物(F-PLP/pBIM)。测量F-PLP/pBIM的物理化学性质，特别是粒径和zeta电位。

1、材料

1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(氯化物盐)(DOTAP)和胆固醇(Chol)分别购自Avanti Polar Lipids，Inc.(Alabaster，AL，USA)和Shanghai Bio Life Science&Technology Co.，Ltd.(中国上海)。合成并纯化了mPEG-琥珀酰胆固醇结合物(mPEG-suc-Chol)和叶酸-PEG-琥珀酰胆固醇结合物(F-PEG-suc-Chol)(见本实验制备方法部分)。BIM-S质粒以pVAX为载体，可操作地插入BIM-S编码核苷酸构建得到。本实施例中使用的pVAX质粒载体具体为pVAX1，选择的插入位点是NheI/XhoI，序列订购于Origene，货号为：MC208191，NCBI Reference Sequence:NM_009754.3。BIM-S的编码核苷酸序列为(SEQ IDNo.8)：

ATGGCCAAGCAACCTTCTGATGTAAGTTCTGAGTGTGACAGAGAAGGTGGACAATTGCAGCCTGCTGAGAGGCCTCCCCAGCTCAGGCCTGGGGCCCCTACCTCCCTACAGACAGAACCGCAAGCTTCCATACGACAGTCTCAGGAGGAACCTGAAGATCTGCGCCCGGAGATACGGATTGCACAGGAGCTGCGGCGGATCGGAGACGAGTTCAACGAAACTTACACAAGGAGGGTGTTTGCAAATGATTACCGCGAGGCTGAAGACCACCCTCAAATGGTTATCTTACAACTGTTACGCTTTATCTTCCGTCTGGTATGGAGAAGGCATTGA。

使用pVAX载体和5％葡萄糖注射液作为阴性对照。使用eGFP(增强型绿色荧光蛋白)质粒进行体外转染，用于荧光成像和流式细胞术分析。根据EndoFree PlasmidPurificationKit(Qiagen，Hilden，Germany)的说明扩增BIM质粒和pVAX载体。GeneRulerDNA梯形混合物和DNA梯形染料购自Fermentas(Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA，USA)。注射用葡萄糖(5％)购自四川科伦药业有限公司(四川成都)。Triton X-100购自Sanland Chemical Co.，Ltd.(CA，USA)。

2、制备方法

(1)制备suc-Chol：将胆固醇(Chol)、丁二酸酐(suc)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于150ml二氯甲烷中，5-15℃搅拌反应约72-96h。反应液浓缩后用乙酸洗涤、抽滤得到白色固体，并干燥至无乙酸臭味。得白色粉末状固体(丁二酰胆固醇半酯，suc-Chol)。产物室温条件下于干燥器中避光保存备用。

(2)制备H2N-PEG-suc-Chol：将suc-Chol、EDCI和NHS溶于少量二氯甲烷中，滴加至含H2N-PEG-NH2的二氯甲烷溶液中，室温(10-25℃)搅拌反应约72-96h。反应液用60-80目硅胶拌样，300-400目硅胶湿法装柱，干法上样。二氯甲烷:甲醇系统(100:1-20:1，v/v)洗脱，收集含有目标产物的洗脱液，合并浓缩除去有机溶剂，得淡黄色固体(氨基聚乙二醇-丁二酰-胆固醇，H2N-PEG-suc-Chol)。产物室温条件下于干燥器中避光保存备用。

(3)制备F-PEG-suc-Chol：将叶酸(Folic acid)、NHS、EDCI和三乙胺(Triethylamine，TEA)溶于无水二甲亚砜(DMSO)中，边搅拌边滴加含H2N-PEG-suc-Chol的无水DMSO溶液。避光反应约120-144h后，将反应液转入透析袋(MWCO＝1000Da)，分别以20％(v/v)DMSO和水为透析介质，透析7天后，转移透析样品至丝口瓶中，预冻至-20℃，于冻干机中冻干，压力<10pa，温度<-40℃，冻干时间在48h以上，再在室温条件下真空干燥24h以上。得淡黄色蓬松纤维状固体(叶酸-聚乙二醇-丁二酰-胆固醇，F-PEG-suc-Chol)。产物室温条件下于干燥器中避光保存备用。

