CN115786515B - Pdpn在拉帕替尼耐药的her2阳性胃癌诊断、治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了PDPN在拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌诊断、治疗中的应用。本发明发现PDPN在人胃癌拉帕替尼耐药细胞系HGC‑27‑LR中的含量显著高于人胃癌细胞系HGC‑27细胞，基于此，本发明提供了检测PDPN的试剂在制备诊断拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌的产品中的应用以及一种诊断拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌的产品。本发明同时发现降低PDPN表达水平能够抑制拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌细胞增殖和侵袭迁移能力、增加拉帕替尼的药物敏感性，因此本发明提供了PDPN在制备治疗拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌的药物组合物中的应用及一种治疗拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌的药物组合物。本发明还提供了构建拉帕替尼耐药的胃癌模型的方法及胃癌模型在筛选治疗拉帕替尼耐药的胃癌药物中的应用。

Description

PDPN在拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌诊断、治疗中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及PDPN在拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌诊断、治疗中的应用。

背景技术

胃癌为全球范围内第四大最常见的恶性肿瘤，同时也是恶性肿瘤相关死亡的第二大病因(每年738,000例死亡)。胃癌的发病率呈现广泛的地域差异，超过50％的新发病例发生在发展中国家，包括中国在内的东亚地区为胃癌的高风险地区之一。据有关研究统计，胃癌的高风险和低风险地区之间的发病风险相差至20倍之多。尽管目前针对胃癌的多模式治疗(包括手术，放疗和化疗)日益发展，但胃癌患者的生存预后仍然不理想，其5年生存率低于10％。

近年来，针对胃癌的分子靶向治疗药物的研发获得了全世界广泛关注。HER2在胃癌患者中的阳性率为15-22％，这使得HER2成为胃癌极具吸引力的治疗靶点。几项临床前期研究提示拉帕替尼通过抑制肿瘤细胞增殖、阻断HER2信号传导发挥对HER2阳性胃癌细胞系的抗肿瘤活性，提示拉帕替尼在HER2阳性(HER2⁺)胃癌临床治疗中的潜在可能。然而，目前已开展的II、III期临床试验结果显示，拉帕替尼联合化疗不能显著延长HER2阳性胃食管癌患者的总生存期，其临床疗效受到耐药机制的限制。因此，深入探讨与HER2靶向治疗相结合的新策略或开发HER2阳性胃癌新疗法的潜在靶点，有助于克服拉帕替尼治疗HER2阳性胃癌的获得性耐药，对提高HER2阳性胃癌患者的生存预后具有重要意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供与拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌相关的标志物及其在拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌诊断和治疗中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了检测PDPN的试剂在制备诊断拉帕替尼耐药的胃癌的产品中的应用。

进一步，所述试剂选自特异性识别PDPN基因的寡核苷酸探针、特异性扩增PDPN基因的引物或特异性结合PDPN基因编码的蛋白的结合剂。

进一步，所述的引物的序列如SEQ ID NO.1-2所示。

进一步，所述胃癌为HER2阳性胃癌。

本发明的第二方面提供了一种诊断拉帕替尼耐药的胃癌的产品，所述产品包括能够检测PDPN表达水平的芯片、试剂盒或核酸膜条。

进一步，所述芯片包括基因芯片、蛋白芯片，所述基因芯片包括用于检测PDPN基因转录水平的针对PDPN基因的寡核苷酸探针，所述蛋白芯片包括PDPN蛋白的特异性结合剂；所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括用于检测PDPN基因转录水平的试剂、或芯片，所述蛋白检测试剂盒包括用于检测PDPN蛋白表达水平的试剂或芯片。

进一步，所述试剂盒包括通过RT-PCR法、qRT-PCR法、生物芯片检测法、DNA印迹法、原位杂交法、免疫印迹法检测PDPN基因或蛋白表达水平的试剂。

进一步，所述胃癌为HER2阳性胃癌。

本发明的第三方面提供了PDPN在制备治疗拉帕替尼耐药的胃癌或增加拉帕替尼治疗胃癌敏感性的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括PDPN的抑制剂。

