CN115786513A - Itga8在拉帕替尼耐药的her2阳性胃癌诊断、治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了ITGA8在拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌诊断、治疗中的应用。本发明建立了拉帕替尼获得性耐药胃癌细胞株HGC‑27‑LR，并评估了HGC‑27‑LR与亲代细胞之间转录组的差异，发现ITGA8表达水平在HGC‑27‑LR细胞中明显上调；本发明同时发现抑制ITGA8的表达水平能够抑制帕替尼耐药的HER2阳性胃癌细胞增殖、迁移和侵袭、增加拉帕替尼的药物敏感性。

Description

ITGA8在拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌诊断、治疗中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及ITGA8在拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌诊断、治疗中的应用。

背景技术

胃癌中约有20％的HER2(ERBB2受体酪氨酸激酶2)基因扩增和HER2蛋白过表达。多种新型针对胃癌的HER2靶向药物正在开发中，例如小分子激酶抑制剂、单克隆抗体、抗体药物偶联物(ADC)和其他新型治疗药物。作为经典的HER2靶向激酶抑制剂之一，拉帕替尼具有口服给药和患者依从性良好的优势，目前处于临床试验阶段。此外，拉帕替尼是一种双重抑制剂，通过竞争性结合EGFR/HER2异二聚体的ATP结合位点阻断EGFR和HER2酪氨酸激酶活性，抑制细胞增殖。

尽管分子靶向治疗是提高部分患者总生存期(OS)的一种有效治疗方法，但耐药依旧影响患者的预后。目前，HER2阳性胃癌患者可能存在用拉帕替尼治疗无反应的现象，药物应答的患者存在继发性耐药的风险，这可能会使治疗效果减弱或消除。在靶向药物治疗的长期压力下，除了原本携带耐药突变的癌细胞发生扩增外，部分肿瘤细胞还会通过生存信号的切换获得适应性耐药能力。因此，为了了解生存信号通路转换对HER2阳性胃癌适应性耐药的重要性，需要寻找一种新的潜在策略来克服HER2阳性胃癌中发生的拉帕替尼耐药。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供开发HER2阳性胃癌新疗法的潜在靶点，有助于克服拉帕替尼治疗HER2阳性胃癌的获得性耐药。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种诊断拉帕替尼耐药的胃癌的产品，所述的产品包括检测样本中ITGA8的表达量所使用的试剂。

进一步，所述的产品包括芯片、试剂盒或核酸膜条。

进一步，所述的芯片包括固相载体、附着在固相载体上的特异性识别ITGA8的探针。

进一步，所述的试剂盒包括特异性识别ITGA8基因的寡核苷酸探针、特异性扩增ITGA8基因的引物或特异性结合ITGA8基因编码的蛋白的结合剂。

进一步，所述的引物的序列如SEQ ID NO.1-2所示。

进一步，所述的试剂盒包含容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

进一步，所述样本包括血液、组织液、脑脊液、尿液、泪液、唾液、汗液。

进一步，所述样本为血液。

进一步，所述胃癌为HER2阳性胃癌。

本发明的第二方面提供了检测ITGA8的表达量的试剂在制备诊断拉帕替尼耐药的胃癌的产品中的应用。

进一步，所述检测ITGA8表达量的试剂包括检测蛋白表达量和/或mRNA表达量的试剂。

进一步，所述检测ITGA8蛋白表达量的试剂是蛋白质印迹法中所使用的试剂，或者是以下方法中所使用试剂：酶联免疫吸附测定、放射性免疫测定、夹心测定、免疫组织化学染色、质谱检测法、免疫沉淀分析法、补体结合分析法、流式细胞荧光分析技术和蛋白质芯片法。

进一步，所述检测ITGA8 mRNA表达量的试剂是qRT-PCR中所使用的试剂，或者是以下方法中所使用的试剂：原位杂交、芯片、高通量测序平台。

进一步，所述胃癌为HER2阳性胃癌。

本发明的第三方面提供了一种治疗拉帕替尼耐药的胃癌的药物组合物，所述药物组合物包括抑制表达ITGA8或抑制ITGA8表达的生物材料。

进一步，所述生物材料包括核酸抑制物、蛋白抑制剂、蛋白水解酶、蛋白结合分子、表达盒、重组载体、细胞。

进一步，所述核酸抑制物包括shRNA、siRNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸。

进一步，所述核酸抑制物为shRNA、siRNA。

进一步，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.5-10所示。

进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

进一步，所述胃癌为HER2阳性胃癌。

本发明的第四方面提供了ITGA8在制备治疗拉帕替尼耐药的胃癌或增加拉帕替尼治疗胃癌敏感性的产品中的应用。

进一步，所述的产品包括抑制ITGA8的表达的试剂。

进一步，所述产品抑制拉帕替尼耐药的胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭、增加拉帕替尼药物敏感性。

进一步，所述胃癌为HER2阳性胃癌。

本发明的第五方面提供了一种筛选治疗拉帕替尼耐药的胃癌的候选药物的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将待测物质与含有或表达ITGA8的体系接触；

(2)检测所述体系中ITGA8的表达量；

(3)选择能够降低ITGA8的表达量的物质为治疗拉帕替尼耐药的胃癌的候选药物。

进一步，所述胃癌为HER2阳性胃癌。

本发明的第六方面提供了一种构建拉帕替尼耐药的胃癌细胞的方法，所述方法包括构建过表达ITGA8的胃癌细胞。

进一步，所述构建过表达ITGA8的胃癌细胞包括将构建的过表达ITGA8载体转染到胃癌细胞中。

进一步，所述载体包括病毒载体、质粒、噬菌体、脂质体、亲脂试剂、聚阳离子。

进一步，所述病毒载体包括慢病毒载体、SV40病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体。

进一步，所述病毒载体为慢病毒载体。

进一步，所述胃癌细胞选自BGC-823、SGC-7901、MGC-803、AGS、HS764T、SNU-1、AGS、KATO-III、HGC-27、MKN-1、MKN-28、MKN-45、MKN-74、NMG C-3、NMG C-4、AZ-521、SNU-1、SNU-5、SNU-16。