(4)制备普通阳离子脂质体(LP)：取(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP)和胆固醇(Chol)(摩尔比％，50:50)溶于氯仿，37℃减压除去氯仿，然后于高真空条件下除尽氯仿，葡萄糖溶液水化脱膜。所得混悬液水浴超声2min(超声总持续时间1min，间歇总持续时间1min)，微孔滤膜过滤，4℃保存备用。

(5)制备无靶向阳离子脂质体mPEG-LPs(PLP)：取DOTAP、Chol和mPEG-suc-Chol(摩尔比％，50:45:5)溶于氯仿，37℃减压除去氯仿，然后于高真空条件下除尽氯仿，葡萄糖溶液水化脱膜。所得混悬液水浴超声2min(超声总持续时间1min，间歇总持续时间1min)，微孔滤膜过滤，4℃保存备用。

(6)制备叶酸修饰的脂质体(F-PLP)：取DOTAP、Chol、mPEG-suc-Chol和F-PEG-suc-Chol(摩尔比％，50:45:4.75:0.25)溶于氯仿，37℃减压除去氯仿，然后于高真空条件下除尽氯仿，葡萄糖溶液水化脱膜。所得混悬液水浴超声2min(超声总持续时间1min，间歇总持续时间1min)，微孔滤膜过滤，4℃保存备用。

(7)制备叶酸修饰的脂质体复合物：将F-PLP与pBIM或pVAX在室温下混合30分钟，通过静电相互作用制备成F-PLP/pBIM或F-PLP/pVAX。

3、表征方法

制备叶酸修饰的脂质体复合物后，在pH7.4的TAE缓冲液(40mM Tris/HCl，1％乙酸，1mM EDTA)中进行1％(w/v)琼脂糖凝胶(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA，USA)电泳。将核酸GoldView染色后，在室温下以120V的恒定电压跑电泳25分钟，以确定F-PLP和pBIM之间的最佳比例。用凝胶记录系统(Gel Doc1000，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)对电泳凝胶进行可视化和数字拍照。

使用ZetasizerNano ZS ZEN3600(Malvern Instruments，Ltd.，Worcestershire，UK)测定脂质体和脂质体复合物的粒径和电位。所有结果均为三次试运行的平均值。

4、结果

凝胶电泳结果见图1，凝胶中第1列为DNAmarker，第2-6列分别为BIM-S质粒和叶酸脂质体比为1:1，1:2.5；1:5，1:6，1:10的混合物。从图1可以看出，BIM质粒与F-PLP的最佳混合比例为BIM质粒：F-PLP质量比＝1：6，此时F-PLP刚好可以完全包裹BIM质粒，无质粒外溢。F-PLP和PLP的尺寸均约为100nm。通过静电相互作用混合F-PLP和BIM或pVAX质粒制备的F-PLP/pBIM和F-PLP/pVAX，其粒径均约为160nm，粒径大于F-PLP和PLP。所有脂质体复合物(F-PLP/pBIM，F-PLP/pVAX，PLP/pBIM和PLP/pVAX)的zeta电位值均低于相应单独脂质体(F-PLP或PLP)。脂质体复合物zeta电位值为10-17mV，单独脂质体为33-39mV。

实施例3体外转染实验

1、细胞培养

LL/2细胞和MH-S细胞源于四川大学华西医院生物治疗与癌症中心国家重点实验室(四川成都)。分别将细胞与不含叶酸的补充有阿米卡星和10％胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)和RPMI1640培养基一起在37℃和5％CO₂的培养箱中培养。

2、实验方法

在6孔板中将含有4μg eGFP质粒的F-PLP/eGFP复合物用于转染LL/2细胞和MH-S细胞48小时。用Hoechst33342染色转染的细胞，并使用ArrayScanVTI HCS Reader(Waltham，MA，USA)拍照。使用FACS Calibur流式细胞仪(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)来确定转染效率。

在6孔板中用F-PLP/pBIM，PLP/pBIM，F-PLP/pVAX或PLP/pVAX和5％葡萄糖溶液转染LL/2和MH-S细胞约24小时后，进行实时定量RT-PCR检测BIM基因表达。转染两种细胞系后约48小时，提取总蛋白质用于BIM表达的蛋白质印迹分析。转染后约48小时，收集细胞用于流式细胞术分析以检测坏死细胞。