进一步，所述抑制剂特异性降低PDPN的表达水平。

进一步，所述抑制剂包括核酸抑制物、蛋白抑制剂、蛋白水解酶、蛋白结合分子。

进一步，所述核酸抑制物包括shRNA、siRNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸。

进一步，所述核酸抑制物为shRNA。

进一步，所述药物组合物抑制拉帕替尼耐药的胃癌细胞的增殖、迁移、增加拉帕替尼药物敏感性。

进一步，所述胃癌为HER2阳性胃癌。

本发明的第四方面提供了一种治疗拉帕替尼耐药的胃癌的药物组合物，所述药物组合物包括PDPN的抑制剂。

进一步，所述抑制剂特异性降低PDPN的表达水平。

进一步，所述抑制剂包括核酸抑制物、蛋白抑制剂、蛋白水解酶、蛋白结合分子。

进一步，所述核酸抑制物包括shRNA、siRNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸。

进一步，所述核酸抑制物为shRNA。

进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

进一步，所述胃癌为HER2阳性胃癌。

本发明的第五方面提供了PDPN在构建拉帕替尼耐药的胃癌模型中的应用。

进一步，所述PDPN在拉帕替尼耐药的胃癌模型中高表达。

进一步，所述模型包括细胞模型、动物模型。

进一步，所述胃癌为HER2阳性胃癌。

本发明的第六方面提供了如下任一种构建拉帕替尼耐药的胃癌细胞模型的方法：

1)制备过表达PDPN的胃癌细胞；

2)使用拉帕替尼耐药的胃癌细胞与非耐药胃癌细胞共培养。

进一步，1)中制备的过表达PDPN的胃癌细胞包括将PDPN构建至载体中之后转染胃癌细胞。

进一步，2)中使用的拉帕替尼耐药的胃癌细胞通过拉帕替尼梯度加压获得或通过方法1)将PDPN构建至载体中之后转染胃癌细胞获得。

进一步，所述载体包括病毒载体、质粒、噬菌体、脂质体、亲脂试剂、聚阳离子。

进一步，所述病毒载体包括慢病毒载体、SV40病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体。

进一步，所述病毒载体为慢病毒载体。

进一步，所述共培养的方法包括直接培养、间接培养。

进一步，所述共培养的时间为72h。

进一步，所述共培养的比例为1:1。

进一步，所述胃癌细胞选自HGC-27、MGC-803、BCG-823。

进一步，所述胃癌细胞为HGC-27。

进一步，所述胃癌为HER2阳性胃癌。

本发明的第七方面提供了一种构建拉帕替尼耐药的胃癌动物模型的方法，所述方法包括过表达PDPN。

进一步，所述动物包括哺乳动物。

进一步，所述哺乳动物包括狗、猪、兔或啮齿目动物。

进一步，所述啮齿目动物包括小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠。

进一步，所述动物为小鼠。

本发明的第八方面提供了一种拉帕替尼耐药的胃癌细胞模型，所述模型由本发明的第六方面所述的方法构建而成。

进一步，所述胃癌为HER2阳性胃癌。

本发明第九方面提供了PDPN在筛选治疗拉帕替尼耐药的胃癌的候选药物中的应用。

进一步，所述筛选治疗肿瘤的候选药物的方法如下：用待筛选物质处理表达或含有PDPN基因或其编码的蛋白的培养体系；和检测所述体系中PDPN基因或其编码的蛋白的表达或活性；其中，当所述待筛选物质促进PDPN基因的或其编码的蛋白的表达水平或活性时，该待筛选物质是治疗拉帕替尼耐药的胃癌的候选药物。

进一步，所述胃癌为HER2阳性胃癌。

本发明第十方面提供了如下任一种应用：

(1)本发明的第六方面所述的方法构建的细胞模型或本发明的第七方面所述的方法构建的动物模型在筛选治疗拉帕替尼耐药的胃癌药物中的应用；

(2)本发明的第六方面所述的方法构建的细胞模型或本发明的第七方面所述的方法构建的动物模型在筛选增加拉帕替尼治疗胃癌敏感性的药物中的应用。

进一步，所述筛选治疗拉帕替尼耐药的胃癌药物的方法包括以下步骤：

1)向拉帕替尼耐药的胃癌模型施用测试药物；

2)检测拉帕替尼耐药的胃癌模型中胃癌的相关症状和/或指标，并与对照组进行比较；

3)所述拉帕替尼耐药的胃癌模型中胃癌的相关症状有显著改善，则表示该测试药物是潜在治疗拉帕替尼耐药的胃癌的药物。

进一步，所述胃癌为HER2阳性胃癌。

本发明的优点和有益效果：

本发明提供了一种与拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌的发生发展相关的分子标志物-PDPN基因，通过检测拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌患者中PDPN的表达水平，可以判断胃癌患者是否对拉帕替尼耐药，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。本发明发现改变PDPN的表达水平，可以影响拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌细胞的增殖和迁移，提示可以将PDPN应用于拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌的治疗。

本发明同时提供了一种构建拉帕替尼耐药的胃癌模型的方法，所述方法构建的模型能够筛选治疗拉帕替尼耐药的胃癌药物与增加拉帕替尼治疗胃癌敏感性的药物。

附图说明

图1为qRT-PCR检测HGC-27和HGC-27-LR细胞中PDPN的差异表达图。

图2为流式细胞术检测HGC-27和HGC-27-LR细胞中PDPN的差异表达图。

图3为Westernblot检测HGC-27和HGC-27-LR细胞中PDPN的差异表达图。

图4为检测PDPN对细胞增殖能力的改变结果图，其中4A是CCK-8实验检测过表达PDPN对不同用量拉帕替尼处理的HGC-27细胞增殖能力的改变结果图；4B是CCK-8实验在不同时间检测过表达PDPN对拉帕替尼处理后的HGC-27细胞增殖能力的改变结果图；4C是EDU实验检测过表达PDPN对细胞增殖能力的改变结果图；4D是EDU实验检测过表达PDPN对细胞增殖能力的改变统计图。图5为验证PDPN的促增殖与促耐药作用的实验结果图，其中5A是CCK-8实验检测敲低PDPN对不同用量拉帕替尼处理的HGC-27-LR细胞增殖能力的改变结果图；5B是CCK-8实验在不同时间检测敲低PDPN对拉帕替尼处理后的HGC-27-LR细胞增殖能力的改变结果图；5C是EDU实验检测敲低PDPN对细胞增殖能力的改变结果图；5D是EDU实验检测敲低PDPN对细胞增殖能力的改变统计图。

图6为功能回复实验的细胞增殖能力结果图，其中6A是Western blot检测敲低PDPN的HGC-27-LR细胞中转染过表达PDPN质粒的PDPN表达情况图；6B是CCK-8实验检测使用不同用量拉帕替尼处理，72h检测敲低PDPN后过表达PDPN对细胞增殖能力的改变结果图。