进一步，所述胃癌细胞为HGC-27。

进一步，所述胃癌为HER2阳性胃癌。

本发明的第七方面提供了一种拉帕替尼耐药的胃癌细胞模型，所述模型由本发明的第六方面所述的方法构建而成。

本发明的第八方面提供了一种构建帕替尼耐药的胃癌动物模型的方法，所述方法包括过表达ITGA8。

进一步，所述方法包括：

1)将构建的过表达ITGA8的胃癌细胞直接引入动物体内；

2)将培养的胃癌细胞引入过表达ITGA8的动物体内；或

3)将构建的过表达ITGA8的载体引入患有胃癌的动物体内。

进一步，所述方法为将构建的过表达ITGA8的胃癌细胞直接引入动物体内。

进一步，所述引入动物体内的方法为皮下注射。

进一步，所述的胃癌细胞包括本发明的第六方面所述的方法构建的胃癌细胞。

进一步，所述动物包括哺乳动物。

进一步，所述哺乳动物包括狗、猪、兔或啮齿目动物。

进一步，所述啮齿目动物包括小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠。

进一步，所述动物为小鼠。

本发明的第九方面提供了如下任一项所述的应用：

1)ITGA8在构建预测拉帕替尼耐药的胃癌的计算模型中的应用；

2)ITGA8在筛选治疗拉帕替尼耐药的胃癌的候选药物中的应用；

3)ITGA8在筛选增加拉帕替尼治疗胃癌敏感性的候选药物中的应用；

4)ITGA8在构建拉帕替尼耐药的胃癌模型中的应用；

5)ITGA8在调控p-STAT3、SOX2表达中的应用；

6)ITGA8在调控Ki67表达中的应用；

7)本发明的第七方面所述胃癌细胞模型或本发明的第八方面所述的方法构建的胃癌动物模型在筛选治疗拉帕替尼耐药的胃癌药物中的应用；

8)本发明的第七方面所述胃癌细胞模型或本发明的第八方面所述的方法构建的胃癌动物模型在筛选增加拉帕替尼治疗胃癌敏感性药物中的应用。

进一步，2)中ITGA8筛选治疗拉帕替尼耐药的胃癌的候选药物的方法为：

(1)将待测物质与含有或表达ITGA8的体系接触；

(2)检测所述体系中ITGA8的表达量；

(3)选择能够降低ITGA8的表达量的物质为治疗拉帕替尼耐药的胃癌的候选药物。

进一步，3)中ITGA8在筛选增加拉帕替尼治疗胃癌敏感性的候选药物的方法包括检测胃癌细胞的相对活力值。

进一步，所述胃癌细胞选自BGC-823、SGC-7901、MGC-803、AGS、HS764T、SNU-1、AGS、KATO-III、HGC-27、MKN-1、MKN-28、MKN-45、MKN-74、NMG C-3、NMG C-4、AZ-521、SNU-1、SNU-5、SNU-16。

进一步，所述胃癌细胞为HGC-27。

进一步，4)中ITGA8在构建的拉帕替尼耐药的胃癌模型中高表达。

进一步，5)中过表达ITGA8促进p-STAT3、SOX2的表达。

进一步，6)中过表达ITGA8促进Ki67的表达。

进一步，所述胃癌为HER2阳性胃癌。

本发明的第十方面提供了一种增加拉帕替尼药物敏感性的方法，所述方法为非治疗目的增加拉帕替尼药物敏感性。

进一步，所述方法包括抑制ITGA8的表达。

进一步，所述方法为通过抑制ITGA8的表达进而抑制p-STAT3/SOX2信号通路的激活来增加拉帕替尼的药物敏感性。

进一步，所述的方法能够增加拉帕替尼治疗肿瘤的药物敏感性。

进一步，所述肿瘤选自胃癌、乳腺癌、头颈部癌。

进一步，所述肿瘤为胃癌。

进一步，所述胃癌为HER2阳性胃癌。

本发明的优点和有益效果：

本发明发现了一种与拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌的发生发展相关的生物标志物-ITGA8基因，通过检测拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌患者中ITGA8的表达水平，可以判断胃癌患者是否对拉帕替尼耐药，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。本发明同时发现改变ITGA8的表达水平，可以影响拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，提示可以将ITGA8应用于拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌的治疗。

本发明同时提供了一种构建拉帕替尼耐药的胃癌模型的方法，所述方法构建的模型能够筛选治疗拉帕替尼耐药的胃癌药物与增加拉帕替尼治疗胃癌敏感性的药物。

附图说明

图1为qPCR法检测HGC-27和HGC-27-LR细胞中ITGA8 mRNA的表达水平图。图2为Western blot检测HGC-27和HGC-27-LR细胞中ITGA8蛋白的表达水平图。

图3为HGC-27、HGC-27-LR细胞成球情况检测图，其中3A是荧光显微镜成球图像；3B是细胞成球数量统计图。

图4为HGC-27和HGC-27-LR细胞的创面愈合情况图，其中4A是HGC-27细胞创面愈合图像；4B是HGC-27-LR细胞创面愈合图像；4C是定量创面相对愈合％的统计图。

图5为Transwell法检测HGC-27和HGC-27-LR细胞的迁移、侵袭能力图，其中5A是不经拉帕替尼处理的HGC-27和HGC-27-LR细胞的迁移和侵袭能力图像；5B是不经拉帕替尼处理的HGC-27和HGC-27-LR细胞迁移和侵袭的细胞数量统计图；5C是HGC-27和HGC-27-LR细胞用10μM拉帕替尼处理24h前后的迁移能力图像；5D是拉帕替尼处理后HGC-27和HGC-27-LR细胞迁移细胞数量统计图；5E是HGC-27和HGC-27-LR细胞用10μM拉帕替尼处理48h前后的侵袭能力图像；5F拉帕替尼处理后是HGC-27和HGC-27-LR细胞侵袭细胞数量统计图。

图6是构建过表达ITGA8的HGC-27细胞的蛋白表达水平与细胞迁移、侵袭能力图，其中6A是Western blot检测LV-vector-HGC-27和LV-ITGA8-HGC-27细胞ITGA8、p-STAT3、STAT3、SOX2蛋白表达水平图；6B是LV-vector-HGC-27、LV-ITGA8-HGC-27细胞的荧光显微镜成球图像；6C是LV-vector-HGC-27、LV-ITGA8-HGC-27细胞成球数量统计图；6D是Transwell法检测LV-vector-HGC-27、LV-ITGA8-HGC-27细胞的迁移能力图像；6E是LV-vector-HGC-27、LV-ITGA8-HGC-27细胞迁移细胞数量统计图；6F是Transwell法检测LV-vector-HGC-27、LV-ITGA8-HGC-27细胞的侵袭能力图像；6G是LV-vector-HGC-27、LV-ITGA8-HGC-27细胞侵袭细胞数量统计图。