流式细胞术分析：收集细胞和上清液，用PBS洗涤两次，再将细胞转移到含有100μL1X结合缓冲液的染色溶液中，并在检测前用5μL PI和5μL AnnexinV(FITCAnnexin VApoptosis Detection Kit I，Cat#556547，BD Biosciences，USA)在室温下孵育15分钟。

3、结果

3.1 F-PLP/pBIM在体外LL/2细胞系中的基因表达和生物学活性

实验结果见图2。LL/2细胞系表达FRα的表达率约为43％。通过流式细胞术分析和显微镜观察评估，LL/2细胞中F-PLP的转染效率约为40％，这表明F-PLP可以通过叶酸和叶酸受体之间的相互作用浓缩质粒DNA并有效转染LL/2细胞。qRT-PCR和蛋白质印迹分析证明，在F-PLP/pBIM组细胞中BIM-S的mRNA和蛋白质表达水平明显高于其他组细胞。此外，Hoechst染色显示F-PLP/pBIM转染的LL/2细胞相比于5％葡萄糖溶液对照组，PLP/pVAX，F-PLP/pVAX或PLP/pBIM组转染细胞有更多的细胞凋亡。此外，细胞凋亡流式分析显示F-PLP/pBIM转染能够在早期和晚期增加凋亡细胞的数量。以上实验结果表明，F-PLP在体外成功转染到LL/2细胞中，并且F-PLP/pBIM有助于提高BIM-S的生物活性。

3.2 F-PLP/pBIM在体外巨噬细胞中的基因表达和生物学活性

为了研究F-PLP/pBIM在巨噬细胞中的抗肿瘤活性，本实验选择了MH-S细胞系，它是肺泡巨噬细胞系。实验结果见图3。

MH-S细胞系表达FRβ的表达率约为60％。F-PLP可以通过叶酸和叶酸受体之间的相互作用来浓缩质粒DNA并有效转染MH-S细胞。与LL/2细胞系研究结果类似，qRT-PCR和蛋白质印迹分析表明，F-PLP/pBIM组细胞中BIM-S的mRNA和蛋白质表达水平明显高于其他组。此外，细胞凋亡流式分析结果也显示F-PLP/pBIM转染能够在早期和晚期增加凋亡细胞数量。

本实验还在体外建立了支气管肺泡灌洗巨噬细胞的原代巨噬细胞模型。在支气管肺泡灌洗巨噬细胞中，97％为F4/80阳性的细胞。支气管肺泡灌洗巨噬细胞的FRβ表达率约为36％。从图4可以看出，对于mRNA和蛋白质水平，F-PLP/pBIM处理组中的BIM表达也明显高于其他组(图4A为RT-PCR结果图，图4B为WesternBlot结果图)。

实施例4小鼠肺癌体内模型

1、实验动物

在特定的无病原体(specific pathogen-free,SPF)条件下，从Vital River Co.(中国北京)购买雌性6至8周龄的C57 BL/6小鼠。所有小鼠均于SPF条件下在四川大学国家重点实验室的标准设施中培养。所有方案均经生物治疗动物护理和使用委员会国家重点实验室(四川大学，成都，中国)批准。

2、实验方法

通过静脉内注射LL/2细胞(约5×10⁵个细胞/0.1mL无血清无抗生素DMEM)建立体内模型。根据体重将小鼠随机分成5组(F-PLP/pBIM，PLP/pBIM，F-PLP/pVAX，PLP/pVAX和5％葡萄糖溶液组)。接种后72小时进行干预。通过静脉内给药治疗小鼠。每两天用脂质体(30μg)和质粒DNA(5μg)形成复合物溶于200μL5％葡萄糖中经小鼠尾静脉注射一次。每天监测小鼠的生活条件，每两天称重一次，并在其中有小鼠出现垂死时处死。然后，获取小鼠全血、肺、其他重要器官和肿瘤组织，记录肺重量和肿瘤结节数。获得全血和血清用于检测血常规和血生化使用。将肿瘤组织分成五个部分：两个立即在液氮中冷冻用于实时定量RT-PCR和Western Blot分析，一个立即包埋在OCT胶中用于冷冻切片，一个用4％多聚甲醛固定用于后续石蜡包埋切片，最后一个新鲜肿瘤组织剪碎消化后用于流式细胞术分析。其他重要器官(心脏，肝脏，脾脏和肾脏)于4％多聚甲醛固定后石蜡包埋切片染色用于分析组织毒性。动物尸体由专业机构(达硕生物技术有限公司，中国成都)处理。