图7为功能回复实验的细胞迁移能力结果图，其中7A是过表达PDPN细胞铺小室后20h检测细胞迁移能力结果图；7B是过表达PDPN细胞铺小室后20h检测细胞迁移数量统计图。

图8为体内实验验证PDPN促进细胞耐药的结果图，其中8A是体内实验模式图；8B是LV-vector组和LV-PDPN组的肿瘤实体照片；8C是Western blot检测小鼠肿瘤组织中PDPN表达结果图；8D是LV-vector组和LV-PDPN组的肿瘤体积统计图；8E是LV-vector组和LV-PDPN组的肿瘤体重统计图。

图9为检测直接共培养对HGC-27细胞耐药性的改变及间接共培养对HGC-27细胞耐药性的改变结果图，其中9A是HGC-27-LR、HGC-27分别与GFP阳性HGC-27共培养，7AAD标记死细胞的结果图；9B是荧光显微镜观察GFP阳性HGC-27阳性率图；9C是荧光显微镜观察GFP阳性HGC-27存活比例图；9D是分别以不加药组HGC-27、HGC-27-LR共培养组GFP阳性HGC-27作为对照，检测不同药物浓度拉帕替尼处理后不同细胞共培养后对HGC-27细胞耐药性的影响图；9E是LV-PDPN HGC-27、LV-vector HGC-27分别与HGC-27共培养，7AAD标记死细胞的结果图；9F是分别以不加药组LV-PDPN HGC-27、LV-vector HGC-27共培养组HGC-27作为对照，检测不同药物浓度拉帕替尼处理后不同细胞共培养后对HGC-27细胞耐药性的影响；9G是shPDPN HGC-27-LR、shNC HGC-27-LR分别与GFP阳性HGC-27共培养，7AAD标记死细胞图；9H是分别以不加药组shPDPN HGC-27-LR、shNC HGC-27-LR共培养组GFP阳性HGC-27作为对照，检测不同药物浓度拉帕替尼处理后不同细胞共培养后对HGC-27细胞耐药性的影响；9I是LV-PDPN HGC-27、LV-vector HGC-27分别与HGC-27共培养，7AAD标记死细胞图；9J是分别以不加药组LV-PDPN HGC-27,LV-vector HGC-27共培养组HGC-27作为对照，检测不同药物浓度拉帕替尼处理后不同细胞共培养后对HGC-27细胞耐药性的影响图。

具体实施方式

本发明通过广泛而深入的研究，发现了PDPN在拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌中呈现显著性差异，与HGC-27细胞相比，PDPN在HGC-27-LR细胞中表达上调，差异具有统计学意义，进一步研究发现，PDPN可促进拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌细胞的增殖和迁移，提示PDPN可作为较好的标志物应用于拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌的诊断和治疗。

在本发明中，PDPN包括野生型、突变型或其片段。该术语涵盖全长，未加工的PDPN，以及源自细胞中加工的任何形式的PDPN。该术语涵盖PDPN的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。该术语涵盖例如PDPN基因，人的PDPN以及来自任何其它脊椎动物来源，包括哺乳动物，诸如灵长动物和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的PDPN。作为一种优选的实施方案，在本发明中，PDPN为人的基因，基因ID为10630。

术语“耐药”包括“内在耐药”和“获得性耐药”，前者是指治疗开始时癌细胞对药物即不敏感，后者是指开始时对药物敏感的癌细胞在治疗中经与药物反复接触后变得不敏感。在本发明中，耐药是指HER2阳性胃癌对拉帕替尼产生的获得性耐药。

在本发明中，术语“诊断”指预测性的过程，预测了疾病、疾患或其他医学病症的存在、不存在、严重性或治疗进程。为了本发明的目的，诊断还包括用于确定治疗结果的预测性的过程。类似的，术语“诊断”指确定受治疗者是否展现病症或疾病的一个或多个特征。术语“诊断”包括确立例如靶抗原或结合试剂的靶的存在或不存在，或确立或以其他方式确定病症或疾病的一个或多个特征，包括类型、等级、阶段、或类似情况。术语“诊断”包括最初的诊断或检测，预后，和病症或疾病的监控。

术语“探针”指能与特别预期的靶生物分子，例如由内在基因编码的或相应于内在基因的核苷酸转录物或蛋白选择性结合的分子。探针可以由本领域技术人员合成，或者可以来自于合适的生物制备物。可以特异性地设计探针以对其进行标记。可以用作探针的分子的实例包括，但不限于RNA、DNA、蛋白、抗体、和有机分子。

在本发明中，针对PDPN基因的寡核苷酸探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

术语“扩增”指的是应用例如各种引物延伸反应中的任何一种，复制核酸的一部分的方法。示例性的引物延伸反应包括但不限于PCR。除非明确说明，“扩增”指的是单个复制，或算术、对数或指数扩增。

术语“引物”指的是寡核苷酸，其能够与邻近靶序列的RNA或DNA区位点特异性地退火，并作为合适条件下DNA合成的起始引物，在所述条件下引物延伸产物的合成被诱导，例如，在存在核苷酸和如DNA-依赖性DNA聚合酶的聚合诱导剂，以及合适的温度、pH、金属浓度和盐浓度的情况下。通常，PCR反应使用一对扩增引物，也称为“引物对”，包括“上游”或“正向”引物和“下游”或“反向”引物，其限定了待扩增的RNA或DNA的区域。