图7为CCK-8检测LV-vector-HGC-27和LV-ITGA8-HGC-27细胞活力的统计图。图8为功能回复实验结果图，其中8A是qPCR检测si-ITGA8-a、si-ITGA8-b、si-ITGA8-c敲低ITGA8的效率结果图；8B是CCK-8检测LV-ITGA8-sh-NC和LV-ITGA8-sh-ITGA8的HGC-27细胞活力的统计图；8C是Transwell法检测LV-ITGA8-sh-NC和LV-ITGA8-sh-ITGA8的HGC-27细胞的迁移能力图像；8D是LV-ITGA8-sh-NC和LV-ITGA8-sh-ITGA8的HGC-27细胞迁移数量统计图；8E是Transwell法检测LV-ITGA8-sh-NC和LV-ITGA8-sh-ITGA8的HGC-27细胞的侵袭能力图像；8F是LV-ITGA8-sh-NC和LV-ITGA8-sh-ITGA8的HGC-27细胞侵袭数量统计图；8G是Westernblot检测ITGA8、p-STAT3、STAT3的蛋白表达水平图；8H是Western blot检测ITGA8、SOX2的蛋白表达水平图。

图9为体内实验验证ITGA8促进HGC-27异种移植小鼠对拉帕替尼耐药的结果图，其中9A是体内实验模式图；9B是从NCG小鼠获得的LV-vector-HGC-27组和LV-ITGA8-HGC-27组的异种移植瘤的实体照片；9C是LV-vector组的异种移植瘤体积统计图；9D是LV-ITGA8组的异种移植瘤体积统计图；9E是LV-vector组的异种移植瘤体重统计图；9F是LV-ITGA8组的异种移植瘤体重统计图；9G是用免疫组化法检测ITGA8和Ki-67表达水平结果图。

具体实施方式

本发明通过广泛而深入的研究，发现了ITGA8在拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌中呈现显著性差异，与HGC-27细胞相比，ITGA8在HGC-27-LR细胞中表达上调，差异具有统计学意义，进一步研究发现，ITGA8可促进拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，提示ITGA8可作为较好的生物标志物应用于拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌的诊断和治疗。

在本发明中，ITGA8包括野生型、突变型或其片段。该术语涵盖全长，未加工的ITGA8，以及源自细胞中加工的任何形式的ITGA8。该术语涵盖ITGA8的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。该术语涵盖例如ITGA8基因，人的ITGA8以及来自任何其它脊椎动物来源，包括哺乳动物，诸如灵长动物和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的ITGA8。作为一种优选的实施方案，在本发明中，AQP7为人的基因，基因ID为8516。

本发明的实用性并不局限于对本发明的靶标基因的任何特定变体的基因表达进行定量。本领域技术人员知道，进行生物信息学分析时，通常会将测序序列和已知的基因进行比对，只要有关序列可以比对到相关基因上，就可以看做是该基因的表达，因此，在提及差异表达的基因时，该基因的不同的转录本、突变型或其片段也包含在本发明中。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

在本发明中，术语“诊断”是指基于与个体相关的一个或其以上的征兆、症状、数据或其他信息，来对个体的健康状态或状况的发现、判断或认知。个体的健康状态可被诊断为健康的/正常的(即，不存在疾病或疾患)，或者可被诊断为不健康的/异常的(即，存在疾病或疾患或特性的评估)。术语“诊断”包括与特定疾病或疾患相关地，疾病的早期发现；疾病的特性或分类；疾病的进展、治愈或复发的发现；个体的处置或治疗后，对疾病的反应的发现。在本发明的上下文中，“诊断拉帕替尼耐药的胃癌”既包括判断受试者是否已经患有拉帕替尼耐药的胃癌、也包括判断受试者是否存在患有拉帕替尼耐药的胃癌的风险。

在本发明中，术语“样本”是指与受试者特异地相关联的材料，从其中可以确定、计算或推断出与受试者有关的特定信息。样本包括从生物学个体获得的样本，例如体内或原位获得、取得或收集的源于生物学组织或流体的样本。样本还包括来自包含癌前或癌细胞或组织的生物学个体的区域的样本。这样的样本可以是，但不限于来自哺乳动物分离的器官、组织、部分和细胞。示例性的生物样本包括，但不限于细胞溶解产物、细胞培养物、细胞系、组织、口腔组织、胃肠组织、器官、细胞器、体液、血样、脑脊液、尿液、泪液、唾液、汗液、皮肤样本等。优选地，样本包括，但不限于全血、部分纯化的血液、PBMC、活组织检查等。优选地，所述样本为血液。

在本发明中，术语“表达量”、“表达水平”可互换使用，指某一物质(如ITGA8)在单位体积或单位质量生物组织内的表达量，可用如体积浓度、质量浓度等表示。

在本发明中芯片包括基因芯片、蛋白芯片；所述基因芯片包括固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于ITGA8所示的部分或全部序列。所述蛋白芯片包括固相载体，以及固定在固相载体上的ITGA8编码的蛋白的特异性结合剂。所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。

特异性结合剂是例如蛋白质ITGA8的受体、结合蛋白质ITGA8的凝集素、针对蛋白质ITGA8的抗体、针对蛋白质ITGA8的肽抗体(peptidebody)、双特异性双重结合剂或双特异性抗体形式。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测ITGA8基因或蛋白的表达水平，包含用于ITGA8检测和/或定量的引物、寡核苷酸探针、配体、和/或芯片。选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对疾病发展进行判断、对治疗方案进行选择。

试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。

在本发明中，核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的特异性识别ITGA8的探针；所述基底可以是任何适于固定探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。

本发明中诊断拉帕替尼耐药的胃癌的产品可用于检测包括ITGA8基因在内的多个基因(例如，与拉帕替尼耐药的胃癌相关的多个基因)的表达水平，将拉帕替尼耐药的胃癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高拉帕替尼耐药的胃癌诊断的准确率。

本发明的ITGA8使用本领域普通技术人员已知的多种核酸以及蛋白技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、蛋白免疫技术。

核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。

核酸测序技术的另一示例性非限制性实例包括下一代测序(深度测序/高通量测序)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板DNA进行测序。