2.1实时定量聚合酶链式反应(Real-Time Quantitative Polymerase ChainReaction,qRT-PCR)

根据总RNA提取试剂盒使用指南(TIANGEN，Cat#DP419，Lot#N3103，中国)分离提取总RNA，并用Nano Drop2000UV-Vis分光光度计(Waltham，MA，USA)定量。使用具有gDNAEraser的Prime Script^TM逆转录试剂盒(TaKaRa，Cat#RR047A，Lot#AK2701，Japan)逆转录总RNA(每组1μg)。GAPDH用作内部对照。引物设计如下：BIM-前引物：5'-CGCCGAATTCATGGCCAAGCAACCTTCTGA-3'(SEQ ID No.1)，BIM-后引物：5'-ACGCCTCGAGTCAATGCCTTCTCCATACCA-3'(SEQ ID No.2)，GAPDH-前引物：5'-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3'(SEQ ID No.3)和GAPDH-后引物：5'-ACACATTGGGGGTAGGAACA-3'(SEQ ID No.4)。使用Bio-Rad CFX96(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)进行定量实时PCR。所有实验进行三次。

2.2蛋白印迹分析(WesternBlot)

用含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂解液(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)裂解细胞和组织。使用Bradford蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)测量总蛋白质浓度。加载等量的蛋白质和标记物，并通过12.5％SDS-PAGE胶分离，然后转移到Millipore聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5％脱脂牛奶封闭膜，并与BIM的一抗(Cat#2819，Cell Signaling Technology，Inc.，MA，USA)在4℃下孵育过夜。再用二抗在37℃温育1小时后，用ChemiScope 5600(Clinx Science Instruments，China)曝光膜。β-Actin(SantaCruz Biotechnology，Inc.，CA，USA)用作内部对照。

2.3流式细胞术分析

将来自对照(5％葡萄糖注射液)，PLP/pVAX，F-PLP/pVAX，PLP/pBIM和F-PLP/pBIM5组的肿瘤组织样品消化成单细胞悬浮液，并用CD45、F4/80、CD206、CD11c、FRβ、TGFβ、IL-10、IL-4、VEGF抗体或相应的同型抗体于4℃孵育30分钟进行染色标记。所有抗体购自BDPharmingen TM(Franklin Lakes，NJ，USA)或BioLegend，Inc.(San Diego，CA，USA)。流式细胞术分析在FACS Calibur流式细胞仪(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)上进行，并使用NovoExpress软件分析数据。

2.4免疫组织化学、免疫荧光、TUNEL测定和HE染色

将小鼠肿瘤组织在4％多聚甲醛中固定48小时，然后行石蜡包埋切片。将组织芯片放入烘箱中，温度调至63度，烘片一小时。用二甲苯进行脱蜡，梯度酒精脱水。使用柠檬酸(PH＝6.0)高压修复5min或EDTA(PH＝9.0)热修复20min。用内源性过氧化物酶阻断剂(H₂O₂)阻断后血清封闭。将Ki67的一抗(Cat#ab16667Abcam PLC，Boston，MA，USA)以1：100稀释。滴加一抗后4℃过夜。再滴加酶标记的二抗，室温孵育30分钟。滴加显色剂DAB显色5分钟后自来水充分冲洗15分钟。苏木素复染2分钟，后在0.25％的盐酸酒精中浸没2秒，用自来水冲洗2分钟。最后脱水、封片。

将新鲜小鼠肿瘤组织冷冻切片进行微血管密度(microvessel density，MVD)的免疫荧光分析。将从小鼠获得的新鲜组织立即包埋在OCT胶中。切片后放在冷丙酮中固定20分钟，用内源性过氧化物酶阻断剂(H₂O₂)阻断后血清封闭。将CD31的一抗(Cat#ab28364，AbcamPLC，Boston，MA，USA)以1:50稀释。于4℃孵育过夜。PE标记的二抗由Abcam提供。将阴性对照切片单独暴露于二抗。于37℃孵育30分钟。用防粹灭的封片剂封片后隔夜观察。