术语“结合剂”是指能够使用特定分子间相互作用与膜蛋白结合的蛋白质(蛋白质、蛋白质样或含蛋白质)分子的全部或部分。在本发明中，特异性结合PDPN基因编码的蛋白的结合剂例如蛋白质PDPN的受体、结合蛋白质PDPN的凝集素、针对蛋白质PDPN的抗体、针对蛋白质PDPN的肽抗体(peptidebody)、双特异性双重结合剂或双特异性抗体形式。特异性结合剂的具体例子是肽、肽模拟物、aptamer、spiegelmer、darpin、锚蛋白重复蛋白、Kunitz型域、抗体、单域抗体和单价抗体片段。在本发明的具体实施例中，所述特异性结合剂为PDPN特异性抗体。

在本发明中，术语“表达水平”是指生物标记物分子或基因组的量、积累或速率。表达水平可以例如由以下来表示：由基因编码的信使RNA(mRNA)的量或合成速率、由基因编码的多肽或蛋白质的量或合成速率、或在细胞或生物流体中积累的生物分子的量或合成速率。术语“表达水平”是指在稳态或非稳态条件下确定的在样品中分子的绝对量或者所述分子的相对量。

在本发明中，所述的芯片、试剂盒或核酸膜条可用于检测包括PDPN基因在内的多个基因及其表达产物的表达水平。将拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌诊断的准确率。

在本发明中，核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的寡核苷酸探针；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。

术语“RT-PCR法”也称为“反转录聚合酶链式反应”或“逆转录聚合酶链式反应”，是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用，从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。

术语“qRT-PCR”也称为“定量实时聚合酶链式反应”，是指利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终对起始模板进行精确的定量分析。

术语“免疫印迹法”也称为“蛋白质印迹”或“Western blot”指对固定化到载体上的蛋白质(或多肽)的分析。

术语“药物组合物”指包含至少一种生物活性化合物。本发明所述的药物组合物可口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、阴道给药或通过植入的贮药装置给药。本发明的药物组合物可含有任何常用的无毒可药用载体、辅料或赋形剂。在某些情况下，药用酸、碱或缓冲剂可用来调节制剂的pH以提高所配制的化合物或其给药剂型的稳定性。本发明所用术语非胃肠道包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞠内、损伤部位内、和颅内注射或输注技术。只要能达到目标组织，本发明所述药物组合物可以通过任何途径给予受体。

在本发明中，“抑制剂”是指PDPN功能性表达的抑制剂，包括核酸抑制物，蛋白抑制剂，蛋白水解酶，蛋白结合分子，但不限于此。其中核酸抑制物选自：以PDPN或其转录本为靶序列、且能够抑制PDPN基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物；蛋白结合分子选自：与PDPN蛋白特异性结合的物质，如能够抑制PDPN蛋白活性的抗体或配体。优选地，所述抑制剂为shRNA。

术语“药学上可接受的载体”是指本身不诱导对接受组合物的个体有害的抗体的产生并且可以在没有过度毒性的情况下施用的任何药物载体。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸和氨基酸共聚物。此类载体是本领域普通技术人员众所周知的。治疗组合物中的药学上可接受的载体可以包含流体，如水、盐水、甘油和乙醇。此类媒剂中还可以存在辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。

在本发明中，胃癌细胞选自BGC-823、SGC-7901、MGC-803、AGS、HS764T、SNU-1、AGS、KATO-III、HGC-27、MKN-1、MKN-28、MKN-45、MKN-74、NMG C-3、NMG C-4、AZ-521、SNU-1、SNU-5、SNU-16，但不限于此。优选地，所述胃癌细胞为HGC-27。

术语“载体”是指将核苷酸序列导入细胞中的运载物。它并不试图限定到任何具体序列。载体本身可以是活化内源基因的核苷酸序列或者可以含有活化内源基因的序列。因此，载体可以仅是一个本质上只含有活化所需的序列的线形成环形多核苷酸，或者可以是存在于较大多核苷酸中的这些序列或者其它构建体，比如一个DNA或RNA病毒基因组、完整的毒粒或其它用来将关键核苷酸或其它序列导入细胞中的生物构建体。

在本发明中，“载体”包括但不限于病毒载体、质粒、噬菌体、脂质体、亲脂试剂、聚阳离子；在一些实施方案中，所述载体为质粒，选自本领域常规的用于构建转基因结构的质粒，通常该质粒上存在“间隔序列”以及位于“间隔序列”两边的多克隆位点或供替换序列，从而人们可以将基因相应的DNA序列通过正向和反向的方式插入多克隆位点或替换其上的供替换序列。所述的载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。

在本发明中，“病毒载体”涵盖源自病毒基因组的任何核酸构建体，其能够掺入异源核酸序列以在宿主生物中表达。例如，这种病毒载体可以包括但不限于慢病毒载体，SV40病毒载体，逆转录病毒载体，腺病毒载体。在本发明的具体实施例中，所述病毒载体为慢病毒载体。

尽管病毒载体有时是由病原性病毒产生的，但可以通过对其进行修饰的方法来最大程度地降低其整体健康风险。这通常涉及删除与病毒复制有关的一部分病毒基因组。这种病毒可以有效地感染细胞，但是一旦感染发生，该病毒可能需要辅助病毒来提供缺失的蛋白以生产新的病毒体。最好是病毒载体应该对其感染的细胞的生理影响最小，并表现出遗传稳定的特性(例如，不进行自发的基因组重排)。大多数病毒载体被工程化以感染尽可能广泛的细胞类型。即使这样，也可以修饰病毒受体以将病毒靶向特定种类的细胞。以这种方式修饰的病毒被称为伪型。