蛋白免疫技术包括夹心免疫测定，例如夹心ELISA，其中使用识别生物标志物上不同表位的两种抗体进行该生物标志物的检测；放射免疫测定(RIA)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。

在本发明的上下文中，“治疗拉帕替尼耐药的胃癌”从疾病的状态变化来分，可以包括疾病的缓解、疾病的完全治愈。

本发明提供了一种治疗拉帕替尼耐药的胃癌的药物组合物，所述药物组合物包括ITGA8的抑制剂。所述抑制剂是指任何可降低ITGA8蛋白的活性、降低ITGA8基因或蛋白的稳定性、下调ITGA8蛋白的表达、减少ITGA8蛋白有效作用时间、或抑制ITGA8基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调ITGA8有用的物质，从而可用于预防或治疗拉帕替尼耐药的胃癌。例如所述的抑制剂包括核酸抑制物，蛋白抑制物。所述抑制剂包括但不限于低表达ITGA8的载体、ITGA8蛋白或其活性肽。

在本发明中，术语“核酸抑制物”是指以ITGA8或其转录本为靶序列、且能够抑制ITGA8基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物；优选地，所述核酸抑制物为shRNA、siRNA。

术语“siRNA”包含两条单独的链的双链体，以及可以形成包括双链体区的发夹结构的单链。双链结构的长度可以例如小于20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个核苷酸。例如，双链结构的长度可以为约21-23个核苷酸、约19-25个核苷酸或约19-23个核苷酸。

术语“shRNA”是指在发夹结构中自杂交并且可以在加工时诱导RNA干扰(RNAi)途径的单链RNA碱基。这些分子的长度可以变化(通常长度为约50-90个核苷酸，或在一些情况下长度至多大于250个核苷酸，例如对于微RNA适应的shRNA)。shRNA分子在细胞内被加工以形成siRNA，其进而可以敲低基因表达。shRNA可以整合到载体中。术语“shRNA”还指可以从中转录短的发夹RNA分子的DNA分子。

在本发明中，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。

在调控ITGA8的水平时，可以使用分子生物学领域的技术人员已知许多合适的载体，其选择取决于所期望的功能。载体的非限制性实例包括质粒、黏粒、病毒、噬菌体和其他常规用于例如遗传工程的载体。本领域技术人员众所周知的方法可以用于构建各种质粒和载体。

作为本发明的一种可选方式，载体是病毒。病毒载体用于引入编码靶标特异性多肽的非内源性核酸序列。病毒载体可以是逆转录病毒载体或慢病毒载体。病毒载体还可以包括编码转导标记的核酸序列。

病毒载体包括逆转录病毒，腺病毒，细小病毒(如腺相关病毒)，冠状病毒，负链RNA病毒，弹状病毒(如狂犬病和水疱性口炎病毒)，副粘病毒(如麻疹和仙台病毒)，正链RNA病毒(例如小核糖核酸病毒和甲型病毒)以及双链DNA病毒，包括腺病毒，疱疹病毒(例如1型和2型单纯疱疹病毒和爱泼斯坦-巴尔病毒和巨细胞病毒)和痘病毒(例如，牛痘，鸡痘和金丝雀痘)。其他病毒包括但不限于诺沃克病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳头瘤病毒、肝炎病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的例子包括禽类白血病肉瘤、哺乳动物C型、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV组、慢病毒和泡沫病毒。

本发明中ITGA8的抑制剂可以通过脂质体给予，所述脂质体的作用是将药物靶向于特定的组织，以及增加药物的半衰期。脂质体包括乳化剂、起泡剂、液态脂质、固态脂质、不溶性单层、磷脂分散剂、表面活性剂等。所述的脂质体中还可以包括能与靶向的细胞中的受体分子结合或其他治疗性或免疫原性组合物。

本发明的药物还可与其他治疗拉帕替尼耐药的胃癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分(例如，ITGA8的抑制剂)同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分(如ITGA8的抑制剂)的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。

在本发明中，“胃癌细胞”选自但不限于BGC-823、SGC-7901、MGC-803、AGS、HS764T、SNU-1、AGS、KATO-III、HGC-27、MKN-1、MKN-28、MKN-45、MKN-74、NMG C-3、NMG C-4、AZ-521、SNU-1、SNU-5、SNU-16。优选地，所述胃癌细胞为HGC-27。

本发明中，术语“细胞模型”指用于药物筛选以及研究药物影响ITGA8基因表达所涉及的信号通路的一套细胞检测系统。

在本发明具体的实施方式中，细胞模型包括具有包含野生型ITGA8和报告基因的重组报告质粒的细胞；和具有包含突变型ITGA8和报告基因的重组报告质粒的细胞。优选地，所述细胞为HGC-27的胃癌细胞。

在本发明中，术语“动物模型”是指具有或显示出疾病或病状的特征的动物。用作动物模型是指动物用于研究疾病或状况的任何用途，例如用于研究进展或发展或对新疗法或现有疗法的反应的用途。在本发明具体的实施方案中，术语“动物”包括脊椎动物，更优选地是哺乳动物，例如驯养的家畜(例如牛，马，猪)，宠物(例如狗，猫)，或啮齿目动物。啮齿目动物是指系统发育类啮齿目动物的任何和所有成员(例如，小鼠，大鼠，松鼠，海狸，土拨鼠，地鼠，田鼠，土拨鼠，仓鼠，豚鼠和刺豚鼠)，包括从中衍生的所有后代的任何后代。

本发明提供各种不同的方法和组合物将核酸或蛋白质引入细胞或动物。将核酸引入各种不同的细胞类型中的方法是本领域已知的并且包括例如，稳定转染法，瞬时转染法和病毒介导的方法。

转染规程以及将核酸序列引入细胞中的操作规程可能各不相同。非限定性的转染方法包括使用脂质体，纳米颗粒，磷酸钙，树枝状聚合物，或诸如DEAE-葡聚糖或聚乙烯亚胺之类的阳离子聚合物的基于化学的转染方法。非化学方法包括电穿孔，Sono-穿孔，和光转染。基于颗粒的转染包括使用基因枪或磁性辅助转染。病毒方法也可用于转染。

将核酸或蛋白质引入细胞内还可以由电穿孔介导，由胞质内注射介导，由病毒感染介导，由腺病毒介导，由腺相关病毒介导，由慢病毒介导，由逆转录病毒介导，由转染介导，由脂质介导的转染介导，或由核转染(nucleofection)介导。核转染是一种改进的电穿孔技术，其不仅能够将核酸底物递送至细胞质而且还可以通过核膜将核酸底物递送至细胞核内。