为了检测肿瘤组织中的凋亡细胞，根据制造商的说明，用TUNEL试剂盒(Promega，Madison，WI，USA)通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)对冷冻切片进行染色。

在荧光显微镜(Leica Microsystems CMS GmbH，Wetzlar，Germany)下观察切片并行数字照相。对于每张切片，检查并计数200×放大倍数的五个随机区域，对CD31和Ki67阳性和TUNEL阳性细胞进行定量。同时行苏木精和伊红(HE)染色，用于切片的形态学分析。所有切片均由两名研究者观察记录。

为检测体内治疗后巨噬细胞凋亡的情况，对肿瘤切片进行免疫荧光共聚焦分析。用F4/80抗体(1：100，Cat#70076，Cell Signaling Technology，Inc.，MA，USA)和cleavedcaspase3抗体(1：100，Cat#9662，Cell Signaling Technology，Inc.，MA，USA)共同孵育后，在ZEISS共聚焦显微镜下观察切片。

3、结果

3.1小鼠整体情况

从图5可以看出，对照组(5％葡萄糖组)，PLP/pVAX组，F-PLP/pVAX组，PLP/pBIM组和F-PLP/pBIM组的小鼠体重增长曲线无明显差异。

经小鼠尾静脉注射脂质体复合物PLP/pBIM和F-PLP/pBIM可导致小鼠肺肿瘤生长减少，以肺重和肿瘤结节总数为代表，均少于对照组(分别为P<0.01和P<0.001))。在PLP/pBIM处理组和F-PLP/pBIM处理组之间也观察到明显差异(P<0.05)。以上实验结果表明，PLP/pBIM和F-PLP/pBIM基因疗法均具有有效的抗肿瘤活性，并且F-PLP/pBIM治疗显示出更有效的抗肿瘤效果。

此外，小鼠的生存曲线表明，PLP/pBIM和F-PLP/pBIM组小鼠的存活时间比对照组小鼠延长，且F-PLP/pBIM组的存活时间长于PLP/pBIM组。

3.2 F-PLP/pBIM对血管生成、细胞凋亡和细胞增殖的影响

F-PLP/pBIM通过载体靶向显示出相当大的抗肿瘤作用，然而抗肿瘤机制还需要进一步研究。因此，本实验研究了各组肺癌细胞血管生成(CD31)，细胞增殖(Ki67)和细胞凋亡(TUNEL)的变化，初步探讨了F-PLP/pBIM的抗肿瘤机制。实验结果见图6。

首先，为了研究F-PLP/pBIM对血管生成的影响，通过免疫荧光染色检测新生血管CD31表达量。结果显示，F-PLP/pBIM组中的新生血管生成明显少于其他组中的血管生成。F-PLP/pBIM组肿瘤组织的CD31阳性血管数量明显减少，微血管密度(MVD)降低，显著低于PLP/pBIM组(P<0.01)和对照组(P<0.001)。

然后，进一步行Ki67免疫组织化学染色，用于评估肿瘤细胞增殖情况。结果显示，F-PLP/pBIM组中的肿瘤细胞增殖显著低于其他组中的肿瘤细胞增殖。在F-PLP/pBIM组中显微镜观察的Ki67阳性细胞数量明显少于PLP/pBIM组(P<0.05)和对照组(P<0.001)。

然后，利用TUNEL试剂盒染色方法研究肿瘤细胞凋亡情况。计数TUNEL阳性细胞，发现在用F-PLP/pBIM处理的肿瘤组织中可观察到许多被鉴定为凋亡的强阳性细胞核，但这种细胞核在PLP/pBIM组和其他组细胞核中较少见。F-PLP/pBIM组中的肿瘤细胞凋亡数量明显多于PLP/pBIM组(P<0.05)和对照组(P<0.001)组。

然后，进行了各组肿瘤组织的苏木精-伊红染色，用于观察每组肿瘤组织的一般形态。结果F-PLP/pBIM组的肿瘤结节远小于其他组的肿瘤结节，并且淋巴细胞浸润也较少。

最后，为了研究治疗后各组肿瘤组织中巨噬细胞的凋亡情况，进行了F4/80和cleaved caspase3免疫荧光共同染色。观察记录了肿瘤组织的共聚焦显微照片。发现F-PLP/pBIM处理组肿瘤组织中的巨噬细胞凋亡明显高于其他组。