术语“转染”泛指将一核酸分子引入一选定的宿主细胞内的方式。依据本领域中已知的技术，一核酸分子(例如，一重组DNA构建体或一重组载体)可通过多种技术而被引入至一选定的宿主细胞内，例如磷酸钙或氯化钙介导的转染作用(transfection)、电穿孔法(electroporation)、微注射法(microinjection)、粒子撞击法(particle bombardment)、脂质体介导的转染作用(liposome-mediatedtransfection)、利用细菌噬菌体的转染作用、利用逆转录病毒(retrovirus)或其他病毒(例如，痘苗病毒(vaccinia virus)或昆虫细胞的杆状病毒(baculovirus))的转导作用(transduction)、原生质融合(protoplastfusion)、农杆菌介导的转化法(Agrobacterium-mediated transformation)或其他方法。

在本发明中，术语“动物”是指除人以外的所有脊椎动物，优选地是哺乳动物，例如狗、猪、兔或啮齿目动物。

作为可选择的实施方案，所述动物是啮齿目动物。术语”啮齿”是指系统发育类啮齿动物的任何和所有成员(例如，小鼠，大鼠，松鼠，海狸，土拨鼠，地鼠，田鼠，土拨鼠，仓鼠，豚鼠和刺豚鼠)，包括从中衍生的所有后代的任何后代。在一些实施方案中，本公开的啮齿动物包括作为非限制性实例的小鼠、大鼠和仓鼠。在一些实施方案中，本公开的啮齿动物包括作为非限制性实例的小鼠和大鼠。在一些实施方案中，啮齿动物选自总科鼠总科(Muroidea)。在一些实施方案中，本公开的啮齿动物来自选自下列的家族：丽仓鼠科(Calomyscidae)(例如，类小鼠的仓鼠)、仓鼠科(Cricetidae)(例如，仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠科(Muridae)(真小鼠和大鼠、沙鼠、棘鼠、冠鼠)、马岛鼠科(Nesomyidae)(攀鼠、岩鼠、具尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺山鼠科(Platacanthomyidae)(例如，刺棒睡鼠)和鼹形鼠科(Spalacidae)(例如，鼹鼠、竹鼠和鼢鼠)。在一些实施方案中，本公开的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、棘鼠和冠鼠。在一些实施方案中，本公开的小鼠来自鼠科(Muridae)的成员。在本发明的具体实施方案中，所述啮齿动物是小鼠。

在本发明中，术语“动物模型”是指具有或显示出疾病或病状的特征的非人类动物。在特定实施方式中，动物模型是哺乳动物模型。在特定实施方式中，动物模型是啮齿目动物模型。在特定实施方式中，啮齿目动物模型是小鼠、大鼠、豚鼠或仓鼠模型。在本发明的具体实施例中，所述动物模型是指小鼠模型。

在本发明中，提供了一种构建拉帕替尼耐药的胃癌动物模型的方法，所述方法包括过表达PDPN。在一些实施方案中，所述的构建方法包括将构建的过表达PDPN的胃癌细胞直接引入动物体内；在一些实施方案中，所述的构建方法包括将培养的胃癌细胞引入过表达PDPN的动物体内，鉴定筛选获得过表达PDPN的胃癌动物模型；在一些实施方案中，所述的构建方法包括将构建的过表达PDPN的载体引入患有胃癌的动物体内，鉴定筛选获得过表达PDPN的胃癌动物模型。优选地，所述构建方法为将构建的过表达PDPN的胃癌细胞直接引入动物体内。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1 PDPN在拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌中的表达水平

1、细胞培养

人源胃癌细胞系HGC-27细胞培养于含10％胎牛血清(TransGen Biotech，P30922)的DMEM-高糖完全培养基(Sigma，D5796)。通过拉帕替尼(15μM)梯度加压的方法获得人胃癌耐药细胞系HGC-27-LR细胞，将HGC-27-LR细胞培养于含10％胎牛血清(TransGen Biotech，P30922)、DMEM-高糖完全培养基(Sigma，D5796)。细胞置于37℃、含5％CO₂的恒温恒湿培养箱中培养。

2、qRT-PCR检测PDPN的表达水平

1)提取细胞RNA

使用Trizol试剂提取细胞RNA。向细胞中加入1ml Trizol，充分吹打。将细胞裂解液转移至1.5m1离心管中，加入200μL氯仿，震荡，静置3-5min，离心。吸取上清液移至EP管中，向上清液中加入异丙醇，颠倒混匀，静置10min，离心。弃上清，加入预冷75％乙醇(现配现用750μL无水乙醇+250μL DEPC水)，弹起RNA沉淀，洗涤，离心。弃上清，留下胶样RNA沉淀，空气干燥5-10min。根据沉淀体积加10-20μL DEPC水复溶。Nanodrop 2000检测RNA浓度。琼脂糖凝胶电泳，检测提取的RNA质量。