将核酸或蛋白质引入细胞(例如，受精卵)内还可通过显微注射完成。在受精卵(即，单细胞期胚胎)中，显微注射可进入母本和/或父本原核中或进入细胞质内。如果显微注射只进入一个原核中，父本原核由于其具有较大的尺寸而是优选的。mRNA的显微注射优选地进入细胞质内(例如，将mRNA直接递送至翻译装置)，而ITGA8蛋白质或编码ITGA8蛋白质或编码RNA的多核苷酸的显微注射，优选地进入细胞核/原核内。可选地，显微注射可通过注射进入细胞核/原核和细胞质这两者来实施：首先可将针头引入细胞核/原核内并注射第一量，并且在将所述针头从单细胞期胚胎中移出时，向细胞质中注射第二量。如果将ITGA8蛋白质注射至细胞质内，那么ITGA8蛋白质优选地包含细胞核定位信号以确保递送至细胞核/原核。实施显微注射的方法是本领域熟知的。

用于将核酸或蛋白质引入细胞内或非人类动物体内的其他方法可包括例如，载体递送，颗粒介导的递送，核外体介导的递送，脂质纳米颗粒介导的递送，细胞渗透肽介导的递送，或可植入设备介导的递送。作为特定实例，可将核酸或蛋白质引入至诸如聚(乳酸)(PLA)微球，聚(D,L-乳酸-co-羟基乙酸)(PLGA)微球，脂质体，胶束，反相胶束，脂质卷(lipid cochleate)或脂质微管之类的载体中的细胞或非人类动物。

将核酸和蛋白质引入细胞或非人类动物还可通过流体力学递送(HDD)完成。流体力学递送作为一种体内递送细胞内DNA的方法而出现。对于将基因递送至实质细胞而言，只需要将必需DNA序列通过所选择的血管进行注射，这消除了与目前的病毒载体和合成载体相关的安全顾虑。当将DNA注射至血流中时，DNA能够到达接近血液的不同组织中的细胞。流体力学递送使用将大量溶液快速注射进入循环中的不可压缩的血液中产生的力以克服内皮的物理障碍和细胞膜的物理障碍，所述细胞膜防止较大的且细胞膜不可渗透的化合物进入实质细胞。除了DNA的递送之外，该方法可用于体内有效细胞内递送RNA，蛋白质和其他小化合物。

引入核酸还可通过病毒介导的递送(例如，AAV-介导的递送或慢病毒介导的递送)完成。其他示例性的病毒/病毒载体包括逆转录病毒，腺病毒，牛痘病毒，痘病毒以及单纯疱疹病毒。所述病毒可感染分化的细胞，未分化的细胞或分化的和未分化的细胞这两者。病毒可被整合至宿主基因组或可选地不整合至宿主基因组。这些病毒还可被工程化以具有降低的免疫性。病毒可以是能够进行复制的或可以是复制有缺陷的(例如，缺乏一种或多种多轮病毒复制和/或包装所必需的基因)。病毒可导致瞬时表达，长期表达(例如，至少1周，两周，1个月，2个月，或3个月)，或者永久表达。

本发明提供了ITGA8在构建预测肿瘤的计算模型中的应用，正如熟练技术人员知道的，可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选地，在数学上组合标志物和一种或多种其它标志物的测定浓度，并将组合值与根本的诊断问题关联起来。可以通过任何适宜的现有技术数学方法将标志物值的测定组合。

本发明进一步提供了一种筛选治疗拉帕替尼耐药的胃癌的候选药物的方法，所述方法包括用待筛选物质处理表达或含有ITGA8基因或其编码的蛋白的培养体系；和检测所述体系中ITGA8基因或其编码的蛋白的表达或活性；其中，当所述待筛选物质抑制ITGA8基因的或其编码的蛋白的表达水平或活性时，该待筛选物质是治疗肿瘤的候选药物。

在本发明中，所述的方法还包括：对上面步骤获得的候选药物进一步测试其抑制拉帕替尼耐药的胃癌的效果，若测试化合物对拉帕替尼耐药的胃癌有显著的抑制效果，则说明该候选药物为治疗拉帕替尼耐药的胃癌的候选药物。

所述培养体系包括(但不限于)细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1ITGA8在拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌组织中的表达水平

1、细胞培养

胃癌细胞系HGC-27细胞来自上海中国科学院细胞库(TCHu 22)。采用体外经典药物梯度压法建立HGC-27-LR(拉帕替尼耐药)细胞。用含有10％胎牛血清(TransGenBiotech,P30922)的DMEM-高糖培养基(Sigma,D5796)培养HGC-27和HGC-27-LR细胞。细胞置于37℃的、含有5％CO₂的加湿培养箱中进行培养。

2、qRT-PCR检测ITGA8的表达水平

用Trizol法(TAKARA，9109)提取总RNA。RNA(1μg)用PrimeScript RT试剂盒(TAKARA，DRR047)反转录为cDNA。qPCR的体积为20μl，由10μl的SYBR qPCR Master Mix(Vazyme，Q321-02)、正向引物、反向引物、模板cDNA和无核酸酶H₂O组成。特异性基因的相对mRNA水平归一化(内参为ACTB)。ITGA8和ACTB引物序列如表1所示。

表1引物序列

SEQ ID NO.1(ITGA8-PrimerF)	5'-GCAGATACCGTTTGACACCAC-3'
		SEQ ID NO.2(ITGA8-PrimerR)	5'-GGAGAGAACTCGGCATAGGC-3'
SEQ ID NO.3(ACTB-PrimerF)	5'-GAAGTGTGACGTGGACATCC-3'
		SEQ ID NO.4(ACTB-PrimerR)	5'-CCGATCCACACGGAGTACTT-3'

3、蛋白质印迹法(Western blot)