3.3 F-PLP/pBIM治疗后小鼠体内M2型巨噬细胞变化

从图7可以看出，通过流式分析，发现经小鼠尾静脉注射LL/2细胞后，小鼠肺组织中M2型巨噬细胞(CD45+F4/80+CD206+)的数量显着增加。但与对照组相比，F-PLP/pBIM处理后小鼠肺组织中M2型巨噬细胞数量明显减少(P<0.01)。F-PLP/pBIM组中FRβ阳性的巨噬细胞数量也明显低于对照组(P<0.01)和PLP/pBIM组(P<0.05)。

实施例5 F-PLP和LP的毒性实验

1、实验方法

将实施例4中治疗后小鼠的重要器官(心脏、肝脏、脾脏和肾脏)切片，用苏木精和伊红染色，并由两名研究者分开观察评价。使用全自动血液分析仪(CelltacAlphaMEK-6318K，Nihon Kohden Corp.，Shinjuku-ku，Tokyo，Japan)将全血用于血常规检查。通过离心获得的血清用全自动分析仪(Hitachi High-Technologies Corp.，Minato-ku，Tokyo，Japan)进行血生化分析。

为了研究F-PLP和传统阳离子脂质体LP的毒性，本实验将F-PLP和LP经尾静脉注射到C57 BL/6雌性小鼠。两小时后，将100μL碘化丙啶(PI，1mg/mL，Sigma-Aldrich，USA)经尾静脉注射给小鼠。注射PI5分钟后再将4％多聚甲醛经小鼠尾静脉注射。分离取出小鼠肺组织，行冷冻切片(4μm)于荧光显微镜下直接观察，并在高倍视野中计数阳性细胞，以检测坏死细胞数量。用酯酶染色试剂盒(Sigma-Aldrich，USA)行中性粒细胞酯酶染色，并按照制造商的说明书进行操作。使用DNA提取试剂盒(Qiagen Germany)浓缩并纯化原代肺上皮细胞培养上清液中的mtDNA。TaqMan探针用于定量mtDNA。本研究中使用的PCR引物和探针是根据GenBank核苷酸序列(J01420，Mus musculus线粒体基因组，位置2891-3173)设计的，并包括前引物：5'-ACCTACCCTATCACTCACACTAGCA-3'(SEQ ID No.5)；后引物：5'-GAGGCTCATCCTGATCATAGAATG-3'(SEQ ID No.6)；以及FAM标记的探针：5'-ATGAGTTCCCCTACCAATACCACACCC-3'(SEQ ID No.7)。所有这些引物均由Invitrogen合成。通过插入目标PCR产物(J01420，位置2891-3173)建立质粒DNA的连续稀释来创建标准曲线。

发明人前期的研究表明阳离子脂质体诱导的坏死细胞可能导致mtDNA释放并引起随后的炎症反应。因此，为了检查F-PLP的潜在毒性，本实验使用常见的阳离子脂质体基因递送系统作为阳性对照。收集了原代肺上皮细胞，用F-PLP或LP处理4小时，收集上清液提取mtDNA。

2、结果

将实施例4中治疗后各组小鼠的重要器官(心脏、肝脏、脾脏和肾脏)置于4％多聚甲醛中浸泡48小时，石蜡包埋切片后行HE染色用于组织病理学分析。实验结果见图8～10。各组重要器官HE染色未发现任何异常。此外，各组小鼠的外观、体重、粪便和尿液排泄，未发现异常。进行了血常规和血生化检测，各组之间未观察到丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、总胆红素、胆固醇、肌酐、尿素氮、白蛋白、肌酸激酶、血糖、血红蛋白浓度、白细胞数、红细胞数、血小板数量等指标的差异。

在小鼠体内，经小鼠尾静脉注射F-PLP和LP后4小时，再次经小鼠尾静脉注射PI染液，冰冻切片观察小鼠肺组织，发现F-PLP引起的肺部炎症明显比LP低。肺组织石蜡切片后行HE染色发现LP处理组小鼠肺部炎性细胞浸润明显较F-PLP处理组多。中性粒细胞酯酶染色发现，LP处理组小鼠肺组织中中性粒细胞明显多于F-PLP处理组。经小鼠尾静脉注射F-PLP和LP后，抽取支气管肺泡灌洗液，行AnnexinV和PI染色流式细胞术分析，观察细胞坏死情况，发现LP组中的坏死细胞多于F-PLP组(见图11)。