2)qRT-PCR检测

取RNA，应用逆转录试剂盒(Takara,PrimeScript^TMRT reagent Kit,RR037A)将其逆转录为cDNA，反应体系为：1μL Oligo DT，10μL 2×Rev Mix，1μL Enzyme Mix，1μL gDNARemover，XμL RNA(2000ng)，(7-X)μL ddH₂O；反应条件为：42℃30min，85℃5s，4℃Hold。

以cDNA为模版，进行qRT-PCR，退火反应体系为：5μL PCR酶Mix，2μLcDNA，0.2μLPrimer F，0.2μL Primer R，2.6μL ddH₂O；引物序列如表1所示。通过qRT-PCR仪特定软件程序记录并分析检测数据结果，根据公式倍数＝2^-ΔΔCt计算各检测目的基因的相对表达量。

表1引物序列

3、流式细胞术

收集培养细胞，用完全培养基重悬。加入100μL抗体稀释液(配制方法：一抗1:400，即2μL抗体加入到800μL含有0.5％BSA的1×PBS。)，1ml 0.5％BSA的1×PBS，吹打混匀，离心，弃上清(重复操作一次)。加入100μL、0.5％BSA稀释的AlexaFluor 488荧光染料标记的二抗重悬细胞，1ml 0.5％BSA的1×PBS，吹打混匀，离心，弃上清(重复操作一次)。最后200μL 1×PBS重悬细胞，采用进行流式细胞术分析。

4、免疫印迹分析(Westernblot)

在裂解缓冲液(1×RIPA、25×PI、100×磷酸酶抑制剂、100×PMSF按照100:4:1:1的比例混合)中制备细胞裂解液。细胞样品用10％的SDS-PAGE分离胶和浓缩胶，将制备好的蛋白样品进行电泳上样，待电泳结束后转移到硝化纤维素(NC)膜上。转移膜用5％脱脂奶粉的1×TBST溶液进行封闭，并用多种目标蛋白一代抗体(primary antibodies)进行免疫印迹。然后用1×TBST洗膜，加入二抗孵育。再用1×TBST洗膜，最后用ECL显影液显色。

5、统计分析

每个实验至少独立重复三次，实验数据以均数±SEM表示，使用SPSS 17.0(SPSSInc.,Chicago,IL,USA)进行统计分析。p<0.05代表差异有统计学意义。

6、实验结果

qPCR结果如图1所示，结果显示，与HGC-27细胞相比，PDPN在HGC-27-LR细胞中表达上调，差异具有统计学意义(P<0.01)。

流式细胞术与Westernblot检测PDPN的表达如图2、图3所示，结果显示，PDPN蛋白在HGC-27-LR细胞中表达显著高于HGC-27细胞，ACTB为内参。

实施例2PDPN对拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌细胞的影响

1、构建敲低PDPN的HGC-27-LR(shPDPN-HGC-27-LR)细胞系

设计针对PDPN的shRNA构建敲低PDPN细胞系。使用限制性内切酶XbaI、Sail对p-suppressor载体进行双酶切，T4连接的方式，将shPDPN PCR片段插入psupressor质粒上，进行基因测序验证正确后，提取敲低PDPN质粒，即shRNA质粒，shRNA质粒与Lipofectamine2000在Opti-MEM培养基中培养，培养完成后转染HGC-27-LR细胞，转染结束得到稳定敲除shPDPN细胞。

2、构建过表达PDPN的HGC-27细胞

包装过表达PDPN的慢病毒(LV-PDPN)。使用EcoR1、BamH1对pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro(LV34)载体和PDPN PCR片段进行双酶切，T4连接的方式，将PDPN片段插入pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro载体上，进行基因测序验证正确后，提取过表达PDPN的病毒质粒感染HGC-27细胞。

3、CCK-8

按照每孔6000个细胞的密度将HGC-27和HGC-27-LR细胞铺在96孔板中，每孔含有100μL含10％FBS的DMEM高糖完全培养基。第二天去除培养基，更换为含不同拉帕替尼药物浓度的完全培养基，每孔加入100μL。培养48h或者72h后，弃去培养基，按CCK-8与培养基1:10的比例，加入到细胞中，37℃孵育2h后，用酶标仪读取450nm的OD值，计算细胞存活率，绘制生存曲线。

4、EDU细胞增殖检测

按照每孔5×10⁴个细胞/ml的密度将HGC-27和HGC-27-LR细胞铺在12孔板中，静置20min后放入培养箱培养过夜，使细胞密度达到60％。每孔加入2ml1×EDU工作液(10μM)，孵育2h。去除培养液，加1ml多聚甲醛(4％)，室温固定15min。弃固定液，含3％BSA的1×PBS洗细胞。去除洗涤液，每孔用1ml 0.3％Triton 100透化细胞，室温孵育10-15min。去除通透液，每孔用1ml 3％BSA的1×PBS洗细胞。每孔加500μL Click反应液，室温避光孵育30min。弃去click反应液，洗涤。加入1×Hoechst 33342进行染细胞核，温避光孵育10min。弃1×Hoechst 33342，1×PBS洗涤细胞。最后对细胞镜检、拍照。

5、功能回复实验

按照每孔1.5×10⁵个/ml的密度将shPDPN的HGC-27-LR细胞种到6孔板上，培养过夜。次日观察细胞密度，达到80％左右。转染前1h更换预热的1ml无血清的培养基。将250μL不含血清的DMEM高糖培养基稀释的质粒加入到含6μL lipofectamine 2000的250μL不含血清的DMEM高糖培养基中，混匀后室温静置20min得到混合液。将上述混合液述均匀滴入对应孔中，培养6h后，弃去旧培养基，更换称新鲜的含有10％FBS的完全培养基，继续培养120h后，提取蛋白，Western blot检测PDPN的蛋白水平，检测转染效率。