用含有蛋白酶抑制剂cocktail(Sigma，P8340)和0.1mM的PMSF(苯甲基磺酰氟)的RIPA裂解缓冲液(APPLYGEN，C1053)裂解细胞。使用核和细胞质蛋白提取试剂盒(Beyotime，P0027)检测HGC-27和HGC-27-LR细胞中p-STAT3亚细胞定位。细胞裂解物在12,000×g，4℃离心20min，收集上清，用BCA蛋白测定试剂盒(APPLYGEN，P1511)测定蛋白浓度。经过12％或15％的SDS-PAGE后，蛋白质通过半干电泳转移系统(Bio-rad)转移到硝化纤维素膜上(Pall，BioTrace NT-66485)。用5％脱脂奶粉在室温下封闭1h，然后用一抗(1:1000)孵育：ACTB(Sigma，A-5441)，SOX2(Proteintech，66411-1-Ig)，STAT3(Cell SignalingTechnology，4904S)，p-STAT3(Cell Signaling Technology，9134P)，ITGA8(Invitrogen，MA5-31449)，在4℃下孵育过夜，用1×TBST洗涤(三次)，然后与二抗(Cell SignalingTechnology，山羊抗兔:7074P2或山羊抗小鼠:7076P2)在室温下孵育1h。然后，与HRP底物孵育3min后，使用Tanon 5200Multi检测荧光信号。用Image J软件对目标蛋白的相对表达量进行量化。

4、统计分析

每个实验至少独立重复三次，实验数据以均数±SEM表示，使用SPSS 17.0(SPSSInc.,Chicago,IL,USA)进行统计分析。p<0.05代表差异有统计学意义。

5、实验结果

qPCR结果见图1，结果表明，与HGC-27细胞相比，ITGA8在HGC-27-LR细胞中表达上调，差异具有统计学意义(P<0.01)。

Western blot实验结果见图2，结果表明，与HGC-27细胞相比，p-STAT3、、SOX2、ITGA8蛋白在HGC-27-LR细胞中表达上调。

实施例2ITGA8对拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌细胞的影响

1、干细胞成球实验

HGC-27、HGC-27-LR、LV-vector-HGC-27、LV-ITGA8-HGC-27细胞消化重悬成单细胞后，分别接种于6孔板(每孔2000个细胞)或24孔板(每孔1000个细胞)(超低吸附的6孔板，康宁)。培养基为DMEM/F12、胎牛血清(10％)、青霉素-链霉素-两性霉素B溶液(100U/ml)、L-谷氨酰胺(2mM)、人EGF(20ng/ml)、B27(1×)、人bFGF(20ng/ml)，每2天补充一次培养基。4～7天后观察细胞的球形状态，然后用荧光显微镜(Olympus)拍照，分析了球体(直径>50μM)的数目，并统计成球个数。

2、划痕愈合实验

HGC-27或HGC-27-LR细胞在6孔板中培养并使其达到100％汇合。用10μl枪头垂直与孔板，制造划痕，尽量保证各个处理组的划痕宽度一致。更换无血清培养基前，用1×PBS冲洗细胞3次，洗去划痕产生的细胞碎片。将培养板放回培养箱中继续培养，监测细胞向创面的迁移情况，用5μM拉帕替尼处理24h后，取出拍照，然后量化和统计迁移的距离。

3、Transwell实验

将经过消化和重悬的2×10⁵个HGC-27细胞种到transwell小室(BIOFIL,TCS-013-024，8.0μM)中。如果是观察细胞侵袭，预先在小室中铺上1×matrigel(Corning，BDBiocoat，356234)基质胶，小室放置于24孔板中，铺好基质胶后在37℃条件下孵育4-5h。待基质胶凝固后，用无血清培养基重悬细胞，将细胞铺在含有基质胶的小室中，孔中加入500μl的条件培养基(含有15％血清、添加或不添加拉帕替尼的培养基)，没过小室即可。在37℃、含有5％CO₂的培养箱中孵育24h或者48h后，用多聚甲醛固定细胞30min，1×PBS洗三次，然后结晶紫(0.1％)染色30min，用1×PBS洗去多余的结晶紫染料，棉签轻轻擦拭小室膜上层的细胞，室温晾干后，拍照和统计穿过小室的细胞数。

4、CCK-8检测实验

HGC-27或HGC-27-LR细胞接种于96孔板(每孔6×10³个细胞)，培养过夜。用细胞培养基按照1:10比例稀释CCK-8反应试剂。拉帕替尼处理细胞后，废弃96孔板中的旧培养基，每孔加入100μl稀释的CCK-8反应液，在37℃、5％CO₂培养箱中孵育2h。用Bio-Rad酶标仪读取450nm处的吸光度值。计算相对细胞活力值。CCK-8实验检测LV-vector-HGC-27和LV-ITGA8-HGC-27细胞相对活力值。

5、构建稳定过表达ITGA8的细胞

过表达ITGA8慢病毒载体的构建和包装由Genechem公司负责提供。HGC-27细胞接种于6孔板(每孔1×10⁵个细胞)，培养于含10％胎牛血清的DMEM-高糖培养基(Sigma，D5796)中。将感染试剂(HiTransG P)和质粒完全混合后加入孔中。37℃下，5％CO₂培养箱孵育16h后更换新鲜培养基，48-72h后检测转染效率，通过嘌呤霉素或杀稻瘟菌素筛选后获得稳定的细胞株。用Westernblot分析过表达ITGA8细胞的表达效率。

6、质粒的瞬时转染

GenePharma设计并合成三条不同序列的ITGA8特异性小干扰RNA(si-ITGA8)和scramble siRNA(NC)，将si-ITGA8的序列命名为si-ITGA8-a、b、c，并参照说明书使用HiPerFect转染试剂(QIAGEN，301705)进行瞬时转染。

表2引物序列

SEQ ID NO.5(si-ITGA8-a:Sense)	5'-GCACCUGCUAUGUAGCAAUTT-3'
		SEQ ID NO.6(si-ITGA8-a:Antisense)	5'-AUUGCUACAUAGCAGGUGCTT-3'
SEQ ID NO.7(si-ITGA8-b:Sense)	5'-GCACCCAAUGAUUAUCAAUTT-3'
		SEQ ID NO.8(si-ITGA8-b:Antisense)	5'-AUUGAUAAUCAUUGGGUGCTT-3'
SEQ ID NO.9(si-ITGA8-c:Sense)	5'-GGAUUUCAUCGUUUACCUUTT-3'
		SEQ ID NO.10(si-ITGA8-c:Antisense)	5'-AAGGUAAACGAUGAAAUCCTT-3'
SEQ ID NO.11(NC:Sense)	5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'
		SEQ ID NO.12(NC:Antisense)	5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'