此外，显微镜观察证明LP迅速诱导原发性肺上皮细胞肿胀和破裂，而F-PLP则没有。流式分析显示F-PLP处理组的原代肺上皮细胞坏死比LP组少。LP处理后细胞mtDNA的释放明显多于F-PLP处理组(见图12)。

需要说明的是，本说明书中描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例以及不同实施例的特征进行结合和组合。

序列表

<110> 四川大学

<120> 叶酸修饰的脂质体复合物及其制备方法和用途

<130> A190162K

<141> 2019-03-27

<150> 201910230267.2

<151> 2019-03-21

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgccgaattc atggccaagc aaccttctga 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acacattggg ggtaggaaca 20

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<211> 25

<212> DNA

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<400> 5

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<210> 6

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggccaagc aaccttctga tgtaagttct gagtgtgaca gagaaggtgg acaattgcag 60

cctgctgaga ggcctcccca gctcaggcct ggggccccta cctccctaca gacagaaccg 120

caagcttcca tacgacagtc tcaggaggaa cctgaagatc tgcgcccgga gatacggatt 180

gcacaggagc tgcggcggat cggagacgag ttcaacgaaa cttacacaag gagggtgttt 240

gcaaatgatt accgcgaggc tgaagaccac cctcaaatgg ttatcttaca actgttacgc 300

tttatcttcc gtctggtatg gagaaggcat tga 333

Claims (10)

1.叶酸修饰的脂质体复合物，其特征是：它是由如下重量配比的原料制备而成的：装载有BIM-S基因的重组表达载体1份、叶酸修饰的脂质体5份以上，其中，所述叶酸修饰的脂质体是包含(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺、胆固醇、聚乙二醇-丁二酰-胆固醇和叶酸-聚乙二醇-丁二酰-胆固醇的原料制备而成的。

2.如权利要求1所述的脂质体复合物，其特征是：它是由如下重量配比的原料制备而成的：装载有BIM-S基因的重组表达载体1份、叶酸修饰的脂质体6份以上；优选地，它是由如下重量配比的原料制备而成的：装载有BIM-S基因的重组表达载体1份、叶酸修饰的脂质体6份。

3.如权利要求1或2所述的脂质体复合物，其特征是：所述叶酸修饰的脂质体是包含如下摩尔配比的原料制备而成的：(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺40～60份、胆固醇36～54份、聚乙二醇-丁二酰-胆固醇3.8～5.7份、叶酸-聚乙二醇-丁二酰-胆固醇0.2～0.3份；优选地，所述叶酸修饰的脂质体是包含如下摩尔配比的原料制备而成的：(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺50份、胆固醇45份、聚乙二醇-丁二酰-胆固醇4.75份、叶酸-聚乙二醇-丁二酰-胆固醇0.25份。

4.如权利要求1～3任意一项所述的脂质体复合物，其特征是：所述叶酸修饰的脂质体由薄膜水化法制备得到；优选地，所述叶酸修饰的脂质体的制备方法为：取各摩尔配比的原料，溶解于氯仿中，然后除去氯仿，水化脱膜，将所得混悬液超声处理，过滤，即得；优选地，所述水化脱膜采用葡萄糖溶液。

5.如权利要求1～4任意一项所述的脂质体复合物，其特征是：所述装载有BIM-S基因的重组表达载体为质粒载体；优选地，所述质粒载体为pVAX质粒载体。

6.权利要求1～5任意一项所述脂质体复合物的制备方法，其特征是：取各重量配比的原料，混合，即得；优选地，混合30分钟以上。

7.权利要求1～5任意一项所述脂质体复合物在制备防治肺癌的药物中的用途。

8.如权利要求7所述的用途，其特征是：所述药物是靶向肺癌细胞和/或肺癌相关巨噬细胞的药物。

9.防治肺癌的药物组合物，其特征是：它是以权利要求1～5任意一项所述的脂质体复合物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分，制备而成的制剂。

10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征是：所述的制剂为口服制剂或注射制剂。