6、Transwell实验检测细胞迁移

消化并收集细胞，用无血清培养液重悬细胞并计数。置于24孔板中，按照每个小室中1×10⁵个细胞/200μL无血清培养基的密度铺上细胞，下层添加500μL含有15％血清的培养基中加入拉帕替尼。培养24h后，取出小室，弃去孔中培养液用PBS洗两次，棉签擦去上层未迁移细胞，多聚甲醛固定30min，1×PBS洗三次，然后用0.1％结晶紫染30min后，1×PBS洗去多余染液，用棉签轻轻擦去上室水分。空气干燥后，小室放回24孔板，显微镜下观察和拍照。

7、统计分析

每个实验至少独立重复三次，实验数据以均数±SEM表示，使用SPSS 17.0(SPSSInc.,Chicago,IL,USA)进行统计分析。p<0.05代表差异有统计学意义。

8、实验结果

检测PDPN对细胞增殖能力的改变如图4所示，结果表明，CCK-8实验检测细胞增殖，与对照组相比，过表达PDPN(LV-PDPN)之后细胞增殖能力高于对照组(LV-vector)，在10，15μM拉帕替尼处理48h后，过表达PDPN的HGC-27细胞产生耐药，用10μM拉帕替尼药物处理后，过表达PDPN之后细胞耐药能力高于对照组，且这一耐药现象在不同时间点均存在；EDU增殖实验(其中DAPI代表荧光染料)同样发现PDPN过表达促进增殖，且差异具有统计学意义。

验证PDPN的促增殖与促耐药作用的实验结果如图5所示，结果表明，CCK-8实验检测细胞增殖，与对照组(shNC)相比，敲低PDPN(shPDPN)之后细胞增殖能力弱于对照组，在10，15μM拉帕替尼处理48h后，敲低PDPN的HGC-27-LR细胞对药物敏感性提高，用10μM拉帕替尼药物处理后，敲低PDPN之后细胞对药物敏感性提高，高于对照组，这一增敏现象在不同时间点均存在(12,24,36,48h)；EDU增殖实验同样发现敲低PDPN抑制增殖，且差异具有统计学意义。

功能回复实验的细胞增殖能力结果如图6所示，结果表明，与对照组(shPDPN-vector)相比，再一次过表达PDPN的shPDPN HGC-27-LR(shPDPN-PDPN)，细胞增殖能力高于对照组；在10，15μM拉帕替尼处理48h后，过表达PDPN的shPDPN HGC-27-LR细胞产生耐药现象；

功能回复实验的细胞迁移能力的结果如图7所示，结果表明，20h后，过表达PDPN细胞迁移能力强于对照组，即过表达PDPN促进HGC-27细胞迁移；迁移24h后，敲低PDPN细胞迁移数目少于对照，即敲低PDPN抑制HGC-27-LR细胞迁移。

实施例3PDPN促进体内HGC-27细胞耐药

1、实验方法

1)体内实验

LV-vector-HGC-27和LV-PDPN-HGC-27细胞的NCG小鼠异种移植瘤实验。将32只5周龄的NCG小鼠随机分为两组，每组16只(n＝16)，分别腋下接种LV-vector-HGC-27细胞或LV-PDPN-HGC-27细胞(接种的细胞数：8×10⁶个)，每2天观测肿瘤大小。当移植瘤体积达到约200mm³时，将每种移植瘤小鼠随机分为拉帕替尼处理组(100mg/kg/天)和玉米油对照组，每组n＝8，每天对小鼠进行腹腔注射(IP)，同时对小鼠的体重进行称重和记录，测量皮下移植瘤的大小并记录数值。连续注射拉帕替尼药物(处理组)、对照溶剂(对照组)11天后，处死小鼠，取出肿瘤组织，并进行肿瘤组织的称重和统计。

2)异种移植肿瘤组织蛋白的提取，具体步骤如下：

取出小鼠新鲜肿瘤组织，1×PBS清洗至没有可见血色后，吸水纸擦干水分，称重，剪碎，放入提前加了研磨珠和蛋白裂解液的组织研磨管，配平，放入提前预冷至4℃的组织破碎匀浆仪进行研磨，研磨至呈无明显组织颗粒。冰上静置20min，12000rpm，4℃，离心10min，取上清，进行蛋白浓度测定，后续通过Western blot检测目标蛋白的表达情况。

2、统计分析

每个实验至少独立重复三次，实验数据以均数±SEM表示，使用SPSS 17.0(SPSSInc.,Chicago,IL,USA)进行统计分析。p<0.05代表差异有统计学意义。

3、实验结果

体内实验验证PDPN促进细胞耐药结果如图8所示，结果表明LV-PDPN组拉帕替尼处理肿瘤体积大于对照组，重量无统计学差异；LV-vector组拉帕替尼处理组肿瘤体积小于对照组，肿瘤重量小于对照组，具有统计学差异；Western blot检测小鼠肿瘤组织中PDPN表达，LV-PDPN组PDPN明显高于对照组，表明模型构建成功。