7、功能回复实验

用NC或si-ITGA8，瞬时转染HGC-27-LR细胞72h后，qPCR检测ITGA8的mRNA水平，验证这三条不同序列的siRNA敲低ITGA8的效率。根据上述经qPCR验证的敲低ITGA8效率最高的siRNA-a的序列，提供给Genechem公司，进行sh-ITGA8质粒构建和慢病毒包装，然后分别用sh-NC和sh-ITGA8的慢病毒感染LV-ITGA8-HGC-27细胞，经嘌呤霉素(puromycin)药筛，构建稳定表达的LV-ITGA8-sh-NC、LV-ITGA8-sh-ITGA8的HGC-27细胞，用不同浓度拉帕替尼处理96h后，CCK-8检测sh-ITGA8对ITGA8过表达诱导的拉帕替尼抗性的影响，对照组是药物溶剂，即DMSO。5μM拉帕替尼分别作用于LV-ITGA8-sh-NC和LV-ITGA8-sh-ITGA8的HGC-27细胞36h和48h，Transwell检测细胞的迁移和侵袭能力。用NC、si-ITGA8-a或si-ITGA8-b分别转染LV-ITGA8-HGC-27细胞24h或48h，Westernblot检测ITGA8基因敲低对p-STAT3和SOX2蛋白水平的影响。

8、统计分析

每个实验至少独立重复三次，实验数据以均数±SEM表示，使用SPSS 17.0(SPSSInc.,Chicago,IL,USA)进行统计分析。p<0.05代表差异有统计学意义。

9、实验结果

HGC-27、HGC-27-LR干细胞成球实验结果见图3，结果表明，单个HGC-27-LR细胞比单个HGC-27细胞具有更强的自我更新能力和成团生长能力。

划痕愈合实验结果见图4，结果表明，HGC-27-LR细胞在拉帕替尼处理下的愈合能力比HGC-27细胞差。

HGC-27、HGC-27-LR细胞的迁移和侵袭能力结果见图5，结果表明，与HGC-27细胞相比，HGC-27-LR细胞在有无拉帕替尼处理下的迁移和侵袭能力均显著增强。

构建过表达ITGA8细胞增殖、迁移、侵袭能力和细胞活力结果见图6、图7，结果所示，LV-ITGA8-HGC-27细胞比LV-vector-HGC-27细胞具有更强的自我更新能力和成团生长能力，无论是否加入拉帕替尼，ITGA8都能显著增加HGC-27细胞的增殖、迁移和侵袭能力；ITGA8过表达细胞对拉帕替尼的耐受能力更强。

功能恢复实验结果见图8，qPCR检测发现敲低ITGA8效率最高的是si-ITGA8-a序列；CCK-8测定结果显示sh-ITGA8减弱ITGA8过表达诱导的拉帕替尼抗性；Transwell实验表明，ITGA8的敲低降低了细胞的迁移和侵袭能力；Western blot分析表明，ITGA8基因敲低可降低p-STAT3和SOX2蛋白水平。

实施例3ITGA8促进体内HGC-27细胞耐药

1、体内异种移植实验

将购买于Gempharmatech公司的5周龄雌性NCG小鼠随机分为两组，每组n＝10只。将LV-vector-HGC-27细胞或LV-ITGA8-HGC-27细胞以1×10⁷个细胞/100μl PBS的浓度重悬，异氟醚麻醉NCG小鼠后，皮下接种细胞。肿瘤体积＝长×宽²×0.52。当移植瘤体积达到200～300mm³时，每组小鼠随机分配给拉帕替尼注射组(100mg/kg/d)或对照组(玉米油)(每组n＝5)。每天监测拉帕替尼对小鼠体重和肿瘤大小的影响。小鼠腹腔注射拉帕替尼10d后处死。取出异种移植瘤，并测量肿瘤的体积和重量，然后对移植瘤拍照。所有动物实验均经徐州医科大学动物护理与使用专业委员会批准(批准号：202112A435)。

2、免疫组织化学染色检测

异种移植瘤用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋肿瘤组织和进行切片。脱蜡切片在柠檬酸缓冲液(0.01mol/L，pH 6.0)中煮沸20min，进行抗原修复。室温下，用0.3％Triton X-100渗透20分钟(膜蛋白不需要)。切片用1×PBST冲洗5分钟(3次)，在室温下用10％山羊血清封闭1小时，然后与一抗ITGA8(Invitrogen,MA5-31449)(1:200)或Ki-67(Cell SignalingTechnology，12202S)(1:200)在4℃下孵育过夜。用1×PBST洗涤5分钟(3次)后，用0.3％H₂O₂封闭内源性辣根过氧化物酶(HRP)。用1×PBST洗5分钟(3次)。二抗室温孵育1h。切片用1×PBST冲洗5分钟(3次)，然后进行DAB反应(1-10分钟)。苏木精染色3min，用蒸馏水冲洗。切片脱水：梯度酒精(50％→75％→85％→95％→100％→100％)各2min，二甲苯I，3min，二甲苯II，5min。脱水完成后，用中性树胶封片。通过多光谱高通量免疫组化扫描系统(日本，Olympus)进行观察和拍照，HE代表苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining)。

3、统计分析

每个实验至少独立重复三次，实验数据以均数±SEM表示，使用SPSS 17.0(SPSSInc.,Chicago,IL,USA)进行统计分析。p<0.05代表差异有统计学意义。

4、实验结果

结果见图9，与对照组相比，拉帕替尼组LV-vector-HGC-27异种移植瘤体积和重量均减小；同时，LV-ITGA8-HGC-27异种移植瘤体积和重量在拉帕替尼组与对照组之间无显著性差异；免疫组化法发现ITGA8的过表达伴随着高水平的Ki67。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种诊断拉帕替尼耐药的胃癌的产品，其特征在于，所述的产品包括检测样本中ITGA8的表达量所使用的试剂；

优选地，所述的产品包括芯片、试剂盒或核酸膜条；

优选地，所述的芯片包括固相载体、附着在固相载体上的特异性识别ITGA8的探针；

优选地，所述的试剂盒包括特异性识别ITGA8基因的寡核苷酸探针、特异性扩增ITGA8基因的引物或特异性结合ITGA8基因编码的蛋白的结合剂；

优选地，所述的引物的序列如SEQ ID NO.1-2所示；

优选地，所述的试剂盒包含容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂；

优选地，所述样本包括血液、组织液、脑脊液、尿液、泪液、唾液、汗液；

优选地，所述样本为血液；

优选地，所述胃癌为HER2阳性胃癌。

2.检测ITGA8的表达量的试剂在制备诊断拉帕替尼耐药的胃癌的产品中的应用；

优选地，所述检测ITGA8表达量的试剂包括检测蛋白表达量和/或mRNA表达量的试剂；

优选地，所述检测ITGA8蛋白表达量的试剂是蛋白质印迹法中所使用的试剂，或者是以下方法中所使用试剂：酶联免疫吸附测定、放射性免疫测定、夹心测定、免疫组织化学染色、质谱检测法、免疫沉淀分析法、补体结合分析法、流式细胞荧光分析技术和蛋白质芯片法；