实施例4高表达PDPN的HGC-27-LR细胞可促进邻近HGC-27细胞耐药

1、实验方法

1)直接共培养

高表达PDPN的HGC-27-LR细胞与低表达PDPN的HGC-27细胞分别与HGC-27细胞直接接触共培养，HGC-27-LR、HGC-27分别与GFP阳性HGC-27按1:1比例种植在24孔板中进行直接共培养，期间每隔24h换液加拉帕替尼处理，共培养72h后弃培养基，收集细胞进行流式检测，7AAD标记死细胞。

将构建的敲低PDPN的HGC-27-LR细胞(shPDPN HGC-27-LR)与转染vector的HGC-27-LR细胞(shNC HGC-27-LR)分别与GFP阳性HGC-27细胞共培养，敲低PDPN的HGC-27-LR细胞与LV-vector的HGC-27-LR细胞分别与HGC-27按1:1比例直接共培养，BF代表桃红荧光蛋白，GFP代表绿色荧光蛋白。

2)间接共培养

将构建的过表达PDPN的HGC-27细胞与LV-vector的HGC-27细胞分别与HGC-27细胞间接共培养，过表达PDPN的HGC-27细胞与LV-vector的HGC-27细胞分别与HGC-27按1:1比例共培养。

2、统计分析

每个实验至少独立重复三次，实验数据以均数±SEM表示，使用SPSS 17.0(SPSSInc.,Chicago,IL,USA)进行统计分析。p<0.05代表差异有统计学意义。

3、实验结果

直接和间接共培养结果如图9所示，结果显示，与HGC-27-LR细胞共培养组相比，HGC-27-LR细胞共培养组的GFP阳性HGC-27细胞存活比例更高，HGC-27-LR细胞可促进GFP阳性HGC-27细胞耐药；与LV-vector HGC-27细胞共培养组相比，LV-PDPN HGC-27细胞共培养组的HGC-27细胞存活比例更高，LV-PDPN HGC-27细胞可促进HGC-27细胞耐药；与shNC HGC-27-LR细胞共培养组相比，shPDPN HGC-27-LR细胞共培养组的HGC-27细胞存活比例更低，表明HGC-27-LR细胞可促进邻近HGC-27细胞耐药，但敲低PDPN以后，这种效应消失，即shPDPNHGC-27-LR细胞不可促进HGC-27细胞耐药；发现过表达PDPN的HGC-27细胞也可促进HGC-27细胞耐药。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (26)

1.检测PDPN的试剂在制备诊断拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂选自特异性识别PDPN基因的寡核苷酸探针、特异性扩增PDPN基因的引物或特异性结合PDPN基因编码的蛋白的结合剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的引物的序列如SEQ ID NO：1-2所示。

4.抑制PDPN的shRNA或siRNA在制备治疗拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌或增加拉帕替尼治疗HER2阳性胃癌敏感性的药物组合物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物组合物抑制拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌细胞的增殖、迁移、增加拉帕替尼药物敏感性。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

7.如下任一种构建拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌细胞模型的方法：

1)制备过表达PDPN的HER2阳性胃癌细胞；

2)使用拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌细胞与非耐药HER2阳性胃癌细胞共培养。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，1)中制备的过表达PDPN的HER2阳性胃癌细胞包括将PDPN构建至载体中之后转染HER2阳性胃癌细胞。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，2)中使用的拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌细胞通过拉帕替尼梯度加压获得或通过方法1)将PDPN构建至载体中之后转染HER2阳性胃癌细胞获得。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述载体包括病毒载体、质粒、噬菌体、脂质体、亲脂试剂、聚阳离子。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述病毒载体包括慢病毒载体、SV40病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述病毒载体为慢病毒载体。

13.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述共培养的方法包括直接培养、间接培养。

14.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述共培养的时间为72h。

15.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述共培养的比例为1:1。

16.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述HER2阳性胃癌细胞选自HGC-27、MGC-803、BCG-823。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述HER2阳性胃癌细胞为HGC-27。

18.一种构建拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌动物模型的方法，其特征在于，所述方法包括过表达PDPN。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述动物包括哺乳动物。

20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物包括狗、猪、兔或啮齿目动物。

21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述啮齿目动物包括小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠。

22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述动物为小鼠。

23.一种拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌细胞模型，其特征在于，所述模型由权利要求7所述的方法构建而成。

24.检测PDPN表达水平的方法在筛选治疗拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌的候选药物中的应用，其特征在于，所述筛选治疗HER2阳性胃癌的候选药物的方法如下：用待筛选物质处理表达或含有PDPN基因或其编码的蛋白的培养体系；和检测所述体系中PDPN基因或其编码的蛋白的表达或活性；其中，当所述待筛选物质抑制PDPN基因的或其编码的蛋白的表达水平或活性时，该待筛选物质是治疗拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌的候选药物。

25.如下任一种应用：

(1)权利要求7所述的方法构建的细胞模型或权利要求18-22任一项所述的方法构建的动物模型在筛选治疗拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌药物中的应用；

(2)权利要求7所述的方法构建的细胞模型或权利要求18-22任一项所述的方法构建的动物模型在筛选增加拉帕替尼治疗HER2阳性胃癌敏感性的药物中的应用。

26.根据权利要求25所述的应用，其特征在于，所述筛选治疗拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌药物的方法包括以下步骤：

1)向拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌模型施用测试药物；

2)检测拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌模型中HER2阳性胃癌的相关症状和/或指标，并与对照组进行比较；

3)所述拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌模型中HER2阳性胃癌的相关症状有显著改善，则表示该测试药物是潜在治疗拉帕替尼耐药的HER2阳性胃癌的药物。