优选地，所述检测ITGA8 mRNA表达量的试剂是qRT-PCR中所使用的试剂，或者是以下方法中所使用的试剂：原位杂交、芯片、高通量测序平台；

优选地，所述胃癌为HER2阳性胃癌。

3.一种治疗拉帕替尼耐药的胃癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括抑制表达ITGA8或抑制ITGA8表达的生物材料；

优选地，所述生物材料包括核酸抑制物、蛋白抑制剂、蛋白水解酶、蛋白结合分子、表达盒、重组载体、细胞；

优选地，所述核酸抑制物包括shRNA、siRNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸；

优选地，所述核酸抑制物为shRNA、siRNA；

优选地，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.5-10所示；

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体；

优选地，所述胃癌为HER2阳性胃癌。

4.ITGA8在制备治疗拉帕替尼耐药的胃癌或增加拉帕替尼治疗胃癌敏感性的产品中的应用；

优选地，所述产品包括抑制ITGA8的表达的试剂；

优选地，所述产品抑制拉帕替尼耐药的胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭、增加拉帕替尼药物敏感性；

优选地，所述胃癌为HER2阳性胃癌。

5.一种筛选治疗拉帕替尼耐药的胃癌的候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)将待测物质与含有或表达ITGA8的体系接触；

(2)检测所述体系中ITGA8的表达量；

(3)选择能够降低ITGA8的表达量的物质为治疗拉帕替尼耐药的胃癌的候选药物；

优选地，所述胃癌为HER2阳性胃癌。

6.一种构建拉帕替尼耐药的胃癌细胞的方法，其特征在于，所述方法包括构建过表达ITGA8的胃癌细胞；

优选地，所述构建过表达ITGA8的胃癌细胞包括将构建的过表达ITGA8载体转染到胃癌细胞中；

优选地，所述载体包括病毒载体、质粒、噬菌体、脂质体、亲脂试剂、聚阳离子；

优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、SV40病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体；

优选地，所述病毒载体为慢病毒载体；

优选地，所述胃癌细胞选自BGC-823、SGC-7901、MGC-803、AGS、HS764T、SNU-1、AGS、KATO-III、HGC-27、MKN-1、MKN-28、MKN-45、MKN-74、NMG C-3、NMG C-4、AZ-521、SNU-1、SNU-5、SNU-16；

优选地，所述胃癌细胞为HGC-27；

优选地，所述胃癌为HER2阳性胃癌。

7.一种拉帕替尼耐药的胃癌细胞模型，其特征在于，所述模型由权利要求6所述的方法构建而成。

8.一种构建帕替尼耐药的胃癌动物模型的方法，其特征在于，所述方法包括过表达ITGA8；

优选地，所述方法包括：

1)将构建的过表达ITGA8的胃癌细胞直接引入动物体内；

2)将培养的胃癌细胞引入过表达ITGA8的动物体内；或

3)将构建的过表达ITGA8的载体引入患有胃癌的动物体内；

优选地，所述方法为将构建的过表达ITGA8的胃癌细胞直接引入动物体内；

优选地，所述引入动物体内的方法为皮下注射；

优选地，所述的胃癌细胞包括权利要求6所述的方法构建的胃癌细胞；

优选地，所述动物包括哺乳动物；

优选地，所述哺乳动物包括狗、猪、兔或啮齿目动物；

优选地，所述啮齿目动物包括小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠；

优选地，所述动物为小鼠。

9.如下任一项所述的应用：

1)ITGA8在构建预测拉帕替尼耐药的胃癌的计算模型中的应用；

2)ITGA8在筛选治疗拉帕替尼耐药的胃癌的候选药物中的应用；

3)ITGA8在筛选增加拉帕替尼治疗胃癌敏感性的候选药物中的应用；

4)ITGA8在构建拉帕替尼耐药的胃癌模型中的应用；

5)ITGA8在调控p-STAT3、SOX2表达中的应用；

6)ITGA8在调控Ki67表达中的应用；

7)权利要求7所述胃癌细胞模型或权利要求8所述的方法构建的胃癌动物模型在筛选治疗拉帕替尼耐药的胃癌药物中的应用；

8)权利要求7所述胃癌细胞模型或权利要求8所述的方法构建的胃癌动物模型在筛选增加拉帕替尼治疗胃癌敏感性药物中的应用；

优选地，2)中ITGA8筛选治疗拉帕替尼耐药的胃癌的候选药物的方法为：

(1)将待测物质与含有或表达ITGA8的体系接触；

(2)检测所述体系中ITGA8的表达量；

(3)选择能够降低ITGA8的表达量的物质为治疗拉帕替尼耐药的胃癌的候选药物；

优选地，所述胃癌细胞选自BGC-823、SGC-7901、MGC-803、AGS、HS764T、SNU-1、AGS、KATO-III、HGC-27、MKN-1、MKN-28、MKN-45、MKN-74、NMG C-3、NMG C-4、AZ-521、SNU-1、SNU-5、SNU-16；

优选地，所述胃癌细胞为HGC-27；

优选地，4)中ITGA8在构建的拉帕替尼耐药的胃癌模型中高表达；

优选地，5)中过表达ITGA8促进p-STAT3、SOX2的表达；

优选地，6)过表达ITGA8促进Ki67的表达；

优选地，所述胃癌为HER2阳性胃癌。

10.一种增加拉帕替尼药物敏感性的方法，其特征在于，所述方法包括抑制ITGA8的表达；

优选地，所述方法为通过抑制ITGA8的表达进而抑制p-STAT3/SOX2信号通路的激活来增加拉帕替尼的药物敏感性；

优选地，所述的方法能够增加拉帕替尼治疗肿瘤的药物敏感性；

优选地，所述肿瘤选自胃癌、乳腺癌、头颈部癌；

优选地，所述肿瘤为胃癌；

优选地，所述胃癌为HER2阳性胃癌。

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